TWI794860B - 用於培養甲基菌屬的培養基及培養方法 - Google Patents

用於培養甲基菌屬的培養基及培養方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種利用甲基菌發酵生產吡咯喹啉醌的培養基及培養方 法，培養基中含有特定濃度的甲醇作為主要碳源、硫酸銨作為主要氮源，以及在培養過程中精確控制pH值、轉速、溫度、溶氧、饋料時機及置換時機、成分、比例等參數，利於實現自動控制和連續發酵。

Description

用於培養甲基菌屬的培養基及培養方法
本發明涉及一種培養基成分及培養方法，特別是用於培養甲基菌的培養基及培養方法。
吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)是細菌脫氫酶中的一種氧化還原輔助因子，又是一種抗氧化劑，能避免細胞內氧化反應以及體外生物活性物質產生活性氧導致的細胞損傷，為細胞的生長發育提供營養與維生素，同時使細胞具有抗氧化的耐受性，因此PQQ常用來作為保健食品的成分。
目前PQQ主要以化學合成取得，而以微生物自然生產具有清潔低碳、溫和可控、成本低廉等優勢，是一種極具潛力的生產方式。影響微生物發酵生產PQQ大規模應用的主要因素有：(1)適合於工業生產的微生物不多；(2)PQQ生產菌株生產週期長，產率不高；(3)PQQ作為一種輔酶，並不是微生物的次級代謝產物，其合成調控受限於培養條件和代謝調控。
為了解決上述問題，本發明提供一種能增加菌量及PQQ產量的培養基及培養方法，實現利用甲基菌高效生產PQQ的目的。
本發明一種用於培養甲基菌的培養基，其成分包含：1~3%甲醇；0.5~2.5g/L硫酸銨；以及其中該培養基的pH值為7~9。
其中，本發明提供一種利用上述培養基培養甲基菌的方法，包含：將一甲基菌接種至含有該培養基的一培養容器中，以形成一發酵液；以及將該培養容器置於溫度為30~35℃的環境中，並以100~200rpm轉速搖晃該培養容器培養10日。
本發明另提供一種甲基菌的培養方法，包含：將一甲基菌接種至含有包含0.5~2.5g/L硫酸銨且pH值為7~9的一培養基的一培養容器中，以形成一發酵液；將該培養容器置於溫度為30~35℃的環境中，並以100~200rpm轉速搖晃該培養容器進行培養；培養至4~8日時添加1~3%甲醇至該發酵液中；以及持續培養至10日。
圖1-1及圖1-2為甲醇對於菌體生長及PQQ產量影響之長條圖。
圖2-1及圖2-2為硫酸銨對於菌體生長及PQQ產量影響之長條圖。
圖3-1及圖3-2為硫酸鎂對於菌體生長及PQQ產量影響之長條圖。
圖4-1及圖4-2為氯化鐵對於菌體生長及PQQ產量影響之長條圖。
圖5-1及圖5-2為轉速對於菌體生長及PQQ產量影響之長條圖。
圖6-1及圖6-2為溫度對於菌體生長及PQQ產量影響之長條圖。
圖7-1及圖7-2為pH值對於菌體生長及PQQ產量影響之長條圖。
圖8-1及圖8-2為通氣量對於菌體生長及PQQ產量影響之曲線圖。
圖9-1、圖9-2及圖9-3為饋料成分對於菌體生長及PQQ產量影響之曲線圖。
圖10-1、圖10-2及圖10-3為饋料時機對於菌體生長及PQQ產量影響之曲線圖。
圖11-1及圖11-2為pH值恆定對於菌體生長及PQQ產量影響之長條圖。
圖12-1及圖12-2為溶氧量對於菌體生長及PQQ產量影響之長條圖。
圖13-1及圖13-2為置換成分對於菌體生長及PQQ產量影響之曲線圖。
圖14-1及圖14-2為置換比例對於菌體生長及PQQ產量影響之曲線圖。
圖15-1、圖15-2及圖15-3為置換週期對於菌體生長及PQQ產量影響之曲線圖。
圖16-1及圖16-2為酵母抽出物對於菌體生長及PQQ產量影響之長條圖。
圖17為綜合置換時機、成分、比例及週期對於菌體生長及PQQ產量影響之曲線圖。
以下各實施例配合圖式，用以說明本發明之精神，讓本技術領域之人士能清楚理解本發明之技術，但非用以限制本發明的範圍，本發明之專利權範圍應由請求項界定。特別強調，圖式僅為示意之用，並非代表元件實際之尺寸或數量，部份細節可能也不完全繪出，以求圖式之簡潔。
本發明提供一種用於培養甲基菌的培養基，其成分包含1~3%甲醇(Methanol)、0.5~2.5g/L硫酸銨((NH4)2SO4)、100~300mg/L硫酸鎂(MgSO4)、0.05~2mg/L氯化鐵(FeCl3)及1~5g/L酵母抽出物，其中培養基的pH值為7~9。在較佳實施例中，其成分包含2~3%甲醇、1~2g/L硫酸銨、200~300mg/L硫酸鎂、1~2mg/L氯化鐵及1~3g/L酵母抽出物。
在其他實施例中，培養基的氮源除了硫酸銨及酵母抽出物，更可選自以下其中一或二種以上進行組合，其濃度皆為2g/L：硝酸鈉(NaNO3)、硝酸銨(NH4NO3)、肉類蛋白腖(meat peptone)、豆類蛋白腖(soy peptone)、硝酸鈣(CaNO3)、氯化銨(NH4Cl)及脫脂牛奶(Skim milk)。培養基的金屬離子來源，除了硫酸鎂及氯化鐵，更可選自以下其中一或二種以上進行組合：0.05g/L氯化鈣(CaCl2)、5μg/L硫酸銅(CuSO4)、10μg/L硫酸錳(MnSO4)、10μg/L鉬酸鈉(Na2MoO4)、10μg/L硼酸(H3BO3)、70μg/L硫酸鋅(ZnSO4)及5μg/L氯化鈷(CoCl2)。
本發明提供一種利用上述任一實施例的培養基培養甲基菌的方法，包含將甲基菌接種至含有該培養基的培養容器中以形成發酵液，以及將培養容器置於溫度為30~35℃的環境中，並以100~200rpm轉速搖晃培養容器培養10日。
本發明提供另一種甲基菌的培養方法，包含將甲基菌接種至含有包含0.5~2.5g/L硫酸銨且pH值為7~9的培養基的培養容器中，以形成發酵液，將培養容器置於溫度為30~35℃的環境中，並以100~200rpm轉速搖晃培養容器進行培養，培養至4~8日時添加1~3%甲醇至該發酵液中，再持續培養至10日。
其中上述所使用的甲基菌可選自Hyphomicrobium sp.BR-1、Methylobacterium extorquens BR-2、Methylophilus methylotrophus BR-3、Methylobacterium sp.BR-4、Hyphomicrobium methylovorum BR-5、Hyphomicrobium sp.BR-6或其組合，該些菌株是由財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心提供。
在較佳實施例中，可選擇性地及將0.3~1vvm(air volume/culture volume/min)的空氣通氣至培養容器中進行培養，使發酵液的溶氧量(Dissolved oxygen,DO)維持在20~40%。
依上述任一培養方法培養10日後，(1)以新培養基置換25~75%的發酵液，再培養6日；(2)依2、4或6日的置換週期以新培養基置換25~75%的發酵液，再培養12日，其中，可選擇地依2日的置換週期更添加1~5g/L酵母抽出物於發酵液。經上述實施例的培養方法，可快速且持續地增加菌量(Biomass)及PQQ產量，適用於大規模生產製程。
以下為相關參數實驗結果：
甲醇濃度：
利用250mL錐形瓶進行Methylobacterium sp.BR-4分別培養於含有1、1.5、2、2.5、3%甲醇濃度之PQQ產量測試，培養條件包括10%接菌量、工作體積為100mL的MMS(Methanol mineral salt)培養基、200rpm、溫度30℃及初始pH 7。培養10天後，從圖1-1及圖1-2可知添加1~3%甲醇對於菌體生長無任何抑制情形，但當添加2~3%甲醇則明顯有助於PQQ產量的提升。
硫酸銨濃度：
利用250mL錐形瓶進行Methylobacterium sp.BR-4培養於0.5、1、1.5、2、2.5g/L硫酸銨濃度之PQQ產量測試，培養條件包括10%接菌量、工作體積為100mL的MMS培養基、200rpm、溫度30℃及初始pH 7。培養10天後，從圖2-1及圖2-2可看出隨著硫酸銨添加濃度的增加，菌體生長隨著增加，顯示硫酸銨的添加有助於菌體生長，其中又以添加1~2g/L硫酸銨明顯有助於PQQ產量的提升。
硫酸鎂濃度：
利用250mL]錐形瓶進行Methylobacterium sp.BR-4培養於100、150、200、300mg/L硫酸鎂濃度之PQQ產量測試，培養條件包括10%接菌量、工作體積為100mL的MMS培養基、200rpm、溫度30℃及初始pH 7。培養10天後，從圖3-1及圖3-2可知添加100~300mg/L硫酸鎂對於菌體生長無任何抑制情形，當添加200~300mg/L硫酸鎂有助於PQQ產量提升。
氯化鐵濃度：
利用250mL錐形瓶進行Methylobacterium sp.BR-4培養於0.05、0.5、1、1.5、2mg/L氯化鐵濃度之PQQ產量測試，培養條件包括10%接菌量、 工作體積為100mL的MMS培養基、200rpm、溫度30℃及初始pH 7。培養10天後，從圖4-1及圖4-2可知添加0.05~2mg/L氯化鐵對於菌體生長無任何抑制情形，當添加1~2mg/L氯化鐵有助於PQQ產量提升。
轉速：
利用250mL錐形瓶進行Methylobacterium sp.BR-4培養於轉速50、100、150、200rpm之PQQ產量測試，培養條件包括10%接菌量、工作體積為100mL的MMS培養基、溫度30℃及初始pH 7。培養10天後，從圖5-1及圖5-2可知提升轉速有助於菌體生長和PQQ生產，當100~200rpm有助於PQQ產量的提升。
溫度：
利用250mL錐形瓶進行Methylobacterium sp.BR-4培養於溫度20、25、30、35℃之PQQ產量測試，培養條件包括10%接菌量、工作體積為100mL的MMS培養基、200rpm及初始pH 7。培養10天後，從圖6-1及圖6-2可知升高培養溫度有利於菌體生長，當30~35℃較合適於菌體生長和PQQ產量的提升。
pH值：
利用250mL錐形瓶進行Methylobacterium sp.BR-4培養於初始MMS培養基pH 5、7、9、11之PQQ產量測試，培養條件包括10%接菌量、工作體積為100mL的MMS培養基200rpm及30℃。培養10天後，從圖7-1及圖7-2可知pH 7~9有助於菌體生長，PQQ產量與菌體生長之趨勢相同，皆是以pH 7~9有助於PQQ生產。
根據上述參數種類，進行PQQ最適化條件試驗，利用250mL錐形瓶進行Methylobacterium sp.BR-4培養於含有2.24%甲醇、2.01g/L硫酸銨、254.8mg/L硫酸鎂及1.56mg/L氯化鐵之MMS培養基，培養條件包括10%接菌量、工作 體積為100mL的MMS培養基、200rpm及初始pH 7。培養10天後，可發酵生產最大PQQ濃度為127.7±14mg/L，與PQQ產量預測值誤差為5.5%。
通氣量：
利用5L發酵槽進行Methylobacterium sp.BR-4培養於0.3、0.6、1vvm通氣量進行PQQ產量測試，培養條件包括10%接菌量、工作體積為3L的MMS培養基、150rpm、溫度30℃及初始pH 7。從圖8-1及圖8-2可知隨著通氣量增加，菌體生長也隨之增加，而PQQ生產量與菌體生長呈正相關，以0.6~1vvm通氣量具有較高的PQQ的生產量。
饋料成分：
利用5L發酵槽進行Methylobacterium sp.BR-4培養於不同的饋料成分包括0.75%甲醇、0.75%甲醇和硫酸銨，以及1.5%甲醇進行PQQ產量測試，分別為圖9-1、圖9-2及圖9-3，培養條件包括10%接菌量、工作體積為3L的MMS培養基、0.6vvm、150rpm、溫度30℃、初始pH7及培養第六天添加饋料。當饋料成分為0.75%甲醇時，可明顯看出菌體生長較其他饋料成分低，推測是因為MMS培養基中其他的金屬成分累積造成菌體生長受到抑制；當饋料成分為0.75%甲醇和硫酸銨時，菌體生長和PQQ產量略低於1.5%甲醇，顯見添加碳源和氮源皆有助於菌體生長和PQQ生產，又以添加操作最簡易的1.5%甲醇作為饋料成分所獲得的菌體生長和PQQ產量為最佳。
饋料時機：
利用5L發酵槽進行Methylobacterium sp.BR-4以1.5%甲醇作為饋料成分，培養於不同饋料時機包括第四天、第六天及第八天條件下進行PQQ產量測試，分別為圖10-1、圖10-2及圖10-3，培養條件包括10%接菌量、工作體積為3 L的MMS培養基、0.6vvm、150rpm、溫度30℃及初始pH 7。不論第四天、第六天及第八天的饋料對於菌體生長皆沒有明顯的差異，PQQ產量以第六天饋料為最佳，不同饋料時機主要造成單位菌體的PQQ產率，可明顯看出第四天和第八天饋料時機所獲得的單位菌體的PQQ生產量明顯低於第六天饋料。
pH值之恆定：
利用5L發酵槽進行Methylobacterium sp.BR-4培養於不控制pH值及以氫氧化鈉(NaOH)控制pH值維持8.5之PQQ產量測試，培養條件包括10%接菌量、工作體積為3L的MMS培養基、培養第6天饋料1.5%甲醇、0.9vvm、160rpm及溫度30℃。培養10天後，從圖11-1及圖11-2可知將pH值維持於8.5有助於菌體生長及PQQ生產。
根據上述參數種類，進行5L規模之PQQ最適化條件試驗，利用5L發酵槽進行Methylobacterium sp.BR-4進行培養，培養條件包括10%接菌量、工作體積為3L的MMS培養基、培養第6天饋料1.5%甲醇、0.9vvm、160rpm及初始pH 8.5。培養10天後，可發酵生產最大PQQ濃度為229.5±15.2mg/L，與PQQ產量預測值誤差為6%。
溶氧量：
利用5L發酵槽進行Methylobacterium sp.BR-4培養於不控制溶氧量及控制溶氧量維持20及40%之PQQ產量測試，培養條件包括10%接菌量、工作體積為3L的MMS培養基、培養第6天饋料1.5%甲醇、0.9vvm、160rpm及溫度30℃。培養10天後，從圖12-1及圖12-2可知將溶氧量維持於20%有助於菌體生長及PQQ生產。
置換成分：
利用5L發酵槽進行Methylobacterium sp.BR-4培養於不置換培養基及培養10天後置換50%培養基之PQQ產量測試，培養條件包括10%接菌量、工作體積為3L的MMS培養基、培養第6天饋料1.5%甲醇、0.9vvm、160rpm、pH8.5及溫度30℃。從圖13-1及圖13-2可知置換50%培養基並培養6天後可達到置換前的菌量及PQQ產量。
置換比例：
利用5L發酵槽進行Methylobacterium sp.BR-4培養於不置換培養基、及培養10天後置換25%、50%及75%培養基之PQQ產量測試，培養條件包括10%接菌量、工作體積為3L的MMS培養基、培養第6天饋料1.5%甲醇、0.9vvm、160rpm、pH8.5及溫度30℃。從圖14-1及圖14-2可知置換50%培養基並培養6天後可達到置換前的菌量及PQQ產量。
置換週期：
利用5L發酵槽進行Methylobacterium sp.BR-4培養，於培養第10天置換50%培養基後，再於每2、4、6天置換50%培養基之PQQ產量測試，培養條件包括10%接菌量、工作體積為3L的MMS培養基、培養第6天饋料1.5%甲醇、0.9vvm、160rpm、pH8.5及溫度30℃。依各置換週期再培養12天後，從圖15-1、圖15-2及圖15-3可知置換週期的天數越少，菌量和PQQ產量越高，其中又以6天的置換週期可獲得最大菌體單位的PQQ生產量41.8mg PQQ/g。
酵母抽出物：
利用250mL錐形瓶進行Methylobacterium sp.BR-4培養於0、1、3、5g/L酵母抽出物濃度之PQQ產量測試，培養條件包括10%接菌量、工作體積為100mL的MMS培養基、200rpm及溫度30℃。培養10天後，從圖16-1及圖16-2可 知添加0~5g/L酵母抽出物些微增加菌體生長，當添加1~3g/L酵母抽出物有助於PQQ產量提升。
置換時機、成分、比例及週期：
利用5L發酵槽進行Methylobacterium sp.BR-4培養，於培養第10天置換50%培養基後，再於每6天置換50%培養基及每2天添加2g/L酵母抽出物之PQQ產量測試，培養條件包括10%接菌量、工作體積為3L的MMS培養基、培養第6天饋料1.5%甲醇、0.9vvm、160rpm、恆定pH8.5及溫度30℃。依上述置換週期再培養12天後，從圖17可知每2天饋入酵母抽出物和每6天以培養基置換50%發酵液可生產最大量315.5mg/L PQQ。
本發明提供的培養基成分及其濃度可明顯地增加甲基菌生長及PQQ產量，本發明更提供多種參數條件可最適化及最大化增加菌量及PQQ產量，且可應用於大規模量產製程。

Claims (12)

  1. 一種用於培養Methylobacterium sp.BR-4的培養基，其成分包含：1~3%甲醇；0.5~2.5g/L硫酸銨；以及1~2mg/L氯化鐵；其中該培養基的pH值為7~9。
  2. 如請求項1所述之培養基，其中甲醇濃度為2~3%及硫酸銨濃度為1~2g/L。
  3. 如請求項1所述之培養基，更包含選自以下其中一或二種以上進行組合的金屬離子來源：100~300mg/L硫酸鎂、0.05g/L氯化鈣、5μg/L硫酸銅、10μg/L硫酸錳、10μg/L鉬酸鈉、10μg/L硼酸、70μg/L硫酸鋅及5μg/L氯化鈷。
  4. 如請求項1所述之培養基，更包含選自以下其中一或二種以上進行組合的氮源：1~5g/L酵母抽出物、2g/L硝酸鈉、2g/L硝酸銨、2g/L肉類蛋白腖、2g/L豆類蛋白腖、2g/L硝酸鈣、2g/L氯化銨及2g/L脫脂牛奶。
  5. 如請求項3或4所述之培養基，其中硫酸鎂濃度為200~300mg/L及酵母抽出物濃度為1~3g/L。
  6. 一種利用如請求項1所述之培養基培養Methylobacterium sp.BR-4的方法，包含：將Methylobacterium sp.BR-4接種至含有該培養基的一培養容器中，以形成一發酵液；以及 將該培養容器置於溫度為30~35℃的環境中，並以100~200rpm轉速搖晃該培養容器培養10日。
  7. 一種Methylobacterium sp.BR-4的培養方法，包含：將Methylobacterium sp.BR-4接種至含有包含0.5~2.5g/L硫酸銨、1~2mg/L氯化鐵且pH值為7~9的一培養基的一培養容器中，以形成一發酵液；將該培養容器置於溫度為30~35℃的環境中，並以100~200rpm轉速搖晃該培養容器進行培養；培養至4~8日時添加1~3%甲醇至該發酵液中；以及持續培養至10日。
  8. 如請求項6或7所述之方法，更包含將0.3~1vvm的空氣通氣至該培養容器中。
  9. 如請求項8所述之方法，其中該發酵液的溶氧量為20~40%。
  10. 如請求項6或7所述之方法，更包含在培養10日後，以一新培養基置換25~75%的該發酵液，再培養6日。
  11. 如請求項6或7所述之方法，更包含在培養10日後，依2、4或6日的置換週期以一新培養基置換25~75%的該發酵液，再培養12日。
  12. 如請求項11所述之方法，更包含每2日添加1~5g/L酵母抽出物至該發酵液。
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