CN103815279B - 一种富含辅酶q10红曲及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富含辅酶Q10红曲及其制备方法，以丛毛红曲菌和红色红曲菌为发酵菌株，以粳米和籼米为主要原料，辅以蔗糖、红辣椒粉和亚油酸，经分段控温培养而成富含辅酶Q10红曲。本发明利用双菌株混菌发酵，并结合控温培养制备富含辅酶Q10红曲，方法简单，易于控制，制得的红曲中辅酶Q10的含量可达400～550mg/kg，且不含桔霉素，同时在制备过程中添加红辣椒粉和亚油酸，可促进洛伐他汀和γ-氨基丁酸的合成，可作为原料广泛应用食品、药品和化妆品的加工。
Description
技术领域
本发明涉及一种红曲，尤其涉及一种富含辅酶Q10红曲及其制备方法。
背景技术
红曲历史悠久，是我国先民的伟大发现，其应用距今已有一千多年的历史，是我国宝贵的科学文化遗产。红曲又名丹曲，是以红曲霉为主发酵菌所生产的一种独特***米曲，主要用于黄酒酿造、食品发酵、色素生产和中医中药等方面。自古以来，红曲因对某些疾病具有良好的治疗功效，被我国中医认为是珍贵的保健营养产品。红曲产地分布于我国福建、浙江、江苏、台湾等省，其中福建省是我国红曲的主要产地，尤以古田红曲最为著名。
红曲霉是红曲的主要生产菌种，它属于真菌界子囊菌门不整囊菌纲散囊菌目红曲科红曲菌属。红曲霉可代谢合成多种生物活性物质，譬如红曲色素、洛伐他汀、麦角固醇和γ-氨基丁酸等，从而赋予红曲一定的生理保健功效，对癌症、老年痴呆症、高胆固醇、高血糖及高血压等疾病均有一定的防治功能。前期研究发现，红曲霉还能代谢合成另一种重要保健营养物质——辅酶Q10，该物质是呼吸链中的重要递氢体，能抑制线粒体过氧化作用，保护生物膜的完整性，同时也能治疗心血管***疾病。在已公开的专利和文献中，有关富含色素、洛伐他汀、麦角固醇和γ-氨基丁酸红曲的研究最为活跃，如公开号为CN 102703512 A的发明专利公开了一种利用红曲霉发酵生产功能性红曲色素的方法、公开号为CN 101999589 A的发明专利公开了一种富集γ-氨基丁酸及莫纳可林K的红曲糙米及生产方法、公开号为CN 102406127 A的发明专利公开了一种降脂红曲的制备方法、也有文献报道对功能性红曲色素发酵工艺进行研究（陈运中，食品科学，Vol.24,No.7,2003）等，但未见富含辅酶Q10红曲及红曲霉发酵生产辅酶Q10的相关报道。因此，研究和开发富含生物活性物质的红曲，具有十分重要的社会效益和经济效益，已成为人们关注的课题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种富含辅酶Q10红曲及其制备方法，本发明利用双菌株混菌发酵，并结合控温培养制备红曲，可大大提高红曲中辅酶Q10的含量，且方法简单，易于控制。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种富含辅酶Q10红曲，其辅酶Q10的含量为400～550mg/kg，不含桔霉素。
所述红曲是由购自日本技术评价研究所生物资源中心的丛毛红曲菌（Monascus pilosus，IFO4521）和红色红曲菌（Monascus rubber，NBRC32318）混合发酵所得。
富含辅酶Q10红曲的制备方法包括以下步骤：
1）种子液制备：将活化好的丛毛红曲菌和红色红曲菌的单菌落分别转接至平板PDA培养基30℃培养7～8天，再用2wt%的吐温-20无菌水分别将PDA平板上长出的孢子轻轻洗脱，制备丛毛红曲菌和红色红曲菌孢子菌悬液，使孢子菌悬液的浓度为105～106个/mL，两种孢子菌悬液分别接至种子培养基，接种量为15wt%，在30℃、150rpm下摇床培养2～4天，再将两种种子液等体积混合，备用；
2）曲饭制备：将粳米与籼米浸泡后沥干，使其水分含量为35%～40%，添加蔗糖、红辣椒粉和亚油酸，拌匀，采用蒸饭机蒸饭，蒸汽压力为0.2MPa，蒸饭18min，蒸饭出料口安装鼓风机降温，米饭温度降至36～38℃后进行接种；
3）接种：向步骤2）制备的曲饭中接入步骤1）制备的种子液，接种量为10～15wt%，充分拌匀后装箩摊平，盖上洁净的麻袋，送入曲房保温培养；
4）分段控温培养：将接种后的曲饭放于消毒后的曲房内，前4天曲房温度控制在30～32℃，随后温度控制在28℃培养1～3天，最后在25℃培养7～9天，共培养14～16天；
5）烘干：将发酵好的红曲倒入烘干池中，保持温度在38～40℃下热风烘干。
步骤1）中的种子培养基是将甘油50mL，葡萄糖30g，酵母膏10g，蛋白胨8g，硝酸钾2g，磷酸二氢铵1g，七水硫酸镁1g，米粉20g，加水定容至1L，再用氢氧化钠调节pH至5.8～6.0，121℃灭菌20分钟。
步骤2）中粳米与籼米的重量比为1:3～1:5。
步骤2）中蔗糖用量为3～5wt%，红辣椒粉用量为0.1～0.2wt%，亚油酸0.02～0.04wt%。
本发明的显著优点在于：
（1）本发明采用不产桔霉素的红曲菌作为发酵菌株，通过双菌株混菌发酵，并结合控温培养，可大大提高红曲中辅酶Q10的含量。
（2）本发明的制备方法中添加红辣椒粉和亚油酸，可显著刺激红曲菌自身代谢合成辅酶Q10，同时也促进了洛伐他汀和γ-氨基丁酸的合成。
（3）本发明所制备的红曲不仅富含辅酶Q10，且含有其他生物活性成分（洛伐他汀、γ-氨基丁酸），可作为原料应用到食品、药品和化妆品加工中，用途十分广泛。
（4）本发明的制备方法采用固态纯种发酵，工艺简单，容易操作，可实现工业化大生产。
具体实施方式
实施例1
一种富含辅酶Q10红曲的制备方法包括以下步骤：
（1）种子液制备：将活化好的丛毛红曲菌（IFO4521）和红色红曲菌（NBRC32318）的单菌落分别转接至平板PDA培养基30℃培养7天，再用2wt%的吐温-20无菌水分别将PDA平板上长出的孢子轻轻洗脱，制备丛毛红曲菌和红色红曲菌孢子菌悬液，孢子菌悬液的浓度为2.4×105个/mL，两种孢子菌悬液分别接至种子培养基，接种量为15wt%，在30℃、150rpm下摇床培养2天，再将两种种子液等体积混合，备用；
种子培养基是将甘油50mL，葡萄糖30g，酵母膏10g，蛋白胨8g，硝酸钾2g，磷酸二氢铵1g，七水硫酸镁1g，米粉20g，加水定容至1L，再用氢氧化钠调节pH至5.8，用500mL的三角瓶分装，121℃灭菌20分钟；
（2）曲饭制备：将1kg粳米和3kg籼米在25℃水温下浸泡10小时后沥干，使其水分含量为35%，添加蔗糖120g、红辣椒粉4g和亚油酸1.2g后拌匀，采用蒸饭机蒸饭，蒸汽压力为0.2MPa，蒸饭18min，蒸饭出料口安装鼓风机降温，米饭温度降至36℃后进行接种；
（3）接种：向将降温后的曲饭中接入400g种子液，充分拌匀后装箩摊平，盖上洁净的麻袋，送入曲房保温培养；
（4）分段控温培养：将接种后的曲饭放于消毒后的曲房内，前4天曲房温度控制在32℃，随后温度控制在28℃培养1天，最后在25℃培养9天，共培养14天；
（5）烘干：将发酵好的红曲倒入烘干池中，保持温度在38℃下热风烘干。
红曲中辅酶Q10含量HPLC测定方法如下：
色谱条件：色谱柱为Shim-Pack VP-ODS C18（5μm，250×4.6nm，日本岛津），流动相为甲醇-乙醇（体积比为1:1），流速为1.0mL/min，柱温35℃，检测波长275nm；进样体积10μL。
样品处理方法：红曲粉碎过40目筛，准确称取0.5g作为试样，加入甲醇超声提取，以5000r/min离心10min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，待检。
结果：红曲中辅酶Q10含量以干重计400mg/kg。
红曲中洛伐他汀含量HPLC测定方法如下：
色谱条件：色谱柱为Shim-Pack VP-ODS C18（5μm，250×4.6nm，日本岛津），流动相为甲醇-水（体积比为83:17），流速为1.0mL/min，柱温35℃，检测波长238nm；进样体积10μL。
样品处理方法：红曲粉碎后过40目筛，准确称取2g作为试样，加入异丙醇超声提取，以5000r/min离心10min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，待检。
结果：红曲中洛伐他汀含量以干重计3.34g/kg。
红曲中γ-氨基丁酸含量HPLC测定方法如下：
色谱条件：色谱柱为Shim-Pack VP-ODS C18（5μm，250×4.6nm，日本岛津），流动相A为甲醇，流动相B为四氢呋喃-甲醇-0.05mol/L氢氧化钠钠（体积比5:75:420），流动相A：流动相B=20:80（v/v），流速为1.0mL/min，柱温35℃，检测波长275nm；进样体积10μL。
样品处理方法：红曲粉碎后过40目筛，准确称取0.5g作为试样，加水于85℃水浴提取，5000r/min离心10min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，待检。
结果：红曲中γ-氨基丁酸含量以干重计330g/kg。
红曲中桔霉素含量HPLC测定方法如下：
色谱条件：色谱柱为Shim-Pack VP-ODS C18（5μm，250×4.6nm，日本岛津），流动相为乙氰-水（用色谱纯磷酸调pH至2.5，体积比35:65），流速为1.0mL/min，柱温35℃，检测波长254nm；进样体积10μL。
样品处理方法：红曲粉碎后过40目筛，准确称取1g作为试样，在磁力搅拌下缓缓加入20mLTEF溶液（甲苯：乙酸乙酯：甲酸=7:3:1，v/v/v），搅拌30min，5000r/min离心10min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，待检。
结果：未检测出桔霉素。
实施例2
一种富含辅酶Q10红曲的制备方法包括以下步骤：
（1）种子液制备：将活化好的丛毛红曲菌（IFO4521）和红色红曲菌（NBRC32318）单菌落分别转接至平板PDA培养基30℃培养8天，再用2wt%的吐温-20无菌水分别将PDA平板上长出的孢子轻轻洗脱，制备丛毛红曲菌和红色红曲菌孢子菌悬液，使孢子菌悬液的浓度为5.6×105个/mL，两种孢子菌悬液分别接至种子培养基，接种量为15wt%，在30℃、150rpm下摇床培养3天，再将两种种子液等体积混合，备用；
种子培养基是将甘油50mL，葡萄糖30g，酵母膏10g，蛋白胨8g，硝酸钾2g，磷酸二氢铵1g，七水硫酸镁1g，米粉20g，加水定容至1L，再用氢氧化钠调节pH至5.9，用500mL的三角瓶分装，121℃灭菌20分钟；
（2）曲饭制备：将1kg粳米和5kg籼米在25℃水温下浸泡10小时后沥干，使其水分含量为38%，添加蔗糖300g、红辣椒粉12g和亚油酸1.2g后拌匀，采用蒸饭机蒸饭，蒸汽压力为0.2MPa，蒸饭18min，之后用鼓风机使曲饭温度降至37℃后进行接种；
（3）接种：向将降温后的曲饭中接入660g种子液，充分拌匀后装箩摊平，盖上洁净的麻袋，送入曲房保温培养；
（4）分段控温培养：将接种后的曲饭放于消毒后的曲房内，前4天曲房温度控制在30℃，随后温度控制在28℃培养3天，最后在25℃培养9天，共培养16天；
（5）烘干：将发酵好的红曲倒入烘干池中，保持温度在39℃下热风烘干。
以实施例1的HPLC方法检测，红曲中辅酶Q10、洛伐他汀和γ-氨基丁酸的含量分别为550mg/kg、3.08g/kg和294mg/kg，桔霉素未检出。
实施例3
一种富含辅酶Q10红曲的制备方法包括以下步骤：
（1）种子液制备：将活化好的丛毛红曲菌（IFO4521）和红色红曲菌（NBRC32318）单菌落分别转接至平板PDA培养基30℃培养8天，再用2wt%的吐温-20无菌水分别将PDA平板上长出的孢子轻轻洗脱，制备丛毛红曲菌和红色红曲菌孢子菌悬液，使孢子菌悬液的浓度为1.8×105个/mL，两种孢子菌悬液分别接至种子培养基，接种量为15wt%，在30℃、150rpm下摇床培养4天，再将两种种子液等体积混合，备用；
种子培养基是将甘油50mL，葡萄糖30g，酵母膏10g，蛋白胨8g，硝酸钾2g，磷酸二氢铵1g，七水硫酸镁1g，米粉20g，加水定容至1L，再用氢氧化钠调节pH至6.0，用500mL的三角瓶分装，121℃灭菌20分钟；
（2）曲饭制备：将1kg粳米和4kg籼米在25℃水温下浸泡10小时后沥干，使其水分含量为40%，添加蔗糖200g、红辣椒粉10g和亚油酸2g后拌匀，采用蒸饭机蒸饭，蒸汽压力为0.2MPa，蒸饭18min，之后用鼓风机使曲饭温度降至38℃后进行接种；
（3）接种：向将降温后的曲饭中接入750g种子液，充分拌匀后装箩摊平，盖上洁净的麻袋，送入曲房保温培养；
（4）分段控温培养：将接种后的曲饭放于消毒后的曲房内，前4天曲房温度控制在30℃，随后温度控制在28℃培养3天，最后在25℃培养8天，共培养15天；
（5）烘干：将发酵好的红曲倒入烘干池中，保持温度在40℃下热风烘干。
以实施例1的HPLC方法检测，红曲中辅酶Q10、洛伐他汀和γ-氨基丁酸的含量分别为496mg/kg、3.15g/kg和288mg/kg，桔霉素未检出。
实施例4
本实施例按常规工艺仅以籼米为原料，以丛毛红曲菌为发酵菌株经分段控温培养功能作为对照。其制备方法包括以下步骤：
（1）种子液制备：将活化好的丛毛红曲菌（IFO4521）单菌落转接至平板PDA培养基30℃培养8天，再用2wt%的吐温-20无菌水分别将PDA平板上长出的孢子轻轻洗脱，制备丛毛红曲菌和红色红曲菌孢子菌悬液，使孢子菌悬液的浓度为7.4×105个/mL，将孢子菌悬液接至种子培养基，接种量为15wt%，在30℃、150rpm下摇床培养3天，得种子液备用；
种子培养基采用PDA液体培养基，再用氢氧化钠调节pH至5.9，用500mL的三角瓶分装，121℃灭菌20分钟。
（2）曲饭制备：将6kg籼米在25℃水温下浸泡10h后沥干，使其水分含量为35%，采用蒸饭机蒸饭，蒸汽压力为0.2MPa，蒸饭18min，之后用鼓风机使曲饭温度降至36℃。
（3）接种：向将降温后的曲饭中接入600g种子液，充分拌匀后装箩摊平，盖上灭菌后的麻袋，送入曲房保温培养。
（4）恒温培养：将接种后曲饭放于消毒后的曲房内，在30℃下培养时间16天；
（5）烘干：将发酵好的红曲倒入烘干池中，保持温度在39℃下热风烘干。
以实施例1的HPLC方法检测，红曲中辅酶Q10、洛伐他汀和γ-氨基丁酸的含量分别为46.34mg/kg、2.05g/kg和220mg/kg，桔霉素未检出。
通过比较表明，采用本发明制得的红曲中辅酶Q10的含量大大高于常规工艺，洛伐他汀和γ-氨基丁酸的含量也有明显提高，可见，本发明的制备方法简单，制得的红曲品质高，具有显著的效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (4)
1.一种富含辅酶Q10红曲的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）种子液制备：将活化好的丛毛红曲菌和红色红曲菌的单菌落分别转接至平板PDA培养基30℃培养7～8天，再用2wt%的吐温-20无菌水分别将PDA平板上长出的孢子轻轻洗脱，制备丛毛红曲菌和红色红曲菌孢子菌悬液，使孢子菌悬液的浓度为105～106个/mL，两种孢子菌悬液分别接至种子培养基，接种量为15wt%，在30℃、150rpm下摇床培养2～4天，再将两种种子液等体积混合，备用；
2）曲饭制备：将粳米与籼米浸泡后沥干，使其水分含量为35%～40%，添加蔗糖、红辣椒粉和亚油酸，拌匀，采用蒸饭机蒸饭，蒸汽压力为0.2MPa，蒸饭18min，待出料的曲饭温度降至36～38℃后进行接种；
3）接种：向步骤2）制备的曲饭中接入步骤1）制备的种子液，接种量为10～15wt%，充分拌匀后装箩摊平，盖上洁净的麻袋，送入曲房保温培养；
分段控温培养：将接种后的曲饭放于消毒后的曲房内，前4天曲房温度控制在30～32℃，随后温度控制在28℃培养1～3天，最后在25℃培养7～9天，共培养14～16天；
4）烘干：将发酵好的红曲倒入烘干池中，保持温度在38～40℃下热风烘干；
所得红曲中辅酶Q10的含量为400～550mg/kg，不含桔霉素。
2.根据权利要求1所述富含辅酶Q10红曲的制备方法，其特征在于：步骤1）中的种子培养基是将甘油50mL，葡萄糖30g，酵母膏10g，蛋白胨8g，硝酸钾2g，磷酸二氢铵1g，七水硫酸镁1g，米粉20g混合后，加水定容至1L，再用氢氧化钠调节pH值至5.8～6.0，121℃灭菌20分钟后制得。
3.根据权利要求1所述富含辅酶Q10红曲的制备方法，其特征在于：步骤2）中粳米与籼米的重量比为1:3～1:5。
4.根据权利要求1所述富含辅酶Q10红曲的制备方法，其特征在于：步骤2）中蔗糖用量为3～5wt%，红辣椒粉用量为0.1～0.2wt%，亚油酸0.02～0.04wt%。
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