TWI747922B - 特異性針對過度磷酸化τ蛋白之抗體及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一類單株抗體，其特異性地以改進的親和力結合病理性過度磷酸化(PHF)τ蛋白上的磷酸化絲胺酸396殘基(pS396)，並且涉及在阿茲海默症和其他τ蛋白病變的治療中使用該等分子以及它們的τ蛋白結合片段之方法。

Description

特異性針對過度磷酸化τ蛋白之抗體及其使用方法
本發明涉及一種新穎種類的單株抗體，其特異性地結合病理性過度磷酸化(PHF)τ蛋白上的磷酸化絲胺酸396殘基(pS396)，並且涉及在阿茲海默症和τ蛋白病變的治療中使用該等分子以及它們的τ蛋白結合片段之方法。
序列表的引用
本申請案包括根據37 C.F.R.1.821等的一個或多個序列表，所述序列表以電腦可讀介質揭露(文件名稱：1049-WO-PCT_FINAL_ST25_1.txt，創建於2017年6月13日，並且具有65kB的大小)，將該文件藉由引用以其全文結合在此。
年齡相關性神經退行性疾病，如阿茲海默症(AD)和失智，係現今的最大社會性挑戰之一。世界衛生組織估計，護理老年人的成本將持續增加並且診斷為失智的病例的數目到2050年增至三倍(World Health Organization and Alzheimer's Disease International-Status Report(2012)DEMENTIA：A public health priority[世界衛生組織和阿茲海默症國際狀態報告(2012)失智：公共衛生優先事項]，WHO)。對於AD的首要治療係神經 遞質調節劑，例如乙醯膽鹼酯酶抑制劑和NMDA調節劑。該等療法在世紀之交變得可用，並且仍然形成用於失智和AD相關的記憶缺陷的症狀減輕的基礎。然而，該等藥物不靶向AD的潛在病因，即澱粉樣蛋白β(A β)肽和τ蛋白聚集體的積累以及神經元突觸和最終神經元的相關損失。
對老年人的縱向的社區範圍的研究(Weiner,M.W.等人(2014)ADNI線上：http：//www.adni-info.org/；Breteler,M.M.等人(1992)Neuroepidemiology[神經流行病學]11增刊1，23-28；Launer,L.J.(1992)Neuroepidemiology[神經流行病學]11增刊1，2-13)以及大基因組範圍相關研究(Lambert,J.C.等人(2013)Nat.Genet.[自然基因組學]45，1452-1458)已經顯示，AD係失智的多相混合物，其中高達10%的晚期AD患者缺乏澱粉樣蛋白病變(pathology)(Crary,J.F.等人(2014)Acta Neuropathol.[神經病理學學報]128，755-766)。此外，由Braak和Braak進行的開創性病理學研究(Braak,H.和Braak,E.(1996)Acta Neurol.Scand.[斯堪的納維亞神經學學報]增刊165，3-12)證明神經纖維纏結病變程度與屍體解剖前的認知狀態之間的明顯相關。該等觀察已經藉由一些研究者(Nelson,P.T.等人(2012)J.Neuropathol.Exp.Neurol.[神經病理學與實驗神經學雜誌]71，362-381)以及在最近的縱向生物標記研究中得以驗證，所述研究指示，貫穿該疾病的早期和後期，τ蛋白和過度磷酸化τ蛋白的腦脊液(CSF)水平增加(Jack,C.R.,Jr.等人(2013)Lancet Neurol.[柳葉刀神經學]12，207-216)。
如以上指出的，微管相關蛋白、τ蛋白、及其過度磷酸化形式形成作為AD的一類主要標誌的細胞內神經纖維纏結的主要成分。此外，τ蛋白的具體基因變體與額顳葉失智症(FTD)的家族形式相關聯。 在AD中τ蛋白病變的表現以不同的空間模式出現，起始於內嗅皮質中，隨後為海馬區以及皮質區(Braak,H.和Braak,E.(1996)Acta Neurol.Scand.[斯堪的納維亞神經學學報]增刊165，3-12)。τ蛋白病變的具體階段還良好地與認知能力相關(Nelson,P.T.等人(2012)J.Neuropathol.Exp.Neurol.[神經病理學與實驗神經學雜誌]71，362-381；Braak,E.等人(1999)Eur.Arch.Psychiatry Clin.Neurosci.[歐洲精神病學與臨床神經科學文件]249增刊3，14-22)。綜上，此證據形成對於AD的基於τ蛋白的假設的基礎。需要的是τ蛋白的細胞內積累導致微管變性和脊髓坍塌。結果係神經元之間的通信故障和細胞死亡隨之發生。最近，還已經顯示τ蛋白本身可以形成內-病原性種類，該等種類可以將神經變性從一個細胞傳遞到下一個細胞(Clavaguera,F.等人(2009)Nat.Cell Biol.[自然細胞生物學]11，909-913)。
I. 作為內-病原體的τ蛋白
Clavaguera和同事們已經證明τ蛋白本身可以充當內-病原體(Clavaguera,F.等人(2009)Nat.Cell Biol.[自然細胞生物學]11，909-913)。低自旋腦提取物分離自P301S τ蛋白轉基因小鼠(Allen,B.等人(2002)J.Neurosci.[神經科學雜誌]22，9340-9351)，稀釋並且注入幼小ALZ17小鼠的海馬體和皮質區中。該ALZ17小鼠係τ蛋白轉基因小鼠品系，該品系僅發展晚期病變(Probst,A.等人(2000)Acta Neuropathol.[神經病理學學報]99，469-481)。經注射的ALZ17小鼠快速發展實體絲狀病變，並且給予來自P301S小鼠的經τ蛋白免疫耗減的腦提取物或來自野生型小鼠的提取物並不誘導τ蛋白病變。將腦提取物在可溶(S1)和十二烷基肌胺酸鈉-不溶的τ蛋白(P3)(Sahara,N.等人(2013)J.Alzheimer’s.Dis.[阿茲海默症雜誌]33， 249-263)方面分級並且將該等注入ALZ17小鼠證明了P3部分係誘導病變中最有力的。它包含多數的細胞內過度磷酸化絲狀τ蛋白。大部分的病變還可以在將P301S提取物注入野生型小鼠的腦中時誘導，但無NFT形成。在後續的研究中，克拉維古等人已經顯示，從其他τ蛋白病變(嗜銀顆粒失智((Argyrophilic Grain Disease)(AGD)、進行性核上性麻痹((Progressive Supranuclear Palsy)PSP)、以及皮質基底節變性((Corticobasal Degeneration)CBD))的屍體解剖後的腦組織提取的人類τ蛋白也可以在ALZ17模型中誘導τ蛋白病變(Clavaguera,F.等人(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美國國家科學院院刊]110，9535-9540)。自從呈現了該等數據，若干其他τ蛋白接種和擴展模型已經被報導(Ahmed,Z.等人(2014)Acta Neuropathol.[神經病理學學報]127，667-683；Walker,L.C.等人(2013)JAMA Neurol.[美國醫學會雜誌：神經學分冊]70，304-310)。從該等研究得出的主要結論指示一種機制，藉由該機制在細胞內內含物中的病原性τ蛋白從該細胞分泌進入周質空間。然後病理τ蛋白材料沿著囊泡鞘以順行方向和逆行方向被運輸，並且隨後藉由批量內吞作用被鄰近細胞吸收。這個機制解釋了為什麼在人類疾病中觀察到的病變的擴展遵循不同的解剖學模式。有趣的是，病理性τ蛋白的外周給予可以加速ALZ17小鼠中τ蛋白病變的形成(Clavaguera,F.等人(2014)Acta Neuropathol.[神經病理學學報]127，299-301)。該擴展機制可以解釋其他蛋白病變中的疾病傳播(Goedert,M.等人(2010)Trends Neurosci.[神經科學趨勢]33，317-325；Sigurdsson,E.M.等人(2002)Trends Mol.Med.[分子醫學趨勢]8，411-413)。
II. τ蛋白種類
τ蛋白可以充當內-病原體的發現已經引發出關於“病原性種類”的研究，可以在潛在的介入療法中靶向該等種類。
該微管相關蛋白τ基因(MAPT)位於人類基因組17號染色體上並且在成人腦中表現τ蛋白的六種亞型。該等亞型產生自MAPT基因內的16個外顯子的外顯子2、3以及10的可變剪接。外顯子2和3表現29個胺基酸重複，並且外顯子10表現另外的微管結合結構域。結果係τ蛋白亞型將包含0、1或2個N-末端重複以及3個或4個C-末端微管結合結構域(3R或4R τ蛋白)。通常τ蛋白的六種亞型被表現。最長的(2N4R)和最短的(0N3R)亞型分別由441和352個胺基酸組成(Kolarova,M.等人(2012)Int.J.Alzheimers.Dis.[阿茲海默症國際雜誌]2012，731526)。τ蛋白(2N4R)的N-末端突出結構域由富含甘胺酸尾的44個胺基酸組成，並且殘基45-102包括兩個高度酸性區域(N1、N2-結構域)。兩個富含脯胺酸的區域發現於殘基151-243處(P1、P2構域)。該蛋白的剩餘部分係由四個微管結合結構域(R1-R4)、隨後為短C-末端區域構成。
τ蛋白係易溶的並且是高度磷酸化不穩定蛋白。在τ蛋白的最長亞型中大約20%或85個胺基酸殘基係潛在的(Ser、Thr或Tyr)磷酸化位點。該等中大約有一半已經在實驗中觀察到係磷酸化的(Hanger,D.P.等人(2009)Trends Mol.Med.[分子醫學趨勢]15，112-119；Hasegawa,M.等人(1992)J.Biol.Chem.[生物化學雜誌]267，17047-17054)，並且該等磷酸化位點在微管結合結構域的末端殘基周圍聚簇。τ蛋白在細胞週期期間係動態地磷酸化和去磷酸化。它必須從微管解離以允許有絲***發生。它在有絲***後細胞(分化神經元)中的主要作用係充當微管穩定劑，從而允 許最佳軸突運輸。它可以按其主要的去磷酸化形式僅與微管關聯，由此磷酸化充當神經元內的直接微管關聯/解離開關。在正常條件下，胞質τ蛋白平均包含兩個磷酸化位點。在配對螺旋絲狀材料中，至少7-8個位點被磷酸化(Hanger,D.P.等人(2009)Trends Mol.Med.[分子醫學趨勢]15，112-119；Hasegawa,M.等人(1992)J.Biol.Chem.[生物化學雜誌]267，17047-17054)。過度磷酸化配對螺旋絲狀τ蛋白係阿茲海默症的關鍵標誌(Kosik等人(1986)PNAS，86，4044-4048)，在對人類AD腦材料的免疫細胞化學分析中觀察到過度磷酸化τ蛋白的不同的遷移性變動。
已經難於用反映其元穩定性質的傳統結構技術(像x射線晶體學或NMR光譜法)來研究τ蛋白。已經主要對非磷酸化τ蛋白的結構域片段進行了此類研究。迄今為止，使用NMR光譜學對全長τ蛋白(2N4R)的僅結構研究揭示了該蛋白質僅包含穩定的二級結構的稀少延展(Mukrasch,M.D.等人(2009)PLoS.Biol.[科學公共庫生物學]7，e34)。此分析指示肽骨架的二級結構具有適於β-片層結構的大的傾向。與包括微管結合結構域的C-末端相比，該骨架的前200個殘基係顯著更有序的。在溶液中在該蛋白內許多特異性的長程相互作用的存在指示它存在於非常無序的熔融球狀狀態中(Ohgushi,M.和Wada,A.(1983)FEBS Lett.[FEBS快報]164，21-24)。
具體地由半胱天冬酶和鈣蛋白酶產生的τ蛋白的蛋白酶產物(Asp13、Glu391和Asp421)已經在纏結材料中得以鑒定(Gamblin,T.C.等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美國科學院院刊]100，10032-10037)。特別地，已經使用τ蛋白C3抗體(其結合至游離Asp421末端)詳細研究了在Asp421處的截短。該截短已經被推測為AD發病機理 中的與細胞凋亡誘導相關聯的早期事件(deCalignon A.等人(2010)Nature[自然]464，1201-1204)。在Asp13處的N-末端切割和在Glu391處的C-末端切割被認為是該發病機理中的晚期事件(deCalignon A.等人(2010)Nature[自然]464，1201-1204；Delobel,P.等人(2008)Am.J.Pathol.[美國病理學雜誌]172，123-131)。最近，在來自AD和PSP患者的CSF中鑒定出另外的N-末端片段(殘基1-224)，並且已經被假設為疾病的早期標記並且具體是病原性的(US 14/092539；Bright,J.等人(2014)Neurobiol.Ageing[老化神經生物學]，1-17)。類似的鈣蛋白酶切割片段由其他團隊進行了報導(Ferreira,A.和Bigio,E.H.(2011)Mol.Med.[分子醫學]17，676-685；Reinecke,J.B.等人(2011)PLoS.One.6，e23865)。
除過度磷酸化和τ蛋白片段化之外，已經提出翻譯後乙醯化(Cohen,T.J.等人(2011)Nat.Commun.[自然通訊]2，252；Min,S.W.等人(2010)Neuron[神經元]67，953-966)和O-GlcN醯化(Zhu,Y.等人(2014)J.Biol.Chem.[生物化學雜誌])係限定了與AD相關聯的纏結病變形成過程中的病變。
III. τ蛋白免疫療法
免疫療法傳統上分為被動和主動疫苗方法。在主動疫苗方法中，將病原性藥劑或其滅活的病原形式注入患者，並且免疫系統引發免疫應答。這觸發了B細胞的成熟，產生針對給予的抗原的高親和力抗體或細胞響應。在被動疫苗方法中，藉由輸注針對抗原的特異性抗體來避免觸發免疫系統。固有清除系統然後去除結合抗體的配位基。
AC免疫正在追尋針對τ蛋白的磷酸化絲胺酸409的小鼠單 株抗體。將抗體針對人類AD和對照腦組織進行特徵概括，並且基於它們識別纏結病變的能力來選擇該等抗體。人源化形式的兩種抗體，hACI-36-2B6-Ab1和hACI-36-3A8-Ab1，均結合至胺基酸401-418內的τ蛋白表位(WO 2013/151762)。
Roger Nitschd的團隊已經從不具有退行性τ蛋白病變的體征的老年健康個體中分離了τ蛋白自身抗體。已經使用全長重組人類τ蛋白(2N4R)以發現τ蛋白特異性抗體而分離出多種抗體。然後，將該等針對其區分來自患病和健康個體的τ蛋白分離物的能力來進行篩選。三種領先抗體，4E4、4A3和24B2，已經描述於專利文獻(WO 2012049570；US 2012087861)中。它們的表位作圖指示所有均識別微管結合區內的以及C-末端到微管結合區的胺基酸(從位置V339到K369)。該等抗體未展現出任何磷酸化-特異性。
C2N診斷主要聚焦在用於早期檢測神經退行性疾病的發育診斷工具上。產生針對全長人類和小鼠τ蛋白的抗體。分別鑒定了識別人類和小鼠τ蛋白的八種和五種抗體(Yanamandra,K.等人(2013)Neuron[神經元]80，402-414)。選擇三種具有不同結合動力學的抗體用於體內評價。即，分別識別τ蛋白殘基306-320、7-13和25-30的HJ9.3、HJ9.4和HJ8.5，其中最後一個(HJ8.5)係特異性針對人類τ蛋白的。在τ蛋白跨細胞傳播的獨創性機理報導測定中，還基於該等抗體防止病變轉移的能力來對該等抗體進行選擇(Sanders,D.W.等人(2014)Neuron[神經元]82，1271-1288；Kfoury,N.等人(2012)J.Biol.Chem.[生物化學雜誌]287，19440-19451)。在P301S轉基因小鼠中的慢性i.c.v.注射研究中，對它們的評價證明了它們能夠 降低過度磷酸化τ蛋白的水平，如在對經處理小鼠的免疫組織化學分析中所確定。
起初將Peter Davies的抗體開發作為診斷工具，該診斷工具可以在AD和對照腦材料中的病理性和正常τ蛋白之間區分(Greenberg,S.G.和Davies,P.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美國國家科學院院刊]87，5827-5831)。在P301S和JPNL3(P301L)中證明了PHF1和MC1抗體的治療效用的評價(Boutajangout,A.等人(2011)J.Neurochem.[神經化學雜誌]118，658-667；Chai,X.等人(2011)J.Biol.Chem.[生物化學雜誌]286，34457-34467；D'Abramo,C.等人(2013)PLoS.One.8，e62402小鼠)。PHF1識別線性磷酸化τ蛋白表位(pS396、pS404)，而MC1係構象-依賴性抗體，其需要線性序列的兩個不同部分(即在殘基46-202內的表位和在殘基312-342之間的C末端表位)來識別結構性τ蛋白表位(Jicha,G.A.等人(1997)J.Neurosci.Res.[神經科學研究雜誌]48，128-132)。在慢性12-13週免疫研究中，這兩種抗體的注射導致脊髓病變的和在其他腦區域中的腦幹病變的實質性減少，該等轉化為該等小鼠中觀察到的運動缺陷的衰減(D'Abramo,C.等人(2013)PLoS.One.8，e62402)。
iPerian/百時美施貴寶(Bristol Meyers Squibb)公司已經開發了針對推測的病理性τ蛋白種類(由τ蛋白的N-末端片段(e τ蛋白：殘基1-224)構成)的τ蛋白抗體，該病理性τ蛋白種類促進了在基於誘導性多能幹細胞的神經元培養物中的過度活性。已經開發了一系列抗體，但表徵已經聚焦於識別殘基9-18內的N末端表位的抗體IPN001和IPN002上。相應地，該等抗體檢測到來自分期AD和PSP患者的CSF中升高的τ 蛋白水平，這可以是疾病的早期體征。在JPNL3小鼠(P301L)中體內注射抗體導致漸進性運動缺陷的部分逆轉(US 14/092539)。
Einar Sigurdsson報導了基於τ蛋白的免疫療法的功效的第一個程式。將由τ蛋白的肽379-408[pS396、pS404]組成的主動疫苗連同Adju-Phos佐劑一起用於免疫JPNL3(P301L)小鼠。在該研究中，當與對照動物相比時，在經疫苗處理的小鼠中觀察到τ蛋白病變的顯著降低。也檢測到τ蛋白相關的運動表現型的衰減。其功效在不同的不是由突變體τ蛋白驅動的小鼠模型(h τ/PS1)中得以確認(Boutajangout,A.等人(2011)AAIC 2011(7，發行4，增補版)p.s480-s431；Congdon,E.E.等人(2013)J.Biol.Chem.[生物化學雜誌]288，35452-35465；Gu,J.等人(2013)J.Biol.Chem.[生物化學雜誌]288，33081-33095)。
Prothena已經評價了在K369I(K3)轉基因τ蛋白小鼠和P301L小鼠模型中的三種τ蛋白抗體。選擇具有不同特性的抗體用於體內評價。將具有不同同種型的兩種pS404-特異性抗體(IgG1/k和IgG2a/k)或總(全)抗τ蛋白抗體(IgG1/k)以慢性模式注射。將K369I小鼠每週採用注射處理，持續21週，在3週齡時開始；並且將P301L小鼠每週採用注射處理，持續7個月，在4月齡時開始。在採用IgG2a/k pS404抗體的K3小鼠中觀察到τ蛋白陽性神經原纖維內含物的減少。兩種pS404-特異性抗體均能降低pS422-陽性τ蛋白的水平，然而在經全τ蛋白抗體處理的小鼠中沒有觀察到減少。該等研究表明：1)τ蛋白清除可以是抗體同種型-依賴性的；並且2)重要的是其靶向與疾病相關的τ蛋白種類，因為總-抗τ蛋白抗體不能減少過度磷酸化的τ蛋白(PCT/US2014/025044)。
本發明的諸位發明人出人意料地發現針對磷酸化τ蛋白絲胺酸殘基396(pS396)的特異性抗體在疾病模型中是有效的；所述抗體與先前技術的抗體相比，其主要識別在396和404殘基處磷酸化、僅在404殘基處磷酸化或在其他殘基處磷酸化的τ蛋白。
諸位發明人已經開發了另外對人類病理性τ蛋白具有顯著特異性和選擇性的抗體。與WO 2013/050567的抗體(參見WO 2013/050567的圖1)相比較，本發明的該等抗體顯示出超過非病理性τ蛋白的對人類病理性τ蛋白非常高程度的特異性和選擇性。被報導為具有特異性結合的、WO 2012/045882的抗體係從τ蛋白胺基酸393-401、396-401、394-400和393-400的6至9殘基胺基酸序列引發的。這與本發明的抗體形成對比，本發明的抗體係針對包含如在此所述的更長胺基酸序列的病原性過度磷酸化τ蛋白引發的。
此外，本發明的抗體及其表位結合片段示出許多有利特徵，例如能夠在病理性和非病理性人類τ蛋白之間區分，並且特別是能夠結合與阿茲海默氏(AD)病理學相關聯的τ蛋白。在電生理研究中，本發明的抗體及其表位結合片段另外還能夠逆轉降低的配對脈衝易化以及自發微小興奮性突觸電流(mEPSC)。
本發明涉及單株抗體及其表位結合片段，能夠特異性地結合至人類(2N4R同種型)τ蛋白(SEQ ID NO：1)的磷酸化殘基絲胺酸396。該等抗體被進一步表徵為它們在磷酸化殘基396和404之間區分的能力，使得它們基本上不結合磷酸化404殘基。
本發明的該等抗體在非病理性但磷酸化的τ蛋白的存在下對於病理性τ蛋白具有選擇性。在正常τ蛋白存在下，本發明的該等抗體能夠選擇性地耗減病理性τ蛋白的τ蛋白纏結。不受具體理論的束縛，認為τ蛋白(包含在τ蛋白位置396處已經磷酸化的τ蛋白)的纏結耗減會防止將病理性τ蛋白接種到τ蛋白纏結中。因此，本發明的一個方面涉及一種抗體，該抗體能夠選擇性地結合至396-磷酸化τ蛋白，甚至當此類分子係在τ蛋白位置404處已經磷酸化的τ蛋白的存在下時。本發明的相關方面涉及一種抗體，該抗體能夠選擇性地結合至396-磷酸化τ蛋白，甚至當此類分子係在非病原性τ蛋白的存在下時。另外定義，本發明涉及一種針對病理性τ蛋白具有選擇性的抗體，所述病理性τ蛋白係過度磷酸化τ蛋白，其在過表現τ蛋白的人類2N4R亞型的轉基因小鼠中作為64kDa條帶出現(藉由西方墨點法分析)。
本發明的一個方面係針對抗τ蛋白抗體，該抗體與來自轉基因小鼠的經免疫耗減的rTg4510提取物一起使用時，其特異性地將過度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa條帶減少至少90%，同時沒有將55kDa τ蛋白條帶減少多於10%。本發明的另外的方面係針對抗τ蛋白抗體，該抗體特異性地將過度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa條帶減少至少90%，同時沒有將55kDa τ蛋白條帶減少多於10%；或者當如在此描述的與來自人類AD屍體解剖後腦的提取物一起使用時，特異性地將pS396過度磷酸化τ蛋白條帶減少至少90%，同時沒有將非過度磷酸化τ蛋白條帶減少多於10%。
本發明的另一個方面係針對一種治療患有τ蛋白病變(例如阿茲海默症)的患者之方法，該方法包括耗減纏結或衰減所述纏結的進 展，所述纏結包括過度磷酸化τ蛋白，所述方法包括使過度磷酸化τ蛋白與本發明之抗體接觸，以使得該纏結被耗減，其過度磷酸化τ蛋白的含量得以減少，或者纏結形成的進展得以衰減。
可替代地定義的，本發明涉及一種治療患有τ蛋白病變(例如阿茲海默症)的患者之方法，所述方法包括使纏結與對具有磷酸化殘基396的τ蛋白具有選擇性的抗體接觸，這樣使得纏結耗減過度磷酸化τ蛋白。
本發明的一個方面針對結合至過度磷酸化人類τ蛋白的單株抗體或其表位結合片段，其包括：(a)輕鏈CDR1，其包括選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：34；SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36；SEQ ID NO：37；SEQ ID NO：38；SEQ ID NO：40；和SEQ ID NO：46；(b)輕鏈CDR2，其包括SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：41；和SEQ ID NO：47的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其包括SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：42；和SEQ ID NO：48的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其包括SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：43；SEQ ID NO：49；SEQ ID NO：52；和SEQ ID NO：55的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其包括選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：44；SEQ ID NO：50；SEQ ID NO：53；和SEQ ID NO：56；以及 (f)重鏈CDR3，其包括選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：45；SEQ ID NO：51；SEQ ID NO：54；和SEQ ID NO：57。
本發明的一個方面針對結合至過度磷酸化人類τ蛋白的單株抗體或其表位結合片段，其包括：(a)選自下組的輕鏈，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23；以及(b)選自下組的重鏈，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：26；和SEQ ID NO：27。
本發明的一個另外的方面針對結合至過度磷酸化人類τ蛋白的單株抗體或其表位結合片段，其包括：(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
本發明的一個有趣的方面針對結合至過度磷酸化人類τ蛋白的單株抗體或其表位結合片段，其包括：(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：31的胺基酸序列； (b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
本發明的一個有趣的方面針對結合至過度磷酸化人類τ蛋白的單株抗體或其表位結合片段，其包括：(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：31的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；以及(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列。
本發明的抗體及其表位結合片段，可以用於治療τ蛋白病變，例如阿茲海默症(AD)、嗜銀顆粒失智(AGD)、進行性核上性麻痹(PSP)、皮質基底節變性(CBD)、TBI(輕度、急性或慢性創傷性腦損傷)、以及慢性創傷性腦病(CTE)。
本發明的抗體及其表位結合片段另外預期用於治療精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病，以及因AD 導致的情感冷漠或患有AD的患者中的情感冷漠。
圖1.使用人源化C10-2和變體(C10-2_N32S和C10-2_N32S_A101T)針對捕獲的AD-P3的液相抑制測定。如在實例3A中的描述，研究了由P396-特異性抗體hC10-2(正方形)、hC10-2_N32S(黑色圓)和hC10-2_N332_A101T(空心圓)捕獲的AD-P3的濃度依賴性抑制。將AD-P3級分在室溫下(r/t)，用漸增濃度的抗體(0-1000nM)培養60分鐘，隨後用固定在96孔板上的200ng/ml小鼠C10-2抗體進行培養。將捕獲的AD-P3抗原用硫標記的抗總τ蛋白抗體(MSD)進行檢測。
將hC10-2_N32S(黑色圓)和hC10-2_N332_A101T(空心圓)抗體的IC50分別計算為44nM和14nM。當比較圖1的曲線時可以看出這係比hC10-2顯著的改進。因此，在本發明的一個方面中，該等抗體在本文描述的液相抑制測定中抑制AD-P3，這樣使得在針對AD-P3捕獲的基於液相抑制測定的抗體的100nM或更少的濃度下，該信號減少了50%。
圖2.肽抑制測定說明了hC10-2及相關的變體的表觀親和力。如在實例3B中的描述，用抗體hC10-2(正方形)、hC10-2_N32S(黑色圓)和hC10-2_N32_A101T(空心圓)來研究在液相溶液中的抗體結合至P τ蛋白386-408(pS396)肽的濃度依賴性抑制。在r/t下，將該抗體用漸增濃度(0-10000nM)的P τ蛋白386-408(pS396)以1ng/ml預培養60分鐘，隨後在包被100ng/ml P τ蛋白386-408(pS396/pS404)的孔中進行培養。用硫標記抗人類IgG抗體(MSD)檢測結合良好的抗體。
從圖2可以看出，基於表觀親和力研究，使用具有P τ蛋白 (P396)386-408的液相溶液，抗體hC-10.2(IC50=24nM)、抗體hC10.2_N32S(IC50=50nM)和抗體hC10.2_N32S、A101T(IC50=34nM)具有小於100nM，並且甚至小於60nM的IC50。
圖3(圖A-Z和AA-AG).在來自患有AD的供體的屍體解剖後腦中和在rTg4510小鼠腦中的病理性τ蛋白的免疫組織化學檢測。如在實例4中的描述，在來自3種不同的AD供體的前額葉皮質中，將hC10-2、hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T標記為神經纖維纏結、神經氈線(neuropil thread)和營養不良性神經突。用最高濃度的抗體來檢測最強的染色強度。對照腦切片缺少免疫反應性。將在患有晚期病變的rTg4510腦中的所有的3種抗體標記磷酸化τ蛋白。
染色從hC10-2向hC10-2_N32S並且向hC10-2_N32S_A101T加重。用hC10-2_N32S_A101T、然後用hC10-2_N32S，再然後用hC10-2檢測最強的染色強度。hC10-2_N32S_A101T和hC10-2_N32S在低至100ng/mL的濃度下，進行在阿茲海默症腦中的病理性τ蛋白的免疫組織化學檢測。
圖4(圖A-F).在用hC10-2處理的rTg4510小鼠中τ蛋白結構的修飾。將hC10.2靜脈內給予(圖A、C、E和F代表rTg4510；圖B和D代表tTA)該小鼠接受在80mg/kg濃度下150μL體積的hC10-2抗體的單次注射。3天后根據在實例5中描述的方法取腦片。hC10-2特異性地標記在rTg4510腦中的海馬體和皮質中的體內靶標結構，而非在對照tTA腦中進行標記。針對AlexaFluor488和Hoechst信號的成對的圖像在海馬體切片中示出。
圖5(圖A-F).在用hC10-2_N32S處理的rTg4510小鼠中 τ蛋白結構的修飾。(圖A、C和E代表rTg4510；圖B、D和F代表tTA)該小鼠接受在80mg/kg濃度下150μL體積的hC10-2_N32S抗體的單次注射。3天后根據在實例5中描述的方法取腦片。hC10-2_N32S特異性地標記在rTg4510腦中的海馬體和皮質中的體內靶標結構，而非在對照tTA腦中進行標記。針對AlexaFluor488和Hoechst信號的成對的圖像在海馬體切片中示出。
圖6(圖A-F).rTg4510小鼠中τ蛋白結構的修飾，隨後進行hC10-2_N32S_A101T的靜脈內注射(圖A、C和E代表rTg4510；圖B、D和F代表tTA)該小鼠接受在80mg/kg濃度下150μL體積的hC10-2_N32S_A101T抗體的單次注射。3天后根據在實例5中描述的方法取腦片。hC10-2_N32S_A101T特異性地標記在rTg4510腦中的海馬體和皮質中的體內靶標結構，而非在對照tTA腦中進行標記。針對AlexaFluor488和Hoechst信號的成對的圖像在海馬體切片中示出。
比較圖4-6表明，hC10.2、hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T在靜脈注射後穿過血腦障壁。該等圖進一步表明，相比hC10-2，hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T標記τ蛋白結構(對τ蛋白纏結的免疫反應性)，具有改進結果的海馬體和皮質。
圖7(圖A-D).由患有阿茲海默症(AD)的腦中的pS396特異性抗體識別的τ蛋白種類。如在實例6中的描述，在AD腦切片中，τ蛋白纏結由E1和p396抗體共同標記，或對於單獨pS396抗體係陽性(箭頭)的。藉由螢光顯微鏡檢術分析該等切片。許多τ蛋白纏結係僅由hC10-2和hC10-2_N32S_A101T抗體(箭頭)標記的。給定的血影纏結沒有被N-端 τ蛋白抗體染色，由單獨的hC10-2或hC10-2_N32S_A101T抗體標記的τ蛋白重鏈很可能代表細胞外的血影纏結。
圖8A-8C.藉由西方墨點法檢測病理性τ蛋白。如在實例6部分“藉由西方墨點法檢測病理性τ蛋白”中的描述，藉由西方墨點法檢測具有hC10.2、hC10-2_N32S、hC10-2_N32S_A101T的病理性τ蛋白。從在32週齡安樂死的三隻rTg4510小鼠和非轉基因的(非tg)對照同窩仔中收集前腦，並且從四隻AD小鼠和四隻健康的對照(HC)供體中收集皮質標本，分別將其分級為可溶性(S1)、TBS-可溶性沈澱(S1p)和肌胺醯不可溶性(P3)級分，並且藉由西方墨點法針對在pS396表位處的磷酸化τ蛋白，用1μg/ml hC10.2(A)、hC10-2_N32S(B)、hC10-2_N32S_A101T(C)進行分析。在rTg4510中，正常人類4R0N τ蛋白顯示為55kDa，而過度磷酸化τ蛋白種類顯示為64kDa和70kDa。在AD中，過度磷酸化τ蛋白種類顯示為具有可變數的AD典型塗片的54kDa、64kDa、69kDa和74kDa四個條帶。
相比於非轉基因小鼠，針對rTg4510小鼠的τ蛋白，以及相比於健康的對照供體，針對AD供體，每個hC10-2、hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T係可選擇性的。此外，相比於正常rTg4510小鼠的τ蛋白55kDa蛋白，在可溶性(S1)、TBS-可溶性沈澱(S1p)和肌胺醯不可溶性(P3)級分中，每個hC10-2、hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T對於rTg4510小鼠的病原性τ蛋白64kDa蛋白係選擇性的。
圖9.來自AD腦的τ蛋白的免疫沈澱反應。如在實例6部分“病理性τ蛋白的免疫沈澱反應”中的描述，具有10μg hC10.2、 hC10-2_N32S、hC10-2_N32S_A101T的τ蛋白的免疫沈澱反應，使用來自從四個AD和健康對照(HC)供體中收集的皮質的腦勻漿物的500μg預澄清的裂解物的人類IgG1對照(hIgG1)，藉由西方墨點法，用多株兔子抗pS396 τ蛋白(pS396 τ蛋白)抗體進行分析。在AD中，過度磷酸化τ蛋白種類顯示為具有可變數的AD典型塗片的54kDa、64kDa、69kDa、和74kDa四個條帶。
圖10A-C藉由Cisbio測定的τ蛋白聚集的定量。野生型(Wt)接種材料(WW)顯示出無接種並且從所有接種的樣品中減去背景信號。將Tg4510勻漿物有效地接種，並且該接種效果沒有被用B12的處理影響，但是被在20μg/mL的濃度下，用本發明的τ蛋白抗體(hC10-2_N32S_A101T>hC10-2_N32S>hC10-2)進行的接種研究處理影響至不同的程度。代表四個獨立實驗組的結果的圖，並且將其繪製為相對的τ蛋白聚集(超出針對總蛋白歸一化的背景的信號倍數)，並且相對的不可溶性p396 τ蛋白係藉由triton-X不可溶性級分(超過歸一化背景的信號倍數)的西方墨點法的密度測定法進行定量的。將所有的樣品歸一化為同種型對照抗體B12。圖10B-10C代表藉由Cisbio測定的τ蛋白聚集的定量。接種的pcDNA HEK293細胞沒有顯示信號，確認了不存在用於輸入接種材料的檢測。Wt(野生型)接種材料(WW)沒有示出接種，但相比之下與未接種的相比，rTg4510勻漿(CC)有效地接種。這種接種效應不受用HEL處理的影響，但部分地藉由用τ蛋白抗體(C10-2>D1.2>hACI36-2B6-Ab1)處理而逆轉。代表三組獨立樣品的圖，並且將其繪製為相對的τ蛋白聚集(超出針對總蛋白歸一化的背景的信號倍數)。實例6，“細胞和聚集測定”部分描述了以下方案。
圖11.使用不同量的hC10-2和2.10.3抗體，AD腦提取物的免疫耗減後τ 5西方墨點法信號的定量。如在實例7中的描述，兩種抗體均確實從阿茲海默氏腦提取物去除了小部分的總τ蛋白。
圖12.使用不同量的hC10-2(方塊)和2.10.3(三角)抗體，AD腦提取物免疫耗減後P-S422 τ蛋白西方墨點法信號的定量。該圖示出了來自實例7的結果。藉由免疫耗減，使用hC10-2或2.10.3，可以將在絲胺酸422處磷酸化的τ蛋白從AD腦提取物中有效地去除。兩種抗體確實去除了多於90% P-S422 τ蛋白，儘管需要更多的2.10.3抗體才能達到該相同的效果。
圖13.使用不同量的hC10-2和2.10.3抗體，AD腦提取物免疫耗減後pS396 τ蛋白西方墨點法信號的定量。該圖示出了來自實例7的結果。hC10-2免疫耗減從AD腦提取物中去除了88%的在絲胺酸396處磷酸化的τ蛋白，然而2.10.3僅去除了55%的pS396 τ蛋白。
圖14.使用不同量的hC10-2和2.10.3抗體，AD腦提取物免疫耗減後P-S199/202 τ蛋白西方墨點法信號的定量。該圖示出了來自實例7的結果。該hC10-2免疫耗減清除了69%的在絲胺酸199/202處磷酸化的τ蛋白。該2.10.3抗體沒有給出相同的劑量依賴性降低。
圖15.免疫耗減之前和之後在西方墨點法上的阿茲海默症腦提取物。該圖示出了來自實例7的結果。存在在絲胺酸396處的25kDa磷酸化的τ蛋白片段。使用hC10-2的免疫耗減導致該25kDa τ蛋白條帶的降低。這2種其他的磷酸化特異性抗體2.10.3和AT8沒有去除該25kDa種類。
圖16.使用不同量的hC10-2變體N32S、N32Q、N32S_A101T、N32Q_A101T、N32Q_D55E和N32S_D55E，免疫耗減AD腦提取物後，pS396 τ蛋白西方墨點法信號的定量。如可以從實例8中得出結論，本發明的抗體從AD腦勻漿物中去除在絲胺酸396處的磷酸化的τ蛋白的能力係顯著的。在小於0.1μg的抗體(在75ng處的數據點)的情況下，該等變體導致pS396信號減少至少28%(除了N32Q，D55E，其減少16%)，然而該C10.2導致了pS396信號的減少低於6%。
圖17(圖A-D).由注射AD腦提取物導致的τ蛋白纏結該海馬體的接種。如在實例8a中進行，以15mg/kg的劑量，該mC10-2處理顯著地將在接種的海馬體中的纏結病變降低了57%(P<0.05)。存在明顯的趨勢表明hC10-2還降低病變。藉由對比，2.10.3沒有顯示出在相同劑量下的效果。
圖18.殘基P-Ser396和Tyr394在該抗原結合位點的中心處
示出了Ile(392)-Val(393)-Tyr(394)-Lys(395)-pSer(396)-Pro(397)-Val(398)的結構。與本發明的抗體的主要相互作用涉及疏水口袋，τ蛋白肽的pSer396和Y394。形成了廣泛氫鍵網路，並且存在具有pSer396的膦酸酯的Y(394)側鏈與骨架之間的電荷/極性相互作用。本發明的抗體的HC CDR1包括迴文的8-殘基基序極性AA-疏水的AA-極性的AA-帶電荷的AA-帶電荷的AA-極性的AA-疏水的AA-極性的AA(Thr- Phe- Thr-Asp- Arg- Thr-Ile-His)。該等帶電荷的殘基藉由由抗體和τ蛋白之間的氫鍵、電荷/電荷以及電荷/極性相互作用形成的廣泛鍵合網路進行相互作用。
圖19.在處理範例中的抗體療效
如在實例8b中進行，將表現h τ-P301L的HEK293細胞用Tg4510勻漿物接種，用指示的抗體預培養，胰蛋白酶化，並且再次接種24小時後(再次添加抗體)，並且接種後48小時將其收穫。使用Cisbio τ蛋白聚集，針對聚集的τ蛋白，將總細胞勻漿物進行探測。數據係4個獨立的生物學重複+/- S.E.M.彙集的數據，歸一化為CC+B12(tg4510)。
將表現P301L-h τ蛋白的細胞用40μg Tg4510腦勻漿(總蛋白)接種，在4℃下，用抗體(20μg/ml
Figure 106123060-A0202-12-0023-152
133nM)/6孔預培養過夜。用CC+B12接種給出較大的接種反應。hC10.2對聚集具有大約40%的影響，所有其他的抗體顯示出與hC10.2至少相當的效果。特別地，hC10.2的N32S和N32S_A101T變體在降低聚集的τ蛋白方面示出了強45%和62%的效果。相比hC10.2，該N32S_A101T變體示出了對聚集顯著更強的效果。該圖表明人源化的C10.2在結合τ蛋白誘導接種方面係有效的，但是N32S的添加，並且特別是N32S和A101T雙突變的添加增加了該mAb的中和活性。
圖20.在脅迫條件下該等變體的去醯胺研究
如在實例8c中進行，藉由LC-MS分析胰蛋白酶肽LC：T2[VTMTCQASQDTSIXLNWFQQKPGK；SEQ ID NO：58]來監測在VL鏈的位置32或34處的Asn殘基的去醯胺作用。X係在圖20中指明的在各自的變體中的Asn、Gln或Ser。該MS分析允許去醯胺肽與非去醯胺肽的相對含量的計算。在WT、A101T和D55E變體中，在LC：T2肽處觀察到廣泛的去醯胺作用。同樣清楚的是，將Asn32轉變為Gln或Ser完全抑制在其他Asn34殘基處的肽的去醯胺作用。同樣我們沒有檢測該Gln32變體的任何去醯胺作用。用該Asn34的變體觀察到相似的結果。
圖21由τ蛋白抗體，在皮質神經元中τ蛋白接種和聚集的降低
來自rTg4510小鼠胚胎的皮質神經元培養物中的τ蛋白接種和聚集係由來自40週齡rTg4510小鼠的P3或S1p級分的由0.2ng病理性τ蛋白誘導的，並且藉由該Cisbio τ蛋白聚集測定進行測量。在7天的培養物(DIV)中，將神經元用P3或S1p和10μg抗體或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)的混合物進行處理。在DIV11下，進行完全培養基更換，以去除殘餘物P3和S1p種子以及抗體。允許τ蛋白接種再持續4天，並且在DIV15處裂解神經元，以測量τ蛋白接種和聚集。PBS和人類對照IgG抗體(IgG con ab)不影響τ蛋白接種和聚集。藉由用τ蛋白抗體(hC10.2_A101T_N32S>hC10.2_N32S>hC10.2)進行處理，將τ蛋白接種和聚集部分逆轉。測量以下τ蛋白接種和聚集的降低：hC10.2降低了23%、hC10.2_N32S降低了41%-53%、並且hC10.2_A101T_N32S降低了48%-60%。該等柱狀圖代表來自τ蛋白聚集歸一化為神經元蛋白作為平均值±SD的兩個獨立實驗的數據。單因素方差分析Newman-Keuls多重比較測驗(One way ANOVA Newman-Keuls Multiple Comparison Test)(PBS/IgG con ab對比hC10.2、hC10.2_N32S、hC10.2_A101T_N32S，***p<0.001；hC10.2對比hC10.2_N32S、hC10.2_A101T_N32S，###p<0.001)。
圖22在rTg4510小鼠中τ蛋白結構的劑量依賴性修飾，隨後進行hC10-2_N32S的靜脈內注射。
hC10-2_N32S特異性地標記在rTg4510腦中的海馬體和皮質中的體內靶標結構。示出了來自扣帶皮質的圖像。最強的信號在20mg/kg和80mg/kg 處，弱信號在8mg/kg處，在0.8mg/kg處無可見信號。
圖23在海馬體中接種的τ蛋白病變
藉由hC10-2、hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T處理，在接種的海馬體中具有Gallyas纏結染色的細胞數目降低了50%、48%以及47%。在覆蓋背部海馬體的每6個切片中進行定量，每個動物共使用8個切片。細胞數反映了在8個切片中鑒定的海馬體的所有亞區中陽性細胞的總和。使用單因素方差分析和Dunnett的多重比較檢驗分析該數據。
藉由引用結合的序列
SEQ ID NO：1 人類τ蛋白(2N4R)
SEQ ID NO：2 τ蛋白殘基386-408(pS396，pS404)
SEQ ID NO：3 C10-2輕鏈CDR1
SEQ ID NO：4 C10-2輕鏈CDR2
SEQ ID NO：5 C10-2輕鏈CDR3
SEQ ID NO：6 C10-2重鏈CDR1
SEQ ID NO：7 C10-2重鏈CDR2
SEQ ID NO：8 C10-2重鏈CDR3
SEQ ID NO：9 小鼠C10-2輕鏈
SEQ ID NO：10 小鼠C10-2重鏈
SEQ ID NO：11 人源化的C10-2重鏈
SEQ ID NO：12 人源化的C10-2輕鏈
SEQ ID NO：13 人源化的C10-2重鏈變體D55E
SEQ ID NO：14 人源化的C10-2重鏈變體D55Q
SEQ ID NO：15 人源化的C10-2重鏈變體D55S
SEQ ID NO：16 人源化的C10-2輕鏈變體N32S
SEQ ID NO：17 人源化的C10-2輕鏈變體N32Q
SEQ ID NO：18 人源化的C10-2輕鏈變體N34S
SEQ ID NO：19 人源化的C10-2輕鏈變體N34Q
SEQ ID NO：20 人源化的C10-2輕鏈變體N32S，N34S
SEQ ID NO：21 人源化的C10-2輕鏈變體N32Q，N34S
SEQ ID NO：22 人源化的C10-2輕鏈變體N32Q，N34Q
SEQ ID NO：23 人源化的C10-2輕鏈變體N32S，N34Q
SEQ ID NO：24 人源化的C10-2重鏈變體A101T
SEQ ID NO：25 人源化的C10-2重鏈變體D55E，A101T
SEQ ID NO：26 人源化的C10-2重鏈變體D55Q，A101T
SEQ ID NO：27 人源化的C10-2重鏈變體D55S，A101T
SEQ ID NO：28 人源化的C10-2重鏈CDR2變體D55E
SEQ ID NO：29 人源化的C10-2重鏈CDR2變體D55Q
SEQ ID NO：30 人源化的C10-2重鏈CDR2變體D55S
SEQ ID NO：31 人源化的C10-2輕鏈CDR1變體N32S
SEQ ID NO：32 人源化的C10-2輕鏈CDR1變體N32Q
SEQ ID NO：33 人源化的C10-2輕鏈CDR1變體N34S
SEQ ID NO：34 人源化的C10-2輕鏈CDR1變體N34Q
SEQ ID NO：35 人源化的C10-2輕鏈CDR1變體N32S，N34S
SEQ ID NO：36 人源化的C10-2輕鏈CDR1變體N32Q，N34S
SEQ ID NO：37 人源化的C10-2輕鏈CDR1變體N32Q，N34Q
SEQ ID NO：38 人源化的C10-2輕鏈CDR1變體N32S，N34Q
SEQ ID NO：39 人源化的C10-2重鏈CDR3變體A101T
SEQ ID NO：40 IMGT編號人源化的C10-2輕鏈CDR1
SEQ ID NO：41 IMGT編號人源化的C10-2輕鏈CDR2
SEQ ID NO：42 IMGT編號人源化的C10-2輕鏈CDR3
SEQ ID NO：43 IMGT編號人源化的C10-2重鏈CDR1
SEQ ID NO：44 IMGT編號人源化的C10-2重鏈CDR2
SEQ ID NO：45 IMGT編號人源化的C10-2重鏈CDR3
SEQ ID NO：46 IMGT編號人源化的C10-2輕鏈CDR1變體N32S
SEQ ID NO：47 IMGT編號人源化的C10-2輕鏈CDR2變體N32S
SEQ ID NO：48 IMGT編號人源化的C10-2輕鏈CDR3變體N32S
SEQ ID NO：49 IMGT編號人源化的C10-2重鏈CDR1變體A101T
SEQ ID NO：50 IMGT編號人源化的C10-2重鏈CDR2變體A101T
SEQ ID NO：51 IMGT編號人源化的C10-2重鏈CDR3變體A101T
SEQ ID NO：52 Chotia編號人源化的C10-2重鏈CDR1
SEQ ID NO：53 Chotia編號人源化的C10-2重鏈CDR2
SEQ ID NO：54 Chotia編號人源化的C10-2重鏈CDR3
SEQ ID NO：55 Chotia編號人源化的C10-2重鏈CDR1變體A101T
SEQ ID NO：56 Chotia編號人源化的C10-2重鏈CDR2變體A101T
SEQ ID NO：57 Chotia編號人源化的C10-2重鏈CDR3變體A101T
如在此使用的，術語“τ”與“τ蛋白”係同義的，並且是指τ蛋白亞型的任一種(例如在UniProt中鑒定為P10636，1-9)。在此使用的τ蛋白的胺基酸編號係相對於如以下所示的亞型2(SEQ ID NO：1)給出的，其中甲硫胺酸(M)係胺基酸殘基1：
SEQ ID NO：1：
Figure 106123060-A0202-12-0028-203
本發明涉及抗體及其表位結合片段，它們能夠特異性地結合至τ蛋白，並且特別是人類τ蛋白，並且在一個實施方式中展現出特異性地結合至人類τ蛋白的磷酸化S396殘基(pS396)的能力。本發明的抗體及其表位結合片段進一步表徵為不能或基本上不能特異性地結合至人類τ蛋白上的磷酸化的絲胺酸404(pS404)殘基，例如在抗體限制或非飽和條件下。此外，在pS404處的磷酸化作用並不干擾特異性結合至含有表位的pS396。如在此使用的，符號“pS”和“{p}S”表示胺基酸殘基磷酸絲胺酸，並且其後的數字表示殘基相對於SEQ ID NO：1的序列的位置。如在此所使用的，如果相對於另一個表位，抗體與表位的結合係用這樣的其他表 位觀察到的結合的小於20%、小於10%、小於5%、小於2%並且更較佳的是小於1%，那麼該抗體“基本上”不能結合至該表位。
本發明上下文中的術語“抗體(Ab)”係指免疫球蛋白分子，或根據本發明的一些實施方式係指能夠特異性地結合至分子(“抗原”)的表位的免疫球蛋白分子的片段。天然存在的抗體典型地包括四聚體，它通常由至少兩條重鏈(HC)和至少兩條輕鏈(LC)構成。每條重鏈由重鏈可變結構域(在此縮寫為VH)和重鏈恒定結構域構成，重鏈恒定結構域通常由3個結構域(CH1、CH2和CH3)構成。人類重鏈可以具有任何同種型，包括IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亞型)。每條輕鏈由輕鏈可變結構域(在此縮寫為VL)和輕鏈恒定結構域(CL)構成。人類輕鏈包括κ鏈和λ鏈。重鏈和輕鏈可變結構域典型地負責抗原識別，而重鏈和輕鏈恒定結構域可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因數(包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(C1q))的結合。該VH和VL結構域可以進一步細分為高變性結構域，稱為“互補決定區”，其穿插有更保守序列的結構域(稱為“框架區”(FR))。每個VH和VL係由三個CDR結構域和四個FR結構域組成，從胺基末端到羧基末端按以下順序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。重鏈和輕鏈可變結構域含有與抗原相互作用的結合結構域。特別相關的是已經“被分離”以便存在於與它可以在自然界中存在的不同於物理環境中的或者已經被修飾以便在胺基酸序列上不同於天然存在的抗體或它們的表位結合片段的抗體及其表位結合片段。
術語“表位”意指能夠特異性地結合至抗體的抗原決定 簇。表位通常由如胺基酸或糖側鏈分子的表面基團組成，並且通常具有特定的三維結構特徵以及特定的電荷特徵。構象表位和線性表位的區別在於與前者而非後者的結合在變性溶劑的存在下常常缺失。表位可以包含直接涉及於結合中的胺基酸殘基和其他未直接涉及於結合中的胺基酸殘基，例如被特異性表位結合肽有效阻斷的胺基酸殘基(換言之，該胺基酸殘基係在特異性表位結合肽的足跡內)。
如在此所使用的，術語“抗體的表位結合片段”意指抗體的片段、部分、區域或結構域(無論它如何產生(例如，經由切割、重組、合成等))，其能夠特異性地結合至表位。表位結合片段可以含有這樣的抗體的任意1、2、3、4、5或所有6個CDR域，並且儘管能夠特異性結合到這樣的表位，仍可以展現出對不同於這樣的抗體的表位的這樣的表位的特異性、親和力或選擇性。然而，較佳的是，表位結合片段將包含這種抗體的所有6個CDR結構域。抗體的表位結合片段可以是單一多肽鏈的部分或者包括單一多肽鏈(例如scFv)，或者可以是兩個或更多個多肽鏈的部分或者包括兩個或更多個多肽鏈，各自具有胺基末端和羧基末端(例如，抗體、Fab片段、Fab2片段等)。可以獲得展現表位結合活性的抗體的片段，例如藉由完整抗體的蛋白酶切割。更較佳的是，儘管Fv片段的兩個結構域VL和VH由單獨基因或編碼這樣的基因序列的多核苷酸(例如，其編碼cDNA)天然地編碼，但是可以將這兩個結構域使用重組方法藉由柔性接頭連接，該柔性接頭使得這兩個結構域能夠成為單條蛋白鏈，在該單條蛋白鏈中VL區和VH區締合以形成單價表位結合分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如，Bird等人，(1988)Science[科學]242：423-426；和Huston等人，(1988)Proc. Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)[美國國家科學院院刊]85：5879-5883)。可替代地，藉由採用太短的柔性接頭(例如，小於約9個殘基)以使得單一多肽鏈的VL和VH結構域能夠關聯在一起，可以形成雙特異性抗體、雙體、或類似分子(其中兩個這樣的多肽鏈關聯在一起以形成二價表位結合分子)(關於雙體的說明參見例如PNAS USA 90(14)，6444-8(1993))。包含在本發明中的表位結合片段的實例包括(i)Fab'或Fab片段，即一種由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段，或如描述於WO 2007059782中的單價抗體；(ii)F(ab')2片段，包含兩個由二硫鍵在鉸鏈結構域連接的Fab片段的二價片段；(iii)Fd片段，實質上由VH和CH1結構域組成；(iv)Fv片段，實質上由VL和VH結構域組成，(v)dAb片段(Ward等人，Nature[自然]341，544-546(1989))，實質上由VH結構域組成，並且還稱為域抗體(Holt等人；Trends Biotechnol.[生物技術趨勢]2003年11月；2i(ll)：484-90)；(vi)駱駝抗體或奈米抗體(Revets等人；Expert Opin Biol Ther.[生物理論專家觀點]2005年1月；5_(l)：l ll-24)以及(vii)分離的互補決定區(CDR)。此外，雖然該Fv片段的兩個結構域VL和VH係由單獨的基因編碼，它們可以使用重組方法藉由能將所述VL和VH產生為單一蛋白鏈的合成接頭來進行連接，在所述單一蛋白鏈中VL和VH結構域配對以形成單價分子(稱為單鏈抗體或單鏈Fv(scFv)，參見例如Bird等人，Science[科學]242，423-426(1988)和Huston等人，PNAS USA[美國國家科學院院刊]85，5879-5883(1988))。在此進一步討論在本發明的背景下的該等和其他有用的抗體片段。還應理解的是，術語抗體，除非另外指明，否則還包括抗體樣多肽(例如嵌合抗體和人源化抗體)、以及保留特異性地結合至抗原的能力的抗體片段(表位結合片 段)，它們係藉由任何已知的技術提供的，例如酶切割、肽合成、以及重組技術。這樣產生的抗體可以具有任何同種型。如在此使用的，“同種型”係指由重鏈恒定結構域基因編碼的免疫球蛋白類別(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。使用熟習該項技術者已知的常規技術獲得此類抗體片段；可以針對實用性，以相同的方式容易地篩選能夠結合至所希望的表位的適合的片段，將其作為完整抗體。在一個實施方式中，本發明的抗體的Fc區包括調整效應子功能的突變。
術語“雙特異性抗體”係指包含兩個獨立表位結合片段的抗體，每個表位結合片段靶向獨立的靶標。該等靶標可以是存在於不同蛋白上的表位或者存在於相同靶標上的不同表位。可以使用親本單特異性二價抗體分子的HC的恒定結構域中的補償胺基酸變化來製備雙特異性抗體分子。所得異源二聚體抗體含有一個由兩個不同親本單特異性抗體貢獻的Fab。Fc域中的胺基酸變化導致具有隨時間穩定的雙特異性的異源二聚體抗體的穩定性增加。(Ridgway等人，Protein Engineering[蛋白質工程]9，617-621(1996)；Gunasekaran等人，JBC 285，19637-1(2010)；Moore等人，MAbs 3：6 546-557(2011)；Strop等人，JMB 420，204-219(2012)；Metz等人，Protein Engineering[蛋白質工程]25：10 571-580(2012)；Labrijn等人，PNAS 110：113，5145-5150(2013)；Spreter Von Kreudenstein等人，MAbs 5：5 646-654(2013))。雙特異性抗體還可以包括使用ScFv融合物產生的分子。然後將兩個單特異性scfv獨立地連接至能夠形成穩定異源二聚體的Fc域，以產生單個雙特異性分子(Mabry等人，PEDS 23：3 115-127(2010))。雙特異性分子具有雙重結合能力。
如在此和在圖中使用的術語“C10-2”、“人類C10-2”、“hC10-2”、“HC10-2”、“hC10.2”、“人源化的C10-2”和“人源化的C10-2”旨在意指係同義的，並且被定義為抗體C10-2。該術語旨在表示抗體或其表位結合片段，包含抗體輕鏈可變結構域或由抗體輕鏈可變結構域組成，該抗體輕鏈可變結構域具有：(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；以及抗體重鏈可變結構域，該抗體重鏈可變結構域具有：(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
抗體C10-2係人源化的抗體，其可以被定義為包括SEQ ID NO：11的重鏈、SEQ ID NO：12的輕鏈、或兩者。本發明的一個實施方式針對抗體或其表位結合片段，其包括SEQ ID NO：11的重鏈和SEQ ID NO：12的輕鏈。
如在此和在圖中使用的術語“mC10-2”旨在意指小鼠抗體C10-2，並且由SEQ ID.NO.9和10定義。小鼠抗體C10.2被用作對照抗體，並且不是本發明的一部分。
如在此和在圖中使用的，術語“hC10-2_N32S”和“C10-2_N32S”旨在意指係同義的，並且是抗體C10-2的變體，其中該輕鏈已經突變為至少包括從N至S的胺基酸殘基32的突變，並且被定義為抗體 N32S。如在此和在圖中使用的術語“hC10-2_N32Q”和“C10-2_N32Q”旨在意指係同義的，並且是抗體C10-2的變體，其中該輕鏈已經突變為至少包括從N至Q的胺基酸殘基32的突變，並且被定義為抗體N32Q。
如在此和在圖中使用的術語“hC10-2_N34S”和“C10-2_N34S”旨在意指係同義的，並且是抗體C10-2的變體，其中該輕鏈已經突變為至少包括從N至S的胺基酸殘基34的突變，並且被定義為抗體N34S。如在此和在圖中使用的術語“hC10-2_N34Q”和“C10-2_N34Q”旨在意指係同義的，並且是抗體C10-2的變體，其中該輕鏈已經突變為至少包括從N至Q的胺基酸殘基34的突變，並且被定義為抗體N34Q。
如在此和在圖中使用的術語“hC10-2_N32S_N34S”和“C10-2_N32S_N34S”旨在意指係同義的，並且是抗體C10-2的變體，其中該輕鏈已經突變為至少包括從N至S的胺基酸殘基32和34的突變，並且被定義為抗體N32S、N34S。如在此和在圖中使用的術語“hC10-2_N32Q_N34S”和“C10-2_N32Q_N34S”旨在意指係同義的，並且是抗體C10-2的變體，其中該輕鏈已經分別突變為至少包括從N至Q和從N至S的胺基酸殘基32和34的突變，並且被定義為抗體N32Q、N34S。如在此和在圖中使用的術語“hC10-2_N32Q_N34Q”和“C10-2_N32Q_N34Q”旨在意指係同義的，並且是抗體C10-2的變體，其中該輕鏈已經突變為至少包括從N至Q的胺基酸殘基32和34的突變，並且被定義為抗體N32Q、N34Q。如在此和在圖中使用的術語“hC10-2_N32S_N34Q”和“C10-2_N32S_N34Q”旨在意指係同義的，並且是抗體C10-2的變體，其中該輕鏈已經分別突變為至少包括從N至S和從N至Q的胺基酸殘基32和 34的突變，並且被定義為抗體N32S、N34Q。
如在此和在圖中使用的術語“hC10-2_D55E”和“C10-2_D55E”旨在意指係同義的，並且是抗體C10-2的變體，其中該重鏈已經突變為至少包括從D至E的胺基酸殘基55的突變，並且被定義為抗體D55E。如在此和在圖中使用的術語“hC10-2_D55Q”，“C10-2_D55Q”旨在意指係同義的，並且是抗體C10-2的變體，其中該重鏈已經突變為至少包括從D至Q的胺基酸殘基55的突變，並且被定義為抗體D55Q。如在此和在圖中使用的術語“hC10-2_D55S”，“C10-2_D55S”旨在意指係同義的，並且是抗體C10-2的變體，其中該重鏈已經突變為至少包括從D至S的胺基酸殘基55的突變，並且被定義為抗體D55S。
如在此和在圖中使用的術語“hC10-2_A101T”和“C10-2_A101T”旨在意指係同義的，並且是抗體C10-2的變體，其中該重鏈已經突變為至少包括從A至T的胺基酸殘基101的突變，並且被定義為抗體A101T。
如在此和在圖中使用的術語“hC10-2_N32S_A101T”、“C10-2_N32S_A101T”、“hC10-2_A101T_N32S”和“C10-2_A101T_N32S”旨在意指係同義的，並且是抗體C10-2的變體，其中該重鏈已經突變為至少包括從A至T的胺基酸殘基101的突變，並且其中該輕鏈已經突變為至少包括從N至S胺基酸殘基32的突變，並且被定義為抗體N32S、A101T。
如在此和在圖中使用的術語“hC10-2_N32Q_A101T”、“C10-2_N32Q_A101T”、“hC10-2_A101T_N32Q”和“C10-2_A101T_N32Q”旨在意指係同義的，並且是抗體C10-2的變體，其 中該重鏈已經突變為至少包括從A至T的胺基酸殘基101的突變，並且其中個輕鏈已經突變為至少包括從N至Q的胺基酸殘基32的突變，並且被定義為抗體N32Q、A101T。
如在此使用的術語“單株抗體”或“單株抗體組成物”係指單分子組成物的抗體分子製品。常規的單株抗體組成物表現出對特定表位的單一結合特異性和親和力。在某些實施方式中，單株抗體可以由多於一種Fab域構成，由此增加對多於一種靶標的特異性。術語“單株抗體”或“單株抗體組成物”不是旨在由任何具體產生方法(例如，重組的、轉基因、雜交瘤等)限制。
本發明的該等抗體及其表位結合片段將較佳的是“人源化”的，特別是當被採用以用於治療目的時。術語“人源化的”係指通常使用重組技術製備的具有衍生自來自非人物種的免疫球蛋白的表位結合位點和基於人免疫球蛋白的結構和/或序列的剩餘免疫球蛋白結構的分子。該表位結合位點可包括與人類恒定結構域融合的完整非人類抗體可變結構域，或者包括此類可變結構域的接枝到人類可變結構域的適當人類框架區上的僅互補決定區(CDR)或其部分。此類人源化分子的構架殘基可以是野生型的(例如，全人的)或者它們可以被修飾成包含一種或多種未在其序列已經充當人源化的基礎的人抗體中發現的胺基酸取代。人源化減小或消除該分子的恒定結構域充當人個體中的免疫原的可能性，但是仍存在對外源可變結構域做出免疫應答的可能性(LoBuglio,A.F.等人(1989)“Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man：Kinetics And Immune Response[人體內的小鼠/人嵌合單株抗體：動力學與免疫應答]”，Proc.Natl. Acad.Sci.(U.S.A.)[美國國家科學院院刊]86：4220-4224)。另一種方法不僅集中於提供人衍生的恒定結構域，還集中於修飾可變結構域以便將它們改造地盡可能接近人類形式。已知的是，重鏈和輕鏈兩者的可變結構域都含有三個互補決定區(CDR)，它們響應於所討論的抗原而改變並且決定結合能力，其側翼為四個構架區(FR)，該等構架區在給定物種中是相對保守的並且推定為CDR提供支架。當相對於特定抗原製備非人抗體時，可以藉由在有待修飾的人抗體中存在的FR上接枝衍生自非人抗體的CDR來“改造”或“人源化”可變結構域。已經由Sato,K.等人(1993)Cancer Res[癌症研究]53：851-856；Riechmann,L.等人(1988)“Reshaping Human Antibodies for Therapy[改造治療用的人抗體]”，Nature[自然]332：323-327；Verhoeyen,M.等人(1988)“Reshaping Human Antibodies：Grafting An Antilysozyme Activity[改造人抗體：接枝抗溶菌酶活性]”，Science[科學]239：1534-1536；Kettleborough,C.A.等人(1991)“Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting：The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation[藉由CDR-接枝人源化小鼠單株抗體：構架殘基在環構象中的重要性]”，Protein Engineering[蛋白質工程]4：773-3783；Maeda,H.等人(1991)“Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity[具有HIV中和活性的經改造的人抗體的構建]”，Human Antibodies Hybridoma[人抗體雜交瘤]2：124-134；Gorman,S.D.等人(1991)“Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody[改造治療用CD4抗體]”，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)[美國國家科學院院刊]88：4181-4185；Tempest,P.R.等人(1991)“Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo[改造人單株抗體以抑制體內人呼吸道合胞病毒感染]”，Bio/Technology[生物/技術]9：266-271；Co,M.S.等人(1991)“Humanized Antibodies For Antiviral Therapy[抗病毒治療用的人源化抗體]”，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)[美國國家科學院院刊]88：2869-2873；Carter,P.等人(1992)“Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy[人癌症治療用的抗p185her2抗體的人源化]”，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)[美國國家科學院院刊]89：4285-4289；以及Co,M.S.等人(1992)“Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen[對CD33抗原具有特異性的嵌合和人源化抗體]”，J.Immunol.[免疫學雜誌]148：1149-1154報導了這種方法在各種抗體中的應用。在一些實施方式中，人源化抗體保留所有CDR序列(例如，含有來自小鼠抗體的所有六個CDR的人源化小鼠抗體)。在其他實施方式中，人源化抗體具有一個或多個CDR(一個、兩個、三個、四個、五個、六個)，它們相對於原始抗體係改變的，它們還被稱為一個或多個“衍生自”來自原始抗體的一個或多個CDR的CDR。人源化抗體的能力係熟知的(參見，例如美國專利號5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,859,205；6,407,213；6,881,557)。
術語“抗體“XX”旨在表示抗體或其表位結合片段(例如抗體“C10-2”)包括：(a)輕鏈、和重鏈、重鏈可變結構域、或重鏈可變結構域CDR1-3如由其各自的SEQ ID NO定義，或(b)輕鏈可變結構域、和重鏈、重鏈可變結構域、或重鏈可變結構域CDR1-3如由其各自的SEQ ID NO定義，或(c)輕鏈可變結構域CDR1-3，如由其對應的SEQ ID NO定義，以及重鏈、重鏈可變結構域、或重鏈可變結構域CDR1-3如由其各自的SEQ ID NO定義，或由其組成。在某些實施方式中，該抗體或其表位結合片段係藉由它們的如藉由其SEQ ID NO定義的整個重鏈可變結構域以及它們的如藉由其SEQ ID NO定義的輕鏈可變結構域來定義。
除非在此另外指定，在抗體的Fc區或恒定結構域中胺基酸殘基的編號係根據EU編號系統，也成為EU索引，如在以下中描述的：Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest[具有免疫學意義的蛋白的序列]，第5版，公共衛生服務(Public Health Service)，國立衛生研究院，貝塞斯達(Bethesda)，馬里蘭州(MD)，1991。
在一些抗體中，僅需CDR的一部分(即結合所需的CDR殘基亞群，稱為SDR)在人源化抗體中保持結合。基於先前的研究，CDR殘基不接觸相關的表位，並且在SDR中不能被鑒定。例如，殘基Tyr Ser Gln Lys Phe Gln，對應於SEQ ID NO.11的HC的殘基60-65通常是不需要的，從位於Chothia超變環外的Kabat CDR區域(該等還被發現於HC CDR2(SEQ.ID.NO.7)中)(參見，Kabat等人，(1992)Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫學關注的蛋白質序列]，美國國立衛生研究院(National Institutes of Health)，公開號91-3242；Chothia,C.等人，(1987)“Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins[免疫球蛋白的超變區的典型結構]”，J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]196：901-917)中，藉由分子建模和/或根據經驗來鑒定，或者如在以下文獻中描述的來鑒定：Gonzales,N.R.等人(2004)“SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity[使用多種人類種系範本進行鼠類抗體的SDR接枝以最小化其免疫原性]”，Mol.Immunol.[分子免疫學]41： 863-872。在此類人源化抗體中，在一個或多個供體CDR殘基不存在或整個供體CDR被省略的位置處，佔據該位置的胺基酸可以是在受體抗體序列中佔據相應位置(藉由Kabat編號)的胺基酸。在包含在內的CDR中受體對供體胺基酸的這樣的取代的數目反映了競爭考慮的平衡。這樣的取代在降低人源化抗體中的小鼠胺基酸的數目方面並且因此在降低潛在的免疫原性方面是潛在有利的。然而，取代還可以引起親和力變化，並且較佳的是避免親和力的顯著減少。還可以憑經驗選擇CDR內的取代位置和待取代的胺基酸。
抗體還根據該IMGT編號系統進行表徵，其在本領域中被明確定義。長度(以胺基酸的數目計，即所占位置的數目)係IMGT-ONTOLOGY(http：//www.imgt.org)的關鍵和原始概念。該CDR-IMGT長度表徵該胚系基因的IG和TR V-域以及重排基因、cDNA和蛋白質的V-結構域。
抗體可以是，例如根據Chothia編號方案http：//www.bioinf.org.uk/abs/表徵。Chothia編號方案與Kabat方案相同，但將其***在結構定義的位置處的CDR-L1和CDR-H1中。Chothia編號方案係基於結構化環區的位置。這意味著該等環中的拓撲等效殘基確實得到了相同的標記(不同於Kabat方案)。
CDR殘基的單一胺基酸改變可以導致功能性結合的損失的事實(Rudikoff,S.等(1982)“Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-Binding Specificity[改變抗原結合特異性的單一胺基酸取代]”，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)[美國國家科學院院刊]79(6)：1979-1983)提供了用於系統地鑒定可替代功能CDR序列的手段。在用於獲得此類變體CDR的一個較 佳的方法中，誘變編碼CDR的多核苷酸(例如經由隨機誘變或藉由定點方法(例如聚合酶鏈介導的採用編碼突變座位的引物進行的擴增))以產生具有經取代的胺基酸殘基的CDR。藉由比較原始(功能性)CDR序列中的相關殘基的身份與取代的(非功能性)變體CDR序列的身份，可以鑒定出該取代的BLOSUM62.iij取代得分。BLOSUM系統提供了藉由分析受信任的比對的序列的資料庫而創建的胺基酸取代的矩陣(Eddy,S.R.(2004)“Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From？[BLOSUM62比對分數矩陣來自哪裡？]”，Nature Biotech.[自然生物技術]22(8)：1035-1036；Henikoff,J.G.(1992)“Amino acid substitution matrices from protein blocks[來自蛋白質塊的胺基酸取代矩陣]”，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)[美國國家科學院院刊]89：10915-10919；Karlin,S.等人(1990)“Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes[用於藉由使用一般評分方案評估分子序列特徵的統計學顯著性的方法]”)，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)[美國國家科學院院刊]87：2264-2268；Altschul,S.F.(1991)“Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective[從資訊理論角度的胺基酸取代矩陣]”，J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]219，555-565。目前，最先進的BLOSUM資料庫係BLOSUM62資料庫(BLOSUM62.iij)。表1呈現了BLOSUM62.iij取代得分(得分越高取代越保守，並且因此更加可能地，該取代將不會影響功能)。如果包含所得CDR的表位結合片段未能結合至τ蛋白，例如，則BLOSUM62.iij取代分數被認為是不足夠保守的，並且選擇並產生具有更高取代分數的新候選取代。因此，例如，如果原始殘基係穀胺酸(E)，並且非功能性取代殘基係 組胺酸(H)，則BLOSUM62.iij取代分數將是0，並且更保守的變化(例如變為天冬胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺、或賴胺酸)係較佳的。
Figure 106123060-A0202-12-0042-204
本發明因此考慮了隨機誘變用於鑒定改進的CDR的用途。在本發明的背景下，保守取代可以由表2、表3或表4中的一個或多個中反映的胺基酸類別之內的取代來限定： 用於保守取代的胺基酸殘基類別：
Figure 106123060-A0202-12-0043-205
替代性保守胺基酸殘基取代類別：
Figure 106123060-A0202-12-0043-206
胺基酸殘基的替代性物理和功能分類：
Figure 106123060-A0202-12-0043-207
更保守的取代分組包括：纈胺酸-亮胺酸-異亮胺酸、*** 酸-酪胺酸、賴胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸以及天冬醯胺-穀胺醯胺。
另外組的胺基酸還可以使用描述於例如Creighton(1984)Proteins：Structure and Molecular Properties[蛋白質：結構和分子特性](第2版，1993)，W.H.弗裡曼公司(W.H.Freeman and Company)中的原則來配製。
噬菌體展示技術可以可替代地用於增加(或降低)CDR親和力。被稱為親和力成熟的這種技術採用誘變或者“CDR步移”和重選擇，使用靶標抗原或其抗原表位結合片段來鑒別具有如下CDR的抗體，該等CDR當與初始抗體或親本抗體比較時以更高(或更低)親和力結合到該抗原(參見例如Glaser等人(1992)J.Immunology[免疫學雜誌]149：3903)。誘變整個密碼子而不是單個核苷酸產生胺基酸突變的半隨機譜。可構建由一組變體殖株所組成的庫，每一殖株都在單個CDR中相差單個胺基酸改變，並且該等殖株包含代表了每個CDR殘基的每個可能胺基酸取代的變體。可藉由使固定化突變體與標記的抗原相接觸來篩選對抗原的結合親和力增加(或減少)的突變體。本領域中已知的任何篩選方法(例如ELISA)可以用於鑒定對抗原具有增加或降低的親和力的突變體抗體(參見Wu等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)[美國國家科學院院刊]95：6037；Yelton等人，1995，J.Immunology[免疫學雜誌]155：1994)。可以可能地使用使輕鏈隨機化的CDR步移(參見例如Schier等人，1996，J.Mol.Bio.[分子生物學雜誌]263：551)。
用於完成此類親和力成熟的方法描述於以下中，例如：Krause,J.C.等人(2011)“An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody[扭曲抗體結合位點構 造的***突變增強了人類抗體的功能]”，MBio.2(1)pii：e00345-10.doi：10.1128/mBio.00345-10；Kuan,C.T.等人(2010)“Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas[靶向惡性膠質瘤和黑色素瘤的親和力成熟的抗糖蛋白NMB重組免疫毒素]”，Int.J.Cancer[國際癌症雜誌]10.1002/ijc.25645；Hackel,B.J.等人(2010)“Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes[穩定性和CDR組成偏移豐富了結合物功能景觀]”，J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]401(1)：84-96；Montgomery,D.L.等人(2009)“Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41[針對HIV-1 gp41的人類單株抗體的親和力成熟和表徵]”，MAbs1(5)：462-474；Gustchina,E.等人(2009)“Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Naïve Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth[藉由源自合成原初人類抗體文庫並且針對Gp41的內部三聚捲曲螺旋的單株Fab的CDR-H2環的靶向多樣化的親和力成熟產生了一組具有改進的HIV-1中和效力和幅度的Fab]，”Virology[病毒學]393(1)：112-119；Finlay,W.J.等人(2009)“Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy：Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions[用於抗RAGE治療的人源化大鼠抗體的親和力成熟：全面誘變揭示在互補決定區內外同時存在的高水平的突變可 塑性]”，J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]388(3)：541-558；Bostrom,J.等人(2009)“Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development[改進抗體結合親和力和特異性用於治療開發]”，Methods Mol.Biol.[分子生物學方法]，525：353-376；Steidl,S.等人(2008)“In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification[藉由靶向的CDR多樣化的人類GM-CSF抗體的體外親和力成熟]”，Mol.Immunol.[分子免疫學]46(1)：135-144；和Barderas,R.等人(2008)“Affinity Maturation Of Antibodies Assisted By In Silico Modeling[藉由電腦建模輔助的抗體的親和力成熟]”，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)[美國國家科學院院刊]105(26)：9029-9034。
因此，所包含的抗體或其表位結合片段的CDR變體的序列可以藉由取代而不同於親本抗體C10-2和C10.2變體的CDR的序列；例如，取代的4個胺基酸殘基、3個胺基酸殘基、2個胺基酸殘基或1個胺基酸殘基。根據本發明的實施方式，進一步設想的是在CDR區中的胺基酸可以用如在上表3中定義的保守取代來取代。例如，酸性殘基Asp可以被Glu取代而不會實質性地影響該抗體的結合特徵。
如在此所使用的，如果一種抗體或其表位結合片段更頻繁地、更快速地以更大持續時間和/或更大親和力或親合力(相對於可替代表位而言)與該表位發生反應或締合，該抗體或其表位結合片段即被認為“特異性地”結合另一個分子的區域(即表位)。藉由閱讀本定義還應理解，例如，特異性地結合至第一靶標的抗體或其表位結合片段可以是或可以不是特異性地或優先地結合至第二靶標。如在此所使用的，在抗體結合至預定 抗原的背景中，術語“結合”典型地是指當藉由例如表面電漿共振(SPR)技術在BIAcore® 3000儀器中使用抗原作為配位基並且使用抗體作為分析物來確定時，以相應於約10-7M或更小(例如約10-8M或更小，例如約10-9M或更小)的KD的親和力的結合，並且與結合至不是預定抗原或密切相關抗原的非特異性抗原(例如BSA，酪蛋白)的親和力相比，以相應於低至少十倍例如低至少100倍、例如低至少1,000倍、例如低至少10,000倍、例如低至少100,000倍的KD的親和力結合至該預定抗原。使親和力更低的量依賴於抗體的KD，從而當抗體的KD非常低時(即抗體係高度特異性的)，則使針對抗原的親和力低於針對非特異性抗原的親和力的量可以是至少10,000倍。
如在此使用的，術語“kd”(sec-1或1/s)係指特定抗體-抗原相互作用的解離速率常數。所述值又稱為koff值。
如在此使用的，術語“ka”(M-1 x sec-1或1/Msec)係指特定抗體-抗原相互作用的締合速率常數。
如在此使用的，術語“KD”(M)係指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數並且藉由kd除以ka獲得。
如在此使用的，術語“KA”(M-1或1/M)係指特定抗體-抗原相互作用的締合平衡常數並且藉由ka除以kd獲得。
在一個實施方式中，本發明涉及一種抗τ蛋白抗體或其表位結合片段，其展現出以下特性中的一種或多種：(i)基本上不能結合至非磷酸化τ蛋白；(ii)基本上不能結合至在S404處磷酸化且在S396處非磷酸化的τ 蛋白；(iii)能夠結合至在S396處磷酸化的τ蛋白；(iv)能夠結合至在S396和在S404二者處均磷酸化的τ蛋白；(v)能夠選擇性地在磷酸化τ蛋白殘基S396和S404之間區分，使其基本上不能結合磷酸化404殘基(pS404)；(vi)能夠結合來自人類阿茲海默症腦的過度磷酸化τ蛋白；(vii)能夠在病理性人類τ蛋白和非病理性人類τ蛋白之間區分；和/或(viii)當如在此所述與經免疫耗減的來自轉基因小鼠的rTg4510提取物一起使用時，能夠特異性地將過度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa條帶減少至少90%，同時沒有將55kDa τ蛋白條帶減少多於10%，或者當如在此所述與來自人類AD屍體解剖後腦的提取物一起使用時，特異性地將S396磷酸化的過度磷酸化τ蛋白條帶減少至少90%，同時沒有將非過度磷酸化τ蛋白條帶減少多於10%。
本發明的另外的實施方式涉及一種用於獲得高特異性、高親和力抗體的方法，其中該方法包括以下步驟：(A)將免疫原注入哺乳動物中，由此免疫所述哺乳動物；(B)將對所述哺乳動物的所述免疫重複進行兩次或更多次；(C)針對所希望的高特異性、高親和力抗體的存在對來自所述經重複免疫的哺乳動物的血清樣品進行篩選，但是該等抗體基本上很少能夠結合至其他蛋白；並且(D)回收所述高特異性、高親和力抗體。
本發明因此涉及對於含有磷酸化S396殘基的病原性過度磷酸化τ蛋白特異性的高特異性、高親和力抗體。可以藉由將用於產生高特異性、高親和力抗體的以上指明的方法進行適應來產生此類抗體：(A)將免疫原注入哺乳動物中，由此免疫所述哺乳動物，所述免疫原包含雙磷酸化肽，該雙磷酸化肽包含18-40個例如18-30個、例如20-30個連續胺基酸殘基，該等連續胺基酸殘基包含覆蓋2N4R τ蛋白的殘基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO：2)；(B)將對所述哺乳動物的所述免疫重複進行兩次或更多次；(C)針對高特異性、高親和力抗體的存在對來自所述經重複免疫的哺乳動物的血清樣品進行篩選，該等高特異性、高親和力抗體能夠結合包含磷酸化S396殘基的病原性過度磷酸化τ蛋白、但是基本上很少能夠結合非病原性τ蛋白；並且(D)回收所述高特異性、高親和力抗體。
如在此使用的，“基本上不能”結合τ蛋白分子表示，相對於由參考抗體介導的可檢測結合而言，在功能方面的多於20%差異、多於40%差異、多於60%差異、多於80%差異、多於100%差異、多於150%差異、多於2倍差異、多於4倍差異、多於5倍差異、或多於10倍差異。
術語“選擇性”和“免疫選擇性”當指代抗τ蛋白抗體相對於兩種表位的結合能力時，係旨在表示在飽和條件下觀察到的結合展現至少80%差異、至少95%差異、以及最較佳的是100%差異(即沒有與一種表位的可檢測結合)。術語“選擇性”和“免疫選擇性”當指代τ蛋白抗體時，進一步旨在意指該抗體結合來自人類阿茲海默症腦的過度磷酸化τ 蛋白，並且能夠在病理性和非病理性人類τ蛋白之間區分。
術語TBS-可提取的(S1)、高鹽/肌胺醯-可提取的(S3)、以及肌胺醯-不溶性(P3)部分係如藉由在此描述的τ蛋白生物化學分級獲得的部分。
術語“正常τ蛋白”係指每莫耳蛋白中包含2-3莫耳磷酸的正常腦τ蛋白。
術語“過度磷酸化τ蛋白”係指與多陰離子種類誘導的在西方墨點法中的遷移性變動相一致的τ蛋白的多磷酸化種類，或者是指具有多於五個、六個或七個磷酸化的絲胺酸、蘇胺酸或酪胺酸位點的τ蛋白種類。
術語“具有磷酸化殘基396的τ蛋白”涉及過度磷酸化τ蛋白，其中該絲胺酸殘基396被磷酸化。
術語“轉基因非人動物”係指具有包含一個或多個人重鏈和/或輕鏈轉基因或轉染色體(整合或未整合進動物的天然基因組DNA)的基因組並且能夠表現全人抗體的非人動物。例如，轉基因的小鼠可以具有人類輕鏈轉基因和人類重鏈轉基因或人類重鏈轉染色體，這樣使得當用τ蛋白抗原和/或細胞表現τ蛋白免疫時，該小鼠產生人類抗τ蛋白抗體。人類重鏈轉基因可以被整合進小鼠的染色體DNA中，轉基因小鼠就是這樣，例如HuMAb小鼠，如HCo7或HCo12小鼠，或者人類重鏈轉基因可以被維持在染色體外，如描述於WO 02/43478中的轉染色體KM小鼠就是這樣。這樣的轉基因和轉染色體小鼠(在此統稱為“轉基因小鼠”)藉由經歷V-D-J重組和同種型轉換能夠產生多種針對給定抗原的人單株抗體同種 型(如IgG、IgA、IgM、IgD和/或IgE)。
轉基因非人動物還可以藉由引入編碼這樣的特異性抗體的基因(例如藉由將該等基因可操作地連接至在該動物的乳中表現的基因)而用於產生針對特定抗原的抗體。
如在此所使用，術語“治療(treatment)”或“治療(treating)”意指改善、減慢、衰減、或逆轉疾病或障礙的進展或嚴重性、或者改善、減慢、衰減、或逆轉這種疾病或障礙的一種或多種症狀或副作用。出於本發明的目的，“治療(treatment)”或“治療(treating)”進一步意指一種用於獲得有益的或希望的臨床結果的方法，其中“有益的或希望的臨床結果”包括但不限於症狀的緩解、障礙或疾病程度的減小、穩定的(即沒有惡化的)疾病或障礙狀態、疾病或障礙狀態進展的延緩或減慢、疾病或障礙狀態的改善或減輕、以及疾病或障礙的緩解，不論是部分地或全部地。
“有效量”，當應用於本發明的抗體或其表位結合片段時，係指一個在所需劑量和持續時期下足以實現預期生物效應或希望的治療結果(包括而不限於臨床結果)的量。短語“治療有效量”當應用於本發明的抗體或其表位結合片段時，旨在表示該抗體或其表位結合片段足以改善、減輕、穩定、逆轉、減慢、衰減或延緩障礙或疾病狀態的進展或該障礙或疾病的症狀的量。在實施方式中，本發明的方法提供用於與其他化合物相組合來給予該抗體或其表位結合片段。在此類情況下，“有效量”係足以引起預期的生物效應的該組合的量。
本發明的抗τ蛋白抗體或其表位結合片段的治療有效量可 以根據因素例如個體的疾病狀態、年齡、性別和體重以及抗τ蛋白抗體或其表位結合片段在該個體中引發希望的應答的能力來改變。治療有效量也是其中治療有利作用大於抗體或抗體部分的任何毒性或有害作用的量。
如以上指出的，本發明特別涉及單株抗體或表位結合片段，並且涉及一種全新的用於產生此類分子(以及由此此類其表位結合片段)的方法。新方法用以分離單株抗體的這種能力在此藉由將該方法用於分離能夠特異性地結合至人類τ蛋白(SEQ ID NO：1)的磷酸化殘基絲胺酸396(P-S396，pS396，{p}S396)的單株抗體得以例證。該等抗體被進一步表徵為它們在磷酸化殘基絲胺酸396和絲胺酸404(P-S404，pS404)之間區分的能力，使得它們不結合至具有磷酸化絲胺酸404的τ蛋白，除非τ蛋白在殘基396處也被磷酸化。
已經藉由使用新穎方法產生並分離本發明的抗體、或其表位結合片段，該方法有利於選擇pS396特異性抗體。此外，藉由應用這種非常嚴格的抗體殖株選擇程序，已經獲得不僅對S396具有高度特異性而且對磷酸化pS396表位具有高度選擇性的抗體。該等抗體唯一性地識別來自阿茲海默症腦的τ蛋白。篩選程序確保了對具有功能性和治療性效用的抗體的鑒定。
針對該雙磷酸化肽產生抗體：TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO：2)覆蓋2N4R τ蛋白的殘基386-408。用該磷酸化肽免疫小鼠。一旦已經獲得足夠的抗體滴度，則處死該等小鼠並產生雜交瘤。使用斑點印跡以及MSD ELISA篩選該等雜交瘤，該ELISA中使用固定的人類病理性和非病理性τ蛋白。在斑點印跡 和西方墨點法中，在病理性和非病理性人類τ蛋白之間區分的能力用於選擇雜交瘤。選擇16個殖株，回收其中的四個雜交瘤殖株，這四個雜交瘤殖株產生展現出結合至人類病理性τ蛋白材料的非凡能力的抗體。
還藉由從患病和未患病人類AD腦中分離τ蛋白，並且將此材料固定在MSD ELISA板上來確定與病理性和非病理性τ蛋白的特異性結合(實例4)。
本發明的另外一方面涉及針對雙磷酸化肽引發的單株抗體或其表位結合片段，該雙磷酸化肽包含覆蓋2N4R τ蛋白的殘基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO：2)內的至少18個例如至少20個連續胺基酸殘基。在本發明的這個方面，該單株抗體或其表位結合片段典型地是針對雙磷酸化肽引發，該雙磷酸化肽包含含有覆蓋2N4R τ蛋白的殘基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO：2)的18-40個例如18-30個、例如20-30個連續胺基酸殘基。
本發明的另外一方面係針對本發明的單株抗體或其表位結合片段，具有超過年齡匹配健康對照的、對於來自AD患病患者的磷酸化τ蛋白(p τ)的特異性，從而使得所述單株抗體或其表位結合片段具有超過來自年齡匹配健康對照的τ蛋白的、對於來自AD患病患者的磷酸化τ蛋白(p τ)的大於50倍的特異性差異，例如，與健康對照材料相比，對於AD疾病材料的特異性具有大於100倍的增加，上述係在基於ELISA的測定中，使用如在此所述的磷酸化-和多聚體-特異性設置1 ELISA或MSD在來自AD和來自健康對照受試者的腦勻漿中檢測磷酸化τ蛋白(p τ)。
本發明的一個相關方面係針對本發明的單株抗體或其表位 結合片段，具有對於AD患病τ蛋白的特異性，從而使得所述單株抗體或其表位結合片段具有超過年齡匹配健康對照的、對於AD的大於50倍的特異性差異，例如，與健康對照材料相比，對於AD疾病材料的特異性具有大於100倍的增加，上述係在基於ELISA或MSD的測定中，使用磷酸化-和多聚體-特異性設置1 ELISA在來自AD和來自健康對照受試者的腦勻漿中檢測磷酸化τ蛋白(p τ)。
設置1 ELISA或MSD方法包括步驟：A)使用C10-2包被的板，捕獲來自AD腦的病理性人類τ蛋白抗原；B)培養τ蛋白抗原與漸增濃度的pS396特異性抗體；以及C)藉由固定的C10.2使用來自MSD的硫標記抗人類(總)τ蛋白抗體捕獲的殘餘游離τ蛋白抗原的檢測。
更確切地說，步驟A包括：用典型地為在包被緩衝液中0.5μg/ml(捕獲抗體)的C10-2抗體包被MSD板(典型地在4℃過夜)，封閉(典型地在室溫1小時)，並且洗滌(典型地3次)。步驟B包括：將來自AD(從3名患者彙集)的P3裂解物的樣品(典型地按1：1000=2-4μg/ml總蛋白稀釋)和/或S1(p)(典型地按1：300=20-40ng/ml總蛋白稀釋)與成梯度濃度的pS396肽表位特異性抗體進行混合，並且培養(典型地在室溫下1小時)。隨後將該等反應物在步驟A中製備的板上培養2小時。遵循製造商的說明書，步驟C包括使用來自MSD的硫標記人類τ蛋白抗體(典型地1：50)檢測C10-2捕獲的τ蛋白。將板在MSD SECTOR® S600上進行分析。以類似設置測試AD P3和AD S1(p)。
一個另外的實施方式針對抗體或其抗原-結合片段，其能夠特異性地結合至人類τ蛋白(SEQ ID NO：1)的磷酸化絲胺酸殘基396，已 經在一種細胞系中產生或製造，該細胞系例如是人類細胞系、哺乳動物非人類細胞系、昆蟲細胞系、酵母細胞系或細菌細胞系。
該抗體或其抗原結合片段能夠特異性地結合至人類τ蛋白(SEQ ID NO：1)的磷酸化殘基396，產生於CHO細胞系、HEK細胞系、BHK-21細胞系、鼠類細胞系(如骨髓瘤細胞系)、纖維肉瘤細胞系、PER.C6細胞系、HKB-11的細胞系、CAP細胞系和HuH-7人類細胞系中。
C10-2和C10.2變體的特異性親和力和結合特性已經使用在位置396或404處磷酸化或非磷酸化的τ蛋白386-410(2R4N)肽進行表徵。使用本申請中概述的特異性免疫和篩選方案將產生高度磷酸化絲胺酸-396(pS396)特異性抗體。
為了證明該等抗體對於病理性τ蛋白具有特異性，已經藉由免疫組織化學分析對C10-2抗體進行表徵。該等抗體展現出與阿茲海默症腦中(τ蛋白纏結)的以及來自表現人類(P301L)突變體τ蛋白的Tg4510 τ蛋白轉基因小鼠切片中的神經纖維纏結的高度特異性結合。沒有觀察到與來自人類對照腦和來自非轉基因小鼠腦的組織的結合，證明了該等抗體特異性地結合人類τ蛋白並且特別是與阿茲海默氏理學相關聯的τ蛋白。
抗體C10-2
本發明的一個方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列； (e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
本發明的一個另外的方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：12的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：11的胺基酸序列。
可替代地定義的，使用IMGT定義，本發明的一個方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：40的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：41的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：42的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：43的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：44的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：45的胺基酸序列。
可替代地定義的，使用Chotia定義，本發明的一個方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：52的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：53的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：54的胺基酸序列。
證明了本發明的抗體識別與疾病病理學相關的τ蛋白的獨特能力。比較了病理性與非病理性τ蛋白的結合。比較係與五種公開的τ蛋白抗體：hACI-2B6、IPN002、HJ8.5、2.10.3、和4E4的比較。2.10.3抗體係可商購的重組單株抗體，該抗體特異性地結合至在絲胺酸422(pS422)處磷酸化的τ蛋白。HJ8.5係可商購的單株抗體，該抗體在N端區(在胺基酸殘基25-30處的表位)僅識別人類τ蛋白。該抗體係IgG2b同種型。抗τ蛋白治療性抗體NI-105-4E4係可商購的抗體。該表證明了分離的抗體展現出對於人類病理性τ蛋白的格外高程度的特異性和選擇性。該選擇性優於如表5中所示的對比抗體中的任一個。
Figure 106123060-A0202-12-0057-208
飽和時，抗體C10-2展現出對於從人類AD腦分離的P3 τ蛋白大於100倍的選擇性。
為了證明所選擇的抗體具有功能性和治療性效用，在體外和細胞內τ-聚集測定中測試了抗體(實例8)。該等測定係功能測定，證實該等抗體能夠干擾τ蛋白的病理性聚集過程。將HEK293細胞暫態轉染人類τ-P301L-FLAG(4R0N)。隨後將細胞暴露於來自人AD腦或來自轉基因 Tg4510腦的τ蛋白提取物。到病理性τ蛋白的這種暴露促進τ蛋白攝取入細胞和細胞內聚集。使用抗體C10-2對τ蛋白-製品的免疫耗減以及用該等抗體直接處理細胞能夠顯著減少τ蛋白聚集體的形成。
抗體C10-2的治療效用也已經在人類τ蛋白/PS1小鼠中被評價。這種小鼠模型係更加與AD疾病相關的動物模型，其僅在生命後期(12-18月齡)產生AD病理學。然而，該等小鼠在實體纏結病理學的出現之前展現出τ蛋白過度磷酸化。慢性注射小鼠持續13週，每週兩次，劑量為15mg/kg。抗體處理的小鼠展現出磷酸化τ蛋白的顯著減少，表明用抗體C10-2慢性處理將降低纏結病變，並且由此降低隨後的體內神經退行性變。
本發明的抗體藉由免疫耗減方法特異性地去除來自rTg4510小鼠腦提取物的過度磷酸化τ蛋白。此外，本發明的抗體並不去除來自勻漿的正常τ蛋白，而可商購的τ 5抗體去除來自勻漿的正常τ蛋白。與結合至τ蛋白(其中磷酸化在殘基404處或在殘基404和396兩者處)的商業抗體相比，本發明的抗體特異性地去除95%的在絲胺酸396上磷酸化的過度磷酸化τ蛋白。實驗(實例12)證明本發明的抗體，儘管僅去除腦勻漿中的總τ蛋白的非常少的部分(8%)，但該等抗體特異性地去除過度磷酸化τ蛋白(以90%)。因此，本發明的一個方面針對單株抗體或其表位結合片段，能夠特異性地結合至病原性過度磷酸化τ蛋白。此外，在其中使用本發明的抗體去除過度磷酸化τ蛋白的實驗中，接種活性被消除。藉由從勻漿中去除過度磷酸化τ蛋白，該等勻漿不再誘導τ蛋白病變的接種。已經提出接種的減少降低了纏結形成的發展以及τ蛋白病變(包括阿 茲海默症)的進展。因此，本發明的另一個方面係針對本發明之抗體，用於在AD進展或AD症狀的降低中使用。
抗體D55E
本發明的一個方面涉及抗體C10-2、抗體D55E的變體抗體。本發明的此方面針對單株抗體或其表位結合片段，包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列，以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
本發明針對抗體D55E的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：12的胺基酸序列；(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：13的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體D55E的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括以下各項中的至少一個(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列； (e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列，以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
抗體D55Q
本發明的另一方面涉及抗體C10-2、抗體D55Q的變體抗體。本發明的此方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：29的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
本發明針對抗體D55Q的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)一條輕鏈，其包括SEQ ID NO：12的胺基酸序列；以及(b)一條重鏈，其包括SEQ ID NO：14的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體D55Q的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括以下各項中的至少一個(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括：(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列； (e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：29的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
抗體D55S
本發明的另一個方面涉及抗體C10-2、抗體D55S的變體抗體。本發明的此方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：30的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
本發明針對抗體D55S的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：12的胺基酸序列，以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：15的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體D55S的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括以下各項中的至少一個(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列； (e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：30的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
使用抗體D55S、抗體D55Q、抗體D55E的研究表明，當在室溫下用低pH持續很長一段時間處理抗體之前和之後比較時，該殘基的突變導致所述抗體具有未改變的結合特性，當與預處理相比時，表明在低pH下沒有發生異構化作用或任何異構化的蛋白具有未改變的結合特性。
抗體N32S
本發明的另一個方面涉及抗體C10-2、抗體N32S的變體抗體。本發明的此方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：31的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
本發明針對抗體N32S的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：11的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N32S的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：31的胺基酸序列； (b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
抗體N32S的可替代的定義，使用IMGT定義，係單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，具有SEQ ID NO：46的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：47的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：48的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：43的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：44的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：45的胺基酸序列。
抗體N32S的另外的可替代的定義，使用Chotia定義，係單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，具有SEQ ID NO：31的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：52的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：53的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：54的胺基酸序列。
從圖1可以看出，與抗體C10-2相比，抗體N32S(黑色圓)的IC50係降低的，N32S的IC50被計算為44nM。沒有預期到超過C10-2的顯著改進。由圖1支持的，本發明的一個方面針對在本文描述的液相抑制分析中抑制AD-P3的抗體，這樣使得該信號在該抗體的100nM或更少的濃度下降低50%。在一個實施方式中，基於液相抑制分析，針對AD-P3捕獲，本發明的抗體具有從0.1nM至100nM的IC50，例如在50nM或更少的濃度下，例如從0.1nM至50nM。
使用抗體N32S產生的數據表明在抗體C10-2的輕鏈的位置32處的突變，或抗體C10-2的LC CDR1對絲胺酸的突變導致在肽抑制分析中增加的表觀親和力(IC50)。此外，在位置32處對絲胺酸或穀胺醯胺(抗體N32S和抗體N32Q)的突變消除了如在圖20中顯示的在位置32和34二者中的去醯胺作用。將如在體外接種和聚集研究方面確定的效力在N32S和N32Q變體中保留。
在C10-2中的位置處鑒定出可能導致蛋白質批次異質性的潛在的去醯胺作用潛力。C10-2示出了異質性結合至具有高表觀親和力(2nM-5nM)的較小級分的AD-P3抗原，以及具有低表觀親和力(200nM-1000nM)的主要結合(圖1)。該異質性結合能夠反映不同的去醯胺的和非去醯胺的C10-2的亞群。藉由抑制去醯胺作用的置換(N32S)產生變體。與C10-2相比，如由提供總體減少的IC50(更高的表觀親和力)指示的活性顯示了改進的結合。將另外的置換A101T引入，導致高表觀親和力型的同源結合。在N32S和N32S-A101T二者中改進的結合活性表明藉由上文描述的突變達到的更穩定且同源的抗體。
抗體N32Q
本發明的另一個方面涉及抗體C10-2、抗體N32Q的變體抗體。本發明的此方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：32的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
本發明針對抗體N32Q的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：17的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：11的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N32Q的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：32的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
如上所述，使用抗體N32S產生的數據表明在抗體C10-2的輕鏈的位置32處的突變，或抗體C10-2的LC CDR1對絲胺酸的突變導致增加的表觀親和力(IC50)，然而對穀胺醯胺(抗體N32Q)的突變導致未改變的結合活性。然而，在位置32處對絲胺酸或穀胺醯胺(抗體N32S和抗體N32Q)的突變消除了如在圖20中顯示的在位置32和34二者中的去醯胺作用。因此，對抗體N32S和抗體N32Q二者均有優勢。將如在體外接種和聚集研究方面確定的效力在N32S和N32Q變體中保留。
抗體N34S
本發明的另一個方面涉及抗體C10-2、抗體N34S的變體抗體。本發明的此方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：33的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
本發明針對抗體N34S的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：18的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：11的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N34S的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括 (a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：33的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
抗體N34Q
本發明的另一個方面涉及抗體C10-2、抗體N34Q的變體抗體。本發明的此方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：34的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
本發明針對抗體N34Q的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：19的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：11的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N34Q的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括 (a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：34的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
抗體N32S、N34S
本發明的另一個方面涉及抗體C10-2、抗體N32S、N34S的變體抗體。本發明的此方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：35的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N32S、N34S的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：20的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：11的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N32S、N34S的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括 (a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：35的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
抗體N32Q、N34S
本發明的另一個方面涉及抗體C10-2、抗體N32Q、N34S的變體抗體。本發明的此方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：36的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N32Q、N34S的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：21的胺基酸序列；(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：11的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N32Q、N34S的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括 (a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：36的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
抗體N32Q、N34Q
本發明的另一個方面涉及抗體C10-2、抗體N32Q、N34Q的變體抗體。本發明的此方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：37的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)a重鏈CDR3具有胺基酸序列of SEQ ID NO：8；可替代地定義的，本發明針對抗體N32Q、N34Q的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：22的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：11的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N32Q、N34Q的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括 (a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：37的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
抗體N32S、N34Q
本發明的另一個方面涉及抗體C10-2、抗體N32S、N34Q的變體抗體。本發明的此方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：38的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N32S、N34Q的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，包括SEQ ID NO：23的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：11的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N32S、N34Q的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括 (a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：38的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
抗體A101T
本發明的另一個方面涉及抗體C10-2、抗體A101T的變體抗體。本發明的此方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體A101T的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：12的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：24的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體A101T的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括以下各項中的至少一個 (a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
使用抗體A101T產生的數據表明抗體C10-2的重鏈的突變或抗體C10-2的重鏈CR3的突變導致兩倍增加的肽結合和10倍-20倍增加的結合至P3材料。此外，變體包括在體外接種測定的具有增加的效力的A101T突變。
抗體N32S、A101T
本發明的另一個方面涉及抗體C10-2、抗體N32S、A101T的變體抗體。本發明的此方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：31的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N32S、A101T的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括 (a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列；(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：24的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N32S、A101T的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：31的胺基酸序列；和(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；以及(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列。
使用IMGT定義，抗體N32S、A101T係單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：46的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：47的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：48的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：49的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：50的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：51的胺基酸序列。
使用Chotia定義，抗體N32S、A101T係單株抗體或其表位結合片段，其包括 (a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：31的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：55的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：56的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：57的胺基酸序列。
如從圖1中可以看出，與抗體C10-2相比，抗體N32S、A101T(白色圓)的IC50顯著降低：N32S A101T的IC50被計算為14nM。沒有預期到超過C10-2的該顯著的改進。基於圖1，本發明的一個方面針對在本文描述的液相抑制分析中抑制AD-P3的抗體，這樣使得該信號在該抗體的100nM或更少的濃度下降低50%，例如從抗體的10nM至100nM，例如在50nM或更少的濃度下，例如從該抗體的10nM至50nM。如在圖20中示出，抗體N32S、A101針對去醯胺作用係非常穩定的。如在圖19中示出，抗體N32S、A101T示出了在聚集方面更強的降低。
抗體N32Q、A101T
本發明的另一個方面涉及抗體C10-2、抗體N32Q、A101T的變體抗體。本發明的此方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：32的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及 (f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N32Q、A101T的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：17的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：24的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N32Q、A101T的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：32的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；和(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；以及(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列。
抗體N32S、D55E
本發明的另一個方面涉及抗體C10-2、抗體N32S、D55E的變體抗體。本發明的此方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：31的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列； (e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N32S、D55E的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列；(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：13的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N32S、D55E的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：31的胺基酸序列；和(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；和(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
抗體N32Q、D55E
本發明的另一個方面涉及抗體C10-2、抗體N32Q、D55E的變體抗體。本發明的此方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：32的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列； (d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N32Q、D55E的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：17的胺基酸序列；(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：13的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N32Q、D55E的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：32的胺基酸序列；和(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；和(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
抗體N34S、A101T
本發明的另一個方面涉及抗體C10-2、抗體N34S、A101T的變體抗體。本發明的此方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：33的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列； (c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N34S、A101T的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：18的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：24的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N34S、A101T的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：33的胺基酸序列；和(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；以及(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列。
抗體N34Q、A101T
本發明的另一個方面涉及抗體C10-2、抗體N34Q、A101T的變體抗體。本發明的此方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：34的胺基酸序列； (b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N34Q、A101T的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：19的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：24的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體N34Q、A101T的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：34的胺基酸序列；和(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列。
抗體D55E、A101T
本發明的另一個方面涉及抗體C10-2、抗體D55E、A101T的變體抗體。本發明的此方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括 (a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體D55E、A101T的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：12的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：25的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體D55E、A101T的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括以下各項中的至少一個(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；和(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
抗體D55Q、A101T
本發明的另一個方面涉及抗體C10-2、抗體D55Q、A101T 的變體抗體。本發明的此方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：29的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體D55Q、A101T的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：12的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：26的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體D55Q、A101T的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括以下各項中的至少一個(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括：(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：29的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
抗體D55S、A101T
本發明的另一個方面涉及抗體C10-2、抗體D55S、A101T的變體抗體。本發明的此方面針對單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：30的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體D55S、A101T的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：12的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：27的胺基酸序列。
可替代地定義的，本發明針對抗體D55S、A101T的方面的另外的實施方式涉及單株抗體或其表位結合片段，其包括以下各項中的至少一個(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；和(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：30的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEO ID NO：39的胺基酸序列。
考慮該重鏈變體和輕鏈變體的組合，例如輕鏈內的多個變體和/或重鏈內的多個變體，輕鏈內的單個變體與重鏈內單個或多個變體的組合，輕鏈內的多個變體與重鏈內的多個變體的組合。本發明的抗體較佳的是包括選自下組的輕鏈，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：12(輕鏈C10-2)；SEQ ID NO：16(輕鏈變體N32S)；SEQ ID NO：17(輕鏈變體N32Q)；SEQ ID NO：18(輕鏈變體N34S)；SEQ ID NO：19(輕鏈變體N34Q)；SEQ ID NO：20(輕鏈變體N32S，N34S)；SEQ ID NO：21(輕鏈變體N32Q，N34S)；SEQ ID NO：22(輕鏈變體N32Q，N34Q)；以及SEQ ID NO：23(輕鏈變體N32S，N34Q)；以及選自下組的重鏈，該組由以下各項組成SEQ ID NO：11(重鏈C10-2)；SEQ ID NO：13(重鏈變體D55E)；SEQ ID NO：14(重鏈變體D55Q)；SEQ ID NO：15(重鏈變體D55S)；SEQ ID NO：24(重鏈變體A101T)；SEQ ID NO：25(重鏈變體D55E，A101T)；SEQ ID NO：26(重鏈變體D55Q，A101T)，以及SEQ ID NO：27(重鏈變體D55S，A101T)。
在一個實施方式中，當該輕鏈係SEQ ID NO：12時，該重鏈選自下組，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：13(重鏈變體D55E)；SEQ ID NO：14(重鏈變體D55Q)；SEQ ID NO：15(重鏈變體D55S)；SEQ ID NO：24(重鏈變體A101T)；SEQ ID NO：25(重鏈變體D55E，A101T)；SEQ ID NO：26(重鏈變體D55Q，A101T)，以及SEQ ID NO：27(重鏈變體D55S，A101T)。在一個可替代的實施方式中，當該重鏈係SEQ ID NO：11時，該輕鏈選自下組，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：16(輕鏈變體N32S)；SEQ ID NO：17 (輕鏈變體N32Q)；SEQ ID NO：18(輕鏈變體N34S)；SEQ ID NO：19(輕鏈變體N34Q)；SEQ ID NO：20(輕鏈變體N32S，N34S)；SEQ ID NO：21(輕鏈變體N32Q，N34S)；SEQ ID NO：22(輕鏈變體N32Q，N34Q)；以及SEQ ID NO：23(輕鏈變體N32S，N34Q)。
該單株抗體或其表位結合片段，適當地包括(a)輕鏈CDR1，其包括選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：34；SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36；SEQ ID NO：37；和SEQ ID NO：38；(b)輕鏈CDR2，其包括SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其包括SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其包括SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其包括選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：29；和SEQ ID NO：30；以及(f)重鏈CDR3，其包括選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：39。
變體的組合的有趣的實施方式包括，其中選自下組的該等抗體，該組由以下各項組成：抗體N32S，A101T；抗體N32Q，A101T；抗體N32S，D55E；和抗體N32Q，D55E，較佳的是抗體N32S，A101T。如從實例可以看出，抗體N32S和抗體N32S，A101T係較佳的實施方式。
總之，該等實例示出包括C10-2的本發明的抗體有效地結合至AD-P3抗原包被的MSD板上。相比之下，商業抗體如PHF-13，具有低的結合活性。此外PHF-13證實了相比於本發明的抗體而言實質上更高程度的非特異性結合。在C10-2包被的板中，P τ蛋白抗原捕獲的C10-2液相抑 制係有效的(IC50=10nM-20nM)，然而PHF-13係無效的(IC50=500nM-1000nM)。
本發明的一個方面係針對一種抗體，該抗體包含(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5胺基酸序列；以及(d)重鏈，其選自下組，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、以及SEQ ID NO：27。
本發明的一個方面係針對一種抗體，該抗體包含(a)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(b)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；(c)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列；以及(d)輕鏈，其選自下組，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、和SEQ ID NO：23。
本發明的該單株抗體或其表位結合片段，典型地抑制在液相抑制分析中的AD-P3，這樣使得該信號在該抗體的100nM或更少的濃度下降低50%，例如從該抗體的10nM至100nM，例如在50nM或更少的濃度下，例如從該抗體的10nM至50nM。典型地根據對阿茲海默症腦提取物的免疫耗減研究後的pS396 τ蛋白的西方墨點法信號，本發明的單株抗體或其表位結合片段能夠從AD腦勻漿物中以約75ng的抗體去除在絲胺酸396 處的至少15%的τ蛋白磷酸化。
該抗體或其表位結合片段較佳的是人類抗體或人源化的抗體。
根據一個實施方式，以上所述的抗體及其表位結合片段可以進一步包括這種輕鏈和/或重鏈CDR1、CDR2或CDR3的變體(具有不多於4個胺基酸差異，或不多於3個胺基酸差異，或不多於2個胺基酸差異，或不多於1個胺基酸差異)。
如從圖18可以看出，在至少一個實施方式中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、和LC CDR3對於結合至τ蛋白的392-398區域係重要的。在本發明的一個實施方式中，本發明的該抗體或其表位結合片段包括：在本發明的一個方面中，本發明係針對一種抗體或其表位結合片段，它們形成疏水口袋，該疏水口袋係由L3：H3、L3：F8*、H1：H13、H2：Y1、H2：Y3與τ肽的Y394形成。在一個實施方式中，本發明針對一種抗體，該抗體與在此進一步描述的抗體相競爭以在溶劑化的{p}S396與L3：T4、H1：R10、H1：T11、H3：R1、H3：T3之間形成氫鍵網路；(*)L3：F8係CDR L3的C-端側翼框架殘基(參見圖11)。
如可以從x-射線晶體結構所見，本發明的抗體以兩個水平的選擇性結合。第一水平的選擇性係針對過度磷酸化病理性τ蛋白的選擇性，並且第二水平的選擇性係針對磷酸化絲胺酸殘基的選擇性，其中所述磷酸化絲胺酸的磷酸鹽藉由氫鍵鍵合到由來自所述磷酸化絲胺酸的一個殘基分離的酪胺酸殘基的側鏈上。因此，本發明的令人感興趣的方面針對一種對過度磷酸化τ蛋白的胺基酸基序具有選擇性的單株抗體或其表位結合 片段，該過度磷酸化τ蛋白的基序包括由單個殘基分隔的磷酸化絲胺酸殘基和酪胺酸殘基。典型地，該胺基酸基序具有以下序列：Y-X-S(磷酸化)-P-
其中Y係酪胺酸，X係天然存在的胺基酸，P係脯胺酸，並且S(磷酸化)係具有磷酸化羥基側鏈的絲胺酸。
類似地，本發明的令人感興趣的一個方面係針對一種抗體或其表位結合片段，其結合至磷酸化τ蛋白、較佳的是至過度磷酸化τ蛋白，其中所述抗體或其表位結合片段對於胺基酸殘基基序IA具有選擇性，其中R係天然存在的胺基酸的側鏈。
Figure 106123060-A0202-12-0088-209
不受具體理論的束縛，認為當胺基酸基序IA處於病理性τ蛋白採用的構象中時，本發明的抗體對於所述基序具有選擇性。因此，該胺基酸基序IA係典型地由本發明的抗體選擇性識別的序列。因此，本發明的令人感興趣的一個方面係針對一種抗體或其表位結合片段，其結合至磷酸化τ蛋白、較佳的是至過度磷酸化τ蛋白，其中所述抗體或其表位結合片段對於胺基酸殘基基序IA具有選擇性，其中R係天然存在的胺基酸的側鏈。
在本發明的此方面的一個典型實施方式中，本發明係針對一種抗體或其表位結合片段，其結合至磷酸化τ蛋白、較佳的是至過度磷酸化τ蛋白，其中所述抗體或其表位結合片段對於胺基酸殘基基序IB具有選擇性，其中R係天然存在的胺基酸的側鏈，但不限於IC或ID。
Figure 106123060-A0202-12-0089-210
Figure 106123060-A0202-12-0089-211
Figure 106123060-A0202-12-0089-212
 ID
本發明的一個方面中，本發明的抗體的HC CDR1區域中，Asp Arg Thr Ile His(SEQ.ID.NO.7)與過度磷酸化τ蛋白的基序IA-ID相互作用。
如從圖18可以看出，在本發明的此方面中，在兩個連續的帶電荷的殘基(即天冬胺酸和精胺酸)的存在下，HC CDR1在與靶標τ蛋白表位中的基序氫鍵中起作用，其中該抗體針對過度磷酸化τ蛋白的胺基酸基序具有選擇性，該過度磷酸化τ蛋白的基序包括由單個殘基分隔的磷酸化絲胺酸殘基和酪胺酸殘基。因此，本發明的一個方面針對抗體或其表位結合片段，其結合磷酸化τ蛋白，較佳的是結合過度磷酸化τ蛋白，其中所述抗體或其表位結合片段對於胺基酸殘基基序IA-ID係具有選擇性的，其中該抗體包括含有兩個連續帶電荷的胺基酸殘基(例如，天冬胺酸和精胺酸)的HC CDR1區域。在另外可替代的本發明的此方面中，本發明的抗體或其表位結合片段結合至過度磷酸化τ蛋白，其中所述抗體或其表位結合片段對包括絲胺酸396和酪胺酸394的表位具有選擇性，其中PO4基團形成與所述絲胺酸396和酪胺酸394之一的共價鍵，以及與其他絲胺酸396和酪胺酸394的氫鍵，其中該抗體包括含有兩個連續的帶電荷的殘基(例如，天冬胺酸和精胺酸)的HC CDR1區域。HC CDR1區域的帶電荷的胺基酸殘基可以選自下組，該組由以下各項組成：精胺酸、賴胺酸、天冬胺酸、和穀胺酸，其中至少一個所述殘基係天冬胺酸或精胺酸，較佳的是其中一個帶電荷的殘基係精胺酸，並且另一個係天冬胺酸。
在本發明的此方面的另外的實施方式，兩個連續的帶電荷的 胺基酸殘基的之一或二者均由極性胺基酸殘基側接，較佳的是選自蘇胺酸和酪胺酸。此外，兩個連續的帶電荷的胺基酸殘基的之一或二者由極性殘基-疏水性殘基-極性殘基的3-胺基酸殘基基序側接。
在一個實施方式中，HC CDR1包括5-殘基基序極性AA-疏水性AA-極性AA-帶電荷的AA-帶電荷的AA，其中至少一個所述殘基係天冬胺酸或精胺酸，較佳的是其中一個帶電荷的殘基係精胺酸，並且另一個係天冬胺酸。較佳的是，該5-殘基基序具有基序極性AA-疏水性AA-極性AA-Asp-Arg。更較佳的是，該HC CDR1的5-殘基基序具有序列Thr-Phe-Thr-Asp-Arg。
有趣地注意到，本發明的抗體的HC CDR1包括在兩個連續的帶電荷的胺基酸殘基的兩側的極性-疏水性-極性-帶電荷的基序，該胺基酸殘基涉及與涉及S396和Y394之間的靜電相互作用的磷酸鹽基團的氫鍵。因此，在較佳的實施方式中，本發明的HC CDR1包括迴文的8-殘基基序極性AA-疏水性AA-極性AA-帶電荷的AA-帶電荷的AA-極性AA-疏水性AA-極性AA。較佳的是，該HC CDR1的8-殘基基序包括基序Thr-Phe-Thr-Asp-Arg-極性AA-疏水性AA-極性AA。更較佳的是，該HC CDR1的8-殘基基序包括基序Thr-Phe-Thr-Asp-Arg-Thr-Ile-His。
在一個實施方式中，該抗體識別包括絲胺酸396和酪胺酸394的過磷酸化的τ蛋白的殘基392-398的表位，其中絲胺酸396係磷酸化的，並且其中該抗體包括含有兩個連續的帶電荷的胺基酸殘基的HC CDR1區域。在一個較佳的實施方式中，該抗體識別包括絲胺酸396和酪胺酸394的過磷酸化的τ蛋白的殘基392-398的表位，其中絲胺酸396係磷酸化的， 並且其中該抗體包括含有5-殘基基序極性AA-疏水性AA-極性AA-帶電荷的AA-帶電荷的AA的HC CDR1區域。在一個更較佳的實施方式中，該抗體識別包括絲胺酸396和酪胺酸394的過磷酸化的τ蛋白的殘基392-398的表位，其中絲胺酸396係磷酸化的，並且其中該抗體包括含有基序極性AA-疏水性AA-極性AA-帶電荷的AA-帶電荷的AA-極性AA-疏水性AA-極性AA的HC CDR1區域。
在另外的較佳的實施方式中，該抗體包括如在此定義的HC CDR1區域，並且包括含有至少兩個帶電荷的殘基的6-殘基基序的HC CDR3區域。
本發明還提供了一種在患者中降低τ蛋白纏結形成的方法，該方法包括向需要這種治療的患者給予治療有效量的本發明的抗體或其表位結合片段。
本發明的一個方面係針對一種使用本發明的抗體或其表位結合片段治療τ蛋白病變的方法。典型地該τ蛋白病變選自下組，該組由以下各項組成：阿茲海默症；嗜銀顆粒失智(AGD)；精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有雷維體失智的患者的精神病症狀；進行性核上性麻痹(PSP)；額顳葉失智症(FTD或其變體)；TBI(急性或慢性創傷性腦損傷)；皮質基底節變性(CBD)；匹克病；原發性年齡相關性τ蛋白病變(PART)；神經纖維纏結為主型老年失智(Neurofibrillary tangle-predominant senile dementia)；拳擊員失智(Dementia pugilistica)；慢性創傷性腦病；中風；中風恢復；與帕金森病相關的神經變性；與染色體關聯的帕金森綜合症；利緹可-伯蒂格病(Lytico-Bodig disease) (關島型(Guam))帕金森病-失智複合征)；神經節膠質瘤和神經節細胞瘤；腦膜血管瘤病；腦炎後帕金森綜合症；亞急性硬化性泛腦炎；杭丁頓症；鉛毒腦病；結節性硬化症；哈勒沃登-施帕茨症候群(Hallervorden-Spatz disease)以及脂褐質症。更典型地，該τ蛋白病變選自下組，該組由以下各項組成：阿茲海默症；嗜銀顆粒失智(AGD)；精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有雷維體失智的患者的精神病症狀；進行性核上性麻痹(PSP)；額顳葉失智症(FTD或其變體)；TBI(急性或慢性創傷性腦損傷)；皮質基底節變性(CBD)；以及匹克病。具體地，該τ蛋白病變可以選自阿茲海默症；嗜銀顆粒失智(AGD)；精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有雷維體失智的患者的精神病症狀。
因此，本發明的另一個方面係針對本發明的抗體或其表位結合片段，用於在治療τ蛋白病變中使用。典型地該τ蛋白病變選自下組，該組由以下各項組成：阿茲海默症；嗜銀顆粒失智(AGD)；精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有雷維體失智的患者的精神病症狀；進行性核上性麻痹(PSP)；額顳葉失智症(FTD或其變體)；TBI(急性或慢性創傷性腦損傷)；皮質基底節變性(CBD)；匹克病；原發性年齡相關性τ蛋白病變(PART)；神經纖維纏結為主型老年失智；拳擊員失智；慢性創傷性腦病；中風；中風恢復；與帕金森病相關的神經變性；與染色體關聯的帕金森綜合症；利緹可-伯蒂格病(Lytico-Bodig disease)(關島型帕金森病-失智複合征)；神經節膠質瘤和神經節細胞瘤；腦膜血管瘤病；腦炎後帕金森綜合症；亞急性硬化性泛腦炎；杭丁頓症；鉛毒腦病； 結節性硬化症；哈勒沃登-施帕茨症候群以及脂褐質症。更典型地，該τ蛋白病變選自下組，該組由以下各項組成：阿茲海默症；嗜銀顆粒失智(AGD)；精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；因AD導致的情感冷漠或患有AD的患者中的情感冷漠；患有雷維體失智的患者的精神病症狀；進行性核上性麻痹(PSP)；額顳葉失智症(FTD或其變體)；TBI(急性或慢性創傷性腦損傷)；皮質基底節變性(CBD)；以及匹克病。特別地，該τ蛋白病變可以選自阿茲海默症；嗜銀顆粒失智(AGD)；因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；因AD導致的情感冷漠或患有AD的患者中的情感冷漠；以及患有雷維體失智的患者的精神病症狀。
本發明的一個方面針對一種療法，該療法包括給予：i)τ蛋白抗體；和ii)選自下組的化合物，該組由以下各項組成：a)BACE抑制劑；b)在主動或被動τ蛋白免疫療法中有用的化合物；c)在主動或被動A β肽免疫療法中有用的化合物；d)NMDA受體拮抗劑；e)另外的τ蛋白聚集抑制劑；e)乙醯膽鹼酯酶抑制劑；f)抗癲癇藥；g)抗炎藥；以及h)SSRI。
本發明的另外的方面針對一種組成物，該組成物包括i)τ 蛋白抗體，和ii)選自下組的化合物，該組由以下各項組成：a)BACE抑制劑；b)在主動或被動τ蛋白免疫療法中有用的化合物；c)在主動或被動A β肽免疫療法中有用的化合物；d)NMDA受體拮抗劑；e)另外的τ蛋白聚集抑制劑；e)乙醯膽鹼酯酶抑制劑；f)抗癲癇藥；g)抗炎藥；以及h)SSRI。
本發明的另外的方面針對套組(kit)，該套組包括i)包含τ蛋白抗體的組成物，以及ii)包含選自下組的化合物的組成物，該組由以下各項組成：a)BACE抑制劑；b)在主動或被動τ蛋白免疫療法中有用的化合物；c)在主動或被動A β肽免疫療法中有用的化合物；d)NMDA受體拮抗劑；e)另外的τ蛋白聚集抑制劑；f)乙醯膽鹼酯酶抑制劑；g)抗癲癇藥；h)抗炎藥；以及i)抗抑鬱藥。
a)將τ蛋白抗體與BACE 1抑制劑組合
在本發明的療法、組成物或套組中，可以將τ蛋白抗體與BACE 1抑制劑組合。該BACE1抑制劑可以是小分子BACE I抑制劑，例如LY2886721、MK-8931、AZD3293或E2609。
在另外的實施方式中，該BACE 1抑制劑具有化學式I，
Figure 106123060-A0202-12-0096-215
其中Ar選自下組，該組由以下各項組成：苯基、吡啶基、嘧啶基、吡
Figure 106123060-A0202-12-0096-153
基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、
Figure 106123060-A0202-12-0096-154
唑基、異
Figure 106123060-A0202-12-0096-156
唑基，並且其中Ar視情況被一個或多個選自鹵素、CN、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6氟烷基、或C1-C6烷氧基的取代基取代；並且R1係一個或多個氫、鹵素、C1-C3氟烷基、或C1-C3烷基；並且R2代表氫或氟。
具有化學式I的示例性的化合物包括
Figure 106123060-A0202-12-0096-213
(3S,6S)-6-(5-胺基-2-氟苯基)-3-氟-3-(氟甲基)-6-甲基哌啶-2-硫酮
Figure 106123060-A0202-12-0096-214
(3R,6S)-6-(5-胺基-2-氟苯基)-3-氟-3-(氟甲基)-6-甲基哌啶-2-硫酮
Figure 106123060-A0202-12-0097-217
(3S,6S)-6-(5-胺基-2,3-二氟苯基)-3-氟-3-(氟甲基)-6-甲基哌啶-2-硫酮
Figure 106123060-A0202-12-0097-218
(3R,6S)-6-(5-胺基-2,3-二氟苯基)-3-氟-3-(氟甲基)-6-甲基哌啶-2-硫酮
Figure 106123060-A0202-12-0097-219
(6S)-6-(5-胺基-2-氟苯基)-3-氟-3,6-雙(氟甲基)哌啶-2-硫酮。
此外，合適的BACE 1抑制劑可以具有化學式II
Figure 106123060-A0202-12-0097-216
其中Ar選自下組，該組由以下各項組成：苯基、吡啶基、嘧啶基、吡
Figure 106123060-A0202-12-0097-157
基、咪唑基、吡唑基、1,2,4-***基、噻吩基、噻唑基、
Figure 106123060-A0202-12-0097-158
唑基、異
Figure 106123060-A0202-12-0097-159
唑基、1,3,4-噻二唑基、異噻唑基、1,3,4-
Figure 106123060-A0202-12-0097-160
二唑基、1,2,4-
Figure 106123060-A0202-12-0097-161
二唑基、呋呫基和1,2,4-噻二唑基，並且其中該Ar被一個或多個鹵素、CN、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6氟烷基或C1-C6烷氧基視情況取代；R1係C1-C3烷基或C1-C3氟烷基；R2係氫、鹵素、C1-C3氟烷基或C1-C3烷基；並且R3係C1-C3烷基。
具有化學式II的BACE 1抑制劑的示例性化合物包括選自下組的化合物，該組由以下各項組成：N-(3-((2R,5S)-6-胺基-3,3,5-三氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4氟苯基)-5-氟吡啶醯胺；N-(3-((2R,5S)-6-胺基-3,3,5-三氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4氟苯基)-5-甲氧基吡
Figure 106123060-A0202-12-0098-162
-2-甲醯胺；N-(3-((2R,5S)-6-胺基-3,3,5-三氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡啶醯胺；N-(3-((2R,5S)-6-胺基-3,3,5-三氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4氟苯基)-5-氰基-3-甲基吡啶醯胺；以及N-(3-((2R,5R)-6-胺基-3,3,5-三氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4氟苯基)-5-(二氟甲基)吡
Figure 106123060-A0202-12-0098-163
-2-甲醯胺。
其他BACE抑制劑可以選自以下化學式
Figure 106123060-A0202-12-0098-220
其中Ar選自下組，該組由以下各項組成：苯基、吡啶基、嘧啶基、吡
Figure 106123060-A0202-12-0098-164
基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、
Figure 106123060-A0202-12-0098-165
唑基、異
Figure 106123060-A0202-12-0098-166
唑基，並且其中該Ar視情況被一個或多個選自鹵素、CN、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6氟烷基或C1-C6烷氧基的取代基取代；並且R1係一個或多個氫、鹵素、C1-C3氟烷基或C1-C3烷基；R2表示氫或氟；或其藥學上可接受的鹽。
例如化合物，如 N-(3-((2S,5S)-6-胺基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡啶醯胺；N-(3-((2S,5S)-6-胺基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡啶醯胺；N-(3-((2S,5S)-6-胺基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氰基-3-甲基吡啶醯胺；N-(3-((2S,5S)-6-胺基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氯吡啶醯胺；N-(3-((2S,5S)-6-胺基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡
Figure 106123060-A0202-12-0099-167
-2-甲醯胺；N-(3-((2S,5S)-6-胺基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-2-甲基
Figure 106123060-A0202-12-0099-168
唑-4-甲醯胺；N-(3-((2S,5S)-6-胺基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-4-溴-1-甲基-1H-咪唑-2-甲醯胺；N-(3-((2S,5S)-6-胺基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-4-甲基噻唑-2-甲醯胺；N-(3-((2S,5S)-6-胺基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-2-(二氟甲基)
Figure 106123060-A0202-12-0099-169
唑-4-甲醯胺；N-(3-((2S,5S)-6-胺基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-1-(二氟甲基)-1H-吡唑-3-甲醯胺；N-(3-((2S,5S)-6-胺基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(二氟甲基)吡
Figure 106123060-A0202-12-0099-170
-2-甲醯胺； N-(3-((2S,5S)-6-胺基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-4-氯苯甲醯胺；N-(3-((2S,5S)-6-胺基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氟吡啶醯胺；N-(3-((2S,5R)-6-胺基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡啶醯胺；N-[3-[(2S,5S)-6-胺基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-3,4-二氫吡啶-2-基]-4,5-二氟-苯基]-5-氟-吡啶-2-甲醯胺；N-[3-[(2S,5S)-6-胺基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-3,4-二氫吡啶-2-基]-4,5-二氟-苯基]-5-甲氧基-吡啶-2-甲醯胺；N-[3-[(2S,5S)-6-胺基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-3,4-二氫吡啶-2-基]-4,5-二氟-苯基]-5-甲氧基-吡
Figure 106123060-A0202-12-0100-171
-2-甲醯胺；N-[3-[(2S,5R)-6-胺基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-3,4-二氫吡啶-2-基]-4,5-二氟-苯基]-5-氟-吡啶-2-甲醯胺；N-[3-[(2S,5R)-6-胺基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-3,4-二氫吡啶-2-基]-4,5-二氟-苯基]-5-甲氧基-吡啶-2-甲醯胺；N-[3-[(2S,5R)-6-胺基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-3,4-二氫吡啶-2-基]-4,5-二氟-苯基]-5-甲氧基-吡
Figure 106123060-A0202-12-0100-172
-2-甲醯胺；N-[3-[(2S,5S)-6-胺基-5-氟-2,5-雙(氟甲基)-3,4-二氫吡啶-2-基]-4-氟-苯基]-5-氟-吡啶-2-甲醯胺；N-[3-[(2S,5S)-6-胺基-5-氟-2,5-雙(氟甲基)-3,4-二氫吡啶-2-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡啶-2-甲醯胺； N-[3-[(2S,5S)-6-胺基-5-氟-2,5-雙(氟甲基)-3,4-二氫吡啶-2-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡
Figure 106123060-A0202-12-0101-173
-2-甲醯胺；N-[3-[(2S,5R)-6-胺基-5-氟-2,5-雙(氟甲基)-3,4-二氫吡啶-2-基]-4-氟-苯基]-5-氟-吡啶-2-甲醯胺；N-[3-[(2S,5R)-6-胺基-5-氟-2,5-雙(氟甲基)-3,4-二氫吡啶-2-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡啶-2-甲醯胺以及N-[3-[(2S,5R)-6-胺基-5-氟-2,5-雙(氟甲基)-3,4-二氫吡啶-2-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡
Figure 106123060-A0202-12-0101-174
-2-甲醯胺；或所述化合物的藥學上可接受的鹽。
其他BACE抑制劑可以具有以下化學式
Figure 106123060-A0202-12-0101-221
其中Ar選自下組，該組由以下各項組成：苯基、吡啶基、嘧啶基、吡
Figure 106123060-A0202-12-0101-175
基、咪唑基、吡唑基、
Figure 106123060-A0202-12-0101-176
唑基、噻唑基和異
Figure 106123060-A0202-12-0101-177
唑基，並且其中該Ar視情況被一個或多個鹵素、CN、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6氟烷基或C1-C6烷氧基取代；並且R1和R2獨立地是氫、鹵素、C1-C3氟烷基或C1-C3烷基；或其藥學上可接受的鹽。
例如化合物，如(S)-N-(3-(6-胺基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5- 氯吡啶醯胺
(S)-N-(3-(6-胺基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氟吡啶醯胺
(S)-N-(3-(6-胺基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡
Figure 106123060-A0202-12-0102-178
-2-甲醯胺
(S)-N-(3-(6-胺基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-1-(二氟甲基)-1H-吡唑-3-甲醯胺
(S)-N-(3-(6-胺基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-2-(二氟甲基)
Figure 106123060-A0202-12-0102-179
唑-4-甲醯胺
(S)-N-(3-(6-胺基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氰基吡啶醯胺
(S)-N-(3-(6-胺基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-2-甲基
Figure 106123060-A0202-12-0102-180
唑-4-甲醯胺
(S)-N-(3-(6-胺基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基嘧啶-2-甲醯胺
(S)-N-(3-(6-胺基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(二氟甲基)吡
Figure 106123060-A0202-12-0102-181
-2-甲醯胺
(S)-N-(3-(6-胺基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4,5-二氟苯基)-2-甲基
Figure 106123060-A0202-12-0102-182
唑-4-甲醯胺
(S)-N-(3-(6-胺基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4,5-二氟苯基)-5-甲氧基吡
Figure 106123060-A0202-12-0102-183
-2-甲醯胺
(S)-N-(3-(6-胺基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4,5-二氟苯 基)-5-氟吡啶醯胺
(S)-N-(3-(6-胺基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4,5-二氟苯基)-5-氯吡啶醯胺
(S)-N-(3-(6-胺基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4,5-二氟苯基)-5-氰基吡啶醯胺
(S)-N-(3-(6-胺基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4,5-二氟苯基)-5-甲氧基吡啶醯胺
(S)-N-(3-(6-胺基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4,5-二氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡啶醯胺
(S)-N-(3-(6-胺基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4,5-二氟苯基)-5-氰基-3-甲基吡啶醯胺
(S)-N-(3-(6-胺基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡啶醯胺(S)-N-(3-(6-胺基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-溴吡啶醯胺
(S)-N-(3-(6-胺基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-溴吡啶醯胺
或所述化合物的藥學上可接受的鹽。
其他BACE化合物可以來自以下化學式
Figure 106123060-A0202-12-0103-222
其中Ar選自下組，該組由以下各項組成：苯基、吡啶基、嘧啶基、吡
Figure 106123060-A0202-12-0104-184
基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、
Figure 106123060-A0202-12-0104-185
唑基、異
Figure 106123060-A0202-12-0104-186
唑基，並且其中該Ar視情況被一個或多個選自鹵素、CN、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6氟烷基或C1-C6烷氧基的取代基取代；並且R1係氫、鹵素、C1-C3氟烷基或C1-C3烷基；或其藥學上可接受的鹽。
該等化合物可以是(S)-N-(3-(6-胺基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氯吡啶醯胺，(S)-N-(3-(6-胺基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氟吡啶醯胺，(S)-N-(3-(6-胺基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡
Figure 106123060-A0202-12-0104-187
-2-甲醯胺，(S)-N-(3-(6-胺基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-2-甲基
Figure 106123060-A0202-12-0104-188
唑-4-甲醯胺，(S)-N-(3-(6-胺基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡啶醯胺，(S)-N-(3-(6-胺基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(二氟甲基)吡
Figure 106123060-A0202-12-0104-189
-2-甲醯胺，(S)-N-(3-(6-胺基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氰基吡啶醯胺，(S)-N-(3-(6-胺基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯 基)-4-甲基噻唑-2-甲醯胺，(S)-N-(3-(6-胺基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基嘧啶-2-甲醯胺，(S)-N-(3-(6-胺基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基-3-甲基吡
Figure 106123060-A0202-12-0105-190
-2-甲醯胺，(S)-N-(3-(6-胺基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氰基-3-甲基吡啶醯胺，(S)-N-(3-(6-胺基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-溴吡啶醯胺，(S)-N-(3-(6-胺基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡啶醯胺，以及(S)-N-(3-(6-胺基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡
Figure 106123060-A0202-12-0105-191
-2-甲醯胺；或所述化合物的藥學上可接受的鹽。
其他BACE抑制劑可以具有以下化學式
Figure 106123060-A0202-12-0105-223
其中Ar選自下組，該組由以下各項組成：苯基、吡啶基、嘧啶基、吡
Figure 106123060-A0202-12-0105-192
基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、
Figure 106123060-A0202-12-0105-193
唑基、異
Figure 106123060-A0202-12-0105-194
唑基，並且其中該Ar視情況被一個或多個選自鹵素、CN、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6氟烷基或C1-C6烷氧基的取代基取代；並且 R1係一個或多個氫、鹵素、C1-C3氟烷基或C1-C3烷基；或其藥學上可接受的鹽。
該化合物可以是：N-(3-((2R,3S,5S)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氟吡啶醯胺，N-(3-((2R,3S,5S)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡
Figure 106123060-A0202-12-0106-195
-2-甲醯胺，N-(3-((2R,3S,5S)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡啶醯胺，N-(3-((2R,3S,5R)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氟吡啶醯胺，N-(3-((2R,3S,5R)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡
Figure 106123060-A0202-12-0106-196
-2-甲醯胺，N-(3-((2R,3S,5R)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-2-甲基
Figure 106123060-A0202-12-0106-197
唑-4-甲醯胺，N-(3-((2R,3S,5R)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡啶醯胺，N-(3-((2R,3S,5R)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡啶醯胺，N-(3-((2R,3S,5R)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氯吡啶醯胺，N-(3-((2R,3S,5R)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟 苯基)-1-甲基-1H-咪唑-2-甲醯胺，N-(3-((2R,3S,5R)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(三氟甲基)吡
Figure 106123060-A0202-12-0107-198
-2-甲醯胺，N-(3-((2R,3S,5R)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-4-甲基噻唑-2-甲醯胺，N-(3-((2R,3S,5R)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-2-(二氟甲基)
Figure 106123060-A0202-12-0107-199
唑-4-甲醯胺，N-(3-((2R,3S,5R)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-1-(二氟甲基)-1H-吡唑-3-甲醯胺，N-(3-((2R,3S,5R)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(二氟甲基)吡
Figure 106123060-A0202-12-0107-200
-2-甲醯胺，N-(3-((2R,3S,5R)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-4-氯苯甲醯胺，N-(3-((2R,3S,5R)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氰基吡啶醯胺，N-(3-((2R,3S,5R)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4,5-二氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡啶醯胺，N-(3-((2R,3S,5S)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡啶醯胺，N-(3-((2R,3S,5S)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡
Figure 106123060-A0202-12-0107-201
-2-甲醯胺，N-(3-((2R,3S,5S)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟 苯基)-5-氰基-3-甲基吡啶醯胺，N-(3-((2R,3S,5S)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4,5-二氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡啶醯胺，N-(3-((2R,3R,5S)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡啶醯胺，N-(3-((2R,3S,5S)-6-胺基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-溴吡啶醯胺或所述化合物的藥學上可接受的鹽。
b)將τ蛋白抗體與N3PGLU ABETA抗體組合
在本發明的療法、組成物或套組中，可以將τ蛋白抗體與N3PGLU ABETA抗體組合。
c)將τ蛋白抗體與在主動或被動A β肽免疫療法中有用的化合物組合
在本發明的療法、組成物或套組中，可以將τ蛋白抗體與在主動或被動A β肽免疫療法中有用的化合物組合。
d)將τ蛋白抗體與NMDA受體拮抗劑組合
在本發明的療法、組成物或套組中，可以將τ蛋白抗體與NMDA受體拮抗劑組合。該NMDA受體拮抗劑可以選自下組，該組由以下各項組成：美金剛(Memantine,)、鈉門達(Namenda)、Namzaric(美金剛/多奈派齊)、以及其類屬形式。該NMDA受體拮抗劑可以選自抗精神藥。突觸前神經元藉由負反饋機制禁止過量的穀胺酸釋放，但是在諸如AD的細胞應激條件下，這種機制受到損害。突觸裂縫中過量的穀胺酸導致突觸後鈣 通道不斷打開，從而導致神經元內的細胞內鈣水平升高，引起嚴重的神經元損傷和/或死亡。藉由在過量鈣流入條件下拮抗NMDA受體，抗精神藥減少鈣向神經元中的過度流入，減少細胞損傷並改善正常的神經元信號，並且因此改善認知功能。
e)將τ蛋白抗體與另外的τ蛋白聚集抑制劑組合；
在本發明的療法、組成物或套組中，可以將τ蛋白抗體與τ蛋白聚集抑制劑組合。
f)將τ蛋白抗體與乙醯膽鹼酯酶抑制劑組合
在本發明的療法、組成物或套組中，可以將τ蛋白抗體與乙醯膽鹼酯酶抑制劑(AChEI)組合。AChEI通常被用作針對在輕度至中度AD中的認知症狀的一線治療。AChEI還被廣泛地用於治療中度至重度AD，包括批准用於該亞群的多奈派齊。在AD患者中觀察到AChEI減輕膽鹼能缺乏症，並且提高患者進行日常活動的能力。在一個實施方式中，本發明包括一種療法，該療法包括如本文定義的τ蛋白抗體，以及乙醯膽鹼酯酶抑制劑。
在一個實施方式中，該AChEI選自下組，該組由以下各項組成：多奈派齊、加蘭他敏(Galantamine)以及利凡斯的明(Rivastigmine)。該AChEI可以是口服片劑、膠凍劑、糖漿劑或口服溶液製劑的其他形式。AChEI也可能是透皮給藥的貼劑。
g)將τ蛋白抗體與抗癲癇藥組合；
在本發明的療法、組成物或套組中，可以將τ蛋白抗體與抗癲癇藥組合。
h)將τ蛋白抗體與抗炎藥組合；
在本發明的療法、組成物或套組中，可以將τ蛋白抗體與抗炎藥組合。
i)將τ蛋白抗體與抗抑鬱藥組合
在本發明的療法、組成物或套組中，可以將τ蛋白抗體與抗抑鬱藥組合。
抑鬱症係常見的AD失智症早期併發症狀。三環抗抑鬱藥曾經係針對AD中抑鬱症狀的較佳的治療方法，但SSRI已經在很大程度上取代了該等藥物。在一個實施方式中，依他普侖(Escitalopram)係抗抑鬱藥，因為它有利於副作用特徵和最小的藥物相互作用，因此經常被用於治療AD。在另外的實施方式中，西酞普蘭(citalopram)或舍曲林(sertraline)係抗抑鬱藥，因為它們也經常被使用。在另外的實施方式中，沃替西汀(vortioxetine)係抗抑鬱藥，因為它與在患有MDD的患者的神經療效的認知性能和神經功能的成像證據的改善有關。該抗抑鬱藥可以選自下組，該組由以下各項組成：依他普侖、舍曲林、西酞普蘭、帕羅西汀、氟西汀(Fluoxetine)、文拉法辛(Venlafaxine)、曲唑酮(Trazodone)、米氮平(Mirtazapine)、沃替西汀(Vortioxetine)以及其類屬形式。
本發明的另一個方面係針對在一種組成物中的本發明的抗體或其表位結合片段，連同藥學上可接受的載體、稀釋劑、佐劑和/或穩定劑。本發明的抗體或其表位結合片段可以在用於治療τ蛋白病變的療法中使用。典型地，該τ蛋白病變選自下組，該組由以下各項組成：阿茲海默症；嗜銀顆粒失智(AGD)；精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD 的患者中的精神病；因AD導致的情感冷漠或患有AD的患者中的情感冷漠；患有雷維體失智的患者的精神病症狀；進行性核上性麻痹(PSP)；額顳葉失智症(FTD或其變體)；TBI(急性或慢性創傷性腦損傷)；皮質基底節變性(CBD)；匹克病；原發性年齡相關性τ蛋白病變(PART)；神經纖維纏結為主型老年失智；拳擊員失智；慢性創傷性腦病；中風；中風恢復；與帕金森病相關的神經變性；與染色體關聯的帕金森綜合症；利緹可-伯蒂格病(關島型帕金森病-失智複合征)；神經節膠質瘤和神經節細胞瘤；腦膜血管瘤病；腦炎後帕金森綜合症；亞急性硬化性泛腦炎；杭丁頓症；鉛毒腦病；結節性硬化症；哈勒沃登-施帕茨症候群以及脂褐質症。更典型地，該τ蛋白病變選自下組，該組由以下各項組成：阿茲海默症；嗜銀顆粒失智(AGD)；精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；因AD導致的情感冷漠或患有AD的患者中的情感冷漠；患有雷維體失智的患者的精神病症狀；進行性核上性麻痹(PSP)；額顳葉失智症(FTD或其變體)；TBI(急性或慢性創傷性腦損傷)；皮質基底節變性(CBD)；以及匹克病。特別地，該τ蛋白病變可以選自阿茲海默症；嗜銀顆粒失智(AGD)；因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；因AD導致的情感冷漠或患有AD的患者中的情感冷漠；以及患有雷維體失智的患者的精神病症狀。
藉由本發明所設想的治療可以是長期的並且患者可以接受至少2週(如至少持續1個月、6個月、1年或更久)治療。
本發明的該等抗體可以例如是藉由雜交瘤方法產生的單株抗體，該雜交瘤方法首次描述於Kohler等人，Nature[自然]256，495(1975)， 或可以是藉由重組DNA或其他方法產生的單株抗體，或更較佳的是可以藉由揭露的新穎方法產生。還可以使用例如，在Clackson等人(Nature[自然]352，624-628(1991))和Marks等人，J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]222，581-597(1991)中描述的技術從噬菌體抗體展示文庫中分離單株抗體。單株抗體可以從任何適合的來源獲得。因此，例如，單株抗體可以從製備自鼠類脾臟B淋巴細胞的雜交瘤獲得，該等淋巴細胞獲得自用感興趣的抗原或編碼感興趣的抗原的核酸免疫的小鼠，例如，該等淋巴細胞處於在表面表現該抗原的細胞的形式。單株抗體還可以從來源於免疫的人的或來自非人哺乳動物(如大鼠、兔、狗、綿羊、山羊、靈長類動物等)的表現抗體的細胞的雜交瘤獲得。
在一個實施方式中，本發明的抗體係人抗體。可以使用攜帶部分人免疫系統而不是小鼠免疫系統的轉基因或轉染色體小鼠產生針對τ蛋白的人類單株抗體。此類轉基因和轉染色體小鼠包括分別在本文中稱為HuMAb(人類單株抗體)小鼠和KM小鼠的小鼠，並且在本文中統稱為“轉基因小鼠”。
HuMAb小鼠包含人類免疫球蛋白基因迷你座位(mini-locus)，該迷你座位編碼未重排的人類重鏈可變和恒定(μ和Y)以及輕鏈可變和恒定(κ)鏈免疫球蛋白序列，連同靶向的突變，所述突變使內源性μ和K鏈座位失活(Lonberg,N.等人，Nature[自然]368，856-859(1994))。因此，該等小鼠展示出小鼠IgM或κ的表現減少，並且響應於免疫，所引入的人類重鏈和輕鏈轉基因經歷類別轉換和體細胞突變以產生高親和力人類IgG、κ單株抗體(Lonberg,N.等人(1994)，同上；評論於 Lonberg,N.，Handbook of Experimental Pharmacology[實驗藥物學手冊]113，49-101(1994)中；Lonberg,N.和Huszar,D.，Intern.Rev.Immunol.[國際免疫學評論]第13卷65-93(1995)，以及Harding,F.和Lonberg,N.，Ann.N.Y.Acad.Sci.[紐約科學院年刊]764536-546(1995))。HuMAb小鼠的製備詳細描述於Taylor,L.等人，Nucleic Acids Research[核酸研究]20，6287-6295(1992)，Chen,J.等人，International Immunology[國際免疫學]5，647-656(1993)，Tuaillon等人，J.Immunol.[免疫學雜誌]152，2912-2920(1994)，Taylor,L.等人，International Immunology[國際免疫學]6，579-591(1994)，Fishwild,D.等人，Nature Biotechnology[自然生物技術]14，845-851(1996)。還參見US 5,545,806、US 5,569,825、US 5,625,126、US 5,633,425、US 5,789,650、US 5,877,397、US 5,661,016、US 5,814,318、US 5,874,299、US 5,770,429、US 5,545,807、WO 98/24884、WO 94/25585、WO 93/1227、WO 92/22645、WO 92/03918以及WO 01/09187。
Hco7、HCo12、HCo17和HCo20小鼠在其內源輕鏈(κ)基因中具有JKD破壞(如描述於Chen等人，EMBOJ.[歐洲分子生物學學會雜誌]12，811-820(1993))，在其內源重鏈基因中具有種CMD破壞(如描述於WO 01/14424的實例1)以及KCo5人κ輕鏈轉基因(如描述於Fishwild等人，Nature Biotechnology[自然生物技術]14，845-851(1996))。此外，HCo7小鼠具有HCo7人重鏈轉基因(如描述於US 5,770,429)，HCo12小鼠具有HCo12人重鏈轉基因(如描述於WO 01/14424的實例2)，HCo17小鼠具有HCo17人重鏈轉基因(如描述於WO 01/09187的實例2)並且HCo20小鼠具有HCo20人重鏈轉基因。所得小鼠在對內源小鼠重鏈和κ輕鏈座位破壞純 合的背景下表現人免疫球蛋白重鏈和κ輕鏈轉基因。
在KM小鼠品系中，內源小鼠κ輕鏈基因已經被同型結合地破壞，如描述於Chen等人，EMBO J.[歐洲分子生物學學會雜誌]12，811-820(1993)，並且內源小鼠重鏈基因已經被同型結合地破壞，如描述於WO 01/09187的實例1。這個小鼠品系攜帶人κ輕鏈轉基因KCo5，如描述於Fishwild等人，Nature Biotechnology[自然生物技術]14，845-851(1996)中。這個小鼠品系還攜帶由染色體14片段hCF(SC20)構成的人重鏈轉染色體，如描述於WO 02/43478中。HCo12-Balb/c、HCo17-Balb/c和HCo20-Balb/c小鼠可以藉由將HCo12、HCo17和HCo20與KCo5[J/K](Balb)雜交來產生，如描述於WO 09/097006中。
rTg4510小鼠係已知的τ蛋白病變模型，提供了突變體τ蛋白轉基因表現上的時空控制。在KM小鼠品系中，內源性小鼠κ輕鏈基因已經純合地破壞，如Chen等人EMBO J.12，811-820(1993)中所述，並且內源性小鼠重鏈基因已經純合地破壞，如在WO 01/09187的實例1中所述。這個小鼠品系攜帶人κ輕鏈轉基因KCo5，如描述於Fishwild等人，Nature Biotechnology[自然生物技術]14，845-851(1996)中。該小鼠品系還攜帶由染色體14表位結合片段hCF(SC20)構成的人類重鏈轉染色體，如在WO 02/43478中所述。
來自該等轉基因小鼠的脾細胞可以用於根據熟知的技術產生分泌人單株抗體的雜交瘤。本發明的人單株抗體或多株抗體或者源於其他物種的本發明的抗體還可以藉由產生對於感興趣的免疫球蛋白重鏈和輕鏈序列而言轉基因的另一非人哺乳動物或植物並且從其中產生可回收形式 的抗體而轉基因地產生。與哺乳動物中的轉基因生產相結合，抗體可以從山羊、奶牛或其他哺乳動物的乳中產生和回收(參考，例如US 5,827,690；US 5,756,687；US 5,750,172和US 5,741,957)。
本發明的抗體可以具有任何同種型。同種型的選擇典型地將由希望的效應子功能(如ADCC誘導)來指導。示例性同種型係IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可以使用人輕鏈恒定結構域κ或λ中任一者。如果希望的話，本發明的抗τ蛋白抗體的類別可以藉由已知的方法轉換。例如，最初是IgM的本發明的抗體可以經類別轉換變為本發明的IgG抗體。此外，類別轉換技術可以用來將一個IgG亞類轉化成另一亞類，例如從IgG1到IgG2。因此，本發明的抗體的效應子功能可以藉由同種型切換變為例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗體，用於各種治療用途。在一個實施方式中，本發明的抗體係IgG1抗體，例如IgG1,κ。抗體被說成屬於特定同種型，如果其胺基酸序列相對於其他同種型與該同種型大部分同源的話。
在一個實施方式中，本發明的抗體係全長抗體，較佳的是IgG抗體，特別是IgG1,κ抗體。在另一個實施方式中，本發明的抗體係抗體表位結合片段或單鏈抗體。
抗體及其表位結合片段可以例如藉由使用常規技術的表位結合片段化獲得，並且以與在此對完整抗體所述的相同方式針對效用篩選表位結合片段。例如，F(ab')2表位結合片段可以藉由用胃蛋白酶處理抗體產生。可以處理所得F(ab')2表位結合片段以減少二硫橋，以產生Fab'表位結合片段。可以藉由用木瓜蛋白酶處理IgG抗體來獲得Fab表位結合片段；可以 用IgG抗體的胃蛋白酶消化來獲得Fab'表位結合片段。F(ab')表位結合片段還可以藉由經由硫醚鍵或二硫鍵結合以下描述的Fab'來產生。Fab'表位結合片段係藉由切割F(ab')2的鉸鏈結構域的二硫鍵獲得的抗體表位結合片段。Fab'-表位結合片段可以藉由用還原劑如二硫蘇糖醇處理F(ab')2表位結合片段獲得。抗體表位結合片段還可以藉由在重組細胞中表現編碼此類表位結合片段的核酸產生(參見例如Evans等人，J.Immunol.Meth.[免疫學方法雜誌]184，123-38(1995))。例如，編碼F(ab')2表位結合片段一部分的嵌合基因可以包括編碼CH1結構域和H鏈的鉸鏈結構域的DNA序列，隨後為翻譯終止密碼子，以產生這樣一種截短的抗體表位結合片段分子。
在一個實施方式中，抗τ蛋白抗體係單價抗體，較佳的是如在WO 2007059782中所述的具有鉸鏈區缺失的單價抗體(將其藉由引用以其全文結合在此)。因此，在一個實施方式中，該抗體係單價抗體，其中所述抗τ蛋白抗體藉由一種方法構建，該方法包括：i)提供編碼所述單價抗體的輕鏈的核酸構建體，所述構建體包括編碼所選的抗原特異性抗τ蛋白抗體的VL區的核苷酸序列，和編碼Ig的恒定CL區的核苷酸序列，其中編碼所選的抗原特異性抗體的VL區的所述核苷酸序列和編碼Ig的CL區的所述核苷酸序列被可操作地連接在一起，並且其中在IgG1亞型的情況下，編碼該CL區的核苷酸序列已經被修飾，這樣使得在多株人類IgG的存在下或當給予給動物或人類時，該CL區不含有能夠與包含該CL區的一致胺基酸序列的其他肽形成二硫鍵或共價鍵的任何胺基酸；ii)提供編碼所述單價抗體的重鏈的核酸構建體，所述構建體包含編碼所選抗原特異性抗體的VH區的核苷酸序列和編碼人類Ig的恒定CH區的核苷酸序列，其中編碼CH 區的核苷酸序列已經被修飾，這樣使得在多株人類IgG的存在下或當給予給動物、人時，對應於鉸鏈區和(如由Ig亞型所要求的)CH區的其他區域(如CH3區)的區域不包含參與和包含人Ig的CH區的一致胺基酸序列的其他肽形成二硫鍵或共價或穩定的非共價重鏈間鍵的任何胺基酸殘基，其中編碼所選抗原特異性抗體的VH區的所述核苷酸序列和編碼所述Ig的CH區的所述核苷酸序列被可操作地連接在一起；iii)提供用於產生所述單價抗體的細胞表現系統；iv)藉由在(iii)的細胞表現系統的細胞中共表現(i)和(ii)的核酸構建體來產生所述單價抗體。
類似地，在一個實施方式中，本發明的抗τ蛋白抗體係單價抗體，其包含：(i)如在此描述的本發明抗體的可變結構域或所述結構域的表位結合部分，以及(ii)免疫球蛋白的CH域或其包含CH2和CH3域的結構域，其中該CH域或其結構域已經被修飾，這樣使得對應於鉸鏈域和(如果該免疫球蛋白不是IgG4亞型的話)CH域的其他結構域(如CH3域)的結構域不包含任何胺基酸殘基，該等任何胺基酸殘基能夠與相同CH域形成二硫鍵或在多株人IgG的存在下與相同CH域形成其他共價或穩定的非共價重鏈間鍵。
在另外的實施方式中，本發明的單價抗體的重鏈已經被修飾為使得整個鉸鏈區已缺失。
在另一個另外的實施方式中，單價抗體的序列已經被修飾，這樣使得它不包含用於N-連接的糖基化的任何受體位點。
本發明還包括“雙特異性抗體”，其中抗τ蛋白結合區(例 如抗τ蛋白單株抗體的τ蛋白-結合區)係靶向多於一個表位(例如第二表位可以包括活性運輸受體的表位，使得雙特異性抗體可以展現出改進的跨生物屏障例如血腦障壁的轉胞吞作用)的二價或多價雙特異性支架的部分。因此，在另一個另外的實施方式中，抗τ蛋白抗體的單價Fab可以連接到另外的靶向不同蛋白的Fab或scfv上，以產生雙特異性抗體。雙特異性抗體可以具有雙重功能，例如由抗τ蛋白結合結構域賦予的治療功能，以及可以結合至受體分子以增強跨生物屏障如血腦障壁的轉移的運輸功能。
本發明的抗體及其表位結合片段還包括單鏈抗體。單鏈抗體係重鏈和輕鏈Fv域被連接的肽。在一個實施方式中，本發明提供了單鏈Fv(scFv)，其中在本發明的抗τ蛋白抗體的Fv中的重鏈和輕鏈與柔性肽接頭(典型地具有約10、12、15或更多個胺基酸殘基)連接在單一肽鏈中。產生此類抗體的方法描述於例如US 4,946,778；Pluckthun，在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies[單株抗體藥理學]，第113卷，Rosenburg和Moore編輯，施普林格出版公司(Springer-Verlag)，紐約，第269-315頁(1994)；Bird等人，Science[科學]242，423-426(1988)；Huston等人，PNAS USA 85，5879-5883(1988)和McCafferty等人，Nature[自然]348，552-554(1990)。單鏈抗體可以是單價的，如果僅使用單個VH和VL的話；可以是二價的，如果使用兩個VH和VL的話；或可以是多價的，如果使用兩個以上VH和VL的話。
可以藉由包含任何適合數目的經修飾的胺基酸和/或與此類偶聯取代基締合來修飾在此描述的抗體及其表位結合片段。在該背景中的 適合性通常是藉由至少基本上保留與未衍生化的親本抗τ蛋白抗體關聯的τ蛋白選擇性和/或τ蛋白特異性的能力來確定。該一個或多個修飾胺基酸的包含在以下方面可以是有利的，例如，增加多肽血清半衰期，降低多肽抗原性，或增加多肽貯存穩定性。對一種或多種胺基酸進行修飾，例如，在重組產生的過程中與翻譯同時進行或在翻譯之後進行(例如，在哺乳動物細胞中表現過程中在N-X-S/T基序上的N-連接的糖基化作用)，或藉由合成手段進行修飾。經修飾的胺基酸的非限制性實例包括：糖基化的胺基酸、硫酸化的胺基酸、異戊二烯化(例如，法尼基化(farnesylated)、香葉基-香葉基化(geranyl-geranylated))的胺基酸、乙醯化的胺基酸、醯化的胺基酸、聚乙二醇化的胺基酸、生物素醯化的胺基酸、羧基化的胺基酸、磷酸化的胺基酸、以及類似胺基酸。足夠指導熟習該項技術者進行胺基酸修飾的參考在文獻中相當充分。實例方案可見於Walker(1998)Protein Protocols on CD-ROM[關於CD-ROM的蛋白質方案]胡瑪納出版社(Humana Press)，托瓦塔(Towata)，NJ。該經修飾的胺基酸可例如選自：糖基化的胺基酸、聚乙二醇化的胺基酸、法尼基化的胺基酸、乙醯化的胺基酸、生物素醯化的胺基酸、偶聯到脂類部分上的胺基酸、或偶聯到有機衍化劑上的胺基酸。
本發明的抗體及其表位結合片段還可以藉由共價綴合到聚合物上進行化學修飾，以例如增加它們的循環半衰期。示例性聚合物以及將它們附接到肽的方法說明於例如US 4,766,106；US 4,179,337；US 4,495,285和US 4,609,546中。另外的說明性聚合物包括聚氧乙基化的多元醇和聚乙二醇(PEG)(例如，分子量在約1,000與約40,000之間，如在約2,000與約20,000之間，例如約3,000-12,000g/mol的PEG)。
本發明的抗體及其表位結合片段可以進一步用於診斷方法中或用作診斷成像配位基。
在一個實施方式中，提供了包含一種或多種放射性標記的胺基酸的本發明的抗體及其表位結合片段。經放射性標記的抗τ蛋白抗體可以用於診斷和治療目的兩者(綴合至經放射性標記的分子係另一種可能的特徵)。此類標記的非限制性實例包括但不限於：鉍(213Bi)、碳(11C、13C、14C)、鉻(51Cr)、鈷(57Co、60Co)、銅(64Cu)、鏑(165Dy)、鉺(169Er)、氟(18F)、釓(153Gd、159Gd)、鎵(68Ga、67Ga)、鍺(68Ge)、金(198Au)、鈥(166Ho)、氫(3H)、銦(111In、112In、113In、115In)、碘(121I、123I、125I、131I)、銥(192Ir)、鐵(59Fe)、氪(81mKr)、鑭(140La)、鑥(177Lu)、錳(54Mn)、鉬(99Mo)、氮(13N、15N)、氧(15O)、鈀(103Pd)、磷(32P)、鉀(42K)、鐠(142Pr)、鉕(149Pm)、錸(186Re、188Re)、銠(105Rh)、銣(81Rb、82Rb)、釕(82Ru、97Ru)、釤(153Sm)、鈧(47Sc)、硒(75Se)、鈉(24Na)、鍶(85Sr、89Sr、92Sr)、硫(35S)、鍀(99Tc)、鉈(201T1)、錫(113Sn、117Sn)、氙(133Xe)、鐿(169Yb、175Yb、177Yb)、釔(90Y)、鋅(65Zn)以及鋯(89Zr)。鋯(89Zr)係特別感興趣的。用於製備放射性標記的胺基酸和相關肽衍生物的方法在本領域係已知的(參見例如，Junghans等人，在Cancer Chemotherapy and Biotherapy[癌症化療和生物療法]655-686(第2版，Chafner和Longo編輯，利平科特瑞文公司(Lippincott Raven)(1996)中)以及US 4,681,581、US 4,735,210、US 5,101,827、US 5,102,990(US RE35,500)、US 5,648,471和US 5,697,902)。例如，放射性同位素可以氯胺T方法進行偶聯(Lindegren,S.等人(1998)“Chloramine-T In High-Specific-Activity Radioiodination Of Antibodies Using N-Succinimidyl-3-(Trimethylstannyl)Benzoate As An Intermediate[使用N-琥珀醯亞胺基-3-(三甲基錫烷基)苯甲酸酯作為中間體的抗體的高比活放射性碘化中的氯胺-T]”，Nucl.Med.Biol.[核醫學與生物學]25(7)：659-665；Kurth,M.等人(1993)“Site-Specific Conjugation Of A Radioiodinated Phenethylamine Derivative To A Monoclonal Antibody Results In Increased Radioactivity Localization In Tumor[放射性碘化的苯乙胺衍生物至單株抗體的位點特異性偶聯在腫瘤中產生增加的放射性]”，J.Med.Chem.[藥物化學雜誌]36(9)：1255-1261；Rea,D.W.等人(1990)“Site-specifically radioiodinated antibody for targeting tumors[用於靶向腫瘤的位點特異性放射性碘化的抗體]”，Cancer Res.[癌症研究]50(3增刊)：857s-861s)。
本發明還提供了使用以下項可檢測地標記的抗τ蛋白抗體及其表位結合片段：螢光標記(如稀土螯合物(例如，銪螯合物))、螢光素型標記(例如，螢光素、螢光素異硫氰酸酯、5-羧基螢光素、6-羧基螢光素、二氯三
Figure 106123060-A0202-12-0121-202
基胺螢光素)、羅丹明型標記(例如，ALEXA FLUOR® 568(英傑公司(Invitrogen))、TAMRA®或丹磺醯氯)、VIVOTAG 680 XL FLUOROCHROMETM(珀金埃爾默公司(Perkin Elmer))、藻紅蛋白；傘形酮、麗絲胺；花菁；藻紅蛋白、德克薩斯紅、BODIPY FL-SE®(英傑公司(Invitrogen))或其類似物，所有該等都適用於光學檢測。可以採用化學發光標記(例如，魯米諾(luminol)、螢光素酶、螢光素和水母蛋白)。這種診斷和檢測還可以藉由將本發明的診斷分子偶合至可檢測物質(包括但不限於各種酶，酶包括但不限於辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶)或者偶合至輔基複合體(如但不限於鏈黴親和素/生物 素和親和素/生物素)來完成。
可以採用化學發光標記(例如，魯米諾、螢光素酶、螢光素、以及水母蛋白)。這種診斷和檢測還可以藉由將本發明的診斷分子偶聯至可檢測物質或輔基複合物來完成，該等可檢測物質包括但不限於：各種酶、包括但不限於辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙醯膽鹼酯酶的酶，該等輔基複合物例如但不限於鏈黴親和素/生物素以及抗生物素蛋白/生物素。還可以採用順磁性標記，並且較佳的是使用正電子發射斷層攝影(PET)或單光子發射型電腦斷層攝影(SPECT)來檢測。這樣的順磁性標記包括但不限於含有鋁(Al)、鋇(Ba)、鈣(Ca)、鈰(Ce)、鏑(Dy)、鉺(Er)、銪(Eu)、釓(Gd)、鈥(Ho)、銥(Ir)、鋰(Li)、鎂(Mg)、錳(Mn)、鉬(M)、釹(Nd)、鋨(Os)、氧(O)、鈀(Pd)、鉑(Pt)、銠(Rh)、釕(Ru)、釤(Sm)、鈉(Na)、鍶(Sr)、鋱(Tb)、銩(Tm)、錫(Sn)、鈦(Ti)、鎢(W)和鋯(Zi)並且特別是Co+2、CR+2、Cr+3、Cu+2、Fe+2、Fe+3、Ga+3、Mn+3、Ni+2、Ti+3、V+3和V+4的順磁離子的化合物，使用各種正電子發射斷層術的正電子發射金屬以及非放射性順磁金屬離子。
因此，在一個實施方式中，本發明的抗τ蛋白抗體或其τ蛋白-結合片段可以用螢光標記、化學發光標記、順磁性標記、放射性同位素標記或酶標記來標記。標記的抗體或片段可以用於檢測或測量所述τ蛋白在受試者腦中的存在。這種方法可以包括檢測或測量結合至所述τ蛋白上的抗τ蛋白抗體或τ蛋白-結合片段的體內成像，並且可以包括結合至此類τ蛋白的所述抗τ蛋白抗體或τ蛋白-結合片段的離體成像。
在一個另外的方面，本發明涉及編碼本發明的抗體或其τ 蛋白結合片段的一種或多種多肽鏈的表現載體。此類表現載體可以用於重組產生本發明的抗體或其表位結合片段。
在本發明的背景下，表現載體可以是任何適合的DNA或RNA載體，包括染色體載體、非染色體載體和合成核酸載體(包含一組適合的表現控制元件的核酸序列)。此類載體的實例包括SV40的衍生物、細菌質粒、噬菌體DNA、桿狀病毒、酵母質粒、衍生自質粒與噬菌體DNA的組合的載體以及病毒核酸(RNA或DNA)載體。在一個實施方式中，編碼抗τ蛋白抗體的核酸被包含在包含例如直鏈表現元件的裸DNA或RNA載體(如例如Sykes和Johnston，Nat Biotech[自然生物技術]12，355-59(1997)中所述)，壓縮核酸載體(如例如US 6,077,835和/或WO 00/70087中所述)，質粒載體如pBR322、pUC 19/18、或pUC 118/119，“midge”最小尺寸的核酸載體(如例如Schakowski等人，MoI Ther[分子理論]3，793-800(2001)中所述)中，或作為沈澱核酸載體構建體，如CaPO4-沈澱構建體(如例如WO 00/46147，Benvenisty和Reshef，PNAS USA 83，9551-55(1986)，Wigler等人，Cell[細胞]14，725(1978)，以及Coraro和Pearson，Somatic Cell Genetics[體細胞遺傳學]2，603(1981)中所述)。這種核酸載體及其使用在本領域中是熟知的(參見例如US 5,589,466和US 5,973,972)。
在一個實施方式中，該載體適合用於在細菌細胞中表現本發明的抗τ蛋白抗體或其表位結合片段。此類載體的實例包括表現載體，例如BlueScript(Stratagene)、pIN載體(Van Heeke和Schuster，J.Biol.Chem.[生物化學雜誌]264，5503-5509(1989)，pET載體(諾沃根(Novagen)，麥迪森(Madison)，WI)。
表現載體還可以是或可替代地是適用於在酵母系統中進行表現的載體。可以採用任何適用於在酵母系統中進行表現的載體。適合的載體包括例如包含組成型或誘導型啟動子(如α因數、醇氧化酶和PGH)的載體(綜述於：F.Ausubel等人編輯的Current Protocols in Molecular Biology[分子生物學實驗指南]，格林出版和威利國際科學(Greene Publishing and Wiley InterScience)紐約(1987)；Grant等人，Methods in Enzymol[酶學方法]153，516-544(1987)；Mattanovich,D.等人，Methods Mol.Biol.[分子生物學方法]824，329-358(2012)；Celik,E.等人，Biotechnol.Adv.[生物技術進展]30(5)，1108-1118(2012)；Li,P.等人，Appl.Biochem.Biotechnol.[應用生物化學與生物技術]142(2)，105-124(2007)；Böer,E.等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.[應用微生物學與生物技術]77(3)，513-523(2007)；van der Vaart,J.M.，Methods Mol.Biol.[分子生物學方法]178，359-366(2002)和Holliger,P.，ethods Mol.Biol.[分子生物學方法]178，349-357(2002))。
在本發明的表現載體中，編碼抗τ蛋白抗體的核酸可以包括任何適合的啟動子、增強子、以及其他表現輔助元件或與其相關聯。此類元件的實例包括強表現型啟動子(例如，人CMV IE啟動子/增強子連同RSV、SV40、SL3-3、MMTV和HIV LTR啟動子)、有效的聚(A)終止序列、用於在大腸桿菌中產生質粒的複製起點、作為選擇性標記的抗生素抗性基因和/或便利的轉殖位點(例如，多聚接頭)。核酸還可以包含與組成型啟動子(如CMV IE)相對的誘導型啟動子(熟習該項技術者應認識到此類術語實際上是在某些條件下的基因表現程度的描述語)。
在一個甚至另外的方面，本發明涉及重組真核或原核宿主細 胞，如轉染瘤，其產生如在此定義的本發明的抗體或其表位結合片段或者如在此定義的本發明的雙特異性分子。宿主細胞的實例包括酵母、細菌、和哺乳動物細胞，例如CHO或HEK細胞。例如，在一個實施方式中，本發明提供了一種細胞，該細胞包含穩定地整合到細胞基因組中的核酸，該核酸包含編碼用於表現本發明的抗τ蛋白抗體或其表位結合片段的序列。在另一個實施方式中，本發明提供了一種細胞，該細胞包含一種非整合的核酸，如質粒、粘粒、噬菌粒或線性表現元件，該非整合的核酸包含編碼用於表現本發明的抗τ蛋白抗體或其表位結合片段的序列。
在一個另外的方面，本發明涉及一種用於產生抗τ蛋白抗體的方法，所述方法包括以下步驟：a)培養雜交瘤或如以上定義的本發明的宿主細胞，並且b)從培養基純化本發明的抗體。
在一個實施方式中，本發明涉及一種製品，在這種術語在此使用時，該製品包含如在此定義的抗τ蛋白抗體，並且基本上不含天然產生的不能結合至τ蛋白或者不實質性地改變該製品的抗τ蛋白功能的抗體。因此，這種製品不包含天然產生的血清、或這種血清的純化衍生物，該血清或其純化衍生物包含抗τ蛋白抗體與另一種不改變該製品的抗τ蛋白抗體的功能的抗體的混合物，其中這種功能是：(i)基本上不能結合至非磷酸化τ蛋白；(ii)基本上不能結合至在S404處磷酸化且在S396處非磷酸化的τ蛋白；(iii)能夠結合至在S396處磷酸化的τ蛋白；(iv)能夠結合至在S396和S404兩者處均磷酸化的τ蛋白； (v)能夠選擇性地在磷酸化τ蛋白殘基S396和S404之間區分，使其基本上不能結合磷酸化404殘基；(vi)能夠結合來自人類阿茲海默症腦的過度磷酸化τ蛋白；(vii)能夠在病理性人類τ蛋白和非病理性人類τ蛋白之間區分；和/或(viii)當如在此所述與經免疫耗減的來自轉基因小鼠的rTg4510提取物一起使用時，能夠特異性地將過度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa條帶減少至少90%，同時沒有將55kDa τ蛋白條帶減少多於10%，或者當如在此所述與來自人類AD屍體解剖後腦的提取物一起使用時，特異性地將S396磷酸化的過度磷酸化τ蛋白條帶減少至少90%，同時沒有將非過度磷酸化τ蛋白條帶減少多於10%。
本發明具體涉及這樣一種抗τ蛋白抗體的製品，該抗體在胺基酸序列方面(在其CDR、可變結構域、框架殘基和/或恒定結構域中的任一個中)相對於天然存在的抗τ蛋白抗體的結構而言具有結構變化，其中相對於由所述天然存在的抗τ蛋白抗體展現出的功能而言，所述結構變化引起抗τ蛋白抗體展現出顯著改變的功能(即在功能方面多於20%的差異，多於40%的差異，多於60%的差異，多於80%的差異，多於100%的差異，多於150%的差異，多於2倍的差異，多於4倍的差異，多於5倍的差異，或多於10倍的差異)；其中這樣的功能性係：(i)基本上不能結合至非磷酸化τ蛋白；(ii)基本上不能結合至在S404處磷酸化且在S396處非磷酸化的τ蛋白； (iii)能夠結合至在S396處磷酸化的τ蛋白；(iv)能夠結合至在S396和S404二者處均磷酸化的τ蛋白；(v)能夠選擇性地在磷酸化τ蛋白殘基S396和S404之間區分，使其基本上不能結合磷酸化404殘基；(vi)能夠結合來自人類阿茲海默症腦的過度磷酸化τ蛋白；(vii)能夠在病理性人類τ蛋白和非病理性人類τ蛋白之間區分；和/或(viii)當如在此所述與經免疫耗減的來自轉基因小鼠的rTg4510提取物一起使用時，能夠特異性地將過度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa條帶減少至少90%，同時沒有將55kDa τ蛋白條帶減少多於10%，或者當如在此所述與來自人類AD屍體解剖後腦的提取物一起使用時，特異性地將S396磷酸化的過度磷酸化τ蛋白條帶減少至少90%，同時沒有將非過度磷酸化τ蛋白條帶減少多於10%。
術語“基本不含”天然產生的抗體係指在此類製品中完全不存在此類天然產生的抗體，或者在此類製品中包含不會實質性影響該等製品的τ蛋白結合特性的一個濃度的此類天然產生的抗體。如果抗體不具有天然產生的對應物或已經從天然伴隨該抗體的組分中分離或純化，則認為該抗體係“分離的”。
術語“天然產生的抗體”，在它涉及此類製品時，係指在活人或其他動物內引發的抗體(包括天然產生的自身抗體)，作為對活人或其他動物的免疫系統發揮作用的自然結果。
因此，本發明的製品不排除並且事實上明確涵蓋此類包含抗 τ蛋白抗體和有意添加的能夠結合至未由τ蛋白擁有的表位上的另外抗體的製品。此類製品特別包括其實施方式，其中該製品在治療阿茲海默症(AD)、嗜銀顆粒失智(AGD)、進行性核上性麻痹(PSP)、和皮質基底節變性(CBD)中展現出增強的功效。此外，本發明係針對包含抗τ蛋白抗體、或其表位結合片段的製品，預期在治療精神病(特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病)，因AD導致的情感冷漠或患有AD的患者中的情感冷漠，以及患有雷維體失智的患者的精神病症狀中使用。此外，本發明的製品包含抗τ蛋白抗體或其表位結合片段，其可以用於治療中風、中風恢復、與帕金森病相關的神經變性。
在甚至另外的方面，本發明涉及藥物組成物，其包含：(i)如均在此定義的τ蛋白抗體或其表位結合片段，或包含這種抗τ蛋白抗體或其表位結合片段的製品(在這種術語在此定義時)；和(ii)藥學上可接受的載體。
該等藥物組成物可以用藥學上可接受的載體或稀釋劑以及任何其他已知的佐劑和賦形劑根據常規技術配製，該等常規技術係例如在以下中揭露的技術：Remington：The Science and Practice of Pharmacy[雷明頓：藥學科學與實踐]，第22版，Gennaro編，馬克出版公司(Mack Publishing Co.)，伊斯頓，賓夕法尼亞，2013。
藥學上可接受的載體或稀釋劑連同任何其他已知的佐劑和賦形劑應該適合於本發明的所選化合物和所選給藥方式。基於就表位結合而言對本發明的所選化合物或藥物組成物的所希望的生物特性的顯著不利影響的缺少(例如，小於實質性影響(10%或更少相對抑制、5%或更少相 對抑制等))來確定藥物組成物的載體和其他組分的適合性。
本發明的藥物組成物還可以包括稀釋劑、填充劑、鹽、緩衝劑、洗滌劑(例如，非離子型洗滌劑(如Tween-20或Tween-80)、穩定劑(例如，無糖或無蛋白胺基酸)、防腐劑、組織固定劑、增溶劑、和/或其他適合用於包含於藥物組成物中的材料。以不影響組成物的生物活性為目的來選擇稀釋劑。此類稀釋劑的實例為蒸餾水、生理磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏(Ringer’s)溶液、右旋糖溶液和漢克氏溶液。此外，藥物組成物或配製品還可以包含其他載體，或無毒的、非治療性的、非免疫原性的穩定劑等。組成物還可以包含大的、緩慢代謝的大分子，如蛋白質、多糖(像殼聚糖)、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(例如，乳膠功能化的交聯瓊脂糖、瓊脂糖、纖維素等)、聚合胺基酸、胺基酸共聚物以及脂質聚集體(例如，油滴或脂質體)。
本發明藥物組成物中活性成分的實際劑量水平可以變化，以獲得對於特定患者、組成物和給藥方式而言有效實現所希望的治療應答的活性成分量。所選的劑量水平將取決於多種藥代動力學因素，包括所採用的本發明具體組成物或其醯胺的活性，給藥路徑，給藥時間，所採用的具體化合物的***速率，治療持續時間，與所採用的具體組成物組合使用的其他藥物、化合物和/或材料，所治療患者的年齡、性別、體重、病情、一般健康狀況和既往病史以及醫學領域熟知的類似因素。
藥物組成物可以藉由任何適合的途徑和方式給予，包括：用於預防性和/或治療性治療的胃腸外、局部、口服或鼻內手段。在一個實施方式中，胃腸外地給予本發明的藥物組成物。如在此使用的短語“胃腸外 給藥(parenteral administration)”和“胃腸外地給藥(administered parenterally)”意指除腸內和局部給藥之外的給藥方式，通常是藉由注射，並且包括表皮、靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眼眶內、心內、真皮內、腹膜內、腱內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、椎管內、顱內、胸腔內、硬膜外以及胸骨內注射和輸注。
另外的適合的在體內和在體外給予本發明化合物的途徑在本領域係熟知的並且可以由熟習該項技術者進行選擇。
在一個實施方式中，藉由靜脈內或皮下注射或輸注給予該藥物組成物。
藥學上可接受的載體包括任何和所有適合的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑、抗氧化劑和吸收延遲劑以及可與本發明的化合物生理上相容的類似物。
可以用於本發明的藥物組成物中的適合的水性和非水性載體的實例包括水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、乙醇、右旋糖、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、以及類似物)、以及其適合的混合物、植物油(如橄欖油、玉米油、花生油、棉籽油、以及芝麻油)、羧甲基纖維素膠體溶液、黃蓍膠以及可注射的有機酯(例如油酸乙酯)和/或各種緩衝劑。在藥物領域中其他載體係熟知的。
藥學上可接受的載體包括無菌水溶液或分散體和用於臨時製備無菌注射液或分散體的無菌粉劑。使用此類介質和試劑用於藥物活性物質在本領域係已知的。除了在任何常規介質或試劑與活性化合物不相容的情況下，考慮了其在本發明藥物組成物中的使用。
可例如藉由使用包衣材料如卵磷脂，藉由維持所需的顆粒大小(在分散劑的情況下)和藉由使用表面活性劑，來維持適當的流動性。
本發明的藥物組成物還可以包含藥學上可接受的抗氧化劑，例如(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱胺酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本發明的藥物組成物還可以在組成物中包含等滲劑，如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇、甘油)或氯化鈉。
本發明的藥物組成物還可以含有一種或多種適用於所選給藥途徑的佐劑，如防腐劑、潤濕劑、乳化劑、分散劑、防腐劑或緩衝劑，該等試劑可以增強藥物組成物的保質期或有效性。本發明的化合物可以與載體一起製備，該等載體可以保護化合物免於被快速釋放，如控釋配製品，包括植入物、透皮貼劑和微囊化遞送系統。此類載體可以包括明膠、單硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、可生物降解的生物相容聚合物(如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸)(單獨的或與蠟一起)或本領域熟知的其他材料。用於製備此類配製品的方法通常是熟習該項技術者已知的。參見例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems[緩釋和控釋遞藥系統]，J.R.Robinson編輯，馬歇爾德克公司(Marcel Dekker,Inc.)，紐約，1978。
在一個實施方式中，可以將本發明的化合物配製成確保在體 內恰當分佈。用於胃腸外給藥的藥學上可接受的載體包括無菌水溶液或分散體和用於臨時製備無菌注射液或分散體的無菌粉劑。使用此類介質和試劑用於藥物活性物質在本領域係已知的。除了在任何常規介質或試劑與活性化合物不相容的情況下，考慮了其在本發明藥物組成物中的使用。還可以將補充活性化合物摻入組成物中。
注射用藥物組成物通常在生產和保存條件下典型地必須係無菌且穩定的。可以將組成物配製為溶液、微乳液、脂質體或適於高藥物濃度的其他有序結構。載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其適合的混合物、植物油(如橄欖油)和可注射有機酯(如油酸乙酯)的水性或非水性溶劑或分散介質。可以例如藉由使用包衣材料(如卵磷脂)，藉由維持所需的粒度(在分散體的情況下)和藉由使用表面活性劑來維持適當的流動性。在許多情況下，較佳的是在組成物中包括等滲劑，例如糖、多元醇(如甘油、甘露醇、山梨醇)或氯化鈉。可注射組成物的延長吸收可以藉由在組成物中包括延遲抗體吸收的試劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)來實現。無菌可注射溶液可以藉由按需要將所需量的活性化合物與一種例如像上文列舉的成分或成分的組合摻在適當溶劑中，隨後滅菌微孔過濾來製備。通常，藉由將活性化合物摻入無菌載體中來製備分散體，該無菌載體含有基礎分散介質和例如來自上文列舉的那些的其他所需成分。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉劑的情況下，製備方法的實例係真空乾燥和冷凍乾燥(凍乾)，這從其之前的無菌過濾溶液得到活性成分和任何另外的所希望成分的粉劑。
無菌可注射溶液可以藉由按需要將所需量的活性化合物與 一種上文列舉的成分或成分的組合摻在適當溶劑中，隨後滅菌微孔過濾來製備。通常，藉由將活性化合物摻入無菌載體中來製備分散體，該無菌載體含有基礎分散介質和來自上文列舉的那些的其他所需成分。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉劑的情況下，製備方法的實例係真空乾燥和冷凍乾燥(凍乾)，這從其之前的無菌過濾溶液得到活性成分和任何另外的所希望成分的粉劑。
調整在以上治療方法和在此描述的使用中的劑量方案，以提供最佳期望應答(例如，治療應答)。例如，可以給予單次推注，可以隨時間給予若干分次劑量或者可以由治療情況的緊迫性所指示的按比例減少或增加劑量。為了便於給藥和劑量統一，胃腸外組成物可以被配製為劑量單位形式。本文使用的劑量單位形式係指適合作為單一劑量用於待治療受試者的物理上離散的單位；每個單位含有經計算以產生與所需的藥物載體組合產生期望的治療效果的活性化合物的預定量。針對本發明的劑量單位形式的描述受指示於並且直接取決於(a)活性化合物的獨特特徵和待達到的具體治療效果，以及(b)在複合這樣的活性化合物以在個體中獲得靈敏治療的領域中固有的限制。
針對本發明的抗體或其表位結合片段的有效劑量和劑量方案取決於待治療的疾病或病症，並且可以由熟習該項技術者確定。在給予一個劑量的任何給定日，該劑量的範圍可以是從約0.0001mg/kg至約100mg/kg、並且更通常是從約0.01mg/kg至約5mg/kg宿主體重。例如，劑量可以是1mg/kg體重或10mg/kg體重，或在1-10mg/kg體重範圍內。因此示例性劑量包括：從約0.1至約10mg/kg/體重、從約0.1至約5mg/kg/體重、從 約0.1至約2mg/kg/體重、從約0.1至約1mg/kg/體重，例如約0.15mg/kg/體重、約0.2mg/kg/體重、約0.5mg/kg/體重、約1mg/kg/體重、約1.5mg/kg/體重、約2mg/kg/體重、約5mg/kg/體重、或約10mg/kg/體重。
具有本領域普通技術的醫師可以容易地確定並且開出所需藥物組成物的有效量。例如，該醫師可以按低於用以實現所希望的治療效果所需的水平，起始用於藥物組成物中的本發明的抗體或其表位結合片段的劑量，並且逐漸增加劑量直到實現所希望的效果。一股而言，本發明組成物的適合的日劑量將是有效產生治療效果的最低劑量的化合物量。這種有效劑量通常將取決於上述因素。給予可以是例如靜脈內、肌內、腹膜內、或皮下。如果希望的話，藥物組成物的有效日劑量可以在一整天以適當的時間間隔分開為兩個、三個、四個、五個、六個或更多個子劑量來給予，視情況以單位劑型給予。雖然本發明的化合物可以單獨給予，但是較佳的是作為如上描述的藥物組成物給予該化合物。
標記的本發明的抗體或其表位結合片段可以用於診斷目的以檢測、診斷、或監測疾病或障礙。本發明提供了用於對神經退行性或認知疾病或障礙的檢測或診斷，所述疾病或障礙包括但不限於阿茲海默症、嗜銀顆粒失智(AGD)、進行性核上性麻痹(PSP)、以及皮質基底節變性(CBD)，該檢測或診斷包括：(a)使用特異性地結合至τ蛋白的一種或多種抗體，測定焦穀胺酸化的Aβ片段在受試者細胞或組織樣品中的存在；並且(b)將該抗原的水平與對照水平(例如，在正常組織樣品中的水平)進行比較，借此相比於該抗原的對照水平而言該抗原的測定水平的增加指示該疾病或失調，或指示該疾病或失調的嚴重性。
本發明的抗體或其表位結合片段可以用於使用在本領域中熟知的免疫組織化學方法測定生物樣品中的τ蛋白或τ蛋白片段。有用於檢測蛋白質的其他基於抗體的方法包括免疫測定(如酶聯免疫測定(ELISA)和放射免疫測定(RIA))以及基於中型發現平臺(mesoscale discovery platform)的測定(MSD)。適合的抗體標記可以用在此類套組和方法中，並且本領域已知的標記包括酶標記，如鹼性磷酸酶和葡萄糖氧化酶；放射性同位素標記，如碘(125I、131I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(121In)和鍀(99mTc)；和發光標記，例如魯米諾和螢光素酶；和螢光標記，例如螢光素和羅丹明。
可以在體內檢測經標記的抗τ蛋白抗體或其τ蛋白結合片段的存在，以用於診斷目的。在一個實施方式中，診斷包括：a)向受試者給予有效量的這種經標記分子；b)在給予之後等待一個時間間隔，以允許經標記的分子在Aβ沈積位點(如果有的話)濃縮，並且以允許未結合的經標記的分子被清除至背景水平；c)測定背景水平；並且d)檢測受試者中經標記的分子，使得對超過背景水平的經標記的分子的檢測指示受試者患有該疾病或障礙，或者指示該疾病或障礙的嚴重性。根據這樣的實施方式，用成像部分標記分子，該成像部分適於使用熟習該項技術者已知的具體成像系統進行檢測。背景水平可以藉由本領域已知的多種方法測定，包括將檢測到的標記抗體的量與先前針對具體成像系統測定的標準值進行比較。可以用於本發明診斷方法的方法和系統包括但不限於電腦斷層術(CT)、全身掃描如正電子發射斷層術(PET)、磁共振成像(MRI)以及超音波檢查。
在一個另外的方面，本發明提供了一種如在此定義的單株抗體或其表位結合片段，用於在治療中使用。
在一個另外的方面，本發明提供了一種如在此定義的單株抗體或其表位結合片段，用於在τ蛋白病變的治療、診斷或成像中使用。
在一個另外的方面，本發明提供了一種如在此定義的單株抗體或其表位結合片段，用於在治療阿茲海默症、嗜銀顆粒失智(AGD)、進行性核上性麻痹(PSP)、以及皮質基底節變性(CBD)中使用。
在一個另外的方面，本發明提供了一種如在此定義的單株抗體或其表位結合片段，用於在製造一種用於對τ蛋白病變進行治療、診斷或成像的藥劑中使用。
較佳的是，該藥劑係用於治療阿茲海默症(AD)、嗜銀顆粒失智(AGD)、進行性核上性麻痹(PSP)、以及皮質基底節變性(CBD)，最較佳的是阿茲海默症(AD)。該藥物還較佳的是用於治療精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；因AD導致的情感冷漠或患有AD的患者中的情感冷漠；以及患有雷維體失智的患者的精神病症狀。
在一個另外的方面，本發明提供了一種在受試者中對阿茲海默症或其他τ蛋白病變進行治療、診斷或成像的方法，所述方法包括向所述受試者給予有效量的如在此定義的藥劑單株抗體或其表位結合片段。
在一個較佳的實施方式中，該治療係長期的，較佳的是持續至少2週，例如至少持續1個月、6個月、1年或更久。
在一個另外的方面，本發明提供了一種套組，該套組包括如 在此定義的用於在治療中使用的抗體或其片段。
實施方式清單
1.一種單株抗體或其表位結合片段，能夠特異性地結合至人類τ蛋白(SEQ ID NO：1)的磷酸化殘基396，這樣使得當殘基396未被磷酸化時，該抗體或其表位結合片段基本上不結合至在殘基404處磷酸化的SEQ ID NO：1。
2.根據實施方式1所述的單株抗體或其表位結合片段，抑制在液相抑制測試中的AD-P3，這樣使得該單株抗體或其表位結合片段具有100nM或更小的IC50，例如從0.1nM至100nM，例如在50nM或更低的濃度下，例如從0.1nM至50nM。
3.根據實施方式1或2中任一項所述的單株抗體或其表位結合片段，其中根據對阿茲海默症腦提取物的免疫耗減研究後pS396 τ蛋白的西方墨點法信號，能夠從阿茲海默氏腦勻漿物中以約75ng的抗體去除在絲胺酸396處的至少15%磷酸化的τ蛋白。
4.一種單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其包括選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：3；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：34；SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36；SEQ ID NO：37；SEQ ID NO：38；SEQ ID NO：40；和SEQ ID NO：46；(b)輕鏈CDR2，其包括SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：41；和SEQ ID NO：47的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其包括SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：42；和SEQ ID NO：48 的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其包括SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：43；SEQ ID NO：49；SEQ ID NO：52；和SEQ ID NO：55的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其包括選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：44；SEQ ID NO：50；SEQ ID NO：53；和SEQ ID NO：56；以及(f)重鏈CDR3，其包括選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：45；SEQ ID NO：51；SEQ ID NO：54；和SEQ ID NO：57。
5.一種單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)一條選自下組的輕鏈，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23；以及(b)一條選自下組的重鏈，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：26；和SEQ ID NO：27。
6.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其中(a)該輕鏈係SEQ ID NO：12；並且(b)該重鏈選自下組，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26以及SEQ ID NO：27。
7.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其中 (a)該輕鏈選自下組，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23；並且(b)該重鏈係SEQ ID NO：11。
8.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列，以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
9.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：12的胺基酸序列；(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：13的胺基酸序列。
10.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括以下各項中的至少一個(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列，以及 (f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
11.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：29的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
12.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：12的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：14的胺基酸序列。
13.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括以下各項中的至少一個(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：29的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
14.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列； (b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：30的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
15.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：12的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：15的胺基酸序列。
16.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括以下各項中的至少一個(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：30的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
17.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：31的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列； (e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
18.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：11的胺基酸序列。
19.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：31的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；以及(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
20.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：32的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
21.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：17的胺基酸序列；以及 (b)重鏈，其包括SEQ ID NO：11的胺基酸序列。
22.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：32的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；和(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
23.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：33的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
24.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：18的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：11的胺基酸序列。
25.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：33的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；和 (c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
26.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：34的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
27.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：19的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：11的胺基酸序列。
28.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：34的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；和(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及 (f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
29.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：35的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
30.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：20的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：11的胺基酸序列。
31.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：35的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；和(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
32.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：36的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列； (c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
33.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：21的胺基酸序列；(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：11的胺基酸序列。
34.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：36的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；和(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
35.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：37的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
36.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：22的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：11的胺基酸序列。
37.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：37的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；和(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
38.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：38的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
39.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：23的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：11的胺基酸序列。
40.根據實施方式4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括 (a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：38的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；和(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
41.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
42.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：12的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：24的胺基酸序列。
43.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括以下各項中的至少一個(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；和(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列； 並且進一步包括(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
44.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：31的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
45.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列；(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：24的胺基酸序列。
46.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：31的胺基酸序列；和(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；和(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；以及 (e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列。
47.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：32的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
48.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：17的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：24的胺基酸序列。
49.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：32的胺基酸序列；和(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；和(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；以及(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列。
50.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：31的胺基酸序列； (b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
51.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列；(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：13的胺基酸序列。
52.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：31的胺基酸序列；以及(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；和(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
53.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：32的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列； (d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
54.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：17的胺基酸序列；(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：13的胺基酸序列。
55.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：32的胺基酸序列；和(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；和(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
56.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：33的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
57.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：18的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：24的胺基酸序列。
58.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：33的胺基酸序列；和(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；和(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；和(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列。
59.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：34的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
60.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：19的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：24的胺基酸序列。
61.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：34的胺基酸序列；和(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；和(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括以下各項中的至少一個(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列。
62.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
63.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：12的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：25的胺基酸序列。
64.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；和 (c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
65.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：29的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
66.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：12的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：26的胺基酸序列。
67.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；和(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括：(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：29的胺基酸序列；以及 (f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
68.根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；(c)輕鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列；(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：30的胺基酸序列；以及(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
69.根據實施方式1或5所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，其包括SEQ ID NO：12的胺基酸序列；以及(b)重鏈，其包括SEQ ID NO：27的胺基酸序列。
70根據實施方式1或4所述的單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：3的胺基酸序列；(b)輕鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：4的胺基酸序列；和(c)輕鏈CDR3，其具有SEgQ ID NO：5的胺基酸序列；並且進一步包括(d)重鏈CDR1，其具有SEQ ID NO：6的胺基酸序列；(e)重鏈CDR2，其具有SEQ ID NO：30的胺基酸序列；和(f)重鏈CDR3，其具有SEQ ID NO：39的胺基酸序列。
71.根據實施方式1至5中任一項所述的單株抗體或其表位結合片段，其針對過度磷酸化τ蛋白的胺基酸基序具有選擇性，該過度磷酸化τ蛋白的基序包括由單個殘基分隔的磷酸化絲胺酸殘基和酪胺酸殘基。
72.根據實施方式71所述的單株抗體或其表位結合片段，其中該胺基酸基序具有以下序列：-Y-X-S(磷酸化)-P-
其中Y係酪胺酸，X係天然存在的胺基酸，P係脯胺酸，並且S(磷酸化)係具有磷酸化羥基側鏈的絲胺酸。
73.根據前述實施方式中任一項所述的單株抗體或其表位結合片段，包括Fc區。
74.根據前述實施方式中任一項所述的單株抗體或其表位結合片段，進一步包括用於增加藥劑在體內半衰期的部分。
75.根據前述實施方式中任一項所述的單株抗體或其表位結合片段，根據以下測試準則其特異性地結合至包括磷酸化殘基396的人類τ蛋白：i)該抗體基本上不結合至非磷酸化τ蛋白；ii)當396未被磷酸化時，該抗體基本上不結合至在404處磷酸化的τ蛋白；iii)該抗體確實結合至在396處磷酸化的τ蛋白；以及iv)當396和404二者均係磷酸化時，該抗體確實結合至τ蛋白。
76.根據前述實施方式中任一項所述的單株抗體或其表位結合片段，針對雙磷酸化肽而被引發，該雙磷酸化肽包含覆蓋2N4R τ蛋白的殘基386-408的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO：2)之內的至少18個連續的胺基酸殘基，例如至少20個連續的胺基酸殘基。
77.根據實施方式76所述的單株抗體或其表位結合片段，針對雙磷酸化肽而被引發，該雙磷酸化肽包含18-40個，例如18-30個，例如20-30個連續的胺基酸殘基，該等連續的胺基酸殘基包含覆蓋2N4R τ蛋白的殘基 386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO：2)。
78.根據實施方式1至70中任一項所述的單株抗體或其表位結合片段，具有超過年齡匹配健康對照的、對於來自AD患病患者的磷酸化τ蛋白(p τ)的特異性，從而使得所述單株抗體或其表位結合片段具有對於來自AD患病患者的磷酸化τ蛋白(p τ)超過對於來自年齡匹配健康對照的τ蛋白的大於50倍的特異性差異，例如，與健康對照材料相比，對於AD疾病材料的特異性具有大於100倍的增加，上述係在基於ELISA的測定中，使用磷酸化-和多聚體-特異性設置1 ELISA在來自AD和來自健康對照受試者的腦勻漿物中檢測磷酸化τ蛋白(p τ)。
79.根據實施方式78所述的單株抗體或其表位結合片段，具有對於AD患病τ蛋白的特異性，從而使得所述單株抗體或其表位結合片段具有對於AD超過對於年齡匹配健康對照的多於50倍的特異性差異，例如，與健康對照材料相比，對於AD疾病材料的特異性具有大於100倍的增加，上述係在基於ELISA的測定中，使用磷酸化-和多聚體-特異性設置1 ELISA在來自AD和來自健康對照受試者的腦勻漿物中檢測磷酸化τ蛋白(p τ)。
80.根據實施方式1至70中任一項所述的單株抗體或其表位結合片段，針對以下雙磷酸化肽而被引發：覆蓋2N4R τ蛋白的殘基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO：2)，或其表位結合片段，能夠特異性地結合至人類τ蛋白的磷酸化殘基396。
81.根據實施方式1至70中任一項所定義的抗體或其表位結合片段，其已經在細胞系中被產生或製造，該細胞系例如是人類細胞系、哺乳動物非 人類細胞系、昆蟲細胞系、酵母細胞系或細菌細胞系，或藉由重組技術進行產生或製造。
82.根據實施方式81所述的抗體或其表位結合片段，在CHO細胞系、HEK細胞系、BHK-21細胞系、鼠類細胞系(例如骨髓瘤細胞系)、纖維肉瘤細胞系、PER.C6細胞系、HKB-11細胞系、CAP細胞系以及HuH-7人類細胞系中產生。
83.根據實施方式1至70中任一項所述的單株抗體或其表位結合片段，其中所述單株抗體係由雜交瘤表現，該雜交瘤係藉由用人類病理性τ蛋白和非病理性τ蛋白篩選雜交瘤以分離以下殖株來分離的，該等殖株i)特異性地針對磷酸化表位S396，並且ii)特異性地識別來自人類阿茲海默症腦的過度磷酸化τ蛋白，其中所述抗體或其表位結合片段能夠在病理性人類τ蛋白和非病理性人類τ蛋白之間區分。
84.根據實施方式1至70中任一項所述的單株抗體或其表位結合片段，其中該抗體或其表位結合片段進一步包括可檢測部分。
85.根據實施方式84所述的單株抗體或其表位結合片段，其中該可檢測部分係螢光標記、化學發光標記順磁性標記、放射性同位素標記或酶標記。
86.一種包括如實施方式1至70中任一項所定義的抗體或其表位結合片段的製品，其中所述製品基本上不含天然產生的抗體，該等天然產生的抗體不能結合至τ蛋白或不實質性地改變該製品的抗-τ蛋白功能，其中所述功能選自下組，該組由以下各項組成：(i)基本上不能結合至非磷酸化τ蛋白；(ii)基本上不能結合至在S404處磷酸化且在S396處非磷酸化的τ 蛋白；(iii)能夠結合至在S396處磷酸化的τ蛋白；(iv)能夠結合在S396和S404二者處均磷酸化的τ蛋白；(v)能夠選擇性地在磷酸化τ蛋白殘基S396和S404之間區分，使得該製品基本上不能結合該磷酸化404殘基或使得該製品優先結合至S396；(vi)能夠結合來自人類阿茲海默症腦的過度磷酸化τ蛋白；(vii)能夠在病理性人類τ蛋白和非病理性人類τ蛋白之間區分；和/或(viii)當如在實例中描述的與來自轉基因小鼠的經免疫耗減的rTg4510提取物一起使用時，能夠特異性地將過度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa條帶減少至少90%，同時沒有將55kDa τ蛋白條帶減少多於10%。
87.一種包括由實施方式1至70所定義的抗體或其表位結合片段的製品，其中相對於天然存在的抗τ蛋白抗體的結構，所述抗體或所述其表位結合片段在其胺基酸序列方面具有結構改變，其中所述結構改變導致所述抗體或所述片段展現出相對於由所述天然存在的抗τ蛋白抗體展現出的功能而言改變的功能，其中所述功能選自下組，該組由以下各項組成：(i)基本上不能結合至非磷酸化τ蛋白；(ii)基本上不能結合至在S404處磷酸化且在S396處非磷酸化的τ蛋白；(iii)能夠結合至在S396處磷酸化的τ蛋白；(iv)能夠結合至在S396和S404二者處均磷酸化的τ蛋白；(v)能夠選擇性地在磷酸化τ蛋白殘基S396和S404之間區分，使 得該製品基本上不能結合該磷酸化404殘基或使得該製品優先結合至S396；(vi)能夠結合來自人類阿茲海默症腦的過度磷酸化τ蛋白；(vii)能夠在病理性人類τ蛋白和非病理性人類τ蛋白之間區分；和/或(viii)當如在此所述的與來自轉基因小鼠的經免疫耗減的rTg4510提取物一起使用時，能夠特異性地將過度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa條帶減少至少90%，同時沒有將55kDa τ蛋白條帶減少多於10%。
88.一種藥物組成物，其包括在實施方式1至70中的任一項中所定義的單株抗體或其表位結合片段，或根據實施方式86至87中任一項所述的製品，以及藥學上可接受的載體。
89.一種對根據實施方式1至70中任一項所述的單株抗體或其表位結合片段進行編碼的或者對其組成鏈進行編碼的核酸。
90.在實施方式1至70中的任一項中所定義的單株抗體或其表位結合片段、或根據實施方式86至87中任一項所述的製品、或如實施方式88所述的藥物組成物，用於在治療中使用。
91.根據實施方式1至70中任一項所述的單株抗體或其表位結合片段、或根據實施方式86至87中任一項所述的製品、或如實施方式88所述的藥物組成物，用於在τ蛋白病變的治療、診斷或成像中使用。
92.根據實施方式1至70中任一項所述的單株抗體或其表位結合片段、或根據實施方式86至87中任一項所述的製品、或如實施方式88所述的藥物組成物，用於在治療選自下組的τ蛋白病變中使用，該組由以下各項組成：阿茲海默症；嗜銀顆粒失智(AGD)；精神病，特別是因AD導致的精 神病或患有AD的患者中的精神病；因AD導致的情感冷漠或患有AD的患者中的情感冷漠；患有雷維體失智的患者的精神病症狀；進行性核上性麻痹(PSP)；額顳葉失智症(FTD或其變體)；TBI(急性或慢性創傷性腦損傷)；皮質基底節變性(CBD)；匹克病，原發性年齡相關性τ蛋白病變(PART)；神經纖維纏結為主型老年失智；拳擊員失智；慢性創傷性腦病；中風；中風恢復；與帕金森病相關的神經變性；與染色體關聯的帕金森綜合症；利緹可-伯蒂格病(關島型帕金森病-失智複合征)；神經節膠質瘤和神經節細胞瘤；腦膜血管瘤病；腦炎後帕金森綜合症；亞急性硬化性泛腦炎；杭丁頓症；鉛毒腦病；結節性硬化症；哈勒沃登-施帕茨症候群以及脂褐質症。
93.根據實施方式1至70中任一項所述的單株抗體或其表位結合片段，用於在治療阿茲海默症中使用。
94.根據實施方式1至70中任一項所述的單株抗體或其表位結合片段、或根據實施方式86至87中任一項所述的製品、或如實施方式88所述的藥物組成物，用於在製造用於對τ蛋白病變進行治療、診斷或成像的藥劑中使用。
95.根據實施方式1至70中任一項所述的單株抗體或其表位結合片段、或根據實施方式86至87中任一項所述的製品、或如實施方式88所述的藥物組成物，在作為用於治療選自下組的疾病的藥物而使用，該組由以下各項組成：阿茲海默症；嗜銀顆粒失智(AGD)；精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；因AD導致的情感冷漠或患有AD的患者中的情感冷漠；患有雷維體失智的患者的精神病症狀；進行性核上 性麻痹(PSP)；額顳葉失智症(FTD或其變體)；TBI(急性或慢性創傷性腦損傷)；皮質基底節變性(CBD)；匹克病；原發性年齡相關性τ蛋白病變(PART)；神經纖維纏結為主型老年失智；拳擊員失智；慢性創傷性腦病；中風；中風恢復；與帕金森病相關的神經變性；與染色體關聯的帕金森綜合症；利緹可-伯蒂格病(關島型帕金森病-失智複合征)；神經節膠質瘤和神經節細胞瘤；腦膜血管瘤病；腦炎後帕金森綜合症；亞急性硬化性泛腦炎；杭丁頓症；鉛毒腦病；結節性硬化症；哈勒沃登-施帕茨症候群以及脂褐質症。
96.一種在受試者中對阿茲海默症或其他τ蛋白病變進行治療、診斷或成像的方法，所述方法包括向所述受試者給予治療有效量的根據實施方式1至70中任一項所述的單株抗體或其表位結合片段、、根據實施方式86至87中任一項所述的製品，或如實施方式88所述的藥物組成物。
97.根據實施方式96所述的方法，其中該治療係長期的。
98.根據實施方式97所述的方法，其中該長期的治療持續至少2週，例如至少持續1個月，至少持續6個月，或至少持續1年。
99.根據實施方式96至98中任一項所述的方法，其中該受試者係人類。
100.一種套組，該套組包含根據實施方式1-70中任一項所述的抗體或其片段、根據實施方式86至87中任一項所述的製品、或根據實施方式88所述的藥物組成物，用於在治療中使用。
101.如實施方式1至70所述的單株抗體或其表位結合片段，或包括所述抗體或片段的製品或藥物組成物，用於在檢測或測量所述τ蛋白在受試者的腦中的存在或量中使用。
102.根據實施方式88所述的單株抗體或其表位結合片段、製品或藥物組成物，其中所述檢測或測量包括對結合至所述τ蛋白的所述抗τ蛋白抗體進行體內成像。
103.根據實施方式99至100所述的單株抗體或其表位結合片段、製品或藥物組成物，其中所述檢測或測量包括對結合至所述τ蛋白的所述抗τ蛋白抗體或其所述片段進行體外成像。
104.一種從纏結中去除至少90%的過度磷酸化τ蛋白的方法，所述纏結包括過度磷酸化τ蛋白，所述方法包括用單株抗體或其表位結合片段接觸過度磷酸化τ蛋白，所述抗體或其表位結合片段針對具有磷酸化殘基396並且如在實施方式1至70中的任一項中所定義的τ蛋白具有選擇性。
105.一種延遲患者中阿茲海默症的進展的方法，所述方法包括藉由給予單株抗體或其表位結合片段，從而減少或衰減所述患者中的病理性τ蛋白的積累，所述抗體或其表位結合片段針對具有磷酸化殘基396並且如在實施方式1至70中的任一項中所定義的τ蛋白具有選擇性。
106.一種藥物組成物，該藥物組成物包含i)根據實施方式1-70並且特別是實施方式17、18、44或45所述的τ蛋白抗體，以及ii)選自下組的化合物，該組由以下各項組成a)BACE抑制劑；b)在主動或被動τ蛋白免疫療法中有用的化合物；c)在主動或被動Aβ肽免疫療法中有用的化合物；d)NMDA受體拮抗劑；e)另外的τ蛋白聚集抑制劑； e)乙醯膽鹼酯酶抑制劑；f)抗癲癇藥；g)抗炎藥；和h)SSRI；以及iii)一種或多種藥學上可接受的賦形劑。
107.一種治療阿茲海默症、降低AD的進程或減少AD的症狀的方法，該方法包括一種治療，該治療包括給予i)根據實施方式1-70並且特別是實施方式17、18、44或45所述的τ蛋白抗體，以及ii)選自下組的化合物，該組由以下各項組成a)BACE抑制劑；b)在主動或被動τ蛋白免疫療法中有用的化合物；c)在主動或被動Aβ肽免疫療法中有用的化合物；d)NMDA受體拮抗劑；e)另外的τ蛋白聚集抑制劑；e)乙醯膽鹼酯酶抑制劑；f)抗癲癇藥；g)抗炎藥；和h)SSRI。
108.一種套組，該套組包括i)包含根據實施方式1-70並且特別是實施方式17、18、44或45所述的τ蛋白抗體的組成物，以及ii)包含選自下組的化合物的組成物，該組由以下各項組成a)BACE抑制劑； b)在主動或被動τ蛋白免疫療法中有用的化合物；c)在主動或被動Aβ肽免疫療法中有用的化合物；d)NMDA受體拮抗劑；e)另外的τ蛋白聚集抑制劑；f)乙醯膽鹼酯酶抑制劑；g)抗癲癇藥；h)抗炎藥；以及i)抗抑鬱藥。
109.根據申請專利範圍106所述之組成物、根據申請專利範圍107所述的方法、根據申請專利範圍108所述的套組，其中所述BACE1抑制劑係選自下組的小分子BACE I抑制劑，該組由以下各項組成：LY2886721、MK-8931、AZD3293或E2609。
110.根據申請專利範圍106所述之組成物、根據申請專利範圍107所述的方法、根據申請專利範圍108所述的套組，其中所述BACE1抑制劑具有化學式I
Figure 106123060-A0202-12-0166-25
其中Ar選自下組，該組由以下各項組成：苯基、吡啶基、嘧啶基、吡
Figure 106123060-A0202-12-0166-150
基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、
Figure 106123060-A0202-12-0166-151
唑基、異
Figure 106123060-A0202-12-0166-152
唑基，並且其中Ar視情況被一個或多個選自鹵素、CN、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6 氟烷基或C1-C6烷氧基的取代基取代；並且R1係一個或多個氫、鹵素、C1-C3氟烷基或C1-C3烷基；並且R2代表氫或氟。
111.根據申請專利範圍110所述之組成物、方法或套組，其中具有化學式I的化合物選自下組，該組由以下各項組成
Figure 106123060-A0202-12-0167-26
(3S,6S)-6-(5-胺基-2-氟苯基)-3-氟-3-(氟甲基)-6-甲基哌啶-2-硫酮
Figure 106123060-A0202-12-0167-28
(3R,6S)-6-(5-胺基-2-氟苯基)-3-氟-3-(氟甲基)-6-甲基哌啶-2-硫酮
Figure 106123060-A0202-12-0167-29
(3S,6S)-6-(5-胺基-2,3-二氟苯基)-3-氟-3-(氟甲基)-6-甲基哌啶-2-硫酮
Figure 106123060-A0202-12-0167-30
(3R,6S)-6-(5-胺基-2,3-二氟苯基)-3-氟-3-(氟甲基)-6-甲基哌啶-2-硫酮
Figure 106123060-A0202-12-0167-31
(6S)-6-(5-胺基-2-氟苯基)-3-氟-3,6-雙(氟甲基)哌啶-2-硫酮。
112.根據申請專利範圍106所述之組成物、根據申請專利範圍107所述的方法、根據申請專利範圍108所述的套組，其中所述BACE1抑制劑 具有化學式II
Figure 106123060-A0202-12-0168-33
其中Ar選自下組，該組由以下各項組成：苯基、吡啶基、嘧啶基、吡
Figure 106123060-A0202-12-0168-153
基、咪唑基、吡唑基、1,2,4-***基、噻吩基、噻唑基、
Figure 106123060-A0202-12-0168-154
唑基、異
Figure 106123060-A0202-12-0168-155
唑基、1,3,4-噻二唑基、異噻唑基、1,3,4-
Figure 106123060-A0202-12-0168-156
二唑基、1,2,4-
Figure 106123060-A0202-12-0168-157
二唑基、呋呫基和1,2,4-噻二唑基，並且其中該Ar視情況被一個或多個鹵素、CN、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6氟烷基或C1-C6烷氧基取代；R1係C1-C3烷基或C1-C3氟烷基；R2係氫、鹵素、C1-C3氟烷基或C1-C3烷基；並且R3係C1-C3烷基。
113.根據申請專利範圍106所述的化合物、根據申請專利範圍107所述的方法、根據申請專利範圍108所述的套組，其中所述BACE1抑制劑選自下組，該組由以下各項組成：N-(3-((2R,5S)-6-胺基-3,3,5-三氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4氟苯基)-5-氟吡啶醯胺；N-(3-((2R,5S)-6-胺基-3,3,5-三氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4氟苯基)-5-甲氧基吡
Figure 106123060-A0202-12-0168-158
-2-甲醯胺；N-(3-((2R,5S)-6-胺基-3,3,5-三氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡啶醯胺；N-(3-((2R,5S)-6-胺基-3,3,5-三氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4氟苯基)-5-氰基-3-甲基吡啶醯胺；以及N-(3-((2R,5R)-6-胺基-3,3,5-三氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4氟苯基)-5-(二氟甲基)吡
Figure 106123060-A0202-12-0168-159
-2-甲醯胺。
114.根據申請專利範圍106所述之組成物、根據申請專利範圍107所述的方法、根據申請專利範圍108所述的套組，其中所述NMDA受體拮抗劑選自下組，該組由以下各項組成：美金剛、鈉門達、Namzaric(美金剛/多奈派齊)，以及其類屬形式。
115.根據申請專利範圍106所述之組成物、根據申請專利範圍107所述的方法、根據申請專利範圍108所述的套組，其中所述乙醯膽鹼酯酶抑制劑選自下組，該組由以下各項組成：多奈派齊、加蘭他敏以及利凡斯的明。
116.根據申請專利範圍106所述之組成物、根據申請專利範圍107所述的方法、根據申請專利範圍108所述的套組，其中所述抗抑鬱藥選自下組，該組由以下各項組成：依他普侖、舍曲林、西酞普蘭、帕羅西汀、氟西汀、文拉法辛、曲唑酮、米氮平、沃替西汀，以及其類屬形式。
117.根據申請專利範圍106所述之組成物、根據申請專利範圍107所述的方法、根據申請專利範圍108所述的套組，用於在治療選自下組的τ蛋白病變中使用，該組由以下各項組成：阿茲海默症；嗜銀顆粒失智(AGD)；精神病，特別是因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有雷維體失智的患者的精神病症狀；進行性核上性麻痹(PSP)；額顳葉失智症(FTD或其變體)；TBI(急性或慢性創傷性腦損傷)；皮質基底節變性(CBD)；匹克病；原發性年齡相關性τ蛋白病變(PART)；神經纖維纏結為主型老年失智；拳擊員失智；慢性創傷性腦病；中風；中風恢復；與帕金森病相關的神經變性；與染色體關聯的帕金森綜合症；利緹可-伯蒂格病(關島型帕金森病-失智複合征)；神經節膠質瘤和神經節細胞瘤；腦膜 血管瘤病；腦炎後帕金森綜合症；亞急性硬化性泛腦炎；杭丁頓症；鉛毒腦病；結節性硬化症；哈勒沃登-施帕茨症候群以及脂褐質症。
118.根據申請專利範圍106所述之組成物、根據申請專利範圍107所述的方法、根據申請專利範圍108所述的套組，用於在製造用於對τ蛋白病變進行治療、診斷或成像的藥劑中使用。
119.根據申請專利範圍106所述之組成物、根據申請專利範圍107所述的方法、根據申請專利範圍108所述的套組，用於治療阿茲海默症；嗜銀顆粒失智(AGD)；進行性核上性麻痹(PSP)；皮質基底節變性(CBD)；因AD導致的精神病或患有AD的患者中的精神病；以及患有雷維體失智的患者的精神病症狀。
【實例】 實例1：用τ蛋白磷酸化肽396/404免疫小鼠
將C56/BL6和FVB小鼠用在TiterMax佐劑中配製的10μg P30綴合的磷酸化τ蛋白肽386-408(pS396/pS404)(SEQ ID NO：2)進行免疫。
小鼠(C56/BL6和FVB品系，雌性和雄性。將2-3月齡小鼠用綴合肽表位P30的磷酸化τ 386-408進行免疫。
遵循TiterMax/供應商方案，將綴合免疫原性P30的磷酸化τ 386-408(pS396/pS404)肽配製於TiterMax(400μg/mL肽，以1：1 vol：vol混合)中，並且將小鼠皮下注射20μg抗原肽(100μl)。對於對照小鼠僅注射佐劑。將所有用肽免疫的小鼠用0.5μg肽/Titermax(10μg/ml肽，如上所述配製並且注射)以月間隔進行強化。最後在收穫脾細胞後，將該等脾細 胞與SP-2細胞融合前3天，在不用Titermax的情況下，將小鼠用P30綴合的磷酸化τ蛋白386-408(pS396/pS404)進行強化。如藉由ELISA檢測展示陽性結合至磷酸化τ蛋白386-408(pS396/pS404)後，選擇生成的原代雜交瘤用於再轉殖循環，並且展示出優先結合至來自AD和TG4510腦裂解物的S1和P3抗原的活性(描述於以下實例2B中)。使用斑點印跡和腦裂解物包被的ELISA或MSD板，將這種結合與此類抗體結合到來自對照的腦裂解物的活性進行比較。
實例2A：雜交瘤產生
從對應的小鼠的脾臟中收穫脾細胞後，將該等脾細胞用SP-2細胞融合前3天，在不用Titermax的情況下，將小鼠用P30綴合的磷酸化τ蛋白386-408(pS396/pS404)進行強化。藉由ELISA檢測，陽性結合至磷酸化τ蛋白386-408(pS396/pS404)後，選擇雜交瘤用於再轉殖循環，並且使用斑點印跡和腦裂解物包被的ELISA或MSD板相比於來自對照的腦裂解物，較佳的是與來自AD和TG4510腦裂解物的S1和P3抗原的結合活性。
實例2B：特異性抗體的西方墨點法和斑點印跡分析 τ蛋白生物化學分級
將來自過表現人類τ蛋白突變P301L的人類或rTg4510小鼠的腦組織勻漿化於10個體積的如下包含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的Tris-緩衝鹽水中：50mM Tris/HCl(pH 7.4)；274mM NaCl；5mM KCl；1%蛋白酶抑制劑混合物(羅氏公司(Roche))；1%磷酸酶抑制劑混合物I和II(西格瑪公司(Sigma))；以及1mM苯甲基磺醯氯(PMSF；西格瑪公司(Sigma))。在4℃下，將勻漿物在27,000 x g下離心20分鐘，以獲得上清 液(S1)和沈澱部分。將沈澱重新勻漿化於5個體積的高鹽/蔗糖緩衝液(0.8M NaCl、10%蔗糖、10mM Tris/HCl[pH 7.4]、1mM EGTA、1mM PMSF)中，並且如上離心。將上清液收集並且與肌胺醯(1%最終濃度；西格瑪公司(Sigma))在37℃一起培養一小時，隨後在150,000 x g下4℃離心一小時，以獲得肌胺醯不可溶的沈澱，在此稱為P3部分。將P3沈澱重懸浮於TE緩衝液(10mM Tris/HCl[pH 8.0]、1mM EDTA)中到一個體積，該體積相當於對於腦勻漿所使用的原始體積的一半。
西方墨點法和斑點印跡
將分級的組織提取物S1和P3溶解於含有0.1M DTT的SDS-樣品緩衝液中。將經熱處理的樣品(95℃持續10分鐘)藉由在4%-12% Bis-Tris SDS-PAGE凝膠(英傑公司(Invitrogen))上的凝膠電泳進行分離，並且轉移到PVDF膜(BioRad Laboratories[伯樂實驗室]，赫拉克勒斯(Hercules)，加利福尼亞州)上。將斑點印跡樣品以跨樣品已知的濃度直接點樣到硝酸纖維素膜(Amersham，匹茲堡，賓夕法尼亞州)上。將西方墨點法和斑點印跡膜在TBS-Tween(0.5%)pH 7.4中的5%脫脂奶粉中封閉，隨後在1μg/ml的C10-2中於4℃培養過夜。將膜進行洗滌，並且與綴合過氧化物酶的抗小鼠IgG一起培養(1：5000；傑克遜免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)，美國賓夕法尼亞州西格羅夫(West Grove，PA))。使用增強的化學發光系統(ECL PLUS套組；珀金埃爾默(PerkinElmer))檢測結合的抗體。使用連接電腦的LAS-4000生物成像分析儀系統(富士膠片(Fujifilm)，東京，日本)和Multi Gauge v3.1軟體(富士膠片)進行西方墨點法和斑點印跡免疫反應性的定量和視覺分析。將蛋白載入藉由原始部分的體積進行調節，並且可 以轉化為原始的組織濕重。
實例3.用於AD-P3捕獲的液相抑制分析
實例3A的目的：為了量化在AD-P3腦材料中結合至pS396 τ蛋白抗原的人類C10-2和突變的變體對鼠類C10.2的抑制。將MSD板用小鼠C10-2包被，然後用感興趣的C10.2變體預培養，用AD-P3或AD-P3培養。抑制的程度被表示為IC50值，反映液相抗體結合至抗原的表觀親和力。藉由使用Graph Pad Prism軟體擬合到一個或兩個位點結合模型獲得IC50值。加入與P(404)τ蛋白反應的陰性對照抗體(小鼠C10-1)進行比較(數據未顯示)。
方法：在室溫下，將MSD板用捕獲的抗體(在碳酸鹽緩衝液pH 8.5中的750ng/ml鼠類C10-2)包被過夜，隨後封閉(30分鐘在PBS中，3% BSA，0.1% NP40)，並且洗滌5次(PBS，0.1% BSA，0.1% NP40)。如以上的描述，在室溫下，將成梯度的濃度(0-1000nM)的抗體用AD-P3材料培養60分鐘，並且隨後在室溫下在包被小鼠C10-2的MSD板上培養1小時。將板洗滌5次(在PBS中，0.1% BSA，0-.1% NP40)，並且向檢測的反映非抑制的游離τ蛋白抗原的捕獲的τ蛋白中添加抗人類總τ蛋白(MSD硫標記1：50)。
結果：數據顯示使用人類C10-2和變體(圖1)的τ蛋白捕獲的劑量依賴性抑制。變體C10-2_N32S和C10-2_N32S：A101T抑制更強(IC50分別=44nM和14nM，擬合至一個位點結合模型)，然而C10-2示出由最佳擬合至兩位點結合模型(IC50 14nM/630nM)的非均質的抑制。該低親和力結合(IC50=630)係主要的，因為高親和力抗體結合(IC50=14nM) 包括少於25%的總結合。結果在圖1中示出。
實例3B的目的：為了量化在液相抑制分析中結合至pS396 τ蛋白386-408肽的人類C10-2和突變的變體的抑制。抑制的程度被表示為IC50值，反映抗體結合的表觀親和力。藉由使用Graph Pad Prism軟體擬合到一個或兩個位點結合模型獲得IC50值。加入與P(404)τ蛋白反應的陰性對照抗體(小鼠C10-1)進行比較(數據未顯示)。
方法：在室溫下，在碳酸鹽緩衝液(pH 9,5)中，將MSD板用pS396 τ蛋白386-408肽包被過夜，隨後封閉(在PBS中30分鐘，3%BSA，0.1% NP40)，並且洗滌5次(PBS，0.1% BSA，0.1% NP40)。如以上的描述，在室溫下，將成梯度的濃度(0-1000nM)的pS396 τ蛋白386-408用1ng/ml抗體培養60分鐘，並且隨後在室溫下，在塗覆pS396 τ蛋白386-408的MSD板上培養1小時。將板洗滌5次(在PBS中，0.1% BSA，0.1% NP40)，並且向反映非抑制的游離抗體的檢測結合抗體中添加抗人類總τ蛋白(MSD硫標記1：50)。結果在圖2中示出。
實例4.抗體的免疫組織化學譜
組織
小鼠：從8個月齡rTg4510小鼠中收集小鼠腦組織。在CamK2陽性神經元中在tet-關(tet-off)響應元件下，該等轉基因小鼠表現人類突變的τ蛋白(P301L 0N4R)，並且顯示出顯著的τ蛋白過度磷酸化作用，以及來自6個月齡及之前的纏結形成。非轉基因的同窩仔充當對照。藉由浸入4%多聚甲醛中將小鼠腦固定，並且包埋在石蠟中。人類：從組織方案公司(Tissue Solutions)(格拉斯哥，英國)獲得福馬林固定的石蠟包埋的人類額 葉皮質的腦樣品。將來自患有診斷的末期阿茲海默症(AD；Braak階段V-VI)的3個供體的組織與年齡匹配的非失智對照供體進行比較。
免疫組織化學：
將小鼠和人類組織的4μm厚的切片在薄片切片機上切割，並且藉由在10mM檸檬酸鹽緩衝液(pH 6)中微波處理切片10分鐘，使其經受抗原修復。將內源性過氧化物酶用在PBS，1% BSA，0.3% Triton X-100(PBS-BT)中的1%過氧化氫，隨後用在5%正常豬血清進行封閉。將處於在圖1中示出的濃度範圍內，在4℃下，將切片與稀釋於PBS-BT中的hC10-2、hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T抗體培養過夜。將該等切片在PBS，0.25% BSA，0.1% Triton X-100中洗滌，之後與生物素醯化的二級豬抗人類抗體(#B1140；西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich))，以1：200培養1小時。在另外的洗滌後，應用鏈黴親和素(StreptAvidin)-生物素複合物套組(載體實驗室(Vector Laboratories)，伯林蓋姆(Burlingame)，加利福尼亞州)，並且最後用0.05%二胺基聯苯胺使免疫反應性可見。將該等切片用蘇木精複染，以顯示細胞核的位置。
結果
hC10-2、hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T標記的結構與在3個AD腦(即，纏結、神經氈線、營養不良性神經突)中的病理性τ蛋白一致。免疫反應性的強度係濃度依賴性的。沒有檢測出例如神經膠質細胞或血管的表觀標記。在來自對照腦的切片中沒有檢測到免疫反應性。同樣地，所有的3種抗體導致針對在rTg4510腦的海馬體和皮質二者中的磷酸化τ蛋白的預期模式。在來自非轉基因小鼠的腦切片中，沒有檢測出免 疫反應性。
實例5.靜脈內注射後在rTg4510小鼠的τ蛋白結構的修飾
方法
10個月齡的rTg4510小鼠。在CamK2陽性神經元中在tet-關(tet-off)響應元件下，該等轉基因小鼠表現人類突變的τ蛋白(P301L 0N4R)，並且顯示出顯著的τ蛋白過度磷酸化作用，以及來自6個月齡及之前的纏結形成。另外，在10個月齡的rTg4510小鼠的具有強烈病變的區域中出現神經退行性變。單個轉基因的tTA同窩仔充當對照。在80mg/kg的濃度下，將該小鼠經尾靜脈用hC10-2、hC10-2_N32S或hC10-2_N32S_A101T抗體接受單次注射。以150μL的體積注射每隻小鼠。注射後3天，將小鼠用PBS灌注2分鐘，隨後用4%多聚甲醛灌注10分鐘。將該等腦在30%蔗糖中低溫保護，並且將其切成40微米自由浮動的冷凍切片。將該等切片在PBS/1% BSA/0.3% Triton X-100中用5%正常豬血清培養20分鐘，在PBS中洗滌，並且最後與AlexaFluor488綴合的二級抗人類IgG以1：200(#709-545-149；傑克遜免疫研究實驗室公司(Jackson ImmunoResearch Laboratories)，美國賓夕法尼亞州西格羅夫(West Grove，USA))進行培養。將Hoechst用於核染色。將該等切片在PBS中洗滌，封片，並且藉由螢光顯微鏡檢術進行檢測。
結果
在年老的rTg4510小鼠腦中，hC10-2、hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T的靜脈內注射導致結合至海馬體和皮質的體內靶標結構中(圖4-7)。觀察到的陽性結構的數量在個體rTg4510動物之間變化。在 tTA對照小鼠中，注射三種抗體中任一者的後，沒有檢測到特異性螢光信號(圖4-7)。作為陰性對照，注射對照人類IgG沒有導致在rTg4510小鼠中的信號(數據未示出)。在rTg4510腦中的陽性信號沒有因為細胞內染色而容易地出現，並且可以代表在神經退行性變過程中釋放的細胞外的τ蛋白材料。總體上，該等數據表明hC10-2、hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T抗體能夠穿透腦薄壁組織，並且在體內特異性地修飾在rTg4510小鼠中的靶標。
實例6.阿茲海默症腦中的τ蛋白免疫反應性的表徵
組織：
從組織方案公司(Tissue Solutions)(格拉斯哥，英國)獲取石蠟包埋的人類額皮質的腦樣品。將來自患有診斷的末期阿茲海默症(AD；Braak階段V-VI)的供體的組織包括在內。
免疫組織化學
將4μm厚的人類組織的切片在薄片切片機上切割，並且藉由在10mM檸檬酸鹽緩衝液(pH 6)中微波處理切片10分鐘，使其經受抗原修復。將切片用5%正常豬血清在PBS，1% BSA，0.3% Triton X-100(PBS-BT)中培養過夜，隨後在4℃下，與稀釋於PBS-BT中的hC10-2或hC10-2_N32S_A101T抗體進行培養。將該等切片在PBS，0.25% BSA，0.1% Triton X-100中洗滌。藉由AlexaFluor488綴合的二級抗人類IgG(1：200；#709-545-149，傑克遜免疫研究實驗室公司(Jackson ImmunoResearch Laboratories)，美國賓夕法尼亞州西格羅夫(West Grove，USA))將免疫反應性視覺化。對於雙免疫螢光，將切片與AT8(1：500；#MN102.0，賽默飛 世爾公司(ThermoFisher)，沃爾瑟姆，美國)、或E1總人類τ蛋白抗體、針對N-端τ蛋白19-33(Crowe等人，1991)飼養的定做兔抗體共培養。將AT8和E1的免疫反應性分別用抗小鼠AlexaFluor568(1：400；#A10037，賽默飛世爾公司)和抗兔AlexaFluor568(1：400；#A10042，賽默飛世爾公司)視覺化。藉由螢光顯微鏡檢術分析該等切片。
結果
在針對N-端總τ蛋白和pS396 τ蛋白的雙染色的AD切片中，藉由E1以及hC10-2和hC10-2_N32S_A101T抗體標記具有纏結神經元的群體(圖7)。許多τ蛋白纏結係僅由hC10-2和hC10-2_N32S_A101T抗體標記的(圖7，箭頭)。細胞外的τ蛋白(血影纏結)先前已經示出沒有被N-端τ蛋白抗體染色(例如，Bondareff等人，1990；Braak等人，1994；Flores-Rodrigues等人，2015)。因此，由單獨地hC10-2或hC10-2_N32S_A101T抗體標記的τ蛋白種類可能代表細胞外的血影纏結。
西方墨點法和免疫沈澱反應
實驗流程和實驗描述
使用轉基因的rTg4510小鼠：將具有P301L突變(4R0N τ蛋白P301L)的人類τ蛋白cDNA置於四環素-操縱子-效應器(TRE)構建體的下游。為了啟動轉基因，該效應器必須與由四環素條件基因表現系統(tTA)組成的啟動劑構建體共表現。將該tTA啟動劑系統置於CaMKIIα啟動子的下游，因此限制TRE主要對前腦結構的表現。將該τ蛋白轉基因效應器在FVB/N(Taconic)小鼠品系中表現，並且將該tTA啟動劑系統在129S6(Taconic)小鼠品系上保持。它們的F1子代攜帶效應器和啟動劑轉 基因(rTg4510)連同非轉基因的(非-tg)和單個轉基因的同窩仔小鼠。僅使用F1小鼠用於實驗。將所有的小鼠飼養在Taconic，丹麥，並且使用引物對的針對tTA啟動劑轉基因的5′-GATTAACAGCGCATTAGAGCTG-3′和5′-GCATATGATCAATTCAAGGCCGATAAG-3′以及針對突變τ蛋白效應器轉基因的5′-TGAACCAGGATGGCTGAGCC-3′和5′-TTGTCATCGCTTCCAGTCCCCG-3′，藉由尾部DNA的分析來進行基因分型。將小鼠分組籠養，並以隨意量獲得水和食物(Brogaarden，丹麥)以及濃縮物質。光/暗循環係12小時；室溫係21℃±2℃，並且相對濕度係55%±5%。根據丹麥對實驗動物的法律(許可證號2014-15-0201-00339)進行實驗。
藉由頸脫位將小鼠安樂死，以保護大腦的代謝環境，並且防止可能改變τ蛋白生物學特徵的人工製品。將小鼠大腦在中線下對切為矢狀，以產生兩個半球。將每隻動物右半球的大腦皮質和海馬體在乾冰上迅速冷凍並在-80℃下儲存直至使用。來自阿茲海默症(AD)患者和年齡健康的對照(HC)供體的冷凍人類皮質係購自組織方案公司(Tissue Solutions)(格拉斯哥，英國)。人腦標本具有相似的<6小時的死後處理時間，並且其特徵為澱粉樣蛋白和τ蛋白病變，並且將所選擇的AD標本分類為Braak階段V-VI。
為了免疫沈澱來自腦裂解物的τ蛋白，遵循製造商的說明書使用交聯免疫沈澱反應(Crosslink Immunoprecipitation)套組(Thermo Fisher Pierce 26147)。簡言之，將該抗體結合至蛋白A/G加瓊脂糖，隨後藉由將結合的抗體與DSS(丁二醯亞胺辛二酸酯)的交聯。將腦勻漿在Tris緩衝液(25mM Tris/HCl pH 7.6，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，以及完 整的蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物)中製備，並且在4℃下用對照瓊脂糖樹脂預澄清。在4℃下，將預澄清的裂解物與抗體交聯的樹脂培養過夜，隨後用50μl洗脫緩衝液(pH 2.8)將抗原進行洗脫，並且立即離心至含有5μl 1M Tris，pH 9.5的收集管中。如下文描述的，將免疫沈澱的τ蛋白溶解於含有二硫蘇糖醇(dithiothreitol)(DTT，100mM)的SDS-樣品緩衝液中，加熱處理(95℃持續10分鐘)，並且經受西方墨點法。
遵循製造商的說明書(英傑公司(Invitrogen))，藉由ELISA，針對總人類τ蛋白測量在腦勻漿物和預澄清的裂解物中的人類τ蛋白濃度。
將組織勻漿化於10個體積的如下含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的Tris-緩衝鹽水(TBS)中：50mM Tris/HCl(pH 7.4)；274mM NaCl；5 mM KCl；1%蛋白酶抑制劑混合物(羅氏公司(Roche))；1%磷酸酶抑制劑混合物I和II(西格瑪公司(Sigma))；以及1mM苯甲基磺醯氯(PMSF)。在4℃下，將該等勻漿物在27,000 x g下離心20分鐘，以獲得上清液(S1)和沈澱級分。將沈澱重新勻漿化於5個體積的高鹽/蔗糖緩衝液(0.8M NaCl、10%蔗糖、10mM Tris/HCl[pH 7.4]、1mM EGTA、1mM PMSF)中，並且如上離心。將上清液收集，並且與肌胺醯(1%終濃度；西格瑪公司(Sigma))在37℃下一起培養1小時，隨後在150,000 x g下4℃離心1小時，以獲得鹽和肌胺醯-可提取物(S3)和肌胺醯不可溶性(P3)級分。將P3沈澱重懸浮於TE緩衝液(10mM Tris/HCl[pH 8.0]、1mM EDTA)中到一個體積，該體積相當於對於腦勻漿所使用的原始體積的一半。為了豐富針對過度磷酸化τ蛋白種類的S1級分，藉由在150,000 x g下進一步離心20分鐘，將一部分 的S1級分分離，以形成上清液(S1)和沈澱物(S1p)級分。將該S1p沈澱重懸浮於TBS緩衝液中至相當於使用的原始S1體積的五分之一的體積。 將分級的組織提取物S1、S1p和P3溶解於含有DTT(100mM)的SDS-樣品緩衝液中。將經熱處理的樣品(95℃持續10分鐘)藉由在4%-12% Bis-Tris SDS-PAGE凝膠(英傑公司(Invitrogen))上的凝膠電泳進行分離，並且轉移到PVDF膜(伯樂實驗室(BioRad Laboratories)，赫拉克勒斯(Hercules)，加利福尼亞州)上。用含有在TBS中的5%脫脂奶和0.1% Triton-X100的封閉液封閉後，將膜與1μg/ml hC10.2、hC10-2_N32S、hC10-2_N32S_A101T或兔抗pS396 τ蛋白(英傑公司(Invitrogen))培養。將膜洗滌，並且與過氧化物酶綴合的抗人類IgG或抗兔抗體(1：5000；傑克遜免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)，美國賓夕法尼亞州西格羅夫(West Grove，PA))進行培養。使用增強的化學發光系統(ECL PLUS套組；珀金埃爾默(Perkin Elmer))檢測結合的抗體。使用連接電腦的LAS-4000生物成像分析儀系統(富士膠片公司(Fujifilm)，東京，日本)和Multi Gauge v3.1軟體(富士膠片公司(Fujifilm))進行西方墨點法和印跡免疫反應性的定量和視覺分析。為了檢測τ蛋白，載入來自小鼠的大約2μg S1，來自人腦的20μg S1，並且是不同級分(S1、S1p和P3)的相同的體積，用於SDS-PAGE。
藉由西方墨點法檢測病理性τ蛋白
將從3隻32週齡的rTg4510小鼠和非轉基因的(非-tg)對照同窩仔中收集的前腦勻漿物，並且從4個AD和4個健康的對照(HC)供體中收集的皮質標本分離為可溶性(S1)、TBS-可溶性沈澱(S1p)和肌胺醯不可溶性級分(P3)，以1μg/ml在西方墨點法上使用hC10.2、hC10-2_N32S、 hC10-2_N32S_A101T，並且檢測來自rTg4510小鼠和AD的病理性τ蛋白。我們觀察來自32週齡的rTg4510小鼠的在S1中的55kDa和64kDa τ蛋白，以及在P3和S1p級分中的64kDa和70kDa τ蛋白的檢測。另外地，在該P3級分中觀察到三種平截的τ蛋白條帶<50kDa。在來自不表現人類轉基因τ蛋白的非-tg對照同窩仔的S1p和P3中沒有檢測到信號。在來自非-tg小鼠的S1級分中檢測到大約50kDa的弱信號，最可能代表在S396殘基處的內源性鼠類τ蛋白磷酸化(圖8A-8C)。總結為hC10.2、hC10-2_N32S、hC10-2_N32S_A101T檢測pS396 τ蛋白，以及在rTg4510小鼠中的正常磷酸化55kDa和過度磷酸化64kDa τ蛋白種類。用hC10-2_N32S_A101T觀察到最強的信號。
在來自AD供體的S1、S1p和P3級分中，hC10.2、hC10-2_N32S、hC10-2_N32S_A101T檢測典型的AD τ蛋白塗片以及病理性的4個τ蛋白帶型(54kDa、64kDa、69kDa和74kDa τ蛋白。如預期的，從P3級分中分離的肌胺醯不可溶性過度磷酸化τ蛋白種類係最顯著的，隨後是富集於S1p級分中的可溶性過度磷酸化τ蛋白。來自健康的對照(HC)的P3級分中沒有檢測到信號。在來自HC的S1和S1p級分中，檢測到大約55kDa的弱信號，可能代表在S396殘基處正常的磷酸化τ蛋白(圖8A-8C)。總結為hC10.2、hC10-2_N32S、hC10-2_N32S_A101T檢測針對AD的特徵的典型的τ蛋白塗片，以及代表過度磷酸化τ蛋白的病理性4個τ蛋白帶型。用hC10-2_N32S_A101T觀察到最強的信號。
病理性τ蛋白的免疫沈澱反應
在非變性條件下，為了確定hC10.2、hC10-2_N32S、 hC10-2_N32S_A101T結合τ蛋白的能力，建立τ蛋白免疫沈澱反應(IP)方案，其中τ蛋白抗體共價交聯至蛋白A/G樹脂上，並由此給出不受抗體污染的IP。對於藉由SDS-PAGE的τ蛋白分析，針對IP使用的抗體的重鏈的存在可以覆蓋信號，因為檢測到的兩種信號係大約50kDa。研究hC10.2、hC10-2_N32S、hC10-2_N32S_A101T降低來自人類腦的病理性τ蛋白的療效。作為抗原，分別使用含有0.1μg和0.15μg人類τ蛋白(藉由人類τ蛋白ELISA確定)的來自4個彙集的AD和HC供體的來自腦勻漿物的500μg預澄清的裂解物。hC10.2、hC10-2_N32S、hC10-2_N32S_A101T(10μg)拉低54kDa、64kDa、69kDa和74kDa τ蛋白種類(4種病理性τ蛋白條帶)和藉由多株兔抗pS396 τ蛋白抗體視覺化的來自預澄清的AD勻漿物(抗原/ab 1：100比率)的AD塗片(圖9)。將用hC10.2、hC10-2_N32S、hC10-2_N32S_A101T拉低的來自AD腦的τ蛋白條帶的強度與對照人類IgG抗體和與HC腦相比，可以總結的是hC10.2、hC10-2_N32S、hC10-2_N32S_A101T免疫沈澱僅從AD腦中在pS396位點處的過度磷酸化τ蛋白，並且是以1：100的抗原/抗體比率係有效的。
細胞和聚集測定
在6孔板中在鋪板後24小時，將HEK293細胞用人類τ蛋白-P301L-FLAG暫態轉染，24小時後接著與腦勻漿一起培養24小時，隨後分離並重鋪板細胞，並且在再一個24小時之後收穫。將細胞在PBS中溶解並且超音波處理，用1% triton X、Phos-stop和完整的磷酸酶和蛋白酶抑制劑(羅氏公司(Roche))緩衝液補充，並且在100,000 x g下超速離心30分鐘。將該沈澱重懸浮於SDS中，在100,000 x g下超音波處理和超速離心30分 鐘。藉由西方墨點法分析上清液。表現人類τ-P301L的細胞在用來自rTg4510 τ蛋白轉基因小鼠的總腦勻漿接種後，顯示不溶性(SDS級分，E1/FLAG檢測)過度磷酸化的(pS396檢測)τ蛋白。
用來自tTA小鼠對照腦勻漿處理的細胞示出不存在聚集的過度磷酸化人類τ蛋白。此外，使用來自Cisbio的τ蛋白聚集測定來分析HEK293細胞的總細胞裂解物。這種測定係基於在FRET中的時間分辨螢光，對於供體(Tb3+綴合的)和受體(d2綴合的)Ab而言使用的是相同抗體。將10μl樣品與10μl抗體混合物進行混合，並且培養20小時。在Pherastar酶標儀上讀取板以評估時間分辨螢光(在切換激發光之後，測量的/積分的FRET信號)。該測定以高特異性和靈敏性測量在人類屍體解剖材料、rTg4510小鼠以及接種的HEK細胞兩者中聚集的τ蛋白。結果在圖10中示出。
實例7.τ蛋白的免疫耗減
在10x體積的無菌冷PBS中，從冷凍的屍體解剖後前額葉皮質中製備阿茲海默氏腦提取物。使用刀勻漿器將組織勻漿化，然後超音波處理，在輸出2中5 x 0.9秒脈衝(Branson超音波儀)。然後將該勻漿以3000g在4℃下離心5分鐘。將上清液等分，快速冷凍，並且在-80℃下儲存直到使用。
將25μg抗體(人源化的C10-2變體和2.10.3，小鼠AT8，Thermo Scientific mn 1020)固定到125μl的磁珠(Magnetic dynabead)懸浮物(免疫沈澱反應套組磁珠蛋白(Immunoprecipitation Kit Dynabeads Protein)G Novex，目錄號10007D)上。在徹底洗滌之後，將包被的珠粒與可變數的 非包被洗滌珠粒進行混合。從100% Ab包被的珠粒(對應於5μg抗體)開始，直到100%未包被的珠粒。珠粒的總量在所有樣品中是相同的。將該等珠粒與20μl AD提取物混合，並且在室溫下培養10分鐘。將磁珠從該提取物中分離，並且將該提取物等分，快速冷凍，並且保持在-80℃下直到使用。
使用西方墨點法對耗減的分析
將樣品在1x SDS載人緩衝液和100mM DTT中煮沸。將對應於3μl提取物的體積載入在4%-12% Bis-Tris NuPAGE凝膠(LifeTech Novex)上。在電泳後，將西方墨點法在Immobilon-FL PVDF膜(0.45μm，IPFL10100，密理博公司(Millipore))上。將膜用SEA封閉緩衝液(Prod#37527，賽默(Thermo))封閉。使用τ 5(τ 5係可商購的抗τ蛋白抗體，其表位在τ蛋白胺基酸210-241的中間處被描述)，在該樣品中評估τ蛋白和P-τ蛋白水平。它係對τ蛋白的小鼠單殖株。艾博抗公司(Abcam)ab80579，1：2000)小鼠C10-2(1μg/ml)、P-S199/202(英傑公司(Invitrogen)44768 G，1：1000)、P-S422(艾博抗公司(Abcam)ab79415，1：750)、人類IPN(1μg/ml)。將磷酸甘油醛脫氫酶(Gapdh)和肌動蛋白用作載入對照(艾博抗公司(Abcam)ab9484，1：2000，西格瑪公司(Sigma)A5441，1：20000)。使用二級螢光團綴合的IgG抗體(IRDye 800CW山羊抗-人，IRDye 800CW，山羊抗-兔，IRDye 680山羊抗-小鼠，LI-COR生物科學)，並且使用Odyssey CLx和Image studio軟體(LI-COR生物科學)對信號定量。進行對整個泳道中單獨條帶以及信號的定量，並且據此繪製S形劑量反應曲線，並且可能時，評價最大效應和EC50值。
結果
2.10.3和C10-2抗體二者去除來自阿茲海默症腦製品的τ蛋白的小級分。這表明在總τ蛋白質含量內針對τ蛋白的子集的選擇性。被設計為對PS422 τ蛋白具有特異性的2.10.3去除了高達24%的總τ蛋白量，而C10-2去除了高達15%的總τ蛋白(參見圖11)。這可以解釋為pS396子集係τ蛋白的較小子集，所有其他因素係相等的。可替代地，該數據被解釋為相比對於pS422的具有選擇性的2.10.3抗體，C10-2抗體對於pS396係更具選擇性的。
2.10.3和C10-2二者去除多於90%的在絲胺酸422處磷酸化的τ蛋白，但去除50%的pS422 τ蛋白所需的抗體的量不同，對相同效果而言，對於2.10.3需要0,42μg抗體，並且對於C10-2需要0.27μg(參見圖12)。在本發明的一個實施方式中，該抗體對於在386-404內的表位係特異性的，其中人類τ蛋白的絲胺酸殘基396係磷酸化的，並且使用少於1μg的抗體將其中80%的pS422 τ蛋白去除(在免疫耗減研究中藉由西方墨點法分析)。
C10-2有效地去除了在絲胺酸396處磷酸化的τ蛋白(最大效應：88%，並且藉由使用0.30μg抗體達到該效應的一半)。2.10.3去除了更少部分的在絲胺酸396處磷酸化的τ蛋白(最大效應：60%，並且當使用0.63g抗體時達到該效應的一半)(參見圖13)。這指示所有的在絲胺酸422處磷酸化的τ蛋白在絲胺酸396處也被磷酸化，但在位置422處的磷酸化絲胺酸不存在時，存在在絲胺酸396處磷酸化的一部分過度磷酸化τ蛋白。在本發明的一個實施方式中，該抗體對於在386-404內的表位係特異 性的，其中人類τ蛋白的殘基396係磷酸化的，並且使用少於1μg的抗體將其中80%的pS396 τ蛋白去除(在免疫耗減研究中藉由西方墨點法分析)。
藉由C10-2去除的大部分τ蛋白在絲胺酸199/202處也被磷酸化，因為69%的具有該磷酸化的τ蛋白受到免疫耗減的影響(當使用0.34g抗體時該效應的50%)。2.10.3免疫耗減並不對PS199/202 τ蛋白給出S形劑量反應，但可看到信號隨遞增量的抗體而降低，當使用抗體的最大量(5μg)時最大值52%降低(參見圖14)。在本發明的一個實施方式中，該抗體對於在386-404內的表位係特異性的，其中人類τ蛋白的絲胺酸殘基396係磷酸化的，並且使用少於1μg的抗體將其中80%的P-S199/202 τ蛋白去除(在免疫耗減研究中藉由西方墨點法分析)。
該等結果指示，與靶向在422位置處的磷酸化絲胺酸的2.10.3抗體相比，靶向磷酸化絲胺酸396的C10-2抗體結合更大量的過度磷酸化τ蛋白。
在免疫耗減後，在西方墨點法上研究個體條帶，25kDa條帶被鑒定為在絲胺酸396處磷酸化。該片段藉由C10-2係免疫耗減的，但是2.10.3和AT8不耗減該片段(參見圖15)。因此，C10-2具有從阿茲海默症腦提取物中去除該平截形式的τ蛋白的獨特特徵。
實例8.比較C10-2變體
在免疫耗減測定中，所有的C10-2變體具有相同的功效(參見圖16)。該等結果表明引入的突變沒有改變功能性結合至阿茲海默氏腦特異性τ蛋白。
8a.在接種的rTg4510小鼠中的抗體處理
使用在CamK2陽性神經元(rTg4510)中在tet-關(tet-off)響應元件下表現人類突變τ蛋白(P301L 0N4R)的轉基因小鼠。該模型正常地在3月齡開始發展τ蛋白病理學，但藉由在妊娠期間用多西環素飼養母鼠並且持續到小鼠生命的第一個3週，病理學在後期(在六月齡之後開始)發展。將多西環素預處理的小鼠用mC10-2、hC10-2、2.10.3或對照抗體進行長期處理，15mg/kg/週，從2個月齡開始。2.5個月大後，將阿茲海默氏腦提取物輸注到海馬體中。將20隻小鼠藉由固定於立體定位架中的異氟烷吸入進行麻醉。將顱骨暴露並且調節直至前囪和人字點在水平向上。在顱骨中在前囪側向2mm(右)和後部2.4mm處鑽孔。使用10μl的注射器斜尖(SGE)在腦表面側部1.4mm以上文所述的座標注射接種材料。將實例7中描述的2μl的提取物緩慢輸注在位點處(1μl/分鐘)，並且將注射器保留5分鐘之後將其移除。藉由縫線將傷口閉合並且在小鼠醒來時加熱。將小鼠籠養3個月，並且然後處死，並且用4% PFA進行灌注固定。將該小鼠用抗體處理，直到接種後3個月處死。
免疫組織化學
將固定的腦在NSA 30上切成35μm冠狀切片，並且將每6個切片針對τ蛋白纏結(Gallyas銀染)染色。將陽性染色的神經元(胞體)在所有腦的海馬體的同側和對側中進行計數。包括海馬體的所有亞區。每個腦計數八個切片。結果反映來自這8個切片的陽性神經元的總和。
統計分析：當比較各組時，差異係顯著不同的。因此，使用非參數Kruskal-Wallis核對總和Dunn的多重比較檢驗。
結果：該等提取物導致在同側的海馬體中的纏結病變的接 種。該mC10-2處理顯著地以57%(P<0.05)降低了在接種的海馬體中的纏結病變。存在明顯的趨勢表明hC10-2降低病變。2.10.3沒有顯示出效果(參見圖17)。
實例8b.該C10.2變體的抗接種效果
研究目標
已經提出τ蛋白聚集體的跨細胞傳播有助於CNS中阿茲海默症的病理性發展和拓撲擴散。建立體外接種模型，其中將在HEK293細胞中表現的細胞人類τ蛋白與細胞外應用的病理性τ蛋白聚集體接種。本研究的目的是在治療範例中接種時評估和比較單株人類C10.2和變體的治療性效果。接種旨在意指引入一定量的引起細胞表現的τ蛋白的過度磷酸化作用/錯折疊的過度磷酸化τ蛋白(種子)。
建立研究相關性的背景
Aβ的細胞外斑塊和τ蛋白的神經元內成對的螺旋纖絲係阿茲海默症的標誌。τ蛋白的神經元內內含物主要由不溶性洗滌劑、過度磷酸化、τ蛋白的澱粉樣蛋白形式組成，並且在AD患者中以空間-時間模式中沈積，表明聚集體在CNS內的擴散。實驗表明，τ蛋白聚集體在體內和體外均以朊病毒樣機制從細胞傳播至細胞。這種細胞外擴散影響疾病傳播的存在為具有CNS滲透抗體的免疫療法開闢了道路。
τ蛋白聚集體/種子的應用已經示出了導致體外細胞的τ蛋白的聚集(Frost等人，2009，Guo和Lee 2011，Yanamandra等人，2013)。我們已經建立了體外接種模型，其中使用來自Tg4510小鼠(含有聚集的人類τ蛋白)的粗腦勻漿物來用在HEK293細胞中暫態表現的P301L突變接 種人類0N4R τ蛋白。重要的是，在接種的pcDNA對照細胞中不能檢測到殘餘的τ蛋白聚集體(種子)，因此所有讀數都檢測到細胞τ蛋白的轉化，並且沒有檢測到來自外源接種材料的任何信號。在該測試中測定hC10.2的不同變體的抗接種效果。
變體
抗體C10-2(hC10.2)
抗體N32S(hC10.2 N32S)
抗體N32Q(hC10.2 N32Q)
抗體N32S，D55E(hC10.2 N32S D55E)
抗體N32Q，D55E(hC10.2 N32Q D55E)
抗體N32S，A101T(hC10.2 N32S A101T)
一個或多個參考項
對照hIgG1(B12)
測試系統/動物
用hτ-P301L(0N4R)暫態地轉染HEK293細胞。
試驗設計
接種材料：藉由珠勻漿化作用並且超音波處理，將來自12個月齡小鼠的Tg4510勻漿物(和對照)勻漿化為在不含抑制劑的TBS中的10%勻漿物。將勻漿物在21000 x g下旋轉15分鐘，並且使用可溶性級分用於接種。
HEK293接種測定：在該測定中，在第0天在6孔板中將600,000 HEK293細胞置於每孔中。遵循製造商的說明書，在第1天，使用10μl脂質體2000將細胞用4μg質粒DNA轉染。4小時後更換介質。在第2 天，用來自12個月齡的Tg4510或tTa小鼠的粗腦勻漿接種細胞。將含有40μg總蛋白(用於tg4510勻漿物的大約65ng總人類τ蛋白)的勻漿物應用於每孔的介質中。對於抗體處理實驗，在4℃下具有或不具有抗體的情況下，將勻漿物預培養過夜。將6小時接種後的培養基更換為低血清培養基，以減少細胞增殖，並且將該等抗體再次應用。
在第3天(接種後24小時)，將細胞胰蛋白酶化3分鐘以降解細胞外的種子，並且藉由高含量成像，在6孔板中以800,000細胞/孔用於分級實驗，20,000細胞/96-孔用於Cisbio τ蛋白聚集測定，並且以10,000細胞/96-孔用於抗體攝取評估。將抗體再次應用至每個孔。
細胞分級：接種後48小時，將用於分級的細胞刮入冷的PBS中收集，將其用含有磷酸酶和蛋白酶抑制劑的1% triton-X進行沈澱並且溶解於TBS中，並且超音波處理。超速離心後(在4℃下，100,000 x g持續30分鐘)，將沈澱重懸浮於1% SDS中，超音波處理並且再次超速離心。藉由用於總τ蛋白(E1)和在S396(D1.2)上的τ蛋白的磷酸化作用的西方墨點法來分析Triton-X和SDS-可溶性級分。藉由在Odyssey成像儀上的免疫螢光來量化D1.2信號。
Cisbio τ蛋白聚集測定：接種後48小時，將用於Cisbio聚集測定的細胞在冰冷的PBS中洗滌，並且將其凍乾。將細胞溶解於含有磷酸酶/蛋白酶抑制劑和核酸酶(核糖核酸酶和去氧核糖核酸酶)的1% triton-X中，並且在定軌振盪器上培養，在650RPM 4℃下，持續40分鐘。將總細胞裂解物藉由Cisbio τ蛋白聚集測定針對τ蛋白聚集進行分析，使用均勻時間分辨螢光(HTRF®，Cisbio)，基於使用偶聯至用於FRET測量的供體 和受體的相同的抗體進行測定。單體τ蛋白只能結合受體或供體抗體，因為它們競爭相同的結合表位=無FRET。對照寡聚物τ蛋白可以結合供體和受體=FRET信號。藉由BCA針對所有樣品確定總蛋白，並將該樣品的信噪比歸一化為蛋白質，並使用8個技術重複繪製為相對τ蛋白聚集。
抗體攝取：接種後48小時，將用於抗體攝取的板固定在4%多聚甲醛和4%蔗糖中，並且用抗人類二級抗體染色。使用Cellomics確定抗體攝取。
數據分析/統計
將作為四個獨立的生物學重複進行的匯總數據表示的數據，並且在不同的兩週+/- S.E.M進行分析。使用單因素方差分析與Tukey多重比較測驗分析數據，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
結果
相比對照，hC10.2對接種和不可溶性過度磷酸化τ蛋白具有大約40%的還原效應。所有其他的抗體示出與hC10.2相似的或優越的效果。特別地，hC10.2的N32S和N32S_A101T變體示出了在聚集的τ蛋白中更強的45%和62%降低的效果。相比hC10.2，該N32S_A101T變體示出了對聚集顯著更強的效果。
實例8C：對本發明的hC10.2和變體的穩定性研究
研究目標
進行本研究以評估本發明的抗體的基本穩定性問題，聚焦脅迫條件以揭示變體中的任何潛在差異。
研究設計
將所有樣品最初製備成相同的起始條件(緩衝液、濃度和聚集水平)。這將消除潛在地可以影響該樣品行為的後續開發的初始特性的差異。將對照保持在-80℃下，並且用脅迫的樣品(40℃)進行平行分析。將樣品在不同時間點從40℃下去除，並藉由SEC-uplc在最後同時進行分析，藉由液相層析-質譜(LCMS)和差示掃描螢光測定法(DSF)進行肽圖譜分析。
變體
抗體C10-2(hC10.2)
抗體N32S(hC10.2 N32S)
抗體N32Q(hC10.2 N32Q)
抗體N32S，D55E(hC10.2 N32S D55E)
抗體N32Q，D55E(hC10.2 N32Q D55E)
抗體N32S，A101(hC10.2 N32S A101T)
抗體A101T(hC10.2 A101T)
抗體D55E(hC10.2 D55E)
抗體N32Q，A101T(hC10.2 N32Q A101T)
參考項
作為參考，使用保存在-80℃下的研究期間的抗體樣品。
背景資訊
單株抗體的穩定性方面對於藥物的製造、最終儲存以及藥品製劑的兩個方面都是重要的。在這項研究中，我們藉由凍融循環、高溫和低pH來脅迫抗體，以揭示在任何候選物中是否存在明顯的問題。
材料與方法
對於去醯胺研究，將樣品以1ml樣品裝入小瓶中，並且在40℃下培養。在預定義的時間點，將樣品移至-80℃並且儲存直到分析。
去醯胺研究
在肽水平下研究Asn殘基的去醯胺作用，以獲得有關所討論的實際殘基的詳細資訊。因此，使用標準化方案還原和烷基化(碘乙酸)後，用豬胰蛋白酶消化mAb。將肽在CSHT130 C18 1.7μm柱上分離，並且引入XEVO QTOF(Waters)MS儀，以MSe模式操作。在整個系列中使用相同的參數。在BiopharmaLynx上分析來自所有時間點的肽圖，並且用以下限制進行量化：僅包括陽性鑒定的去醯胺肽，不包括源片段。隨著時間的推移監測每個經鑒定的肽的%去醯胺作用。
SEC方法概述
藉由SEC層析法在ACQUITY UPLC® BEH200 SEC 1.7μm 4.6 x 150mm柱上在具有TUV檢測器(waters)的Acquity UPLC中測定聚集。將20μl的樣品調節至100μg/ml(在運行緩衝液中稀釋：Gibco PBS-英傑公司(Invitrogen)#14190-094+0.1M NaCl)，在0.4ml/min應用到柱上，並且藉由等度洗脫在6分鐘內分離。
藉由MassLynx分析數據，並且使用AUC量化聚集的水平。
低pH實驗
將hC10.2應用到蛋白G柱，並且使用標準的條件在pH 2.8下洗脫。將樣品保持在pH 2.8下，並且將整分試樣在時間0、15分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘和180分鐘處去除，並且在PBS中脫鹽之前進行 中和。針對結合親和力、聚集和去醯胺作用分析樣品。
在脅迫條件下hC10.2的特性：在40℃和28天的去醯胺作用
在由肽LC：T2、HC：T36和HC：T25覆蓋的若干次要和三個主要位點處觀察到Asn的去醯胺作用。隨著時間的推移，該等去醯胺作用的增長分別為75%、38%和28%。對比肽HC：T36和T25，在LC：T2肽中的Asn殘基(LC N32和N34)不是期望的，基於電腦類比分析(序列基序)，易於去醯胺作用，但令人驚訝的是在實際實驗與hC10.2中的其他Asn殘基明顯區別。該肽的增加的去醯胺作用與針對雙磷酸化肽的結合活性的降低有關，並表明去醯胺化和IC50之間存在機理關係。該觀察還表明改變在hC10.2 LC中的Asn殘基32和/或34可以減少在該等位點處的去醯胺作用。
在該等變體的分析中，很明顯，簡單地將Asn32修飾為Ser或Gln完全預防Asn34上的去醯胺反應(圖20)。此外，我們沒有檢測到具有該突變的變體中Gln32的任何去醯胺作用。
在低pH下的去醯胺作用
在本研究中，我們以按上述描述的相同的方式分析hC10.2用於40℃穩定性研究。僅在這種情況下，使用胰蛋白酶和Lys-C的混合物(Promega商品)來優化賴胺酸殘基的切割。沒有觀察到額外的位點或去醯胺作用的程度，而再次最突出的肽係LC-T2、HC-T25和HC-T36。此外，在低pH處理的樣品中沒有觀察到IC50中的變化。
SEC分析
在所有製品中聚集水平均低於3%，並且在40℃下28天內觀察到聚集度沒有變化。
實例9
來自rTg4510小鼠的τ蛋白種子的分離
該rTg4510小鼠係具有在四環素-操縱子-效應器(TRE)和活化劑構建體的下游的人MAPT基因中的P301L突變的雙重轉錄共表現的4R0N τ蛋白，由四環素條件的基因表現系統(tTA)構成。該P301L突變係導致與17號染色體(FTDP-17)相關的帕金森綜合症的額顳葉失智的顯性突變。在rTg4510小鼠中，P301L h τ蛋白的表現導致τ蛋白病變，包括在年齡依賴性方式中的預-纏結和神經纖維纏結(NFT)形成、神經元缺失和行為異常。NFT係神經元間的τ蛋白聚集，由成對的螺旋纖絲(PHF)、扭曲的帶狀結構或直的絲狀體製成，係洗滌劑不可溶性的，並且主要含有過度磷酸化τ蛋白。過度磷酸化作用意味著相比來自成年健康腦的τ蛋白，該τ蛋白在更多的位點處磷酸化，並且對於給定的位點相比正常百分比，更高百分比的τ蛋白分子被磷酸化(>8磷酸化莫耳/τ蛋白莫耳)。NFT的解剖分佈係與阿茲海默症(AD)認知衰退和正常老化和輕度認知障礙記憶喪失相關的屍體解剖後組織病理學標誌。AD患者的腦中NFT的分佈格局係高度分級的，並且分為六個階段。NFT變化對大腦的逐漸入侵也已經被生物化學證實，並根據受影響區域分類為十個階段。來自AD腦的不同τ蛋白種類的生物化學特徵最初基於使用1%肌胺醯用於分離不可溶性τ蛋白的分級方案。基於此方法，在肌胺醯-不可溶性沈澱(P3)級分中分離的該肌胺醯不可溶性過度磷酸化τ蛋白種類被定義為PHF-τ蛋白，並且被認為是生物化學的NFT等效物。在可溶性級分(S1)中分離的緩衝液可溶性過度磷酸化τ蛋白種類被定義為非原纖維寡聚體τ蛋白種類並且被認為是生物 化學的預纏結τ蛋白等效物。在rTg4510小鼠中，正常單體磷酸化和非磷酸化人類4R0N轉基因的τ蛋白存在於該可溶性級分(S1)中，並且視覺化為在SDS-PAGE上的55kDa τ蛋白種類。具有P301L突變的過度磷酸化4R0N τ蛋白展示為在可溶性(S1)中流動性轉移的64kDa和70kDa的τ蛋白，並且僅在Tris-緩衝鹽水(TBS)-可溶性沈澱物(S1p)和肌胺醯-不可溶性沈澱(P3)級分中。在P3中分離的肌胺醯不可溶性64kDa和70kDa τ蛋白種類係τ蛋白原纖維(PHF-τ蛋白)和生物化學的NFT等效物。在S1中和在TBS-可溶性沈澱物級分(S1p)中富集的緩衝液可溶性64kDa和70kDa τ蛋白種類係寡聚物τ蛋白和生物化學預纏結τ蛋白等效物。該等70kDa τ蛋白種類對於P301L突變係特異性的，並且還被發現於FTDP-17患者的腦中。將來自40週齡的rTg4510小鼠的腦組織勻漿化於10個體積的含有50mM Tris/HCl(pH 7.4)、274mM NaCl以及5mM KCl的TBS中。將該等勻漿物在27,000 x g下4℃離心20分鐘以獲得上清液(S1)和沈澱(P1)級分。將TBS-可提取物S1級分藉由在150,000 x g下4℃離心1小時，分離為上清液(S1s)和沈澱物(S1p)級分。將S1p沈澱物重新懸浮在10mM Tris/HCl[pH 8.0]中至相當於初始S1體積的五分之一的體積。將P1沈澱再勻漿化於5個體積的高鹽/蔗糖緩衝液(0.8M NaCl，10%蔗糖，10mM Tris/HCl，[pH 7.4])中，並且在27,000 x g下4℃離心20分鐘。將該上清液收集並且在37℃下用肌胺醯(1%終濃度；西格瑪公司(Sigma))培養1小時，隨後在150,000 x g下4℃離心1小時以獲得肌胺醯不可溶性沈澱(被稱為P3級分)。將P3沈澱重懸浮於10 mM Tris/HCl[pH 8.0]中到一個體積，該體積相當於對於腦勻漿所使用的原始體積的一半。來自rTg4510小鼠腦的病理性τ 蛋白表徵為在SDS-page上64kDa和70kDa的過度磷酸化τ蛋白，僅存在於S1p和P3級分中分別作為TBS可溶性寡聚物和肌胺醯不可溶性原纖維τ蛋白。該S1s級分含有在SDS-page上展示為55kDa τ蛋白的正常的非磷酸化和磷酸化τ蛋白。在S1p和P3級分中分別分離的病理性τ蛋白、可溶性寡聚物和不可溶性原纖維被用作過度磷酸化τ蛋白種子，以將內源性單體人類τ蛋白摻入聚集的τ蛋白內含物中，並誘導從rTg4510小鼠分離的原代皮質培養物中的人類τ蛋白接種。
從rTg4510小鼠中分離的初級神經元培養物中的接種測定。
鼠類皮質神經元(CTX)分離自第E14-16天的rTg4510小鼠胚胎。將單個轉基因tTA啟動小鼠與單個轉基因突變體τ蛋白效應器小鼠進行時間匹配。在懷孕後14-16天將懷孕的雌性安樂死，並且將胚胎用腦DNA使用引物對的針對tTA啟動劑轉基因的5′-GATTAACAGCGCATTAGAGCTG-3′和5′-GCATATGATCAATTCAAGGCCGATAAG-3′以及針對突變τ蛋白效應器轉基因的5′-TGAACCAGGATGGCTGAGCC-3′和5′-TTGTCATCGCTTCCAGTCCCCG-3′進行基因分型，同時將分離的胚胎皮質在4℃下保存在不含有氯化鈣的Hibernate E(BrainBits LLC)中。選擇來自rTg4510小鼠胚胎的皮質，並且將離解的神經元置於以0.13 x 106個細胞/cm2(420,000個細胞/ml，100μl/孔，96孔板)的密度的100μg/ml聚-L-賴胺酸包被的平盤中，並且在用含有抗氧化劑、0.5mM L-穀胺醯胺、100U/ml青黴素、0.1mg/ml鏈黴素(所有溶液來自Gibco-BRL英傑公司(Invitrogen))的2% B-27補充物補充的神經膠質條件Neurobasal[神經基礎]培養基中進行培養。24小時培養後，藉由融合和非增殖的原代鼠類星形膠質細胞培養物 產生神經膠質條件Neurobasal[神經基礎]培養基。藉由用新鮮神經膠質條件Neurobasal[神經基礎]培養基替換一半的培養基，並且然後每7天進食一次，在體外4天餵食神經元(DIV)。在DIV4處理後，將神經元培養物用1μM胞嘧啶***糖苷處理以終止增殖細胞。在DIV15，如藉由抗體針對神經膠質-原纖維-酸性蛋白(GFAP)的的評估，在培養物中神經膠質細胞的比例少於10%。來自rTg4510小鼠的CTX表現內源性鼠類τ蛋白和轉基因的人類τ蛋白4R0N。來自rTg4510小鼠的CTX僅含有在SDS-page上展現為55kDa τ蛋白條帶的正常的人類單體的非磷酸化和磷酸化τ蛋白；在來自rTg4510小鼠的初次接受試驗的CTX中不存在過度磷酸化τ蛋白種類(64kDa和70kDa)。藉由將CTX與病理性τ蛋白種子培養誘導DIV7 τ蛋白接種，在S1p和P3級分中分別分離可溶性寡聚物、不可溶性原纖維和過度磷酸化τ蛋白。在DIV11引入了完全培養基更換，以防止連續攝取病理性τ蛋白種子，並在DIV15測量CTX中的τ蛋白接種。τ蛋白接種的特徵在於將單體可溶性人類τ蛋白摻入到SDS-page上的展示為以64kDa、70kDa和140kDa較高分子量的流動性轉移的τ蛋白條帶的聚集的和過度磷酸化τ蛋白的內含物中。分別來自S1p和P3級分中的過度磷酸化τ蛋白種子、可溶性寡聚物或不可溶性原纖維同樣誘導在CTX中的τ蛋白接種。為了研究τ蛋白抗體對τ蛋白接種的影響，將CTX用分離自40週齡rTg4510小鼠和10μg抗體(hC10.2、hC10.2_N32S、hC10.2_A101T_N32S、人類IgG對照)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)的0.1μl P3或0.2μl S1p級分(含有0.2ng總人類τ蛋白)的混合物處理。將該τ蛋白種子-抗體混合物在4℃下預培養2小時，然後添加至CTX。在DIV11，進行將完全培養基更換 為新鮮的神經膠質條件Neurobasal[神經基礎]培養基。遵循製造商的說明書，在DIV15，在200rpm下4℃，將神經元溶解於具有1%蛋白酶抑制劑混合物(羅氏公司(Roche))、1%磷酸酶抑制劑混合物I和II(西格瑪公司(Sigma))和0.2%核酸酶(西格瑪公司(Sigma))的冰冷的triton裂解緩衝液(在50mM Tris中1% triton X-100，150mM NaCl(pH 7.6)中搖動45分鐘，並且在Cisbio體外聚集測定中使用裂解物，並且藉由二喹啉甲酸(BCA)測定來確定該蛋白含量。遵循製造商的說明書，來自Cisbio的τ蛋白聚集測定係基於在螢光共振能量轉移(FRET)中使用針對與供體(Tb3+綴合的)和受體(d2綴合的)抗體二者相同的抗體的時間分辨螢光。簡言之，將9μl樣品與9μl抗體混合物混合，並培養20小時。在Pherastar平板讀數器上讀板以評估時間分辨螢光(激發光切換後測量/積分的FRET信號)。該測定法測量來自rTg4510小鼠的腦材料中的以及從具有高特異性和靈敏度的rTg4510胚胎分離的來自τ蛋白接種的CTX的神經元裂解物中的τ蛋白聚集、τ蛋白寡聚物和τ蛋白原纖維。結果可以在圖21中看出。將P3或S1p種子與人類IgG對照抗體培養導致來自接種的CTX的相似的τ蛋白聚集信號，如將P3或S1p種子與PBS培養。將來自PBS和人類IgG對照抗體的信號平均，並設置為100% τ蛋白聚集。該τ蛋白抗體hC10.2、hC10.2N32S和hC10.2A101T-N32S顯著降低了來自在DIV15誘導τ蛋白接種的P3和S1p的τ蛋白聚集信號。將來自2個個體實驗的結果進行總結。該hC10.2抗體將P3和S1p誘導的τ蛋白接種降低23%。變體hC10.2N32S和hC10.2A101T-N32S分別將P3和S1p誘導的τ蛋白接種降低41%-53%和48%-60%。變體hC10.2N32S和hC10.2A101T-N32S在來自由寡聚體或原纖維 的τ蛋白分別構成的S1p或P3的過度磷酸化τ蛋白種子誘導的rTg4510的CTX中的減少的τ蛋白接種中優於hC10.2。
實例10
在rTg4510小鼠中τ蛋白結構的劑量依賴性修飾，隨後進行hC10-2_N32S_A101T的靜脈內注射。
方法：
12個月齡的rTg4510小鼠。在CamK2陽性神經元中在tet-關(tet-off)響應元件下，該等轉基因小鼠表現人類突變的τ蛋白(P301L 0N4R)，並且顯示出顯著的τ蛋白過度磷酸化作用，以及來自6個月齡及之前的纏結形成。另外，在12個月齡的rTg4510小鼠的具有強烈病變的區域中出現神經退行性變。該小鼠經尾靜脈用hC10-2_N32S抗體，以80mg/kg、20mg/kg、8mg/kg和0.8mg/kg的劑量接受單個靜脈內注射。以100微升的體積注射每隻小鼠。注射後3天，將小鼠用PBS灌注2分鐘，隨後用4%多聚甲醛灌注10分鐘。將該等腦在30%蔗糖中低溫保護，並且將其切成40微米自由浮動的冷凍切片.將該等切片在PBS/1% BSA/0.3% Triton X-100中用5%正常豬血清培養20分鐘，在PBS中洗滌，並且最後與AlexaFluor488綴合的二級抗人類IgG以1：200(#709-545-149；傑克遜免疫研究實驗室公司(Jackson ImmunoResearch Laboratories)，美國賓夕法尼亞州西格羅夫(West Grove，USA))進行培養。將該等切片在PBS中洗滌，封片，並且藉由螢光顯微鏡檢術進行檢測。
結果：
在年老的rTg4510小鼠腦中，hC10-2_N32S的靜脈內注射導 致主要結合至海馬體和皮質的體內靶標結構中(圖1)。觀察到的陽性結構的數量在個體rTg4510動物之間變化。在rTg4510腦中的陽性信號沒有因為細胞內染色而容易地出現，並且可以代表在神經退行性變過程中釋放的細胞外的τ蛋白材料。藉由半定量評分，在以20mg/kg和80mg/kg給藥的所有小鼠中檢測到最強信號(螢光強度和陽性結構數)(表6)。標記的結構在4隻小鼠中的3隻中以8mg/kg存在，但相比20mg/kg和80mg/kg明顯處於低水平。使用應用的視覺化方法，靜脈注射0.8mg/kg不會導致高於背景的信號。總體上，該等數據表明hC10-2_N32S抗體以劑量依賴性方式能夠穿透到腦薄壁組織中，並且在體內特異性地修飾rTg4510小鼠中的靶標。圖22
Figure 106123060-A0202-12-0202-34
螢光標記的τ蛋白結構在腦切片中進行檢測，隨後進行hC10-2_N32S的靜脈內注射。半定量評分：+++強；++中等；+弱；0沒有檢測到。
實例11在τ蛋白中接種τ蛋白病變
種子製品
來自AD供體的冷凍的皮質的組織樣品獲得自組織方案公司(Tissue Solutions)(格拉斯哥，英國)。將腦組織稱重，並且使用刀勻漿 器在無菌冷的PBS(10倍體積的腦樣品)勻漿化。然後將勻漿藉由5 x 0.9sec脈衝，在Branson超音波儀上設定為輸出2進行超音波處理。將勻漿在3000g下4℃離心5分鐘，並且將上清液等分，在乾冰上快速冷凍，並且在-80℃下儲存直到使用。
在研究中使用的動物
使用在CamKII-陽性神經元(rtg4510)中的四環素控制的反式啟動因數下表現人突變的τ蛋白(P301L 0N4R)的轉基因小鼠。該模型正常地在3-4個月齡的小鼠中開始發展τ蛋白病理學。藉由在妊娠期間用多西環素飼養母鼠並且持續到小鼠生命的第一個3週，病理學在後期(在六月齡之後)發展。用於研究中的經多西環素預處理的小鼠在在接種時為2.5月大。
抗體處理
將抗體以1,5mg/ml的濃度在無菌PBS中進行製備，並用用於一次劑量時間點的足夠的抗體製備成等分試樣。將等分試樣在4℃下儲存直到使用。從2個月齡到在5.5個月齡處死的小鼠每週接受IP劑量的抗體(15mg/kg等於10ml/kg)。使用的抗體：對照人類B12-IgGI、hC10-2、hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T。
立體定位注射
剛接受3rd抗體劑量後，藉由吸入異氟烷使小鼠麻醉，並固定於立體定位架中。將顱骨暴露，並且定位調節直到前囪和人字點在水平上。在顱骨中在前囪側向2mm(右)和後部2.4mm處鑽孔。使用具有26度，斜尖(SGE)的10μl注射器，將接種材料在腦表面側部1.4mm注射。
在該部位緩慢注入2μl物質(0.5μl/min)，並且其後在注射器撤出之前再次注射5分鐘。將傷口封閉並用縫合線密封，並在麻醉恢復期間將小鼠進行熱支持。然後將小鼠飼養3個月，然後用4%多聚甲醛灌注固定。
組織學
使用MultiBrain®技術，將固定的腦在神經科學協會(諾克斯維爾，田納西州)加工。每塊最多25個小鼠大腦包埋在一起，並藉由整個大腦在冠狀面以平均35μm冷凍切片。將每6個切片用Gallyas銀染染色以顯示神經纖維纏結。將切片封固，蓋玻片，並且將Gallyas銀-陽性神經元(soma)在所有腦海馬體注射側計數。包括海馬體的所有亞區。每個腦計數八個切片。結果反映來自這8個切片的陽性神經元的總和。
結果
hC10-2、hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T均顯著地降低了在經注射的海馬體中τ蛋白纏結的接種(單因素方差分析和Turkey多重比較測驗)。hC10-2：50%；hC10-2_N32S：47%；以及hC10-2_N32S_A101T：60%，與對照處理的小鼠相比。圖23。
<110> 丹麥商H．朗德貝克公司(H.Lundbeck A/S)
<120> 特異性針對過度磷酸化τ蛋白之抗體及其使用方法
<130> 1049-DK-NP3
<140> TW 106123060
<141> 2017-07-10
<150> PA 201600416
<151> 2016-07-12
<150> PA 201700008
<151> 2017-01-04
<150> PA 201700179
<151> 2017-03-14
<150> PA 201700005
<151> 2017-01-04
<160> 57
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人類τ蛋白
<400> 1
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<223> τ蛋白殘基386-408(pS396，pS404)
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<223> C10-2輕鏈CDR1
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<223> C10-2輕鏈CDR2
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<223> C10-2輕鏈CDR3
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<223> C10-2重鏈CDR1
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<223> C10-2重鏈CDR2
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<223> C10-2重鏈CDR3
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<213> 小鼠C10-2輕鏈
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<213> 小鼠C10-2重鏈
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<223> 人源化的C10-2重鏈
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<223> 人源化的C10-2輕鏈
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<223> 人源化的C10-2輕鏈變體N32Q
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<223> 人源化的C10-2輕鏈變體N34S
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<223> 人源化的C10-2輕鏈變體N34Q
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<223> 人源化的C10-2輕鏈變體N32S，N34S
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<223> 人源化的C10-2輕鏈變體N32Q，N34S
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<223> 人源化的C10-2輕鏈變體N32Q，N34Q
<400> 22
Figure 106123060-A0305-02-0234-44
Figure 106123060-A0305-02-0235-45
<210> 23
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化的C10-2輕鏈變體N32S，N34Q
<400> 23
Figure 106123060-A0305-02-0236-46
Figure 106123060-A0305-02-0237-47
<210> 24
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化的C10-2重鏈變體A101T
<400> 24
Figure 106123060-A0305-02-0237-48
Figure 106123060-A0305-02-0238-49
Figure 106123060-A0305-02-0239-50
<210> 25
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化的C10-2重鏈變體D55E，A101T
<400> 25
Figure 106123060-A0305-02-0239-51
Figure 106123060-A0305-02-0240-52
Figure 106123060-A0305-02-0241-53
Figure 106123060-A0305-02-0242-54
<210> 26
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化的C10-2重鏈變體D55Q，A101T
<400> 26
Figure 106123060-A0305-02-0242-55
Figure 106123060-A0305-02-0243-56
Figure 106123060-A0305-02-0244-57
<210> 27
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化的C10-2重鏈變體D55S，A101T
<400> 27
Figure 106123060-A0305-02-0244-58
Figure 106123060-A0305-02-0245-59
Figure 106123060-A0305-02-0246-60
<210> 28
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化的C10-2重鏈CDR2變體D55E
<400> 28
Figure 106123060-A0305-02-0247-61
<210> 29
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化的C10-2重鏈CDR2變體D55Q
<400> 29
Figure 106123060-A0305-02-0247-62
<210> 30
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化的C10-2重鏈CDR2變體D55S
<400> 30
Figure 106123060-A0305-02-0247-63
Figure 106123060-A0305-02-0248-67
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化的C10-2輕鏈CDR1變體N32S
<400> 31
Figure 106123060-A0305-02-0248-66
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化的C10-2輕鏈CDR1變體N32Q
<400> 32
Figure 106123060-A0305-02-0248-65
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化的C10-2輕鏈CDR1變體N34S
<400> 33
Figure 106123060-A0305-02-0248-64
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化的C10-2輕鏈CDR1變體N34Q
<400> 34
Figure 106123060-A0305-02-0249-68
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化的C10-2輕鏈CDR1變體N32S，N34S
<400> 35
Figure 106123060-A0305-02-0249-69
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化的C10-2輕鏈CDR1變體N32Q，N34S
<400> 36
Figure 106123060-A0305-02-0249-70
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化的C10-2輕鏈CDR1變體N32Q，N34Q
<400> 37
Figure 106123060-A0305-02-0249-71
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化的C10-2輕鏈CDR1變體N32S，N34Q
<400> 38
Figure 106123060-A0305-02-0250-75
<210> 39
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 人源化的C10-2重鏈CDR3變體A101T
<400> 39
Figure 106123060-A0305-02-0250-73
<210> 40
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IMGT C10.2 LC CDR1
<400> 40
Figure 106123060-A0305-02-0250-72
<210> 41
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IMGT C10.2 LC CDR2
<400> 41
Figure 106123060-A0305-02-0251-76
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IMGT C10.2 LC CDR3
<400> 42
Figure 106123060-A0305-02-0251-77
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IMGT C10.2 HC CDR1
<400> 43
Figure 106123060-A0305-02-0251-78
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IMGT C10.2 HC CDR2
<400> 44
Figure 106123060-A0305-02-0251-79
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IMGT C10.2 HC CDR3
<400> 45
Figure 106123060-A0305-02-0252-83
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IMGT N32S/N32S,A101T LC CDR1
<400> 46
Figure 106123060-A0305-02-0252-82
<210> 47
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IMGT N32S/N32S,A101T LC CDR2
<400> 47
Figure 106123060-A0305-02-0252-81
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IMGT N32S/N32S,A101T LC CDR3
<400> 48
Figure 106123060-A0305-02-0252-80
Figure 106123060-A0305-02-0253-84
<210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IMGT A101T/N32S,A101T HC CDR1
<400> 49
Figure 106123060-A0305-02-0253-85
<210> 50
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IMGT A101T/N32S,A101T HC CDR2
<400> 50
Figure 106123060-A0305-02-0253-86
<210> 51
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> IMGT A101T/N32S,A101T HC CDR3
<400> 51
Figure 106123060-A0305-02-0253-87
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Chotia C10.2/N32S HC CDR1
<400> 52
Figure 106123060-A0305-02-0254-91
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Chotia C10.2/N32S HC CDR2
<400> 53
Figure 106123060-A0305-02-0254-90
<210> 54
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Chotia C10.2/N32S HC CDR3
<400> 54
Figure 106123060-A0305-02-0254-89
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Chotia A101T/N32S,A101T HC CDR1
<400> 55
Figure 106123060-A0305-02-0254-88
<210> 56
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Chotia A101T/N32S,A101T HC CDR2
<400> 56
Figure 106123060-A0305-02-0255-92
<210> 57
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> Chotia A101T/N32S,A101T HC CDR3
<400> 57
Figure 106123060-A0305-02-0255-93

Claims (3)

  1. 一種單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)具有SEQ ID NO：31之胺基酸序列的輕鏈CDR1；(b)具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列的輕鏈CDR2；(c)具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈CDR3；(d)具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列的重鏈CDR1；(e)具有SEQ ID NO：7之胺基酸序列的重鏈CDR2；以及(f)具有SEQ ID NO：39之胺基酸序列的重鏈CDR3。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之單株抗體或其表位結合片段，其包括(a)輕鏈，該輕鏈包括SEQ ID NO：16的胺基酸序列；(b)重鏈，該重鏈包括SEQ ID NO：24的胺基酸序列。
  3. 一種藥物組成物，該藥物組成物包括如申請專利範圍第1或2項所述之單株抗體或其表位結合片段以及藥學上可接受的載體。
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2767532B1 (en) 2012-12-21 2016-07-13 National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology Novel compound for imaging tau protein accumulated in the brain
TWI827405B (zh) 2015-06-05 2023-12-21 美商建南德克公司 抗-ｔａｕ抗體及使用方法
JO3711B1 (ar) 2015-07-13 2021-01-31 H Lundbeck As أجسام مضادة محددة لبروتين تاو وطرق استعمالها
JOP20180117B1 (ar) 2016-07-12 2022-03-14 H Lundbeck As أجسام مضادة انتقائية لـ tau فائق المعالجة بفوسفوريلات وطرق لاستخدامها
JP7193457B2 (ja) 2016-12-07 2022-12-20 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｔａｕ抗体及び使用方法
CA3045294A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Genentech, Inc. Anti-tau antibodies and methods of use
MA47205A (fr) * 2017-01-04 2019-11-13 H Lundbeck As Anticorps spécifiques de la protéine tau hyperphosphorylée pour traiter des maladies oculaires
MA47499A (fr) 2017-02-17 2019-12-25 Denali Therapeutics Inc Anticorps anti-tau et leurs procédés d'utilisation
JOP20200074A1 (ar) 2017-10-16 2020-04-30 Eisai R&D Man Co Ltd أجسام مضادة ضد tau واستخداماتها
EA202091756A1 (ru) * 2018-02-01 2020-10-28 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Связывающие молекулы, специфично связывающиеся с тау-белком
SG11202008579UA (en) * 2018-03-05 2020-10-29 Janssen Pharmaceutica Nv Anti-phf-tau antibodies and uses thereof
WO2020123492A1 (en) * 2018-12-10 2020-06-18 New York University Monoclonal antibodies targeting c-terminal region of phosphorylated tau
WO2020193500A1 (en) 2019-03-28 2020-10-01 H. Lundbeck A/S Use of a ps396 assay to diagnose tauophaties
CA3148740A1 (en) * 2019-08-06 2021-02-11 Aprinoia Therapeutics Limited Antibodies that bind to pathological tau species and uses thereof
TWI759962B (zh) 2019-11-13 2022-04-01 香港商新旭生技股份有限公司 用於降解tau蛋白聚集體的化合物及其用途
CA3227440A1 (en) 2021-07-27 2023-02-02 Stand Therapeutics Co., Ltd. Peptide tag and nucleic acid encoding same

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012045882A2 (en) * 2010-10-07 2012-04-12 Ac Immune S.A. Pharmaceutical composition
WO2013050567A1 (en) * 2011-10-07 2013-04-11 Ac Immune S.A. Phosphospecific antibodies recognising tau

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
EP0098110B1 (en) 1982-06-24 1989-10-18 NIHON CHEMICAL RESEARCH KABUSHIKI KAISHA also known as JAPAN CHEMICAL RESEARCH CO., LTD Long-acting composition
US4681581A (en) 1983-12-05 1987-07-21 Coates Fredrica V Adjustable size diaper and folding method therefor
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5101827A (en) 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4861581A (en) 1986-12-05 1989-08-29 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
US5648471A (en) 1987-12-03 1997-07-15 Centocor, Inc. One vial method for labeling antibodies with Technetium-99m
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
ES2125854T3 (es) 1989-08-09 1999-03-16 Rhomed Inc Radiomarcado directo de anticuerpos y otras proteinas con tecnetio o renio.
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE69133476T2 (de) 1990-08-29 2006-01-05 GenPharm International, Inc., Palo Alto Transgene Mäuse fähig zur Produktion heterologer Antikörper
ATE255131T1 (de) 1991-06-14 2003-12-15 Genentech Inc Humanisierter heregulin antikörper
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
EP0593592B1 (en) 1991-07-08 1998-03-25 The University Of Massachusetts At Amherst Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
DE69233767D1 (de) 1991-12-06 2009-09-17 Max Planck Gesellschaft Verwendung von Protein-Kinasen zur Diagnose und Behandlung der Alzheimer-Krankheit
ATE193301T1 (de) 1993-03-09 2000-06-15 Genzyme Corp Verfahren zur isolierung von proteinen aus milch
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
CA2361421A1 (en) 1999-02-03 2000-08-10 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic calcium phosphate particles and methods of manufacture and use
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
JP2003516718A (ja) 1999-07-29 2003-05-20 メダレックス インク ＨＥＲ２／ｎｅｕに対するヒトモノクローナル抗体
EP1792991A1 (en) 1999-08-24 2007-06-06 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
US20030162230A1 (en) 2000-09-27 2003-08-28 Reagan Kevin J. Method for quantifying phosphokinase activity on proteins
US7041870B2 (en) 2000-11-30 2006-05-09 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
AT500379B8 (de) * 2001-02-02 2009-08-15 Axon Neuroscience Tau-proteine
MXPA05000511A (es) 2001-07-12 2005-09-30 Jefferson Foote Anticuepros super humanizados.
US8003108B2 (en) 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
EP1940442A4 (en) 2005-08-04 2009-08-19 Einstein Coll Med PHOSPHORYLATION OF TAU BY ABL
SG10201600950TA (en) 2005-11-28 2016-03-30 Genmab As Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
WO2009097006A2 (en) 2007-08-10 2009-08-06 Medarex, Inc. Hco32 and hco27 and related examples
EP2527369A3 (en) * 2007-09-13 2012-12-19 University Of Zurich Prorektorat Forschung Monoclonal amyloid beta (abeta)-specific antibody and uses thereof
EP2440234A4 (en) 2009-06-10 2013-11-06 Univ New York IMMUNOLOGICAL TARGETING OF PATHOLOGICAL TAU PROTEINS
US8609097B2 (en) 2009-06-10 2013-12-17 Hoffmann-La Roche Inc. Use of an anti-Tau pS422 antibody for the treatment of brain diseases
NZ609984A (en) 2010-10-11 2015-05-29 Biogen Idec Internat Neuroscience Gmbh Human anti-tau antibodies
WO2012162179A1 (en) * 2011-05-20 2012-11-29 Oligomerix, Inc. Tau protease compositions and methods of use
WO2013151762A1 (en) 2012-04-05 2013-10-10 Ac Immune S.A. Humanized tau antibody
KR102494798B1 (ko) 2012-07-03 2023-02-06 워싱턴 유니버시티 Tau에 대한 항체
WO2014028777A2 (en) 2012-08-16 2014-02-20 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
AU2014248515B2 (en) 2013-03-13 2019-03-07 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
EP2986713A1 (en) 2013-04-16 2016-02-24 Glykos Finland Oy A method for generating induced pluripotent stem cells
GB201312226D0 (en) * 2013-07-08 2013-08-21 Adx Neurosciences Improved antibodies
US10472514B2 (en) 2014-01-23 2019-11-12 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Block copolymer composition and adhesive composition
EP3166688A4 (en) 2014-07-08 2017-12-20 New York University Tau imaging ligands and their uses in the diagnosis and treatment of tauopathy
JO3711B1 (ar) * 2015-07-13 2021-01-31 H Lundbeck As أجسام مضادة محددة لبروتين تاو وطرق استعمالها
JOP20180117B1 (ar) 2016-07-12 2022-03-14 H Lundbeck As أجسام مضادة انتقائية لـ tau فائق المعالجة بفوسفوريلات وطرق لاستخدامها
US10364286B2 (en) 2016-12-22 2019-07-30 H. Lundbeck A/S Monoclonal anti-alpha-synuclein antibodies for preventing tau aggregation
MA47205A (fr) 2017-01-04 2019-11-13 H Lundbeck As Anticorps spécifiques de la protéine tau hyperphosphorylée pour traiter des maladies oculaires
US10934438B2 (en) 2017-04-27 2021-03-02 Axalta Coating Systems Ip Co., Llc Coatings and methods for using and producing the same

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012045882A2 (en) * 2010-10-07 2012-04-12 Ac Immune S.A. Pharmaceutical composition
WO2013050567A1 (en) * 2011-10-07 2013-04-11 Ac Immune S.A. Phosphospecific antibodies recognising tau

Also Published As

Publication number Publication date
CY1123995T1 (el) 2022-05-27
ECSP19005417A (es) 2019-01-31
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SV2019005807A (es) 2019-02-13
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EP3484916A1 (en) 2019-05-22
US20190284266A1 (en) 2019-09-19
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US20200109192A1 (en) 2020-04-09
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SG11201811015RA (en) 2019-01-30
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