CN106978350B - 一株黑曲霉及其在普洱茶素类化合物的制备中的应用 - Google Patents

一株黑曲霉及其在普洱茶素类化合物的制备中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株黑曲霉M03及其在微生物转化普洱茶素中的应用。从普洱熟茶中分离得到一株能生物转化生产普洱茶素的黑曲霉M03，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10930。以其为发酵菌株，采用“渥堆”固体发酵的方式以云南大叶种茶晒青毛茶为原料，或采用液体发酵的方式以儿茶素类化合物和茶氨酸为底物，进行“渥堆”固体发酵和液体发酵，生产普洱茶素类化合物。本发明能特异性地生产普洱茶素类化合物，且具有环境友好、操作简单、便于推广的特点，具有很好的应用前景。

Description

一株黑曲霉及其在普洱茶素类化合物的制备中的应用
技术领域
本发明涉及微生物转化领域，涉及黑曲霉的应用，具体涉及一株黑曲霉及其普洱茶素类化合物的生产与生物转化中的应用。
背景技术
普洱茶是以云南特有的大叶种茶Camellia sinensis var.assamica(Masters)Kitamura的干燥嫩叶(习称晒青毛茶)为原料经特殊的后发酵工艺加工而成的茶叶，为著名的后发酵茶。普洱茶风味品质独特，保健功效众多，且较其他茶类效果更为显著，研究表明这与其后发酵过程密切相关。普洱茶经后发酵过程后，在微生物的酶促或非酶促作用下，所含儿茶素类成分的含量大幅降低，产生了许多有别于其他茶类的新化合物。
普洱茶素类化合物是普洱熟茶中的一类特征的微生物转化产物，这类化合物具有显著的保护H2O2诱导的人血管内皮细胞损伤的活性，具有非常强的抗氧化作用。已知抗氧化活性物质具有清除自由基的作用，可以预防各种疾病如动脉粥样硬化、心血管疾病、糖尿病、肿瘤等。因此，该类化合物的开发利用价值高，市场前景广阔，且普洱茶素类化合物的生物合成对于研究普洱茶的后发酵机理、进而揭示普洱茶功效优于其他茶类的物质原因具有非常重要的意义。
但是，普洱茶素类化合物在普洱茶中的含量低。如要进行化学合成，则存在难度大、产率低、消耗大量有机溶剂、污染环境等缺点。
生物转化是指利用生物有机体(细胞、细胞器、组织等)或者酶作为催化剂进行化学转化的过程，因其具有作用条件温和、独特、高效的底物选择性等特点，广泛应用于天然产物的生物合成、手性药物的不对称合成等领域。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的是，提供一种用于生产普洱茶素类化合物的新型黑曲霉菌株，利用该菌株对晒青毛茶进行“渥堆”固体发酵以及以儿茶素类化合物和茶氨酸为底物进行液体发酵，可以生成或生物转化成普洱茶素类化合物。
本发明的另一个目的是，提供一种采用该菌株发酵生产或生物转化普洱茶素类化合物的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
一方面，本发明提供了一株黑曲霉(Aspergillus niger)M03，其是从普洱熟茶中筛选得到的野生菌株，该菌株已于2015年6月9日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心(中国，北京，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo.10930。
该菌具有如下性质：
形态特征：PDA平板上28℃培养1天为白色菌丝，培养2天形成黑色产孢区，培养4天后菌落直径为50-60mm；菌株分生孢子头呈球形，黑色，孢子梗壁厚，光滑，无色；足细胞壁厚，呈“L”型。
另一方面，本发明提供所述黑曲霉M03在普洱茶素类化合物的制备中的应用。
其中，所述制备通过所述黑曲霉M03的固体发酵或液体发酵进行。
本文所述的普洱茶素类化合物的结构如通式I所示：
Figure GDA0003262685620000021
其中R1可以为-OH或没食子酰氧基；R2和R3可以各自独立地为H、-OH或N-乙基吡咯烷酮基
Figure GDA0003262685620000031
并且所述N-乙基吡咯烷酮基C5’的构型可以是R或S；R4可以为-OH或H；并且通式I中的C2和C3的构型可以是R和/或S。
优选地，所述普洱茶素类化合物可选自下述式I至式XII所示化合物中的一种或多种：
Figure GDA0003262685620000032
Figure GDA0003262685620000041
本发明中也将上述化合物分别称为普洱茶素I至XII。
优选地，所述制备通过所述黑曲霉M03的固体发酵进行，其中固体发酵为晒青毛茶的“渥堆”后发酵；
或者优选地，所述制备通过所述黑曲霉M03的液体发酵进行，其中液体发酵以儿茶素类化合物和茶氨酸作为底物进行。
又一方面，本发明提供一种制备普洱茶素类化合物的方法，所述方法包括采用所述黑曲霉M03进行固体发酵或液体发酵；
优选地，所述普洱茶素类化合物选自式I至式XII所示化合物中的一种或多种。
优选地，所述方法包括采用所述黑曲霉M03进行固体发酵，并包括以下步骤：
将所述黑曲霉M03添加到潮水的晒青毛茶中进行发酵；
所述方法优选包括以下步骤：
取所述黑曲霉M03的种子液，按照种子液与茶的质量百分比为1-4％的比例将菌丝均匀地添加到以30-40％灭菌水进行潮水的晒青毛茶中，在35-45℃、湿度为60-90％的条件下“渥堆”后发酵21-35d，每间隔6-8d翻堆一次。
进一步优选地，所述方法包括以下步骤：
1)种子液制备：取黑曲霉M03的孢子，制成1×105～1×107CFU/mL的孢子悬液，取孢子悬液按1-4％(体积)的接种量接种于PDB液体培养基中，在25-31℃、160-240rpm下培养12-24h，得到种子液；
2)“渥堆”固体发酵：将步骤1)得到的黑曲霉M03种子液在30-40℃、160-240rpm下培养18-30h，按照种子液与茶的质量百分比为1-4％的比例将菌丝均匀地添加到以30-40％灭菌水进行潮水的晒青毛茶中，在35-45℃、湿度为60-90％的条件下“渥堆”后发酵21-35d，每间隔6-8d翻堆一次；
更优选地，所述方法包括以下步骤：
1)种子液制备：取黑曲霉M03的孢子，制成1×106CFU/mL的孢子悬液，取孢子悬液按2％(体积)的接种量接种于PDB液体培养基中，在28℃、200rpm下培养18h，得到种子液；
2)“渥堆”固体发酵：将步骤1)得到的黑曲霉M03种子液在35℃、200rpm下培养24h，按照质量百分比为2％的比例将菌丝均匀地添加到以35％灭菌水进行潮水的晒青毛茶中，在40℃、湿度为75％的条件下“渥堆”后发酵28d，每间隔7d翻堆一次。
或者优选地，所述方法包括采用所述黑曲霉M03进行液体发酵，并包括以下步骤：将所述黑曲霉M03与儿茶素类化合物和茶氨酸在液体培养条件下进行发酵；
优选地，所述方法包括以下步骤：
将所述黑曲霉M03的种子液接种至发酵培养基中，加入儿茶素类化合物和茶氨酸作为底物进行发酵，其中发酵培养基的组成为：葡萄糖15-20g/L，酵母浸出粉1.5-2.0g/L，硝酸铵10-13.5g/L，硫酸镁1.0-1.5g/L，磷酸氢二钾1.0-1.5g/L，pH为5.5-6.5；
所述儿茶素类化合物为普洱茶中的黄烷-3-醇类化合物；优选地，所述儿茶素类化合物选自儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯中的一种或多种，优选地选自儿茶素、表儿茶素和没食子儿茶素中的一种或多种；
优选地，所述方法包括以下步骤：
将所述黑曲霉M03的种子液按照1-4％(体积)的接种量接种至所述发酵培养基中，加入终浓度为10-30mg/L的儿茶素类化合物和30-80mg/L的茶氨酸作为底物，在30-40℃、160-240rpm下培养48-96h。
进一步优选地，所述方法包括以下步骤：
1)种子液制备：取黑曲霉M03的孢子，制成1×105-1×107CFU/mL的孢子悬液，取孢子悬液按1-4％(体积)的接种量接种于PDB液体培养基中，在25-31℃、160-240rpm下培养12-24h，得到种子液；
2)液体发酵：将步骤1)得到的黑曲霉M03种子液按照1-4％(体积)的接种量接种至所述发酵培养基中，加入终浓度为10-30mg/L的儿茶素类化合物和30-80mg/L的茶氨酸作为底物，在30-40℃、160-240rpm下培养48-96h；
更优选地，所述方法包括以下步骤：
1)种子液制备：取黑曲霉M03的孢子，制成1×106CFU/mL孢子悬液，取孢子悬液按2％(体积)的接种量接种于PDB液体培养基中，在28℃、200rpm下培养18h，得到种子液；
2)液体发酵：将步骤1)得到的黑曲霉M03种子液按照2％(体积)的接种量接种至所述发酵培养基中，加入终浓度为20mg/L的儿茶素类化合物和50mg/L的茶氨酸作为底物，在35℃、200rpm下培养72h。
在上述方法中，步骤1)中的孢子悬液可以通过以下步骤制得：
将所述黑曲霉M03的孢子接种在PDA斜面培养基上，在25-30℃下培养1-5天待孢子成熟，用灭菌生理盐水洗下PDA斜面培养基上的孢子；优选地，将所述黑曲霉M03的孢子接种在PDA斜面培养基上，在28℃下培养3天待孢子成熟，用灭菌生理盐水洗下PDA斜面培养基上的孢子。孢子成熟后也可保藏在4℃下备用。
在上述方法中，PDA培养基组成为：马铃薯浸出粉5.0g，葡萄糖15.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL；PDB培养基组成为：马铃薯浸出粉5.0g，蛋白胨15.0g，葡萄糖15.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL。
根据本发明的具体实施方案，包括如下发酵过程：
1.发酵菌种的制备：
取低温保藏的菌种M03，划线接种于PDA固体培养基上，于28℃恒温培养箱中培养3天，将活化后的菌种接种于PDB液体培养基中，置于28℃、200rpm的摇床中培养18h，得到种子液。
2.普洱茶素的固体发酵
取步骤1中的黑曲霉M03种子液，按质量百分数为2％的比例将黑曲霉菌丝均匀地添加到以35％灭菌水进行潮水的晒青毛茶中，在40℃、湿度为75％的条件下“渥堆”后发酵28d，每间隔7d翻堆一次。
3.普洱茶素的液体发酵
取步骤1中的黑曲霉M03种子液和儿茶素类化合物及茶氨酸一起加入到转化培养基中，在28℃、200rpm的条件下培养72h，儿茶素类化合物和茶氨酸在黑曲霉M03的作用下生物合成普洱茶素类化合物，然后采用柱色谱法和半制备高效液相色谱法分离得到普洱茶素类化合物纯品。
转化培养基终浓度组成：葡萄糖15-20g/L，酵母浸出粉1.5-2.0g/L，硝酸铵10-13.5g/L，硫酸镁1.0-1.5g/L，磷酸氢二钾1.0-1.5g/L，溶剂为蒸馏水，pH为5.5-6.5。
发酵菌种的加入为转化培养基的体积分数为2％(v/v)，儿茶素类化合物的加入量为20mg/L，茶氨酸的加入量为50mg/L。
本发明从普洱熟茶中分离得到一株新型黑曲霉菌株M03，其能够固体发酵生产普洱茶素类化合物，并且还能够生物转化生成普洱茶素类化合物，将其应用于普洱茶素类化合物的生产或生物转化，具有良好的开发潜力，对于阐释普洱茶的后发酵机理也具有非常重要的意义。特别是相对于其他现有黑曲霉菌株，黑曲霉菌株M03能够在液体条件下发酵，将儿茶素类化合物和茶氨酸转化为普洱茶素类化合物，而且液体发酵具有生产周期短，生产效率高、发酵条件容易控制，易于产业化等特点，将其应用于普洱茶素类化合物的生物转化能够实现普洱茶素类化合物的大规模产业化。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示了本发明的黑曲霉M03与其他种类菌株的生物转化比较结果，其中1A为黑曲霉M03，1B为塔宾曲霉，1C为烟曲霉，1D为米曲霉，1E为灰绿曲霉，1F为普通青霉菌，1G为泡盛曲霉，1H为普洱茶素I和II标准品；图上的峰1为茶氨酸，峰2为儿茶素，峰3为普洱茶素I，峰4为普洱茶素II。
图2显示了本发明的黑曲霉M03的菌落形态。
图3显示了对本发明的黑曲霉M03进行分子鉴定的***进化树。
图4显示了由本发明的黑曲霉M03固体发酵产生的普洱茶素类化合物的1H-NMR和13C-NMR核磁图谱，其中：
4A-1：普洱茶素I H谱；4A-2：普洱茶素I C谱；
4B-1：普洱茶素II H谱；4B-2：普洱茶素II C谱；
4C-1：普洱茶素III H谱；4C-2：普洱茶素III C谱；
4D-1：普洱茶素IV H谱；4D-2：普洱茶素IV C谱；
4E-1：普洱茶素V H谱；4E-2：普洱茶素V C谱；
4F-1：普洱茶素VI H谱；4F-2：普洱茶素VI C谱；
4G-1：普洱茶素VII H谱；4G-2：普洱茶素VII C谱；
4H-1：普洱茶素VIII H谱；4H-2：普洱茶素VIII C谱；
4I-1：普洱茶素IX H谱；4I-2：普洱茶素IX C谱；
4J-1：普洱茶素X H谱；4J-2：普洱茶素X C谱；
4K-1：普洱茶素XI H谱；4K-2：普洱茶素XI C谱；
4L-1：普洱茶素XII H谱；4L-2：普洱茶素XII C谱；
图5显示了本发明的黑曲霉M03与黑曲霉标准菌株ATCC1015、CMCC98003和CBS554.65在生物转化得到普洱茶素类化合物方面的比较实验结果，其中5A为黑曲霉M03，5B为黑曲霉ATCC1015，5C为黑曲霉CMCC98003，5D为黑曲霉CBS 554.65；图上的峰1为茶氨酸，峰2为儿茶素，峰3为普洱茶素I，峰4为普洱茶素II。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1黑曲霉M03的分离鉴定
1初筛
制备菌液：取普洱熟茶样品，置于灭菌蒸馏水中浸泡10min，静置，取上清作为菌液。取菌液1mL加入盛有9mL无菌水的试管中，以此类推，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5不同浓度的稀释菌液，使用灭菌吸管，分别吸取一滴加入到初筛培养基中，使用涂布棒涂布均匀。将培养皿倒置于28℃恒温培养箱中培养一定时间，使出现菌落，挑取单菌落，通过平板划线法接种至筛选培养基中，继续培养至出现明显单菌落，挑取各单菌落保藏于初筛培养基斜面上，即可获得菌种。
筛选培养基组成(每升)：马铃薯浸出粉5.0g，葡萄糖15.0～20.0g，琼脂15.0～20.0g，蒸馏水1000mL。
2复筛
分别挑取斜面保存的不同单菌落接种至筛选培养基中，将培养皿倒置于28℃恒温培养箱中培养至菌体长满整个平皿，分别加入灭菌晒青毛茶，置于培养箱中，在相同的条件(温度为40℃、湿度为75％)下培养14d。取不同菌落发酵后的普洱茶研碎，加入甲醇超声提取(甲醇与普洱茶质量比为10:1，超声功率200w，超声时间30min，温度为30℃，提取3次)，滤过，滤液进行LC-MS检测，与普洱茶素标准品在相同色谱条件下进行比对，观察不同菌落发酵的普洱茶中是否具有普洱茶素。
结果表明，经筛选仅一株菌发酵普洱茶后能生物转化产生普洱茶素，命名为菌株M03。不同菌株生物转化普洱茶素筛选结果的LC-MS图如图1所示，图1中为黑曲霉M03(1A)和属于不同菌种的菌株，包括塔宾曲霉(1B)，烟曲霉(1C)，米曲霉(1D)，灰绿曲霉(1E)，普通青霉菌(1F)和泡盛曲霉(1G)的筛选结果；1H为普洱茶素I(峰3)和II(峰4)标准品的LC-MS图。
LC-MS检测条件为：色谱柱：Waters Symmetry Shield RP 18(3.5μm)，流动相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱，0min，5％A；30min，30％A；40min，95％A，45min，95％A；柱温为30℃；流速：1.0mL/min；检测波长：230nm；进样量：5μL；离子源：电喷雾离子源(ESI)；检测模式：正离子模式；扫描范围：m/z 50-800。
3生理理化特征
筛选到的菌株菌落圆形，边缘整齐，绒状，白色不透明；菌落正面黑色，边缘有白色菌丝圈，不透明，背面黄褐色；质地湿润，紧密，平坦，有同心圆，无沟纹，绒毛较短。显微镜下，菌株分生孢子头多，成球状，黑色；孢子梗壁厚，光滑，无色；足细胞壁厚，呈“L”型。菌落形态如图2所示。因此，通过形态观察可初步判定为黑曲霉。
4分子鉴定
基因学测定，委托北京三博远志生物技术有限责任公司进行测定：以ITS1和ITS4为引物，提取菌株M03总RNA并反转录成cDNA作为模板，通过PCR扩增、纯化，最终获得近ITS区全系列(核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示)，通过美国国立生物信息中心(NCBI)的基因库Genbank检索得到菌株M03的ITS全系列与黑曲霉(Aspergillus niger)同源性为100％，根据同源性分析表，建立***进化树，如图3所示。
引物ITS1(正向；SEQ ID NO:1)：5′-GGCGTCCAAGTGGATGCCT-3′
引物ITS4(反向；SEQ ID NO:2)：5′-CGTATAGTTATTCGCCTCCT-3′
ITS区(SEQ ID NO:3)：
5′-CCTTCCTACCTGATCCGAGGTCACCTGGAAAAATGGTTGGAAAACGTCGGCAGGCGCCGGCCAATCCTACAGAGCATGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCCGGAGAGGGGGACGGCGACCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCATTCAATCAACTCAGACTGCACGCTTTCAGACAGTGTTCGTGTTGGGGTCTCCGGCGGGCACGGGCCCGGGGGGCAAAGGCGCCCCCCCGGCGGCCGACAAGCGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAGGGTATAATAGACACGGATGGGAGGTTGGGCCCAAAGGACCCGCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAG-3′
根据菌株M03的生理生化特征及分子鉴定结果，将菌株M03鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)，命名为黑曲霉(Aspergillus niger)M03，保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10930，保藏日期2015年6月9日，地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
实施例2发酵菌种制备
取低温保藏的菌种M03，划线接种于PDA固体培养基上，于28℃恒温培养箱中培养72h待孢子成熟，用灭菌生理盐水洗下PDA斜面培养基上的孢子，制成1×106CFU/mL孢子悬液，取孢子悬液按2％(体积)的接种量接种于PDB液体培养基中，置于28℃、200rpm的摇床中培养18h，得到种子液。
PDA培养基组成：马铃薯浸出粉5.0g，葡萄糖15.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL。
PDB培养基组成：马铃薯浸出粉5.0g，蛋白胨15.0g，葡萄糖15.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL。
实施例3固体发酵晒青毛茶生物转化普洱茶素类化合物
取在35℃、200rpm下培养24h的黑曲霉种子液，按质量百分数为2％的比例将黑曲霉菌丝均匀地添加到以35％灭菌水进行潮水的晒青毛茶中，在40℃、湿度为75％的条件下“渥堆”后发酵28d，每间隔7d翻堆一次。
取发酵后普洱茶，甲醇超声提取，浓缩后得浸膏，以氯仿萃取除去咖啡因后，以乙酸乙酯萃取，萃取3次，萃取液合并，减压浓缩后得浸膏，浸膏以少量甲醇溶解后用葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱进行分离，共收集40个流分，经LC-MS分析合并相同的流分，共得到12个含有普洱茶素的流分。接着将这些流分进行半制备高效液相色谱分离制备，得到流分1-12，减压蒸干得到产物1-12，经LC-MS检测和核磁共振波谱分析，产物1-12确定为普洱茶素类I-XII。图4显示了各个化合物的1H-NMR和13C-NMR核磁图谱。
甲醇超声提取条件：甲醇与普洱茶质量比为10:1，超声功率200w，超声时间30min，温度为30℃，提取3次。
凝胶Sephadex LH-20柱色谱分离条件：样品以甲醇溶解，上样后以100％甲醇进行洗脱，洗流速为0.5-1.0mL/min，间隔5.0-8.0mL收集1份洗脱液。半制备高效液相色谱条件：色谱柱为Waters Atlantis T3(5μm，20×250mm)；流动相为乙腈：0.1％甲酸水(80-86:20-14)等度洗脱；柱温40℃；检测波长230nm和280nm，运行时间45-90min。
实施例4液体发酵转化普洱茶素I和II
在50mL转化培养基(即发酵培养基)中加入体积分数为2％的在35℃、200rpm下培养24h的黑曲霉M03种子液和终浓度为20mg/L儿茶素和50mg/L的茶氨酸，置于35℃恒温培养箱中，自然pH，200rpm培养72h后取出，加入乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，萃取液合并，减压蒸干，加入甲醇溶解，采用半制备高效液相色谱分离，共收集2个流分，减压蒸干得产物1和2，经LC-MS检测和核磁共振波谱分析，产物1和2为普洱茶素I和II。
半制备高效液相色谱条件：色谱柱为Waters Atlantis T3(5μm，20×250mm)；流动相为乙腈：0.1％甲酸水(85:15)等度洗脱；柱温40℃；检测波长230nm和280nm，运行时间45min。
实施例5液体发酵转化普洱茶素III和IV
在50mL转化培养基(即发酵培养基)中加入体积分数为2％的在35℃、200rpm下培养24h的黑曲霉M03种子液和终浓度为20mg/L表儿茶素和50mg/L的茶氨酸，置于35℃恒温培养箱中，自然pH，200rpm培养72h后取出，加入乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，萃取液合并，减压蒸干，加入甲醇溶解，采用半制备高效液相色谱分离(条件同实施例4)，共收集2个流分，减压蒸干得产物3和4，经LC-MS检测和核磁共振波谱分析，产物3和4为普洱茶素III和IV。
实施例6液体发酵转化普洱茶素V和VI
在50mL转化培养基(即发酵培养基)中加入体积分数为2％的在35℃、200rpm下培养24h的黑曲霉M03种子液和终浓度为20mg/L没食子儿茶素和50mg/L的茶氨酸，置于35℃恒温培养箱中，自然pH，200rpm培养72h后取出，加入乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，萃取液合并，减压蒸干，加入甲醇溶解，采用半制备高效液相色谱分离，共收集2个流分，减压蒸干得产物5和6，经LC-MS检测和核磁共振波谱分析，产物5和6为普洱茶素V和VI。
半制备高效液相色谱条件：色谱柱为Waters Atlantis T3(5μm，20×250mm)；流动相为乙腈：0.1％甲酸水(86:14)等度洗脱；柱温40℃；检测波长230nm和280nm，运行时间55min。
实施例7液体发酵转化普洱茶素VII和VIII
在50mL转化培养基(即发酵培养基)中加入体积分数为2％的在35℃、200rpm下培养24h的黑曲霉M03种子液和终浓度为20mg/L表儿茶素和50mg/L的茶氨酸，置于35℃恒温培养箱中，自然pH，200rpm培养72h后取出，加入乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，萃取液合并，减压蒸干，加入甲醇溶解，采用半制备高效液相色谱分离(条件同实施例6)，共收集2个流分，减压蒸干得产物7和8，经LC-MS检测和核磁共振波谱分析，产物7和8为普洱茶素VII和VIII。
实施例8液体发酵转化普洱茶素IX、X、XI和XII
在50mL转化培养基(即发酵培养基)中加入体积分数为2％的在35℃、200rpm下培养24h的黑曲霉M03种子液和终浓度为30mg/L表儿茶素没食子酸酯(ECG)及表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)混合物和75mg/L的茶氨酸，置于35℃恒温培养箱中，自然pH，200rpm培养72h后取出，加入乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，萃取液合并，减压蒸干，加入甲醇溶解，采用半制备高效液相色谱分离，共收集4个流分，减压蒸干得4种产物，经LC-MS检测和核磁共振波谱分析，产物分别为普洱茶素IX、X、XI和XII。
半制备高效液相色谱条件：色谱柱为Waters Atlantis T3(5μm，20×250mm)；流动相为乙腈：0.1％甲酸水(83:17)等度洗脱；柱温40℃；检测波长230nm和280nm，运行时间75min。
实施例9黑曲霉M03与黑曲霉标准菌株的比较实验
取本发明中分离得到的黑曲霉M03以及从中国普通微生物菌种保藏管理中心购买的黑曲霉标准菌株ATCC1015、CMCC98003和CBS 554.65的孢子，按照本发明的方法分别制成1×106CFU/mL孢子悬液，取孢子悬液按2％接种量接种于PDB液体培养基中，在28℃、200rpm下培养18h，制备种子液。
在50mL转化培养基(即发酵培养基)中分别加入体积分数为2％的上述黑曲霉M03、黑曲霉标准菌株ATCC1015、CMCC98003或CBS 554.65种子液以及终浓度为20mg/L儿茶素和50mg/L的茶氨酸，置于35℃恒温培养箱中，自然pH，200rpm培养72h后取出，加入乙酸乙酯进行萃取，萃取3次，萃取液合并，减压蒸干，加入甲醇溶解，进行LC-MS检测(条件同实施例1)，结果表明仅黑曲霉M03具有液态发酵生物转化普洱茶素的能力，结果见图5。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
Figure IDA0000907277270000011
Figure IDA0000907277270000021

Claims (19)

1.黑曲霉(Aspergillus niger)M03，保藏编号为CGMCC No.10930。
2.权利要求1所述的黑曲霉M03在普洱茶素类化合物的制备中的应用，所述普洱茶素类化合物的结构如通式I所示：
Figure FDA0003262685610000011
其中R1为-OH或没食子酰氧基；R2为H或-OH，R3为N-乙基吡咯烷酮基
Figure FDA0003262685610000012
并且所述N-乙基吡咯烷酮基中C5’的构型是R或S；R4为-OH或H；并且通式I中C2和C3的构型是R和/或S。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述普洱茶素类化合物选自下述式I至式XII所示化合物中的一种或多种：
Figure FDA0003262685610000013
Figure FDA0003262685610000021
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述制备通过所述黑曲霉M03的固体发酵或液体发酵进行。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述制备通过所述黑曲霉M03的固体发酵进行，其中固体发酵为晒青毛茶的“渥堆”后发酵；
或者，所述制备通过所述黑曲霉M03的液体发酵进行，其中液体发酵以儿茶素类化合物和茶氨酸作为底物进行，其中所述儿茶素类化合物选自儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯中的一种或多种。
6.一种制备普洱茶素类化合物的方法，所述方法包括采用权利要求1所述的黑曲霉M03进行固体发酵或液体发酵，其中所述普洱茶素类化合物的结构如权利要求2中限定。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述普洱茶素类化合物选自权利要求3中限定的式I至式XII所示化合物中的一种或多种。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法包括采用所述黑曲霉M03进行固体发酵，并包括以下步骤：
将所述黑曲霉M03添加到潮水的晒青毛茶中进行发酵。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
取所述黑曲霉M03的种子液，按照质量百分比为1-4％的比例将菌丝均匀地添加到以30-40％灭菌水进行潮水的晒青毛茶中，在35-45℃、湿度为60-90％的条件下“渥堆”后发酵21-35d，每间隔6-8d翻堆一次。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)种子液制备：取黑曲霉M03的孢子，制成1×105～1×107CFU/mL的孢子悬液，取孢子悬液按1-4％(体积)的接种量接种于PDB液体培养基中，在25-31℃、160-240rpm下培养12-24h，得到种子液；
2)“渥堆”固体发酵：将步骤1)得到的黑曲霉M03种子液在30-40℃、160-240rpm下培养18-30h，按照质量百分比为1-4％的比例将菌丝均匀地添加到以30-40％灭菌水进行潮水的晒青毛茶中，在35-45℃、湿度为60-90％的条件下“渥堆”后发酵21-35d，每间隔6-8d翻堆一次。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)种子液制备：取黑曲霉M03的孢子，制成1×106CFU/mL的孢子悬液，取孢子悬液按2％(体积)的接种量接种于PDB液体培养基中，在28℃、200rpm下培养18h，得到种子液；
2)“渥堆”固体发酵：将步骤1)得到的黑曲霉M03种子液在35℃、200rpm下培养24h，按照质量百分比为2％的比例将菌丝均匀地添加到以35％灭菌水进行潮水的晒青毛茶中，在40℃、湿度为75％的条件下“渥堆”后发酵28d，每间隔7d翻堆一次。
12.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法包括采用所述黑曲霉M03进行液体发酵，并包括以下步骤：
将所述黑曲霉M03与儿茶素类化合物和茶氨酸在液体培养条件下进行发酵，其中所述儿茶素类化合物选自儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯中的一种或多种。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将所述黑曲霉M03的种子液接种至发酵培养基中，加入所述儿茶素类化合物和茶氨酸作为底物进行发酵，其中发酵培养基的组成为：葡萄糖15-20g/L，酵母浸出粉1.5-2.0g/L，硝酸铵10-13.5g/L，硫酸镁1.0-1.5g/L，磷酸氢二钾1.0-1.5g/L，pH为5.5-6.5。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述儿茶素类化合物选自儿茶素、表儿茶素和没食子儿茶素中的一种或多种。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将所述黑曲霉M03的种子液按1-4％(体积)的接种量接种至所述发酵培养基中，加入终浓度为10-30mg/L的所述儿茶素类化合物和30-80mg/L的茶氨酸作为底物，在30-40℃、160-240rpm下培养48-96h。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)种子液制备：取黑曲霉M03的孢子，制成1×105～1×107CFU/mL的孢子悬液，取孢子悬液按1-4％(体积)的接种量接种于PDB液体培养基中，在25-31℃、160-240rpm下培养12-24h，得到种子液；
2)液体发酵：将步骤1)得到的黑曲霉M03种子液按1-4％(体积)的接种量接种至所述发酵培养基中，加入终浓度为10-30mg/L的所述儿茶素类化合物和30-80mg/L的茶氨酸作为底物，在30-40℃、160-240rpm下培养48-96h。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)种子液制备：取黑曲霉M03的孢子，制成1×106CFU/mL的孢子悬液，取孢子悬液按2％(体积)的接种量接种于PDB液体培养基中，在28℃、200rpm下培养18h，得到种子液；
2)液体发酵：将步骤1)得到的黑曲霉M03种子液按2％(体积)的接种量接种至所述发酵培养基中，加入终浓度为20mg/L的儿茶素类化合物和50mg/L的茶氨酸作为底物，在35℃、200rpm下培养72h。
18.根据权利要求10和16中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的孢子悬液通过以下步骤制得：
将所述黑曲霉M03的孢子接种在PDA斜面培养基上，在25-30℃下培养1-5天待孢子成熟，用灭菌生理盐水洗下PDA斜面培养基上的孢子。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，将所述黑曲霉M03的孢子接种在PDA斜面培养基上，在28℃下培养3天。
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