ES2647596T3 - Variantes de proteínas AXMI205 y métodos para su uso - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que es una variante de SEQ ID NO:2, donde dicho polipéptido tiene actividad plaguicida mejorada relativa a la SEQ ID NO:2 y donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona de entre SEQ ID NO:4, 5 ó 6, o una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NO:7, 8, 9, 10, 11 ó 12.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (% GC) -0,61 (% de formamida) -500/l; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, % de GC es el porcentaje de los nucleótidos guanosina y citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un 5 pH definidos) a la que el 50% de una secuencia objetivo complementaria se hibrida con una sonda perfectamente equiparada. Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1% de desapareamiento; por tanto, las condiciones de Tm, hibridación y/o lavado pueden ajustarse para hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con una identidad ≥90 %, la Tm puede reducire 10 °C. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan para que sean aproximadamente 5 °C más bajas que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones muy rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3 o 4 °C por debajo del punto de fusión térmico (Tm); Las condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9 o 10 °C por debajo del punto de fusión térmico (Tm); las condiciones de baja rigurosidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20 °C por debajo del punto de fusión térmico (Tm). Usando la ecuación, las composiciones de

15 hibridación y lavado, y la Tm deseada, los expertos habituales entenderán que las variaciones en la rigurosidad de las soluciones de hibridación y/o lavado están inherentemente descritas. Si el grado de desapareamiento deseado da como resultado una Tm de menos de 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida), se prefiere aumentar la concentración de SSC de modo que se pueda usar una temperatura más alta. Una exhaustiva guía para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Técnicas de laboratorio en bioquímica y biologíahibridación molecular con sondas de ácido nucleico, parte I, capítulo 2 (Elsevier, Nueva York ); y Ausubel y col., eds., (1995) Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 2 (Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York). Véase Sambrook y col., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

25 Proteínas aisladas y variantes y fragmentos de las mismas

Las proteínas plaguicidas también están abarcadas dentro de la presente invención. Por «proteína plaguicida» se entiende una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:7, 8, 9, 10, 11 o 12. Una «proteína aislada» se usa para referirse a una proteína que ya no está en su entorno natural, por ejemplo en una célula huésped de planta, o bacteriana recombinante, o in vitro.

Por «actividad mejorada» se entiende un aumento de al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos

35 aproximadamente el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o mayor, o al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 3 veces o un aumento mayor en la actividad plaguicida de la variante de proteína relativa a la actividad plaguicida de Axmi205. En algunas realizaciones, la mejora consiste en una disminución en la LC50 relativa a la CL50 de Axmi205, p. ej., una disminución de al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 55 %, al menos aproximadamente el 60 %, o una reducción mayor en la LC50. Los métodos de medición de la actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews y col., (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone y col., (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la patente de EE.UU. n.º 5.743.477.

45 Los genes bacterianos, tales como los genes axmi de la presente invención, con bastante frecuencia poseen múltiples codones de iniciación de metionina en las proximidades del inicio del marco de lectura abierto. A menudo, el inicio de la traducción en uno o más de estos codones de inicio conducirá a la generación de una proteína funcional. Estos codones de inicio pueden incluir codones ATG. Sin embargo, bacterias tales como Bacillus sp. también reconoce el codón GTG como un codón de inicio, y las proteínas que inician la traducción en los codones GTG contienen una metionina en el primer aminoácido. En raras ocasiones, la traducción en sistemas bacterianos puede iniciarse en un codón TTG, aunque en este caso el TTG codifica una metionina. Además, a menudo no se determina a priori cuál de estos codones se usa naturalmente en la bacteria. Por tanto, se entiende que el uso de uno de los codones de metionina alternativos también puede conducir a la generación de proteínas plaguicidas.

55 Estas proteínas plaguicidas están abarcadas en la presente invención y se pueden usar en los métodos de la presente invención. Se entenderá que, cuando se exprese en plantas, será necesario alterar el codón de inicio alternativo a ATG para una traducción adecuada.

Los anticuerpos para los polipéptidos de la presente invención también están abarcados. Los métodos de producción de anticuerpos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; patente de EE.UU. n.º 4.196.265).

Por tanto, un aspecto de la invención se refiere a anticuerpos, que se unen específicamente a una o más de las moléculas de proteína de la invención. En una realización particularmente preferente, el anticuerpo se une

65 específicamente a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:7, 8, 9, 10, 11 o 12. En otra realización, el anticuerpo se une específicamente a una proteína de fusión que comprende una secuencia de

aminoácidos seleccionada de entre la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:7, 8, 9, 10, 11 o 12.

Los anticuerpos de la invención se pueden usar para detectar cuantitativa o cualitativamente la proteína o las moléculas peptídicas de la invención, o para detectar modificaciones postraduccionales de las proteínas. Tal como

5 se usa en el presente documento, se dice que un anticuerpo o péptido «se une específicamente» a una proteína o a una molécula peptídica de la invención si dicha unión no se inhibe competitivamente por la presencia de moléculas no relacionadas.

Vectores

Se puede proporcionar una secuencia plaguicida de la invención en un casete de expresión para la expresión en una planta de interés. Por «casete de expresión de plantas» se entiende una construcción de ADN que puede dar como resultado la expresión de una proteína a partir de un marco de lectura abierto en una célula de planta. Típicamente, estos contienen un promotor y una secuencia de codificación. A menudo, dichas construcciones también contendrán

15 una región 3’ no traducida. Dichas construcciones pueden contener una «secuencia señal» o «secuencia líder» para facilitar el transporte cotraduccional o postraduccional del péptido a determinadas estructuras intracelulares tales como el cloroplasto (u otro plasto), el retículo endoplásmico o el aparato de Golgi.

Por «secuencia señal» se entiende una secuencia que se sabe o se sospecha que da como resultado un transporte de péptidos cotraduccional o postraduccional a través de la membrana de la célula. En eucariotas, esto típicamente implica la secreción en el aparato de Golgi, con alguna glicosilación resultante. Las toxinas insecticidas de bacterias a menudo se sintetizan como protoxinas, que se activan protolíticamente en el intestino de la plaga objetivo (Chang (1987) Methods Enzymol., 153:507-516). En algunas realizaciones de la presente invención, la secuencia señal se localiza en la secuencia nativa, o se puede obtener de una secuencia de la invención. Por «secuencia líder» se

25 entiende cualquier secuencia que, cuando se traduce, da como resultado una secuencia de aminoácidos suficiente para desencadenar el transporte cotraduccional de la cadena peptídica a un orgánulo subcelular. Por tanto, esto incluye secuencias líder que se dirigen al transporte y/o glicosilación mediante el paso al retículo endoplasmático, el paso a las vacuolas, plastos que incluyen cloroplastos, mitocondrias y similares.

Por «vector de transformación de plantas» se entiende una molécula de ADN que es necesaria para la transformación eficiente de una célula de planta. Dicha molécula puede consistir en uno o más casetes de expresión de plantas, y puede organizarse en más de una molécula de ADN «vector». Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformación de plantas que utilizan dos vectores de ADN no contiguos para codificar todas las funciones necesarias de acción cis y trans para la transformación de células de plantas (Hellens y Mullineaux (2000)

35 Trends in Plant Science 5:446-451). «Vector» se refiere a una construcción de ácido nucleico diseñada para la transferencia entre diferentes células huésped. «Vector de expresión» se refiere a un vector que tiene la capacidad de incorporar, integrar y expresar secuencias de ADN heterólogas o fragmentos en una célula extraña. El casete incluirá secuencias reguladoras 5’ y 3’ operativamente unidas a una secuencia de la invención. Por «operativamente unido» se entiende un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, donde la secuencia promotora inicia y actúa como mediador de la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, operativamente unido significa que las secuencias de ácido nucleico que se unen son contiguas y, cuando sea necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en el mismo marco de lectura. El casete puede contener adicionalmente al menos un gen adicional a cotransformar en el organismo. Como alternativa, el gen o genes adicionales pueden proporcionarse en múltiples casetes de expresión.

45 «Promotor» se refiere a una secuencia de ácido nucleico que funciona para dirigir la transcripción de una secuencia de codificación aguas abajo. El promotor junto con otras secuencias de ácido nucleico reguladoras transcripcionales y traduccionales (también denominadas «secuencias de control») son necesarias para la expresión de una secuencia de ADN de interés.

Dicho casete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia plaguicida bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras.

El casete de expresión incluirá en la dirección 5’-3’ de la transcripción, una región de iniciación transcripcional y

55 traduccional (es decir, un promotor), una secuencia de ADN de la invención y una región de terminación transcripcional y transcripcional (es decir, una región de terminación) funcional en las plantas. El promotor puede ser nativo o análogo, o extraño o heterólogo, a la planta huésped y/o a la secuencia de ADN de la invención. Además, el promotor puede ser la secuencia natural o, como alternativa una secuencia sintética. Cuando el promotor es «nativo» u «homólogo» a la planta huésped, se entiende que el promotor se encuentra en la planta nativa en la que se introduce el promotor. Cuando el promotor es «extraño» o «heterólogo» a la secuencia de ADN de la invención, se entiende que el promotor no es el promotor nativo o de origen natural para la secuencia de ADN operativamente unida de la invención.

La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de la transcripción, puede ser nativa con la

65 secuencia de ADN operativamente unidad de interés, puede ser nativa con la planta huésped, o se puede obtener de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga al promotor, a la secuencia de ADN de interés, a la planta huésped, o a

imagen6

Típicamente este «casete de expresión de la planta» se insertará en un «vector de transformación de la planta». Este vector de transformación de la planta puede estar compuesto por uno o más vectores de ADN necesarios para conseguir la transformación de la planta. Por ejemplo, es una práctica común en la técnica utilizar vectores de transformación de plantas que están compuestos por más de un segmento de ADN contiguo. Estos vectores se 5 denominan a menudo en la técnica «vectores binarios». Los vectores binarios así como los vectores con plásmidos auxiliares se usan con mayor frecuencia para la transformación mediada por Agrobacterium, donde el tamaño y la complejidad de los segmentos de ADN necesarios para conseguir la transformación eficiente es bastante grande, y es ventajoso para separar las funciones en moléculas de ADN separadas. Los vectores binarios típicamente contienen un vector de plásmido que contiene las secuencias que actúan en cis requeridas para la transferencia de T-ADN (tal como borde izquierdo y borde derecho), un marcador seleccionable que está modificado por ingeniería que puede expresarse en una célula de planta, y un «gen de Interés» (un gen modificado por ingeniería que puede expresarse en una célula de planta para la cual se desea la generación de plantas transgénicas). También están presentes en este vector de plásmido secuencias requeridas para la replicación bacteriana. Las secuencias que actúan en cis están dispuestas de una forma que permitan la transferencia eficiente en las células de las plantas y la

15 expresión en la misma. Por ejemplo, el gen marcador seleccionable y el gen plaguicida se localizan entre los bordes izquierdo y derecho. A menudo, un segundo vector de plásmido contiene los factores que actúan en trans que actúan como mediadores de la transferencia de ADN-T de Agrobacterium a las células de plantas. A menudo, este plásmido contiene las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de las células de plantas por Agrobacterium, y la transferencia de ADN por escisión en secuencias de borde y la transferencia de ADN mediada por vir, como se entiende en la técnica (Hellens y Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Se pueden usar varios tipos de cepas de Agrobacterium (p. ej., LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) para la transformación de plantas. El segundo vector de plásmido no es necesario para la transformación de las plantas por otros métodos tales como microproyección, microinyección, electroporación, polietilenglicol, etc.

25 En general, los métodos de transformación de plantas implican la transferencia de ADN heterólogo en las células de la planta objetivo (p. ej., embriones inmaduros o maduros, cultivos en suspensión, callo no diferenciado, protoplastos, etc.), seguido de la aplicación de un nivel umbral máximo de selección adecuada (dependiendo del gen marcador seleccionable) para recuperar las células de las plantas transformadas del grupo de una masa de células sin transformar. Típicamente, los explantes se transfieren a un suministro fresco del mismo medio y se cultivan de forma habitual. Posteriormente, las células transformadas se diferencian en brotes después de colocar en un medio de regeneración suplementado con un nivel umbral máximo de un agente de selección. Los brotes se transfieren a continuación a un medio de enraizamiento selectivo para la recuperación de brotes o plántula enraizados. La plántula transgénica se cultiva entonces en una planta madura y produce semillas fértiles (p. ej.,Hiei y col., (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida y col., (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Típicamente, los explantes se

35 transfieren a un suministro fresco del mismo medio y se cultivan de forma habitual. Una descripción general de las técnicas y métodos de generación de plantas transgénicas se encuentra en Ayres y Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 y Bommineni y Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Dado que el material transformado contiene muchas células; tanto las células transformadas como no transformadas están presentes en cualquier parte del callo objetivo sometido o tejido o grupo de células. La capacidad para eliminar células no trasnformadas y permitir que las células transformadas proliferen, da como resultado cultivos de plantas transformadas. A menudo, la capacidad de eliminar células no transformadas es una limitación a la rápida recuperación de las células de plantas transformadas y la generación exitosa de plantas transgénicas.

Los protocolos de transformación así como los protocolos para la introducción de secuencias de nucleótidos en las

45 plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula de planta, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, dirigida para la transformación. La generación de plantas transgénicas se puede realizar mediante uno de los métodos varios, incluyendo, pero sin limitación, microinyección, electroporación, transferencia directa de genes, introducción de ADN heterólogo por Agrobacteriumen células de plantas (transformación mediada por Agrobacterium), bombardeo de células de plantas con ADN heterólogo extraño adherido a partículas, aceleración de partículas balística, transformación del haz de aerosol (Solicitud publicada de EE.UU. n.º 20010026941; patente de EE.UU. n.º 4.945.050; publicación internacional del documento WO n.º 91/00915; solicitud publicada de EE.UU. n.º 2002015066), La transformación Lec1, y otros métodos diversos no mediados directamente por partículas para la transferencia de ADN.

55 Los métodos de transformación de cloroplastos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Svab y col., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87:8526-8530; Svab y Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:913-917; Svab yMaliga (1993) EMBO J. 12:601-606. El método se basa en la entrega de la pistola de partículas de ADN que contiene un marcador seleccionable y la dirección del ADN al genoma del plasto a través de recombinación homóloga. Además, la transformación de plastos se puede lograr por transactivación de un transgén silencioso transmitido por plastos por la expresión preferente de tejido de un ARN polimerasa codificado en el núcleo y dirigido al plasto. Dicho sistema ha sido presentado en McBride y col.,(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91:7301-7305.

Después de la integración del ADN extraño heterólogo en células de plantas, se aplica a continuación un nivel umbral máximo de selección adecuada en el medio para matar las células no transformadas y separadar y proliferar 65 las células putativamente transformadas que sobreviven de este tratamiento de selección mediante la transferencia con regularidad a un medio natural. Por paso continuo y el problema con la selección adecuada, se identifica y se

prolifera las células que son transformadas con el vector del plásmido. Los métodos moleculares y iboquimicos se pueden usar a continuación para confirmar la presencia del gen heterólogo integrado de interés en el genoma de la planta transgénica.

5 Las células que han sido transformadas pueden ser cultivadas en plantas de acuerdo con las formas convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick y col., (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas pueden entonces ser cultivadas, y, polinizadas con la misma cepa transformada o con cepas diferentes, y el híbrido resultante que tiene la expresión constitutiva de la característica fenotípica deseada identificada. Se pueden cultivar dos o más generaciones para asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantiene de forma estable y se hereda, y se consigue entonces la cosecha de semillas para asegurar la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, la presente invención proporciona una semilla transformada (también denominada «semilla transgénica») que tiene una construcción de nucleótidos de la invención, por ejemplo, un casete de expresión de la invención, incorporado de manera estable en su genoma.

15 Evaluación de la transformación de plantas

Después de la introducción de ADN extraño heterólogo en células de plantas, la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma de la planta se confirma por diversos métodos tales como el análisis de ácidos nucléicos, proteínas y metabolitos asociados con el gen integrado.

El análisis RCP es un método rápido para detectar células transformadas, tejido o brotes para la presencia del gen incorporado en la etapa anterior antes del transplante en el suelo (Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). RCP se lleva a cabo usando cebadores de oligonucleótidos específicos para el gen de interés o antecedentes del vector de Agrobacterium, etc.

25 La transformación de plantas puede confirmarse mediante el análisis de transferencia Southern de ADN genómico (Sambrook y Russell, 2001, supra). En general, el ADN total se extrae a partir del transformante, se digiere con enzimas de restricción adecuadas, se fracciona en un gel de agarosa y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o nylon. La membrana o «mancha» se prueba entonces con, por ejemplo, un fragmento de ADN diana radiomarcado con 32P para confirmar la integración del gen introducido en el genoma de la planta de acuerdo con las técnicas convencionales (Sambrook y Russell, 2001, supra).

En el análisis de transferencia Northern, el ARN se aisla de los tejidos específicos del transformante, se fracciona en un gel de agarosa formaldehído y se transfiere sobre un filtro de nylon de acuerdo con procedimientos

35 convencionales que se usan de forma habitual en la técnica (Sambrook y Russell, 2001, supra). La expresión de ARN codificada por el gen plaguicida se analiza a continuación, mediante la hibridación del filtro con una sonda radioactiva obtenida de un gen plaguicida, por métodos conocidos en la técnica (Sambrook y Russell, 2001, supra).

Los ensayos bioquímicos de transferencia Western, y similares pueden llevarse a cabo en plantas transgénicas que confirman la presencia de la proteína codificada por el gen plaguicida por procedimientos convencionales (Sambrook y Russell, 2001, supra) usando anticuerpos que se unen a uno o más epítopos presentes en la proteína plaguicida.

Actividad plaguicida en plantas

45 En otro aspecto de la invención, se pueden generar plantas transgénicas que expresan una proteína plaguicida que tiene actividad plaguicida. Los métodos descritos anteriormente a modo de ejemplo pueden utilizarse para generar plantas transgénicas, pero la manera en la que se generan las células de plantas transgénicas no es crítica para la presente invención. Los métodos conocidos o descritos en la técnica, tales como la transformación mediada por Agrobacterium, transformación biolística, y métodos no mediados por partículas se pueden usar a discreción del experimentador. Las plantas que expresan una proteína plaguicida se pueden aislar por métodos comunes descritos en la técnica, por ejemplo por transformación del callo, selección del callo transformado y regeneración de plantas fértiles a partir de dicho callo transgénico. En dicho proceso, se puede usar cualquier gen como un marcador seleccionable mientras su expresión en células de plantas, confiera capacidad para identificar o seleccionar las células transformadas.

55 Se ha desarrollado un número de marcadores para su uso con células de plantas, tales como resistencia a cloranfenicol, el aminoglicósido G418, higromicina, o similares. Otros genes que codifican un producto implicado en el metabolismo del cloroplasto también se pueden usar como marcadores seleccionables. Por ejemplo, los genes que proporcionan resistencia a los herbicidas de las plantas, tales como glifosato, bromoxinil o imidazolinona pueden encontrar un uso particular. Dichos genes han sido presentados (Stalker y col.,(1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (resistencia del gen de la nitrilasa a bromoxinil); y Sathasivan y col.,(1990) Nucl. Acids Res. 18:2188 (resistencia del gen de AHAS a la imidazolinona). Además, los genes divulgados en el presente documento son útiles como marcadores para evaluar la transformación de células bacterianas o de plantas. Los métodos de detección de la presencia de un transgén en una planta, un órgano de plantas (p. ej., hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, una célula

65 de planta, propágulos, embriones o progenie de la misma son bien conocidos en la técnica. En una realización, la presencia del transgén se detecta mediante el análisis para la detección de actividad plaguicida.

imagen7

La composición puede formularse en forma de un polvo, un polvo fino, un microgránulo, un gránulo, una pulverización, una emulsión, un coloide, una solución o similares, y pueden prepararse por medios convencionales tales como desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación, o concentración de un cultivo de células que comprende el polipéptido. En todas las composiciones de este tipo que

5 contienen al menos uno de dichos polipéptidos plaguicidas, el polipéptido puede estar presente en una concentración de aproximadamente 1 % a aproximadamente 99 % en peso.

Las plagas de lepidópteros, dípteros, heterópteros, nematodos o coleópteros pueden eliminarse o reducirse en números en un área determinada mediante los métodos de la invención, o pueden aplicarse profilácticamente a un área ambiental para evitar la infestación por una plaga susceptible. Preferentemente, la plaga ingiere, o se pone en contacto con, una cantidad eficaz como plaguicida del polipéptido. Por «cantidad eficaz como plaguicida» se entiende una cantidad del plaguicida que puede provocar la muerte de al menos una plaga, o de reducir notablemente el crecimiento de plagas, la alimentación o el desarrollo fisiológico normal. Esta cantidad variará dependiendo de factores tales como, por ejemplo, las plagas objetivo específicas a controlar, el entorno específico,

15 el emplazamiento, la planta, el cultivo o el sitio agrícola a tratar, las condiciones ambientales, y el método, la velocidad, la concentración, la estabilidad y la cantidad de aplicación de la composición polipeptídica eficaz como plaguicida. Las formulaciones también pueden variar con respecto a las condiciones climáticas, las consideraciones medioambientales y/o la frecuencia de aplicación y/o la gravedad de la infestación de plagas.

Las composiciones de plaguicida descritas se pueden preparar formulando la suspensión de células bacterianas, cristal y/o espora, o el componente de proteína aislado con el portador agrícolamente aceptable deseado. Las composiciones se pueden formular antes de la administración en un medio apropiado tal como liofilizado, deshidratado por congelación, desecado, o en un portador acuoso, medio o diluyente adecuado, tal como solución salina u otro tampón. Las composiciones formuladas pueden estar en forma de un polvo o material granular, o una 25 suspensión en aceite (vegetal o mineral), o emulsiones de agua o aceite/agua, o como un polvo humectable, o en combinación con cualquier otro material portador adecuado para la aplicación agrícola. Los portadores agrícolas adecuados pueden ser sólidos o líquidos y son bien conocidos en la técnica. El término «vehículo agrícolamente aceptable» incluye todos los adyuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensioactivos, agentes de pegajosidad, aglutinantes, etc., que se usan habitualmente en la tecnología de formulación de plaguicidas; estos son bien conocidos por los expertos en la formulación de plaguicidas. Las formulaciones pueden mezclarse con uno o más adyuvantes sólidos o líquidos y prepararse por diversos medios, por ejemplo, mezclando, combinando y/o triturando homogéneamente la composición plaguicida con adyuvantes adecuados usando técnicas de formulación convencionales. Las formulaciones y los métodos de aplicación adecuados se describen en la patente de EE.UU. n.º

6.468.523.

35 Las plantas también se pueden tratar con una o más composiciones químicas, que incluyen uno o más herbicidas, insecticidas o fungicidas. Las composiciones químicas ejemplares incluyen: herbicidas de frutas/verduras: atrazina, bromacil, diuron, glifosato, linuron, metribuzin, simazine, trifluralin, fluazifop, glufosinate, halosulfuron Gowan, paraquat, propyzamid, setoxidim, butafenacil, halosulfurón, indaziflam; insecticidas de frutas/verduras: aldicarb, bacillus thuriengiensis, carbaril, carbofurano, clorpirifos, cipermetrina, deltametrina, diazinón, malatión, abamectina, ciflutrín/beta-ciflutrina, esfenvalerato, lambda-cihalotrina, acequinocilo, bifenazato, metoxifenocida, novalurón, cromfenozida, tiacloprid, dinotefuran, fluacripirim, tolfenpyrad, clotianidina, spirodiclofen, gamma-cihalotrina, spiromesifen, spinosad, rynaxypyr, cyazypyr, spinoteram, triflumuron, spirotetramat, imidacloprid, flubendiamida, thiodicarb, metaflumizona, sulfoxaflor, ciflumetofeno, cyanopyrafen, imidacloprid, clotianidina, tiametoxam,

45 spinotoram, thiodicarb, flonicamid, metiocarb, emamectin-benzoato, indoxacarb, fostiazato, fenamifos, cadusafos, piriproxifen, óxido de fenbutatin, hextiazox, metomilo, 4-[[(6-clorpiridin-3-il) metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)ona; fungicidas de frutas/verduras: carbendazima, clorotalonil, EBDC, azufre, metil-tiofanato, azoxistrobina, cymoxanil, fluazinam, fosetilo, iprodiona, kresoxim-metilo, metalaxil/mefenoxam, trifloxistrobina, ethaboxam, iprovalicarb, trifloxistrobina, fenhexamida, oxpoconazol fumarato, ciazofamida, fenamidona, zoxamida, picoxystrobin, pyraclostrobin, cyflufenamid, boscalid; herbicidas de cereales: isoproturon, bromoxinil, ioxinil, fenoxis, clorsulfuron, clodinafop, diclofop, diflufenican, fenoxaprop, florasulam, fluroxypyr, metsulfuron, triasulfuron, flucarbazone, iodosulfuron, propoxycarbazone, picolinafen, mesosulfuron, beflubutamid, pinoxaden, amidosulfuron, thifensulfuron, tribenuron, flupyrsulfuron, sulfosulfuron, pyrasulfotole, pyroxsulam, flufenacet, tralkoxydim, pyroxasulfon; fungicidas de cereales: carbendazima, clorotalonil, azoxistrobina, cyproconazole, cyprodinil, fenpropimorph, epoxiconazole,

55 kresoxim-metilo, kresoxim-methyl, tebuconazol, trifloxistrobina, simeconazole, picoxystrobin, pyraclostrobin, dimoxystrobin, prothioconazol, fluoxastrobin; insecticidas de cereales: dimetoato, lambda-cihalotrina, deltametrina, alfa-cipermetrina, β-ciflutrina, bifentrina, imidacloprid, clotianidina, tiametoxam, tiacloprid, acetamiprid, dinetofurano, clorfirifos, metamidofos, óxidemeton-metil, pirimicarb, methiocarb; herbicidas de maíz: atrazina, alachlor, bromoxinil, acetochlor, dicamba, clopyralid, (S-)dimethenamid, glufosinate, glifosato, isoxaflutole, (S-) metolachlor, mesotrione, nicosulfuron, primisulfuron, rimsulfuron, sulcotrione, foramsulfuron, topramezone, tembotrione, saflufenacil, thiencarbazone, flufenacet, pyroxasulfon; insecticidas de maíz: carbofurano, clorpirifos, bifentrina, fipronil, imidacloprid, lambda-cihalotrina, tefluthrin, terbufos, tiametoxam, clotianidina, spiromesifen, flubendiamida, triflumuron, rynaxypyr, deltametrina, thiodicarb, β-ciflutrina, cipermetrina, bifentrina, lufenuron, triflumoron, teflutrin, ethiprole, cyazypyr, tiacloprid, acetamiprid, dinetofurano, avermectin, metiocarb, spirodiclofen, spirotetramat;

65 fungicidas de maíz: fenitropan, tiram, prothioconazol, tebuconazol, trifloxistrobina; herbicidas de arroz: butachlor, propanil, azimsulfuron, bensulfuron, cyhalofop, daimuron, fentrazamide, imazosulfuron, mefenacet, oxaziclomefone,

imagen8

imagen9

divulgada en el presente documento y cultivar la planta o una semilla de la misma en un campo infestado con una plaga contra la que dicho polipéptido tiene actividad plaguicida. Por lo tanto, la presente invención proporciona un método de aumento del rendimiento en una planta que comprende cultivar en un campo una planta o una semilla de la misma que tiene incorporado de manera estable en su genoma una construcción de ADN que comprende una

5 secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene actividad plaguicida, donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que es una variante de SEQ ID NO:2, donde dicho polipéptido tiene actividad plaguicida mejorada relativa a la SEQ ID NO:2, donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona de entre la SEQ ID NO:4, 5 o 6, o una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre SEQ ID NO:7, 8, 9, 10, 11 o 12, donde dicho campo está infestado con una plaga contra la cual dicho polipéptido tiene actividad plaguicida. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene actividad plaguicida contra una plaga de lepidópteros, coleópteros, dípteros, hemípteros o nematodos, y dicho campo está infestado con una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, dípteros o nematodos.

Tal como se define en el presente documento, el «rendimiento» de la planta se refiere a la calidad y/o cantidad de

15 biomasa producida por la planta. Por «biomasa» se entiende cualquier producto medido de la planta. Un aumento de la producción de biomasa es cualquier mejora en el rendimiento del producto medido de la planta. El aumento del rendimiento de la planta tiene varias aplicaciones comerciales. Por ejemplo, aumentar la biomasa de hojas de la planta puede aumentar el rendimiento de vegetales de hoja para el consumo humano o animal. Además, el aumento de biomasa de hojas se puede usar para aumentar la producción de productos farmacéuticos o industriales derivados de plantas. Un aumento del rendimiento puede comprender cualquier aumento estadísticamente significativo que incluye, pero sin limitación, al menos un aumento del 1 %, al menos un aumento del 3 %, al menos un aumento del 5 %, al menos un aumento del 10 %, al menos un aumento del 20 %, al menos un 30 %, al menos un 50 %, al menos un 70 %, al menos un 100% o un aumento mayor del rendimiento en comparación con una planta que no expresa la secuencia plaguicida.

25 En métodos específicos, el rendimiento de la planta aumenta como resultado de la resistencia a las plagas mejorada de una planta que expresa una proteína plaguicida divulgada en el presente documento. La expresión de la proteína plaguicida da como resultado una capacidad reducida de una plaga para infestar o alimentarse de la planta, mejorando así el rendimiento de la planta.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Parte experimental

35 Ejemplo 1. Mutagénesis de la parte N-terminal de Axmi205

Axmi205 es una toxina activa en larvas de gusano de la raíz del maíz del oeste (WCRW) (véase la publicación de patente de EE.UU. n.º 20110023184, que se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad). La secuencia de nucleótidos para Axmi205 se expone en la SEQ ID NO:1. La secuencia de aminoácidos para Axmi205 se expone en la SEQ ID NO:2.

El modelado tridimensional y las alineaciones de secuencia indican que la mitad N-terminal de Axmi205 es homóloga a los dominios formadores de poros de las perforinas. La mitad C-terminal de Axmi205 no muestra homologías, y su función es desconocida. Otras endotoxinas de proteína que son activas en insectos contienen un dominio formador

45 de poros y un dominio de unión a receptores. Es concebible que la mitad C-terminal de Axmi205 esté implicada en dirigir Axmi205 a emplazamientos en WCRW donde se produce la formación de poros. Se generó una biblioteca de mutantes puntuales que se dirige a 30 posiciones en la porción C-terminal de Axmi205 usando el kit de mutagénesis de aclaramiento QUIKCHANGE® (Stratagene). El plásmido pAX7011 que codifica Axmi205 nativa en pRSF1b fue mutagenizado. La biblioteca tenía una complejidad total de 506.

Los mutantes combinados, así como par7011, se transformaron en células BL21*DE3 y se sembraron en placas LB

+ Kanamicina (100 μg/ml). Se recogieron colonias frescas en 8 ml de medio líquido LB + kanamicina (100 μg/ml) y se cultivaron en 24 bloques de pocillos profundos a 37 grados C y 300 rpm hasta que se alcanzó una DO600 nm de 0,3. Se añadió IPTG a una concentración final de 0,5 mM y los cultivos se incubaron durante 18 horas adicionales a

55 20 grados C. Se determinó la DO600 nm y las células se recogieron por centrifugación (10 minutos a 4000 rpm, 4 grados C). Los sedimentos celulares se resuspendieron en Tris/HCl 20 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, DTT 1 mM a una densidad de DO600/ml de 20. Las células fueron alteradas mediante el batido de perlas y se obtuvieron extractos solubles después de la centrifugar a 4500 rpm durante 15 minutos a 4 grados C.

Los extractos se determinaron para determinar la actividad contra WCRW en cuatro réplicas por variante. Después de 5 y 6 días, las puntuaciones de toxicidad del gusano de la raíz se determinaron promediando las puntuaciones de cuatro réplicas. Se identificaron mil ciento treinta y nueve variantes en esta pantalla principal, proporcionando una cobertura de 2,2x de la biblioteca. Se secuenciaron y se volvieron a determinar las variantes con una puntuación mayor que la del tipo silvestre Axmi205. Luego se realizaron ensayos de escala para clasificar los mutantes relativos 65 al tipo salvaje Axmi205 y Axmi205 (evo25) (publicación de la patente de EE.UU. n.º 20110023184 y expuestos en el presente documento como SEQ ID NO:3). Los datos del ensayo de escala se muestran en las Tablas 1 y 2 para las

principales variantes que puntuaron por encima de Axmi205 de tipo salvaje en el ensayo primario, la re-evaluación y ambas ampliaciones.

Tabla 1.

Promedio de mortalidad en % de WCRW

Desviación típica

Axmi205

16,35 12,60

Axmi205(evo25)

20,20 12,17

Axmi205(evo30)

23,05 4,61

Axmi205 PMlib1 con 1G2_p2a11

19,56 9,47

Axmi205 PMlib1 con 1G2_p1c1

18,36 7,09

Axmi205 PMlib1 con 1G2_p1a4

17,97 11,42

5 La variante Axmi205 (evo30) mostró una actividad mejorada en comparación con Axmi205 (evo25). Porta la mutación V467L. La secuencia de nucleótidos que codifica Axmi205 (evo30) se expone en SEQ ID NO:4. La secuencia de aminoácidos se expone en SEQ ID NO:7. Las siguientes variantes más activas son Axmi205 PMlibI con1G2_p2a11 (mutación S468L; SEQ ID NO:10), Axmi205 PMlibI con1G2_p1c1 (mutación V467T; SEQ ID NO: 11)

10 y Axmi205 PMlibI con1 G2_p1a4 (mutación R464N; SEQ ID NO:12). De las 30 posiciones mutagenizadas, las variantes mejoradas portan mutaciones que se agrupan con Axmi205 (evo25) (mutación V467A). Estos resultados sugieren que las posiciones 467 y 468 están relacionadas con una actividad mejorada en Axmi205.

Ejemplo 2. Mutagénesis aleatoria de Axmi205 15

Gen completo:

Se llevó a cabo la mutagénesis por RCP aleatoria de toda la proteína Axmi205. Se determinaron mil ciento sesenta y seis variantes en el nivel de cuatro réplicas, se volvieron a determinar y se ampliaron para identificar la variante

20 Axmi205 (evo35) que tenía propiedades mejoradas (Tabla 2). La secuencia de nucleótidos que codifica Axmi205 (evo35) se expone en SEQ ID NO:6. La secuencia de aminoácidos se expone en SEQ ID NO:9.

Ejemplo 3. Mutagéneses de la parte C-terminal de Axmi205

25 En el dominio formador de poros N-terminal de las toxinas de tipo perforina, se sabe que varias hélices alfa interactúan con la membrana de los organismos objetivo. Estas hélices se reorganizan para formar el canal transmembrana de toxinas de tipo perforina. Estas hélices fueron objetivo de mutagénesis. Se mutagenizaron treinta y nueve posiciones para una diversidad total de 648. Se identificaron mil cincuenta y cinco variantes, se determinaron nuevamente 116 coincidencias y se ampliaron 34 coincidencias. De estas variantes, Axmi205 (evo34)

30 fue la variante más activa (Tabla 2) y mostró una expresión mejorada relativa a la expresión de Axmi205wt. La secuencia de nucleótidos que codifica Axmi205 (evo34) se expone en SEQ ID NO:5. La secuencia de aminoácidos se expone en SEQ ID NO:8.

Tabla 2.

Nucleótidos de SEQ ID NO:

Amino ácidos de SEQ ID NO: Promedio de puntuación del crecimiento reducido de WCRW Promedio de mortalidad media de WCRW (%)

Axmi205wt

1 2 0,33 11,28

Axmi205(evo30)

4 7 0,56 18,17

Axmi205(evo34)

5 8 0,94 19,46

Axmi205(evo35)

6 9 0,75 20,19

pRSF1b (control negativo)

- - 0,13 0,00

35 Ejemplo 4. Ensayos adicionales de determinación de la actividad plaguicida

Las secuencias de nucleótidos de la invención se pueden analizar para determinar su capacidad para producir proteínas plaguicidas. La capacidad de una proteína plaguicida para actuar como un plaguicida sobre una plaga a 40 menudo se evalúa de varias maneras. Una forma bien conocida en la técnica es realizar un ensayo de alimentación. En dicho ensayo de alimentación, se expone la plaga a una muestra que contiene compuestos a analizar o muestras de control. A menudo, esto se realiza colocando el material a analizar, o una dilución adecuada de dicho material, en un material que la plaga va a ingerir, tal como una dieta artificial. El material a analizar puede estar compuesto por un líquido, sólido o suspensión. El material a analizar puede colocarse sobre la superficie y luego dejarse secar.

45 Como alternativa, el material a analizar se puede mezclar con una dieta artificial fundida y luego dispensarse en la cámara de ensayo. La cámara de ensayo puede ser, por ejemplo, una taza, un plato o un pocillo de una placa de microtitulación.

imagen10

Ejemplo 7. Transformación de células de maíz con los genes de proteínas plaguicidas descritos en el presente documento

Las mazorcas de maíz se recogen mejor 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aíslan de las

5 mazorcas, y se prefieren los embriones de 0,8-1,5 mm de tamaño para su uso en la transformación. Los embriones se siembran en placas escutelo hacia arriba en un medio de incubación adecuado, tal como los medios DN62ASS (3,98 g/l de sales de N6; 1 ml/l (de 1000x reserva) de vitaminas de N6; 800 mg/l de L-asparagina; 100 mg/l de mioinositol; 1,4 g/l de L-prolina; 100 mgl/l de ácidos Casamino; 50 g/l de sacarosa; 1 ml/l (de 1 mg/ml de reserva) de 2,4-D). Sin embargo, los medios y sales distintos de DN62A5S son adecuados y son conocidos en la técnica. Los

10 embriones se incubaron durante una noche a 25 °C en la oscuridad. Sin embargo, no es necesario en sí incubar los embriones durante una noche.

Los explantes resultantes se transfieren a la malla de cuadrados (30-40 por placa), se transfieren a medios osmóticos durante aproximadamente 30-45 minutos, luego se transfieren a una placa radiante (véase, por ejemplo,

15 la publicación PCT n.ºWO/0138514 y la patente de EE.UU. n.º 5.240.842).

Las construcciones de ADN diseñadas para los genes de la invención en células de plantas son aceleradas en el tejido de la planta usando un acelerador de haz de aerosol, usando condiciones esencialmente como se describe en la publicación PCT n.º WO/0138514. Después de la irradiación, los embriones se incuban durante aproximadamente 20 30 minutos en medios osmóticos, y se colocan sobre medios de incubación durante una noche a 25 °C en la oscuridad. Para evitar explantes irradiados indebidamente perjudiciales, se incuban durante al menos 24 horas antes de su transferencia a medios de recuperación. Los embriones se extienden entonces sobre medios de período de recuperación, durante aproximadamente 5 días, 25 °C en la oscuridad, después se transfirieren a un medio de selección. Los explantes se incuban en medios de selección hasta por ocho semanas, dependiendo de la naturaleza 25 y las características de la selección particular utilizada. Después del periodo de selección, el callo resultante se transfiere a medios de maduración del embrión, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes se colocan a continuación en condiciones de baja luz, y el proceso de regeneración se inicia por métodos conocidos en la técnica. Los brotes resultantes se dejan arraigar en medios de enraizamiento, y las plantas resultantes se transfieren a macetas vivero y se propagan como plantas

30 transgénicas.

Materiales

Medios DN62A5S

Componentes

Por litro Fuente

Mezcla de sales basales de N6 de Chu (prod. n.º C 416)

3,98 g/l Laboratorios fitotecnológicos

Solución de vitaminas de N6 de Chu (prod. n.º C 149)

1 ml/l (de 1000x reserva) Laboratorios fitotecnológicos

L-asparagina

800 mg/l Laboratorios fitotecnológicos

Mio-inositol

100 mg/l Sigma

L-prolina

1,4 g/l Laboratorios fitotecnológicos

Ácidos casamino

100 mg/l Fisher Scientific

Sacarosa

50 g/l Laboratorios fitotecnológicos

2,4-D (prod. n.º D-7299)

1 ml/l (de 1 mg/ml de reserva) Sigma

35 El pH de la solución se ajusta a pH 5,8 con KOH 1 N/KCl 1N, Se añade Gelrite (Sigma) a una concentración de hasta 3 g/l, y los medios se esterilizan en autoclave. Después de enfriar a 50 °C, se añade 2 ml/l de una solución madre de 5 mg/ml de nitrato de plata (laboratorios fitotecnológicos).

40 Ejemplo 8. Transformación de los genes de la invención en células de plantas mediante la transformación mediada por Agrobacterium

Las mazorcas se recogen mejor 8-12 días después de la polinización. Los embriones se aíslan de las mazorcas, y se prefieren los embriones de 0,8-1,5 mm de tamaño para su uso en la transformación. Los embriones se siembran 45 en placas escutelo hacia arriba en un medio de incubación adecuado, y se incuban durante una noche a 25 °C en la oscuridad. Sin embargo, no es necesario en sí incubar los embriones durante una noche. Los embriones se ponen en contacto con una cepa de Agrobacterium que contiene los vectores adecuados para la transferencia mediada por el plásmido Ti durante aproximadamente 5-10 minutos, y luego se siembran en placas sobre medios de co-cultivo durante aproximadamente 3 días (25 °C en la oscuridad). Después del co-cultivo, los explantes se transfieren a 50 medios de período de recuperación durante aproximadamente cinco días (a 25 °C en la oscuridad). Los explantes se incuban en medios de selección hasta por ocho semanas, dependiendo de la naturaleza y las características de la selección particular utilizada. Después del periodo de selección, el callo resultante se transfiere a medios de maduración del embrión, hasta que se observa la formación de embriones somáticos maduros. Los embriones somáticos maduros resultantes se colocan a continuación en condiciones de baja luz, y el proceso de regeneración

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2