TWI764304B - 珍珠製備品及其製備方法和用途 - Google Patents

珍珠製備品及其製備方法和用途

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Abstract

本發明提供一種珍珠製備品及其製備方法和用途。所述珍珠製備品通過以下方法製備：1）將珍珠用氣流粉碎機粉碎；2）將粉碎的珍珠粉與去離子水混合得到混合液；3）將混合液用弱酸溶解；4）將步驟3）獲得的溶液接入微生物擴培菌液進行發酵培養；以及5）將步驟4）中得到的發酵培養液凍乾，即獲得珍珠製備品凍乾粉。所述珍珠製備品具有非常顯著的抗衰能力，並且其通過PI3K/AKT路徑作用於線粒體起到抗衰老作用。

Description

珍珠製備品及其製備方法和用途
本申請涉及一種珍珠製備品，其製備方法、及其用途。
衰老是大自然生物的特殊規律，抗衰也是人類一直想要克服的技術難題。尤其在化妝品和保健品中，具有抗衰老功能的產品深受消費者的歡迎。國內外不少科研單位，就衰老機理展開了全面深入的研究。結合現有的發展技術，抗衰老機制大體可分為七大類：細胞外機制的調節、皮膚美白功能、改善角質層屏障功能、促細胞增殖、抵禦細胞凋亡、抗炎作用以及抗氧化作用。這七個機制相互作用，側重點不同。目前，在研究抗衰活性物的作用機制中都會選擇其中的一種或者幾種去證明其具備抗衰老作用。
珍珠，或稱真珠(Pearl)，是一種由軟體動物(主要是牡蠣)生產的硬的、圓滑的產物。在《本草綱目》中特別寫道：珍珠味甘、鹹、性寒無毒，鎮心點目；珍珠塗面，令人潤澤好顏色。塗手足，去皮膚逆臚；墜痰，除面斑，止瀉；除小兒驚熱，安魂魄；止遺精白濁，解痘療毒令光澤潔白等。鑒於珍珠的以上功能，有必要開發一種方法，其能夠有效地萃取和利用珍珠中的抗衰老成分。
本發明的技術目的是提供一種方法，其能夠有效地萃取和利用珍珠中的抗衰老成分，以及提供由其製備的珍珠抗衰老產品，以期可用於皮膚抗衰老、抗炎產品中。
一方面，本發明提供一種珍珠製備品的製備方法，其包括以下步驟：1)粉碎：將珍珠用氣流粉碎機粉碎，獲得粒徑為小於6微米，優選0.3-1微米的超微細珍珠粉；2)與水混合：將珍珠粉與去離子水混合得到混合液；3)弱酸溶解：將過量二氧化碳通入混合液底部，或添加弱酸溶液以使所述混合液中之珍珠粉溶解；4)發酵：將步驟3)獲得的溶液滅菌後，接入微生物擴培菌液進行發酵培養；5)凍乾：將步驟4)中得到的發酵培養液凍乾獲得為珍珠製備品之凍乾粉。
根據本發明的具體實施方式，在步驟1)之前，所述方法還可包括對珍珠進行清洗、磨漿、噴霧乾燥的步驟。
根據本發明的具體實施方式，在步驟2)中，珍珠粉與去離子水混合重量比可為1：5~20，混合條件為：30~70℃下通過內部攪拌子或者攪拌葉於50~100rpm速度下攪拌混合。
根據本發明的具體實施方式，在步驟3)中，如果添加弱酸溶液，則弱酸溶液和混合液的體積比例為1：4~10，優選為1：5，所述弱酸溶液選自乙酸、檸檬酸、乳酸、蘋果酸等中的一種或多種；優選為乳酸、乙酸或檸檬酸。
根據本發明的具體實施方式，在步驟4)中，添加的微生物擴培菌液占步驟3)中獲得溶液的1~10體積%，所用的微生物選自釀酒酵母、葡萄汁酵母、乳酸菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等中的一種或多種；優選為釀酒酵母、鼠李糖乳桿菌、枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌；發酵培養條件可為：發酵罐中25~38℃下，pH值7.0~7.5、300~500r/min、通風3~5L/min和培養24~72小時。
根據本發明的具體實施方式，在步驟5)中，在85~100℃下攪拌發酵培養液20~50分鐘進行滅活後，通過0.22μm的過濾膜壓濾獲取無菌過濾液，並將無菌過濾液與凍乾保護劑以體積/重量比例為100：0.5~2進行混合，在上述體積/重量比例中，體積單位為ml，重量單位為克，採用液態氮或者在-70~-85℃下進行預凍3~10小時，隨後放入真空冷凍乾燥倉中凍乾24~72小時。最終收穫水分含量在2~5重量%的凍乾粉。
根據本發明的具體實施方式，在步驟5)後，所述方法還可包括將凍乾粉置於棕色的樣品瓶(vial)中或者真空包裝的塑膠袋中進行儲存的步驟，優選在1~10℃下儲存。
另一方面，本發明提供一種由上述製備方法製備的珍珠製備品。
另一方面，本發明提供一種組合物，其至少包含上述珍珠製備品。
再一方面，本發明提供一種上述珍珠製備品或上述組合物作為抗衰產品的用途。
根據本發明的具體實施方式，所述抗衰產品為保健品或化妝品。
根據本發明的具體實施方式，所述抗衰產品不含防腐劑。
本發明的方法具有以下優點：
1.經過氣流粉碎處理，能夠打散珍珠粉末的假性團聚，並且再進一步打碎得到粒徑分佈範圍小且集中的小粒徑粉體。
2.通過弱酸溶解以溫和方式無損地萃取珍珠中酸性溶液成分；
3.保留珍珠中的部分鈣質，有利於提高皮膚鈣離子通道，有利於珍珠抗衰多肽越過皮膚屏障，作用於發炎細胞和皮膚基底層的成纖維細胞；
4.通過微生物分解的方式加以降解，獲得小分子多肽，從而在微生物的作用下獲得更為豐富的活性混合物，同時，由於多種微生物代謝產物中含有抑菌肽，能夠保證珍珠製備品後期不必添加防腐劑；
5.所述珍珠製備品能夠有效抑制發炎因子bcl-2、caspase-3和caspase-9的表達，抑制活性氧、丙二醛的產生，並且同時促進麩胱甘肽和超氧化物歧化酶的產生。通過線粒體抗衰途徑，有效修護衰老細胞，延長細胞活性，在抗衰老化妝品和保健品中具有很大的應用前景。
圖1A和圖1B顯示經過氣流粉碎處理前後(圖1A：處理前，圖1B：處理後)的珍珠粉末的電顯圖。
圖2顯示經過氣流粉碎處理後的珍珠粉末的粒徑分佈。
圖3A和圖3B顯示微生物發酵前後珍珠製備品的SDS-PAGE電泳圖，其中，圖3A：泳道1為發酵前測試樣品，泳道2為標準蛋白；圖3B：泳道1和4為標準蛋白，泳道2和3為發酵後的測試樣品。
圖4A至圖4D顯示根據本發明的製備實施例1製備的珍珠製備品在不同濃度下(1*10-4g/ml和1*10-3g/ml)對於角質細胞中各氧化指標(圖4A：ROS；圖4B：GSH-Px；圖4C：MDA；和圖4D：SOD)影響的示意圖。
圖5顯示根據本發明的製備實施例2製備的珍珠製備品在不同濃度下(1*10-4g/ml和1*10-3g/ml)對於細胞發炎因子表達的影響的示意圖(泳道1：空白，泳道2：UV處理，泳道3：UV+10-4g/ml，泳道4：UV+10-3g/ml)。
實驗材料：珍珠採購於浙江歐詩漫集團德清生物科技有限公司，角質形成細胞和成纖維細胞採購於中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，抗體均來自於美國Cell Signaling Tcchnology,Inc(CST)。
製備實施例1
步驟1)將珍珠清洗乾淨，磨漿，噴霧乾燥後，過氣流粉碎機，獲得粒徑為0.1~1微米的超微細珍珠粉；步驟2)將1kg珍珠粉與去離子水按1：10的重量比在30℃下通過內部攪拌子或者攪拌葉在50rpm速度下攪拌混合；步驟3)添加20%(v/v)的乳酸液加以溶解並過濾；步驟4)將上一步驟過濾後得到溶液滅菌後，接入5%的釀酒酵母擴培菌液，置於發酵罐中於28℃，pH值7.0、轉速300r/min、通風3L/min下培養36小時；步驟5)在85℃下攪拌發酵培養液20分鐘進行滅活後，通過0.22μm的過濾膜壓濾獲得無菌過濾液；步驟6)將無菌過濾液與凍乾保護劑以100：0.5(體積/重量，即ml/g)比例混合，採用液態氮進行預凍2小時，隨後放入真空冷凍乾燥倉中凍乾12小時。最終得到凍乾粉；步驟7)將凍乾粉罐裝於棕色的樣品瓶中在4℃下儲存。
製備實施例2
步驟1)將珍珠清洗乾淨，磨漿，噴霧乾燥後，過氣流粉碎機，獲得粒徑為0.1~1微米超微細珍珠粉；步驟2)將1kg珍珠粉與去離子水按1：5的重量比在30℃下通過內部攪拌子或者攪拌葉在50rpm速度下攪拌混合；步驟3)添加20%(v/v)的乙酸溶液加以溶解並過濾；步驟4)將上一步驟過濾後得到溶液滅菌後，接入5%的釀酒酵母擴培菌液，置於發酵罐中28℃，pH值6.8、轉速250r/min、通風4L/min培養36小時；步驟5)在85℃下攪拌發酵培養液20分鐘進行滅活後，通過0.22μm的過濾膜壓濾獲得無菌過濾液；步驟6)將無菌過濾液與凍乾保護劑以100：0.5(體積/重量)比例混合，採用在-80℃下進行預凍3小時，隨後放入真空冷凍乾燥倉中凍乾12小時。最終得到凍乾粉；步驟7)將凍乾粉罐裝於棕色的樣品瓶中在4℃下儲存。
製備實施例3
步驟1)將珍珠清洗乾淨，磨漿，噴霧乾燥後，過氣流粉碎機，獲得粒徑為0.1~1微米超微細珍珠粉；步驟2)將1kg珍珠粉與去離子水按1：5的重量比在30℃下通過內部攪拌子或者攪拌葉在50rpm速度下攪拌混合；步驟3)添加20%(v/v)的乳酸溶液將超微細珍珠粉加以溶解並過濾；步驟4)將上一步驟過濾後得到溶液滅菌後，接入5%的乳酸桿菌擴培菌液，置於發酵罐中37℃，pH值7.0、轉速300r/min、通風3L/min培養36小時； 步驟5)在85℃下攪拌發酵培養液20分鐘進行滅活後，通過0.22μm的過濾膜壓濾獲得無菌過濾液；步驟6)將過濾液與凍乾保護劑以100：0.5(體積/重量)比例混合，採用在-80℃下進行預凍5小時，隨後放入真空冷凍乾燥倉中凍乾12小時。最終得到凍乾粉；步驟7)將凍乾粉罐裝於棕色的樣品瓶中在4℃下儲存。
製備實施例4
步驟1)將珍珠清洗乾淨，磨漿，噴霧乾燥後，過氣流粉碎機，獲得粒徑為0.3~1微米超微細珍珠粉；步驟2)將1kg珍珠粉與去離子水按1：5的重量比在30℃下通過內部攪拌子或者攪拌葉在50rpm速度下攪拌混合；步驟3)將過量二氧化碳通入混合液底部0.5小時，之後過濾；步驟4)將上一步驟過濾後得到溶液滅菌後，接入5%的乳酸菌和釀酒酵母(1：1重量比)的混合擴培菌液，置於發酵罐中37℃，pH值7.0、轉速300r/min、通風3L/min下培養36小時；步驟5)在85℃下攪拌發酵培養液20分鐘進行滅活後，通過0.22μm的過濾膜壓濾獲得無菌過濾液；步驟6)將無菌過濾液與凍乾保護劑以100：0.5(體積/重量)比例混合，採用在-80℃下進行預凍3小時，隨後放入真空冷凍乾燥倉中凍乾12小時。最終得到凍乾粉；步驟7)將凍乾粉罐裝於棕色的樣品瓶中在4℃下儲存。
製備實施例5
步驟1)將珍珠清洗乾淨，磨漿，噴霧乾燥後，過氣流粉碎機，獲得粒徑為0.3~1微米超微細珍珠粉； 步驟2)將1kg珍珠粉與去離子水按1：5的重量比在30℃下通過內部攪拌子或者攪拌葉在50rpm速度下攪拌混合；步驟3)添加20%(v/v)的乙酸溶液加以溶解並過濾；步驟4)將上一步驟過濾後得到溶液滅菌後，接入5%的乳酸菌擴培菌液，置於發酵罐中37℃，pH值7.0、轉速300r/min、通風3L/min下培養36小時；步驟5)在85℃下攪拌發酵培養液20分鐘進行滅活後，通過0.22μm的過濾膜壓濾獲得無菌過濾液；步驟6)將過濾液與凍乾保護劑以100：0.5(體積/重量)比例混合，採用液態氮下進行預凍5小時，隨後放入真空冷凍乾燥倉中凍乾12小時。最終得到凍乾粉；步驟7)將凍乾粉罐裝於棕色的樣品瓶中在4℃下儲存。
製備實施例6
步驟1)將珍珠清洗乾淨，磨漿，噴霧乾燥後，過氣流粉碎機，獲得粒徑為0.3~1微米超微細珍珠粉；步驟2)將1kg珍珠粉與去離子水按1：5的重量比在30℃下通過內部攪拌子或者攪拌葉在50rpm速度下攪拌混合；步驟3)添加20%(v/v)的乳酸溶液加以溶解並過濾；步驟4)將上一步驟過濾後得到溶液滅菌後，接入5%的乳酸菌擴培菌液，置於發酵罐中37℃，pH值6.5、轉速300r/min、通風3L/min下培養36小時；步驟5)在85℃下攪拌發酵培養液20分鐘進行滅活後，通過0.22μm的過濾膜壓濾獲得無菌過濾液； 步驟6)將過濾液與凍乾保護劑以100：0.5(體積/重量)比例混合，採用液態氮進行預凍3小時，隨後放入真空冷凍乾燥倉中凍乾12小時。最終得到凍乾粉；步驟7)將凍乾粉罐裝於棕色的樣品瓶中在4℃下儲存。
製備實施例7
步驟1)將珍珠清洗乾淨，磨漿，噴霧乾燥後，過氣流粉碎機，獲得粒徑為0.3~1微米超微細珍珠粉；步驟2)將1kg珍珠粉與去離子水按1：5的重量比在30℃下通過內部攪拌子或者攪拌葉在50rpm速度下攪拌混合；步驟3)將過量二氧化碳通入混合液底部0.5小時，之後過濾；步驟4)將上一步驟過濾後得到溶液滅菌後，接入5%的枯草芽孢桿菌擴培菌液，置於發酵罐中37℃，pH值6.5、轉速300r/min、通風3L/min下培養36小時；步驟5)在85℃下攪拌發酵培養液20分鐘進行滅活後，通過0.22μm的過濾膜壓濾獲得無菌過濾液；步驟6)將過濾液與凍乾保護劑以100：0.5(體積/重量)比例混合，採用液態氮進行預凍，隨後放入真空冷凍乾燥倉中凍乾12小時。最終得到凍乾粉；步驟7)將凍乾粉罐裝於棕色的樣品瓶中在4℃下儲存。
製備實施例8
步驟1)將珍珠清洗乾淨，磨漿，噴霧乾燥後，過氣流粉碎機，獲得粒徑為0.3~1微米超微細珍珠粉；步驟2)將1kg珍珠粉與去離子水按1：5的重量比在30℃下通過內部攪拌子或者攪拌葉在50rpm速度下攪拌混合； 步驟3)添加20%(v/v)的乙酸溶液加以溶解並過濾；步驟4)將上一步驟過濾後得到溶液滅菌後，接入5%的枯草芽孢桿菌擴培菌液，置於發酵罐中37℃，pH值6.8、轉速300r/min、通風3L/min下培養36小時；步驟5)在85℃下攪拌發酵培養液20分鐘進行滅活後，通過0.22μm的過濾膜壓濾獲得無菌過濾液；步驟6)將過濾液與凍乾保護劑以100：0.5(體積/重量)比例混合，採用液態氮或者在-80℃下進行預凍，隨後放入真空冷凍乾燥倉中凍乾24小時。最終得到凍乾粉；步驟7)將凍乾粉罐裝於棕色的樣品瓶中在4℃下儲存。
製備實施例9
步驟1)將珍珠清洗乾淨，磨漿，噴霧乾燥後，過氣流粉碎機，獲得粒徑為0.3~1微米超微細珍珠粉；
步驟2)將1kg珍珠粉與去離子水按1：5的重量比在30℃下通過內部攪拌子或者攪拌葉在50rpm速度下攪拌混合；
步驟3)添加15%的乳酸溶液加以溶解並過濾；
步驟4)將上一步驟過濾後得到溶液滅菌後，接入5%的枯草芽孢桿菌擴培菌液，置於發酵罐中37℃，pH值6.8、轉速300r/min、通風3L/min下培養48小時；
步驟4)在85℃下攪拌20分鐘的滅活後，通過0.22μm的過濾膜壓濾獲取無菌過濾液；
步驟5)無菌過濾液與凍乾保護劑進行100：0.5(體積/重量)比例的混合，進行-80℃進行預凍1小時，隨後放入真空冷凍乾燥倉中進行凍乾72小時。最終收穫得凍乾粉。
步驟6)將凍乾粉罐裝於棕色的樣品瓶中進行4℃下儲存。
實驗實施例1 採用掃描電子顯微鏡法觀察氣流粉碎前後的珍珠形態
分別將處理乾燥後的樣品粉末(分別為經氣流粉碎前和氣流粉碎後的樣品粉末)用雙面導電膠帶黏到潔淨銅臺上，經離子濺射鍍膜後，在掃描電子顯微鏡上觀察照相，加速電壓為20kV。實驗結果見圖1。
從圖1中可以看出，氣流粉碎前，粉末假性團聚。經過氣流粉碎後，能夠打散假性團聚，並且再進一步打碎得到粒徑分佈範圍小且集中的小粒徑粉體。
實驗實施例2 採用鐳射細微性電位儀法測量氣流粉碎後的珍珠粉末粒徑分佈
操作步驟：
ar)分散納米珍珠粉樣品的液體用去離子水；b)檢查溶液有無氣泡，有氣泡則用超音波消除氣泡；c)檢查樣品池是否乾淨；d)折射率選定在1.61，吸收率選定為1；按GB/T 19077.1-2008規定測定。
結果如圖2所示，由圖2可見，經過粉碎後的珍珠粉末粒徑分佈範圍窄。
實驗實施例3 經發酵處理前後的珍珠製備品的SDS-PAGE電泳
採用SDS-PAGE電泳對經發酵處理前後的珍珠製備品進行檢測，結果如圖3A和圖3B所示，從圖中可以看出經過發酵處理珍珠製備品的分子量範圍明顯下降，證實通過本發明的方法獲得小分子多肽。
實驗實施例4 在UV衰老模型中，珍珠製備品對角質細胞中各氧化指標的影響
試驗方法：紫外照射損傷角質形成細胞後，於冰上以超音波破碎各組細胞，在離心機上離心收集細胞勻漿(homogenate)，並按南京建成試劑盒說明書操作檢測各組的吸光值，以BCA蛋白濃度測定試劑盒測定相應各組的蛋白質濃度，最後計算出各組的ROS、SOD、MDA的含量。
如圖4A至圖4D所示，將角質形成細胞通過UV照射後，角質細胞中ROS、麩胱甘肽過氧化物酶以及丙二醛和超氧化物歧化酶的含量均發生顯著性變化，隨後添加0.01%和0.1%(g/ml)濃度的珍珠製備品作用24小時後進行測定，結果顯示，珍珠製備品可顯著改善氧化指標(有影響*p<0.1，顯著**p<0.01，非常顯著**p<0.001)。
實驗實施例5 在UV衰老模型中，珍珠製備品對於細胞發炎因子表達的影響
試驗方法：西方墨點法(Western blot)檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3及Caspase-9蛋白表達水準
六孔盤中成纖維細胞生長達80%-90%時，收集各組細胞，丟棄上清液，按每孔100μL的量添加RIPA裂解液(含1% PMSF)，靜置3分鐘後將液體移至1.5ml離心管中，冰上靜置30分鐘然後離心(4℃，12000r/min-15000r/min)，將上清液吸出至另1個新1.5mL離心管中，即為蛋白。將蛋白樣品與5×SDS上樣緩衝液(Loading Buffer)以4：1比例混合，沸水加熱7分鐘，使蛋白充分變性。配製分離膠和濃縮膠，將製好的凝膠放入電泳槽內，內外槽加入新鮮配製的電泳緩衝液，拔出樣本梳，加入蛋白樣品，樣品量為60μg。電泳結束切割凝膠，轉印(100V，30分鐘)。一抗(1：500)封閉，4℃過夜，二抗 (1：10 000)反應1小時，ECL發光液A液和B液按照1：1的比例混合均勻，滴至PVDF膜上，使其均勻覆蓋，於暗室中曝光並顯影，分析結果。
如附圖5顯示，在不同濃度的珍珠製備品的作用下，Caspase3和Caspase9凋亡因子的表達均明顯減少、抑制凋亡因子Bcl-2的表達增加，表明本發明的珍珠製備品通過PI3K/AKT路徑具有抑制發炎因子表達的作用。
綜上，本申請的珍珠製備品在萬分之一的濃度添加量下仍具備非常顯著的抗衰能力，並且其通過PI3K/AKT路徑作用於線粒體起到抗衰老作用。

Claims (10)

  1. 一種珍珠製備品的製備方法，其包括以下步驟：1)粉碎：將珍珠用氣流粉碎機粉碎，獲得珍珠粉，其粒徑為小於6微米；2)混合：將珍珠粉與去離子水於30~70℃混合得到混合液；3)弱酸溶解：將二氧化碳通入混合液底部，或添加弱酸溶液以使所述混合液中之珍珠粉溶解；4)發酵：將步驟3)中獲得的溶液滅菌後接入微生物擴培菌液進行發酵培養，發酵培養條件為：發酵罐中25~38℃，pH值7.0~7.5、300~500r/min、通風3-5L/min和培養24~72小時；以及5)凍乾：將步驟4)中得到的發酵培養液凍乾獲得為珍珠製備品之凍乾粉。
  2. 如請求項1所述之製備方法，其中，在步驟1)之前，所述方法還包括對珍珠進行清洗、磨漿、噴霧乾燥的步驟。
  3. 如請求項1所述之製備方法，其中，在步驟2)中，所述珍珠粉與所述去離子水混合重量比為1：5~20。
  4. 如請求項1所述之製備方法，其中，在步驟3)中，所述弱酸溶液和所述混合液的體積比例為1：4~10。
  5. 如請求項1所述之製備方法，其中，在步驟4)中，所述微生物擴培菌液占待接入溶液的1~10體積%。
  6. 如請求項1所述之製備方法，其中，在步驟5)中，將發酵培養液滅活後，通過過濾膜壓濾獲取無菌過濾液，並將無菌過濾液與凍乾保護劑以體積/重量比例為100：0.5~2進行混合，在上述體積/重量比例中，體積單位為毫升(ml)，重量單位為克，採用液態氮或者在-70~-85℃下進行預凍3~10小時，隨後放入真空冷凍乾燥倉中凍乾24~72小時。
  7. 如請求項1所述之製備方法，其中，在步驟5)後，所述方法還包括將珍珠製備品之凍乾粉置於棕色的樣品瓶中或者真空包裝的塑膠袋中進行儲存的步驟。
  8. 一種珍珠製備品，其根據請求項1至7中任一項所述的製備方法製備。
  9. 一種抗衰組合物，其包含如請求項8所述的珍珠製備品。
  10. 一種如請求項8所述的珍珠製備品或如請求項9所述的抗衰組合物用於製備抗衰產品的用途。
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