TWI785245B

TWI785245B - 蟬花的液態培養方法

Info

Publication number: TWI785245B
Application number: TW108118847A
Authority: TW
Inventors: 吳建一; 李坤緯; 林憶茜
Original assignee: 大葉大學
Priority date: 2019-05-30
Filing date: 2019-05-30
Publication date: 2022-12-01
Also published as: TW202043454A

Abstract

本發明提供一種蟬花的液態培養方法，其包含：培養蟬花菌種於液態培養基，且蟬花菌種的序列如SEQ ID NO：1所示，以獲得蟬花菌種的菌絲體；其中，液態培養基包含基礎培養基。

Description

蟬花的液態培養方法

本發明係關於一種蟬花的液態培養方法，特別是關於一種使用液培養基進行培養之蟬花的液態培養方法。

隨著醫療科技的發展，除了西藥之外，傳統的中醫藥材也成為熱門話題。文獻指出，冬蟲夏草是一種在台灣廣受歡迎的傳統中藥，其作為藥物進行治療已經有超過數百年的歷史。

然而，近幾年來冬蟲夏草的產量不但呈現了下降的趨勢，而且取得來源也開始加以限制，因此冬蟲夏草的替代材料，或是其他蟲草物種的發展備受關注。因此，由於蟬花(C.cicadae)與冬蟲夏草一樣具有良好的藥理活性，相應地受到關注。

是以，為了避免將來長期過度採收野生的蟬花，將導致野生的蟬花在市場上呈現了類似於冬蟲夏草的供不應求的情形發生。仍需要一種能夠減少培養時間、降低野外細菌汙染比率之蟬花的液態培養方法。

鑒於上述問題，本發明提供一種蟬花的液態培養方法，其包含：培養蟬花菌種於液態培養基，且蟬花菌種的序列如SEQ ID NO：1所示，以獲得蟬花菌種的菌絲體；其中，液態培養基包含基礎培養基。

可選地，基礎培養基包含碳源，且碳源包含葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、糊精、羧甲基纖維素、可溶性澱粉、甘露醇、或其組合。

可選地，碳源佔基礎培養基之總體積比的0.5%~5%。

可選地，基礎培養基包含氮源，且氮源包含蛋白腖、酵母萃取物、麥芽萃取物、牛肉萃取物、酪蛋白、硝酸鈉、硝酸鉀、硫酸銨、或其組合。

可選地，氮源佔該基礎培養基之總體積比的0.1%~3%。

可選地，基礎培養基包含礦物元素，且礦物元素包含硫酸鎂、硫酸鈣、硫酸亞鐵、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、硫酸鎳、或其組合。

可選地，蟬花之該菌絲體的生物質含量為2~9g/L。

可選地，該蟬花之該菌絲體的尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷含量分別為0.5~3mg/mg、0.05~0.6mg/mg、0.02~0.9mg/mg及0.1~2.91mg/mg。

可選地，蟬花之總類黃酮及總酚含量分別為0.1~37mg/mg及1.5~25mg/mg。

本發明之蟬花的液態培養方法具有下述優點：

(1)由於本發明之蟬花為Cordyceps cicadae Wu-BFP14(SEQ ID NO：1)，因此能夠獲得有別於習知之蟬花不同比例的萃取物。

(2)相對於於野外培養蟬花，本發明之蟬花的液態培養方法可以達到減少培養時間、降低野外細菌汙染比率、提升蟬花菌絲體的形態穩定性之目的。

(3)此外，由於本發明之蟬花的液態培養方法能夠藉由調整培養時間、培養濕度、碳源種類、氮源種類、礦物元素等參數來調整萃取液所獲之成分的高低，因此係為一種能夠依據需求而調整的培養方法。

S10~S20:步驟

第1圖係為本發明之培養方法的流程示意圖。

第2圖係為本發明之蟬花影像圖。

第3圖係為本發明之蟬花固態培養圖。

第4圖係為本發明之蟬花液態培養圖。

第5圖係為本發明之蟬花固態培養圖。

第6圖至第8圖，其係為本發明之實例1至實例11之分析圖。

第9圖至第11圖，其係為本發明之實例12至實例21之分析圖。

第12圖至第14圖，其係為本發明之實例22至實例30之分析圖。

第15圖至第18圖，其係為本發明之實例31至實例28之分析圖。

第19圖至第22圖，其係為本發明之實例39至實例45之分析圖。

第23圖至第26圖，其係為本發明之實例46至實例53之分析圖。

第27圖至第30圖，其係為本發明之實例54至實例73之分析圖。

為使上述目的、技術特徵及實際實施後之效益更易於使本領域具通常知識者所理解，將於下文中以實施例搭配圖式更詳細地說明。

參照第1圖，其係為本發明之液態培養方法的流程示意圖。

步驟S10中，培養蟬花菌種於液態培養基。其中蟬花菌種為Cordyceps cicadae Wu-BFP14，且其序列如SEQ ID NO：1所示。

液態培養基可包含碳源。碳源可包含葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、糊精、羧甲基纖維素、可溶性澱粉及甘露醇、或其組合。較佳地，碳源佔基礎培養基之總體積比的0.5%~5%，更佳地為1%~3%。

液態培養基可包含氮源。氮源可包含蛋白腖、酵母萃取物、麥芽萃取物、牛肉萃取物、酪蛋白、硝酸鈉、硝酸鉀、硫酸銨、或其組合。較佳地，氮源佔基礎培養基之總體積比的0.1%~3%，更佳地為0.3~0.8%。

液態培養基可包含礦物元素。礦物元素可包含硫酸鎂、硫酸鈣、硫酸亞鐵、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、硫酸鎳、或其組合。

在一實施例中，蟬花之菌絲體的生物質含量為2~9g/L。在一實施例中，蟬花之菌絲體的尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷含量分別為0.5~3mg/mg、0.05~0.6mg/mg、0.02~0.9mg/mg及0.1~2.91mg/mg。在一實施例中，蟬花之總類黃酮及總酚含量分別為0.1~37mg/mg及1.5~25mg/mg。

步驟S20中，獲得蟬花菌種的菌絲體。較佳地，培養時間為7~14，更佳地為7~9。較佳地，培養溫度為20~32，更佳地為23~28。較佳地，培養溼度為100。

以下針對各實例進行詳細地描述。

研究方法

1.1菌種篩選

本發明選用之蟬花菌種由台灣三峽山區自行篩選，將篩選所得之菌種進行培養，並收集其菌絲體，接著抽取其基因組DNA，利用PCR技術將DNA 擴增。經選殖及解序後，將其序列與NCBI基因庫中的其它種蟬花菌種進行BLAST比對。與本發明進行比較之蟬花菌種包含習知之KF740422、KF373077、EU807996、KJ173474、FJ765285、KJ173475、FJ765283、KJ173461、FJ765282、AB916360、KP771879、AY245627、KJ857272、EU573331、JQ283963、EU573333、AB086631、FJ765284、KJ173448、FJ765280、JX488475及KJ173447的蟬花菌種。

1.2蟬花菌絲體之液態培養

將培養皿之蟬花菌絲體，取一片直徑5mm之菌片，接入已滅菌之液態培養基，探討像是不同環境因子、碳源種類與濃度、氮源種類與濃度及微量元素等參數對於蟬花菌株生長的影響。其流程為：使用管徑5mm之金屬管從菌盤接菌(接菌量為一片直徑5mm之菌片)至內含培養基之125mL平底錐形瓶，以28℃於130rpm恆溫震盪培養，接者以孔徑0.45μm的濾紙將菌絲過濾並烘乾。接著，可進行分裝及凍菌等步驟。

1.3菌種活化

將凍菌後的菌種重新接菌至含有馬鈴薯葡萄糖培養基(Potato dextrose agar，PDA)的培養皿中培養，再將銑刀在已長菌落的培養皿上切出2個直徑1cm的PDA，接種至250mL菌種液態活化培養基中，以25℃於150rpm恆溫震盪培養箱培養7天。其中，液態活化培養基為馬鈴薯葡萄糖培養基(Potato Dextrose Broth，PDB)。

1.4不同碳源

以上述活化培養基配方為基底，分別以未添加任何碳源及添加2%的不同碳源進行分析。其中，碳源包含葡萄糖(Glucose，Glu)、果糖(Fructose，Fru)、木糖(Xylose，Xyl)、蔗糖(Sucrose，Sur)、麥芽糖(Maltose，Mal)、乳糖(Lactos， Lac)、糊精(Dextrin，Dex)、羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose，CMC)、可溶性澱粉(Soluble Starch，SS)及甘露醇(Mannitol，Man)。其中，培養時間為7天~14天；培養溫度為23℃~28℃；培養濕度為100%。

1.5不同氮源

以葡萄糖為碳源為比較，分別添加0.5%的不同氮源進行分析。其中，氮源包含像是蛋白腖(Peptone，PT)、酵母萃取物(Yeast extract，YT)、麥芽萃取物(Malt Extract，ME)、牛肉萃取物(Beef extract，BE)及酪蛋白(Casein，Cas)之有機氮源以及像是硝酸鈉(Sodium nitrate，SN)、硝酸鉀(Potassium nitrate，PN)、硫酸銨(Ammonium sulfate，AS)、亞硝酸鈉(Sodium nitrite)及尿素(Urea)之無機氮源。其中，培養時間為7天~14天；培養溫度為23℃~28℃；培養濕度為100%。

另外，由於礦物元素也是菌絲體生長的一個主要元素，因此選用葡萄糖(Glucose，Glu)及酵母萃取物(Yeast extract，YT)作為碳、氮源並分別添加2mM濃度之硫酸鎂(MgSO₄)、硫酸鈣(CaSO₄)、硫酸亞鐵(FeSO₄)、硫酸鐵(Fe₂(SO₄)₃)、硫酸錳(MnSO₄)、硫酸鋅(ZnSO₄)、硫酸銅(CuSO₄)、硫酸鎳(NiSO₄)及5mM硫酸鎂的礦物元素進行分析。其中，培養時間為7天~14天；培養溫度為23℃~28℃；培養濕度為100%。

1.6蟬花固態培養

將經前述液態培養之蟬花菌株液態菌種，取固態培養基質總體積10%菌液接入已滅菌之不同的穀物中，其中，穀物包含像是紅豆(RB)、綠豆(GB)、黃豆(YB)、黑豆(BB)、米豆(MB)之豆類穀物、像是紅薏仁(RY)、白薏仁(WY)、糙米(RR)、白米(WR)、紫米(PR)、小米(MR)、十穀米(Ten)之米類穀物、像是紅藜(TR)、祕魯藜(MUR)、燕麥(YM)、麥片(OL)、小麥(MM)、蕎麥(CM)之藜麥類穀物、以及像是高粱(H)、玉米(PC)之其他穀物。

1.7不同光照強度

取30g小麥為固態培養基質，添加1：1.5固液比的培養基滅菌後接入5%液態菌種，先以暗室培養至表面長出白色菌絲體，轉置不同光強度(0、50、100、250、500、1000及1500Lux)，於25℃恆溫培養42天。

1.8不同光源

取45g小麥為固態培養基質，添加1：2固液比的培養基滅菌後接入5%液態菌種，先以暗室培養至表面長出白色菌絲體，轉置不同光源於25℃恆溫培養42天。其中，光源為微型組織培養系統(MEL，Mini E Light，光茵生物科技)之5種不同光質冷光螢光燈(Cw)、100%紅光、70%紅光與30%藍光、30%紅光與70%藍光、及100%藍光之發光二極體光源，且光源的光源參數如表1所示。

將以上參數示於表2及表3。其中，「--」代表未添加。

1.9萃取方法

以1g蟬花菌絲體或者固態培養乾燥後粉末，加入溶劑進行萃取，再以9000rpm離心10分鐘，取上清液作為萃取液。其中，溶劑可為去離子水、酒精、酸液或鹼液。

1.10樣品處理

取1g凍乾後之菌絲體加入10mL蒸餾水中，置於121℃的高壓滅菌釜中進行熱水萃取20min，過濾得其萃取液。將培養液之上清液(萃取方法所述之上清液)及胞內之萃取液(菌絲體經過萃取後之萃取液)經0.45μm微孔過濾膜過濾，以HPLC分析。

2.1多醣含量分析

取0.5mL的樣品，加入0.5mL苯酚(Phenol，10%，v/w)，再加入2.5mL硫酸(Sulfuric acid，36N)混合均勻於室溫反應10分鐘，將其置於25℃水中降溫反應15分鐘，將反應後樣品以吸光光譜波長490nm進行紀錄。

2.2蟲草素及腺苷含量分析

各取蟲草素及腺苷標準品10mg，溶於10mL甲醇(Methanol，15%)，以高效能液相層析(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)分析以分別製作檢量線，再將蟲草素及腺苷的波峰面積代入線性回歸方程式，而獲得其兩者之濃度。

2.3尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷含量分析

分別製備尿嘧啶(Uracil)、尿苷(Uridine)、腺嘌呤(Adenine)和腺苷(Adenosine)標準品溶於10mL去離子水，並以高效能液相層析分析以分別製作檢量線。HPLC的操作條件如下：管柱為Phenomenex Luna 5μ C18 100A；移動相(Mobile phase)為0.02M磷酸二氫鉀(KH₂PO₄)：甲醇Methanol(85：15)；流速0.8mL/min；使用波長254nm之UV偵測器；且注射量為20μ。

2.4總酚(Total phenolics content，TPC)含量

取1mL樣品溶液，加入1mL之Folin-Ciocalteu試劑震盪混合反應3分鐘，接著添加1mL碳酸鈉(Sodium carbonate，10%，v/w)，於室溫下避光反應30分鐘，以吸光光譜波長735nm進行紀錄。以沒食子酸(Gallic acid)為標準品，並製作檢量線，利用內插法求得每克樣品當中相對沒食子酸當量(Gallic acid equivalent，GAE mg/g)，表示樣品中之酚類化合物的總量。

2.5總類黃酮(Total flavonoids content，TFC)含量

取250μL樣品溶液，加入1.25mL去離子水和75μL亞硝酸鈉(NaNO₂，5%，v/w)，混合反應6分鐘，加入150μL氯化鋁(AlCl₃，10%，v/w)，混合反應5分鐘，再加入0.5mL之1M氫氧化鈉(NaOH)及275μL去離子水，並利用高速離心機以9,000rpm離心3分鐘，取上清液以吸光光譜波長510nm進行紀錄。以槲皮素(Quercetin)標準品並製作檢量線，利用內插法求得每克樣品當中相對槲皮素當量(Quercetin equivalent，QE mg/g)，表示樣品中之類黃酮化合物的總量。

結果討論

3.1蟬花的形態特徵

參照第2圖，其係為本發明之蟬花影像圖。其中，(a)部分代表野生蟬花全貌；(b)部分代表子實體；(c)部分代表蟲體；(d)部分代表子實體顯微鏡照；(e)部分代表子實體顯微鏡照；(f)部分代表子實體顯微鏡照；(g)部分代表子實體顯微鏡照；(h)部分代表菌絲體顯微鏡照；以及(i)部分代表菌絲體顯微鏡照。

本發明所揭露之蟬花係為從台灣山區的竹林採集後分離的蟬花純菌種之台灣本土性大蟬花。新鮮的蟬花表面由白色或是灰白色的菌絲所包覆，乾燥後會變成淺黃至棕褐的顏色，蟲體除了表皮、複眼和三對胸足的型態未改變外，全部的器官都會被菌絲所包覆，構成了大小約3公分，直徑約1-1.1公分的長橢圓菌核。菌核在生長出3-4個長度約4-10公分鹿角型或是棒狀型的分支。由光學顯微鏡觀察野生蟬花子實體，可以發現在蟬花子實體部分呈現了許多的分支，並存在著橢圓形的分生孢子，而在蟬花蟲體中，只發現許多的絲狀構造存在。

參照第3圖，其係為本發明之蟬花固態培養圖。其中，(a)部分代表平板培養；(b)部分代表平板培養特寫；(c)部分代表菌絲體顯微鏡照；以及(d)部分代表菌絲體顯微鏡照。

將蟬花子實體培養在PDA培養皿10天過後，就可以長出直徑約6-8公分，白色至灰白色氈狀至絨毛狀的蟬花菌絲體，而菌落的背面呈現放色狀溝紋的半黃色至橘黃色菌絲，蟬花的菌絲內壁光滑的透明管狀，呈現許多稠密且不規則的分支，而這些分支的粗大約為2.0μm-3.5μm。

參照第4圖，其係為本發明之蟬花液態培養圖。其中，(a)部分代表液態搖瓶培養；(b)部分代表平板培養；(c)部分代表液態搖瓶培養特寫；(d)部分代表菌絲體顯微照；(e)部分代表菌絲體顯微照；(f)部分代表菌絲體顯微照；(g)部分代表菌絲體顯微照；(h)部分代表菌絲體顯微照；以及(i)部分代表菌絲體顯微照。

蟬花利用液態培養過後，會從淺黃色的培養基逐漸轉成淡粉色至淡紫色的培養液，利用光學微鏡觀察可以發現蟬花液態醱酵的菌絲體，在低倍率下，呈現了密密麻麻如頭髮結構形狀的細絲，再隨著倍率放大到500倍後可以發現，蟬花液態培養菌絲與在培養皿上培養的蟬花菌絲型態相似，具內壁光滑的透明管狀，呈現許多稠密且不規則的分支，而這些分支的粗大約為1.5μm-3.0μm，較蟬花培養皿細小，但是密度高於蟬花培養皿菌絲。將液態培養培養基靜置1到2周的時間後，培養基表面變化形成薄薄一層的蟬花菌絲膜，以光學顯微鏡觀察菌絲膜表面可以發現菌絲膜表面具有相當多層次絲狀結構，而隨著顯微鏡的倍率放大可以逐漸可以發現密麻麻如頭髮結構形狀的透明細絲，放大到500倍後，同樣的可以發現與菌絲體和培養皿的菌絲型態相似，具內壁光滑的透明管狀，呈現許多稠密且不規則的分支，而這些分支的粗大約為5.0μm-10μm。

參照第5圖，其係為本發明之蟬花固態培養圖。其中，(a)部分代表蟬花固態培養；(b)部分代表子實體特寫；(c)部分代表基底頗面特寫；(d)部分代表子實體顯微照；以及(e)部分代表菌絲體顯微照。

將蟬花菌種接種於五穀雜糧當中，大約培養1到2個月的時間，就可以配養出人工固態培養子實體及菌絲體，經由人工培養的子實體與野生子實體一樣新鮮的子實體外觀呈現白色或是灰白色，長度約為4-10公分，粗度約為0.1-0.5公分，乾燥後會變成淺黃色至棕褐色，但子實體的長度和粗度會明顯的萎縮。進一步的利用光學顯微鏡觀察，可以發現人工子實體呈現多層次的結構，而在子實體周圍可以觀察到些許多菌絲的分佈。在人工菌絲體上與野生蟬體有相似的結果具有多層次的絲狀構造存在。

3.2蟬花之菌種鑑定

此本土性大蟬花先以外觀型態判定，並分別進行液態培養及固態培養。一般真菌的分類以核糖體DNA為主，針對18SRrna基因、5.8Rrna基因、或是28SRrna基因核糖體DNA在真菌上有非常高的保留性，主要用於科屬以上分類的研究。而5.8S Rrna基因分別與18S及28S Rrna基因間各有一個內轉錄間隔區(internal transcribed spacer，ITS)，分為ITS1及ITS2，而ITS1及ITS2進化速率較快，在同屬不同種的基因序列會有明顯的不同。所以針對蟬花菌株的ITS序列進行分析，並將其ITS序列與基因資料庫(NCBI GenBank)上22種不同的蟬花(Cordyceps cicadae)的ITS序列進行比對，可以發現其序列與Cordyceps cicadae相似度達99%以上，證實所篩選的菌株為蟬花菌株，並將此菌株命名為Cordyceps cicadae Wu-BFP14，並將其基因序列上傳至基因資料資料庫，登記號碼(Accession number)為KX289580，在下文中簡稱為BFP14(SEQ ID NO：1)。

3.3不同碳源

參照第6圖，其係為本發明之實例1至實例11之分析圖。其中，(a)至(d)部分分別代表pH值、胞外多醣(Exo polysaccharides，EPS，單位：g/L)含量、胞內多醣(Intracellular polysaccharides，IPS，單位：g/L)含量、以及生物質(Biomass，單位：g/L)含量。

BFP14在利用各種不同碳源培養醱酵液的酸鹼度並沒有太大的差異，都維持在pH5-pH6左右，只有以CMC為碳源條件時稍微偏高，在pH7左右。可以發現BFP14不論在單醣(Gly、Fru以及Xyl)、雙醣(Sur、Mal以及Lac)、多醣(Dex、CMC以及SS)甚至連多元醇類(Man)都可以利用。

BFP14菌絲體在生物質量上，未添加碳源的條件，有2.11g/L的菌絲體生物質量，在添加各種不同的碳源後，菌絲體生物質量都有顯著上升的現象，其中以Gly為較佳的培養碳源，菌絲體生物質量可達6.55g/L，比起未加碳源的條件高出三倍以上，其次為Man，約有6.21g/L的菌絲體生物質量，再者為SS的6.15g/L。在胞內多醣含量上，同樣的以Gly為較佳可達到6.19g/L，其次為乳糖(Lac)可達5.25g/L。在胞外多醣上，以甘露醇(Man)為較佳可達17.8g/L，其次為Glu可達14.51g/L，而與其他碳源生產胞外多醣上有顯著的差異。

參照第7圖，其係為本發明之實例1至實例11之分析圖。其中，(a)至(d)部分分別代表尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷的含量(mg/mg)。

可以發現以Xyl為碳源時，具有最高的尿嘧啶、尿苷及腺嘌呤含量，分別為2.91mg/g、0.53mg/g及0.10mg/g；以Mal為碳源下，尿嘧啶及尿苷是僅次於木糖為碳源的含量，其分別為2.49mg/g及0.44mg/g；緊接著是Sur，分別為2.39mg/g及0.48mg/g，再接著則為葡萄糖和果糖。由於Mal與Sur分別屬於由兩分子的葡萄糖以及一分子葡萄糖和一分子的果糖聚合而成的雙醣，推測Glu與Fru能促進尿嘧啶及尿苷的生成。在腺苷方面，可以明顯地發現較佳地為CMC，其約有2.91mg/g的含量，其次為有2.65mg/g的含量的Lac，再接續地為有2.22mg/g的含量的Glu。

參照第8圖，其係為本發明之實例1至實例11之分析圖。其中，(a)及(b)部分分別代表總類黃酮及總酚的含量(mg/mg)。

在總酚含量上，可以發現以Xyl為碳源時為最高，有9.87mg/g的沒食子酸含量，接下來為有6.93mg/g的沒食子酸含量的Dex，再接著則為有5.35mg/g的沒食子酸含量的葡萄糖，而其餘的碳源皆未產生高於4mg/g的沒食子酸。在類黃酮含量上，同樣的以Xyl為碳源時為最高，有19.76mg/g的槲皮素含量，其次為有15.5mg/g的槲皮素含量的Lac。

綜合以上結果，Glu為大多數細菌及真菌利用的碳源，其取的相對較為容易，成本上也較為便宜，在其於尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷等活性成分上，也優於大部分的碳源，所以選用葡萄糖為下述實例所用的碳源。

參照第9圖，其係為本發明之實例12至實例21之分析圖。其中，(a)至(d)部分分別代表pH值、胞外多醣含量、胞內多醣含量、以及生物質含量。

五種有機氮源皆可被BFP14利用，然而在無機氮源中僅有SN、PN及AS可以被利用。整體來說，以有機氮源的培養條件優於無機氮源。在有機氮源中，BFP14菌絲體生物質量以YT為較佳，可以得到8.37g/L的菌絲體生物質量，比起未添加氮源的條件(3.11g/L)還要高將近三倍，其次為Cas(7.32g/L)，而MT則為最低只有4.50g/L的菌絲體生物質量。在無機氮源中則以SN為較佳，可以得到5.05g/L菌絲體生物質量，其次則為PN(5.01g/L)，而硫酸銨最不適合BFP14菌絲體生物質量生長。

在多醣方面，主要以MT為較佳，其之胞內多醣或是胞外多醣的含量分別為17.54g/L及54.96g/L，在無機氮源的多醣則如菌絲體生物質量，以SN(11.53g/L、50.45g/L)為較佳，其次為PN(10.17g/L、46.37g/L)。在本發明中BFP14不論是菌絲體生物質量、胞內多醣及胞外多醣，皆以有機氮源優於無機氮源，而在無機氮源又可發現，以硝酸鹽氮源優於銨鹽氮源。

參照第10圖，其係為本發明之實例12至實例21之分析圖。其中，(a)至(d)部分分別代表尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷的含量(mg/mg)。

在生物活性成分上，在有機氮源中，YT在尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷之四個生物活性成分皆是最高的，分別具有1.69mg/g、0.17mg/g、0.91mg/g及0.98mg/g的含量，其次依序為Cas、PT、BT及MT，其中在MT中，並未偵測到尿苷的存在，而在無機氮源中，可以發現同樣的以硝酸鹽氮源優於銨鹽氮源，四個生物活性成分在SN及PN中各有其優勢，但是以SN優於PN。

參照第11圖，其係為本發明之實例12至實例21之分析圖。其中，(a)及(b)部分分別代表總類黃酮及總酚的含量(mg/mg)。

在總酚含量上，以YT為氮源時為會有較佳的總酚含量，有24.21mg/g的沒食子酸含量，其次為PT有23.6mg/g的沒食子酸含量，再者為Cas有22.36mg/g的沒食子酸含量，其餘兩個有機氮源的總酚含量皆小於20mg/g的沒食子酸含量。在無機氮源中以SN為較佳，相當於有21.62mg/g的沒食子酸含量，其次為PN(20.29mg/g)，遠高於AS(1.7mg/g)。類黃酮含量上，有機氮源則以YE 為較佳，有24.36mg/g的槲皮素含量，其次為PT有23.96mg/g的槲皮素含量，再者為Cas有23.93mg/g的槲皮素含量，其餘兩個有機氮源皆為大於20mg/g的總黃酮含量，在無機氮源中，以AS有最高的總黃酮含量，最高可達12.83mg/g。

參照第12圖，其係為本發明之實例22至實例30之分析圖。其中，(a)至(d)部分分別代表pH值、胞外多醣含量、胞內多醣含量、以及生物質含量。

添加各個礦物元素下，BFP14菌絲體皆可生長。在未添加礦物元素及添加硫酸鎂、硫酸鈣的條件下，發酵液會呈現紅色，而在其他礦物元素的條件中，呈現不同的顏色變化。BFP14菌絲體生物質量以未添加礦物元素為較佳，可達6.35g/L的菌絲體生物質量，其次為添加2mM硫酸鎂(6.18g/L)，其餘微量元素皆為高於6g/L以上的菌絲體生物質量，硫酸鎳最不利於BFP14菌絲體生長，只有2.73g/L的菌絲體生物質量，其次為硫酸鐵(3.43g/L)。在胞內多醣方面，則可以明顯的觀察到，以添加硫酸鎂為較佳，可達7.12g/L的胞內多醣，其次為硫酸鈣有6.40g/L的胞內多醣，其餘條件皆為高於6g/L的胞內多醣產量，又以硫酸鐵為最低，胞內多醣產量只有3.79g/L。添加不同礦物元素對於胞外多醣，則較無顯著的差異，以硫酸鎳為較佳，可得到55.19g/L的胞外多醣，其餘的條件胞外多醣產量則維持在48到53g/L之間。

參照第13圖，其係為本發明之實例22至實例30之分析圖。其中，(a)至(d)部分分別代表尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷的含量(mg/mg)。

BFP14菌絲體萃取液的尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷含量，在尿嘧啶含量上以硫酸鐵為較佳，可以達2.75mg/g的含量，但是其之尿苷含量則較為不佳。在硫酸銅的條件下，在尿苷、腺嘌呤及腺苷的含量都為最差，明顯地硫酸銅可能較不利於生物活性成分的生產。在腺嘌呤以硫酸錳為較佳，可以達 0.52mg/g，其次為硫酸鐵(0.49mg/mg)，然而在腺苷以硫酸鋅為較佳，可以達2.46mg/g，其次為硫酸鎳(2.44mg/g)。

參照第14圖，其係為本發明之實例22至實例30之分析圖。其中，(a)及(b)部分分別代表總類黃酮及總酚的含量(mg/mg)。

總酚含量上以硫酸鎂為較佳，相當於9.73mg/g的沒食子酸含量，類黃酮含量則可以明顯地觀察到以硫酸錳為最高，相當於36.98mg/g槲皮素含量，其次為硫酸錳。

在本發明中添加不同的礦物元素，除了影響菌絲體生物質量及胞內多醣，也會影響不同的生物活性成分組成，不同的元素萃取液所含的生物活性成分比例大有不同。菌絲體生物質量上，以未添加礦物元素為較佳、其次為硫酸鎂，胞內多醣則為硫酸鎂較佳，生物活性成份上，則各有不同其中以添加硫酸錳的類黃酮成分較佳，但其菌絲體生物質量並未表現較佳，未來若考慮到抗氧化活性及類黃酮含量，硫酸錳是非常值得關注的一個重點。

參照第15圖，其係為本發明之實例31至實例38之分析圖，其中，(a)及(b)部分分別代表含水率(%)及產率(Product yield)。產率之計算方式為=產物(g)/原料(raw material)(g)。

以不同培養天數對於BFP14在以麥片作為穀物之固態培養中，可以發現在培養7天過後，菌絲體就可以佈滿整個穀物基質，而在培養14天過後，可以長出0.3-0.5cm的原基，在培養21天時，就可以長出1-3cm的子實體。在培養28天時，子實體高度就可達3-5公分，而在培養35天時，子實體生長到大約5-7cm，接著在培養42天時，胞子形成，子實體逐漸萎縮。其中，培養濕度在60-80% 左右，而隨著培養天數增加，濕度也會隨著提高。在產率方面，也隨著培養天數提升而產生產率下降的現象。

參照第16圖，其係為本發明之實例31至實例38之分析圖，其代表多醣(Total sugars content，TSC，單位：葡萄糖當量(glucose equivalent)g/L)含量分析。

可以發現，隨著培養天數提升，總多醣含量呈現下降的趨勢，在BFP14穀物基質固態培養的第7天，總多醣含量為27.55g/L，經過了56天的培養過後，多醣含量只剩下8.88g/L。

參照第17圖，其係為本發明之實例31至實例38之分析圖。其中，(a)至(d)部分分別代表尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷的含量(mg/mg)。

尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷之四個生物活性成分都隨著培養天數而增加，在培養的第35天，也是在子實體最成熟期，有最高的含量，分別為0.42、0.09、0.07及0.63mg/g的含量。

參照第18圖，其係為本發明之實例31至實例38之分析圖。其中，(a)及(b)部分分別代表總類黃酮及總酚的含量(mg/mg)。

總類黃酮及總酚同樣都隨著培養天數而增加，在培養的第42天，有最高的總酚含量，當於9mg/g的沒食子酸含量，相對於培養7天(2.62mg/g)之總酚含量可提高3倍以上，而類黃酮含量則一直隨著培養天數，一直呈現上升，培養7天有相當於10.74mg/g的槲皮素含量，而在培養56天後，則可以達到相當於49.83mg/g的槲皮素含量，提高了將近五倍以上。

參照第19圖，其係為本發明之實例39至實例45之分析圖，其中，(a)及(b)部分分別代表含水率及產率。

可以觀察到在光照強度0Lux的條件，沿著培養容器邊緣生長出一層白色的菌絲膜，並未有子實體產生，在50Lux的光照強度培養下，可以生長出5-7公分的子實體，隨著光照強度的提高，並未有太大的變化，到光照強度為1500Lux可以發現，子實體呈現逐漸萎縮的現象，在BFP14的穀物固態培養中，必須要些許的光照，才可以刺激子實體的生長，而光照強度也不能太高，光照強度太高，會導致孢子形成，子實體逐漸萎縮。

在不同的光照強度培養中，以不照光的培養濕度約為70%，其他光照強度的培養濕度維持在80%左右，在產率方面，以不照光的條件下，可以得到70%的產率，30g的穀物進行發酵完，可得到21g的發酵產物，在50到1500Lux的光照條件下，約為50%左右的產率，約可獲得15g的發酵產物。

參照第20圖，其係為本發明之實例39至實例45之分析圖，其代表多醣含量分析。

可以發現在0Lux的培養條件，同有最高的多醣含量(14.86g/L)，然而隨著光照強度的提高，多醣的含量逐漸地呈現下降的趨勢。

參照第21圖，其係為本發明之實例39至實例45之分析圖。其中，(a)至(d)部分分別代表尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷的含量(mg/mg)。

光照強度對於尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷之生物活性成分並沒有太大的影響，但可以觀察到，在照光培養後，生物活性成分都較無光照高，尤其是在尿苷含量上，則可以明顯觀察到，在0到100Lux的光照條件，並未能檢測出尿苷的含量，隨著光強度的提高，含量隨之增加，在500Lux，有最高的尿苷含量(0.09mg/g)，而後則呈現下降。

參照第22圖，其係為本發明之實例39至實例45之分析圖。其中，(a)及(b)部分分別代表總類黃酮及總酚的含量(mg/mg)。

在總酚含量上，可以觀察到在50到1000Lux的白光之光照條件，無顯著的差異性存在；在無光照及1500Lux的光照下，分別有當於9.18mg/g與10.67mg/g的沒食子酸含量，其餘條件皆大於12mg/g的沒食子酸含量，又以1000Lux為最高，相當於13.24mg/g的沒食子酸含量。類黃酮含量方面，同樣在50-1000Lux的光照，無顯著的差異性存在；而在無光照及1500Lux的光照下，分別有當於13.17mg/g與13.77mg/g的槲皮素含量，其餘條件皆大於15mg/g的槲皮素含量，又以500Lux為最高，相當於16.77mg/g的槲皮素含量。

在子實體型態上，光照強度介於50到1000Lux之間，對於子實體生長並無太大的影響，除了尿嘧啶在500Lux有高的含量外，其他的生物活性成分同樣在50-1000Lux之間並無太大的差異存在。總酚及類黃酮含量也同樣的有此現象，然而在抗氧化活性上，同樣的較無明顯的差異，可以發現在無光照及高光照強度(1500Lux)較為不利，以1000Lux為較佳。綜合以上結果，認為光照強度500Lux為較佳的培養條件，後續的研究以500Lux光照強度進行培養。其中，所述後續的研究是指使用白光為照射光源條件皆為500Lux，而其他光源由於光源種類不同，其光源並非並500Lux。

參照第23圖，其係為本發明之實例46至實例53之分析圖，其中，(a)及(b)部分分別代表含水率及產率。

在各種光源條件下，BFP14穀物固態培養都可以生產出子實體，可以觀察到6R3B及9IR下，子實體的生長高度較高，約為5公分左右，然而在其他的光源條件的子實體高度，則約在3-4公分左右。

不同光源的培養濕度在80%左右，在產率方面，約在40-50%以上，在5000K及6R3B下高於50%以上，分別為53%及54%。

參照第24圖，其係為本發明之實例46至實例53之分析圖，其代表多醣含量分析。

在總糖含量上，可以發現差異並不大，都維持在9-11g/L的多醣含量，以6R3B為較佳，有11.41g/L的多醣含量。

參照第25圖，其係為本發明之實例46至實例53之分析圖。其中，(a)至(d)部分分別代表尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷的含量(mg/mg)。

在尿嘧啶中，以對照組(500Lux的白光)為較佳，有1.4mg/g的含量，其次為3R3B3IR有1.31mg/g的含量，再者為9IR有1.27mg/g的含量。尿苷則以9B為較佳，有0.19mg/g的含量，其次為9IR有0.15mg/g的含量，再者為3R3B3IR有0.14mg/g的含量。腺嘌呤則以3R3B3IR為較佳，有0.49mg/g的含量，其次為6R3B有0.41mg/g的含量，再者為9R有0.4mg/g的含量。腺苷則以9B為較佳，有1.05mg/g的含量，其次為9IR有0.92mg/g的含量，再者為3R3B3IR有0.87mg/g的含量。可以發現，遠紅外線可以刺激尿嘧啶的含量，藍光可以刺激尿苷及腺苷的含量，而紅光則可以刺激腺嘌呤的含量。

參照第26圖，其係為本發明之實例46至實例53之分析圖。其中，(a)及(b)部分分別代表總類黃酮及總酚的含量(mg/mg)。

在不同的光源條件下，都有相當於將近10mg/g的沒食子酸含量，其中又以2700K為較佳，有12.32mg/g的沒食子酸含量。在類黃酮含量上，可以發現以3R3B3IR為較佳，相當於41.36mg/g槲皮素含量，其次為9IR相當於 36.61mg/g的槲皮素含量。代表遠紅外線可以刺激BFP14穀物固態培養的類黃酮含量。

參照第27圖，其係為本發明之實例54至實例73之分析圖，其中，(a)及(b)部分分別代表含水率及產率。

可以發現，所使用的20種不同穀物中，BFP14穀物固態培養都可以生長。除了少數幾種穀物外，大多數的穀物固態培養都能夠生長出子實體。在豆類穀物中，除了YB及BB沒有生長出子實體，其餘豆類穀物都可以長出約1-2公分左右的子實體，米類穀物中，除了RR長出厚厚的一層菌絲體外，其餘六種米類穀物都能長出子實體，其中又以WR為較佳，在黎麥類穀物中，TR及MUR同樣的只長出厚厚的菌絲體外，其餘四種黎麥類穀物皆能生長出子實體，而在其他穀物的H及PC，也都能長出子實體。在這些穀物中，子實體型態以MM為較佳，其次為WR，其餘穀物的子實體型態至少都有3-4公分的子實體，然而豆類穀物的子實體型態較差。

除了在YB及BB中的生長型態較差外，含水率在60%左右，而其他18種的穀物，其含水率都介於70%到80%之間。在產率上，可以發現以豆類穀物的產率皆高於50%以上，比起其他種類的穀物較為高，尤其是YB及BB這兩種豆類穀物，分別為74%及79%，可以得到22.4g及23.7g的發酵產物。然而以米類穀物的產率較低，平均產率大約在40%左右。

參照第28圖，其係為本發明之實例54至實例73之分析圖，其代表多醣含量分析。

總醣含量上，隨著穀物的不同有不同的多醣含量，米類穀物中以MR為最高，有相當於18.75g/L的多醣含量，再者則為WR有相當於13.14g/L的多醣含量，豆類穀物則以MB為最高，有相當於13.59g/L的多醣含量，黎麥類穀物，則是以MM為最高，有相當於11.71g/L的多醣含量。

參照第29圖，其係為本發明之實例54至實例73之分析圖。其中，(a)至(d)部分分別代表尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷的含量(mg/mg)。

在豆類穀物中，尿嘧啶以MB為最高，可得到0.99mg/g的含量，其次為GB為0.94mg/g的含量，另外在RB和BB並未檢測出尿苷及腺嘌呤的含量，在尿苷以YB的含量最高有0.02mg/g的含量，然而在腺嘌呤則是以GB為較佳，有0.02mg/g的含量，然而在腺苷則以MB為較佳，有0.47mg/g的含量。在米類穀物中，尿嘧啶以Ten為最高，可得到1.23mg/g的含量，另外在尿苷的含量上，WR、PR和MR並未檢測出，以RR的含量最高有0.21mg/g的含量，然而在腺嘌呤則是以PR為較佳，有0.12mg/g的含量，然而在腺苷則以RR為較佳，有0.97mg/g的含量。在黎麥類穀物中，尿嘧啶和尿苷都是以TR為較佳，分別有1.13mg/g和0.21mg/g的含量，然而在OL未檢測出尿苷的含量，在腺嘌呤則是以YM為較佳，有0.08mg/g的含量，在腺苷同樣的以YM為較佳，有0.76mg/g的含量。在其他類穀物中，這四種生物活性成分比起來含量都較少，其次為黎麥類的穀物。

參照第30圖，其係為本發明之實例54至實例73之分析圖。其中，(a)及(b)部分分別代表總類黃酮及總酚的含量(mg/mg)。

在豆類穀物的總酚含量上，以GB為較佳，有7.8mg/g的沒食子酸含量，米類穀物上則是以PR為較佳，有12.77mg/g的沒食子酸含量，其次為RR有11.02mg/g的沒食子酸含量，在黎麥類穀物則是以OL為較佳有10.92mg/g的沒食子酸含量，而其他類穀物的H及PC則分別為8.45及6.63mg/g的沒食子酸含量。類黃酮含量上，豆類穀物以RB為最高，有31.88mg/g的槲皮素含量，米類穀物則具有很大的差異，在WR只有9.9mg/g的槲皮素含量，然而PR有41.22mg/g的槲皮素含量，差了四倍以上的含量，黎麥類穀物則是TR為較佳，有40.9mg/g的槲皮素含量，其他類穀物的H及PC則分別有22.77及9.94mg/g的槲皮素含量。

BFP14可在20種穀物中生長，就子實體型態而言，以MM及WR為較佳，但其生物活性成分、總酚、類黃酮含量並未較佳。每種不同的穀物各有不同的優勢，如RR有最高的尿苷及腺苷含量，但其總酚及類黃酮含量則並未較佳，且抗氧化活性也不比其他穀物佳，PR有最高的總酚及類黃酮含量，同時也具有相當不錯的DPPH自由基清除活性，但其並未檢測出尿苷的含量，其他抗氧化活性也不如預期。在此，只證明BFP14可生長於各種穀物當中，並可依據所需的特性來調整選用之穀物及比例。

4.結論

蟬花屬於蟲草屬的藥用真菌，富含了與冬蟲夏草、蛹蟲草相關的生物活性成分如核苷酸、蟲草素和麥角固醇等等，具有抗氧化、抗發炎等等的功效。本發明篩選出台灣本土性蟬花菌株並經由18S rDNA鑑定後命名為Cordyceps cicadae Wu-BFP14(NCBI：KX289580)，並探討碳源及氮源對於蟬花液態發酵菌絲體生長及生物活性之影響。

在碳源研究結果顯示，利用葡萄糖有較佳的菌絲體產量(6.55g/L)，同時具有最高的胞內多醣產量(6.19g/L)。另外，結果亦顯示以木糖為碳源時具有最高的尿嘧啶、尿苷及腺嘌呤含量，分別為2.912mg/g、0.527mg/g及0.100mg/g。同時在總酚及類黃酮含量也以木糖為較佳。而在氮源研究中，BFP14菌絲體產量以酵母萃取物為較佳，有8.37g/L的產量，同時也具有較佳的尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷，分別為1.690mg/g、0.172mg/g、0.905mg/g及0.976mg/g。總酚及類黃酮的含量，分別為24.21mgGAE/g及23.96mg QE/g。

最佳菌絲體生長、多醣及生物活性成分含量的液態培養基組成為：葡萄糖50g/L、酵母萃取液5g/L並添加5mM的硫酸錳。

在固態培養當中以小麥作為培養基質，探討各種培養條件對於生物活性的影響，在固液比2：1、光照強度500Lux培養42天過後有最佳的生物活性產量。以不同LED光源進行測試，尿嘧啶(0.19mg/g)、腺苷(1.05mg/g)、總酚(12.32mg GAE/g)和類黃酮(41.36mg QE/g)的含量分別在藍光、藍光、白光2700K及紅光、藍光、遠紅外線混合光源為最佳。利用20種穀物作為BFP14的固態培養基質，觀察不同穀物生長的形態及生物活性，對於生產尿苷和腺苷最佳的穀物基質是糙米，然而以最佳的酚類及類黃酮含量則為紫米。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於申請專利範圍中。

<110> 大葉大學

<120> 蟬花的固態培養方法

<130> DY-19007-TWI

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 549

<212> DNA

<213> 蟬花(Cordyceps bifusispora)

<400> 1

S10~S20:步驟

Claims

一種蟬花的液態培養方法，其包含：培養一蟬花菌種於一液態培養基，該蟬花菌種培養時間為7~14天、培養溫度為23~28℃、培養濕度為100%，且該蟬花菌種的序列如SEQ ID NO：1所示，以獲得該蟬花菌種的一菌絲體；其中，該菌絲體的生物質含量為2~9g/L，該生物質包含一尿嘧啶、一尿苷、一腺嘌呤、一腺苷、一類黃酮化合物及一酚類化合物，該尿嘧啶、該尿苷、該腺嘌呤及該腺苷含量分別為0.5~3mg/mg、0.05~0.6mg/mg、0.02~0.9mg/mg及0.1~2.91mg/mg，該類黃酮化合物(總類黃酮)含量及該酚類化合物(總酚)含量分別為0.1~37mg/mg及1.5~25mg/mg；以及該液態培養基包含一基礎培養基，該基礎培養基包含碳源、氮源以及礦物元素，其中該碳源包含葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、糊精、羧甲基纖維素、可溶性澱粉、甘露醇或其組合，且該碳源佔該基礎培養基之總體積比的0.5%~5%；該氮源包含蛋白腖、酵母萃取物、麥芽萃取物、牛肉萃取物、酪蛋白、硝酸鈉、硝酸鉀、硫酸銨或其組合，且該氮源佔該基礎培養基之總體積比的0.1%~3%；以及該礦物元素包含硫酸鎂、硫酸鈣、硫酸亞鐵、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、硫酸鎳或其組合。