TWI780140B - 免疫結合物 - Google Patents

免疫結合物 Download PDF

Info

Publication number
TWI780140B
TWI780140B TW107111635A TW107111635A TWI780140B TW I780140 B TWI780140 B TW I780140B TW 107111635 A TW107111635 A TW 107111635A TW 107111635 A TW107111635 A TW 107111635A TW I780140 B TWI780140 B TW I780140B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
amino acid
domain
seq
antigen
binding
Prior art date
Application number
TW107111635A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201842937A (zh
Inventor
迪克 蘿拉 柯達瑞
克里斯俊 克雷恩
蘿拉 羅安納
史蒂芬 席伯
帕伯羅 優瑪那
櫻加 華德豪爾
Original Assignee
瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 filed Critical 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
Publication of TW201842937A publication Critical patent/TW201842937A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI780140B publication Critical patent/TWI780140B/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor

Abstract

本發明大體上係關於免疫結合物，特定言之，包含突變型介白素-2多肽及結合至PD-1與Tim-3之雙特異性抗原結合分子的免疫結合物。另外，本發明係關於編碼免疫結合物的聚核苷酸分子，以及包含此類聚核苷酸分子的載體及宿主細胞。本發明另外關於製備突變型免疫結合物的方法、包含其的醫藥組合物，及其用途。

Description

免疫結合物
本發明大體上係關於免疫結合物，特定言之，包含突變型介白素-2多肽及結合至PD-1與Tim-3之雙特異性抗原結合分子的免疫結合物。另外，本發明係關於編碼免疫結合物的聚核苷酸分子，以及包含此類聚核苷酸分子的載體及宿主細胞。本發明另外關於製備突變型免疫結合物的方法、包含其的醫藥組合物，及其用途。
介白素-2 (IL-2)，亦稱為T細胞生長因子(TCGF)，為15.5 kDa球形醣蛋白，其在淋巴球產生、存活及恆定方面起主要作用。其具有133個胺基酸的長度且由四個逆平行兩性α-螺旋組成，該等α螺旋形成其功能必不可少的四級結構(Smith, Science 240, 1169-76 (1988)；Bazan, Science 257, 410-413 (1992))。來自不同物種之IL-2的序列發現於NCBI RefSeq編號NP000577(人類)、NP032392(小鼠)、NP446288(大鼠)或NP517425 (黑猩猩)。 IL-2藉由結合至IL-2受體(IL-2R)來介導其作用，該等受體由至多三個個別亞單元組成，其不同的結合可以產生針對IL-2之親和力不同的受體形式。α (CD25)、β (CD122)及γ (γc ， CD132)亞單元的結合產生IL-2的三聚合高親和力受體。由β及γ亞單元組成的二聚合IL-2受體稱為中等親和力IL-2R。α亞單元形成低親和力單體IL-2受體。雖然中等親和力的二聚合IL-2受體結合IL-2的親和力比高親和力三聚合受體低約100倍，但二聚合與三聚合IL-2受體變異體均能夠在IL-2結合後傳輸信號(Minami等人, Annu Rev Immunol 11, 245-268 (1993))。因此，α亞單元CD25並非IL-2信號傳導所必需的。其以高親和力結合至其受體，而β亞單元CD122及γ-亞單元為信號轉導的關鍵(Krieg等人, Proc Natl Acad Sci 107, 11906-11 (2010))。(靜止) CD4+ 叉頭框P3 (FoxP3)+ 調控T (Treg )細胞表現三聚合IL-2受體，包括CD25。其亦短暫誘導於習知活化T細胞上，而此等細胞在靜止狀態下僅表現二聚合IL-2受體。Treg 細胞在活體內始終最高量地表現CD25 (Fontenot等人, Nature Immunol 6, 1142-51 (2005))。 IL-2主要由活化T細胞(特定而言，CD4+ 輔助T細胞)合成。其刺激T細胞增殖及分化，誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)產生及周邊血液淋巴細胞分化成細胞毒性細胞及淋巴介質活化殺手(LAK)細胞，促進T細胞表現細胞介素及溶胞分子，促使B細胞增殖及分化以及B細胞合成免疫球蛋白，且刺激天然殺手(NK)細胞產生、增殖及活化(回顧於例如Waldmann, Nat Rev Immunol 6, 595-601 (2009)；Olejniczak及Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-89 (2008)；Malek, Annu Rev Immunol 26, 453-79 (2008))。 其使淋巴球群體在活體內擴增及增強此等細胞效應功能的能力賦予IL-2抗腫瘤作用，使得IL-2免疫療法成為某些轉移癌之吸引人的治療選項。因此，高劑量IL-2療法已批准用於患有轉移性腎細胞癌及惡性黑色素瘤的患者。 然而，IL-2在免疫反應方面具有雙重功能：其不僅介導效應細胞擴增及活性，而且主要涉及周邊免疫耐受性的維持。 周邊自身耐受性所依據的主要機制為IL-2誘導T細胞發生活化誘導式細胞死亡(AICD)。AICD為一種過程，完全活化的T細胞藉此過程經由與細胞表面表現的死亡受體(諸如CD95 (亦稱為Fas)或TNF受體)接合而經歷程式化細胞死亡。當在增殖期間表現高親和力IL-2受體(預先暴露於IL-2之後)的抗原活化T細胞用抗原、經由T細胞受體(TCR)/CD3複合體再刺激時，誘導Fas配位體(FasL)及/或腫瘤壞死因子(TNF)之表現，使得該等細胞容易發生Fas介導的細胞凋亡。此過程具有IL-2依賴性(Lenardo, Nature 353, 858-61 (1991))且經由STAT5介導。AICD過程不僅可以對自身抗原，而且可以對顯然不是宿主體格之一部分的持久性抗原(諸如腫瘤抗原)建立T淋巴細胞耐受性。 此外，IL-2亦涉及周邊CD4+ CD25+ 調控T (Treg )細胞的維持(Fontenot等人, Nature Immunol 6, 1142-51 (2005)；D'Cruz及Klein, Nature Immunol 6, 1152-59 (2005)；Maloy及Powrie, Nature Immunol 6, 1171-72 (2005)，其亦稱為抑制T細胞。其經由細胞-細胞接觸、藉由抑制T細胞幫助及活化，或經由免疫抑制細胞介素(諸如IL-10或TGF-β)的釋放來抑制效應T細胞摧毀其(自身)標靶。Treg 細胞的耗竭已表明可增強IL-2誘導抗腫瘤免疫力(Imai等人, Cancer Sci 98, 416-23 (2007))。 因此，IL-2並非抑制腫瘤生長之最佳選項，原因是在IL-2存在下，所產生的CTL可能會將腫瘤識別為自身且經歷AICD，或IL-2依賴性Treg 細胞可能會抑制免疫反應。 關於IL-2免疫療法的另一個擔憂為重組人類IL-2療法所產生的副作用。接受高劑量IL-2療法的患者頻繁地經歷嚴重的心血管、肺、腎、肝、胃腸、神經、皮膚、血液及全身不良事件，此需要密集的監測及住院管理。此等副作用中的大部分可以解釋為：所謂血管(或毛細管)滲漏症候群(VLS)的發展；血管通透性出現病理性增強，引起多種器官之體液外滲(導致例如肺及皮膚水腫及肝臟細胞損傷)及血管內體液耗竭(導致血壓下降及心率補償性增強)。除停服IL-2之外，不存在VLS之療法。為了避免VLS，已在患者中測試低劑量IL-2療法，然而以次最佳的治療結果為代價。咸信VLS係由促炎性細胞介素的釋放引起，諸如IL-2活化的NK細胞釋放腫瘤壞死因子(TNF)-α，然而最近已表明，IL-2誘發的肺水腫起因於IL-2直接結合至肺內皮細胞，以致肺內皮細胞以低至中等水準表現功能性αβγ IL-2受體(Krieg等人, Proc Nat Acad Sci USA 107, 11906-11 (2010))。 已採取若干方法克服與IL-2免疫療法相關的此等問題。舉例而言，已發現IL-2與某些抗IL-2單株抗體的組合使IL-2的活體內治療作用增強(Kamimura等人, J Immunol 177, 306-14 (2006)；Boyman等人, Science 311, 1924-27 (2006))。在一種替代方法中，IL-2已以各種方式突變，以減少其毒性且/或增強其功效。Hu等人(Blood 101, 4853-4861 (2003)；美國專利公開案第2003/0124678號)已用色胺酸取代IL-2之位置38處的精胺酸殘基，以排除IL-2的血管通透活性。Shanafelt等人(Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000))已使天冬醯胺88突變為精胺酸，以增強對T細胞而非NK細胞的選擇性。Heaton等人(Cancer Res 53, 2597-602 (1993)；美國專利第5,229,109號)已引入兩種突變：Arg38Ala及Phe42Lys，以減少NK細胞分泌促炎性細胞介素。Gillies等人(美國專利公開案第2007/0036752號)已取代IL-2中之三個殘基(Asp20Thr、Asn88Arg及Gln126Asp)，其有助於針對中等親和力IL-2受體的親和力，從而減輕VLS。Gillies等人(WO 2008/0034473)亦已藉由胺基酸取代Arg38Trp及Phe42Lys而使IL-2與CD25之界面發生突變，以減少與CD25之相互作用及Treg 細胞活化，從而增強功效。為了相同目的，Wittrup等人(WO 2009/061853)已產生IL-2突變體，其對CD25的親和力增強，但不活化該受體，從而充當拮抗劑。所引入的突變旨在中斷與受體之β-亞單元及/或γ-亞單元的相互作用。 WO 2012/107417中描述了一種特定的突變型IL-2多肽，其經設計而克服與IL-2免疫療法相關的上述問題(VLS誘導所引起的毒性、AICD誘導所引起的腫瘤耐受性，及Treg 細胞活化所引起的免疫抑制)。IL-2之位置42處的***酸殘基經丙胺酸取代、位置45處的酪胺酸殘基經丙胺酸取代及位置72處的白胺酸殘基經甘胺酸取代基本上消除了此突變型IL-2多肽對IL-2受體之α-亞單元(CD25)的結合。 除上述方法之外，亦可藉由使IL-2選擇性地靶向腫瘤來改良IL-2免疫療法，例如以包含結合至腫瘤細胞上所表現之抗原之抗體的免疫結合物形式。若干種此類免疫結合物已有描述(參見例如Ko等人, J Immunother (2004) 27, 232-239；Klein等人, Oncoimmunology (2017) 6 (3), e1277306)。 然而，腫瘤可以藉由使抗體之靶抗原排出、突變或下調而能夠逃避此類靶向。此外，靶向腫瘤的IL-2與主動排除淋巴細胞的腫瘤微環境中的效應細胞(諸如細胞毒性T淋巴細胞(CTL))可能不會達成最佳的接觸。 因此，仍需要進一步改良IL-2免疫療法。可以避開腫瘤靶向問題的一種方法為使IL-2直接靶向效應細胞，特定而言，CTL。 Ghasemi等人已描述IL-2與NKG2D結合蛋白之融合蛋白(Ghashemi等人, Nat Comm (2016) 7, 12878)，其用於使IL-2靶向攜帶NKG2D的細胞，諸如自然殺手(NK)細胞。 程式化細胞死亡蛋白1 (PD1或CD279)為CD28受體家族之抑制成員，該家族亦包括CD28、CTLA-4、ICOS及BTLA。PD-1為細胞表面受體且表現於活化B細胞、T細胞及骨髓細胞上(Okazaki等人(2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82；Bennett等人(2003) J Immunol 170:711-8)。PD1之結構係單體1型跨膜蛋白，其由一個免疫球蛋白可變樣細胞外域及含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基元(ITIM)及基於免疫受體酪胺酸之開關基元(ITSM)之細胞質域組成。已鑑別出PD-1之兩種配位體：PD-Ll及PD-L2，其已展示在結合至PD-1後即下調T細胞活性(Freeman等人(2000) J Exp Med 192: 1027-34；Latchman等人(2001) Nat Immunol 2:261-8；Carter等人(2002) Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1與PD-L2均為結合至PD-1，但不結合至其他CD28家族成員之B7同源物。PD-1之一種配位體PD-Ll富含於多種人類癌症中(Dong等人(2002) Nat. Med 8:787-9)。PD-1與PD-L1之間的相互作用使得腫瘤浸潤性淋巴球減少、T細胞受體介導之增殖減少及癌細胞之免疫逃避(Dong等人(2003) J. MoI. Med. 81:281-7；Blank等人(2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314；Konishi等人(2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100)。免疫抑制(T細胞功能障礙或耗竭)可以藉由抑制PD-1與PD-Ll之局部相互作用而逆轉，且當PD-1與PD-L2之相互作用亦阻斷時，效果具相加性(Iwai等人(2002) Proc. Nat 7. Acad. ScL USA 99: 12293-7；Brown等人(2003) J. Immunol. 170:1257-66)。 然而，靶向單獨的PD-1-PD-L1路徑不能始終引起T細胞耗竭之逆轉(Gehring等人, Gastroenterology 137 (2009), 682-690)，此表明其它分子可能涉及T細胞耗竭(Sakuishi, J. Experimental Med. 207 (2010), 2187-2194)。 Tim-3為最初經鑑別選擇性地表現於分泌IFN-γ之Th1及Tc1細胞上的一種分子(Monney等人, Nature 415 (2002), 536-541)。Tim-3與其配位體半乳糖凝集素-9之相互作用觸發Tim-3+ T細胞發生細胞死亡。因此，Tim-3與PD-1均可以充當T細胞反應之負調控劑。已證明，在實體惡性疾病與血液科惡性疾病之臨床前模型中，Tim-3標誌著受最大抑制的或功能異常的CD8+ T細胞群(Sakuishi, J. Experimental Med. 207 (2010), 2187-2194；Zhou, Blood 117 (2011), 4501-4510；Majeti R等人, PNAS, 106 (2009), 3396-3401)。在此等模型中，所有CD8+ Tim-3+ T細胞共同表現PD-1，且此等雙重表現細胞在細胞週期進展與效應子細胞介素產生[介白素(IL)-2、TNF及IFN-γ]中展現的缺陷大於僅表現PD-1的細胞。因此，Tim-3路徑可以與PD-1路徑協同作用，以促進CD8+ T細胞在癌症中的嚴重功能異常表型發展。因此預期Tim-3與PD-1路徑之靶向組合高度有效地控制腫瘤生長。 結合至PD-1與Tim-3的雙特異性抗體描述於例如PCT專利申請案第PCT/EP2016/073192號中。此等雙特異性抗體不僅有效阻斷過度表現兩種抗原之T細胞上的PD-1及Tim-3，而且其對於此等細胞具有很大的選擇性且藉此可以避免與阻斷其它細胞(諸如先天免疫細胞(例如未處理樹突狀細胞(DC)及單核球))上之Tim-3相關的副作用。
本發明提供一種使具有免疫療法有利特性之突變型IL-2直接靶向免疫效應細胞(諸如細胞毒性T淋巴細胞)而非腫瘤細胞的新穎方法。靶向免疫效應細胞係藉由使該突變型IL-2分子與結合至PD-1及Tim-3的雙特異性抗原結合分子結合來達成。 本發明中所用之IL-2突變體經設計已克服與IL-2免疫療法相關的問題，特定而言，誘導VLS所引起的毒性、誘導AICD所引起的腫瘤耐受性，及活化Treg 細胞所引起的免疫抑制。除防止腫瘤躲避如上文所提及的腫瘤靶向之外，IL-2突變體靶向免疫效應細胞可以進一步增強CTL優先於免疫抑制性Treg 細胞的活化。藉由使用結合至PD-1及Tim-3的雙特異性抗原結合分子，可以另外逆轉PD-1/PD-L1路徑及/或Tim-3所誘導的T細胞活性抑制，從而進一步增強免疫反應。PD-1與Tim-3靶向組合進一步增強免疫結合物特定地靶向表現兩種抗原的耗竭T細胞。 在第一態樣中，本發明提供一種免疫結合物，其包含突變型IL-2多肽以及結合至PD-1及Tim-3的雙特異性抗原結合分子， 其中該突變型IL-2多肽為包含胺基酸取代F42A、Y45A及L72G (相對於人類IL-2序列SEQ ID NO: 22編號)的人類IL-2分子；且其中該雙特異性抗原結合分子包含(i)結合至PD-1的第一抗原結合部分，及(ii)結合至Tim-3的第二抗原結合部分。 在一些實施例中，第一抗原結合部分包含：(a)重鏈可變區(VH)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 1的HVR-H1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 2的HVR-H2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 3的HVR-H3；以及(b)輕鏈可變區(VL)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 4的HVR-L1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 5的HVR-L2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 6的HVR-L3。在一些實施例中，第一抗原結合部分包含：(a)重鏈可變區(VH)，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 7至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及(b)輕鏈可變區(VL)，其包含與選自由SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 11組成之群的胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。 在一些實施例中，第二抗原結合部分包含：(a)重鏈可變區(VH)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 12的HVR-H1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 13的HVR-H2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 14的HVR-H3；以及(b)輕鏈可變區(VL)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 15的HVR-L1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 16的HVR-L2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 17的HVR-L3。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含：(a)重鏈可變區(VH)，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 18至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，及(b)輕鏈可變區(VL)，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 19至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；或(a)重鏈可變區(VH)，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 20至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，及(b)輕鏈可變區(VL)，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 21至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。 在一些實施例中，突變型IL-2多肽進一步包含胺基酸取代T3A及/或胺基酸取代C125A。在一些實施例中，突變型IL-2多肽包含SEQ ID NO: 23序列。在一些實施例中，免疫結合物包含不超過一種突變型IL-2多肽。 在一些實施例中，第一及/或第二抗原結合部分為Fab分子。在一些實施例中，第一或第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈中的可變域VL與VH或恆定域CL與CH1 (特定言之，可變域VL與VH)彼此置換。在一些實施例中，第一或第二抗原結合部分為Fab分子，其中在恆定域中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)且位置123處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在恆定域CH1中，位置147處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。在一些實施例中，第一抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈中的可變域VL與VH彼此置換，且第二抗原結合部分為Fab分子，其中在恆定域中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代，尤其經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且在恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。 在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含由第一及第二亞單元組成的Fc域。在一些實施例中，Fc域為IgG類別(特定而言，IgG1 子類) Fc域。在一些實施例中，Fc域為人類Fc域。在一些實施例中，Fc域包含促進Fc域之第一與第二亞單元結合的修飾。在一些實施例中，Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸殘基經具有較大側鏈體積的胺基酸殘基置換，藉此在第一亞單元之CH3域內產生可定位於第二亞單元之CH3域內之空腔中的隆凸，且Fc域之第二亞單元之CH3域中的胺基酸殘基經具有較小側鏈體積的胺基酸殘基置換，藉此在第二亞單元之CH3域內產生可供第一亞單元之CH3域內之隆凸可定位於其中的空腔。在一些實施例中，在Fc域之第一亞單元中，位置366處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基置換(T366W)，且在Fc域之第二亞單元的CH3域中，位置407處的酪胺酸殘基經纈胺酸殘基置換(Y407V)且視情況，位置366處之蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基置換(T366S)且位置368處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L368A)(根據Kabat EU索引編號)。在一些此類實施例中，在Fc域之第一亞單元中，另外，位置354處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基(S354C)置換或位置356之麩胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(E356C)，且在Fc域之第二亞單元中，另外，位置349處之酪胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(Y349C)(根據Kabat EU索引編號)。 在一些實施例中，突變型IL-2多肽的胺基端胺基酸與Fc域之亞單元之一(特定而言，Fc域之第一亞單元)的羧基端胺基酸融合，視情況經由連接肽融合。在一些實施例中，連接肽具有胺基酸序列SEQ ID NO: 24。 在一些實施例中，第一抗原結合部分為Fab分子且在Fab重鏈之C端與Fc域之亞單元之一(特定而言，Fc域之第一亞單元)之N端融合，且第二抗原結合部分為Fab分子且在Fab重鏈之C端與Fc域之亞單元之一(特定而言，Fc域之第二亞單元)之N端融合。在一些實施例中，第一及第二抗原結合部分各自經由免疫球蛋白鉸鏈區與Fc域融合。 在一些實施例中，Fc域包含一種或多種胺基酸取代，其減少對Fc受體(特定而言，Fcγ受體)的結合及/或效應功能，特定而言，抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)。在一些此類實施例中，該一或多種胺基酸取代位於選自L234、L235及P329之群的一或多個位置(Kabat EU索引編號)。在一些實施例中，Fc域中之每個亞單元包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G (Kabat EU索引編號)。 在一些實施例中，免疫結合物包含：含有胺基酸序列與SEQ ID NO: 25序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的多肽、含有胺基酸序列與SEQ ID NO: 26序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的多肽、含有胺基酸序列與SEQ ID NO: 27序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的多肽，及含有胺基酸序列與SEQ ID NO: 28序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的多肽。 在一些實施例中，免疫結合物基本上由突變型IL-2多肽及IgG1 免疫球蛋白分子(其中一種Fab分子中的重鏈及輕鏈可變區或恆定區彼此置換)經連接子序列連接而組成。 本發明進一步提供一或多種編碼本發明之免疫結合物的分離聚核苷酸、一或多種包含該等聚核苷酸的載體(特定而言，表現載體)，及包含該(等)聚核苷酸或該(等)載體的宿主細胞。 亦提供一種製備免疫結合物之方法，該免疫結合物包含突變型IL-2多肽以及結合至PD-1及Tim-3的雙特異性抗原結合分子，該方法包含(a)在適於免疫結合物表現的條件下培養本發明之宿主細胞，及視情況，(b)回收該免疫結合物。本發明亦提供一種藉由該方法產生的免疫結合物，該免疫結合物包含突變型IL-2多肽以及結合至PD-1及Tim-3的雙特異性抗原結合分子。 本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含本發明之免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑；及使用本發明之免疫結合物的方法。 特定言之，本發明涵蓋根據本發明的免疫結合物，其用作藥劑，及用於治療疾病。在一個特定實施例中，該疾病為癌症。 本發明亦涵蓋根據本發明之免疫結合物用於製造供治療疾病用之藥劑的用途。在一個特定實施例中，該疾病為癌症。 另外提供一種治療個體之疾病的方法，包含向該個體投與治療有效量之包含根據本發明之免疫結合物的組合物，其呈醫藥學上可接受之形式。在一個特定實施例中，該疾病為癌症。 亦提供一種刺激個體之免疫系統的方法，包含向該個體投與有效量之包含根據本發明之免疫結合物的組合物，其醫藥學上可接受之形式。
定義 除非下文中另外定義，否則術語在本文中的使用如此項技術一般性所用。 除非另外指明，否則如本文所用，術語「介白素-2」或「IL-2」係指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)之任何原生IL-2。該術語涵蓋未處理之IL-2以及在細胞中處理所產生之任何形式的IL-2。該術語亦涵蓋天然存在之IL-2變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。例示性人類IL-2之胺基酸序列展示於SEQ ID NO: 22中。未處理之人類IL-2另外包含具有序列SEQ ID NO: 32之N端20個胺基酸信號肽，所述信號肽不存在於成熟IL-2分子中。 如本文所用，術語「IL-2突變體」或「突變型IL-2多肽」希望涵蓋各種形式之IL-2分子的任何突變型，包括全長IL-2、截斷的IL-2形式及其中IL-2藉由融合或化學結合與另一分子連接的形式。「全長」當關於IL-2使用時，意指成熟、天然長度的IL-2分子。舉例而言，全長人類IL-2是指一種具有133個胺基酸的分子(參見例如SEQ ID NO: 22)。IL-2突變體之各種形式的特徵為具有至少一種影響IL-2與CD25相互作用的胺基酸突變。此突變可能涉及通常位於該位置之野生型胺基酸殘基的取代、缺失、截斷或修飾。較佳為藉由胺基酸取代獲得的突變體。除非另外指明，否則IL-2突變體在本文中可以稱作突變型IL-2肽序列、突變型IL-2多肽、突變型IL-2蛋白質或突變型IL-2類似物。 各種形式之IL-2在本文中根據SEQ ID NO: 22中所示的序列標示。本文中可以使用不同名稱表示相同突變。舉例而言，位置42處之***酸突變為丙胺酸可以用42A、A42、A42 、F42A或Phe42Ala表示。 如本文所用，「人類IL-2分子」意指包含與人類IL-2序列SEQ ID NO: 22至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%或至少約96%一致之胺基酸序列的IL-2分子。特定而言，序列一致性為至少約95%，更特定言之，至少約96%。在特定實施例中，人類IL-2分子為全長IL-2分子。 如本文所用，術語「胺基酸突變」意欲包含胺基酸取代、缺失、***及修飾。取代、缺失、***及修飾可以任何組合存在以獲得最終構築體，其限制條件為該最終構築體具有所需特徵，例如結合至CD25減少。胺基酸序列缺失及***包括胺基酸之胺基及/或羧基端缺失及***。末端缺失之一實例為全長人類IL-2之位置1缺失丙胺酸殘基。較佳胺基酸突變為胺基酸取代。出於改變例如IL-2多肽之結合特徵之目的，尤其較佳為非保守胺基酸取代，亦即，一種胺基酸經具有不同結構及/或化學特性的另一胺基酸置換。較佳胺基酸取代包括親水性胺基酸置換疏水性胺基酸。胺基酸取代包括置換為非天然存在之胺基酸或置換為二十種標準胺基酸之天然存在之胺基酸衍生物(例如4-羥基脯胺酸、3-甲基組胺酸、鳥胺酸、高絲胺酸、5-羥基離胺酸)。胺基酸突變可使用此項技術中熟知之遺傳學或化學方法產生。遺傳學方法可包括定點突變誘發、PCR、基因合成及其類似方法。預期藉由除基因工程之外的諸如化學修飾方法改變胺基酸側鏈基團的方法亦可為適用的。 如本文所用，IL-2之「野生型」形式為IL-2之一種形式，其在其他方面與突變型IL-2多肽相同，但該野生型形式在突變型IL-2多肽之各胺基酸位置具有野生型胺基酸。舉例而言，若IL-2突變體為全長IL-2 (亦即，IL-2與任何其他分子不融合或結合)，則此突變體之野生型形式為全長原生IL-2。若IL-2突變體為IL-2與IL-2下游所編碼的另一多肽(例如抗體鏈)之間的融合物，則此IL-2突變體之野生型形式為具有野生型胺基酸序列的IL-2，其與相同的下游多肽融合。另外，若IL-2突變體為IL-2之截斷形式(IL-2之未截斷部分內的突變或經修飾序列)，則此IL-2突變體之野生型形式為具有野生型序列的類似截斷之IL-2。為了比較IL-2突變體之各種形式與IL-2之相應野生型形式對IL-2受體的結合親和力或生物活性，術語野生型涵蓋相較於天然存在的原生IL-2包含不影響IL-2受體結合之一或多種胺基酸突變的IL-2形式，諸如對應於人類IL-2殘基125之半胱胺酸經丙胺酸取代。在一些實施例中，用於本發明目的之野生型IL-2包含胺基酸取代C125A (參見SEQ ID NO: 39)。在根據本發明的某些實施例中，與突變型IL-2多肽比較的野生型IL-2多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO: 22。在其他實施例中，與突變型IL-2多肽比較的野生型IL-2多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO: 39。 除非另外指明，否則如本文所用，術語「CD25」或「IL-2受體之α-亞單元」係指來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)之任何原生CD25。該術語涵蓋「全長」、未處理之CD25以及在細胞中處理而產生之任何形式的CD25。該術語亦涵蓋天然存在之CD25變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。在某些實施例中，CD25為人類CD25。人類CD25之胺基酸序列發現於例如UniProt登錄號P01589 (185版)。 如本文所用，術語「高親和力IL-2受體」係指由以下組成的IL-2受體之雜三聚形式：受體γ-亞單元(亦稱為共同細胞介素受體γ-亞單元、γc 或CD132，參見UniProt登錄號P14784 (192版))、受體β-亞單元(亦稱為CD122或p70，參見UniProt登錄號P31785 (197版))及受體α-亞單元(亦稱為CD25或p55，參見UniProt登錄號P01589 (185版))。相比之下，術語「中等親和力IL-2受體」係指僅包括γ-亞單元及β-亞單元而無α-亞單元的IL-2受體(欲回顧，參見例如Olejniczak及Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-189 (2008))。 「親和力」係指分子(例如受體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如配位體)之間之非共價相互作用力的總和。除非另外指明，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對成員(例如抗原結合部分與抗原，或受體與其配位體)之間1:1相互作用的固有結合親和力。分子X對其搭配物Y的親和力一般可由解離常數(KD )表示，解離常數為解離速率常數與結合速率常數(分別為koff 與kon )之比率。因此，等效親和力可包含不同速率常數，只要速率常數之比率保持相同即可。可藉由此項技術中已知之明確方法(包括本文所述之方法)量測親和力。一種用於量測親和力之具體方法為表面電漿子共振(SPR)。 突變型或野生型IL-2多肽對各種形式之IL-2受體的親和力可以根據WO 2012/107417中所述之方法、藉由表面電漿子共振(SPR)、使用標準儀器(諸如BIAcore儀器(GE Healthcare))測定，且諸如受體亞單元可以藉由重組表現獲得(參見例如Shanafelt等人, Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000))。或者，IL-2突變體對不同形式之IL-2受體的結合親和力可以使用已知表現一種或其他此類形式之受體的細胞株評估。量測結合親和力之特定說明性及例示性實施例描述於下文中。 「調控T細胞」或「Treg 細胞」意指一種特定類型的CD4+ T細胞，其可以抑制其他T細胞之反應。Treg 細胞之特徵為表現IL-2受體之α-亞單元(CD25)及轉錄因子叉頭框P3 (FOXP3)(Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004))且在誘導及維持針對抗原(包括腫瘤所表現的抗原)的周邊自身耐受性方面起關鍵作用。Treg 細胞需要IL-2來實現其功能及其抑制特徵之發展及誘導。 如本文所用，術語「效應細胞」係指介導IL-2細胞毒性作用之淋巴細胞群。效應細胞包括效應T細胞，諸如CD8+ 細胞毒性T細胞、NK細胞、淋巴介質活化殺手(LAK)細胞及巨噬細胞/單核球。 如本文所用，術語「PD1」、「人類PD1」、「PD-1」或「人類PD-1」(亦稱為程式化細胞死亡蛋白質1，或程式化死亡1)係指人類蛋白質PD1 (SEQ ID NO: 33，不具有信號序列的蛋白質)/(SEQ ID NO: 34，具有信號序列的蛋白質)。亦參見UniProt登錄號Q15116 (156版)。如本文所用，「結合至PD-1」、「特異性結合至PD-1」、「結合至PD-1」的抗體(或抗原結合部分)或「抗PD-1抗體」係指能夠以足夠親和力結合PD-1 (具體而言，細胞表面上所表現的PD-1多肽)的抗體(或抗原結合部分)，使得該抗體適用作靶向PD-1的診斷劑及/或治療劑。在一個實施例中，抗PD-1抗體結合至無關非PD-1蛋白質的程度低於抗體與PD-1結合之約10%，如藉由例如放射免疫分析(RIA)或流式細胞術(FACS)或藉由表面電漿子共振分析、使用生物感測系統(諸如Biacore®系統)所量測。在某些實施例中，結合至PD-1的抗體(或抗原結合部分)具有結合至人類PD-1之結合親和力的KD值，該KD值≤1 μM、≤100 nM、≤10 nM、≤1 nM、≤0.1 nM、≤0.01 nM或≤0.001 nM (例如10-8 M或小於10-8 M，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)。在一個實施例中，結合親和力之KD值係使用人類PD-1之胞外域(ECD)(PD-1-ECD，參見SEQ ID NO: 35)作為抗原、在表面電漿子共振分析中測定。 如本文所用，術語「Tim-3」、「人類Tim-3」、「TIM3」或「人類TIM3」(亦稱為「含有T細胞免疫球蛋白及黏蛋白域的分子3」係指人類蛋白質Tim-3 (SEQ ID NO: 36，無信號序列的蛋白質)/(SEQ ID NO: 37，有信號序列的蛋白質)。亦參見UniProt登錄號Q8TDQ0 (123版)。如本文所用，「結合至Tim-3」、「特異性結合至Tim-3」、「結合至Tim-3」的抗體(或抗原結合域)或「抗Tim-3抗體」係指能夠以足夠親和力結合Tim-3 (具體而言，細胞表面上表現的Tim-3多肽)的抗體(或抗原結合域)，使得該抗體適用作靶向Tim-3的診斷劑及/或治療劑。在一個實施例中，抗Tim-3抗體結合至無關非Tim-3蛋白質的程度低於抗體與Tim-3結合之約10%，如藉由例如放射免疫分析(RIA)或流式細胞術(FACS)或藉由表面電漿子共振分析、使用生物感測系統(諸如Biacore®系統)所量測。在某些實施例中，結合至Tim-3的抗體(或抗原結合部分)具有結合至人類Tim-3之結合親和力的KD值，該KD值≤1 μM、≤100 nM、≤10 nM、≤1 nM、≤0.1 nM、≤0.01 nM或≤0.001 nM (例如10-8 M或小於10-8 M，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)。在一個實施例中，結合親和力之KD值係使用人類Tim-3之胞外域(ECD)(Tim-3-ECD，參見SEQ ID NO: 38)作為抗原、在表面電漿子共振分析中測定。 「特異性結合」意謂結合對於抗原而言具選擇性且可與非所需或非特異性相互作用區分。抗體結合至特定抗原(例如PD-1)的能力可經由酶聯免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者熟悉的其他技術量測，例如表面電漿子共振(SPR)技術(例如在BIAcore儀器上分析)(Liljeblad等人, Glyco J 17, 323-329 (2000))及傳統結合分析(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))。在一個實施例中，抗體結合至無關蛋白質的程度低於該抗體與抗原結合之約10%，如藉由例如SPR所量測。本文所述之免疫結合物中所包含之雙特異性抗原結合分子的抗原結合部分特異性結合至PD-1或Tim-3。 如本文所用，術語「多肽」係指由單體(胺基酸)經醯胺鍵(亦稱為肽鍵)線性連接而構成之分子。術語「多肽」係指兩個或超過兩個胺基酸之任何鏈，且並非指產物之特定長度。因此，「多肽」之定義內包括肽、二肽、三肽、寡肽、「蛋白質」、「胺基酸鏈」或用於指兩個或超過兩個胺基酸之鏈的任何其他術語且可使用術語「多肽」替代此等術語中的任一者，或術語「多肽」可與此等術語中的任一者互換使用。術語「多肽」亦指多肽之表現後修飾產物，包括(但不限於)糖基化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、藉由已知保護/阻斷基團衍生化、蛋白水解***或藉由非天然存在之胺基酸修飾。多肽可衍生自天然生物學來源或藉由重組技術製得，但不一定自指定的核酸序列轉譯而成。其可以任何方式產生，包括化學合成。多肽可具有定義的三維結構，但其不必定具有此類結構。具有定義之三維結構的多肽稱為摺疊，且不具有定義之三維結構，而是可採用許多不同構形的多肽稱為展開。 「分離」多肽或其變異體或衍生物意指不處於天然環境下的多肽。不需要特定的純化程度。舉例而言，分離多肽可自其原生或天然環境中移除。出於本發明之目的，宿主細胞中所表現之重組產生型多肽及蛋白質視為經分離，已藉由任何適合技術分離、分級分離或部分或實質上純化的原生或重組多肽亦視為經分離。 相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列且引入空位(若需要)以達到最大序列一致性百分比之後，候選序列中之與參考多肽序列胺基酸殘基一致的胺基酸殘基的百分比，且任何保守性取代不視為序列一致性之一部分。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的的比對可以此項技術中之技能範圍內的各種方式達成，例如使用公開可獲得的電腦軟體，如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign (DNASTAR)軟體或FASTA程式包。熟習此項技術者可確定用於比對序列之適當參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何算法。然而，出於本文之目的，胺基酸序列一致性%值係使用FASTA套裝36.3.8c版或更近版中之ggsearch程式、使用BLOSUM50比較矩陣來產生。FASTA套裝程式的作者為W. R. Pearson及D. J. Lipman (1988),「Improved Tools for Biological Sequence Analysis」, PNAS 85:2444-2448；W. R. Pearson (1996)「Effective protein sequence comparison」 Meth. Enzymol. 266:227-258；及Pearson等人(1997) Genomics 46:24-36，且公開獲自http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml。或者，可以使用在http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi可存取的公共伺服器、利用ggsearch (全域蛋白質:蛋白質)程式及預設選項(BLOSUM50；開端：-10；ext：-2；Ktup = 2）來比較序列，以確保進行全域而非局域的比對。輸出比對標題中示出胺基酸一致性百分比。 術語「聚核苷酸」係指分離之核酸分子或構築體，例如信使RNA (mRNA)、病毒源RNA或質體DNA (pDNA)。聚核苷酸可包含習知磷酸二酯鍵或非習知鍵(例如醯胺鍵，諸如肽核酸(PNA)中所發現)。術語「核酸分子」係指聚核苷酸中存在之任一或多個核酸區段，例如DNA或RNA片段。 「分離」的核酸分子或聚核苷酸意指已自原生環境中移除之核酸分子、DNA或RNA。舉例而言，出於本發明之目的，編碼載體中所含之多肽的重組聚核苷酸視為分離的。分離之聚核苷酸之其他實例包括異質宿主細胞中所維持的重組聚核苷酸或溶液中經純化(部分或實質上)之聚核苷酸。經分離之聚核苷酸包括通常含有聚核苷酸分子之細胞中所含的聚核苷酸分子，但聚核苷酸分子存在於染色體外或與其天然染色體位置不同之染色體位置處。分離之RNA分子包括本發明之活體內或活體外RNA轉錄物，以及正股及負股形式，及雙股形式。本發明之經分離之聚核苷酸或核酸進一步包括以合成方式產生的此類分子。另外，聚核苷酸或核酸可為或可包括調控元件，諸如啟動子、核糖體結合位點或轉錄終止子。 「編碼[例如本發明之免疫結合物]的經分離之聚核苷酸(或核酸)」係指一或多種編碼抗體重鏈及輕鏈及/或IL-2多肽(或其片段)的聚核苷酸分子，包括單一載體或個別載體中的此類聚核苷酸分子，及存在於宿主細胞中之一或多個位置的此類核酸分子。 術語「表現卡匣」係指重組或合成方式產生的聚核苷酸，其具有允許特定核酸在靶細胞中發生轉錄的一系列特定核酸元件。重組表現卡匣可併入質體、染色體、粒線體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。通常，表現載體之重組表現卡匣部分包括待轉錄的核酸序列及啟動子，以及其他序列。在某些實施例中，表現卡匣包含編碼本發明之免疫結合物或其片段的聚核苷酸序列。 術語「載體」或「表現載體」係指用於引入特定基因且導引該特定基因表現的DNA分子，該DNA分子在細胞中與所述特定基因可操作地結合。該術語包括呈自我複製核酸結構之載體以及併入已引入其之宿主細胞之基因組中的載體。本發明之表現載體包含表現卡匣。表現載體允許大量的穩定mRNA發生轉錄。一旦表現載體進入靶細胞內，則藉由細胞轉錄及/或轉譯機構產生由該基因編碼的核糖核酸分子或蛋白質。在一個實施例中，本發明之表現載體包含含有聚核苷酸序列的表現卡匣，該等聚核苷酸序列編碼本發明之免疫結合物或其片段。 術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之後代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括初級轉型細胞及自其衍生之後代(不考慮繼代次數)。後代之核酸含量與母細胞可能不完全相同，但可能含有突變。本文包括針對原始轉型細胞篩檢或選擇具有相同功能或生物活性之突變型後代。宿主細胞為可以用於產生本發明之免疫結合物的任何類型之細胞系統。宿主細胞不僅包括培養細胞，例如哺乳動物培養細胞，諸如HEK細胞、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞(僅舉數例)，而且包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或經培養植物或動物組織內所含的細胞。 術語「抗體」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所需抗原結合活性即可。 如本文所用，術語「抗原結合分子」在其最廣泛的意義上係指特異性結合抗原決定子的分子。抗原結合分子之實例為免疫球蛋白及其衍生物，例如片段。 術語「雙特異性」意謂抗原結合分子能夠特異性結合於至少兩個不同的抗原決定子。典型地，雙特異性抗原結合分子包含兩個抗原結合位點，其中每一者對不同抗原性決定子具有特異性。在某些實施例中，雙特異性抗原結合分子能夠同時結合兩個抗原決定子，特定言之兩個不同細胞上所表現的兩個抗原決定子。 如本文所用，術語「價」表示抗原結合分子中存在指定數目個抗原結合位點。因而，術語「單價結合至抗原」表示抗原結合分子中存在一個(及不超過一個)特異性針對抗原的抗原結合位點。 「抗原結合位點」係指提供與抗原相互作用之抗原結合分子的位點，亦即一或多個胺基酸殘基。舉例而言，抗體之抗原結合位點包含來自互補決定區(CDR)的胺基酸殘基。原生免疫球蛋白分子通常具有兩個抗原結合位點，Fab分子通常具有單個抗原結合位點。 如本文所用，術語「抗原結合部分」係指特異性結合抗原決定子的多肽分子。在一個實施例中，抗原結合部分能夠將其所附接的實體(例如IL-2多肽)導引至靶點，例如攜帶抗原決定子的特定類型之腫瘤細胞。抗原結合部分包括如本文進一步定義的抗體及其片段。特定抗原結合部分包括抗體之抗原結合域，包含抗體重鏈可變區及抗體輕鏈可變區。在某些實施例中，抗原結合部分可包含如本文進一步定義及此項技術中已知的抗體恆定區。適用的重鏈恆定區包括五種同型中的任一者：α、δ、ε、γ或μ。適用的輕鏈恆定區包括兩種同型中的任一者：κ及λ。 如本文所用，術語「抗原性決定子」與「抗原」及「抗原決定基」同義且係指多肽大分子上的位點(例如相連胺基酸區段或由非相連胺基酸之不同區域組成的構形組態)，該位點由抗原結合部分結合，從而形成抗原結合部分-抗原複合物。適用的抗原決定子可發現於例如腫瘤細胞表面上、病毒所感染細胞之表面上、其他病變細胞表面上、免疫細胞表面上、游離於血清中及/或細胞外基質(ECM)中。 如本文所用，術語「單株抗體」係指獲自基本上均質抗體群體的抗體，亦即該群體中所包含之個別抗體相同且/或結合相同抗原決定基，但可能存在變異型抗體，例如含有天然存在的突變或在單株抗體製劑製備期間產生的突變，此類變異體通常以少量存在。相比於典型地包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑，單株抗體製劑中之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，修飾語「單株」指示抗體之特性為自實質上均質之抗體群體獲得，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製得，包括(但不限於)融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體呈現方法及利用含有所有或部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物的方法、本文所描述的製得單株抗體之此類方法及其他例示性方法。 「分離」的抗體為已與其天然環境之組分分離(亦即，不存在於其天然環境中)的抗體。不需要特定的純化程度。舉例而言，經分離之抗體可自其原生或天然環境中移除。出於本發明之目的，宿主細胞中所表現之重組產生型多肽及蛋白質視為經分離，已藉由任何適合技術分離、分級分離或部分或實質上純化的原生或重組多肽亦視為經分離。因而，本發明之免疫結合物經分離。在一些實施例中，抗體純化至大於95%或99%之純度，如藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)方法所測定。欲回顧用於評估抗體純度之方法，參見例如Flatman等人,J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。 術語「全長抗體」、「完整抗體」及「完全抗體」在本文中可互換使用，其係指結構與原生抗體結構實質上類似的抗體。 「抗體片段」係指除完整抗體之外的分子，其包含完整抗體之一部分，該部分結合由完整抗體結合的抗原。抗體片段之實例包括(但不限於) Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)及單域抗體。關於某些抗體片段之評述，參見Holliger及Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)。關於scFv片段之評述，參見例如Plückthun, 於The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 第113卷, Rosenburg及Moore編, Springer-Verlag, New York, 第269-315頁 (1994)；亦參見WO93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含救助受體結合抗原決定基殘基及具有延長之活體內半衰期之Fab及F(ab')2 片段的論述，參見美國專利第5,869,046號。雙功能抗體為其中兩個抗原結合位點可為二價或雙特異性之抗體片段。參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人, Nat Med 9, 129-134 (2003)；及Hollinger等人, Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人, Nat Med 9, 129-134 (2003)中。單域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或一部分或輕鏈可變域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；參見例如美國專利第6,248,516B1號)。抗體片段可藉由各種技術製得，包括(但不限於)蛋白水解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生，如本文所述。 術語「免疫球蛋白分子」係指具有天然存在之抗體之結構的蛋白質。舉例而言，IgG類免疫球蛋白為約150,000道爾頓(dalton)之雜四聚體糖蛋白，其由兩條輕鏈及兩條重鏈經二硫鍵鍵結而構成。自N端至C端，各重鏈具有可變域(VH)，亦稱為重鏈可變域或重鏈可變區；繼之為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變域(VL)，亦稱為輕鏈可變域或輕鏈可變區；繼之為輕鏈恆定域(CL)，亦稱為輕鏈恆定區。免疫球蛋白重鏈可歸為五種類型之一，稱為α (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、γ (IgG)或μ (IgM)，其中一些可進一步分成亞型，例如γ1 (IgG1 )、γ2 (IgG2 )、γ3 (IgG3 )、γ4 (IgG4 )、α1 (IgA1 )及α2 (IgA2 )。免疫球蛋白輕鏈基於其恆定域胺基酸序列可歸為兩種類型之一，稱為kappa (κ)及lambda (λ)。免疫球蛋白基本上由兩個Fab分子及一個Fc域經由免疫球蛋白鉸鏈區連接而組成。 「Fab分子」係指由免疫球蛋白之重鏈(「Fab重鏈」)之VH及CH1域及輕鏈(「Fab輕鏈」)之VL及CL域組成的蛋白質。 「互換型」Fab分子(亦稱為「互換fab」)意指一種Fab分子，其中Fab重鏈及輕鏈之可變域或恆定域交換(亦即彼此置換)，亦即，互換型Fab分子包含由輕鏈可變域VL及重鏈恆定域1 CH1組成的肽鏈(VL-CH1，N端至C端方向)及由重鏈可變域VH及輕鏈恆定域CL組成的肽鏈(VH-CL，N端至C端方向)。為了清楚起見，在其中Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域交換的互換型Fab分子中，包含重鏈恆定域1 CH1的肽鏈在本文中稱為互換型Fab分子之「重鏈」。反之，在Fab輕鏈與Fab重鏈之恆定域發生交換的互換型Fab分子中，包含重鏈可變域VH的肽鏈在本文中稱為(互換型)Fab分子的「重鏈」。 相比之下，「習知」Fab分子意謂呈天然形式的Fab分子，亦即包含由重鏈可變域及恆定域組成的重鏈(VH-CH1，N端至C端方向)及由輕鏈可變域及恆定域組成的輕鏈(VL-CL，N端至C端方向)。 術語「抗原結合域」係指抗體中包含特異性結合至抗原之一部分或全部且與之互補的區域的部分。抗原結合域可由例如一或多個抗體可變域(亦稱為抗體可變區)提供。詳言之，抗原結合域包含抗體輕鏈可變域(VL)及抗體重鏈可變域(VH)。 術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原之結合的結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈(分別為VH及VL)可變域通常具有類似的結構，其中各結構域包含四個保守性構架區(FR)及三個高變區(HVR)。參看例如Kindt等人, KubyImmunology, 第6版, W.H. Freeman and Co., 第91頁(2007)。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。如本文中關於可變區序列所用，「Kabat編號」係指Kabat等人闡述的編號系統，Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版, 公共衛生署(Public Health Service), 美國國家衛生研究院(National Institutes of Health), Bethesda, MD (1991)。 如本文所用，重鏈及輕鏈之所有恆定區及恆定域中的胺基酸位置均根據Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 公共衛生署, 美國國家衛生研究院, Bethesda, MD (1991)中所述之Kabat編號系統編號，在本文中稱為「根據Kabat編號」或「Kabat編號」。具體而言，κ及λ同型之輕鏈恆定域CL使用Kabat編號系統(參見Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版之第647-660頁, 公共衛生署, 美國國家衛生研究院, Bethesda, MD (1991))且重鏈恆定域(CH1、鉸鏈、CH2及CH3)使用Kabat EU索引編號系統(參見第661-723頁)，在此情況下，在本文中藉由參考「根據Kabat EU索引編號」來進一步澄清。 如本文所用，術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中之各區域，其序列高變(「互補決定區」或「CDR」)且/或形成結構上限定之環(「高變環」)且/或含有抗原接觸殘基(「抗原觸點」)。一般而言，抗體包含六個HVR；三個在VH中(H1、H2、H3)，且三個在VL中(L1、L2、L3)。本文之例示性HVR包括： (a)存在於胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)處之高變環(Chothia及Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))； (b)存在於胺基酸殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3)處之CDR (Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版. 公共衛生署, 美國國家衛生研究院, Bethesda, MD (1991))； (c)存在於胺基酸殘基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)及93-101 (H3)處之抗原觸點(MacCallum等人,J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；及 (d) (a)、(b)及/或(c)之組合，包括HVR胺基酸殘基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)及94-102 (H3)。 除非另外指明，否則可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)在本文中係根據Kabat等人(同上)進行編號。 「構架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基以外的可變域殘基。可變域之FR一般由四個FR域：FR1、FR2、FR3及FR4組成。因此，在VH (或VL)中，HVR及FR序列一般依以下次序呈現：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。 「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含至少一個且典型地兩個可變域之基本上所有者，其中所有或基本上所有HVR (例如CDR)皆對應於非人類抗體之HVR，且所有或基本上所有FR皆對應於人類抗體之FR。此類可變域在本文中稱為「人類化可變區」。人類化抗體視情況可包含來源於人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如CDR殘基所來源之抗體)之相應殘基取代，以例如恢復或改良抗體特異性或親和力。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指已經歷人類化之抗體。本發明涵蓋之「人類化抗體」之其他形式為其中恆定區已經額外修飾或自原始抗體發生變化以產生根據本發明之特性（尤其在C1q結合及/或Fc受體(FcR)結合方面）之抗體。 「人類抗體」為胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或來源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體的胺基酸序列之抗體。人類抗體之此定義特別排除包含非人類抗原結合殘基之人源化人類化抗體。在某些實施例中，人類抗體來源於非人類轉殖基因哺乳動物，例如小鼠、大鼠或兔。在某些實施例中，人類抗體來源於融合瘤細胞株。自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段在本文中亦視為人類抗體或人類抗體片段。 抗體或免疫球蛋白之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區的類型。抗體存在五種主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中若干者可進一步分成亞類(同型)，例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 。對應於不同類別免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱作α、δ、ε、γ及μ。 本文術語「Fc域」或「Fc區」用於定義含有恆定區之至少一部分的免疫球蛋白重鏈C端區域。該術語包括原生序列Fc區及變異型Fc區。雖然IgG重鏈之Fc區的邊界可能稍微變化，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，宿主細胞所產生的抗體可能在重鏈C端經歷一或多個(特定言之，一個或兩個)胺基酸之轉譯後***。因此，宿主細胞藉由表現編碼全長重鏈之特定核酸分子而產生的抗體可包括全長重鏈，或其可包括全長重鏈的***型變異體(在本文中亦被稱作「***變異型重鏈」)。在重鏈之最末兩個C端胺基酸為甘胺酸(G446)及離胺酸(K447，根據Kabat EU索引編號)的情況下，情況可為如此。因此，Fc區之C端離胺酸(Lys447)或C端甘胺酸(Gly446)及離胺酸(K447)可能存在或可能不存在。除非另有說明，否則包括Fc域(或如本文所定義之Fc域之亞單元)之重鏈的胺基酸序列在本文中指明無C端甘胺酸-離胺酸二肽。在本發明之一個實施例中，本發明之免疫結合物中所包含的重鏈(該重鏈包括如本文說明的Fc域亞單元)包含另一個C端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU索引編號)。在本發明的一個實施例中，本發明之免疫結合物中所包含之重鏈(包括如本文中所指定的Fc域亞單元)包含另一個C端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat EU索引編號)。本發明之組合物，例如本文所述之醫藥組合物，包含本發明之免疫結合物之群體。免疫結合物之群體可以包含具有全長重鏈的分子及具有***之變異型重鏈的分子。免疫結合物之群體可以由具有全長重鏈之分子與具有***之變異型重鏈之分子的混合物組成，其中至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的免疫結合物具有***之變異型重鏈。在本發明的一個實施例中，包含本發明之免疫結合物群體之組合物包含含有包括如本文中指定之Fc域亞單元之重鏈的免疫結合物，所述重鏈具有額外的C端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU索引編號)。在本發明的一個實施例中，包含本發明之免疫結合物群體的組合物包含含有包括如本文中指定之Fc域亞單元之重鏈的免疫結合物，所述重鏈具有額外的C端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat EU索引編號)。在本發明之一個實施例中，此組合物包含免疫結合物群體，所述群體包含：包含包括如本文中指定之Fc域亞單元之重鏈的分子；包含包括如本文指定之Fc域亞單元之重鏈的分子，所述重鏈具有額外的C端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat EU索引編號)；及包含包括如本文中指定之Fc域亞單元之重鏈的分子，所述重鏈具有額外的C端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU索引編號)。除非本文另外說明，否則Fc區或恆定區胺基酸殘基之編號係依據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版中所述。公共衛生服務署, 美國國家衛生研究院, Bethesda, MD, 1991 (亦參見上述)。如本文所用，Fc域之「亞單元」係指形成二聚合Fc域之兩種多肽之一，亦即，包含免疫球蛋白重鏈之C端恆定區的多肽，其能夠穩定地發生自結合。舉例而言，IgG Fc域之亞單元包含IgG CH2及IgG CH3恆定域。 「促進Fc域之第一亞單元與第二亞單元結合的修飾」為肽主鏈之操縱或Fc域亞單元之轉譯後修飾，從而減少或阻止包含Fc域亞單元之多肽與相同多肽結合形成均二聚體。詳言之，如本文所用之促進結合的修飾包括分別對欲結合之兩個Fc域亞單元(亦即Fc域之第一及第二亞單元)中之每一者進行的修飾，其中該等修飾彼此間互補以便促進兩個Fc域亞單元結合。舉例而言，促進結合的修飾可改變Fc域亞單元中之一或兩者的結構或電荷以便使其結合在空間上或在靜電上分別為有利的。因此，包含第一Fc域亞單元之多肽與包含第二Fc域亞單元之多肽之間發生(雜)二聚，就與亞單元(例如抗原結合部分)中之每一者融合的其他組分不相同而言，(雜)二聚可能不相同。在一些實施例中，促進結合之修飾包含Fc域中之胺基酸突變，特定言之胺基酸取代。在一特定實施例中，促進結合之修飾包含Fc域之兩個亞單元中之每一者中的個別胺基酸突變，特定言之胺基酸取代。 術語「效應功能」當關於抗體使用時，係指可歸因於抗體之Fc區的彼等生物活性，其因抗體同型而異。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、細胞介素分泌、免疫複合體介導抗原呈遞細胞攝入抗原、細胞表面受體(例如B細胞受體)下調及B細胞活化。 抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)為促使免疫效應細胞溶解塗有抗體之目標細胞的免疫機制。靶細胞為包含Fc區之抗體或其衍生物特異性結合(一般經由Fc區N端之蛋白質部分結合)的細胞。如本文所使用，術語「降低之ADCC」定義為在圍繞目標細胞之介質中、在指定的抗體濃度下、在指定時間內、藉由上文所定義之ADCC機制溶解之目標細胞的數目減少，及/或在圍繞目標細胞之介質中，在指定時間內藉由ADCC機制達成指定數目個目標細胞溶解所需的抗體濃度增加。ADCC降低係相對於由同類型宿主細胞使用相同的標準生產、純化、調配及儲存方法(熟習此項技術者已知)所產生、但尚未經工程改造之相同抗體介導的ADCC而言。舉例而言，Fc域中包含降低ADCC之胺基酸取代的抗體所介導之ADCC降低係相對於Fc域中無此胺基酸取代之相同抗體所介導的ADCC而言。適於量測ADCC的分析在此項技術中已熟知(參見例如PCT公開案第WO 2006/082515號或PCT公開案第WO 2012/130831號)。 「活化Fc受體」為一種Fc受體，其與抗體Fc域接合之後，引發信號傳導事件，刺激攜帶受體之細胞執行效應功能。人類活化Fc受體包括FcγRIIIa (CD16a)、FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32)及FcαRI (CD89)。 如本文所用，術語「工程改造（engineer/engineered/engineering）」視為包括任何肽主鏈操縱或天然存在或重組多肽或其片段之轉譯後修飾。工程改造包括胺基酸序列、糖基化模式或個別胺基酸之側鏈基團之修飾，以及此等方法之組合。 「減弱的結合」(例如與Fc受體或CD25的結合減弱)係指對應相互作用的親和力降低，如藉由例如SPR所量測。為了清楚起見，該術語亦包括親和力降低至零(或低於分析方法之偵測極限)，亦即相互作用完全消除。反之，「增強的結合」係指對應相互作用的結合親和力增強。 如本文所用，術語「免疫結合物」係指包括至少一種IL-2分子及至少一種抗體的多肽分子。IL-2分子可以藉由多種相互作用及如本文所述的多種構型連接至抗體。在特定實施例中，IL-2分子與抗體經由肽連接子融合。本發明之特定免疫結合物基本上由一種IL-2分子及抗體(例如雙特異性抗原結合分子)藉由一種或多種連接子序列連接而組成。 「融合」意指所述組分(例如抗體及IL-2分子)藉由肽鍵直接連接或經由一種或多種肽連接子連接。 如本文所用，當存在超過一種的各類型部分時，關於Fc域亞單元等的術語「第一」及「第二」係為了方便區分而使用。此等術語之使用並非旨在賦予免疫結合物之特定次序或取向，除非明確有如此陳述。 藥劑之「有效量」係指在所投與之細胞或組織中產生生理變化所需的量。 藥劑(例如醫藥組合物)之「治療有效量」係指在劑量及所需時間段上有效達成所需治療或預防結果的量。舉例而言，治療有效量之藥劑可消除、減少、延遲、最小化或預防疾病之副作用。 「個體」或「受試者」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人體及非人類靈長類動物，諸如猴)、家兔及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。特定言之，個體係人類。 術語「醫藥組合物」係指所呈形式允許其中所含活性成分之生物活性有效發揮的製劑，且其不含對組合物將投與之個體具有不可接受毒性之其他組分。 「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥組合物中之除活性成分之外的對個體無毒的成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝液、賦形劑、穩定劑或防腐劑。 如本文所用，「治療(treatment)」(及其文法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指試圖改變所治療個體之疾病之自然過程的臨床介入且可出於預防或在臨床病理學過程中進行。所需治療作用包括(但不限於)預防疾病發生或復發，緩解症狀，減輕疾病之任何直接或間接病理性結果，預防癌轉移，減緩疾病進展速率，改善或緩和疾病病狀及緩解或改良預後。在一些實施例中，本發明之免疫結合物用於延遲疾病發展或減慢疾病進展。實施例之詳細說明 突變型 IL-2 多肽 本發明之免疫結合物包含具有免疫療法有利特性之突變型IL-2多肽。特定言之，突變型IL-2多肽中排除了造成毒性、但不為IL-2功效必需的IL-2藥理學特性。此類突變型IL-2多肽詳細地描述於WO 2012/107417中，該文獻以全文引入的方式併入本文中。如上文所論述，不同形式的IL-2受體由不同亞單元組成且對IL-2展現不同親和力。由β及γ受體亞單元組成的中等親和力IL-2受體表現於靜止效應細胞上且足以供IL-2信號傳導。另外包含受體α-亞單元之高親和力IL-2受體主要表現於調控T (Treg )細胞上以及活化效應細胞上，其中其與IL-2的接合可以分別促進Treg 細胞介導的免疫抑制或活化誘導的細胞死亡(AICD)。因此，不希望受理論所束縛，IL-2對IL-2受體α-亞單元之親和力減少或消除應該減少IL-2誘導效應細胞功能被調控T細胞下調及減少AICD過程產生腫瘤耐受性。另一方面，對中等親和力IL-2受體維持親和力應該保持IL-2誘導效應細胞(如NK及T細胞)增殖及活化。 本發明之免疫結合物中所包含的突變型介白素-2 (IL-2)多肽包含至少一個胺基酸突變，該突變消除或減少突變型IL-2多肽對IL-2受體α-亞單元的親和力且保持突變型IL-2多肽對中等親和力IL-2受體的親和力，各相較於野生型IL-2多肽。 對CD25親和力減小之人類IL-2突變體(hIL-2)可以例如藉由胺基酸位置35、38、42、43、45或72之胺基酸取代或其組合(相對於人類IL-2序列SEQ ID NO: 22編號)來產生。例示性胺基酸取代包括K35E、K35A、R38A、R38E、R38N、R38F、R38S、R38L、R38G、R38Y、R38W、F42L、F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、K43E、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R及L72K。適用於本發明之免疫結合物中的特定IL-2突變體包含對應於人類IL-2之殘基42、45或72之胺基酸位置的胺基酸突變，或其組合。在一個實施例中，該胺基酸突變是選自以下之群組的胺基酸取代：F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R及L72K，更特定言之，選自F42A、Y45A及L72G之群組的胺基酸取代。相較於IL-2突變體之野生型形式，此等突變體對中等親和力IL-2受體展現基本上類似的結合親和力，且對IL-2受體α-亞單元及高親和力IL-2受體的親和力實質上減小。 適用突變體之其他特徵可以包括誘導帶有IL-2受體之T細胞及/或NK細胞增殖的能力、誘導帶有IL-2受體之T細胞及/或NK細胞信號傳導之能力、NK細胞產生干擾素(IFN)-γ作為二級細胞介素的能力、誘導周邊血液單核細胞(PBMC)加工二級細胞介素(特定言之，IL-10及TNF-α)的能力減小、活化調控T細胞的能力減小、誘導T細胞發生細胞凋亡的能力減小，及活體內毒性分佈減少。 適用於本發明的特定突變體IL-2多肽包含三種胺基酸突變，所述胺基酸突變消除或減少突變型IL-2多肽對IL-2受體α-亞單元的親和力，但保持突變型IL-2多肽對中等親和力IL-2受體的親和力。在一個實施例中，該等三種胺基酸突變位於對應於人類IL-2之殘基42、45及72的位置。在一個實施例中，該等三種胺基酸突變是胺基酸取代。在一個實施例中，該等三種胺基酸突變是選自以下群組之胺基酸取代：F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R、F42K、Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R、Y45K、L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R及L72K。在一個特定實施例中，該等三種胺基酸突變是胺基酸取代F42A、Y45A及L72G (相對於SEQ ID NO: 22之人類IL-2序列編號)。 在某些實施例中，該胺基酸突變使突變型IL-2多肽對IL-2受體α-亞單元的親和力減少至少5倍，尤其至少10倍，更尤其至少25倍。在存在超過一種使突變型IL-2多肽對IL-2受體α-亞單元之親和力減小之胺基酸突變的實施例中，此等胺基酸突變之組合可以使突變型IL-2多肽對IL-2受體α-亞單元的親和力減少至少30倍、至少50倍或甚至至少100倍。在一個實施例中，該胺基酸突變或胺基酸突變組合消除了突變型IL-2多肽對IL-2受體α-亞單元的親和力，以致表面電漿子共振偵測不到結合。 當IL-2突變體對中等親和力IL-2受體之親和力為IL-2突變體之野生型形式的大於約70%時，達成對中等親和力受體之基本上類似的結合，亦即，突變型IL-2多肽對該受體的親和力保持。本發明之IL-2突變體可以展現此類親和力之大於約80%且甚至大於約90%。 IL-2對IL-2受體α-亞單元之親和力減小與IL-2之O-糖基化之消除的組合使得IL-2蛋白質的特性改良。舉例而言，當突變型IL-2多肽表現於哺乳動物細胞(諸如CHO或HEK細胞)中時，消除O-糖基化位點產生更均質的產物。 因此，在某些實施例中，突變型IL-2多肽包含額外的胺基酸突變，所述胺基酸突變消除對應於人類IL-2殘基3之位置處的IL-2 O-糖基化位點。在一個實施例中，消除對應於人類IL-2殘基3之位置處之IL-2 O-糖基化位點的該額外胺基酸突變為胺基酸取代。例示性胺基酸取代包括T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K及T3P。在一個特定實施例中，該額外胺基酸突變為胺基酸取代T3A。 在某些實施例中，突變型IL-2多肽基本上為全長IL-2分子。在某些實施例中，突變型IL-2多肽為人類IL-2分子。在一個實施例中，突變型IL-2多肽包含具有至少一個胺基酸突變之SEQ ID NO: 22序列，相較於包含不具有該突變之SEQ ID NO: 22的IL-2多肽，所述突變消除或減小突變型IL-2多肽對IL-2受體α-亞單元的親和力，但保持突變型IL-2多肽對中等親和力IL-2受體的親和力。在另一個實施例中，突變型IL-2多肽包含具有至少一個胺基酸突變之SEQ ID NO: 39序列，相較於包含不具有該突變之SEQ ID NO: 39的IL-2多肽，所述突變消除或減小突變型IL-2多肽對IL-2受體α-亞單元之親和力，但保持突變型IL-2多肽對中等親和力IL-2受體之親和力。 在一個特定實施例中，突變型IL-2多肽可以引發選自由以下組成之群的一或多種細胞反應：活化T淋巴細胞細胞增殖、活化T淋巴球細胞分化、細胞毒性T細胞(CTL)活性、活化B細胞增殖、活化B細胞分化、自然殺手(NK)細胞增殖、NK細胞分化、活化T細胞或NK細胞分泌細胞介素，及NK/淋巴球活化殺手(LAK)抗腫瘤細胞毒性。 在一個實施例中，相較於野生型IL-2多肽，突變型IL-2多肽誘導調控T細胞中之IL-2信號傳導的能力減小。在一個實施例中，突變型IL-2多肽誘導T細胞發生的活化誘導細胞死亡(AICD)比野生型IL-2多肽少。在一個實施例中，相較於野生型IL-2多肽，突變型IL-2多肽具有減小的活體內毒性分佈。在一個實施例中，相較於野生型IL-2多肽，突變型IL-2多肽具有延長的血清半衰期。 適用於本發明的特定突變型IL-2多肽包含位於對應於人類IL-2之殘基3、42、45及72之位置處的四個胺基酸取代。特定的胺基酸取代是T3A、F42A、Y45A及L72G。如WO 2012/107417中所表明，該四重突變型IL-2多肽展現偵測不到的對CD25之結合、誘導T細胞發生細胞凋亡的能力減小、誘導Treg 細胞中之IL-2信號傳導的能力減小，及減小的活體內毒性分佈。然而，其保持活化效應細胞中之IL-2信號傳導、誘導效應細胞增殖及NK細胞產生IFN-γ作為二級細胞介素的能力。 此外，該突變型IL-2多肽具有其他有利特性，諸如減小的表面疏水性、良好穩定性及良好表現量，如WO 2012/107417中所述。出乎意料地，相較於野生型IL-2，該突變型IL-2多肽亦提供延長的血清半衰期。 除IL-2與CD25或糖基化位點形成界面之IL-2區域中具有突變之外，適用於本發明的IL-2突變體亦可以在此等區域外部的胺基酸序列中具有一或多個突變。人類IL-2中之此類額外突變可以提供額外的優勢，諸如表現或穩定性增強。舉例而言，位置125之半胱胺酸可經中性胺基酸置換，諸如絲胺酸、丙胺酸、蘇胺酸或纈胺酸，從而分別產生C125S IL-2、C125A IL-2、C125T IL-2或C125V IL-2，如美國專利第4,518,584號中所述。如其中所述，亦可使IL-2之N端丙胺酸殘基缺失，從而產生諸如des-A1 C125S或des-A1 C125A等突變體。替代地或結合地，IL-2突變體可以包括如下突變：其中野生型人類IL-2之位置104通常存在的甲硫胺酸經中性胺基酸(諸如丙胺酸)置換(參見美國專利第5,206,344號)。所得突變體，例如des-A1 M104A IL-2、des-A1 M104A C125S IL-2、M104A IL-2、M104A C125A IL-2、des-A1 M104A C125A IL-2或M104A C125S IL-2 (此等及其他突變體可以發現於美國專利第5,116,943號及Weiger等人, Eur J Biochem 180, 295-300 (1989))，可以結合本發明之特定IL-2突變使用。 因此，在某些實施例中，突變型IL-2多肽包含對應於人類IL-2之殘基125之位置處的額外胺基酸突變。在一個實施例中，該額外胺基酸突變為胺基酸取代C125A。 熟習此項技術者能夠確定哪些額外突變可以提供額外的優勢以用於本發明之目的。舉例而言，其將瞭解IL-2序列中之減少或消除IL-2對中等親和力IL-2受體之親和力的胺基酸突變，諸如D20T、N88R或Q126D (參見例如US 2007/0036752)，可能不適於納入本發明之突變型IL-2多肽中。 在一個實施例中，相較於對應的野生型IL-2序列(例如人類IL-2序列SEQ ID NO: 22)，突變型IL-2多肽包含不超過12個、不超過11個、不超過10個、不超過9個、不超過8個、不超過7個、不超過6個或不超過5個胺基酸突變。在一個特定實施例中，相較於對應的野生型IL-2序列(例如人類IL-2序列SEQ ID NO: 22)，突變型IL-2多肽包含不超過5個胺基酸突變。 在一個實施例中，突變型IL-2多肽包含SEQ ID NO: 23序列。在一個實施例中，突變型IL-2多肽由SEQ ID NO: 23序列組成。免疫結合物 如本文所述的免疫結合物包含IL分子及雙特異性抗原結合分子。此類免疫結合物藉由使例如IL-2直接靶向腫瘤微環境而顯著增強IL-2治療功效。根據本發明，免疫結合物中所包含之雙特異性抗原結合分子可以是完整抗體或免疫球蛋白，或具有生物功能(諸如抗原特異性結合親和力)之其一部分或變異體。 免疫結合物療法之一般益處顯而易見。舉例而言，免疫結合物中所包含之雙特異性抗原結合分子識別腫瘤特異性抗原決定基且使得免疫結合物分子靶向腫瘤位點。因此，使用劑量比未結合IL-2所需低得多的免疫結合物，可以將高濃度的IL-2遞送至腫瘤微環境中，藉此活化及增殖本文中提及的多種免疫效應細胞。此外，由於IL-2以免疫結合物形式施用可使細胞介素本身劑量降低，但限制IL-2之潛在不良副作用，且藉助於免疫結合物使IL-2靶向體內特定部位亦可減少全身暴露且從而減少副作用(與未結合IL-2所得的副作用相比)。另外，免疫結合物之循環半衰期相較於未結合的IL-2延長促成免疫結合物之功效。然而，IL-2免疫結合物之此特徵可能再次加重IL-2分子之潛在副作用：由於IL-2免疫結合物在血流中之循環半衰期相對於未結合的IL-2顯著更長，融合蛋白分子中之IL-2或其他部分活化通常存在於血管中的組分之機率增加。對於含有IL-2與其他部分(諸如Fc或白蛋白)融合的其他融合蛋白有相同擔憂，其使得IL-2在循環中之半衰期延長。因此，包含如本文及WO 2012/107417所述之突變型IL-2多肽的免疫結合物特別有利，其毒性相較於IL-2野生型形式減小。 如上文所述，使IL-2直接靶向免疫效應細胞而非腫瘤細胞可以有利於IL-2免疫療法。 相應地，本發明提供如上文中所述的突變型IL-2多肽，及結合至PD-1及Tim-3的雙特異性抗原結合分子。在一個實施例中，免疫結合物包含不超過一種突變型IL-2多肽。在一個實施例中，突變型IL-2多肽及雙特異性抗原結合分子形成融合蛋白，亦即，突變型IL-2多肽與雙特異性抗原結合分子共有肽鍵。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子包含由第一及第二亞單元組成的Fc域。在一個特定實施例中，突變型IL-2多肽的胺基端胺基酸與Fc域之一亞單元的羧基端胺基酸融合，視情況經由連接肽融合。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子為全長抗體。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子為免疫球蛋白分子，特定言之，IgG類免疫球蛋白分子，更特定言之，IgG1 子類免疫球蛋白分子，其中在一個Fab分子(結合臂)中，重鏈及輕鏈之可變區或恆定區(分別為VH/VL或CH1/CL)彼此交換/置換。在一個此類實施例中，突變型IL-2多肽與免疫球蛋白重鏈之一共有胺基端肽鍵。在某些實施例中，雙特異性抗原結合分子為抗體片段。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子包含Fab分子或scFv分子。在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子包含Fab分子。在另一個實施例中，雙特異性抗原結合分子包含scFv分子。本發明之免疫結合物包含第一及第二抗原結合部分。各抗原結合部分可獨立地選自多種形式之抗體及抗體片段。舉例而言，第一抗原結合部分可為Fab分子且第二抗原結合部分可為scFv分子。在一個特定實施例中，該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分中之每一者為scFv分子，或該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分中之每一者為Fab分子。在一個特定實施例中，該第一抗原結合部分及該第二抗原結合部分中之每一者為Fab分子。免疫結合物形式 例示性免疫結合物形式描述於PCT公開案第WO 2011/020783號中，該案以全文引入的方式併入本文中。此等免疫結合物包含至少兩個抗原結合部分。因此，在一個實施例中，本發明之免疫結合物包含如本文所述之突變型IL-2多肽，以及至少第一及第二抗原結合部分。在一個特定實施例中，該第一及第二抗原結合部分獨立地選自由Fv分子(特定言之，scFv分子)及Fab分子組成之群。在一個特定實施例中，該突變型IL-2多肽與該第一抗原結合部分共有胺基或羧基端肽鍵且該第二抗原結合部分與i)突變型IL-2多肽或ii)第一抗原結合部分共有胺基或羧基端肽鍵。在一個特定實施例中，免疫結合物主要由突變型IL-2多肽與第一及第二抗原結合部分(特定言之，Fab分子)藉由一或多個連接子序列連接而組成。此類形式的優點在於，其以高親和力結合至靶抗原(PD-1及Tim-3)，但僅單體結合至IL-2受體，從而避免使免疫結合物靶向除靶點外之位置之帶有IL-2受體的免疫細胞。在一個特定實施例中，突變型IL-2多肽與第一抗原結合部分(特定言之，第一Fab分子)共有羧基端肽鍵，且另外與第二抗原結合部分(特定言之，第二Fab分子)共有胺基端肽鍵。在另一個實施例中，第一抗原結合部分(特定言之，第一Fab分子)與突變型IL-2多肽共有羧基端肽鍵，且另外與第二抗原結合部分(特定言之，第二Fab分子)共有胺基端肽鍵。在另一個實施例中，第一抗原結合部分(特定言之，第一Fab分子)與第一突變型IL-2多肽共有胺基端肽鍵，且另外與第二抗原結合部分(特定言之，第二Fab分子)共有羧基端肽。在一個特定實施例中，突變型IL-2多肽與第一重鏈可變區共有羧基端肽鍵且另外與第二重鏈可變區共有胺基端肽鍵。在另一個實施例中，突變型IL-2多肽與第一輕鏈可變區共有羧基端肽鍵且另外與第二輕鏈可變區共有胺基端肽鍵。在另一個實施例中，第一重鏈或輕鏈可變區藉由羧基端肽鍵連接至突變型IL-2多肽且另外藉由胺基端肽鍵連接至第二重鏈或輕鏈可變區。在另一個實施例中，第一重鏈或輕鏈可變區藉由胺基端肽鍵連接至突變型IL-2多肽且另外藉由羧基端肽鍵連接至第二重鏈或輕鏈可變區。在一個實施例中，突變型IL-2多肽與第一Fab重鏈或輕鏈共有羧基端肽鍵且另外與第二Fab重鏈或輕鏈共有胺基端肽鍵。在另一個實施例中，第一Fab重鏈或輕鏈與突變型IL-2多肽共有羧基端肽鍵且另外與第二Fab重鏈或輕鏈共有胺基端肽鍵。在其他實施例中，第一Fab重鏈或輕鏈與突變型IL-2多肽共有胺基端肽鍵且另外與第二Fab重鏈或輕鏈共有羧基端肽鍵。在一個實施例中，免疫結合物包含突變型IL-2多肽，該多肽與一或多種scFv分子共有胺基端肽鍵且另外與一或多個scFv分子共有羧基端肽鍵。 其他例示性免疫結合物形式描述於PCT公開案第WO 2012/146628號中，該案以全文引入的方式併入本文中。此等免疫結合物包含免疫球蛋白分子作為抗原結合部分。 在特定實施例中，本發明之免疫結合物包含如本文所述之突變型IL-2多肽以及結合至PD-1及Tim-3之雙特異性抗原結合分子，其中雙特異性抗原結合分子為免疫球蛋白分子，特定言之，IgG分子，更特定言之，IgG1 分子，其中在一個Fab分子(結合臂)中，重鏈及輕鏈之可變區或恆定區(分別為VH/VL或CH1/CL)彼此交換/置換。在一個實施例中，免疫球蛋白分子為人類免疫球蛋白分子。在一個實施例中，免疫球蛋白分子包含人類恆定區，例如人類CH1、CH2、CH3及/或CL域。在一個實施例中，免疫球蛋白包含人類Fc域，特定言之，人類IgG1 Fc域。在一個實施例中，突變型IL-2多肽與免疫球蛋白分子共有胺基或羧基端肽鍵。在一個實施例中，免疫結合物基本上由突變型IL-2多肽與免疫球蛋白分子(特定言之，IgG分子，更特定言之，IgG1 分子)藉由一或多種連接肽連接而組成。在一個特定實施例中，突變型IL-2多肽的胺基端胺基酸與免疫球蛋白重鏈之一的羧基端胺基酸融合，視情況經由連接肽融合。 突變型IL-2多肽可以與雙特異性抗原結合分子直接融合或經由包含一或多個胺基酸(典型地約2-20個胺基酸)的連接肽融合。連接肽在此項技術中已知且描述於本文中。適合的非免疫原性連接肽包括例如(G4 S)n 、(SG4 )n 、(G4 S)n 或G4 (SG4 )n 連接肽。「n」通常為整數1至10，典型地為2至4。在一個實施例中，連接肽具有至少5個胺基酸之長度；在一個實施例中，具有5至100個胺基酸之長度；在另一實施例中，具有10至50個胺基酸之長度。在一個特定實施例中，連接肽具有15個胺基酸之長度。在一個實施例中，連接肽為(GxS)n 或(GxS)n Gm ，其中G=甘胺酸，S=絲胺酸，且(x=3，n=3、4、5或6，且m=0、1、2或3)或(x=4，n=2、3、4或5且m=0、1、2或3)，在一個實施例中，x=4且n=2或3，在另一實施例中，x=4且n=3。在一個特定實施例中，連接肽為(G4 S)3 (SEQ ID NO: 24)。在一個實施例中，連接肽具有(或組成為)胺基酸序列SEQ ID NO: 24。 在一個特定實施例中，免疫結合物包含突變型IL-2分子以及結合至PD-1及Tim-3之雙特異性抗原結合分子，其中雙特異性抗原結合分子為免疫球蛋白分子，特定言之，IgG類免疫球蛋白分子，更特定言之，IgG1 子類免疫球蛋白分子，其中在一個Fab分子(結合臂)中，重鏈及輕鏈之可變區或恆定區(分別為VH/VL或CH1/CL)彼此交換/置換，其中突變型IL-2分子的胺基端胺基酸與免疫球蛋白重鏈之一的羧基端胺基酸經由SEQ ID NO: 24之連接肽融合。 在一個特定實施例中，免疫結合物包含突變型IL-2分子以及結合至PD-1及Tim-3之雙特異性抗原結合分子，其中雙特異性抗原結合分子包含由第一及第二亞單元組成的Fc域，特定言之，人類IgG1 Fc域，且突變型IL-2分子的胺基端胺基酸與Fc域之一亞單元的羧基端胺基酸經由SEQ ID NO: 24之連接肽融合。結合至 PD-1 及 Tim-3 之 雙特異性抗原結合分子 本發明之免疫結合物包含雙特異性抗原結合分子，亦即，包含至少兩個能夠特異性結合至兩種不同抗原決定子(諸如PD-1及Tim-3)之抗原結合部分的抗原結合分子。 本發明之免疫結合物中所包含的雙特異性抗原結合分子結合至PD-1及Tim-3，特定言之，人類PD-1及人類Tim-3，且能夠將突變型IL-2多肽導引至表現PD-1及/或Tim-3的靶點，特定言之，導引至表現PD-1及/或Tim-3之T細胞，例如與腫瘤相關。 可用於本發明之免疫結合物中的適合PD-1/Tim-3雙特異性抗原結合分子描述於PCT專利申請案第PCT/EP2016/073192號，該案以全文引用之方式併入本文中。 根據本發明之特定實施例，雙特異性抗原結合分子中所包含之抗原結合部分為Fab分子(亦即，抗原結合域，其由各包含可變域及恆定域的重鏈及輕鏈組成)。在一個實施例中，第一及/或第二抗原結合部分為Fab分子。在一個實施例中，該Fab分子為人類Fab分子。在一個特定實施例中，該Fab分子為人類化Fab分子。在又另一個實施例中，該Fab分子包含人類重鏈及輕鏈恆定域。 優選地，抗原結合部分中之至少一者為互換型Fab分子。此類修飾減少來自不同Fab分子之重鏈與輕鏈的錯配，藉此改良雙特異性抗原結合分子在重組製備中的產量及純度。在適用於本發明之免疫結合物中所包含之雙特異性抗原結合分子地特定互換型Fab分子中，Fab輕鏈與Fab重鏈(分別為VL及VH)中的可變域交換。然而，即使存在此域交換，雙特異性抗原結合分子製劑亦可包含由於錯配之重鏈與輕鏈之間之所謂瓊斯本型(Bence Jones-type)相互作用而產生的某些副產物(參見Schaefer等人, PNAS, 108 (2011) 11187-11191)。為了進一步減少來自不同Fab分子之重鏈與輕鏈的錯配且從而提高所需雙特異性抗原結合分子的純度及產量，具有相反電荷的帶電胺基酸可以在結合至PD-1之Fab分子或結合至Tim-3之Fab分子之CH1及CL域中的特定胺基酸位置引入，如本文進一步描述。電荷修飾發生於雙特異性抗原結合分子所包含之習知Fab分子中(諸如所示，例如圖 1A 、 B 中)，或發生於雙特異性抗原結合分子所包含之(VH/VL)互換型Fab分子中(諸如所示，例如圖 1C 、 D 中)(但不發生於兩者中)。在特定實施例中，電荷修飾發生於雙特異性抗原結合分子所包含之習知Fab分子(在特定實施例中結合至Tim-3)中。 第一抗原結合部分 本發明之免疫結合物中所包含之雙特異性抗原結合分子包含至少一個抗原結合部分，特定言之，Fab分子，其結合至PD-1，特定言之，人類PD-1 (第一抗原)。在特定實施例中，結合至PD-1之抗原結合部分為如本文中所述的互換型Fab分子，亦即，其中Fab重鏈與輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL彼此交換/置換的Fab分子。在此類實施例中，結合至Tim-3之抗原結合部分為習知Fab分子(諸如所示，例如圖 1A 、 C 中)。 在替代實施例中，結合至Tim-3的抗原結合部分為如本文中所述的互換型Fab分子，亦即，其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL彼此交換/置換的Fab分子。在此類實施例中，結合至PD-1的抗原結合部分為習知Fab分子(諸如所示，例如圖 1B 、D 中)。 在一些實施例中，第一抗原結合部分包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 1的HVR-H1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 2的HVR-H2、含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 3的HVR-H3、含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 4的HVR-L1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 5的HVR-L2，及含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 6的HVR-L3。 在一些實施例中，第一抗原結合部分包含：(a)重鏈可變區(VH)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 1的HVR-H1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 2的HVR-H2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 3的HVR-H3；以及(b)輕鏈可變區(VL)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 4的HVR-L1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 5的HVR-L2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 6的HVR-L3。 在一些實施例中，第一抗原結合部分為(來源於)人類化抗體。在一個實施例中，VH為人類化VH且/或VL為人類化VL。在一個實施例中，第一抗原結合部分包含如任一上述實施例中的HVR，且進一步包含受體人類構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。在一些實施例中，重鏈及/或輕鏈可變區包含人類構架區(FR)。 在一些實施例中，第一抗原結合部分包含(a)重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 7至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，第一抗原結合部分包含輕鏈可變區(VL)，所述輕鏈可變區包含與選自由SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 11組成之群的胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。在一些實施例中，第一抗原結合部分包含：(a)重鏈可變區(VH)，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 7至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及(b)輕鏈可變區(VL)，其包含與選自由SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 11組成之群的胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。 在一些實施例中，第一抗原結合部分包含：與胺基酸序列SEQ ID NO: 7至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，以及與選自SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 11之群組的胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列。 在一些實施例中，第一抗原結合部分包含(a)含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 7的重鏈可變區(VH)，以及(b)含有胺基酸序列選自由SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 11組成之群的輕鏈可變區(VL)。 在一些實施例中，第一抗原結合部分包含VH序列SEQ ID NO: 7，及選自SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 11之群組的VL序列。 在一個特定實施例中，第一抗原結合部分包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 7的VH及含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 8的VL。 在一個特定實施例中，第一抗原結合部分包含VH序列SEQ ID NO: 7及VL序列SEQ ID NO: 8。 在一個實施例中，第一抗原結合部分包含人類恆定區。在一個實施例中，第一抗原結合部分為包含人類恆定區(特定言之，人類CH1及/或CL域)的Fab分子。人類恆定域之例示性序列明示於SEQ ID NO 41及42 (分別為人類κ及λ CL域)及SEQ ID NO: 43 (人類IgG1 重鏈恆定域CH1-CH2-CH3)中。在一些實施例中，第一抗原結合部分包含含有胺基酸序列與胺基酸序列SEQ ID NO: 41或SEQ ID NO: 42 (特定言之，胺基酸序列SEQ ID NO: 41)至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈恆定區。特定言之，輕鏈恆定區可以包含如本文在「電荷修飾」下所述的胺基酸突變且/或可以包含互換型Fab分子中之一或多個(特定言之，兩個) N端胺基酸的缺失或取代。在一些實施例中，第一抗原結合部分包含胺基酸序列與SEQ ID NO: 43胺基酸序列中所包含之CH1域序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈恆定區。特定言之，重鏈恆定區(尤其CH1域)可以包含如本文在「電荷修飾」下所述的胺基酸突變。 在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子中存在不超過一個結合至PD-1的抗原結合部分(亦即，雙特異性抗原結合分子向PD-1提供單價結合)。 第二抗原結合部分 本發明之免疫結合物中所包含的雙特異性抗原結合分子包含至少一個抗原結合部分，特定言之，Fab分子，其結合至Tim-3，特定言之，人類Tim-3 (第二抗原)。 在特定實施例中，結合至Tim-3的抗原結合部分為習知Fab分子。在此類實施例中，結合至PD-1的抗原結合部分較佳為如本文中所述的互換型Fab分子，亦即，其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL彼此交換/置換的Fab分子(參見例如圖 1A 、C )。 在替代實施例中，結合至PD-1的抗原結合部分為習知Fab分子。在此類實施例中，結合至Tim-3的抗原結合部分為如本文中所述的互換型Fab分子，亦即，其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CH1及CL彼此交換/置換的Fab分子(參見例如圖 1B 、D )。 在一些實施例中，第二抗原結合部分包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 12的HVR-H1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 13的HVR-H2、含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 14的HVR-H3、含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 15的HVR-L1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 16的HVR-L2，及含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 17的HVR-L3。 在一些實施例中，第二抗原結合部分包含：(a)重鏈可變區(VH)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 12的HVR-H1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 13的HVR-H2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 14的HVR-H3；以及(b)輕鏈可變區(VL)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 15的HVR-L1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 16的HVR-L2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 17的HVR-L3。 在一些實施例中，第二抗原結合部分為(來源於)人類化抗體。在一個實施例中，VH為人類化VH且/或VL為人類化VL。在一個實施例中，第二抗原結合部分包含如任一上述實施例中之HVR，且進一步包含受體人類構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。在一些實施例中，重鏈及/或輕鏈可變區包含人類構架區(FR)。 在一些實施例中，第二抗原結合部分包含含有胺基酸序列與SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 20胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH)。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含含有胺基酸序列與SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 21胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL)。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含(a)含有胺基酸序列與SEQ ID NO: 18胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH)，及(b)含有胺基酸序列與SEQ ID NO: 19胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL)。在其他實施例中，第二抗原結合部分包含：(a)重鏈可變區(VH)，其包含與SEQ ID NO: 20胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，及(b)輕鏈可變區(VL)，其包含與SEQ ID NO: 21胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。 在一些實施例中，第二抗原結合部分包含與SEQ ID NO: 18胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO: 19胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含與SEQ ID NO: 20胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VH序列，及與SEQ ID NO: 21胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的VL序列。 在一個特定實施例中，第二抗原結合部分包含(a)含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 18的重鏈可變區(VH)，及(b)含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 19的輕鏈可變區(VL)。在另一個特定實施例中，第二抗原結合部分包含SEQ ID NO: 18之VH序列及SEQ ID NO: 19之VL序列。 在一個實施例中，第二抗原結合部分包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 20的VH及含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 21的VL。在另一個實施例中，第二抗原結合部分包含SEQ ID NO: 20之VH序列及SEQ ID NO: 21之VL序列。 在一個實施例中，第二抗原結合部分包含人類恆定區。在一個實施例中，第二抗原結合部分為包含人類恆定區(特定言之，人類CH1及/或CL域)的Fab分子。人類恆定域之例示性序列明示於SEQ ID NO 41及42 (分別為人類κ及λ CL域)及SEQ ID NO: 43 (人類IgG1 重鏈恆定域CH1-CH2-CH3)中。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含含有胺基酸序列與SEQ ID NO: 41或SEQ ID NO: 42之胺基酸序列(特定言之，SEQ ID NO: 41之胺基酸序列)至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈恆定區。特定言之，輕鏈恆定區可以包含如本文在「電荷修飾」下所述的胺基酸突變且/或可以包含互換型Fab分子中之一或多個(特定言之，兩個) N端胺基酸的缺失或取代。在一些實施例中，第一抗原結合部分包含胺基酸序列與SEQ ID NO: 43胺基酸序列中所包含之CH1域序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈恆定區。特定言之，重鏈恆定區(尤其CH1域)可以包含如本文在「電荷修飾」下所述的胺基酸突變。 在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子中存在不超過一個結合至Tim-3的抗原結合部分(亦即，雙特異性抗原結合分子向Tim-3提供單價結合)。 電荷修飾 本發明之免疫結合物中所包含的雙特異性抗原結合分子可以包含存在於其中所含Fab分子中的胺基酸取代，該等胺基酸取代特別有效地減少輕鏈與不匹配重鏈的錯配(瓊斯本型副產物)，可以在基於Fab之雙特異性/多特異性抗原結合分子之製備時發生，其結合臂之一(或多個，在分子包含超過兩個抗原結合Fab分子的情況下)中存在VH/VL交換(亦參見PCT公開案第WO 2015/150447號，尤其是其中的實例，該案以全文引用之方式併入本文中)。所需雙特異性抗原結合分子相較於非所需副產物(特定言之，存在於雙特異性抗原結合分子中的瓊斯本型副產物，其結合臂之一中存在VH/VL域交換)的比率可以藉由在CH1及CL域中的特定胺基酸位置引入具有相反電荷的帶電胺基酸(在本文中有時稱為「電荷修飾」)而改良。 相應地，在其中雙特異性抗原結合分子之第一與第二抗原結合部分均為Fab分子的一些實施例中，且在抗原結合部分之一(特定言之，第一抗原結合部分)中，Fab輕鏈與Fab重鏈之可變域VL與VH彼此置換， i)在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經帶正電的胺基酸取代(根據Kabat編號)，且其中在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸經帶負電的胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)；或 ii)在第一抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經帶正電的胺基酸取代(根據Kabat編號)，且其中在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸經帶負電的胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。 雙特異性抗原結合分子不包含i)與ii)項下所提及的修飾。具有VH/VL交換之抗原結合部分之恆定域CL及CH1彼此不置換(亦即保持不交換)。 在一個更特定實施例中， i)在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)；或 ii)在第一抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。 在一個此類實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。 在另一個實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。 在一個特定實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)且位置123處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。 在一個更特定實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。 在一個甚至更特定的實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123處之胺基酸經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。 在特定實施例中，若根據上述實施例之胺基酸取代發生於第二抗原結合部分之恆定域CL及恆定域CH1中，則第二抗原結合部分之恆定域CL具有κ同型。 或者，根據上述實施例之胺基酸取代可發生於第一抗原結合部分之恆定域CL及恆定域CH1中，而非第二抗原結合部分之恆定域CL及恆定域CH1中。在特定的此類實施例中，第一抗原結合部分之恆定域CL具有κ同型。 相應地，在一個實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸或位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。 在另一個實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。 在再另一個實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)且位置123處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。 在一個實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。 在另一個實施例中，在第一抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123處之胺基酸經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且在第一抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。 在一個特定實施例中，本發明之免疫結合物中所包含之雙特異性抗原結合分子包含 (a)結合至PD-1之第一抗原結合部分，其中第一抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL與VH彼此置換，及 (b)結合至Tim-3之第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分為(習知) Fab分子； 其中在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123處之胺基酸經精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。 在一個特定實施例中，本發明之免疫結合物中所包含之雙特異性抗原結合分子包含 (a)結合至PD-1之第一抗原結合部分，其中第一抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL與VH彼此置換，及 (b)結合至Tim-3之第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分為(習知) Fab分子； 其中在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個特定實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)且位置123處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)(在一個特定實施例中，獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代)，且在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。 雙特異性抗原結合分子形式 本發明之免疫結合物所包含之雙特異性抗原結合分子中的組分可以多種構型彼此間融合。例示性構型描繪於圖1中。適合的雙特異性抗原結合分子形式描述於PCT公開案第WO2009080252號及第WO2009080253號，該等案以全文引用之方式併入本文中。 在特定實施例中，雙特異性抗原結合分子中所包含之抗原結合部分為Fab分子。在此類實施例中，第一、第二抗原結合部分等在本文中可分別稱為第一、第二Fab分子等。 在特定實施例中，雙特異性抗原結合分子包含由第一及第二亞單元組成的Fc域。Fc域之第一及第二亞單元能夠穩定結合。 雙特異性抗原結合分子可以具有不同構型，亦即，第一及第二抗原結合部分可以彼此間及與Fc域以不同方式融合。各組分可以彼此間直接融合或較佳經由一或多種適合連接肽融合。在Fab分子與Fc域亞單元之N端融合的情況下，其典型地經由免疫球蛋白鉸鏈區進行。 在一些實施例中，第一及第二抗原結合部分各自為Fab分子且各自在Fab重鏈之C端與Fc域之一亞單元之N端融合。在特定的此類實施例中，第二抗原結合部分為習知Fab分子，且第一抗原結合部分為如本文中所述的互換型Fab分子，亦即Fab分子，其中Fab重鏈及輕鏈之可變域VH及VL或恆定域CL及CH1彼此交換/置換。在其他此類實施例中，第二Fab分子為互換型Fab分子且第一Fab分子為習知Fab分子。 在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子基本上由以下組成：第一及第二Fab分子、由第一及第二亞單元組成的Fc域，及視情況存在之一或多種連接肽，其中第一及第二Fab分子各自在Fab重鏈之C端與Fc域之一亞單元之N端融合。此構型示意性地描繪於圖 1 中(在圖 1A 及1C 的實例中，第一抗原結合域為VH/VL互換型Fab分子且第二抗原結合部分為習知Fab分子，且在圖 1B 及1D 的實例中，第二抗原結合域為VH/VL互換型Fab分子且第一抗原結合部分為習知Fab分子)。第一及第二Fab分子可以與Fc域直接融合或經由連接肽融合。在一個特定實施例中，第一及第二Fab分子各自經由免疫球蛋白鉸鏈區與Fc域融合。在一個特定實施例中，免疫球蛋白鉸鏈區為人類IgG1 鉸鏈區，特別是Fc域為IgG1 Fc域的情況下。 在其中Fab分子於Fab重鏈之C端經由免疫球蛋白鉸鏈區與Fc域之各亞單元之N端融合的雙特異性抗原結合分子構型中，兩個Fab分子、鉸鏈區及Fc域基本上形成免疫球蛋白分子。在一個特定實施例中，免疫球蛋白分子為IgG類免疫球蛋白。在一個更特定的實施例中，免疫球蛋白為IgG1 子類免疫球蛋白。在另一個實施例中，免疫球蛋白為IgG4 子類免疫球蛋白。在另一特定實施例中，免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。在其他實施例中，免疫球蛋白為嵌合免疫球蛋白或人類化免疫球蛋白。在一個實施例中，免疫球蛋白包含人類恆定區，特定言之，人類Fc區。 抗原結合部分可與Fc域(或彼此間)直接融合或經由包含一或多個胺基酸(典型地約2-20個胺基酸)之連接肽融合。連接肽在此項技術中已知且描述於本文中。適合的非免疫原性連接肽包括例如(G4 S)n 、(SG4 )n 、(G4 S)n 或G4 (SG4 )n 連接肽。「n」通常為整數1至10，典型地為2至4。在一個實施例中，該連接肽具有至少5個胺基酸之長度；在一個實施例中，具有5至100個胺基酸之長度；在另一實施例中，具有10至50個胺基酸之長度。在一個實施例中，該連接肽為(GxS)n 或(GxS)n Gm ，其中G=甘胺酸，S=絲胺酸，且(x=3，n=3、4、5或6，且m=0、1、2或3)或(x=4，n=2、3、4或5且m=0、1、2或3)，在一個實施例中，x=4且n=2或3，在另一實施例中，x=4且n=2。在一個實施例中，該連接肽為(G4 S)2 。連接肽亦可包含免疫球蛋白鉸鏈區(之一部分)。特別是在Fab分子與Fc域亞單元N端融合的情況下，其可在額外的連接肽存在或不存在的情況下經由免疫球蛋白鉸鏈區或其一部分融合。 在特定實施例中，雙特異性抗原結合分子包含：其中第一Fab分子之Fab輕鏈可變區與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即，第一Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)、該第一Fab分子之Fab重鏈恆定區又與Fc域亞單元共有羧基端肽鍵的多肽(VL(1) -CH1(1) -CH2-CH3(-CH4))；及其中第二Fab分子之Fab重鏈與Fc域亞單元共有羧基端肽鍵的多肽(VH(2) -CH1(2) -CH2-CH3(-CH4))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第一Fab分子之Fab重鏈可變區與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(1) -CL(1) )及第二Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(2) -CL(2) )共有羧基端肽鍵的多肽。在某些實施例中，多肽係共價連接，例如經二硫鍵連接。參見例如圖 1A 及1C 。 在其他實施例中，雙特異性抗原結合分子包含：其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即，第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈可變區經輕鏈可變區置換)、該第二Fab分子之Fab重鏈恆定區又與Fc域亞單元共有羧基端肽鍵的多肽(VL(2) -CH1(2) -CH2-CH3(-CH4))；及其中第一Fab分子之Fab重鏈與Fc域亞單元共有羧基端肽鍵的多肽(VH(1) -CH1(1) -CH2-CH3(-CH4))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區(VH(2) -CL(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共有羧基端肽鍵的多肽。在某些實施例中，多肽係共價連接，例如經二硫鍵連接。參見例如圖 1B 及1D 。 在某些實施例中，雙特異性抗原結合分子包含：其中第一Fab分子之Fab重鏈可變區與第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即，第一Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)、該第一Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與Fc域亞單元共有羧基端肽鍵的多肽(VL(1) -CL(1) -CH2-CH3(-CH4))；及其中第二Fab分子之Fab重鏈與Fc域亞單元共有羧基端肽鍵的多肽(VH(2) -CH1(2) -CH2-CH3(-CH4))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第一Fab分子之Fab輕鏈可變區與第一Fab分子之Fab重鏈恆定區(VL(1) -CH1(1) )及第二Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(2) -CL(2) )共有羧基端肽鍵的多肽。在某些實施例中，多肽係共價連接，例如經二硫鍵連接。 在再其他實施例中，雙特異性抗原結合分子包含：其中第二Fab分子之Fab重鏈可變區與第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區共有羧基端肽鍵(亦即，第二Fab分子包含互換型Fab重鏈，其中重鏈恆定區經輕鏈恆定區置換)、該第二Fab分子之Fab輕鏈恆定區又與Fc域亞單元共有羧基端肽鍵的多肽(VH(2) -CL(2) -CH2-CH3(-CH4))；及其中第一Fab分子之Fab重鏈與Fc域亞單元共有羧基端肽鍵的多肽(VH(1) -CH1(1) -CH2-CH3(-CH4))。在一些實施例中，雙特異性抗原結合分子進一步包含其中第二Fab分子之Fab輕鏈可變區與第二Fab分子之Fab重鏈恆定區(VL(2) -CH1(2) )及第一Fab分子之Fab輕鏈多肽(VL(1) -CL(1) )共有羧基端肽鍵的多肽。在某些實施例中，多肽係共價連接，例如經二硫鍵連接。 在一個特定實施例中，本發明之免疫結合物中所包含之雙特異性抗原結合分子包含 a)結合至PD-1之第一抗原結合部分，其中該第一抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL與VH或恆定域CL與CH1彼此置換； b)結合至Tim-3之第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分為(習知) Fab分子；及 c)由第一及第二亞單元組成的Fc域； 其中 a)項下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與c)項下之Fc域之一亞單元(特定言之，第一亞單元)之N端融合，且b)項下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與c)項下之Fc域之另一亞單元(特定言之，第二亞單元)的N端融合。 在一個特定實施例中，第一及第二抗原結合部分各自與Fc域經由免疫球蛋白鉸鏈區融合。 在另一個實施例中，本發明之免疫結合物中所包含之雙特異性抗原結合分子包含 a)結合至PD-1之第一抗原結合部分，其中該第一抗原結合部分為(習知) Fab分子； b)結合至Tim-3之第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL與VH或恆定域CL與CH1彼此置換；及 c)由第一及第二亞單元組成的Fc域； 其中 a)項下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與c)項下之Fc域之一亞單元(特定言之，第一亞單元)之N端融合，且b)項下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與c)項下之Fc域之另一亞單元(特定言之，第二亞單元)的N端融合。 在一個特定實施例中，第一及第二抗原結合部分各自與Fc域經由免疫球蛋白鉸鏈區融合。 在雙特異性抗原結合分子之所有不同構型中，本文所述之胺基酸取代若存在，則可以存在於第一抗原結合部分/Fab分子之CH1及CL域中，或第二抗原結合部分/Fab分子之CH1及CL域中。較佳地，其存在於第二抗原結合部分/Fab分子之CH1及CL域中。根據本發明之構思，若如本文所述的胺基酸取代發生於第二抗原結合部分/Fab分子中，則第一抗原結合部分/Fab分子中不發生此類胺基酸取代。反之，若第一抗原結合部分/Fab分子中發生如本文所述的胺基酸取代，則第二抗原結合部分/Fab分子中不發生此類胺基酸取代。胺基酸取代特定地發生於包含Fab分子的雙特異性抗原結合分子中，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL與VH1彼此置換。 在雙特異性抗原結合分子之特定實施例中(特定言之，其中如本文所述之胺基酸取代發生於第二抗原結合部分/Fab分子中)，第二Fab分子之恆定域CL具有κ同型。在雙特異性抗原結合分子之其他實施例中(特定言之，其中如本文所述之胺基酸取代發生於第一抗原結合部分/Fab分子中)，第一抗原結合部分/Fab分子之恆定域CL具有κ同型。在一些實施例中，第一抗原結合部分/Fab分子之恆定域CL及第二抗原結合部分/Fab分子之恆定域CL具有κ同型。 在一個特定實施例中，本發明之免疫結合物中所包含之雙特異性抗原結合分子包含 (a)結合至PD-1之第一抗原結合部分，其中第一抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL與VH彼此置換； b)結合至Tim-3之第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分為(習知) Fab分子； c)由第一及第二亞單元組成的Fc域； 其中在b)項下之第二抗原結合部分的恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123處之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最特定言之，經精胺酸(R)取代)，且其中在b)項下之第二抗原結合部分的恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；並且 其中 a)項下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與c)項下之Fc域之一亞單元(特定言之，第一亞單元)之N端融合，且b)項下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與c)項下之Fc域之另一亞單元(特定言之，第二亞單元)的N端融合。 在一個特定實施例中，第一及第二抗原結合部分各自與Fc域經由免疫球蛋白鉸鏈區融合。 在另一個實施例中，本發明之免疫結合物中所包含之雙特異性抗原結合分子包含 a)結合至PD-1之第一抗原結合部分，其中該第一抗原結合部分為(習知) Fab分子； b)結合至Tim-3之第二抗原結合部分，其中第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL與VH彼此置換； c)由第一及第二亞單元組成的Fc域； 其中在a)項下之第一抗原結合部分的恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123處之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最特定言之，經精胺酸(R)取代)，且其中在a)項下之第一抗原結合部分的恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及 其中 a)項下之第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與c)項下之Fc域之一亞單元(特定言之，第一亞單元)之N端融合，且b)項下之第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與c)項下之Fc域之另一亞單元(特定言之，第二亞單元)的N端融合。 在一個特定實施例中，第一及第二抗原結合部分各自與Fc域經由免疫球蛋白鉸鏈區融合。 Fc 域 在特定實施例中，本發明之免疫結合物中所包含的雙特異性抗原結合分子包含由第一及第二亞單元組成的Fc域。 雙特異性抗原結合分子中之Fc域係由包含免疫球蛋白分子重鏈域之一對多肽鏈組成。舉例而言，免疫球蛋白G (IgG)分子之Fc域為二聚體，其中各亞單元包含CH2及CH3 IgG重鏈恆定域。Fc域之兩個亞單元彼此間能夠穩定結合。在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子包含不超過一個Fc域。 在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子之Fc域為IgG Fc域。在一個特定實施例中，Fc域為IgG1 Fc域。在另一實施例中，Fc域為IgG4 Fc域。在一個更特定實施例中，Fc域為包含位置S228 (Kabat EU索引編號)之胺基酸取代(特定言之，胺基酸取代S228P)的IgG4 Fc域。此胺基酸取代減少活體內IgG4 抗體之Fab臂交換(參見Stubenrauch等人, Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010))。在另一特定實施例中，Fc域為人類Fc域。在一個甚至更特定的實施例中，Fc域為人類IgG1 Fc域。人類IgG1 Fc區之例示性序列明示於SEQ ID NO: 40中。促進雜二聚化之 Fc 域修飾 本發明之免疫結合物包含突變型IL-2多肽，特定言之，單一(不超過一種)突變型IL-2多肽，及不同抗原結合部分，其可以與雙特異性抗原結合分子之Fc域之兩個亞單元中的一者或另一者融合，因此兩個不一致多肽鏈中典型地包含Fc域之兩個亞單元。此等多肽之重組型共表現及隨後的二聚化引起兩種多肽之若干種可能的組合。為了改良雙特異性抗原結合分子在重組製備時的產量及純度，將促進所需多肽結合的修飾引入雙特異性抗原結合分子之Fc域中因此將是有利的。 相應地，在特定實施例中，本發明之免疫結合物所包含之雙特異性抗原結合分子中的Fc域包含促進Fc域之第一與第二亞單元結合的修飾。人類IgG Fc域中之兩個亞單元之間最廣泛蛋白質-蛋白質相互作用的位點存在於Fc域之CH3域中。因此，在一個實施例中，該修飾存在於Fc域之CH3域中。 Fc域之CH3域中的修飾存在若干種方法以便加強雜二聚化，此等方法充分描述於例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO 2013157954、WO 2013096291中。典型地，在所有此類方法中，Fc域之第一亞單元之CH3域與Fc域之第二亞單元之CH3域均以互補方式經工程改造，使得各CH3域(或包含其的重鏈)不再與本身發生均二聚，而是被迫與以互補方式經工程改造之另一CH3域雜二聚(使得第一與第二CH3域發生雜二聚且兩個第一或兩個第二CH3域之間不形成均二聚體)。涵蓋用於改良重鏈雜二聚的此等不同方法與雙特異性抗原結合分子之重鏈-輕鏈修飾(例如，一個結合臂中之VH與VL交換/置換及將具有相反電荷之帶電胺基酸取代引入CH1/CL界面)的組合作為不同替代方案，從而減少重鏈/輕鏈錯配及瓊斯本型副產物。 在一個特定實施例中，促進Fc域之第一亞單元與第二亞單元結合的該修飾為所謂的「臼包杵」型修飾，包含發生於Fc域之兩個亞單元之一中的「杵」型修飾及發生於Fc域之兩個亞單元之另一者中的「臼」型修飾。 臼包杵技術描述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人, Prot Eng 9, 617-621 (1996)及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中。一般而言，方法包括在第一多肽之界面處引入隆凸(「杵」)及在第二多肽之界面處引入相應空腔(「臼」)，使得隆凸可定位於空腔中以便促進雜二聚體形成且阻礙均二聚體形成。藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換第一多肽界面中之小胺基酸側鏈來構建隆凸。大小與隆凸相同或相似的補償性空腔藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈而產生於第二多肽之界面中。 相應地，在一個特定實施例中，在雙特異性抗原結合分子之Fc域之第一亞單元的CH3域中，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積的胺基酸殘基置換，從而在第一亞單元之CH3域內產生可定位於第二亞單元之CH3域內之空腔中的隆凸，且在Fc域之第二亞單元之CH3域中，胺基酸殘基經具有較小側鏈體積的胺基酸殘基置換，從而在第二亞單元之CH3域內產生供第一亞單元之CH3域內之隆凸可定位於其中的空腔。 較佳地，具有較大側鏈體積之該胺基酸殘基選自由精胺酸(R)、***酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)組成之群。 較佳地，具有較小側鏈體積的胺基酸殘基選自由丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)組成之群。 隆凸及空腔可藉由改變編碼多肽之核酸(例如藉由定點突變誘發或藉由肽合成來改變)來產生。 在一個特定實施例中，在Fc域之第一亞單元(「杵」亞單元)(之CH3域)中，位置366處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基置換(T366W)，且在Fc域之第二亞單元(「臼」亞單元)(之CH3域)中，位置407處之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基置換(Y407V)。在一個實施例中，在Fc域之第二亞單元中，另外，位置366處之蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基置換(T366S)且位置368處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L368A)(根據Kabat EU索引編號)。 在另一實施例中，在Fc域之第一亞單元中，另外，位置354處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(S354C)或位置356處之麩胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(E356C)(特定言之，位置354處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換)，且在Fc域之第二亞單元中，另外，位置349處之酪胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(Y349C)(根據Kabat EU索引編號)。引入此兩個半胱胺酸殘基使得Fc域之兩個亞單元之間形成二硫橋鍵，進一步穩定二聚體(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。 在一個特定實施例中，Fc域之第一亞單元包含胺基酸取代S354C及T366W，且Fc域之第二亞單元包含胺基酸取代Y349C、T366S、L368A及Y407V (根據Kabat EU索引編號)。 在一個特定實施例中，突變型IL-2多肽與Fc域之第一亞單元(包含「杵」修飾)融合(視情況經由連接肽)。不希望受理論所束縛，突變型IL-2多肽與Fc域之含杵亞單元的融合(進一步)使包含兩種突變型IL-2多肽之免疫結合物的產生最小化(兩種含杵多肽發生空間位阻)。 涵蓋用於增強雜二聚化之CH3修飾的其他技術作為本發明之替代方案且此等技術描述於例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291中。 在一個實施例中，替代地使用EP 1870459中所述之雜二聚化方法。此方法係基於在Fc域之兩個亞單元之間的CH3/CH3域界面中的特定胺基酸位置引入具有相反電荷的帶電胺基酸。本發明之免疫結合物中所包含之雙特異性抗原結合分子的一個較佳實施例為存在於(Fc域之)兩個CH3域之一中的胺基酸突變R409D、K370E及存在於Fc域之另一個CH3域中的胺基酸突變D399K、E357K (根據Kabat EU索引編號)。 在另一個實施例中，本發明之免疫結合物中所包含的雙特異性抗原結合分子包含存在於Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸突變T366W及存在於Fc域之第二亞單元之CH3域中的胺基酸突變T366S、L368A、Y407V；以及另外存在於Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸突變R409D、K370E及存在於Fc域之第二亞單元之CH3域中的胺基酸突變D399K、E357K (根據Kabat EU索引編號)。 在另一個實施例中，雙特異性抗原結合分子包含存在於Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸突變S354C、T366W及存在於Fc域之第二亞單元之CH3域中的胺基酸突變Y349C、T366S、L368A、Y407V，或該雙特異性抗原結合分子包含存在於Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸突變Y349C、T366W及存在於Fc域之第二亞單元之CH3域中的胺基酸突變S354C、T366S、L368A、Y407V，以及另外存在於Fc域之第一亞單元之CH3域中的胺基酸突變R409D、K370E及存在於Fc域之第二亞單元之CH3域中的胺基酸突變D399K、E357K (所有均根據Kabat EU索引編號)。 在一個實施例中，替代地使用WO 2013/157953中所述之雜二聚化方法。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變T366K且第二CH3域包含胺基酸突變L351D (根據Kabat EU索引編號)。在另一個實施例中，第一CH3域進一步包含胺基酸突變L351K。在另一個實施例中，第二CH3域進一步包含選自Y349E、Y349D及L368E之胺基酸突變(較佳為L368E)(根據Kabat EU索引編號)。 在一個實施例中，替代地使用WO 2012/058768中所述之雜二聚化方法。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變L351Y、Y407A且第二CH3域包含胺基酸突變T366A、K409F。在另一個實施例中，第二CH3域包含位置T411、D399、S400、F405、N390或K392之另一胺基酸突變，例如選自以下之胺基酸突變：a) T411N、T411R、T411Q、T411K、T411D、T411E或T411W；b) D399R、D399W、D399Y或D399K；c) S400E、S400D、S400R或S400K；d) F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W；e) N390R、N390K或N390D；f) K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E (根據Kabat EU索引編號)。在另一實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變L351Y、Y407A且第二CH3域包含胺基酸突變T366V、K409F。在另一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變Y407A且第二CH3域包含胺基酸突變T366A、K409F。在另一個實施例中，第二CH3域進一步包含胺基酸突變K392E、T411E、D399R及S400R (根據Kabat EU索引編號)。 在一個實施例中，替代地使用WO 2011/143545中所述的雜二聚化方法，例如在選自由368及409組成之群之位置進行胺基酸修飾(根據Kabat EU索引編號)。 在一個實施例中，替代地使用WO 2011/090762中所述之雜二聚化方法，其亦使用上述臼包杵技術。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變T366W且第二CH3域包含胺基酸突變Y407A。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變T366Y且第二CH3域包含胺基酸突變Y407T (根據Kabat EU索引編號)。 在一個實施例中，雙特異性抗原結合分子或其Fc域屬於IgG2 子類且替代地使用WO 2010/129304中所述的雜二聚化方法。 在一個替代性實施例中，促進Fc域之第一與第二亞單元結合的修飾包含介導靜電偏轉效應之修飾，例如如PCT公開案WO 2009/089004中所述。通常，此方法涉及用帶電胺基酸殘基置換兩個Fc域子單元界面處之一或多個胺基酸殘基，使得均二聚體形成變得在靜電上不利，但雜二聚在靜電上有利。在一個此類實施例中，第一CH3域包含帶負電胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)，較佳為K392D或N392D)對K392或N392實現的胺基酸取代且第二CH3域包含帶正電胺基酸(例如離胺酸(K)或精胺酸(R)，較佳為D399K、E356K、D356K或E357K，且更佳為D399K及E356K)對D399、E356、D356或E357實現的胺基酸取代。在另一實施例中，第一CH3域進一步包含帶負電胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)，較佳為K409D或R409D)對K409或R409實現的胺基酸取代。在另一實施例中，第一CH3域進一步或替代地包含帶負電胺基酸(例如麩胺酸(E)或天冬胺酸(D))對K439及/或K370實現的胺基酸取代(所有編號均根據Kabat EU索引)。 在又另一個實施例中，替代地使用WO 2007/147901中所述之雜二聚化方法。在一個實施例中，第一CH3域包含胺基酸突變K253E、D282K及K322D且第二CH3域包含胺基酸突變D239K、E240K及K292D (根據Kabat EU索引編號)。 在再另一個實施例中，可替代地使用WO 2007/110205中所述之雜二聚化方法。 在一個實施例中，Fc域之第一亞單元包含胺基酸取代K392D及K409D，且Fc域之第二亞單元包含胺基酸取代D356K及D399K (根據Kabat EU索引編號)。降低 Fc 受體結合及 / 或效應子功能之 Fc 域修飾 Fc域賦予雙特異性抗原結合分子(或抗體)有利的藥物動力學特性，包括較長血清半衰期，其有助於良好聚積於靶組織中及有利的組織-血液分佈比率。然而，其同時導致雙特異性抗原結合分子(或抗體)非所需地靶向表現Fc受體的細胞，而非優先靶向帶有抗原的細胞。此外，Fc受體信號傳導路徑的共活化可能引起細胞介素釋放，全身投與後，其與IL-2多肽及雙特異性抗原結合分子之長半衰期組合，導致細胞介素受體之過度活化及嚴重副作用。據此，與輸注反應相關的習知IgG-IL-2免疫結合物已有描述(參見例如King等人, J Clin Oncol 22, 4463-4473 (2004))。 相應地，在特定實施例中，本發明之免疫結合物所包含之雙特異性抗原結合分子中的Fc域相較於原生IgG1 Fc域，展現了減小的針對Fc受體之結合親和力及/或減少的效應功能。在一個此類實施例中，Fc域(或包含該Fc域的雙特異性抗原結合分子)相較於原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域的雙特異性抗原結合分子)，展現小於50%、較佳小於20%、更佳小於10%且最佳小於5%的針對Fc受體之結合親和力，且/或相較於原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域的雙特異性抗原結合分子)，展現小於50%、較佳小於20%、更佳小於10%且最佳小於5%的效應功能。在一個實施例中，Fc域(或包含該Fc域的雙特異性抗原結合分子)基本上不結合至Fc受體且/或誘導效應功能。在一特定實施例中，Fc受體為Fcγ受體。在一個實施例中，Fc受體為人類Fc受體。在一個實施例中，Fc受體為活化Fc受體。在一特定實施例中，Fc受體為活化人類Fcγ受體，更特定言之人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定言之，人類FcγRIIIa。在一個實施例中，效應功能為選自CDC、ADCC、ADCP及細胞介素分泌之群的一或多者。在一個特定實施例中，效應功能為ADCC。在一個實施例中，Fc域對新生兒Fc受體(FcRn)展現的結合親和力實質上類似於原生IgG1 Fc域。當Fc域(或包含該Fc域之雙特異性抗原結合分子)展現大於約70%、特定言之大於約80%、更特定言之大於約90%之原生IgG1 Fc域(或包含原生IgG1 Fc域的雙特異性抗原結合分子)對FcRn之結合親和力時，達成基本上類似的針對FcRn之結合。 在某些實施例中，相較於未經工程改造的Fc域，經工程改造的Fc域對Fc受體的結合親和力減小且/或效應功能減少。在特定實施例中，雙特異性抗原結合分子之Fc域包含一或多個使Fc域對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸突變。典型地，Fc域之兩個子單元之每一者中存在相同的一或多個胺基酸突變。在一個實施例中，胺基酸突變使Fc域對Fc受體的結合親和力減小。在一個實施例中，胺基酸突變使Fc域對Fc受體的結合親和力減小至少2倍、至少5倍或至少10倍。在其中存在超過一個使Fc域對Fc受體之結合親和力減小之胺基酸突變的實施例中，此等胺基酸突變之組合可使Fc域對Fc受體的結合親和力減小至少10倍、至少20倍或甚至至少50倍。在一個實施例中，包含經工程改造之Fc域的雙特異性抗原結合分子相較於包含未經工程改造之Fc域的雙特異性抗原結合分子，展現小於20%、特定言之小於10%、更特定言之5%的針對Fc受體之結合親和力。在一個特定實施例中，Fc受體為Fcγ受體。在一些實施例中，Fc受體為人類Fc受體。在一些實施例中，Fc受體為活化Fc受體。在一個特定實施例中，Fc受體為活化人類Fcγ受體，更特定言之，人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定言之，人類FcγRIIIa。較佳地，與此等受體中之每一者的結合減少。在一些實施例中，針對補體組分的結合親和力，特定言之，針對C1q的結合親和力，亦減小。在一個實施例中，針對新生兒Fc受體(FcRn)的結合親和力不減小。當Fc域(或包含該Fc域的雙特異性抗原結合分子)展現大於約70%之Fc域非工程化形式(或包含該Fc域非工程化形式的雙特異性抗原結合分子)對FcRn之結合親和力時，達成基本上類似的對FcRn之結合，亦即保持Fc域對該受體的結合親和力。Fc域或包含該Fc域的雙特異性抗原結合分子可以展現此類親和力之大於約80%及甚至大於約90%。在某些實施例中，相較於非工程化Fc域，雙特異性抗原結合分子中的Fc域經工程改造以具有減少的效應功能。減少之效應功能可包括(但不限於)以下一或多者：補體依賴性細胞毒性(CDC)降低、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)降低、抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)減少、細胞介素分泌減少、免疫複合物介導抗原呈遞細胞攝入抗原減少、與NK細胞之結合減少、與巨噬細胞之結合減少、與單核細胞之結合減少、與多形核細胞之結合減少、誘導細胞凋亡之直接信號傳導減少、結合標靶之抗體之交聯減少、樹突狀細胞成熟減少或T細胞激活減少。在一個實施例中，減少之效應功能為選自以下之群的一或多者：CDC降低、ADCC降低、ADCP減少及細胞介素分泌減少。在一個特定實施例中，減少之效應功能為ADCC降低。在一個實施例中，降低之ADCC為非工程化Fc域(或包含非工程化Fc域之雙特異性抗原結合分子)所誘導之ADCC的小於20%。 在一個實施例中，使Fc域對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸突變為胺基酸取代。在一個實施例中，Fc域包含位於選自以下之群之位置的胺基酸取代：E233、L234、L235、N297、P331及P329 (根據Kabat EU索引編號)。在一個更特定實施例中，Fc域包含位於選自以下之群之位置的胺基酸取代：L234、L235及P329 (根據Kabat EU索引編號)。在一些實施例中，Fc域包含胺基酸取代L234A及L235A (根據Kabat EU索引編號)。在一個此類實施例中，Fc域為IgG1 Fc域，特定言之，人類IgG1 Fc域。在一個實施例中，Fc域包含位置P329處之胺基酸取代。在一個更特定實施例中，胺基酸取代為P329A或P329G，特定言之，P329G (根據Kabat EU索引編號)。在一個實施例中，Fc域包含位置P329之胺基酸取代及選自E233、L234、L235、N297及P331之位置的另一胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。在一個更特定的實施例中，另一胺基酸取代為E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定實施例中，Fc域包含位置P329、L234及L235之胺基酸取代(根據Kabat EU索引編號)。在更多特定實施例中，Fc域包含胺基酸突變L234A、L235A及P329G (「P329G LALA」、「PGLALA」或「LALAPG」)。具體言之，在特定實施例中，Fc域中之各亞單元包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G (Kabat EU索引編號)，亦即，在Fc域之第一及第二亞單元之每一者中，位置234處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L234A)，位置235處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L235A)且位置329處之脯胺酸殘基經甘胺酸殘基置換(P329G)(根據Kabat EU索引編號)。 . 在一個此類實施例中，Fc域為IgG1 Fc域，特定言之，人類IgG1 Fc域。「P329G LALA」胺基酸取代組合幾乎徹底地消除人類IgG1 Fc域與Fcγ受體(以及補體)之結合，如PCT公開案第WO 2012/130831號中所述，該文獻以全文引用的方式併入本文中。WO 2012/130831亦描述製備此類突變型Fc域的方法及測定其特性(諸如Fc受體結合或效應功能)的方法。 相較於IgG1 抗體，IgG4 抗體展現減小之針對Fc受體的結合親和力及減少之效應功能。因此，在一些實施例中，本發明之免疫結合物所包含之雙特異性抗原結合分子中的Fc域為IgG4 Fc域，特定言之，人類IgG4 Fc域。在一個實施例中，IgG4 Fc域包含位置S228之胺基酸取代，特定言之，胺基酸取代S228P (根據Kabat EU索引編號)。為了進一步減小其對Fc受體的結合親和力及/或其效應功能，在一個實施例中，IgG4 Fc域包含位置L235之胺基酸取代，特定言之，胺基酸取代L235E (根據Kabat EU索引編號)。在另一個實施例中，IgG4 Fc域包含位置P329之胺基酸取代，特定言之，胺基酸取代P329G (根據Kabat EU索引編號)。在一個特定實施例中，IgG4 Fc域包含位置S228、L235及P329之胺基酸取代，特定言之，胺基酸取代S228P、L235E及P329G (根據Kabat EU索引編號)。此類IgG4 Fc域突變體及其Fcγ受體結合特性描述於PCT公開案第WO 2012/130831號中，該案以全文引用的方式併入本文中。 在一個特定實施例中，相較於原生IgG1 Fc域展現減小之針對Fc受體之結合親和力及/或減少之效應功能的Fc域為包含胺基酸取代L234A、L235A及視情況存在之P329G的人類IgG1 Fc域，或包含胺基酸取代S228P、L235E及視情況存在之P329G的人類IgG4 Fc域(根據Kabat EU索引編號)。 在某些實施例中，Fc域之N-糖基化已消除。在一個此類實施例中，Fc域包含位置N297之胺基酸突變，特定言之，丙胺酸置換天冬醯胺的胺基酸取代(N297A)或天冬胺酸置換天冬醯胺的胺基酸取代(N297D)(根據Kabat EU索引編號)。 除上文及PCT公開案第WO 2012/130831號中所述的Fc域之外，Fc受體結合及/或效應功能減少的Fc域亦包括一或多個Fc域殘基238、265、269、270、297、327及329取代的彼等Fc域(美國專利第6,737,056號)(根據Kabat EU索引編號)。此類Fc突變體包括胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩個或超過兩個位置發生取代的Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸的所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。 突變型Fc域可使用此項技術中熟知之遺傳學或化學方法，藉由胺基酸缺失、取代、***或修飾來製備。遺傳學方法可包括DNA編碼序列之位點特異性突變誘發、PCR、基因合成及類似方法。恰當的核苷酸變化可藉由例如定序來檢驗。 與Fc受體的結合可容易測定，例如藉由ELISA，或藉由表面電漿子共振(SPR)、使用標準儀器，諸如BIAcore儀器(GE Healthcare)，且可藉由重組表現來獲得諸如Fc受體。或者，Fc域或包含Fc域之雙特異性抗原結合分子對Fc受體的結合親和力可使用已知表現特定Fc受體的細胞株(諸如表現FcγIIIa受體的人類NK細胞)評價。 Fc域或包含Fc域之雙特異性抗原結合分子的效應功能可藉由此項技術中已知之方法量測。用於評估所關注分子之ADCC活性的活體外分析實例描述於美國專利第5,500,362號；Hellstrom等人, Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及Hellstrom等人, Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；美國專利第5,821,337號；Bruggemann等人, J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)中。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如流式細胞術用的ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及CytoTox 96® 非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI))。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。替代地或另外，可以評估所關注之分子在例如動物模型中的ADCC活性，諸如Clynes等人, Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)中所揭示。 在一些實施例中，Fc域對補體組分(特定言之，C1q)的結合減少。因此，在其中Fc域經工程改造而具有減少之效應功能的一些實施例中，該減少之效應功能包括降低之CDC。可以進行C1q結合分析以確定Fc域或包含該Fc域之雙特異性抗原結合分子是否能夠結合C1q且因此具有CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為了評估補體活化，可以執行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人, J Immunol Methods 202, 163 (1996)；Cragg等人, Blood 101, 1045-1052 (2003)；及Cragg及Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004))。 亦可使用此項技術中已知之方法(參見例如Petkova, S.B.等人,Int ' l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)；WO 2013/120929)進行FcRn結合及活體內清除/半衰期測定。本發明之特定態樣 在一個特定態樣中，本發明提供一種免疫結合物，其包含突變型IL-2多肽以及結合至PD-1及Tim-3的雙特異性抗原結合分子， 其中該突變型IL-2多肽為包含胺基酸取代F42A、Y45A及L72G (相對於人類IL-2序列SEQ ID NO: 22編號)的人類IL-2分子；及 其中該雙特異性抗原結合分子包含 (i)結合至PD-1的第一抗原結合部分，包含(a)含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 7的重鏈可變區(VH)，及(b)含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 8的輕鏈可變區(VL)；及 (ii)結合至Tim-3的第二抗原結合部分，包含(a)含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 18的重鏈可變區(VH)，及(b)含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 19的輕鏈可變區(VL)。 在一個特定態樣中，本發明提供一種免疫結合物，其包含突變型IL-2多肽以及結合至PD-1及Tim-3的雙特異性抗原結合分子， 其中該突變型IL-2多肽為人類IL-2分子，其包含胺基酸取代T3A、F42A、Y45A、L72G及C125A (相對於人類IL-2序列SEQ ID NO: 22編號)；及 其中該雙特異性抗原結合分子包含 (i)結合至PD-1的第一抗原結合部分，包含(a)含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 7的重鏈可變區(VH)，及(b)含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 8的輕鏈可變區(VL)；及 (ii)結合至Tim-3的第二抗原結合部分，包含(a)含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 18的重鏈可變區(VH)，及(b)含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 19的輕鏈可變區(VL)。 在一個特定態樣中，本發明提供一種免疫結合物，其包含突變型IL-2多肽以及結合至PD-1及Tim-3的雙特異性抗原結合分子， 其中突變型IL-2多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO: 23；及 其中該雙特異性抗原結合分子包含 (i)結合至PD-1的第一抗原結合部分，包含(a)含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 7的重鏈可變區(VH)，及(b)含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 8的輕鏈可變區(VL)；及 (ii)結合至Tim-3的第二抗原結合部分，包含(a)含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 18的重鏈可變區(VH)，及(b)含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 19的輕鏈可變區(VL)。 在一些實施例中，根據上述態樣中的任一態樣，第一抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL與VH彼此置換，且第二抗原結合部分為(習知) Fab分子。在一些此類實施例中，在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)，且位置123處之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最特定言之，經精胺酸(R)取代)，且在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。 在一些實施例中，根據上述態樣中的任一態樣，雙特異性抗原結合分子進一步包含由第一及第二亞單元組成的Fc域。在一些此類實施例中，第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與Fc域之一亞單元(特定言之，Fc域之第一亞單元)的N端融合，且第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與Fc域之另一亞單元(特定言之，Fc域之第二亞單元)的N端融合。 在一個特定態樣中，本發明提供一種免疫結合物，其包含突變型IL-2多肽以及結合至PD-1及Tim-3的雙特異性抗原結合分子， 其中突變型IL-2多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO: 23；及 其中該雙特異性抗原結合分子包含 (i)結合至PD-1之第一抗原結合部分，其中該第一抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL與VH彼此置換，該Fab分子包含(a)含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 7的重鏈可變區(VH)，及(b)含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 8的輕鏈可變區(VL)； (ii)結合至Tim-3的第二抗原結合部分，其中該第二抗原結合部分為(習知) Fab分子，其包含(a)含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 18的重鏈可變區(VH)，及(b)含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 19的輕鏈可變區(VL)，其中在第二抗原結合部分之恆定域CL中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123處之胺基酸經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)(最特定言之，經精胺酸(R)取代)，且在第二抗原結合部分之恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)；及 (iii)由第一及第二亞單元組成的Fc域， 其中該第一抗原結合部分在Fab重鏈之C端與Fc域之一亞單元(特定言之，Fc域之第一亞單元)的N端融合，且第二抗原結合部分在Fab重鏈之C端與Fc域之另一亞單元(特定言之，Fc域之第二亞單元)的N端融合。 在一些實施例中，根據本發明之上述態樣中之任一態樣，在Fc域之第一亞單元中，位置366處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基置換(T366W)，且在Fc域之第二亞單元中，位置407處的酪胺酸殘基經纈胺酸殘基置換(Y407V)且視情況，位置366處之蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基置換(T366S)且位置368處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L368A)(根據Kabat EU索引編號)。在一些此類實施例中，在Fc域之第一亞單元中，另外，位置354處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(S354C)或位置356處之麩胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(E356C)(特定言之，位置354處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換)，且在Fc域之第二亞單元中，另外，位置349處之酪胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(Y349C)(根據Kabat EU索引編號)。 在一些實施例中，根據本發明之上述態樣中之任一態樣，在Fc域之第一及第二亞單元之每一者中，位置234處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L234A)，位置235處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L235A)且位置329處之脯胺酸殘基經甘胺酸殘基置換(P329G)(根據Kabat EU索引編號)。 在一些實施例中，根據本發明之上述態樣中的任一態樣，Fc域為人類IgG1 Fc域。 在一些實施例中，根據本發明之上述態樣中的任一態樣，突變型IL-2多肽的胺基端胺基酸經由SEQ ID NO: 24連接肽與Fc域之第一亞單元的羧基端胺基酸融合。 在特定的具體實施例中，免疫結合物包含含有胺基酸序列與SEQ ID NO: 25序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、含有胺基酸序列與SEQ ID NO: 26序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、含有胺基酸序列與SEQ ID NO: 27序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽，及含有胺基酸序列與SEQ ID NO: 28序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一個特定的具體實施例中，雙特異性抗原結合分子包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 25的多肽、含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 26的多肽、含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 27的多肽及含有胺基酸序列為SEQ ID NO: 28的多肽。聚核苷酸 本發明進一步提供編碼如本文所述之免疫結合物或其片段的分離之聚核苷酸。在一些實施例中，該片段為抗原結合片段。 編碼本發明免疫結合物之聚核苷酸可作為編碼完整免疫結合物的單一聚核苷酸或作為共表現的多種(例如兩種或更多種)聚核苷酸表現。由共表現之聚核苷酸編碼之多肽可以經由例如二硫鍵或其他方式結合，以形成功能免疫結合物。舉例而言，抗體之輕鏈部分可以由來自包含抗體重鏈部分及突變型IL-2多肽之免疫結合物之部分的個別聚核苷酸編碼。共表現時，重鏈多肽與輕鏈多肽結合而形成免疫結合物。在另一實例中，包含兩種Fc域亞單元之一及突變型IL-2多肽之免疫結合物的部分可以由得自包含兩種Fc域亞單元之另一者之免疫結合物之該部分的個別聚核苷酸編碼。共表現時，Fc域亞單元將結合而形成Fc域。 在一些實施例中，分離之聚核苷酸編碼如本文所述之本發明完整免疫結合物。在其他實施例中，分離之聚核苷酸編碼如本文所述的本發明免疫結合物中所包含之多肽。 在一個實施例中，本發明之經分離之聚核苷酸編碼免疫結合物所包含之雙特異性抗原結合分子的重鏈(例如免疫球蛋白重鏈)，及突變型IL-2多肽。在另一個實施例中，本發明之經分離之聚核苷酸編碼免疫結合物所包含之雙特異性抗原結合分子的輕鏈。 在某些實施例中，該聚核苷酸或核酸為DNA。在其他實施例中，本發明之聚核苷酸係RNA，例如呈信使RNA (mRNA)形式。本發明之RNA可為單股或雙股RNA。重組方法 適用於本發明的突變型IL-2多肽可以使用此項技術中熟知之遺傳學或化學方法、藉由缺失、取代、***或修飾來製備。遺傳學方法可包括DNA編碼序列之位點特異性突變誘發、PCR、基因合成及類似方法。恰當的核苷酸變化可藉由例如定序來檢驗。就此而言，原生IL-2之核苷酸序列已由Taniguchi等人描述(Nature 302, 305-10 (1983))且編碼人類IL-2之核酸獲自公共保藏機構，諸如美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection，Rockville MD)。原生人類IL-2之序列展示於SEQ ID NO: 22中。取代或***可能涉及天然以及非天然胺基酸殘基。胺基酸修飾包括熟知的化學修飾方法，諸如添加糖基化位點或碳水化合物連接及其類似方法。 本發明之免疫結合物可以例如藉由固態肽合成(例如梅里菲爾德固相合成(Merrifield solid phase synthesis))或重組產生來獲得。為了重組產生，分離出一或多種編碼免疫結合物(片段)的聚核苷酸(例如如上文所述)且***一或多種載體中以便在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此類聚核苷酸可使用習知程序容易地分離及定序。在一個實施例中，提供包含本發明之一或多種聚核苷酸的載體，較佳為表現載體。熟習此項技術者已熟知的方法可以用於構建含有免疫結合物(片段)之編碼序列以及適當轉錄/轉譯控制信號的表現載體。此等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術及活體內重組/基因重組。參見例如以下文獻中所述的技術：Maniatis等人, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及Ausubel等人, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)。表現載體可為質體、病毒之一部分，或可為核酸片段。表現載體包括表現卡匣，編碼免疫結合物(片段)的聚核苷酸(亦即編碼區)在該表現卡匣中與啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件以可操作結合方式選殖。如本文所用，「編碼區」為由轉譯成胺基酸之密碼子組成的核酸一部分。雖然「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)未轉譯成胺基酸，但其可視為編碼區(若存在)之一部分，但任何側接序列(例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子、5'及3'未轉譯區及類似序列)不為編碼區之一部分。兩個或超過兩個編碼區可以存在於單一聚核苷酸構築體中，例如存在於單一載體上，或存在於個別聚核苷酸構築體中，例如存在於個別(不同)載體上。此外，任何載體可含有單一編碼區，或可包含兩個或超過兩個編碼區，例如本發明之載體可編碼一或多種多肽，其經由蛋白水解***而轉譯後或共轉譯分離成最終蛋白質。另外，本發明之載體、聚核苷酸或核酸可以編碼異源編碼區，該等異源編碼區與編碼本發明之免疫結合物或其變異體或衍生物的聚核苷酸融合或不融合。異源編碼區包括(但不限於)專用元件或基元，諸如分泌性信號肽或異源功能域。當基因產物(例如多肽)之編碼區與一或多個調控序列以基因產物表現置於調控序列之影響或控制下的方式結合時，為可操作的結合。若啟動子功能的誘導引起編碼所要基因產物之mRNA轉錄且若兩個DNA片段之間的連接性質不干擾表現調控序列導引基因產物表現的能力或不干擾DNA模板轉錄的能力，則兩個DNA片段(諸如多肽編碼區及與其結合的啟動子)為「可操作地結合」。因此，若啟動子能夠實現該核酸轉錄，則啟動子區域與編碼多肽之核酸可操作地結合。啟動子可為僅導引預定細胞中之DNA實質性轉錄之細胞特異性啟動子。除啟動子以外的其他轉錄控制元件(例如增強子、操縱子、抑制子及轉錄終止信號)可與導引細胞特異性轉錄之聚核苷酸可操作地結合。適合的啟動子及其他轉錄控制區揭示於本文中。多個轉錄控制區已為熟習此項技術者所知。此等區域包括(但不限於)在脊椎動物細胞中起作用的轉錄控制區，諸如(但不限於)啟動子及增強子區段，其來自巨細胞病毒(例如即刻早期啟動子，連同內含子-A)、猴病毒40 (例如早期啟動子)及逆轉錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))。其他轉錄控制區包括來源於脊椎動物基因(諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔α-血球蛋白)之區域，以及能夠控制真核細胞中之基因表現的其他序列。其他適合轉錄控制區域包括組織特異性啟動子及增強子以及誘導性啟動子(例如啟動子誘導性四環素(tetracyclins))。類似地，多種轉譯控制元件已為一般熟習此項技術者所知。此等元件包括(但不限於)核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子，以及來源於病毒系統的元件(特定言之，內部核糖體進入位點或IRES，亦稱為CITE序列)。表現卡匣亦可包括其他特徵，諸如複製起點，及/或染色體整合元件，諸如逆轉錄病毒長末端重複序列(LTR)，或腺相關聯病毒(AAV)反向末端重複序列(ITR)。 本發明之聚核苷酸及核酸編碼區可與編碼分泌性肽或信號肽的其他編碼區結合，從而導引由本發明之聚核苷酸編碼的多肽之分泌。根據信號假設，哺乳動物細胞所分泌的蛋白質具有自成熟蛋白質裂解(一旦生長蛋白質鏈跨越粗糙內質網輸出已起始)的信號肽或分泌性前導序列。一般熟習此項技術者認識到，脊椎動物細胞分泌的多肽通常具有與多肽之N端融合的信號肽，該信號肽自所轉譯之多肽裂解而產生呈分泌或「成熟」形式的多肽。舉例而言，人類IL-2經由位於多肽N端之20個胺基酸信號序列轉譯，該信號序列隨後裂解而產生成熟的133個胺基酸人類IL-2。在某些實施例中，使用原生信號肽，例如IL-2信號肽或免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽，或該序列之功能衍生物，其保持導引與其可操作地結合之多肽分泌的能力。或者，可使用異源哺乳動物信號肽或其功能衍生物。舉例而言，野生型前導序列可經人類組織纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸酶之前導序列取代。 編碼免疫結合物(片段)之聚核苷酸內部或末端處可以包括編碼短蛋白質序列的DNA，該短蛋白質序列可以用於促進隨後純化(例如組胺酸標籤)或有助於標記免疫結合物。 在另一實施例中，提供包含本發明之一或多種聚核苷酸的宿主細胞。在某些實施例中，提供包含一或多種本發明載體之宿主細胞。聚核苷酸及載體可合併本文分別關於聚核苷酸及載體所述之任一特徵(單個或組合)。在一個此類實施例中，宿主細胞包含一或多種載體(例如已經該等載體轉型或轉染)，該等載體包含一或多種編碼本發明之免疫結合物的聚核苷酸。如本文所用，術語「宿主細胞」係指任何種類的細胞系統，其可經工程改造以產生本發明之免疫結合物或其片段。適合於複製及支持免疫結合物表現的宿主細胞在此項技術中已熟知。此類細胞在適當時可經特定表現載體轉染或轉導，且可以培養含有大量載體之細胞以用於接種大型醱酵槽，從而獲得足量的免疫結合物用於臨床應用。適合的宿主細胞包括原核微生物，諸如大腸桿菌，或各種真核細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞或其類似物。舉例而言，可在細菌中產生多肽，尤其在不需要糖基化時。在表現之後，可自可溶性部分之細菌細胞糊狀物分離出多肽且可將該多肽進一步純化。除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適用於編碼多肽之載體的選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已「人類化」的真菌及酵母菌株，從而產生具有部分或完全人類糖基化模式之多肽。參見Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)，及Li等人, Nat Biotech 24, 210-215 (2006)。適用於表現(糖基化)多肽的宿主細胞亦來源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda )細胞之眾多桿狀病毒株。植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述利用轉殖基因植物產生抗體的PLANTIBODIESTM 技術)。脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40轉型的猴腎CV1細胞株(COS-7)；人類胚腎細胞株(293或293T細胞，如例如Graham等人, J Gen Virol 36, 59 (1977)中所述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cells)(TM4細胞，如例如Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)中所述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞(MMT 060562)；TRI細胞(如例如Mather等人, Annals N. Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)中所述)；MRC 5細胞及FS4細胞。其他適用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括dhfr- CHO細胞(Urlaub等人, Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如YO、NS0、P3X63及Sp2/0。欲回顧適於產生蛋白質的某些哺乳動物宿主細胞株，參見例如Yazaki及Wu, Methods in Molecular Biology, 第248卷(B. K. C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ), 第255-268頁(2003)。宿主細胞包括經培養細胞，例如經培養之哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞及植物細胞(僅舉數例)，而且包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或經培養之植物或動物組織中所包含的細胞。在一個實施例中，宿主細胞係真核細胞，較佳係哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人類胚腎(HEK)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。 此項技術中已知在此等系統中表現外源基因的標準技術。表現與抗體重鏈或輕鏈融合之突變型IL-2多肽的細胞可以經工程改造，以便亦表現其他抗體鏈，從而使得經表現的突變型IL-2融合產物為具有重鏈與輕鏈的抗體。 在一個實施例中，提供製備本發明之免疫結合物的方法，其中該方法包含在適於表現免疫結合物的條件下培養如本文所提供之包含一或多種編碼免疫結合物之聚核苷酸的宿主細胞，及視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收免疫結合物。 在本發明之免疫結合物中，突變型IL-2多肽可以遺傳學方式與雙特異性抗原結合分子融合，或可以化學方式與雙特異性抗原結合分子結合。IL-2多肽與雙特異性抗原結合分子的基因融合物可以設計成使得IL-2序列與多肽直接融合或經由連接子序列間接融合。連接子之組成及長度可根據此項技術中熟知之方法確定且可測試其功效。本文中描述了特定連接肽。為了併入裂解位點以分離融合物之個別組分，必要時亦可包括其它序列，例如內肽酶識別序列。另外，亦可使用此項技術中熟知的多肽合成方法(例如梅里菲爾德固相合成(Merrifield solid phase synthesis))，以化學方式合成IL-2融合蛋白。可使用熟知的化學結合方法，以化學方式使突變型IL-2多肽與其他分子(例如抗體)結合。出於此目的，可以使用雙官能交聯試劑，諸如此項技術中熟知的同官能及雜官能交聯試劑。使用的交聯試劑類型視與IL-2偶聯的分子性質而定且可容易由熟習此項技術者鑑別。替代地或另外，希望結合的突變型IL-2及/或分子可以化學方式衍生化，使得兩者可以此項技術中亦熟知的個別反應結合。 本發明之免疫結合物包含雙特異性抗原結合分子，該雙特異性抗原結合分子可以包含抗體(一部分)。產生抗體的方法在此項技術中已熟知(參見例如Harlow及Lane, 「Antibodies, a laboratory manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。非天然存在之抗體可使用固相肽合成法構建，可以重組方式產生(例如如美國專利第4,186,567號中所述)或可藉由例如篩選包含可變重鏈及可變輕鏈的組合文庫來獲得(參見例如McCafferty之美國專利第5,969,108號)。免疫結合物、抗體及其製備方法亦詳細地描述於例如PCT公開案第WO 2011/020783號、第WO 2012/107417號及第WO 2012/146628中，該等案各自以全文引用之方式併入本文中。 本發明之免疫結合物中可使用任何動物物種之抗體、抗體片段、抗原結合域或可變區。適用於本發明的非限制性抗體、抗體片段、抗原結合域或可變區可具有鼠類、靈長類動物或人類來源。若該免疫結合物旨在用於人類用途，則可以使用抗體之嵌合形式，其中抗體恆定區來自人類。人類化或完全人類形式之抗體亦可根據此項技術中熟知之方法製備(參見例如Winter之美國專利第5,565,332號)。人類化可藉由各種方法達成，包括(但不限於)(a)將非人類(例如供者抗體) CDR移植至人類(例如受者抗體)構架及恆定區上，保留或不保留關鍵構架殘基(例如對於保持良好抗原結合親和力或抗體功能而言具有重要作用的彼等殘基)；(b)僅將非人類特異性決定區(SDR或a-CDR；對於抗體-抗原相互作用而言具有關鍵作用的殘基)移植至人類構架及恆定區上，或(c)移植整個非人類可變域，但藉由表面殘基置換而用人類類似區段「遮掩」其。人類化抗體及製造其之方法評述於例如Almagro及Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)中，且進一步描述於例如Riechmann等人,Nature 332:323-329 (1988)；Queen等人,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人,Methods 36:25-34 (2005)(描述特異性決定區(SDR)移植)；Padlan,Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (描述「表面再塑」)；Dall'Acqua等人,Methods 36:43-60 (2005)(描述「FR改組」)；及Osbourn等人,Methods 36:61-68 (2005)及Klimka等人,Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)(描述FR改組之「導引選擇」方法)。可用於人類化之人類構架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合(best-fit)」法選擇之構架區(參見例如Sims等人,J. Immunol. 151:2296 (1993))；來源於具有輕鏈或重鏈可變區之特定亞群之人類抗體的共同序列之構架區(參見例如Carter等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；及Presta等人,J. Immunol. , 151:2623 (1993))；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro及Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))；及來源於篩選FR文庫之構架區(參見例如Baca等人,J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及Rosok等人,J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996))。 可使用此項技術中已知之各種技術產生人類抗體。人類抗體大體上描述於van Dijk及van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001)及Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)中。人類抗體可藉由將免疫原投與已改造可回應於抗原攻毒而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體的轉殖基因動物來製備。此類動物通常含有人類免疫球蛋白基因座的全部或一部分，其置換內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在此類轉殖基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座一般已失活。欲回顧自轉殖基因動物獲得人類抗體之方法，參見Lonberg,Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)。亦參見例如描述XENOMOUSETM 技術的美國專利第6,075,181號及第6,150,584號；描述HUMAB®技術的美國專利第5,770,429號；描述K-M MOUSE®技術的美國專利第7,041,870號；及描述VELOCIMOUSE®技術的美國專利申請公開案第US 2007/0061900號。由此類動物產生之完整抗體之人類可變區可進一步加以修飾，例如藉由與不同人類恆定區組合。 人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製備。已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類融合骨髓瘤細胞株。(參見例如KozborJ. Immunol. , 133: 3001 (1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications , 第51-63頁 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及Boerner等人,J. Immunol ., 147: 86 (1991))。經由人類B細胞融合瘤技術產生的人類抗體亦描述於Li等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 103:3557-3562 (2006)中。其他方法包括例如美國專利第7,189,826號(描述自融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue 26(4):265-268 (2006)(描述人類-人類融合瘤)中所述之彼等方法。人類融合瘤技術(三源雜交瘤技術(Trioma technology))亦描述於Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology , 20(3):927-937 (2005)以及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology , 27(3):185-91 (2005)中。 人類抗體亦可藉由自人類抗體文庫分離而產生，如本文所述。 適用於本發明之抗體可藉由自組合文庫中篩選出具有所需活性之抗體來分離。用於篩選組合文庫之方法評述於例如Lerner等人之Nature Reviews 16:498-508 (2016)中。舉例而言，此項技術中已知多種方法用於產生噬菌體呈現文庫及自此類文庫中篩選出具有所需結合特徵的抗體。此類方法評述於例如Frenzel等人之mAbs 8:1177-1194 (2016)；Bazan等人之Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828 (2012)及Zhao等人之Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289 (2016)以及Hoogenboom等人之Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien等人編, Human Press, Totowa, NJ, 2001)及Marks及Bradbury之Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo編, Human Press, Totowa, NJ, 2003)。 在某些噬菌體呈現方法中，VH及VL基因之譜系分別藉由聚合酶鏈反應(PCR)選殖且在噬菌體文庫中隨機重組，接著可如Winter等人之Annual Review of Immunology 12: 433-455 (1994)中所述，針對抗原結合噬菌體篩選。噬菌體典型地以單鏈Fv (scFv)片段或Fab片段形式呈現抗體片段。來自免疫來源之文庫向免疫原提供高親和力抗體而無需構築融合瘤。或者，可選殖原始譜系(例如來自人類)以提供針對廣泛範圍之非自體抗原以及自體抗原之單一抗體來源而無需任何免疫接種，如Griffiths等人在EMBO Journal 12: 725-734 (1993)中所述。最後，原始文庫亦可以合成方式如下製備：自幹細胞選殖未重排V基因區段，且使用含有隨機序列之PCR引子編碼高度可變CDR3區及完成活體外重排，如Hoogenboom及Winter在Journal of Molecular Biology 227: 381-388 (1992)中所述。描述人類抗體噬菌體文庫的專利公開案包括例如美國專利第5,750,373號、第7,985,840號、第7,785,903號及第8,679,490號以及美國專利公開案第2005/0079574號、第2007/0117126號、第2007/0237764號及第2007/0292936號。此項技術中已知之用於自組合文庫中篩選出具有所需活性之抗體的方法之其他實例包括核糖體及mRNA呈現，以及用於在細菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或酵母細胞上呈現及選擇抗體的方法。酵母表面呈現方法評述於例如Scholler等人之Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012)及Cherf等人之Methods in Molecular biology 1319:155-175 (2015)以及Zhao等人之Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012)中。核糖體呈現方法描述於例如He等人之Nucleic Acids Research 25:5132-5134 (1997)及Hanes等人之PNAS 94:4937-4942 (1997)。 可能需要對本發明之免疫結合物作進一步化學修飾。舉例而言，藉由與基本上直鏈聚合物(諸如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG))結合可以改良免疫原性及短半衰期之問題(參見例如WO 87/00056)。 如本文所述製備的免疫結合物可藉由此項技術中已知的技術(諸如高效液相層析、離子交換層析、凝膠電泳、親和力層析、尺寸排阻層析及其類似技術)純化。用於純化特定蛋白質的實際條件部分地視諸如淨電荷、疏水性、親水性等因素而定，且對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。對於親和層析純化而言，可使用免疫結合物所結合之抗體、配位體、受體或抗原。舉例而言，可以使用特異性結合突變型IL-2多肽的抗體。對於親和層析而言，可以使用具有蛋白質A或蛋白質G之基質純化本發明之免疫結合物。舉例而言，可以基本上如實例中所述，使用依序進行的蛋白質A或G親和層析及尺寸排阻層析來分離免疫結合物。免疫結合物之純度可以藉由多種熟知分析方法中之任一種來測定，包括凝膠電泳、高壓液相層析及其類似方法。組合物、調配物及投藥途徑 在另一個方面中，本發明提供包含如本文中所述之免疫結合物的醫藥組合物，例如供任一種下述治療方法使用。在一個實施例中，醫藥組合物包含本文所提供的任一種免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。在另一個實施例中，醫藥組合物包含本文所提供的任一種免疫結合物及至少一種其他治療劑，例如如下文所述。 另外提供一種製備本發明免疫結合物之適於活體內投與之形式的方法，該方法包含(a)獲得本發明之免疫結合物及(b)用至少一種醫藥學上可接受之載劑調配該免疫結合物，其中免疫結合物製劑係針對活體內投與而調配。 本發明之醫藥組合物包含溶解或分散於醫藥學上可接受之載劑中之治療有效量的免疫結合物。片語「醫藥學上或藥理學上可接受」係指在所用劑量及濃度下對於接受者而言一般無毒性的分子實體及組合物，亦即當投與動物(適當時諸如人類)時，不產生有害、過敏或其他不良反應。熟習此項技術者依據本發明將得知含有免疫結合物及視情況存在之額外活性成分的醫藥組合物之製備，如Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Printing Company, 1990所例示，該文獻以引用之方式併入本文中。此外，關於動物(例如人類)投藥，應瞭解，製劑應滿足FDA生物學標準局(FDA Office of Biological Standards)或其他國家之相應機關所要求的無菌性、發熱性、總體安全及純度標準。較佳組合物為凍乾調配物或水溶液。如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、緩衝劑、分散介質、包衣、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌劑、抗真菌劑)、等張劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、抗氧化劑、蛋白質、藥物、藥物穩定劑、聚合物、凝膠、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、染料及類似材料及其組合，如一般技術者所知(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Printing Company, 1990, 第1289-1329頁，該文獻以引用的方式併入本文中)。除非任何習知載劑與活性成分不相容，否則涵蓋其在治療或醫藥組合物中之用途。本發明之抗體或免疫結合物(及任何其他治療劑)可藉由任何適合之方式投與，包括非經腸、肺內及鼻內且必要時針對局部治療，病灶內投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。可藉由任何適合途徑(例如注射，諸如靜脈內或皮下注射)給藥，此部分地視短期或長期投藥而定。 非經腸組合物包括為針對注射(例如皮下、皮內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內或腹膜內注射)投藥所設計的彼等物。為了注射，本發明之免疫結合物可以在水溶液中，較佳在生理學上相容之緩衝液(諸如漢克氏溶液(Hank's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理食鹽水緩衝液)中調配。溶液可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。或者，免疫結合物可呈粉末形式，其在使用之前用適合媒劑(例如無菌無熱原質水)復原。必要時，藉由將所需量之本發明免疫結合物與下文列舉之多種其他成分一起併入適當溶劑中來製備無菌可注射溶液。無菌性可容易藉由例如無菌過濾膜過濾來實現。一般而言，分散液係藉由將各種經滅菌之活性成分併入含有基本分散介質及/或其他成分的無菌媒劑中來製備。在無菌粉末用於製備無菌可注射溶液之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥技術，其利用預先無菌過濾之液體介質產生活性成分與任何其他所需成分之粉末。必要時，液體介質宜經緩衝，且注射之前，首先用足量生理食鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑呈等張性。該組合物在製造及儲存條件下須穩定，且須防腐以避免諸如細菌及真菌之微生物的污染作用。應瞭解，內毒素污染應最低限度地保持在安全水準，例如低於0.5 ng/mg蛋白質。醫藥學上可接受的適合載劑包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(低於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；和/或非離子型界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之化合物，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、聚葡萄糖或其類似物。視情況，懸浮液亦可含有適合穩定劑或增加化合物溶解性之試劑以允許製備高度濃縮之溶液。另外，活性化合物之懸浮液可視需要製備成油性注射懸浮液。適合親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或三酸甘油酯；或脂質體。 活性成分可截留於微膠囊中，例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合法所製備之微膠囊，例如分別為羥基甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊；截留於膠態藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或***液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences (第18版, Mack Printing Company, 1990)中。可以製備持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之適合實例包括含有多肽之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形物品形式，例如薄膜或微膠囊。在特定實施例中，可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中使用延遲吸收劑(諸如單硬脂酸鋁、明膠或其組合)來達成。 除先前描述之組合物以外，免疫結合物亦可調配成儲槽式製劑。此類長效調配物可藉由植入(例如皮下或肌肉內植入)或藉由肌肉內注射來投與。因此，舉例而言，免疫結合物可以用適合聚合物或疏水性材料調配(例如在可接受之油中調配成乳液)或用離子交換樹脂調配，或調配成微溶衍生物，例如微溶鹽。 包含本發明之免疫結合物的醫藥組合物可藉助於習知混合、溶解、乳化、囊封、包覆或凍乾製程製造。醫藥組合物可使用生理學上可接受之有利於將蛋白質處理成可在醫藥學上使用之製劑的一或多種載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑、以習知方式調配。適當調配物視所選投與途徑而定。 免疫結合物可以調配成呈游離酸或鹼、中性或鹽形式的組合物。醫藥學上可接受之鹽為實質上保留游離酸或鹼之生物活性的鹽。此等鹽包括酸加成鹽，例如與蛋白質組合物之自由胺基形成的鹽，或與無機酸(諸如鹽酸或磷酸)或有機酸(諸如乙酸、草酸、酒石酸或杏仁酸)形成的鹽。與自由羧基形成的鹽亦可衍生自無機鹼，諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因(procaine)。相較於相應的游離鹼形式，醫藥鹽傾向於更可溶於水性及其他質子溶劑中。治療方法及組合物 本文所提供的任一種免疫結合物可以用於治療方法中。本發明之免疫結合物可以用作免疫治療劑，例如治療癌症的免疫治療劑。 為了用於治療方法中，本發明之免疫結合物將以符合良好醫學實務的方式調配、給藥及投與。在此情形下考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症起因、藥劑遞送位點、投藥方法、投藥時程及從醫者已知之其他因素。 本發明之免疫結合物可以特別適用於治療其中刺激宿主免疫系統有益的疾病狀態，特定而言，其中需要增強的細胞免疫反應。此等疾病狀態可以包括其中宿主免疫反應不足或缺乏的疾病狀態。可投與本發明免疫結合物所針對的疾病狀態包含例如其中細胞免疫反應為特定免疫之關鍵機制的腫瘤或感染。本發明之免疫結合物可以本身或以任何適合的醫藥組合物投與。 在一個態樣中，提供用作藥劑的本發明免疫結合物。在其他態樣中，提供用於治療疾病之本發明免疫結合物。在某些實施例中，提供治療方法用的本發明免疫結合物。在一個實施例中，本發明提供用於治療有需要之個體之疾病之如本文所述的免疫結合物。在某些實施例中，本發明提供治療患有疾病之個體之方法中使用的免疫結合物，包含向該個體投與治療有效量之免疫結合物。在某些實施例中，所治療之疾病為增生性病症。在一個特定實施例中，該疾病為癌症。在某些實施例中，若待治療的疾病為癌症，則該方法進一步包含向該個體投與治療有效量之至少一種其他治療劑，例如抗癌劑。在其他實施例中，本發明提供用於刺激免疫系統的免疫結合物。在某些實施例中，本發明提供刺激個體之免疫系統之方法中使用的免疫結合物，該方法包含向個體投與有效量之刺激免疫系統的免疫結合物。根據任一上述實施例之「個體」為哺乳動物，較佳為人類。根據任一上述實施例的「免疫系統之刺激」可以包括以下中之任一者或多者：免疫功能的整體提高、T細胞功能的提高、B細胞功能的提高、淋巴球功能的恢復、IL-2受體表現的增強、T細胞反應的增強、自然殺手細胞活性或淋巴介質活化殺手(LAK)細胞活性的增強，及其類似者。 在另一態樣中，本發明提供本發明之免疫結合物用於製造或製備藥劑之用途。在一個實施例中，該藥劑係用於治療有需要之個體的疾病。在一個實施例中，藥物係用於治療疾病之方法，該方法包含向患有疾病之個體投與治療有效量之藥劑。在某些實施例中，所治療之疾病為增生性病症。在一個特定實施例中，該疾病為癌症。在一個實施例中，若待治療的疾病為癌症，則該方法進一步包含向該個體投與治療有效量之至少一種其他治療劑，例如抗癌劑。在另一個實施例中，該藥劑係用於刺激免疫系統。在另一個實施例中，該藥劑係用於刺激個體之免疫系統的方法中，該方法包含向個體投與有效量之刺激免疫系統的藥劑。根據任一上述實施例之「個體」可為哺乳動物，較佳為人類。根據任一上述實施例的「免疫系統之刺激」可以包括以下中之任一者或多者：免疫功能的整體提高、T細胞功能的提高、B細胞功能的提高、淋巴球功能的恢復、IL-2受體表現的增強、T細胞反應的增強、自然殺手細胞活性或淋巴介質活化殺手(LAK)細胞活性的增強，及其類似者。 在另一態樣中，本發明提供一種治療個體疾病之方法。在一個實施例中，該方法包含向患有此類疾病之個體投與治療有效量之本發明免疫結合物。在一個實施例中，向該個體投與包含本發明免疫結合物之組合物，該組合物呈醫藥學上可接受之形式。在某些實施例中，所治療之疾病為增生性病症。在一個特定實施例中，該疾病為癌症。在某些實施例中，若待治療的疾病為癌症，則該方法進一步包含向該個體投與治療有效量之至少一種其他治療劑，例如抗癌劑。在另一個態樣中，本發明提供一種刺激個體免疫系統的方法，包含向個體投與有效量之刺激免疫系統的免疫結合物。根據任一上述實施例之「個體」可為哺乳動物，較佳為人類。根據任一上述實施例的「免疫系統之刺激」可以包括以下中之任一者或多者：免疫功能的整體提高、T細胞功能的提高、B細胞功能的提高、淋巴球功能的恢復、IL-2受體表現的增強、T細胞反應的增強、自然殺手細胞活性或淋巴介質活化殺手(LAK)細胞活性的增強，及其類似者。 在某些實施例中，所治療之疾病為增生性病症，特定言之，癌症。癌症之非限制性實例包括膀胱癌、腦癌、頭頸癌、胰臟癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、***癌、血液癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌、骨癌及腎臟癌。可使用本發明之免疫結合物治療的其他細胞增殖病症包括(但不限於)位於以下中之贅瘤：腹部、骨骼、***、消化系統、肝臟、胰臟、腹膜、內分泌腺體(腎上腺、副甲狀腺、垂體、睾丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼、頭頸部、神經系統(中樞及周邊)、淋巴系統、骨盆、皮膚、軟組織、脾臟、胸部區域及泌尿生殖系統。亦包括癌前病狀或病變及癌症轉移。在某些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：腎癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、腦癌、頭頸癌、***癌及膀胱癌。熟習此項技術者容易認識到，在許多情況下，免疫結合物可能不會提供治癒，而僅僅可能提供部分益處。在一些實施例中，具有一些益處之生理學變化亦視為治療上有益的。因此，在一些實施例中，提供生理學變化之免疫結合物的量視為「有效量」或「治療有效量」。需要治療之個體(subject)、患者或個體(individual)通常為哺乳動物，更特定言之，人類。 在一些實施例中，將有效量的本發明免疫結合物投與細胞。在其他實施例中，將治療有效量之本發明免疫結合物投與個體用於治療疾病。 為了預防或治療疾病，本發明之免疫結合物(當單獨或與一或多種其他其他治療劑組合使用時)的適當劑量視以下而定：待治療的疾病類型、投藥途徑、患者體重、分子類型(例如包含或不包含Fc域)、疾病嚴重度及過程、免疫結合物是否為了預防或治療目的而投與、預先或並行治療干預、患者臨床史及對免疫結合物的反應，及主治醫師之判斷。負責投藥的從業者將在任何情況下確定組合物中活性成分之濃度及個別個體的適當劑量。本文中涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投藥或在不同時間點的多次投藥、快速投藥及脈衝式輸注。 免疫結合物宜一次性或經一系列治療而投與患者。視疾病類型及嚴重度而定，約1 µg/kg至15 mg/kg (例如0.1 mg/kg-10 mg/kg)的免疫結合物可為投與患者的初始候選劑量，不論藉由例如一或多次獨立投與或藉由連續輸注。視上述因素而定，一種典型的日劑量可能在約1 μg/kg至100 mg/kg或超過100 mg/kg之範圍內。對於歷經數日或更長時間之重複投藥，視病狀而定，治療通常持續至疾病症狀之所需抑制發生為止。免疫結合物之一種例示性劑量將在約0.005 mg/kg至約10 mg/kg之範圍內。在其他非限制性實例中，劑量亦可包含每次投藥每公斤體重約1微克、每公斤體重約5微克、每公斤體重約10微克、每公斤體重約50微克、每公斤體重約100微克、每公斤體重約200微克、每公斤體重約350微克、每公斤體重約500微克、每公斤體重約1毫克、每公斤體重約5毫克、每公斤體重約10毫克、每公斤體重約50毫克、每公斤體重約100毫克、每公斤體重約200毫克、每公斤體重約350毫克、每公斤體重約500毫克至每公斤體重約1000毫克或超過約1000毫克，及其中可導出之任何範圍。在本文所列數值之可推導範圍之非限制性實例中，基於上述數值，可投與的範圍為每公斤體重約5毫克至約每公斤體重約100毫克、每公斤體重約5微克至約每公斤體重約500毫克等。因此，可向患者投與約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、5.0 mg/kg或10 mg/kg (或其任何組合)之一或多種劑量。此類劑量可以間歇性地投與，例如每週或每三週(例如使得患者接受約兩次至約二十次或例如約六次劑量的免疫結合物)。可投與初始較高起始劑量，接著可投與一或多種較低劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進程易於藉由習知技術及分析來監測。 本發明之免疫結合物通常將以有效達成預定目的的量使用。為了用於治療或預防疾病病狀，本發明之免疫結合物或其醫藥組合物係以治療有效量投與或施用。治療有效量之確定完全在熟習此項技術者之能力範圍內，尤其根據本文所提供之詳細揭示內容。 關於全身性投藥，首先可利用活體外分析(諸如細胞培養分析)估算治療有效劑量。接著可利用動物模型調配劑量以獲得循環濃度範圍，包括如在細胞培養物中測定的IC50 。此類資訊可用於更準確地確定適用於人類之劑量。 亦可使用此項技術中熟知的技術由活體內資料(例如動物模型)評估初始劑量。一般熟習此項技術者可基於動物資料容易地最佳化人類投藥。 劑量及時間間隔可個別地調整以提供足以維持治療效果之免疫結合物血漿含量。常見的患者注射投藥劑量在約0.1至50毫克/公斤/天，通常約0.5至1毫克/公斤/天範圍內。治療有效血漿含量可藉由每日投與多次劑量來達成。血漿含量可藉由例如HPLC量測。 在局部投藥或選擇性吸收之情況下，免疫結合物之局部有效濃度可能與血漿濃度無關。熟習此項技術者能夠最佳化治療有效局部劑量而無需不當實驗。 本文所述之免疫結合物的治療有效劑量一般將提供治療效益而不引起實質毒性。可藉由標準醫藥學程序測定免疫結合物在細胞培養物或實驗動物中之毒性及治療功效。可使用細胞培養分析及動物研究來確定LD50 (50%群體致死劑量)及ED50 (50%群體治療有效劑量)。毒性效應與治療效應之間的劑量比為治療指數，其可以比率LD50 /ED50 表示。展現大治療指數之免疫結合物較佳。在一個實施例中，根據本發明之免疫結合物展現高治療指數。自細胞培養分析法及動物研究獲得之資料可用於調配適用於人類的劑量範圍。該劑量較佳在循環濃度範圍內，包括毒性極小或無毒性的ED50 。視多種因素而定，例如所用劑型、所用投藥途徑、個體之病狀及其類似因素，劑量可在此範圍內變化。確切配方、投藥途徑及劑量可由個別醫師考慮患者病狀而選擇。(參見例如Fingl等人, 1975, 於: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第1章, 第1頁，該文獻以全文引用之方式併入本文中)。 經本發明免疫結合物治療之患者的主治醫師知道如何及何時終止、中斷或調整因毒性、器官功能障礙及其類似者所致的投藥。反之，主治醫師亦已知在臨床反應不足(排除毒性)時將治療調節至較高水準。管理所關注病症時所投與劑量之量值將因所治療之病狀之嚴重度及投藥途徑及類似因素而變。病狀之嚴重度可例如部分地藉由標準預後評估方法來評估。此外，劑量及可能的給藥頻率亦將根據個別患者之年齡、體重及反應而變。 相對於包含野生型IL-2之免疫結合物所用的最大治療劑量，可以增加包含如本文所述之突變型IL-2多肽之免疫結合物的最大治療劑量。其他藥劑及療法 本發明之免疫結合物可以與一或多種其他治療藥劑組合投與。舉例而言，本發明之免疫結合物可與至少一種其他治療劑共投與。術語「治療劑」涵蓋為治療需要此類治療之個體之症狀或疾病而投與的任何藥劑。此類其他治療劑可包含適於治療特定適應症的任何活性成分，較佳為具有互補活性、彼此間無不利影響的彼等活性成分。在某些實施例中，其他治療劑為免疫調節劑、細胞抑制劑、細胞黏附抑制劑、細胞毒性劑、細胞凋亡活化劑，或增強細胞對細胞凋亡誘導劑之敏感性的藥劑。在一個特定實施例中，其他治療劑為抗癌劑，例如微管中斷劑、抗代謝物、拓樸異構酶抑制劑(topoisomerase inhibitor)、DNA嵌入劑、烷化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞凋亡活化劑或抗血管生成劑。 此類其他藥劑宜以有效達成預定目的之量組合存在。此類其他藥劑之有效量視所用免疫結合物之量、病症或治療之類型及如上文所述之其他因素而定。免疫結合物通常以如本文中所述的相同劑量及投藥途徑使用，或以本文中所述劑量之1至99%，或以任何劑量及憑經驗/臨床上確定為適當的任何途徑使用。 上文提及之此類組合療法涵蓋組合投藥(其中相同或單獨的組合物中包括兩種或超過兩種治療劑)，且單獨的投藥(在此情況下，為本發明免疫結合物之投藥)可以發生於另一種治療劑及/或佐劑投與之前、同時及/或之後。本發明之免疫結合物亦可與輻射療法組合使用。製品 在本發明之另一態樣中，提供含有適用於治療、預防及/或診斷上述病症之製品。製品包含容器及容器上或容器隨附之標記或藥品說明書。適合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由各種材料形成，諸如玻璃或塑膠。容器容納組合物本身或該組合物與有效治療、預防及/或診斷病狀之另一組合物之組合，且可具有無菌接取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之免疫結合物。標記或藥品說明書指示組合物用於治療所選病狀。此外，該製品可包含(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之免疫結合物；及(b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此實施例中之製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病狀之藥品說明書。替代地或另外，製品可進一步包含第二(或第三）容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。胺基酸序列
Figure 107111635-A0304-0001
Figure 107111635-A0304-0001-1
Figure 107111635-A0304-0001-2
Figure 107111635-A0304-0001-3
Figure 107111635-A0304-0001-4
Figure 107111635-A0304-0001-5
Figure 107111635-A0304-0001-6
 實例 以下為本發明之方法及組合物之實例。應理解，考慮到上文所提供之一般說明，可實施各種其他實施例。實例 1 人類 PD1-Tim3-IL-2v 之選殖及表現 PD1-Tim3-ILv構築體之表現載體(SEQ ID NO 25、26、27及28)如PCT專利申請案第PCT/EP2016/073192號中所述製備。 在振盪燒瓶中，藉由使適當質體以1:1:1:1之質體比率共轉染HEK293F細胞(Invitrogen)來產生人類抗PD1-Tim3-IL-2v構築體。1週之後，收集上清液且經由無菌過濾器過濾且藉由標準方法純化(參見例如PCT專利申請案第PCT/EP2016/073192號)。簡言之，自上清液純化係藉由蛋白質A親和層析與尺寸排阻層析之組合來進行。所得產物藉由質譜表徵其身分且藉由毛細管電泳(CE-SDS)表徵其分析特性，諸如純度、單體含量及穩定性。免疫結合物可以良好產量產生且穩定。實例 2 實例 2A. PD1-TIM3-IL2v 結合至活化 CD8 及 CD4 T 細胞 自健康供體新鮮分離的PBMC用CD3及CD28刺激隔夜以誘導T細胞上之PD1上調。在37℃經1 μg/ml CD3 (純系OKT3，317304，BioLegend)塗佈1小時的細胞培養瓶中，將PBMC接種於培養基(RPMI1640，10% FCS，2 mM麩醯胺酸)中。將CD28溶液以2 μg/ml (純系CD28.2，302914，BioLegend)之濃度添加至PBMC中。次日，收集PBMC且轉移至圓底96孔盤(每孔200'000個細胞)中。細胞用FACS緩衝液(PBS，2% FBS，5 mM EDTA，0.025% NaN3 )洗滌且在4℃用40 μl含有指定分子(PD1-TIM3-IL2v，PD1 IgG，CEA-IL2v)的FACS緩衝液染色30分鐘。細胞用FACS緩衝液洗滌兩次以移除未結合的分子。接著將40 μl經稀釋的PE抗人類Fc特異性二級抗體(109-116-170，Jackson ImmunoResearch)添加至細胞中。在4℃培育30分鐘後，用FACS緩衝液洗滌細胞兩次。為了偵測T細胞，PBMC在4℃用CD3 FITC (純系UCHT1，300406，BioLegend)、CD4 APC (純系RPA-T4，300514，BioLegend)與CD8 BV421 (純系RPA-T8，301036，BioLegend)之40 μl混合物染色30分鐘。未結合之抗體藉由用FACS緩衝液洗滌兩次來移除。最後，細胞用含有1% PFA之FACS緩衝液固定且使用BD Fortessa、藉由CD3+CD4+細胞(CD4 T細胞)及CD3+CD8+細胞(CD8 T細胞)閘選來量測。圖 2 表明PD1-TIM3-IL2v及對應PD1 IgG類似地結合至CD4及CD8 T細胞。靶向CEA的類似融合蛋白CEA-IL2v係作為非靶向對照物添加，以比較單獨IL2v對T細胞的結合相對於PD1-TIM3-IL2v對T細胞的結合。實例 2B. NK92 在 PD1-TIM3-IL2v 存在下的 增殖 收集NK92細胞，計數且評估存活率。細胞用PBS洗滌三次以移除殘餘IL-2且再懸浮於不含IL-2的培養基(RPMI1640，10% FCS，1%麩醯胺酸)中。經洗滌的NK92細胞在細胞培育箱中培育兩小時(IL-2饑餓)。饑餓之後，將細胞再懸浮於不含IL-2的新鮮培養基中直至每毫升200'000個細胞且將50 µl細胞懸浮液轉移至經細胞培養物處理的平底96孔盤中且補充50 µl經稀釋的分子PD1-Tim3-IL2v (於不含IL-2的培養基中)、普留淨(Proleukin)(1.5 µg/ml最終濃度)或培養基(對照孔)以達到每孔100 µl之最終體積。培養盤在培育箱中培育2天。 2天後，使CellTiter-Glo (Promega)試劑及細胞培養盤平衡至室溫。CellTiter-Glo溶液如製造商說明書中所述製備且向各孔中添加100 µl溶液。培育10分鐘之後，藉由移液使剩餘的聚集體再懸浮且轉移150 µl混合物至白色平底的盤中。利用Tecan Spark 10M多模式讀取器量測發光。圖 3 表明PD1-TIM3-IL2v能夠誘導NK92細胞以濃度依賴性方式增殖。實例 3 IL-2v 遞送至耗竭之病毒特異性 T 細胞的 效應 ， 其經由 PD-1 或 PD-1 及 TIM-3 阻斷來達成 最近，已在彼等PD-1陽性病毒特異性T細胞之表面上鑑別出TIM-3 (另一免疫檢查點)，該等T細胞的功能異常程度大於PD-1單一陽性T細胞。吾等因此評估PD-1及TIM-3共靶向將IL-2v遞送至功能高度異常之病毒特異性T細胞的作用。圖 4 中所示之結果突顯了相對於單獨PD-1靶向，PD-1與TIM-3靶向使IL-2v遞送至病毒特異性T細胞之組合作用。有趣的是，相較於單獨的PD-1阻斷，PD1-TIM3-IL-2v構築體使能夠共分泌IL-2及IFN-γ (圖 4B，p≤0.001)以及單獨IFN-γ (圖 4C ，p≤0.01)之保護性CMV特異性CD4 T細胞之頻率高度顯著地增加。相較於單獨的PD-1阻斷，PD1-IL2v (僅靶向PD-1的類似分子；參見SEQ ID NO 29、30及31)在顯著擴增保護性多功能CD4 T細胞以及IFN-γ單一分泌型CMV特異性CD4 T細胞方面展示出類似於PD1-TIM3-IL2v的傾向(圖 4B ，p≤0.05及圖 4C ，p≤0.01)。PD-1-IL-2v與PD-1-TIM-3-IL-2v均未使IL-2單一分泌型CD4 T細胞之頻率顯著增加。 PD1-TIM3-IL2v擴增/增強保護性病毒特異性多功能T細胞之效應功能的能力為此分子在慢性感染中以及在癌症中靶向耗竭/功能異常之抗原特異性T細胞之潛在應用的相關特徵。 自從多功能CD4 T細胞已描述為具有內在增殖能力且因此在壽命期間能夠自我維持，吾等表徵其在不同構築體存在下在pp65再刺激後的分化狀態。有趣的是，吾等觀察到在PD1-TIM3-IL2v及PD1-IL2v處理後，多功能CD4 T細胞內之效應子記憶體(CD45RO+ CD62L- )及中心記憶池(CD45RO+ CD62L+ )存在增加的傾向(圖 5A 及B) 。 已描述單一IFN-γ分泌型CD4 T細胞來源於多功能對應體、更易分化且因此其增殖能力已喪失。在CMV特異性CD4 T細胞之此亞群中，在PD1-TIM3-IL2v及PD1-IL2v處理後，吾等不僅注意到效應子及中心記憶細胞之頻率增加(圖 5C ，p≤0.01及圖 5D )，而且終末分化效應子(CD45RO- CD62L- )之頻率亦增加(圖 5C )。 綜合而言，資料表明，PD1-TIM3-IL2v使長壽命保護性病毒特異性多功能T細胞之頻率增加且亦允許缺乏內在增殖能力之彼等病毒特異性效應子CD4 T細胞擴增。實例 4 IL-2v 遞送至耗竭之病毒特異性 T 細胞的 效應 ， 其經由 PD-1 或 PD-1 及 TIM-3 阻斷來達成 耗竭之病毒特異性T細胞上的PD-1表現首次已描述為長期暴露於病毒抗原的結果且其已與T細胞不能建立有效的抗病毒反應相關。能夠同時分泌IL-2及IFN-γ的病毒特異性CD4 T細胞防止病毒在長期感染中再活化。的確，在細胞巨大病毒(CMV)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus，EBV)及單純疱疹病毒(HSV)所感染之健康個體中以及在感染人類免疫缺乏病毒(HIV)、多年保持無症狀的彼等個體中，CD4 T細胞之多功能標誌已與病毒控制相關。 最近，已在彼等PD-1陽性病毒特異性T細胞之表面上鑑別出TIM-3 (另一免疫檢查點)，該等T細胞的功能異常程度大於PD-1單一陽性T細胞。因此，開發活體外分析以評估PD-1及TIM-3靶向使突變型IL-2 (IL-2v)遞送至功能異常抗原特異性T細胞的作用。為了避免對適用於分析之供體的量產生限制，選擇CMV免疫原性病毒蛋白質(pp65)作為T細胞之回憶抗原，條件是群體中約80%呈CMV血清反應陽性。因此，在10 μg/ml濃度的構築體存在下，用CMV-pp65 (Miltenyi)刺激健康人類供體周邊血液單核細胞(PBMC)。43小時後，藉由添加高爾基體栓塞(BD Bioscience，佈雷菲爾德菌素A (Brefeldin A))及高爾基體擋塊(BD Bioscience，莫能菌素(Monensin))來阻斷蛋白質自高爾基體轉運且細胞在37℃另培育5小時。接著洗滌細胞，在表面上用抗人類CD3、CD4、CD8、CD62L及CD45RO抗體染色，隨後用FoxP3轉錄因子染色緩衝液套件(eBioscience)固定/滲透。最後，針對IL-2、IFN-γ及Ki67進行細胞內染色(均得自eBioscience)。 圖6表明，48小時後，在單獨抗PD-1、與TIM-3及IL-2v組合或作為融合蛋白存在下，CD4 T細胞分泌IL-2 (A)、IL-2及IFN-γ (B)或IFN-γ (C)及增殖(D)的能力經由CMV免疫原性蛋白質pp65而恢復。圖6中所示的結果突顯了相對於單獨PD-1阻斷或非靶向IL-2v，阻斷PD-1及TIM-3、同時遞送IL-2v至病毒特異性T細胞之組合作用。有趣的是，相較於單獨的PD-1阻斷，PD1-TIM3-IL-2v構築體使能夠共分泌IL-2及IFN-γ (圖6B)以及單一IFN-γ (圖6C，P≤0.0001)之CMV特異性CD4 T細胞的頻率增加。反之，DP47-IL2v使IL-2單功能性CD4 T細胞之頻率增加(圖6A)。正如所料，經靶向或非靶向IL-2v處理的所有細胞均增殖，如根據Ki67染色陽性所指示(圖6D)。 圖7表明，48小時後，在單獨的抗PD-1、與TIM-3及IL-2v組合或作為融合蛋白存在下，分泌IFN-γ之病毒特異性CD4 T細胞的分化狀態(根據CD45RO及CD62L之表現)經由CMV免疫原性蛋白質pp65而恢復。經擴增之IFN-γ分泌型病毒特異性CD4 T細胞的表型表徵(圖7)揭露了效應子-記憶體(CD45RO+ CD62L- )分佈。 因此可以得出結論，經由PD1-TIM3-IL2v融合蛋白將IL-2v遞送至耗竭之CMV特異性CD4 T細胞引起長壽命之保護性病毒特異性群體擴增，其藉由有差別的記憶體分佈及分泌IL-2與IFN-γ之能力表徵。在長期感染中以及在癌症中，此為此分子靶向耗竭/功能異常之抗原特異性T細胞之潛在應用的相關特徵。實例 5 實例 5A. PD1-TIM3-IL2v 優先結合至活化的習知 T 細胞而非 活化的調控 T 細胞 PD1-TIM3-IL2v對活化之習知及調控T細胞的結合特性係在競爭性結合分析中評估。使用調控T細胞兩步分離套組(Miltenyi，#130-094-775)分離出CD4+ CD25+ CD127dim 調控T細胞(Treg)。同時，藉由收集CD25陽性選擇之陰性部分(Miltenyi，#130-092-983)、隨後進行CD4+ 富集(Miltenyi，#130-045-101)來分離出CD4+ CD25- 習知T細胞(Tconv)。Tconv用CFSE (eBioscience，#65-0850-84)標記且Treg用細胞追蹤紫(ThermoFisher scientific, C34557)標記以追蹤兩種群體之增殖。Tconv與Treg一起接種於培養盤中，該培養盤在4℃用1 μg/ml CD3 (純系OKT3，#317315，BioLegend)塗佈隔夜。添加濃度為1 μg/ml CD28 (純系CD28.2，#302923，BioLegend)的CD28溶液。刺激5天之後，使用PD1 (0376)及PD1-TIM3-IL2v (0592)執行結合分析，兩者均在內部用AF647標記。 圖8A展示相同樣品內之Tconv相對於Treg上所結合之指定抗體之頻率差，其中各符號代表個別供體，水平線表示N=4之中值。圖8B展示得自一個代表性供體的資料，其展示結合至Tconv (黑線)及Treg (灰色)。PD1-TIM3-IL2v三特異性抗體展示與PD1類似的結合分佈(圖8A及8B)。由於PD-1在Tconv上的表現量高於在Treg上，因此兩種分子均展示對Tconv的結合力高於Treg。因此，儘管IL2v與抗體偶聯，但PD1-IL2v雙特異性抗體維持PD1之結合特性。實例 5B. 在 Treg 抑制分析中對 PD1-TIM3-IL2v 處理後的 Tconv 效應功能進行拯救 在下一步驟中測試PD1-TIM3-IL2v是否能逆轉Treg對Tconv之抑制。因此吾等建立抑制功能分析，其中使用或不使用阻斷抗體、在來自無關供體之用於同種特異性刺激之CD4- CD25- 存在下將Tconv與Treg一起培養5天。出於此目的，分離出Tconv及Treg且加以標記，如上文所述。FACS染色之前5小時，藉由施加蛋白質轉運抑制劑(高爾基體塞#555029，BD及高爾基體擋塊#554724，BD)來增強細胞介素在高爾基體複合體中的積聚。 在Treg存在及不存在下量測所增殖Tconv分泌顆粒酶B (GrzB)及干擾素γ (IFNγ)的能力。根據下式計算Treg抑制：% 細胞介素抑制 = 100-(% 細胞介素 Tconv+Treg ±阻斷抗體 )/(% 細胞介素未處理之 Tconv ) *100) 其中，%細胞介素Tconv+Treg ±阻斷抗體 為Tconv在Treg ± 阻斷抗體存在下所分泌之細胞介素含量，%細胞介素未處理 Tconv 為Tconv在Treg存在下所分泌之細胞介素含量。在圖9中，展示共培養5天後，Tregs對Tconv分泌顆粒酶B (圖9A)及干擾素-γ (圖9B)之抑制百分比。各符號代表個別供體，水平線表示N=5的中值，0%處的虛線代表Treg無抑制。使用單向ANOVA (*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001)計算P。 相較於未處理組之68.6%抑制中值(無統計顯著性)，PD1抗體(0376)處理產生47.7%之Tconv功能抑制中值。同樣，阿特唑單抗(Atezolizumab)、納武單抗(Nivolumab)及派立珠單抗(Pembrolizumab)阻斷PD-1/PD-L1相互作用展示與吾等內部PD1相同的傾向。有趣的是，DP47-IL2v (中值 = -11.3%，p = 0.0011)及PD1-TIM3-IL2v (中值 = -37.3%，p＜0.0001)將Tconv GrzB效應功能自Treg抑制中拯救出來。另外，PD1-TIM3-IL2v甚至比單獨的PD1顯著(p=0.0016)更有效。同時，對Treg抑制Tconv分泌INFy進行相同分析。DP47-IL2v (中值 = 51.77%，p = 0.0251)及PD1-TIM3-IL2v (中值 = 21.58%，p = 0.0001)將Tconv IFNy效應功能自Treg抑制中拯救出來。實例 6 實例 6A.供體 1及 2之細胞活化 (pSTAT5分析 )將自健康供體新鮮分離的PBMC接種於圓底96孔盤之溫培養基(RPMI1640，10% FCS，2 mM麩醯胺酸)(200'000個細胞/孔)中。培養盤以300 g離心10分鐘且移除上清液。將細胞再懸浮於50 μl含有IL2分子的培養基中且在37℃刺激20分鐘。為了保持磷酸化狀態，細胞在37℃用等量的預溫熱Cytofix緩衝液(554655，BD Bioscience)刺激10分鐘之後立即固定。隨後，培養盤以300 g離心10分鐘且移除上清液。為了達成細胞內染色，使細胞在200 µl Phosflow Perm緩衝液III (558050，BD Bioscience)中、在4℃滲透30分鐘。接著，細胞用150 µl冷FACS緩衝液洗滌兩次且拆分至兩個圓底96孔盤中且在冰箱中各用20 μl抗體混合物I或II染色60分鐘。抗體混合物I用於將CD4 T細胞及調控T細胞中之pSTAT5染色且抗體混合物II用於將CD8 T細胞及NK細胞中之pSTAT5染色。隨後，細胞用FACS緩衝液洗滌兩次且再懸浮於每孔200 µl含有2% PFA的FACS緩衝液中。使用BD Fortessa流式細胞儀進行分析。 使用根據表1及表2的FACS抗體混合物。 表1. FACS抗體混合物I (CD4 T細胞及調控T細胞)
Figure 107111635-A0304-0002
 表2. FACS抗體混合物II (CD8 T細胞及NK細胞)
Figure 107111635-A0304-0003
 圖10展示PD1-IL2v、FAP-IL2v及FAP-IL2wt處理供體1之靜止PBMC後，CD8 T細胞(A)、NK細胞(B)、CD4 T細胞(C)及調控T細胞(D)中的STAT5磷酸化。所有三種測試分子對CD8 T細胞、NK細胞及CD4 T細胞(不包括Tregs)同樣有效。FAP-IL2wt更有效地誘導Tregs中之STAT5磷酸化，繼之為PD1-IL2v。FAP-IL2v對Tregs的活性最低。 圖11展示FAP-IL2v、PD1-IL2c、FAP-IL2wt及PD1-TIM3-IL2v處理供體2之靜止PBMC後，CD4 T細胞(A)、CD8 T細胞(B)、調控T細胞(C)及NK細胞(D)中的STAT5磷酸化。所有四種測試分子對CD8 T細胞、NK細胞及CD4 T細胞(不包括Tregs)具有類似的活性。FAP-IL2wt更有效地誘導Tregs中之STAT5磷酸化，繼之為PD1-IL2v。FAP-IL2v對Tregs的活性最低。實例 6B. 供體 3 及 4 之細胞活化 (pSTAT5 分析 ) 使冷凍的自健康供體分離之PBMC解凍且在37℃培養隔夜。次日，將細胞接種於圓底96孔盤之溫培養基(RPMI1640，10% FCS，2 mM麩醯胺酸)中(200'000個細胞/孔)。培養盤以300 g離心10分鐘且移除上清液。將細胞再懸浮於50 μl含有IL2分子的培養基中且在37℃刺激20分鐘。為了保持磷酸化狀態，細胞在37℃用等量的預溫熱Cytofix緩衝液(554655，BD Bioscience)刺激10分鐘之後立即固定。隨後，培養盤以300 g離心10分鐘且移除上清液。為了達成細胞內染色，使細胞在200 µl Phosflow Perm緩衝液III (558050，BD Bioscience)中、在4℃滲透30分鐘。接著，細胞用150 µl冷FACS緩衝液洗滌兩次且拆分至兩個圓底96孔盤中且在冰箱中各用20 μl抗體混合物I或II染色60分鐘。抗體混合物I用於將CD4 T細胞及調控T細胞中之pSTAT5染色且抗體混合物II用於將CD8 T細胞及NK細胞中之pSTAT5染色。隨後，細胞用FACS緩衝液洗滌兩次且再懸浮於每孔200 µl含有2% PFA的FACS緩衝液中。使用BD Fortessa流式細胞儀進行分析。使用根據表3及表4的FACS抗體混合物。 表3. FACS抗體混合物I (CD4 T細胞及調控T細胞)
Figure 107111635-A0304-0004
 表4. FACS抗體混合物II (CD8 T細胞及NK細胞)
Figure 107111635-A0304-0005
 圖12展示FAP-IL2v、PD1-IL2c、FAP-IL2wt及PD1-TIM3-IL2v處理供體3之靜止PBMC後，CD8 T細胞(A)、NK細胞(B)、CD4 T細胞(C)及調控T細胞(D)中的STAT5磷酸化。所有四種測試分子對CD8 T細胞、NK細胞及CD4 T細胞(不包括Tregs)具有類似的活性。FAP-IL2wt更有效地誘導Tregs中之STAT5磷酸化，繼之為PD1-IL2v。FAP-IL2v對Tregs的活性最低。 圖13展示FAP-IL2v、PD1-IL2v、FAP-IL2wt、PD1-TIM3-IL2v處理供體4之靜止PBMC後，CD4 T細胞(A)、NK細胞(B)、CD4 T細胞(C)及調控T細胞(D)中的STAT5磷酸化。所有四種測試分子對CD8 T細胞、NK細胞及CD4 T細胞(不包括Tregs)具有類似的活性。FAP-IL2wt更有效地誘導Tregs中之STAT5磷酸化，繼之為PD1-IL2v。FAP-IL2v對Tregs的活性最低。 * * * 雖然前述本發明已藉助於說明及實例較詳細地描述以用於清楚理解之目的，但描述及實例不應解釋為限制本發明之範疇。本文中所引用之所有專利及科學文獻之揭示內容均以全文引用之方式明確併入本文中。
圖 1. 本文所述之免疫結合物中所包含之雙特異性抗原結合分子的例示性構型。(A、C)雙特異性抗原結合分子，其包含結合至PD-1之VH/VL互換型Fab分子、結合至Tim-3之(習知) Fab分子，及Fc域。(B、D)雙特異性抗原結合分子，其包含結合至PD-1之(習知) Fab分子、結合至Tim-3之VH/VL互換型Fab分子，及Fc域。黑點：Fc域中視情況存在之促進雜二聚化的修飾。++、--：視情況引入CH1及CL域中之帶有相反電荷的胺基酸。互換型Fab分子描繪為包含VH與VL區域之交換，但可以替代地包含CH1與CL域之交換，尤其在其中CH1及CL域未引入電荷修飾的實施例中。圖 2. 相較於PD1 IgG及CEA-IL2v，PD1-TIM3-IL2v結合至CD3/CD28活化PBMC內的CD4 T細胞(A)及CD8 T細胞(B)。圖 3. 2天後測得，PD1-TIM3-IL2v誘導人類NK細胞株NK92增殖。圖 4. 48小時後，在抗PD-1單獨或與PD1-IL2v、PD1-TIM3-IL2v之IL-2v組合的存在下，或在抗PD-1、抗TIM-3及IL-2v之組合存在下，CD4 T細胞分泌IL-2 (A)、IL-2及IFN-γ (B)或IFN-γ (C)的能力經由CMV免疫原性蛋白質pp65而恢復。圖 5. 48小時後，在抗PD-1單獨或與PD1-IL2v、PD1-TIM3-IL2v之IL-2v組合存在下，或在抗PD-1、抗TIM-3及IL-2v之組合存在下，分泌(A及B) IL-2與IFN-γ或僅IFN-γ (C、D、E)之病毒特異性CD4 T細胞的分化狀態經由CMV免疫原性蛋白質pp65而恢復。圖 6A-D . 48小時後，在單獨抗PD-1、與TIM-3及IL-2v組合或作為融合蛋白存在下，CD4 T細胞分泌IL-2 (圖6A)、IL-2及IFN-γ (圖6B)或IFN-γ (圖6C)及增殖(圖6D)的能力經由CMV免疫原性蛋白質pp65而恢復。圖 7. 48小時後，在單獨抗PD-1、與TIM-3及IL-2v組合或作為融合蛋白存在下，分泌IFN-γ之病毒特異性CD4 T細胞的分化狀態(根據CD45RO及CD62L之表現)經由CMV免疫原性蛋白質pp65而恢復。圖 8A 及 8B . 在相同樣品內，Tconv相對於Treg上所結合之指定抗體頻率差。各符號代表個別供體，水平線表示N=4的中值(圖8A)。得自一個代表性供體的資料展示結合至Tconv (黑線)及Treg (灰色)(圖8B)。圖 9 . 共培養5天之後，Tregs對Tconv分泌顆粒酶B (圖9A)及干擾素-γ (圖9B)之抑制百分比。各符號代表個別供體，水平線表示N=5的中值，0%處的虛線代表Treg無抑制。使用單向ANOVA (*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001)計算P。圖 10A-D . 對第一供體之靜止PBMC(CD8 T細胞(A)、NK細胞(B)、CD4 T細胞(C)及調控T細胞(D))進行的STAT5分析。圖 11A-D . 對第二供體之靜止PBMC (CD4 T細胞(A)、CD8 T細胞(B)、調控T細胞(C)及NK細胞(D))進行的STAT5分析。圖 12A-D . 對第三供體之靜止PBMC (CD8 T細胞(A)、NK細胞(B)、CD4 T細胞(C)及調控T細胞(D))進行的STAT5分析。圖 13A-D . 對第四供體之靜止PBMC (CD8 T細胞(A)、NK細胞(B)、CD4 T細胞(C)及調控T細胞(D))進行的STAT5分析。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032

Claims (43)

  1. 一種免疫結合物，其包含突變型IL-2多肽以及結合至PD-1及Tim-3的雙特異性抗原結合分子，其中該突變型IL-2多肽為包含胺基酸取代F42A、Y45A及L72G(相對於人類IL-2序列SEQ ID NO：22編號)的人類IL-2分子；及其中該雙特異性抗原結合分子包含(i)結合至PD-1的第一抗原結合部分，其包含(a)重鏈可變區(VH)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：1的HVR-H1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：2的HVR-H2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：3的HVR-H3；以及(b)輕鏈可變區(VL)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：4的HVR-L1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：5的HVR-L2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：6的HVR-L3，及(ii)結合至Tim-3的第二抗原結合部分，其包含(a)重鏈可變區(VH)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：12的HVR-H1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：13的HVR-H2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：14的HVR-H3；以及(b)輕鏈可變區(VL)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：15的HVR-L1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：16的HVR-L2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：17的HVR-L3。
  2. 如請求項1之免疫結合物，其中該第一抗原結合部分包含：(a)重鏈可變區(VH)，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及(b)輕鏈可變區(VL)，其 包含與選自由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：11組成之群的胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
  3. 如請求項1之免疫結合物，其中該第二抗原結合部分包含(a)重鏈可變區(VH)，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：18至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及(b)輕鏈可變區(VL)，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：19至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或(a)重鏈可變區(VH)，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：20至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及(b)輕鏈可變區(VL)，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO：21至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。
  4. 如請求項1之免疫結合物，其中該突變型IL-2多肽進一步包含胺基酸取代T3A及/或胺基酸取代C125A。
  5. 如請求項1之免疫結合物，其中該突變型IL-2多肽包含SEQ ID NO：23之序列。
  6. 如請求項1之免疫結合物，其中該免疫結合物包含不超過一種突變型IL-2多肽。
  7. 如請求項1之免疫結合物，其中該第一及/或第二抗原結合部分為Fab分子。
  8. 如請求項1之免疫結合物，其中該第一或第二抗原結合部分為Fab分子，其中Fab輕鏈及Fab重鏈之可變域VL與VH或恆定域CL與CH1彼此置換。
  9. 如請求項1之免疫結合物，其中該第一或第二抗原結合部分為Fab分子，其中在該恆定域中，位置124處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)且位置123處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)取代(根據Kabat編號)，且在該恆定域CH1中，位置147處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213處之胺基酸獨立地經麩胺酸(E)或天冬胺酸(D)取代(根據Kabat EU索引編號)。
  10. 如請求項1之免疫結合物，其中該第一抗原結合部分為Fab分子，其中該Fab輕鏈及該Fab重鏈之該可變域VL與VH彼此置換，且該第二抗原結合部分為Fab分子，其中在該恆定域中，位置124處之胺基酸經離胺酸(K)取代(根據Kabat編號)且位置123處之胺基酸獨立地經離胺酸(K)或精胺酸(R)取代(根據Kabat編號)，且在該恆定域CH1中，位置147處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)且位置213處之胺基酸經麩胺酸(E)取代(根據Kabat EU索引編號)。
  11. 如請求項1之免疫結合物，其中該雙特異性抗原結合分子進一步包含由第一及第二亞單元組成的Fc域。
  12. 如請求項11之免疫結合物，其中該Fc域為IgG類的Fc域。
  13. 如請求項11之免疫結合物，其中該Fc域為IgG1子類的Fc域。
  14. 如請求項11之免疫結合物，其中該Fc域為人類Fc域。
  15. 如請求項11之免疫結合物，其中該Fc域包含促進該Fc域之該第一與第二亞單元結合的修飾。
  16. 如請求項11之免疫結合物，其中該Fc域之該第一亞單元之CH3域中的胺基酸殘基經具有較大側鏈體積的胺基酸殘基置換，藉此在該第一亞單元之CH3域內產生可定位於該第二亞單元之CH3域內之空腔中的隆凸，且該Fc域之該第二亞單元之CH3域中的胺基酸殘基經具有較小側鏈體積的胺基酸殘基置換，藉此在該第二亞單元之CH3域內產生可供該第一亞單元之CH3域內之該隆凸可定位於其中的空腔。
  17. 如請求項11之免疫結合物，其中在該Fc域之該第一亞單元中，位置366處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基置換(T366W)，且在該Fc域之該第二亞單元的CH3域中，位置407處的酪胺酸殘基經纈胺酸殘基置換(Y407V)(根據Kabat EU索引編號)。
  18. 如請求項17之免疫結合物，其中在該Fc域之該第二亞單元的CH3域中，位置366處之蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基置換(T366S)且位置368處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L368A)(根據Kabat EU索引編號)。
  19. 如請求項17之免疫結合物，其中在該Fc域之該第一亞單元中，另外，位置354處之絲胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(S354C)或位置356處之麩胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(E356C)，且在該Fc域之該第二亞單元中，另外，位置349處之酪胺酸殘基經半胱胺酸殘基置換(Y349C)(根據Kabat EU索引編號)。
  20. 如請求項11之免疫結合物，其中該突變型IL-2多肽在其胺基端胺基酸處與該Fc域之一亞單元的羧基端胺基酸融合。
  21. 如請求項20之免疫結合物，其中該突變型IL-2多肽經由連接肽融合至該Fc域之一亞單元。
  22. 如請求項21之免疫結合物，其中該連接肽具有SEQ ID NO：24之胺基酸序列。
  23. 如請求項11之免疫結合物，其中該第一抗原結合部分為Fab分子且在該Fab重鏈之C端與該Fc域之一亞單元的N端融合，且該第二抗原結合部分為Fab分子且在該Fab重鏈之C端與該Fc域之另一亞單元的N端融合。
  24. 如請求項23之免疫結合物，其中該第一及第二抗原結合部分各自經由免疫球蛋白鉸鏈區與該Fc域融合。
  25. 如請求項11之免疫結合物，其中該Fc域包含一或多種胺基酸取代，該等胺基酸取代減少對Fc受體的結合，及/或效應功能。
  26. 如請求項25之免疫結合物，其中該一或多種胺基酸取代發生於一或多個選自L234、L235及P329之群的位置(Kabat EU索引編號)。
  27. 如請求項11之免疫結合物，其中該Fc域中之各亞單元包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G(Kabat EU索引編號)。
  28. 如請求項1之免疫結合物，包含含有胺基酸序列與SEQ ID NO：25之序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的多肽、含有胺基酸序列與SEQ ID NO：26之序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的多肽、含有胺基酸序列與SEQ ID NO：27之序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的多肽，及含有胺基酸序列與SEQ ID NO：28之序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的多肽。
  29. 如請求項1之免疫結合物，其基本上由突變型IL-2多肽及IgG1免疫球 蛋白分子經連接子序列連接而組成，其中該等Fab分子之一中的該重鏈及輕鏈可變區或恆定區彼此置換。
  30. 一種經分離之聚核苷酸，其編碼如請求項1至29中任一項之免疫結合物。
  31. 一種載體，其包含如請求項30之聚核苷酸。
  32. 一種宿主細胞，其包含如請求項30之聚核苷酸或如請求項31之載體。
  33. 一種製備免疫結合物之方法，該免疫結合物包含突變型IL-2多肽以及結合至PD-1及Tim-3的雙特異性抗原結合分子，該方法包含在適於該免疫結合物表現的條件下培養如請求項32之宿主細胞。
  34. 如請求項33之方法，其進一步包含回收該免疫結合物。
  35. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至29中任一項之免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。
  36. 如請求項1之免疫結合物，其用作藥劑。
  37. 如請求項1之免疫結合物，其用於治療疾病。
  38. 如請求項37之免疫結合物，其中該疾病為癌症。
  39. 一種如請求項1至29中任一項之免疫結合物用於製造供治療疾病用之藥劑的用途。
  40. 如請求項39之用途，其中該疾病為癌症。
  41. 一種包含如請求項1至29中任一項之免疫結合物之呈醫藥學上可接受之形式之組合物的用途，用於製造供治療個體之疾病用的藥劑。
  42. 如請求項41之用途，其中該疾病為癌症。
  43. 一種包含如請求項1至29中任一項之免疫結合物之呈醫藥學上可接受之形式之組合物的用途，用於製造供刺激個體之免疫系統用的藥劑。
TW107111635A 2017-04-03 2018-04-02 免疫結合物 TWI780140B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17164538.5 2017-04-03
EP17164538 2017-04-03
??17164538.5 2017-04-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201842937A TW201842937A (zh) 2018-12-16
TWI780140B true TWI780140B (zh) 2022-10-11

Family

ID=58488893

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW107111635A TWI780140B (zh) 2017-04-03 2018-04-02 免疫結合物

Country Status (7)

Country Link
US (2) US20180326011A1 (zh)
EP (1) EP3606947B1 (zh)
JP (1) JP7148539B2 (zh)
CN (1) CN110382525B (zh)
AR (1) AR111203A1 (zh)
TW (1) TWI780140B (zh)
WO (1) WO2018184965A1 (zh)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102146319B1 (ko) 2015-10-02 2020-08-25 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd1 및 tim3에 특이적인 이중특이성 항체
WO2018170288A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
LT3606946T (lt) 2017-04-03 2022-10-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-pd-1 antikūno imunokonjugatai su mutantiniu il-2 arba su il-15
KR102346336B1 (ko) 2017-04-05 2022-01-04 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd1 및 lag3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체
BR112019024127A2 (pt) 2017-05-24 2020-06-23 Pandion Therapeutics, Inc. Imunotolerância alvejada
KR20200097275A (ko) * 2017-12-06 2020-08-18 팬디온 테라퓨틱스, 인코포레이티드 Il-2 뮤테인 및 그 용도
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
US10174091B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
US20210388049A1 (en) * 2018-10-29 2021-12-16 1Globe Biomedical Co., Ltd. Novel Rationally Designed Protein Compositions
KR20220035333A (ko) 2019-05-20 2022-03-22 팬디온 오퍼레이션스, 인코포레이티드 Madcam 표적 면역관용
KR20220034115A (ko) * 2019-06-14 2022-03-17 큐진 인크. 암 치료용 신규한 인터루킨-2 변이체
US20220235133A1 (en) * 2019-06-24 2022-07-28 Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. Monoclonal antibody-cytokine fusion protein dimer and application thereof
JP2023526282A (ja) 2020-05-13 2023-06-21 ボナム セラピューティクス，インク． タンパク質複合体の組成物及びその使用方法
BR112023018117A2 (pt) * 2021-03-09 2023-10-31 Hoffmann La Roche Imunoconjugados
WO2022189380A1 (en) * 2021-03-09 2022-09-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of pd-1-targeted il-2 variant immunoconjugate and anti-tyrp1/anti-cd3 bispecific antibodies
CA3233075A1 (en) * 2021-09-22 2023-03-30 Fortvita Biologics (Singapore) Pte. Ltd. Interleukin-2 mutant and fusion protein thereof
WO2023046093A1 (zh) * 2021-09-24 2023-03-30 广东菲鹏制药股份有限公司 一种双特异性多肽复合物
WO2023092006A1 (en) * 2021-11-17 2023-05-25 Good Therapeutics, Inc. Compositions of protein complexes and methods of use thereof
WO2023151661A1 (zh) * 2022-02-11 2023-08-17 江苏恒瑞医药股份有限公司 免疫缀合物及其用途
KR20230168273A (ko) * 2022-06-03 2023-12-13 (주)지아이이노베이션 항-tigit 항체를 포함하는 이중 특이적 항체 및 이의 용도
CN116041539B (zh) * 2022-10-31 2023-07-21 山东博安生物技术股份有限公司 Il-2突变体免疫缀合物

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011159877A2 (en) * 2010-06-18 2011-12-22 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Bi-specific antibodies against tim-3 and pd-1 for immunotherapy in chronic immune conditions
US20120244112A1 (en) * 2011-02-10 2012-09-27 Oliver Ast Mutant interleukin-2 polypeptides
US20150315296A1 (en) * 2014-04-02 2015-11-05 Hoffmann-La Roche Inc. Multispecific antibodies

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2388385B1 (fr) 1977-04-18 1982-01-08 Hitachi Metals Ltd Piece d'ornement fixee par des aimants permanents
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US5116943A (en) 1985-01-18 1992-05-26 Cetus Corporation Oxidation-resistant muteins of Il-2 and other protein
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
JP2524586B2 (ja) 1985-06-26 1996-08-14 シタス コーポレイション ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5229109A (en) 1992-04-14 1993-07-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Low toxicity interleukin-2 analogues for use in immunotherapy
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
DE69830901T2 (de) 1997-05-02 2006-05-24 Genentech Inc., San Francisco ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
ATE531812T1 (de) 1997-12-05 2011-11-15 Scripps Research Inst Humanisierung von nager-antikörpern
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
AU782626B2 (en) 1999-10-04 2005-08-18 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
AU784983B2 (en) 1999-12-15 2006-08-17 Genentech Inc. Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
AU2002355955A1 (en) 2001-08-13 2003-03-03 University Of Southern California Interleukin-2 mutants with reduced toxicity
ES2381025T3 (es) 2001-12-04 2012-05-22 Merck Patent Gmbh Inmunocitocinas con selectividad modulada
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
AU2004205631A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
CA2885854C (en) 2004-04-13 2017-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
NZ556286A (en) 2005-02-07 2010-11-26 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules that bind EGFR, vectors encoding same, and uses thereof
US10011858B2 (en) 2005-03-31 2018-07-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
ES2577292T3 (es) 2005-11-07 2016-07-14 Genentech, Inc. Polipéptidos de unión con secuencias hipervariables de VH/VL diversificadas y consenso
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
AU2007229698B9 (en) 2006-03-24 2012-11-08 Merck Patent Gmbh Engineered heterodimeric protein domains
CA2651567A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Genentech, Inc. Binding polypeptides with optimized scaffolds
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
SI2066796T1 (sl) 2006-09-20 2012-01-31 Mt Biomethan Gmbh Postopek in naprava za ravnanje s surovimi plini, ki vsebujejo metan in ogljikov dioksid, zlasti bioplinom, za pridobivanje metana
US8906356B2 (en) 2007-11-05 2014-12-09 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2 (IL-2) polypeptides
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
PT2235064E (pt) 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
JP5764127B2 (ja) 2009-08-17 2015-08-12 ロシュ グリクアート アーゲー 標的化イムノコンジュゲート
SI2519543T1 (sl) 2009-12-29 2016-08-31 Emergent Product Development Seattle, Llc Beljakovine, ki se vežejo s heterodimeri in njihova uporaba
US9527926B2 (en) 2010-05-14 2016-12-27 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
AU2011325833C1 (en) 2010-11-05 2017-07-13 Zymeworks Bc Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain
PT2691417T (pt) 2011-03-29 2018-10-31 Roche Glycart Ag Variantes de fc de anticorpos
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
CA2859667C (en) 2011-12-20 2022-05-24 Medimmune, Llc Modified polypeptides for bispecific antibody scaffolds
JP6152120B2 (ja) 2012-02-15 2017-06-21 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｆｃ受容体に基づくアフィニティークロマトグラフィー
MX360109B (es) 2012-04-20 2018-10-23 Merus Nv Metodos y medios para la produccion de moleculas de tipo ig.
SG10201800535XA (en) * 2012-08-07 2018-02-27 Roche Glycart Ag Composition comprising two antibodies engineered to have reduced and increased effector function
JP6660297B2 (ja) * 2013-11-11 2020-03-11 アルモ・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド 疾患及び障害を処置するためのインターロイキン−１０の使用方法
RS59664B1 (sr) * 2014-11-06 2020-01-31 Hoffmann La Roche Anti-tim3 antitela i postupci upotrebe
KR102146319B1 (ko) * 2015-10-02 2020-08-25 에프. 호프만-라 로슈 아게 Pd1 및 tim3에 특이적인 이중특이성 항체

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011159877A2 (en) * 2010-06-18 2011-12-22 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Bi-specific antibodies against tim-3 and pd-1 for immunotherapy in chronic immune conditions
US20120244112A1 (en) * 2011-02-10 2012-09-27 Oliver Ast Mutant interleukin-2 polypeptides
US20150315296A1 (en) * 2014-04-02 2015-11-05 Hoffmann-La Roche Inc. Multispecific antibodies

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
期刊 Kaori Sakuishi, et al." Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity." J Exp Med. 2010 Sep 27; 207(10): 2187-2194. *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3606947B1 (en) 2022-12-21
CN110382525A (zh) 2019-10-25
EP3606947A1 (en) 2020-02-12
WO2018184965A1 (en) 2018-10-11
JP7148539B2 (ja) 2022-10-05
US20230071733A1 (en) 2023-03-09
TW201842937A (zh) 2018-12-16
AR111203A1 (es) 2019-06-12
JP2020512814A (ja) 2020-04-30
US20180326011A1 (en) 2018-11-15
CN110382525B (zh) 2023-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI780140B (zh) 免疫結合物
JP7426825B2 (ja) 抗ｐｄ－１抗体と突然変異ｉｌ－２とまたはｉｌ－１５とのイムノコンジュゲート
TW202219065A (zh) 免疫活化 Fc 域結合分子
TW202115115A (zh) 免疫結合物
US20230192795A1 (en) Immunoconjugates
JP2023509952A (ja) 新規４－１ｂｂｌ三量体含有抗原結合分子
WO2022148853A1 (en) Immunoconjugates
WO2023062048A1 (en) Alternative pd1-il7v immunoconjugates for the treatment of cancer

Legal Events

Date Code Title Description
GD4A Issue of patent certificate for granted invention patent