CN116041504A - 特异性针对过度磷酸化τ蛋白的抗体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一类单克隆抗体，其特异性地以改善的亲和力结合病理性过度磷酸化(PHF)τ蛋白上的磷酸化丝氨酸396残基(pS396)，并且涉及在阿尔茨海默病和其他τ蛋白病变的治疗中使用这些分子以及它们的τ蛋白结合片段的方法。

Description

特异性针对过度磷酸化τ蛋白的抗体及其使用方法
本申请是申请日为2017年7月7日、申请号为201780036665X、发明名称为“特异性针对过度磷酸化τ蛋白的抗体及其使用方法”的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种新颖种类的单克隆抗体，其特异性地结合病理性过度磷酸化(PHF)τ蛋白上的磷酸化丝氨酸396残基(pS396)，并且涉及在阿尔茨海默病和τ蛋白病变的治疗中使用这些分子以及它们的τ蛋白结合片段的方法。
序列表的引用
本申请包括根据37C.F.R.1.821等的一个或多个序列表，所述序列表以计算机可读介质披露(文件名称：1049-WO-PCT_FINAL_ST25_1.txt，创建于2017年6月13日，并且具有65kB的大小)，将该文件通过引用以其全文结合在此。
背景技术
年龄相关性神经退行性疾病，如阿尔茨海默病(AD)和痴呆，是现今的最大社会性挑战之一。世界卫生组织估计，护理老年人的成本将持续增加并且诊断为痴呆的病例的数目到2050年增至三倍(World Health Organization and Alzheimer's DiseaseInternational-Status Report(2012)DEMENTIA:A public health priority[世界卫生组织和阿尔茨海默病国际状态报告(2012)痴呆：公共卫生优先事项]，WHO)。对于AD的首要治疗是神经递质调节剂，例如乙酰胆碱酯酶抑制剂和NMDA调节剂。这些疗法在世纪之交变得可用，并且仍然形成用于痴呆和AD相关的记忆缺陷的症状减轻的基础。然而，这些药物不靶向AD的潜在病因，即淀粉样蛋白β(Aβ)肽和τ蛋白聚集体的积累以及神经元突触和最终神经元的相关损失。
对老年人的纵向的社区范围的研究(Weiner,M.W.等人(2014)ADNI在线：http://www.adni-info.org/；Breteler,M.M.等人(1992)Neuroepidemiology[神经流行病学]11增刊1，23-28；Launer,L.J.(1992)Neuroepidemiology[神经流行病学]11增刊1，2-13)以及大的基因组范围相关研究(Lambert,J.C.等人(2013)Nat.Genet.[自然基因组学]45，1452-1458)已经显示，AD是痴呆的多相混合物，其中高达10％的晚期AD患者缺乏淀粉样蛋白病变(Crary,J.F.等人(2014)Acta Neuropathol.[神经病理学学报]128，755-766)。此外，由Braak和Braak进行的开创性病理学研究(Braak,H.和Braak,E.(1996)Acta Neurol.Scand.[斯堪的纳维亚神经学学报]增刊165，3-12)证明神经原纤维缠结病变程度与尸体解剖前的认知状态之间的明显相关。这些观察已经通过一些研究者(Nelson,P.T.等人(2012)J.Neuropathol.Exp.Neurol.[神经病理学与实验神经学杂志]71，362-381)以及在最近的纵向生物标记研究中得以验证，所述研究指示，贯穿该疾病的早期和后期，τ蛋白和过度磷酸化τ蛋白的脑脊液(CSF)水平增加(Jack,C.R.,Jr.等人(2013)Lancet Neurol.[柳叶刀神经学]12，207-216)。
如以上指出的，微管相关蛋白、τ蛋白、及其过度磷酸化形式形成作为AD的一类主要标志的细胞内神经原纤维缠结的主要成分。此外，τ蛋白的具体基因变体与额颞痴呆(FTD)的家族形式相关联。在AD中τ蛋白病变的表现以不同的空间模式出现，起始于内嗅皮质中，随后为海马区以及皮质区(Braak,H.和Braak,E.(1996)Acta Neurol.Scand.[斯堪的纳维亚神经学学报]增刊165，3-12)。τ蛋白病变的具体阶段还良好地与认知能力相关(Nelson,P.T.等人(2012)J.Neuropathol.Exp.Neurol.[神经病理学与实验神经学杂志]71，362-381；Braak,E.等人(1999)Eur.Arch.Psychiatry Clin.Neurosci.[欧洲精神病学与临床神经科学档案]249增刊3，14-22)。综上，此证据形成对于AD的基于τ蛋白的假设的基础。需要的是τ蛋白的细胞内积累导致微管变性和脊髓坍塌。结果是神经元之间的通信故障和细胞死亡随之发生。最近，还已经显示τ蛋白本身可以形成内-病原性种类，这些种类可以将神经变性从一个细胞传递到下一个细胞(Clavaguera,F.等人(2009)Nat.Cell Biol.[自然细胞生物学]11，909-913)。
I.作为内-病原体的τ蛋白
Clavaguera和同事们已经证明τ蛋白本身可以充当内-病原体(Clavaguera,F.等人(2009)Nat.Cell Biol.[自然细胞生物学]11，909-913)。低自旋脑提取物分离自P301Sτ蛋白转基因小鼠(Allen,B.等人(2002)J.Neurosci.[神经科学杂志]22，9340-9351)，稀释并且注入幼小ALZ17小鼠的海马体和皮质区中。该ALZ17小鼠是τ蛋白转基因小鼠品系，该品系仅发展晚期病变(Probst,A.等人(2000)Acta Neuropathol.[神经病理学学报]99，469-481)。经注射的ALZ17小鼠快速发展实体丝状病变，并且给予来自P301S小鼠的经τ蛋白免疫耗减的脑提取物或来自野生型小鼠的提取物并不诱导τ蛋白病变。将脑提取物在可溶(S1)和十二烷基肌氨酸钠-不溶的τ蛋白(P3)(Sahara,N.等人(2013)J.Alzheimer’s.Dis.[阿尔茨海默病杂志]33，249-263)方面分级并且将这些注入ALZ17小鼠证明了P3部分是诱导病变中最有力的。它包含多数的细胞内过度磷酸化丝状τ蛋白。大部分的病变还可以在将P301S提取物注入野生型小鼠的脑中时诱导，但无NFT形成。在后续的研究中，克拉维古等人已经显示，从其他τ蛋白病变(嗜银颗粒痴呆(AGD)、进行性核上性麻痹(PSP)、以及皮质基底节变性(CBD))的尸体解剖后的脑组织提取的人类τ蛋白也可以在ALZ17模型中诱导τ蛋白病变(Clavaguera,F.等人(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]110，9535-9540)。自从呈现了这些数据，若干其他τ蛋白接种和扩展模型已经被报道(Ahmed,Z.等人(2014)ActaNeuropathol.[神经病理学学报]127，667-683；Walker,L.C.等人(2013)JAMA Neurol.[美国医学会杂志：神经学分册]70，304-310)。从这些研究得出的主要结论指示一种机制，通过该机制在细胞内内含物中的病原性τ蛋白从该细胞分泌进入周质空间。然后病理τ蛋白材料沿着囊泡鞘以顺行方向和逆行方向被运输，并且随后通过批量内吞作用被邻近细胞吸收。这个机制解释了为什么在人类疾病中观察到的病变的扩展遵循不同的解剖学模式。有趣的是，病理性τ蛋白的外周给予可以加速ALZ17小鼠中τ蛋白病变的形成(Clavaguera,F.等人(2014)ActaNeuropathol.[神经病理学学报]127，299-301)。该扩展机制可以解释其他蛋白病变中的疾病传播(Goedert,M.等人(2010)Trends Neurosci.[神经科学趋势]33，317-325；Sigurdsson,E.M.等人(2002)Trends Mol.Med.[分子医学趋势]8，411-413)。
II.τ蛋白种类
τ蛋白可以充当内-病原体的发现已经引发出关于“病原性种类”的研究，可以在潜在的介入疗法中靶向这些种类。
该微管相关蛋白τ基因(MAPT)位于人类基因组17号染色体上并且在成人脑中表达τ蛋白的六种亚型。这些亚型产生自MAPT基因内的16个外显子的外显子2、3以及10的可变剪接。外显子2和3表达29个氨基酸重复，并且外显子10表达另外的微管结合结构域。结果是τ蛋白亚型将包含0、1或2个N-末端重复以及3个或4个C-末端微管结合结构域(3R或4Rτ蛋白)。通常τ蛋白的六种亚型被表达。最长的(2N4R)和最短的(0N3R)亚型分别由441和352个氨基酸组成(Kolarova,M.等人(2012)Int.J.Alzheimers.Dis.[阿尔茨海默病国际杂志]2012，731526)。τ蛋白(2N4R)的N-末端突出结构域由富含甘氨酸尾的44个氨基酸组成，并且残基45-102包括两个高度酸性区域(N1、N2-结构域)。两个富含脯氨酸的区域发现于残基151-243处(P1、P2构域)。该蛋白的剩余部分是由四个微管结合结构域(R1-R4)、随后为短C-末端区域构成。
τ蛋白是易溶的并且是高度磷酸化不稳定蛋白。在τ蛋白的最长亚型中大约20％或85个氨基酸残基是潜在的(Ser、Thr或Tyr)磷酸化位点。这些中大约有一半已经在实验中观察到是磷酸化的(Hanger,D.P.等人(2009)Trends Mol.Med.[分子医学趋势]15，112-119；Hasegawa,M.等人(1992)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]267，17047-17054)，并且这些磷酸化位点在微管结合结构域的末端残基周围聚簇。τ蛋白在细胞周期期间是动态地磷酸化和去磷酸化。它必须从微管解离以允许有丝***发生。它在有丝***后细胞(分化神经元)中的主要作用是充当微管稳定剂，从而允许最佳轴突运输。它可以按其主要的去磷酸化形式仅与微管关联，由此磷酸化充当神经元内的直接微管关联/解离开关。在正常条件下，胞质τ蛋白平均包含两个磷酸化位点。在配对螺旋丝状材料中，至少7-8个位点被磷酸化(Hanger,D.P.等人(2009)Trends Mol.Med.[分子医学趋势]15，112-119；Hasegawa,M.等人(1992)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]267，17047-17054)。过度磷酸化配对螺旋丝状τ蛋白是阿尔茨海默病的关键标志(Kosik等人(1986)PNAS，86，4044-4048)，在对人类AD脑材料的免疫细胞化学分析中观察到过度磷酸化τ蛋白的不同的迁移性变动。
已经难于用反映其元稳定性质的传统结构技术(像x射线晶体学或NMR光谱法)来研究τ蛋白。已经主要对非磷酸化τ蛋白的结构域片段进行了此类研究。迄今为止，使用NMR光谱学对全长τ蛋白(2N4R)的仅结构研究揭示了该蛋白质仅包含稳定的二级结构的稀少延展(Mukrasch,M.D.等人(2009)PLoS.Biol.[科学公共库生物学]7，e34)。此分析指示肽骨架的二级结构具有适于β-片层结构的大的倾向。与包括微管结合结构域的C-末端相比，该骨架的前200个残基是显著更有序的。在溶液中在该蛋白内许多特异性的长程相互作用的存在指示它存在于非常无序的熔融球状状态中(Ohgushi,M.和Wada,A.(1983)FEBS Lett.[FEBS快报]164，21-24)。
具体地由半胱天冬酶和钙蛋白酶产生的τ蛋白的蛋白酶产物(Asp13、Glu391和Asp421)已经在缠结材料中得以鉴定(Gamblin,T.C.等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国科学院院刊]100，10032-10037)。特别地，已经使用τ蛋白C3抗体(其结合至游离Asp421末端)详细研究了在Asp421处的截短。该截短已经被推测为AD发病机理中的与细胞凋亡诱导相关联的早期事件(deCalignon A.等人(2010)Nature[自然]464，1201-1204)。在Asp13处的N-末端切割和在Glu391处的C-末端切割被认为是该发病机理中的晚期事件(deCalignonA.等人(2010)Nature[自然]464，1201-1204；Delobel,P.等人(2008)Am.J.Pathol.[美国病理学杂志]172，123-131)。最近，在来自AD和PSP患者的CSF中鉴定出另外的N-末端片段(残基1-224)，并且已经被假设为疾病的早期标记并且具体是病原性的(US14/092539；Bright,J.等人(2014)Neurobiol.Ageing[老化神经生物学]，1-17)。类似的钙蛋白酶切割片段由其他团队进行了报道(Ferreira,A.和Bigio,E.H.(2011)Mol.Med.[分子医学]17，676-685；Reinecke,J.B.等人(2011)PLoS.One.6，e23865)。
除过度磷酸化和τ蛋白片段化之外，已经提出翻译后乙酰化(Cohen,T.J.等人(2011)Nat.Commun.[自然通讯]2，252；Min,S.W.等人(2010)Neuron[神经元]67，953-966)和O-GlcN酰化(Zhu,Y.等人(2014)J.Biol.Chem.[生物化学杂志])是限定了与AD相关联的缠结病变形成过程中的病变。
III.τ蛋白免疫疗法
免疫疗法传统上分为被动和主动疫苗方法。在主动疫苗方法中，将病原性药剂或其灭活的病原形式注入患者，并且免疫***引发免疫应答。这触发了B细胞的成熟，产生针对给予的抗原的高亲和力抗体或细胞响应。在被动疫苗方法中，通过输注针对抗原的特异性抗体来避免触发免疫***。固有清除***然后去除结合抗体的配体。
AC免疫正在追寻针对τ蛋白的磷酸化丝氨酸409的小鼠单克隆抗体。将抗体针对人类AD和对照脑组织进行特征概括，并且基于它们识别缠结病变的能力来选择这些抗体。人源化形式的两种抗体，hACI-36-2B6-Ab1和hACI-36-3A8-Ab1，均结合至氨基酸401-418内的τ蛋白表位(WO 2013/151762)。
RogerNitschd的团队已经从不具有退行性τ蛋白病变的体征的老年健康个体中分离了τ蛋白自身抗体。已经使用全长重组人类τ蛋白(2N4R)以发现τ蛋白特异性抗体而分离出多种抗体。然后，将这些针对其区分来自患病和健康个体的τ蛋白分离物的能力来进行筛选。三种领先抗体，4E4、4A3和24B2，已经描述于专利文献(WO2012049570；US 2012087861)中。它们的表位作图指示所有均识别微管结合区内的以及C-末端到微管结合区的氨基酸(从位置V339到K369)。这些抗体未展现出任何磷酸化-特异性。
C2N诊断主要聚焦在用于早期检测神经退行性疾病的发育诊断工具上。产生针对全长人类和小鼠τ蛋白的抗体。分别鉴定了识别人类和小鼠τ蛋白的八种和五种抗体(Yanamandra,K.等人(2013)Neuron[神经元]80，402-414)。选择三种具有不同结合动力学的抗体用于体内评价。即，分别识别τ蛋白残基306-320、7-13和25-30的HJ9.3、HJ9.4和HJ8.5，其中最后一个(HJ8.5)是特异性针对人类τ蛋白的。在τ蛋白跨细胞传播的独创性机理报道测定中，还基于这些抗体防止病变转移的能力来对这些抗体进行选择(Sanders,D.W.等人(2014)Neuron[神经元]82，1271-1288；Kfoury,N.等人(2012)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]287，19440-19451)。在P301S转基因小鼠中的慢性i.c.v.注射研究中，对它们的评价证明了它们能够降低过度磷酸化τ蛋白的水平，如在对经处理小鼠的免疫组织化学分析中所确定。
起初将Peter Davies的抗体开发作为诊断工具，该诊断工具可以在AD和对照脑材料中的病理性和正常τ蛋白之间区分(Greenberg,S.G.和Davies,P.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]87，5827-5831)。在P301S和JPNL3(P301L)中证明了PHF1和MC1抗体的治疗效用的评价(Boutajangout,A.等人(2011)J.Neurochem.[神经化学杂志]118，658-667；Chai,X.等人(2011)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]286，34457-34467；D'Abramo,C.等人(2013)PLoS.One.8，e62402小鼠)。PHF1识别线性磷酸化τ蛋白表位(pS396、pS404)，而MC1是构象-依赖性抗体，其需要线性序列的两个不同部分(即在残基46-202内的表位和在残基312-342之间的C末端表位)来识别结构性τ蛋白表位(Jicha,G.A.等人(1997)J.Neurosci.Res.[神经科学研究杂志]48，128-132)。在慢性12-13周免疫研究中，这两种抗体的注射导致脊髓病变的和在其他脑区域中的脑干病变的实质性减少，这些转化为这些小鼠中观察到的运动缺陷的衰减(D'Abramo,C.等人(2013)PLoS.One.8，e62402)。
iPerian/百时美施贵宝(Bristol Meyers Squibb)公司已经开发了针对推测的病理性τ蛋白种类(由τ蛋白的N-末端片段(eτ蛋白：残基1-224)构成)的τ蛋白抗体，该病理性τ蛋白种类促进了在基于诱导性多能干细胞的神经元培养物中的过度活性。已经开发了一系列抗体，但表征已经聚焦于识别残基9-18内的N末端表位的抗体IPN001和IPN002上。相应地，这些抗体检测到来自分期AD和PSP患者的CSF中升高的τ蛋白水平，这可以是疾病的早期体征。在JPNL3小鼠(P301L)中体内注射抗体导致渐进性运动缺陷的部分逆转(US14/092539)。
Einar Sigurdsson报道了基于τ蛋白的免疫疗法的功效的第一个程序。将由τ蛋白的肽379-408[pS396、pS404]组成的主动疫苗连同Adju-Phos佐剂一起用于免疫JPNL3(P301L)小鼠。在该研究中，当与对照动物相比时，在经疫苗处理的小鼠中观察到τ蛋白病变的显著降低。也检测到τ蛋白相关的运动表型的衰减。其功效在不同的不是由突变体τ蛋白驱动的小鼠模型(hτ/PS1)中得以确认(Boutajangout,A.等人(2011)AAIC 2011(7，发行4，增补版)p.s480-s431；Congdon,E.E.等人(2013)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]288，35452-35465；Gu,J.等人(2013)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]288，33081-33095)。
Prothena已经评价了在K369I(K3)转基因τ蛋白小鼠和P301L小鼠模型中的三种τ蛋白抗体。选择具有不同特性的抗体用于体内评价。将具有不同同种型的两种pS404-特异性抗体(IgG1/k和IgG2a/k)或总(全)抗τ蛋白抗体(IgG1/k)以慢性模式注射。将K369I小鼠每周采用注射处理，持续21周，在3周龄时开始；并且将P301L小鼠每周采用注射处理，持续7个月，在4月龄时开始。在采用IgG2a/k pS404抗体的K3小鼠中观察到τ蛋白阳性神经原纤维内含物的减少。两种pS404-特异性抗体均能降低pS422-阳性τ蛋白的水平，然而在经全τ蛋白抗体处理的小鼠中没有观察到减少。这些研究表明：1)τ蛋白清除可以是抗体同种型-依赖性的；并且2)重要的是其靶向与疾病相关的τ蛋白种类，因为总-抗τ蛋白抗体不能减少过度磷酸化的τ蛋白(PCT/US 2014/025044)。
本发明的诸位发明人出人意料地发现针对磷酸化τ蛋白丝氨酸残基396(pS396)的特异性抗体在疾病模型中是有效的；所述抗体与现有技术的抗体相比，其主要识别在396和404残基处磷酸化、仅在404残基处磷酸化或在其他残基处磷酸化的τ蛋白。
诸位发明人已经开发了另外对人类病理性τ蛋白具有显著特异性和选择性的抗体。与WO 2013/050567的抗体(参见WO2013/050567的图1)相比较，本发明的这些抗体显示出超过非病理性τ蛋白的对人类病理性τ蛋白非常高程度的特异性和选择性。被报道为具有特异性结合的、WO 2012/045882的抗体是从τ蛋白氨基酸393-401、396-401、394-400和393-400的6至9残基氨基酸序列引发的。这与本发明的抗体形成对比，本发明的抗体是针对包含如在此所述的更长氨基酸序列的病原性过度磷酸化τ蛋白引发的。
此外，本发明的抗体及其表位结合片段示出许多有利特征，例如能够在病理性和非病理性人类τ蛋白之间区分，并且特别是能够结合与阿尔茨海默(AD)病理学相关联的τ蛋白。在电生理研究中，本发明的抗体及其表位结合片段另外还能够逆转降低的配对脉冲易化以及自发微小兴奋性突触电流(mEPSC)。
发明内容
本发明涉及单克隆抗体及其表位结合片段，能够特异性地结合至人类(2N4R同种型)τ蛋白(SEQ ID NO:1)的磷酸化残基丝氨酸396。这些抗体被进一步表征为它们在磷酸化残基396和404之间区分的能力，使得它们基本上不结合磷酸化404残基。
本发明的这些抗体在非病理性但磷酸化的τ蛋白的存在下对于病理性τ蛋白具有选择性。在正常τ蛋白存在下，本发明的这些抗体能够选择性地耗减病理性τ蛋白的τ蛋白缠结。不受具体理论的束缚，认为τ蛋白(包含在τ蛋白位置396处已经磷酸化的τ蛋白)的缠结耗减会防止将病理性τ蛋白接种到τ蛋白缠结中。因此，本发明的一个方面涉及一种抗体，该抗体能够选择性地结合至396-磷酸化τ蛋白，甚至当此类分子是在τ蛋白位置404处已经磷酸化的τ蛋白的存在下时。本发明的相关方面涉及一种抗体，该抗体能够选择性地结合至396-磷酸化τ蛋白，甚至当此类分子是在非病原性τ蛋白的存在下时。另外定义，本发明涉及一种针对病理性τ蛋白具有选择性的抗体，所述病理性τ蛋白是过度磷酸化τ蛋白，其在过表达τ蛋白的人类2N4R亚型的转基因小鼠中作为64kDa条带出现(通过蛋白质印迹分析)。
本发明的一个方面是针对抗τ蛋白抗体，该抗体与来自转基因小鼠的经免疫耗减的rTg4510提取物一起使用时，其特异性地将过度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa条带减少至少90％，同时没有将55kDaτ蛋白条带减少多于10％。本发明的另外的方面是针对抗τ蛋白抗体，该抗体特异性地将过度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa条带减少至少90％，同时没有将55kDaτ蛋白条带减少多于10％；或者当如在此描述的与来自人类AD尸体解剖后脑的提取物一起使用时，特异性地将pS396过度磷酸化τ蛋白条带减少至少90％，同时没有将非过度磷酸化τ蛋白条带减少多于10％。
本发明的另一个方面是针对治疗患有τ蛋白病变(例如阿尔茨海默病)的患者的方法，该方法包括耗减缠结或衰减所述缠结的进展，所述缠结包括过度磷酸化τ蛋白，所述方法包括使过度磷酸化τ蛋白与本发明的抗体接触，以使得该缠结被耗减，其过度磷酸化τ蛋白的含量得以减少，或者缠结形成的进展得以衰减。
可替代地定义的，本发明涉及治疗患有τ蛋白病变(例如阿尔茨海默病)的患者的方法，所述方法包括使缠结与对具有磷酸化残基396的τ蛋白具有选择性的抗体接触，这样使得缠结耗减过度磷酸化τ蛋白。
本发明的一个方面针对结合至过度磷酸化人类τ蛋白的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括：
(a)轻链CDR1，其包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:40；和SEQ ID NO:46；
(b)轻链CDR2，其包括SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:41；和SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其包括SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:42；和SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其包括SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:43；SEQ ID NO:49；SEQ ID NO:52；和SEQ ID NO:55的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:44；SEQ ID NO:50；SEQ ID NO:53；和SEQ ID NO:56；以及
(f)重链CDR3，其包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:51；SEQ ID NO:54；和SEQ ID NO:57。
本发明的一个方面针对结合至过度磷酸化人类τ蛋白的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括：
(a)选自下组的轻链，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:16；SEQ IDNO:17；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22和SEQID NO:23；以及
(b)选自下组的重链，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ IDNO:14；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；和SEQ ID NO:27。
本发明的一个另外的方面针对结合至过度磷酸化人类τ蛋白的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括：
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
本发明的一个有趣的方面针对结合至过度磷酸化人类τ蛋白的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括：
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
本发明的一个有趣的方面针对结合至过度磷酸化人类τ蛋白的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括：
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
本发明的抗体及其表位结合片段，可以用于治疗τ蛋白病变，例如阿尔茨海默病(AD)、嗜银颗粒痴呆(AGD)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、TBI(轻度、急性或慢性创伤性脑损伤)、以及慢性创伤性脑病(CTE)。
本发明的抗体及其表位结合片段另外预期用于治疗精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病，以及因AD导致的情感冷漠或患有AD的患者中的情感冷漠。
附图说明
图1.使用人源化C10-2和变体(C10-2_N32S和C10-2_N32S_A101T)针对捕获的AD-P3的液相抑制测定。如在实例3A中的描述，研究了由P396-特异性抗体hC10-2(正方形)、hC10-2_N32S(黑色圆)和hC10-2_N332_A101T(空心圆)捕获的AD-P3的浓度依赖性抑制。将AD-P3级分在室温下(r/t)，用渐增浓度的抗体(0-1000nM)孵育60分钟，随后用固定在96孔板上的200ng/ml小鼠C10-2抗体进行孵育。将捕获的AD-P3抗原用硫标记的抗总τ蛋白抗体(MSD)进行检测。
将hC10-2_N32S(黑色圆)和hC10-2_N332_A101T(空心圆)抗体的IC50分别计算为44nM和14nM。当比较图1的曲线时可以看出这是比hC10-2显著的改进。因此，在本发明的一个方面中，这些抗体在本文描述的液相抑制测定中抑制AD-P3，这样使得在针对AD-P3捕获的基于液相抑制测定的抗体的100nM或更少的浓度下，该信号减少了50％。
图2.肽抑制测定说明了hC10-2及相关的变体的表观亲和力。如在实例3B中的描述，用抗体hC10-2(正方形)、hC10-2_N32S(黑色圆)和hC10-2_N32_A101T(空心圆)来研究在液相溶液中的抗体结合至Pτ蛋白386-408(pS396)肽的浓度依赖性抑制。在r/t下，将该抗体用渐增浓度(0-10000nM)的Pτ蛋白386-408(pS396)以1ng/ml预孵育60分钟，随后在包被100ng/ml Pτ蛋白386-408(pS396/pS404)的孔中进行孵育。用硫标记抗人类IgG抗体(MSD)检测结合良好的抗体。
从图2可以看出，基于表观亲和力研究，使用具有Pτ蛋白(P396)386-408的液相溶液，抗体hC-10.2(IC50＝24nM)、抗体hC10.2_N32S(IC50＝50nM)和抗体hC10.2_N32S、A101T(IC50＝34nM)具有小于100nM，并且甚至小于60nM的IC50。
图3(图A-Z和AA-AG).在来自患有AD的供体的尸体解剖后脑中和在rTg4510小鼠脑中的病理性τ蛋白的免疫组织化学检测。如在实例4中的描述，在来自3种不同的AD供体的前额叶皮质中，将hC10-2、hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T标记为神经原纤维缠结、神经毡线和营养不良性神经突。用最高浓度的抗体来检测最强的染色强度。对照脑切片缺少免疫反应性。将在患有晚期病变的rTg4510脑中的所有的3种抗体标记磷酸化τ蛋白。
染色从hC10-2向hC10-2_N32S并且向hC10-2_N32S_A101T加重。用hC10-2_N32S_A101T、然后用hC10-2_N32S，再然后用hC10-2检测最强的染色强度。hC10-2_N32S_A101T和hC10-2_N32S在低至100ng/mL的浓度下，进行在阿尔茨海默病脑中的病理性τ蛋白的免疫组织化学检测。
图4(图A-F).在用hC10-2处理的rTg4510小鼠中τ蛋白结构的修饰。将hC10.2静脉内给予(图A、C、E和F代表rTg4510；图B和D代表tTA)该小鼠接受在80mg/kg浓度下150μL体积的hC10-2抗体的单次注射。3天后根据在实例5中描述的方法取脑片。hC10-2特异性地标记在rTg4510脑中的海马体和皮质中的体内靶标结构，而非在对照tTA脑中进行标记。针对AlexaFluor488和Hoechst信号的成对的图像在海马体切片中示出。
图5(图A-F).在用hC10-2_N32S处理的rTg4510小鼠中τ蛋白结构的修饰。(图A、C和E代表rTg4510；图B、D和F代表tTA)该小鼠接受在80mg/kg浓度下150μL体积的hC10-2_N32S抗体的单次注射。3天后根据在实例5中描述的方法取脑片。hC10-2_N32S特异性地标记在rTg4510脑中的海马体和皮质中的体内靶标结构，而非在对照tTA脑中进行标记。针对AlexaFluor488和Hoechst信号的成对的图像在海马体切片中示出。
图6(图A-F).rTg4510小鼠中τ蛋白结构的修饰，随后进行hC10-2_N32S_A101T的静脉内注射。(图A、C和E代表rTg4510；图B、D和F代表tTA)该小鼠接受在80mg/kg浓度下150μL体积的hC10-2_N32S_A101T抗体的单次注射。3天后根据在实例5中描述的方法取脑片。hC10-2_N32S_A101T特异性地标记在rTg4510脑中的海马体和皮质中的体内靶标结构，而非在对照tTA脑中进行标记。针对AlexaFluor488和Hoechst信号的成对的图像在海马体切片中示出。
比较图4-6表明，hC10.2、hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T在静脉注射后穿过血脑屏障。这些图进一步表明，相比hC10-2，hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T标记海马体和皮质中τ蛋白结构(对τ蛋白缠结的免疫反应性)具有改进的结果。
图7(图A-D).由患有阿尔茨海默病(AD)的脑中的pS396特异性抗体识别的τ蛋白种类。如在实例6中的描述，在AD脑切片中，τ蛋白缠结由E1和p396抗体共同标记，或对于单独pS396抗体是阳性(箭头)的。通过荧光显微镜检术分析这些切片。许多τ蛋白缠结是仅由hC10-2和hC10-2_N32S_A101T抗体(箭头)标记的。给定的血影缠结没有被N-端τ蛋白抗体染色，由单独的hC10-2或hC10-2_N32S_A101T抗体标记的τ蛋白重链很可能代表细胞外的血影缠结。
图8A-8C.通过蛋白质印迹检测病理性τ蛋白。如在实例6部分“通过蛋白质印迹检测病理性τ蛋白”中的描述，通过蛋白质印迹检测具有hC10.2、hC10-2_N32S、hC10-2_N32S_A101T的病理性τ蛋白。从在32周龄安乐死的三只rTg4510小鼠和非转基因的(非tg)对照同窝仔中收集前脑，并且从四只AD小鼠和四只健康的对照(HC)供体中收集皮质标本，分别将其分级为可溶性(S1)、TBS-可溶性沉淀(S1p)和肌氨酰不可溶性(P3)级分，并且通过蛋白质印迹针对在pS396表位处的磷酸化τ蛋白，用1μg/ml hC10.2(A)、hC10-2_N32S(B)、hC10-2_N32S_A101T(C)进行分析。在rTg4510中，正常人类4R0Nτ蛋白显示为55kDa，而过度磷酸化τ蛋白种类显示为64kDa和70kDa。在AD中，过度磷酸化τ蛋白种类显示为具有可变量的AD典型涂片的54kDa、64kDa、69kDa和74kDa四个条带。
相比于非转基因小鼠，针对rTg4510小鼠的τ蛋白，以及相比于健康的对照供体，针对AD供体，每个hC10-2、hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T是可选择性的。此外，相比于正常rTg4510小鼠的τ蛋白55kDa蛋白，在可溶性(S1)、TBS-可溶性沉淀(S1p)和肌氨酰不可溶性(P3)级分中，每个hC10-2、hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T对于rTg4510小鼠的病原性τ蛋白64kDa蛋白是选择性的。
图9.来自AD脑的τ蛋白的免疫沉淀反应。如在实例6部分“病理性τ蛋白的免疫沉淀反应”中的描述，具有10μg hC10.2、hC10-2_N32S、hC10-2_N32S_A101T的τ蛋白的免疫沉淀反应，使用来自从四个AD和健康对照(HC)供体中收集的皮质的脑匀浆物的500μg预澄清的裂解物的人类IgG1对照(hIgG1)，通过蛋白质印迹，用多克隆兔子抗pS396τ蛋白(pS396τ蛋白)抗体进行分析。在AD中，过度磷酸化τ蛋白种类显示为具有可变量的AD典型涂片的54kDa、64kDa、69kDa、和74kDa四个条带。
图10A-C通过Cisbio测定的τ蛋白聚集的定量。野生型(Wt)接种材料(WW)显示出无接种并且从所有接种的样品中减去背景信号。将Tg4510匀浆物有效地接种，并且该接种效果没有被用B12的处理影响，但是被在20μg/mL的浓度下，用本发明的τ蛋白抗体(hC10-2_N32S_A101T>hC10-2_N32S>hC10-2)进行的接种研究处理影响至不同的程度。代表四个独立实验组的结果的图，并且将其绘制为相对的τ蛋白聚集(超出针对总蛋白归一化的背景的信号倍数)，并且相对的不可溶性p396τ蛋白是通过triton-X不可溶性级分(超过归一化背景的信号倍数)的蛋白质印迹的密度测定法进行定量的。将所有的样品归一化为同种型对照抗体B12。图10B-10C代表通过Cisbio测定的τ蛋白聚集的定量。接种的pcDNA HEK293细胞没有显示信号，确认了不存在用于输入接种材料的检测。Wt(野生型)接种材料(WW)没有示出接种，但相比之下与未接种的相比，rTg4510匀浆(CC)有效地接种。这种接种效应不受用HEL处理的影响，但部分地通过用τ蛋白抗体(C10-2>D1.2>hACI36-2B6-Ab1)处理而逆转。代表三组独立样品的图，并且将其绘制为相对的τ蛋白聚集(超出针对总蛋白归一化的背景的信号倍数)。实例6，“细胞和聚集测定”部分描述了以下方案。
图11.使用不同量的hC10-2和2.10.3抗体，AD脑提取物的免疫耗减后τ5蛋白质印迹信号的定量。如在实例7中的描述，两种抗体均确实从阿尔茨海默脑提取物去除了小部分的总τ蛋白。
图12.使用不同量的hC10-2(方块)和2.10.3(三角)抗体，AD脑提取物免疫耗减后P-S422τ蛋白蛋白质印迹信号的定量。该图示出了来自实例7的结果。通过免疫耗减，使用hC10-2或2.10.3，可以将在丝氨酸422处磷酸化的τ蛋白从AD脑提取物中有效地去除。两种抗体确实去除了多于90％P-S422τ蛋白，尽管需要更多的2.10.3抗体才能达到该相同的效果。
图13.使用不同量的hC10-2和2.10.3抗体，AD脑提取物免疫耗减后pS396τ蛋白蛋白质印迹信号的定量。该图示出了来自实例7的结果。hC10-2免疫耗减从AD脑提取物中去除了88％的在丝氨酸396处磷酸化的τ蛋白，然而2.10.3仅去除了55％的pS396τ蛋白。
图14.使用不同量的hC10-2和2.10.3抗体，AD脑提取物免疫耗减后P-S199/202τ蛋白蛋白质印迹信号的定量。该图示出了来自实例7的结果。该hC10-2免疫耗减清除了69％的在丝氨酸199/202处磷酸化的τ蛋白。该2.10.3抗体没有给出相同的剂量依赖性降低。
图15.免疫耗减之前和之后在蛋白质印迹上的阿尔茨海默病脑提取物。该图示出了来自实例7的结果。存在在丝氨酸396处的25kDa磷酸化的τ蛋白片段。使用hC10-2的免疫耗减导致该25kDaτ蛋白条带的降低。这2种其他的磷酸化特异性抗体2.10.3和AT8没有去除该25kDa种类。
图16.使用不同量的hC10-2变体N32S、N32Q、N32S_A101T、N32Q_A101T、N32Q_D55E和N32S_D55E，免疫耗减AD脑提取物后，pS396τ蛋白蛋白质印迹信号的定量。如可以从实例8中得出结论，本发明的抗体从AD脑匀浆物中去除在丝氨酸396处的磷酸化的τ蛋白的能力是显著的。在小于0.1μg的抗体(在75ng处的数据点)的情况下，这些变体导致pS396信号减少至少28％(除了N32Q，D55E，其减少16％)，然而该C10.2导致了pS396信号的减少低于6％。
图17(图A-D).由注射AD脑提取物导致的τ蛋白缠结该海马体的接种。如在实例8a中进行，以15mg/kg的剂量，该mC10-2处理显著地将在接种的海马体中的缠结病变降低了57％(P<0.05)。存在明显的趋势表明hC10-2还降低病变。通过对比，2.10.3没有显示出在相同剂量下的效果。
图18.残基P-Ser396和Tyr394在该抗原结合位点的中心处
示出了Ile(392)-Val(393)-Tyr(394)-Lys(395)-pSer(396)-Pro(397)-Val(398)的结构。与本发明的抗体的主要相互作用涉及疏水口袋，τ蛋白肽的pSer396和Y394。形成了广泛氢键网络，并且存在具有pSer396的膦酸酯的Y(394)侧链与骨架之间的电荷/极性相互作用。本发明的抗体的HC CDR1包括回文的8-残基基序极性AA-疏水的AA-极性的AA-带电荷的AA-带电荷的AA-极性的AA-疏水的AA-极性的AA(Thr-Phe-Thr-Asp-Arg-Thr-Ile-His)。这些带电荷的残基通过由抗体和τ蛋白之间的氢键、电荷/电荷以及电荷/极性相互作用形成的广泛键合网络进行相互作用。
图19.在处理范例中的抗体疗效
如在实例8b中进行，将表达hτ-P301L的HEK293细胞用Tg4510匀浆物接种，用指示的抗体预孵育，胰蛋白酶化，并且再次接种24小时后(再次添加抗体)，并且接种后48小时将其收获。使用Cisbioτ蛋白聚集，针对聚集的τ蛋白，将总细胞匀浆物进行探测。数据是4个独立的生物学重复+/-S.E.M.汇集的数据，归一化为CC+B12(tg4510)。
将表达P301L-hτ蛋白的细胞用40μg Tg4510脑匀浆(总蛋白)接种，在4℃下，用抗体(20μg/ml≈133nM)/6孔预孵育过夜。用CC+B12接种给出较大的接种反应。hC10.2对聚集具有大约40％的影响。所有其他的抗体显示出与hC10.2至少相当的效果。特别地，hC10.2的N32S和N32S_A101T变体在降低聚集的τ蛋白方面示出了强45％和62％的效果。相比hC10.2，该N32S_A101T变体示出了对聚集显著更强的效果。该图表明人源化的C10.2在结合τ蛋白诱导接种方面是有效的，但是N32S的添加，并且特别是N32S和A101T双突变的添加增加了该mAb的中和活性。
图20.在胁迫条件下这些变体的脱酰胺研究
如在实例8c中进行，通过LC-MS分析胰蛋白酶肽LC:T2[VTMTCQASQDTSIXLNWFQQKPGK；SEQ ID NO:58]来监测在VL链的位置32或34处的Asn残基的脱酰胺作用。X是在图20中指明的在各自的变体中的Asn、Gln或Ser。该MS分析允许脱酰胺肽与非脱酰胺肽的相对含量的计算。在WT、A101T和D55E变体中，在LC:T2肽处观察到广泛的脱酰胺作用。同样清楚的是，将Asn32转变为Gln或Ser完全抑制在其他Asn34残基处的肽的脱酰胺作用。同样我们没有检测该Gln32变体的任何脱酰胺作用。用该Asn34的变体观察到相似的结果。
图21由τ蛋白抗体，在皮质神经元中τ蛋白接种和聚集的降低
来自rTg4510小鼠胚胎的皮质神经元培养物中的τ蛋白接种和聚集是由来自40周龄rTg4510小鼠的P3或S1p级分的由0.2ng病理性τ蛋白诱导的，并且通过该Cisbioτ蛋白聚集测定进行测量。在7天的培养物(DIV)中，将神经元用P3或S1p和10μg抗体或磷酸盐缓冲盐水(PBS)的混合物进行处理。在DIV11下，进行完全培养基更换，以去除残余物P3和S1p种子以及抗体。允许τ蛋白接种再持续4天，并且在DIV15处裂解神经元，以测量τ蛋白接种和聚集。PBS和人类对照IgG抗体(IgG con ab)不影响τ蛋白接种和聚集。通过用τ蛋白抗体(hC10.2_A101T_N32S>hC10.2_N32S>hC10.2)进行处理，将τ蛋白接种和聚集部分逆转。测量以下τ蛋白接种和聚集的降低：hC10.2降低了23％、hC10.2_N32S降低了41％-53％、并且hC10.2_A101T_N32S降低了48％-60％。这些柱状图代表来自τ蛋白聚集归一化为神经元蛋白作为平均值±SD的两个独立实验的数据。单因素方差分析Newman-Keuls多重比较测验(One way ANOVA Newman-Keuls Multiple Comparison Test)(PBS/IgG con ab对比hC10.2、hC10.2_N32S、hC10.2_A101T_N32S，***p<0.001；hC10.2对比hC10.2_N32S、hC10.2_A101T_N32S，###p<0.001)。
图22在rTg4510小鼠中τ蛋白结构的剂量依赖性修饰，随后进行hC10-2_N32S的静脉内注射。
hC10-2_N32S特异性地标记在rTg4510脑中的海马体和皮质中的体内靶标结构。示出了来自扣带皮质的图像。最强的信号在20mg/kg和80mg/kg处，弱信号在8mg/kg处，在0.8mg/kg处无可见信号。
图23在海马体中接种的τ蛋白病变
通过hC10-2、hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T处理，在接种的海马体中具有Gallyas缠结染色的细胞数目降低了50％、48％以及47％。在覆盖背部海马体的每6个切片中进行定量，每个动物共使用8个切片。细胞数反映了在8个切片中鉴定的海马体的所有亚区中阳性细胞的总和。使用单因素方差分析和Dunnett的多重比较检验分析该数据。
通过引用结合的序列
SEQ ID NO:1人类τ蛋白(2N4R)
SEQ ID NO:2τ蛋白残基386-408(pS396，pS404)
SEQ ID NO:3C10-2轻链CDR1
SEQ ID NO:4C10-2轻链CDR2
SEQ ID NO:5C10-2轻链CDR3
SEQ ID NO:6C10-2重链CDR1
SEQ ID NO:7C10-2重链CDR2
SEQ ID NO:8C10-2重链CDR3
SEQ ID NO:9小鼠C10-2轻链
SEQ ID NO:10小鼠C10-2重链
SEQ ID NO:11人源化的C10-2重链
SEQ ID NO:12人源化的C10-2轻链
SEQ ID NO:13人源化的C10-2重链变体D55E
SEQ ID NO:14人源化的C10-2重链变体D55Q
SEQ ID NO:15人源化的C10-2重链变体D55S
SEQ ID NO:16人源化的C10-2轻链变体N32S
SEQ ID NO:17人源化的C10-2轻链变体N32Q
SEQ ID NO:18人源化的C10-2轻链变体N34S
SEQ ID NO:19人源化的C10-2轻链变体N34Q
SEQ ID NO:20人源化的C10-2轻链变体N32S，N34S
SEQ ID NO:21人源化的C10-2轻链变体N32Q，N34S
SEQ ID NO:22人源化的C10-2轻链变体N32Q，N34Q
SEQ ID NO:23人源化的C10-2轻链变体N32S，N34Q
SEQ ID NO:24人源化的C10-2重链变体A101T
SEQ ID NO:25人源化的C10-2重链变体D55E，A101T
SEQ ID NO:26人源化的C10-2重链变体D55Q，A101T
SEQ ID NO:27人源化的C10-2重链变体D55S，A101T
SEQ ID NO:28人源化的C10-2重链CDR2变体D55E
SEQ ID NO:29人源化的C10-2重链CDR2变体D55Q
SEQ ID NO:30人源化的C10-2重链CDR2变体D55S
SEQ ID NO:31人源化的C10-2轻链CDR1变体N32S
SEQ ID NO:32人源化的C10-2轻链CDR1变体N32Q
SEQ ID NO:33人源化的C10-2轻链CDR1变体N34S
SEQ ID NO:34人源化的C10-2轻链CDR1变体N34Q
SEQ ID NO:35人源化的C10-2轻链CDR1变体N32S，N34S SEQ ID NO:36人源化的C10-2轻链CDR1变体N32Q，N34S SEQ ID NO:37人源化的C10-2轻链CDR1变体N32Q，N34Q SEQID NO:38人源化的C10-2轻链CDR1变体N32S，N34Q SEQ ID NO:39人源化的C10-2重链CDR3变体A101T
SEQ ID NO:40IMGT编号人源化的C10-2轻链CDR1
SEQ ID NO:41IMGT编号人源化的C10-2轻链CDR2
SEQ ID NO:42IMGT编号人源化的C10-2轻链CDR3
SEQ ID NO:43IMGT编号人源化的C10-2重链CDR1
SEQ ID NO:44IMGT编号人源化的C10-2重链CDR2
SEQ ID NO:45IMGT编号人源化的C10-2重链CDR3
SEQ ID NO:46IMGT编号人源化的C10-2轻链CDR1变体N32S SEQ ID NO:47IMGT编号人源化的C10-2轻链CDR2变体N32S SEQ ID NO:48IMGT编号人源化的C10-2轻链CDR3变体N32S SEQ ID NO:49IMGT编号人源化的C10-2重链CDR1变体A101T
SEQ ID NO:50IMGT编号人源化的C10-2重链CDR2变体A101T
SEQ ID NO:51IMGT编号人源化的C10-2重链CDR3变体A101T
SEQ ID NO:52Chotia编号人源化的C10-2重链CDR1
SEQ ID NO:53Chotia编号人源化的C10-2重链CDR2
SEQ ID NO:54Chotia编号人源化的C10-2重链CDR3
SEQ ID NO:55Chotia编号人源化的C10-2重链CDR1变体A101T
SEQ ID NO:56Chotia编号人源化的C10-2重链CDR2变体A101T
SEQ ID NO:57Chotia编号人源化的C10-2重链CDR3变体A101T
具体实施方式
如在此使用的，术语“τ”与“τ蛋白”是同义的，并且是指τ蛋白亚型的任一种(例如在UniProt中鉴定为P10636，1-9)。在此使用的τ蛋白的氨基酸编号是相对于如以下所示的亚型2(SEQ ID NO:1)给出的，其中甲硫氨酸(M)是氨基酸残基1：
SEQ ID NO:1:
本发明涉及抗体及其表位结合片段，它们能够特异性地结合至τ蛋白，并且特别是人类τ蛋白，并且在一个实施例中展现出特异性地结合至人类τ蛋白的磷酸化S396残基(pS396)的能力。本发明的抗体及其表位结合片段进一步表征为不能或基本上不能特异性地结合至人类τ蛋白上的磷酸化的丝氨酸404(pS404)残基，例如在抗体限制或非饱和条件下。此外，在pS404处的磷酸化作用并不干扰特异性结合至含有表位的pS396。如在此使用的，符号“pS”和“{p}S”表示氨基酸残基磷酸丝氨酸，并且其后的数字表示残基相对于SEQ IDNO:1的序列的位置。如在此所使用的，如果相对于另一个表位，抗体与表位的结合是用这样的其他表位观察到的结合的小于20％、小于10％、小于5％、小于2％并且更优选小于1％，那么该抗体“基本上”不能结合至该表位。
本发明上下文中的术语“抗体(Ab)”是指免疫球蛋白分子，或根据本发明的一些实施例是指能够特异性地结合至分子(“抗原”)的表位的免疫球蛋白分子的片段。天然存在的抗体典型地包括四聚体，它通常由至少两条重链(HC)和至少两条轻链(LC)构成。每条重链由重链可变结构域(在此缩写为VH)和重链恒定结构域构成，重链恒定结构域通常由3个结构域(CH1、CH2和CH3)构成。人类重链可以具有任何同种型，包括IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)。每条轻链由轻链可变结构域(在此缩写为VL)和轻链恒定结构域(CL)构成。人类轻链包括κ链和λ链。重链和轻链可变结构域典型地负责抗原识别，而重链和轻链恒定结构域可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体***的第一组分(C1q))的结合。该VH和VL结构域可以进一步细分为高变性结构域，称为“互补决定区”，其穿插有更保守序列的结构域(称为“框架区”(FR))。每个VH和VL是由三个CDR结构域和四个FR结构域组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。重链和轻链可变结构域含有与抗原相互作用的结合结构域。特别相关的是已经“被分离”以便存在于与它可以在自然界中存在的不同于物理环境中的或者已经被修饰以便在氨基酸序列上不同于天然存在的抗体或它们的表位结合片段的抗体及其表位结合片段。
术语“表位”意指能够特异性地结合至抗体的抗原决定簇。表位通常由如氨基酸或糖侧链分子的表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象表位和线性表位的区别在于与前者而非后者的结合在变性溶剂的存在下常常缺失。表位可以包含直接涉及于结合中的氨基酸残基和其他未直接涉及于结合中的氨基酸残基，例如被特异性表位结合肽有效阻断的氨基酸残基(换言之，该氨基酸残基是在特异性表位结合肽的足迹内)。
如在此所使用的，术语“抗体的表位结合片段”意指抗体的片段、部分、区域或结构域(无论它如何产生(例如，经由切割、重组、合成等))，其能够特异性地结合至表位。表位结合片段可以含有这样的抗体的任意1、2、3、4、5或所有6个CDR域，并且尽管能够特异性结合到这样的表位，仍可以展现出对不同于这样的抗体的表位的这样的表位的特异性、亲和力或选择性。然而，优选地，表位结合片段将包含这种抗体的所有6个CDR结构域。抗体的表位结合片段可以是单一多肽链的部分或者包括单一多肽链(例如scFv)，或者可以是两个或更多个多肽链的部分或者包括两个或更多个多肽链，各自具有氨基末端和羧基末端(例如，抗体、Fab片段、Fab2片段等)。可以获得展现表位结合活性的抗体的片段，例如通过完整抗体的蛋白酶切割。更优选地，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独基因或编码这样的基因序列的多核苷酸(例如，其编码cDNA)天然地编码，但是可以将这两个结构域使用重组方法通过柔性接头连接，该柔性接头使得这两个结构域能够成为单条蛋白链，在该单条蛋白链中VL区和VH区缔合以形成单价表位结合分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人，(1988)Science[科学]242:423-426；和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。可替代地，通过采用太短的柔性接头(例如，小于约9个残基)以使得单一多肽链的VL和VH结构域能够关联在一起，可以形成双特异性抗体、双体、或类似分子(其中两个这样的多肽链关联在一起以形成二价表位结合分子)(关于双体的说明参见例如PNAS USA 90(14)，6444-8(1993))。包含在本发明中的表位结合片段的实例包括(i)Fab'或Fab片段，即一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，或如描述于WO2007059782中的单价抗体；(ii)F(ab')2片段，包含两个由二硫键在铰链结构域连接的Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，实质上由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，实质上由VL和VH结构域组成，(v)dAb片段(Ward等人，Nature[自然]341，544-546(1989))，实质上由VH结构域组成，并且还称为域抗体(Holt等人；Trends Biotechnol.[生物技术趋势]2003年11月；2i(ll):484-90)；(vi)骆驼抗体或纳米抗体(Revets等人；Expert Opin Biol Ther.[生物理论专家观点]2005年1月；5_(l):l ll-24)以及(vii)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然该Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码，它们可以使用重组方法通过能将所述VL和VH产生为单一蛋白链的合成接头来进行连接，在所述单一蛋白链中VL和VH结构域配对以形成单价分子(称为单链抗体或单链Fv(scFv)，参见例如Bird等人，Science[科学]242，423-426(1988)和Huston等人，PNAS USA[美国国家科学院院刊]85，5879-5883(1988))。在此进一步讨论在本发明的背景下的这些和其他有用的抗体片段。还应理解的是，术语抗体，除非另外指明，否则还包括抗体样多肽(例如嵌合抗体和人源化抗体)、以及保留特异性地结合至抗原的能力的抗体片段(表位结合片段)，它们是通过任何已知的技术提供的，例如酶切割、肽合成、以及重组技术。这样产生的抗体可以具有任何同种型。如在此使用的，“同种型”是指由重链恒定结构域基因编码的免疫球蛋白类别(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段；可以针对实用性，以相同的方式容易地筛选能够结合至所希望的表位的适合的片段，将其作为完整抗体。在一个实施例中，本发明的抗体的Fc区包括调整效应子功能的突变。
术语“双特异性抗体”是指包含两个独立表位结合片段的抗体，每个表位结合片段靶向独立的靶标。这些靶标可以是存在于不同蛋白上的表位或者存在于相同靶标上的不同表位。可以使用亲本单特异性二价抗体分子的HC的恒定结构域中的补偿氨基酸变化来制备双特异性抗体分子。所得异源二聚体抗体含有一个由两个不同亲本单特异性抗体贡献的Fab。Fc域中的氨基酸变化导致具有随时间稳定的双特异性的异源二聚体抗体的稳定性增加。(Ridgway等人，Protein Engineering[蛋白质工程]9，617-621(1996)；Gunasekaran等人，JBC285，19637-1(2010)；Moore等人，MAbs 3:6546-557(2011)；Strop等人，JMB 420，204-219(2012)；Metz等人，Protein Engineering[蛋白质工程]25:10571-580(2012)；Labrijn等人，PNAS 110:113，5145-5150(2013)；SpreterVon Kreudenstein等人，MAbs 5:5646-654(2013))。双特异性抗体还可以包括使用ScFv融合物产生的分子。然后将两个单特异性scfv独立地连接至能够形成稳定异源二聚体的Fc域，以产生单个双特异性分子(Mabry等人，PEDS 23:3115-127(2010))。双特异性分子具有双重结合能力。
如在此和在图中使用的术语“C10-2”、“人类C10-2”、“hC10-2”、“HC10-2”、“hC10.2”、“人源化的C10-2”和“人源化的C10-2”旨在意指是同义的，并且被定义为抗体C10-2。该术语旨在表示抗体或其表位结合片段，包含抗体轻链可变结构域或由抗体轻链可变结构域组成，该抗体轻链可变结构域具有：
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
以及抗体重链可变结构域，该抗体重链可变结构域具有：
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
抗体C10-2是人源化的抗体，其可以被定义为包括SEQ ID NO:11的重链、SEQ IDNO:12的轻链、或两者。本发明的一个实施例针对抗体或其表位结合片段，其包括SEQ IDNO:11的重链和SEQ ID NO:12的轻链。
如在此和在图中使用的术语“mC10-2”旨在意指小鼠抗体C10-2，并且由SEQID.NO.9和10定义。小鼠抗体C10.2被用作对照抗体，并且不是本发明的一部分。
如在此和在图中使用的，术语“hC10-2_N32S”和“C10-2_N32S”旨在意指是同义的，并且是抗体C10-2的变体，其中该轻链已经突变为至少包括从N至S的氨基酸残基32的突变，并且被定义为抗体N32S。如在此和在图中使用的术语“hC10-2_N32Q”和“C10-2_N32Q”旨在意指是同义的，并且是抗体C10-2的变体，其中该轻链已经突变为至少包括从N至Q的氨基酸残基32的突变，并且被定义为抗体N32Q。
如在此和在图中使用的术语“hC10-2_N34S”和“C10-2_N34S”旨在意指是同义的，并且是抗体C10-2的变体，其中该轻链已经突变为至少包括从N至S的氨基酸残基34的突变，并且被定义为抗体N34S。如在此和在图中使用的术语“hC10-2_N34Q”和“C10-2_N34Q”旨在意指是同义的，并且是抗体C10-2的变体，其中该轻链已经突变为至少包括从N至Q的氨基酸残基34的突变，并且被定义为抗体N34Q。
如在此和在图中使用的术语“hC10-2_N32S_N34S”和“C10-2_N32S_N34S”旨在意指是同义的，并且是抗体C10-2的变体，其中该轻链已经突变为至少包括从N至S的氨基酸残基32和34的突变，并且被定义为抗体N32S、N34S。如在此和在图中使用的术语“hC10-2_N32Q_N34S”和“C10-2_N32Q_N34S”旨在意指是同义的，并且是抗体C10-2的变体，其中该轻链已经分别突变为至少包括从N至Q和从N至S的氨基酸残基32和34的突变，并且被定义为抗体N32Q、N34S。如在此和在图中使用的术语“hC10-2_N32Q_N34Q”和“C10-2_N32Q_N34Q”旨在意指是同义的，并且是抗体C10-2的变体，其中该轻链已经突变为至少包括从N至Q的氨基酸残基32和34的突变，并且被定义为抗体N32Q、N34Q。如在此和在图中使用的术语“hC10-2_N32S_N34Q”和“C10-2_N32S_N34Q”旨在意指是同义的，并且是抗体C10-2的变体，其中该轻链已经分别突变为至少包括从N至S和从N至Q的氨基酸残基32和34的突变，并且被定义为抗体N32S、N34Q。
如在此和在图中使用的术语“hC10-2_D55E”和“C10-2_D55E”旨在意指是同义的，并且是抗体C10-2的变体，其中该重链已经突变为至少包括从D至E的氨基酸残基55的突变，并且被定义为抗体D55E。如在此和在图中使用的术语“hC10-2_D55Q”，“C10-2_D55Q”旨在意指是同义的，并且是抗体C10-2的变体，其中该重链已经突变为至少包括从D至Q的氨基酸残基55的突变，并且被定义为抗体D55Q。如在此和在图中使用的术语“hC10-2_D55S”，“C10-2_D55S”旨在意指是同义的，并且是抗体C10-2的变体，其中该重链已经突变为至少包括从D至S的氨基酸残基55的突变，并且被定义为抗体D55S。
如在此和在图中使用的术语“hC10-2_A101T”和“C10-2_A101T”旨在意指是同义的，并且是抗体C10-2的变体，其中该重链已经突变为至少包括从A至T的氨基酸残基101的突变，并且被定义为抗体A101T。
如在此和在图中使用的术语“hC10-2_N32S_A101T”、“C10-2_N32S_A101T”、“hC10-2_A101T_N32S”和“C10-2_A101T_N32S”旨在意指是同义的，并且是抗体C10-2的变体，其中该重链已经突变为至少包括从A至T的氨基酸残基101的突变，并且其中该轻链已经突变为至少包括从N至S氨基酸残基32的突变，并且被定义为抗体N32S、A101T。
如在此和在图中使用的术语“hC10-2_N32Q_A101T”、“C10-2_N32Q_A101T”、“hC10-2_A101T_N32Q”和“C10-2_A101T_N32Q”旨在意指是同义的，并且是抗体C10-2的变体，其中该重链已经突变为至少包括从A至T的氨基酸残基101的突变，并且其中个轻链已经突变为至少包括从N至Q的氨基酸残基32的突变，并且被定义为抗体N32Q、A101T。
如在此使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组合物的抗体分子制品。常规的单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。在某些实施例中，单克隆抗体可以由多于一种Fab域构成，由此增加对多于一种靶标的特异性。术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”不是旨在由任何具体产生方法(例如，重组的、转基因、杂交瘤等)限制。
本发明的这些抗体及其表位结合片段将优选是“人源化”的，特别是当被采用以用于治疗目的时。术语“人源化的”是指通常使用重组技术制备的具有衍生自来自非人物种的免疫球蛋白的表位结合位点和基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的剩余免疫球蛋白结构的分子。该表位结合位点可包括与人类恒定结构域融合的完整非人类抗体可变结构域，或者包括此类可变结构域的接枝到人类可变结构域的适当人类框架区上的仅互补决定区(CDR)或其部分。此类人源化分子的构架残基可以是野生型的(例如，全人的)或者它们可以被修饰成包含一种或多种未在其序列已经充当人源化的基础的人抗体中发现的氨基酸取代。人源化减小或消除该分子的恒定结构域充当人个体中的免疫原的可能性，但是仍存在对外源可变结构域做出免疫应答的可能性(LoBuglio,A.F.等人(1989)“Mouse/HumanChimeric Monoclonal Antibody In Man:Kinetics And Immune Response[人体内的小鼠/人嵌合单克隆抗体：动力学与免疫应答]”，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)[美国国家科学院院刊]86:4220-4224)。另一种方法不仅集中于提供人衍生的恒定结构域，还集中于修饰可变结构域以便将它们改造地尽可能接近人类形式。已知的是，重链和轻链两者的可变结构域都含有三个互补决定区(CDR)，它们响应于所讨论的抗原而改变并且决定结合能力，其侧翼为四个构架区(FR)，这些构架区在给定物种中是相对保守的并且推定为CDR提供支架。当相对于特定抗原制备非人抗体时，可以通过在有待修饰的人抗体中存在的FR上接枝衍生自非人抗体的CDR来“改造”或“人源化”可变结构域。已经由Sato,K.等人(1993)CancerRes[癌症研究]53:851-856；Riechmann,L.等人(1988)“Reshaping Human Antibodies forTherapy[改造治疗用的人抗体]”，Nature[自然]332:323-327；Verhoeyen,M.等人(1988)“Reshaping Human Antibodies:Grafting An Antilysozyme Activity[改造人抗体：接枝抗溶菌酶活性]”，Science[科学]239:1534-1536；Kettleborough,C.A.等人(1991)“Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting:The ImportanceOf Framework Residues On Loop Conformation[通过CDR-接枝人源化小鼠单克隆抗体：构架残基在环构象中的重要性]”，Protein Engineering[蛋白质工程]4:773-3783；Maeda,H.等人(1991)“Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-NeutralizingActivity[具有HIV中和活性的经改造的人抗体的构建]”，Human Antibodies Hybridoma[人抗体杂交瘤]2:124-134；Gorman,S.D.等人(1991)“Reshaping A Therapeutic CD4Antibody[改造治疗用CD4抗体]”，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)[美国国家科学院院刊]88:4181-4185；Tempest,P.R.等人(1991)“Reshaping A Human Monoclonal Antibody ToInhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo[改造人单克隆抗体以抑制体内人呼吸道合胞病毒感染]”，Bio/Technology[生物/技术]9:266-271；Co,M.S.等人(1991)“Humanized Antibodies For Antiviral Therapy[抗病毒治疗用的人源化抗体]”，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)[美国国家科学院院刊]88:2869-2873；Carter,P.等人(1992)“Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy[人癌症治疗用的抗p185her2抗体的人源化]”，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)[美国国家科学院院刊]89:4285-4289；以及Co,M.S.等人(1992)“Chimeric And HumanizedAntibodies With SpecificityFor The CD33 Antigen[对CD33抗原具有特异性的嵌合和人源化抗体]”，J.Immunol.[免疫学杂志]148:1149-1154报道了这种方法在各种抗体中的应用。在一些实施例中，人源化抗体保留所有CDR序列(例如，含有来自小鼠抗体的所有六个CDR的人源化小鼠抗体)。在其他实施例中，人源化抗体具有一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，它们相对于原始抗体是改变的，它们还被称为一个或多个“衍生自”来自原始抗体的一个或多个CDR的CDR。人源化抗体的能力是熟知的(参见，例如美国专利号5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,859,205；6,407,213；6,881,557)。
术语“抗体“XX”旨在表示抗体或其表位结合片段(例如抗体“C10-2”)包括：(a)轻链、和重链、重链可变结构域、或重链可变结构域CDR1-3如由其各自的SEQ ID NO定义，或(b)轻链可变结构域、和重链、重链可变结构域、或重链可变结构域CDR1-3如由其各自的SEQID NO定义，或(c)轻链可变结构域CDR1-3，如由其对应的SEQ ID NO定义，以及重链、重链可变结构域、或重链可变结构域CDR1-3如由其各自的SEQ ID NO定义，或由其组成。在某些实施例中，该抗体或其表位结合片段是通过它们的如通过其SEQ ID NO定义的整个重链可变结构域以及它们的如通过其SEQ ID NO定义的轻链可变结构域来定义。
除非在此另外指定，在抗体的Fc区或恒定结构域中氨基酸残基的编号是根据EU编号***，也成为EU索引，如在以下中描述的：Kabat等人，Sequences ofProteinsofImmunological Interest[具有免疫学意义的蛋白的序列]，第5版，公共卫生服务(Public Health Service)，国立卫生研究院，贝塞斯达(Bethesda)，马里兰州(MD)，1991。
在一些抗体中，仅需CDR的一部分(即结合所需的CDR残基亚群，称为SDR)在人源化抗体中保持结合。基于先前的研究，CDR残基不接触相关的表位，并且在SDR中不能被鉴定。例如，残基Tyr Ser Gln Lys Phe Gln，对应于SEQ ID NO.11的HC的残基60-65通常是不需要的，从位于Chothia超变环外的Kabat CDR区域(这些还被发现于HC CDR2(SEQ.ID.NO.7)中)(参见，Kabat等人，(1992)Sequences ofProteins ofImmunological Interest[免疫学关注的蛋白质序列]，美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)，公开号91-3242；Chothia,C.等人，(1987)“Canonical Structures For The Hypervariable RegionsOfImmunoglobulins[免疫球蛋白的超变区的典型结构]”，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917)中，通过分子建模和/或根据经验来鉴定，或者如在以下文献中描述的来鉴定：Gonzales,N.R.等人(2004)“SDR Grafting OfA Murine Antibody Using MultipleHuman Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity[使用多种人类种系模板进行鼠类抗体的SDR接枝以最小化其免疫原性]”，Mol.Immunol.[分子免疫学]41:863-872。在此类人源化抗体中，在一个或多个供体CDR残基不存在或整个供体CDR被省略的位置处，占据该位置的氨基酸可以是在受体抗体序列中占据相应位置(通过Kabat编号)的氨基酸。在包含在内的CDR中受体对供体氨基酸的这样的取代的数目反映了竞争考虑的平衡。这样的取代在降低人源化抗体中的小鼠氨基酸的数目方面并且因此在降低潜在的免疫原性方面是潜在有利的。然而，取代还可以引起亲和力变化，并且优选避免亲和力的显著减少。还可以凭经验选择CDR内的取代位置和待取代的氨基酸。
抗体还根据该IMGT编号***进行表征，其在本领域中被明确定义。长度(以氨基酸的数目计，即所占位置的数目)是IMGT-ONTOLOGY(http://www.imgt.org)的关键和原始概念。该CDR-IMGT长度表征该胚系基因的IG和TR V-域以及重排基因、cDNA和蛋白质的V-结构域。
抗体可以是，例如根据Chothia编号方案http://www.bioinf.org.uk/abs/表征。Chothia编号方案与Kabat方案相同，但将其***在结构定义的位置处的CDR-L1和CDR-H1中。Chothia编号方案是基于结构化环区的位置。这意味着这些环中的拓扑等效残基确实得到了相同的标记(不同于Kabat方案)。
CDR残基的单一氨基酸改变可以导致功能性结合的损失的事实(Rudikoff,S.等(1982)“Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-Binding Specificity[改变抗原结合特异性的单一氨基酸取代]”，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)[美国国家科学院院刊]79(6):1979-1983)提供了用于***地鉴定可替代功能CDR序列的手段。在用于获得此类变体CDR的一个优选方法中，诱变编码CDR的多核苷酸(例如经由随机诱变或通过定点方法(例如聚合酶链介导的采用编码突变座位的引物进行的扩增))以产生具有经取代的氨基酸残基的CDR。通过比较原始(功能性)CDR序列中的相关残基的身份与取代的(非功能性)变体CDR序列的身份，可以鉴定出该取代的BLOSUM62.iij取代得分。BLOSUM***提供了通过分析受信任的比对的序列的数据库而创建的氨基酸取代的矩阵(Eddy,S.R.(2004)“Where DidThe BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From？[BLOSUM62比对分数矩阵来自哪里？]”，Nature Biotech.[自然生物技术]22(8):1035-1036；Henikoff,J.G.(1992)“Aminoacid substitutionmatrices from protein blocks[来自蛋白质块的氨基酸取代矩阵]”，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)[美国国家科学院院刊]89:10915-10919；Karlin,S.等人(1990)“Methods For Assessing The Statistical Significance Of MolecularSequence Features By Using General Scoring Schemes[用于通过使用一般评分方案评估分子序列特征的统计学显著性的方法]”)，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)[美国国家科学院院刊]87:2264-2268；Altschul,S.F.(1991)“Amino Acid Substitution Matrices FromAn Information Theoretic Perspective[从信息理论角度的氨基酸取代矩阵]”，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]219，555-565。目前，最先进的BLOSUM数据库是BLOSUM62数据库(BLOSUM62.iij)。表1呈现了BLOSUM62.iij取代得分(得分越高取代越保守，并且因此更加可能地，该取代将不会影响功能)。如果包含所得CDR的表位结合片段未能结合至τ蛋白，例如，则BLOSUM62.iij取代分数被认为是不足够保守的，并且选择并产生具有更高取代分数的新候选取代。因此，例如，如果原始残基是谷氨酸(E)，并且非功能性取代残基是组氨酸(H)，则BLOSUM62.iij取代分数将是0，并且更保守的变化(例如变为天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、或赖氨酸)是优选的。
本发明因此考虑了随机诱变用于鉴定改善的CDR的用途。在本发明的背景下，保守取代可以由表2、表3或表4中的一个或多个中反映的氨基酸类别之内的取代来限定：
用于保守取代的氨基酸残基类别：
替代性保守氨基酸残基取代类别：
氨基酸残基的替代性物理和功能分类：
更保守的取代分组包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
另外组的氨基酸还可以使用描述于例如Creighton(1984)Proteins:Structureand Molecular Properties[蛋白质：结构和分子特性](第2版，1993)，W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Company)中的原则来配制。
噬菌体展示技术可以可替代地用于增加(或降低)CDR亲和力。被称为亲和力成熟的这种技术采用诱变或者“CDR步移”和重选择，使用靶标抗原或其抗原表位结合片段来鉴别具有如下CDR的抗体，这些CDR当与初始抗体或亲本抗体比较时以更高(或更低)亲和力结合到该抗原(参见例如Glaser等人(1992)J.Immunology[免疫学杂志]149:3903)。诱变整个密码子而不是单个核苷酸产生氨基酸突变的半随机谱。可构建由一组变体克隆所组成的库，每一克隆都在单个CDR中相差单个氨基酸改变，并且这些克隆包含代表了每个CDR残基的每个可能氨基酸取代的变体。可通过使固定化突变体与标记的抗原相接触来筛选对抗原的结合亲和力增加(或减少)的突变体。本领域中已知的任何筛选方法(例如ELISA)可以用于鉴定对抗原具有增加或降低的亲和力的突变体抗体(参见Wu等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)[美国国家科学院院刊]95:6037；Yelton等人，1995，J.Immunology[免疫学杂志]155:1994)。可以可能地使用使轻链随机化的CDR步移(参见例如Schier等人，1996，J.Mol.Bio.[分子生物学杂志]263:551)。
用于完成此类亲和力成熟的方法描述于以下中，例如：Krause,J.C.等人(2011)“An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site ArchitectureEnhances Function Of A Human Antibody[扭曲抗体结合位点构造的***突变增强了人类抗体的功能]”，MBio.2(1)pii:e00345-10.doi:10.1128/mBio.00345-10；Kuan,C.T.等人(2010)“Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant ImmunotoxinsTargeting Malignant Gliomas And Melanomas[靶向恶性胶质瘤和黑色素瘤的亲和力成熟的抗糖蛋白NMB重组免疫毒素]”，Int.J.Cancer[国际癌症杂志]10.1002/ijc.25645；Hackel,B.J.等人(2010)“Stability And CDR Composition Biases Enrich BinderFunctionality Landscapes[稳定性和CDR组成偏移丰富了结合物功能景观]”，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]401(1):84-96；Montgomery,D.L.等人(2009)“AffinityMaturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1gp41[针对HIV-1gp41的人类单克隆抗体的亲和力成熟和表征]”，MAbs 1(5):462-474；Gustchina,E.等人(2009)“Affinity Maturation By Targeted Diversification Of TheCDR-H2 Loop Of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Human AntibodyLibrary And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 YieldsA Set Of Fabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth[通过源自合成原初人类抗体文库并且针对Gp41的内部三聚卷曲螺旋的单克隆Fab的CDR-H2环的靶向多样化的亲和力成熟产生了一组具有改善的HIV-1中和效力和幅度的Fab]，”Virology[病毒学]393(1):112-119；Finlay,W.J.等人(2009)“Affinity Maturation Of A HumanizedRat Antibody For Anti-RAGE Therapy:Comprehensive Mutagenesis Reveals A HighLevel Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions[用于抗RAGE治疗的人源化大鼠抗体的亲和力成熟：全面诱变揭示在互补决定区内外同时存在的高水平的突变可塑性]”，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]388(3):541-558；Bostrom,J.等人(2009)“Improving Antibody Binding Affinity AndSpecificity For Therapeutic Development[改进抗体结合亲和力和特异性用于治疗开发]”，Methods Mol.Biol.[分子生物学方法]，525:353-376；Steidl,S.等人(2008)“InVitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification[通过靶向的CDR多样化的人类GM-CSF抗体的体外亲和力成熟]”，Mol.Immunol.[分子免疫学]46(1):135-144；和Barderas,R.等人(2008)“AffinityMaturation OfAntibodies AssistedBy In Silico Modeling[通过计算机建模辅助的抗体的亲和力成熟]”，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)[美国国家科学院院刊]105(26):9029-9034。
因此，所包含的抗体或其表位结合片段的CDR变体的序列可以通过取代而不同于亲本抗体C10-2和C10.2变体的CDR的序列；例如，取代的4个氨基酸残基、3个氨基酸残基、2个氨基酸残基或1个氨基酸残基。根据本发明的实施例，进一步设想的是在CDR区中的氨基酸可以用如在上表3中定义的保守取代来取代。例如，酸性残基Asp可以被Glu取代而不会实质性地影响该抗体的结合特征。
如在此所使用的，如果一种抗体或其表位结合片段更频繁地、更快速地以更大持续时间和/或更大亲和力或亲合力(相对于可替代表位而言)与该表位发生反应或缔合，该抗体或其表位结合片段即被认为“特异性地”结合另一个分子的区域(即表位)。通过阅读本定义还应理解，例如，特异性地结合至第一靶标的抗体或其表位结合片段可以是或可以不是特异性地或优先地结合至第二靶标。如在此所使用的，在抗体结合至预定抗原的背景中，术语“结合”典型地是指当通过例如表面等离子体共振(SPR)技术在3000仪器中使用抗原作为配体并且使用抗体作为分析物来确定时，以相应于约10-7M或更小(例如约10-8M或更小，例如约10-9M或更小)的KD的亲和力的结合，并且与结合至不是预定抗原或密切相关抗原的非特异性抗原(例如BSA，酪蛋白)的亲和力相比，以相应于低至少十倍例如低至少100倍、例如低至少1,000倍、例如低至少10,000倍、例如低至少100,000倍的KD的亲和力结合至该预定抗原。使亲和力更低的量依赖于抗体的KD，从而当抗体的KD非常低时(即抗体是高度特异性的)，则使针对抗原的亲和力低于针对非特异性抗原的亲和力的量可以是至少10,000倍。
如在此使用的，术语“kd”(sec-1或1/s)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。所述值又称为koff值。
如在此使用的，术语“ka”(M-1x sec-1或1/Msec)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数。
如在此使用的，术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数并且通过kd除以ka获得。
如在此使用的，术语“KA”(M-1或1/M)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合平衡常数并且通过ka除以kd获得。
在一个实施例中，本发明涉及一种抗τ蛋白抗体或其表位结合片段，其展现出以下特性中的一种或多种：
(i)基本上不能结合至非磷酸化τ蛋白；
(ii)基本上不能结合至在S404处磷酸化且在S396处非磷酸化的τ蛋白；
(iii)能够结合至在S396处磷酸化的τ蛋白；
(iv)能够结合至在S396和在S404二者处均磷酸化的τ蛋白；
(v)能够选择性地在磷酸化τ蛋白残基S396和S404之间区分，使其基本上不能结合磷酸化404残基(pS404)；
(vi)能够结合来自人类阿尔茨海默病脑的过度磷酸化τ蛋白；
(vii)能够在病理性人类τ蛋白和非病理性人类τ蛋白之间区分；和/或
(viii)当如在此所述与经免疫耗减的来自转基因小鼠的rTg4510提取物一起使用时，能够特异性地将过度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa条带减少至少90％，同时没有将55kDaτ蛋白条带减少多于10％，或者当如在此所述与来自人类AD尸体解剖后脑的提取物一起使用时，特异性地将S396磷酸化的过度磷酸化τ蛋白条带减少至少90％，同时没有将非过度磷酸化τ蛋白条带减少多于10％。
本发明的另外的实施例涉及一种用于获得高特异性、高亲和力抗体的方法，其中该方法包括以下步骤：
(A)将免疫原注入哺乳动物中，由此免疫所述哺乳动物；
(B)将对所述哺乳动物的所述免疫重复进行两次或更多次；
(C)针对所希望的高特异性、高亲和力抗体的存在对来自所述经重复免疫的哺乳动物的血清样品进行筛选，但是这些抗体基本上很少能够结合至其他蛋白；并且
(D)回收所述高特异性、高亲和力抗体。
本发明因此涉及对于含有磷酸化S396残基的病原性过度磷酸化τ蛋白特异性的高特异性、高亲和力抗体。可以通过将用于产生高特异性、高亲和力抗体的以上指明的方法进行适应来产生此类抗体：
(A)将免疫原注入哺乳动物中，由此免疫所述哺乳动物，所述免疫原包含双磷酸化肽，该双磷酸化肽包含18-40个例如18-30个、例如20-30个连续氨基酸残基，这些连续氨基酸残基包含覆盖2N4Rτ蛋白的残基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:2)；
(B)将对所述哺乳动物的所述免疫重复进行两次或更多次；
(C)针对高特异性、高亲和力抗体的存在对来自所述经重复免疫的哺乳动物的血清样品进行筛选，这些高特异性、高亲和力抗体能够结合包含磷酸化S396残基的病原性过度磷酸化τ蛋白、但是基本上很少能够结合非病原性τ蛋白；并且
(D)回收所述高特异性、高亲和力抗体。
如在此使用的，“基本上不能”结合τ蛋白分子表示，相对于由参考抗体介导的可检测结合而言，在功能方面的多于20％差异、多于40％差异、多于60％差异、多于80％差异、多于100％差异、多于150％差异、多于2倍差异、多于4倍差异、多于5倍差异、或多于10倍差异。
术语“选择性”和“免疫选择性”当指代抗τ蛋白抗体相对于两种表位的结合能力时，是旨在表示在饱和条件下观察到的结合展现至少80％差异、至少95％差异、以及最优选100％差异(即没有与一种表位的可检测结合)。术语“选择性”和“免疫选择性”当指代τ蛋白抗体时，进一步旨在意指该抗体结合来自人类阿尔茨海默病脑的过度磷酸化τ蛋白，并且能够在病理性和非病理性人类τ蛋白之间区分。
术语TBS-可提取的(S1)、高盐/肌氨酰-可提取的(S3)、以及肌氨酰-不溶性(P3)部分是如通过在此描述的τ蛋白生物化学分级获得的部分。
术语“正常τ蛋白”是指每摩尔蛋白中包含2-3摩尔磷酸的正常脑τ蛋白。
术语“过度磷酸化τ蛋白”是指与多阴离子种类诱导的在蛋白质印迹中的迁移性变动相一致的τ蛋白的多磷酸化种类，或者是指具有多于五个、六个或七个磷酸化的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸位点的τ蛋白种类。
术语“具有磷酸化残基396的τ蛋白”涉及过度磷酸化τ蛋白，其中该丝氨酸残基396被磷酸化。
术语“转基因非人动物”是指具有包含一个或多个人重链和/或轻链转基因或转染色体(整合或未整合进动物的天然基因组DNA)的基因组并且能够表达全人抗体的非人动物。例如，转基因的小鼠可以具有人类轻链转基因和人类重链转基因或人类重链转染色体，这样使得当用τ蛋白抗原和/或细胞表达τ蛋白免疫时，该小鼠产生人类抗τ蛋白抗体。人类重链转基因可以被整合进小鼠的染色体DNA中，转基因小鼠就是这样，例如HuMAb小鼠，如HCo7或HCo12小鼠，或者人类重链转基因可以被维持在染色体外，如描述于WO02/43478中的转染色体KM小鼠就是这样。这样的转基因和转染色体小鼠(在此统称为“转基因小鼠”)通过经历V-D-J重组和同种型转换能够产生多种针对给定抗原的人单克隆抗体同种型(如IgG、IgA、IgM、IgD和/或IgE)。
转基因非人动物还可以通过引入编码这样的特异性抗体的基因(例如通过将这些基因可操作地连接至在该动物的乳中表达的基因)而用于产生针对特定抗原的抗体。
如在此所使用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”意指改善、减慢、衰减、或逆转疾病或障碍的进展或严重性、或者改善、减慢、衰减、或逆转这种疾病或障碍的一种或多种症状或副作用。出于本发明的目的，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”进一步意指一种用于获得有益的或希望的临床结果的方法，其中“有益的或希望的临床结果”包括但不限于症状的缓解、障碍或疾病程度的减小、稳定的(即没有恶化的)疾病或障碍状态、疾病或障碍状态进展的延缓或减慢、疾病或障碍状态的改善或减轻、以及疾病或障碍的缓解，不论是部分地或全部地。
“有效量”，当应用于本发明的抗体或其表位结合片段时，是指一个在所需剂量和持续时期下足以实现预期生物效应或希望的治疗结果(包括而不限于临床结果)的量。短语“治疗有效量”当应用于本发明的抗体或其表位结合片段时，旨在表示该抗体或其表位结合片段足以改善、减轻、稳定、逆转、减慢、衰减或延缓障碍或疾病状态的进展或该障碍或疾病的症状的量。在实施例中，本发明的方法提供用于与其他化合物相组合来给予该抗体或其表位结合片段。在此类情况下，“有效量”是足以引起预期的生物效应的该组合的量。
本发明的抗τ蛋白抗体或其表位结合片段的治疗有效量可以根据因素例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗τ蛋白抗体或其表位结合片段在该个体中引发希望的应答的能力来改变。治疗有效量也是其中治疗有利作用大于抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用的量。
如以上指出的，本发明特别涉及单克隆抗体或表位结合片段，并且涉及一种全新的用于产生此类分子(以及由此此类其表位结合片段)的方法。新方法用以分离单克隆抗体的这种能力在此通过将该方法用于分离能够特异性地结合至人类τ蛋白(SEQ ID NO:1)的磷酸化残基丝氨酸396(P-S396，pS396，{p}S396)的单克隆抗体得以例证。这些抗体被进一步表征为它们在磷酸化残基丝氨酸396和丝氨酸404(P-S404，pS404)之间区分的能力，使得它们不结合至具有磷酸化丝氨酸404的τ蛋白，除非τ蛋白在残基396处也被磷酸化。
已经通过使用新颖方法产生并分离本发明的抗体、或其表位结合片段，该方法有利于选择pS396特异性抗体。此外，通过应用这种非常严格的抗体克隆选择程序，已经获得不仅对S396具有高度特异性而且对磷酸化pS396表位具有高度选择性的抗体。这些抗体唯一性地识别来自阿尔茨海默病脑的τ蛋白。筛选程序确保了对具有功能性和治疗性效用的抗体的鉴定。
针对该双磷酸化肽产生抗体：TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:2)覆盖2N4Rτ蛋白的残基386-408。用该磷酸化肽免疫小鼠。一旦已经获得足够的抗体滴度，则处死这些小鼠并产生杂交瘤。使用斑点印迹以及MSD ELISA筛选这些杂交瘤，该ELISA中使用固定的人类病理性和非病理性τ蛋白。在斑点印迹和蛋白质印迹中，在病理性和非病理性人类τ蛋白之间区分的能力用于选择杂交瘤。选择16个克隆，回收其中的四个杂交瘤克隆，这四个杂交瘤克隆产生展现出结合至人类病理性τ蛋白材料的非凡能力的抗体。
还通过从患病和未患病人类AD脑中分离τ蛋白，并且将此材料固定在MSD ELISA板上来确定与病理性和非病理性τ蛋白的特异性结合(实例4)。
本发明的另外一方面涉及针对双磷酸化肽引发的单克隆抗体或其表位结合片段，该双磷酸化肽包含覆盖2N4Rτ蛋白的残基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQID NO:2)内的至少18个例如至少20个连续氨基酸残基。在本发明的这个方面，该单克隆抗体或其表位结合片段典型地是针对双磷酸化肽引发，该双磷酸化肽包含含有覆盖2N4Rτ蛋白的残基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:2)的18-40个例如18-30个、例如20-30个连续氨基酸残基。
本发明的另外一方面是针对本发明的单克隆抗体或其表位结合片段，具有超过年龄匹配健康对照的、对于来自AD患病患者的磷酸化τ蛋白(pτ)的特异性，从而使得所述单克隆抗体或其表位结合片段具有超过来自年龄匹配健康对照的τ蛋白的、对于来自AD患病患者的磷酸化τ蛋白(pτ)的大于50倍的特异性差异，例如，与健康对照材料相比，对于AD疾病材料的特异性具有大于100倍的增加，上述是在基于ELISA的测定中，使用如在此所述的磷酸化-和多聚体-特异性设置1ELISA或MSD在来自AD和来自健康对照受试者的脑匀浆中检测磷酸化τ蛋白(pτ)。
本发明的一个相关方面是针对本发明的单克隆抗体或其表位结合片段，具有对于AD患病τ蛋白的特异性，从而使得所述单克隆抗体或其表位结合片段具有超过年龄匹配健康对照的、对于AD的大于50倍的特异性差异，例如，与健康对照材料相比，对于AD疾病材料的特异性具有大于100倍的增加，上述是在基于ELISA或MSD的测定中，使用磷酸化-和多聚体-特异性设置1ELISA在来自AD和来自健康对照受试者的脑匀浆中检测磷酸化τ蛋白(pτ)。
设置1ELISA或MSD方法包括步骤：A)使用C10-2包被的板，捕获来自AD脑的病理性人类τ蛋白抗原；B)孵育τ蛋白抗原与渐增浓度的pS396特异性抗体；以及C)通过固定的C10.2使用来自MSD的硫标记抗人类(总)τ蛋白抗体捕获的残余游离τ蛋白抗原的检测。
更确切地说，步骤A包括：用典型地为在包被缓冲液中0.5μg/ml(捕获抗体)的C10-2抗体包被MSD板(典型地在4℃过夜)，封闭(典型地在室温1小时)，并且洗涤(典型地3次)。步骤B包括：将来自AD(从3名患者汇集)的P3裂解物的样品(典型地按1:1000＝2-4μg/ml总蛋白稀释)和/或S1(p)(典型地按1:300＝20-40ng/ml总蛋白稀释)与成梯度浓度的pS396肽表位特异性抗体进行混合，并且孵育(典型地在室温下1小时)。随后将这些反应物在步骤A中制备的板上孵育2小时。遵循制造商的说明书，步骤C包括使用来自MSD的硫标记人类τ蛋白抗体(典型地1:50)检测C10-2捕获的τ蛋白。将板在MSDS600上进行分析。以类似设置测试AD P3和AD S1(p)。
一个另外的实施例针对抗体或其抗原-结合片段，其能够特异性地结合至人类τ蛋白(SEQ ID NO:1)的磷酸化丝氨酸残基396，已经在一种细胞系中产生或制造，该细胞系例如是人类细胞系、哺乳动物非人类细胞系、昆虫细胞系、酵母细胞系或细菌细胞系。
该抗体或其抗原结合片段能够特异性地结合至人类τ蛋白(SEQ ID NO:1)的磷酸化残基396，产生于CHO细胞系、HEK细胞系、BHK-21细胞系、鼠类细胞系(如骨髓瘤细胞系)、纤维肉瘤细胞系、PER.C6细胞系、HKB-11的细胞系、CAP细胞系和HuH-7人类细胞系中。
C10-2和C10.2变体的特异性亲和力和结合特性已经使用在位置396或404处磷酸化或非磷酸化的τ蛋白386-410(2R4N)肽进行表征。使用本申请中概述的特异性免疫和筛选方案将产生高度磷酸化丝氨酸-396(pS396)特异性抗体。
为了证明这些抗体对于病理性τ蛋白具有特异性，已经通过免疫组织化学分析对C10-2抗体进行表征。这些抗体展现出与阿尔茨海默病脑中(τ蛋白缠结)的以及来自表达人类(P301L)突变体τ蛋白的Tg4510τ蛋白转基因小鼠切片中的神经原纤维缠结的高度特异性结合。没有观察到与来自人类对照脑和来自非转基因小鼠脑的组织的结合，证明了这些抗体特异性地结合人类τ蛋白并且特别是与阿尔茨病理学相关联的τ蛋白。
抗体C10-2
本发明的一个方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
本发明的一个另外的方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
可替代地定义的，使用IMGT定义，本发明的一个方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
可替代地定义的，使用Chotia定义，本发明的一个方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
证明了本发明的抗体识别与疾病病理学相关的τ蛋白的独特能力。比较了病理性与非病理性τ蛋白的结合。比较是与五种公开的τ蛋白抗体：hACI-2B6、IPN002、HJ8.5、2.10.3、和4E4的比较。2.10.3抗体是可商购的重组单克隆抗体，该抗体特异性地结合至在丝氨酸422(pS422)处磷酸化的τ蛋白。HJ8.5是可商购的单克隆抗体，该抗体在N端区(在氨基酸残基25-30处的表位)仅识别人类τ蛋白。该抗体是IgG2b同种型。抗τ蛋白治疗性抗体NI-105-4E4是可商购的抗体。该表证明了分离的抗体展现出对于人类病理性τ蛋白的格外高程度的特异性和选择性。该选择性优于如表5中所示的对比抗体中的任一个。
饱和时，抗体C10-2展现出对于从人类AD脑分离的P3τ蛋白大于100倍的选择性。
为了证明所选择的抗体具有功能性和治疗性效用，在体外和细胞内τ-聚集测定中测试了抗体(实例8)。这些测定是功能测定，证实这些抗体能够干扰τ蛋白的病理性聚集过程。将HEK293细胞瞬时转染人类τ-P301L-FLAG(4R0N)。随后将细胞暴露于来自人AD脑或来自转基因Tg4510脑的τ蛋白提取物。到病理性τ蛋白的这种暴露促进τ蛋白摄取入细胞和细胞内聚集。使用抗体C10-2对τ蛋白-制品的免疫耗减以及用这些抗体直接处理细胞能够显著减少τ蛋白聚集体的形成。
抗体C10-2的治疗效用也已经在人类τ蛋白/PS1小鼠中被评价。这种小鼠模型是更加与AD疾病相关的动物模型，其仅在生命后期(12-18月龄)产生AD病理学。然而，这些小鼠在实体缠结病理学的出现之前展现出τ蛋白过度磷酸化。慢性注射小鼠持续13周，每周两次，剂量为15mg/kg。抗体处理的小鼠展现出磷酸化τ蛋白的显著减少，表明用抗体C10-2慢性处理将降低缠结病变，并且由此降低随后的体内神经退行性变。
本发明的抗体通过免疫耗减方法特异性地去除来自rTg4510小鼠脑提取物的过度磷酸化τ蛋白。此外，本发明的抗体并不去除来自匀浆的正常τ蛋白，而可商购的τ5抗体去除来自匀浆的正常τ蛋白。与结合至τ蛋白(其中磷酸化在残基404处或在残基404和396两者处)的商业抗体相比，本发明的抗体特异性地去除95％的在丝氨酸396上磷酸化的过度磷酸化τ蛋白。实验(实例12)证明本发明的抗体，尽管仅去除脑匀浆中的总τ蛋白的非常少的部分(8％)，但这些抗体特异性地去除过度磷酸化τ蛋白(以90％)。因此，本发明的一个方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，能够特异性地结合至病原性过度磷酸化τ蛋白。此外，在其中使用本发明的抗体去除过度磷酸化τ蛋白的实验中，接种活性被消除。通过从匀浆中去除过度磷酸化τ蛋白，这些匀浆不再诱导τ蛋白病变的接种。已经提出接种的减少降低了缠结形成的发展以及τ蛋白病变(包括阿尔茨海默病)的进展。因此，本发明的另一个方面是针对本发明的抗体，用于在AD进展或AD症状的降低中使用。
抗体D55E
本发明的一个方面涉及抗体C10-2、抗体D55E的变体抗体。本发明的此方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列，以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
本发明针对抗体D55E的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(b)重链，其包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体D55E的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括以下各项中的至少一个
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列，以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
抗体D55Q
本发明的另一方面涉及抗体C10-2、抗体D55Q的变体抗体。本发明的此方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
本发明针对抗体D55Q的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体D55Q的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括以下各项中的至少一个
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括：
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
抗体D55S
本发明的另一个方面涉及抗体C10-2、抗体D55S的变体抗体。本发明的此方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
本发明针对抗体D55S的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列，以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体D55S的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括以下各项中的至少一个
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
使用抗体D55S、抗体D55Q、抗体D55E的研究表明，当在室温下用低pH持续很长一段时间处理抗体之前和之后比较时，该残基的突变导致所述抗体具有未改变的结合特性，当与预处理相比时，表明在低pH下没有发生异构化作用或任何异构化的蛋白具有未改变的结合特性。
抗体N32S
本发明的另一个方面涉及抗体C10-2、抗体N32S的变体抗体。本发明的此方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
本发明针对抗体N32S的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N32S的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
抗体N32S的可替代的定义，使用IMGT定义，是单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
抗体N32S的另外的可替代的定义，使用Chotia定义，是单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
从图1可以看出，与抗体C10-2相比，抗体N32S(黑色圆)的IC50是降低的，N32S的IC50被计算为44nM。没有预期到超过C10-2的显著改进。由图1支持的，本发明的一个方面针对在本文描述的液相抑制分析中抑制AD-P3的抗体，这样使得该信号在该抗体的100nM或更少的浓度下降低50％。在一个实施例中，基于液相抑制分析，针对AD-P3捕获，本发明的抗体具有从0.1nM至100nM的IC50，例如在50nM或更少的浓度下，例如从0.1nM至50nM。
使用抗体N32S产生的数据表明在抗体C10-2的轻链的位置32处的突变，或抗体C10-2的LC CDR1对丝氨酸的突变导致在肽抑制分析中增加的表观亲和力(IC50)。此外，在位置32处对丝氨酸或谷氨酰胺(抗体N32S和抗体N32Q)的突变消除了如在图20中显示的在位置32和34二者中的脱酰胺作用。将如在体外接种和聚集研究方面确定的效力在N32S和N32Q变体中保留。
在C10-2中的位置处鉴定出可能导致蛋白质批次异质性的潜在的脱酰胺作用潜力。C10-2示出了异质性结合至具有高表观亲和力(2nM-5nM)的较小级分的AD-P3抗原，以及具有低表观亲和力(200nM-1000nM)的主要结合(图1)。该异质性结合能够反映不同的脱酰胺的和非脱酰胺的C10-2的亚群。通过抑制脱酰胺作用的置换(N32S)产生变体。与C10-2相比，如由提供总体减少的IC50(更高的表观亲和力)指示的活性显示了改善的结合。将另外的置换A101T引入，导致高表观亲和力型的同源结合。在N32S和N32S-A101T二者中改善的结合活性表明通过上文描述的突变达到的更稳定且同源的抗体。
抗体N32Q
本发明的另一个方面涉及抗体C10-2、抗体N32Q的变体抗体。本发明的此方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
本发明针对抗体N32Q的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N32Q的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
如上所述，使用抗体N32S产生的数据表明在抗体C10-2的轻链的位置32处的突变，或抗体C10-2的LC CDR1对丝氨酸的突变导致增加的表观亲和力(IC50)，然而对谷氨酰胺(抗体N32Q)的突变导致未改变的结合活性。然而，在位置32处对丝氨酸或谷氨酰胺(抗体N32S和抗体N32Q)的突变消除了如在图20中显示的在位置32和34二者中的脱酰胺作用。因此，对抗体N32S和抗体N32Q二者均有优势。将如在体外接种和聚集研究方面确定的效力在N32S和N32Q变体中保留。
抗体N34S
本发明的另一个方面涉及抗体C10-2、抗体N34S的变体抗体。本发明的此方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
本发明针对抗体N34S的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N34S的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
抗体N34Q
本发明的另一个方面涉及抗体C10-2、抗体N34Q的变体抗体。本发明的此方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
本发明针对抗体N34Q的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N34Q的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
抗体N32S、N34S
本发明的另一个方面涉及抗体C10-2、抗体N32S、N34S的变体抗体。本发明的此方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N32S、N34S的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N32S、N34S的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
抗体N32Q、N34S
本发明的另一个方面涉及抗体C10-2、抗体N32Q、N34S的变体抗体。本发明的此方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N32Q、N34S的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列；
(b)重链，其包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N32Q、N34S的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
抗体N32Q、N34Q
本发明的另一个方面涉及抗体C10-2、抗体N32Q、N34Q的变体抗体。本发明的此方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)a重链CDR3具有氨基酸序列ofSEQ ID NO:8；
可替代地定义的，本发明针对抗体N32Q、N34Q的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N32Q、N34Q的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
抗体N32S、N34Q
本发明的另一个方面涉及抗体C10-2、抗体N32S、N34Q的变体抗体。本发明的此方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N32S、N34Q的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N32S、N34Q的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
抗体A101T
本发明的另一个方面涉及抗体C10-2、抗体A101T的变体抗体。本发明的此方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体A101T的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体A101T的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括以下各项中的至少一个
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
使用抗体A101T产生的数据表明抗体C10-2的重链的突变或抗体C10-2的重链CR3的突变导致两倍增加的肽结合和10倍-20倍增加的结合至P3材料。此外，变体包括在体外接种测定的具有增加的效力的A101T突变。
抗体N32S、A101T
本发明的另一个方面涉及抗体C10-2、抗体N32S、A101T的变体抗体。本发明的此方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N32S、A101T的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(b)重链，其包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N32S、A101T的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
使用IMGT定义，抗体N32S、A101T是单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
使用Chotia定义，抗体N32S、A101T是单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
如从图1中可以看出，与抗体C10-2相比，抗体N32S、A101T(白色圆)的IC50显著降低：N32S A101T的IC50被计算为14nM。没有预期到超过C10-2的该显著的改进。基于图1，本发明的一个方面针对在本文描述的液相抑制分析中抑制AD-P3的抗体，这样使得该信号在该抗体的100nM或更少的浓度下降低50％，例如从抗体的10nM至100nM，例如在50nM或更少的浓度下，例如从该抗体的10nM至50nM。如在图20中示出，抗体N32S、A101针对脱酰胺作用是非常稳定的。如在图19中示出，抗体N32S、A101T示出了在聚集方面更强的降低。
抗体N32Q、A101T
本发明的另一个方面涉及抗体C10-2、抗体N32Q、A101T的变体抗体。本发明的此方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N32Q、A101T的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N32Q、A101T的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
抗体N32S、D55E
本发明的另一个方面涉及抗体C10-2、抗体N32S、D55E的变体抗体。本发明的此方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N32S、D55E的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(b)重链，其包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N32S、D55E的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
抗体N32Q、D55E
本发明的另一个方面涉及抗体C10-2、抗体N32Q、D55E的变体抗体。本发明的此方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N32Q、D55E的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
(b)重链，其包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N32Q、D55E的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列；和
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
抗体N34S、A101T
本发明的另一个方面涉及抗体C10-2、抗体N34S、A101T的变体抗体。本发明的此方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N34S、A101T的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列；和
(b)重链，其包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N34S、A101T的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列；和
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
抗体N34Q、A101T
本发明的另一个方面涉及抗体C10-2、抗体N34Q、A101T的变体抗体。本发明的此方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N34Q、A101T的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体N34Q、A101T的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列；和
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
抗体D55E、A101T
本发明的另一个方面涉及抗体C10-2、抗体D55E、A101T的变体抗体。本发明的此方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体D55E、A101T的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体D55E、A101T的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括以下各项中的至少一个
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
抗体D55Q、A101T
本发明的另一个方面涉及抗体C10-2、抗体D55Q、A101T的变体抗体。本发明的此方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体D55Q、A101T的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体D55Q、A101T的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括以下各项中的至少一个
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括：
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
抗体D55S、A101T
本发明的另一个方面涉及抗体C10-2、抗体D55S、A101T的变体抗体。本发明的此方面针对单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体D55S、A101T的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)一个轻链，其包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；以及
(b)一个重链，其包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
可替代地定义的，本发明针对抗体D55S、A101T的方面的另外的实施例涉及单克隆抗体或其表位结合片段，其包括以下各项中的至少一个
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
考虑该重链变体和轻链变体的组合，例如轻链内的多个变体和/或重链内的多个变体，轻链内的单个变体与重链内单个或多个变体的组合，轻链内的多个变体与重链内的多个变体的组合。本发明的抗体优选地包括
选自下组的轻链，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:12(轻链C10-2)；SEQ ID NO:16(轻链变体N32S)；SEQ ID NO:17(轻链变体N32Q)；SEQ ID NO:18(轻链变体N34S)；SEQ IDNO:19(轻链变体N34Q)；SEQ ID NO:20(轻链变体N32S，N34S)；SEQ ID NO:21(轻链变体N32Q，N34S)；SEQ ID NO:22(轻链变体N32Q，N34Q)；以及SEQ ID NO:23(轻链变体N32S，N34Q)；以及
选自下组的重链，该组由以下各项组成
SEQ ID NO:11(重链C10-2)；SEQ ID NO:13(重链变体D55E)；SEQ ID NO:14(重链变体D55Q)；SEQ ID NO:15(重链变体D55S)；SEQ ID NO:24(重链变体A101T)；SEQ ID NO:25(重链变体D55E，A101T)；SEQ ID NO:26(重链变体D55Q，A101T)，以及SEQ ID NO:27(重链变体D55S，A101T)。
在一个实施例中，当该轻链是SEQ ID NO:12时，该重链选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:13(重链变体D55E)；SEQ ID NO:14(重链变体D55Q)；SEQ ID NO:15(重链变体D55S)；SEQ ID NO:24(重链变体A101T)；SEQ ID NO:25(重链变体D55E，A101T)；SEQ IDNO:26(重链变体D55Q，A101T)，以及SEQ ID NO:27(重链变体D55S，A101T)。在一个可替代的实施例中，当该重链是SEQ ID NO:11时，该轻链选自下组，该组由以下各项组成：SEQ IDNO:16(轻链变体N32S)；SEQ ID NO:17(轻链变体N32Q)；SEQ ID NO:18(轻链变体N34S)；SEQID NO:19(轻链变体N34Q)；SEQ ID NO:20(轻链变体N32S，N34S)；SEQ ID NO:21(轻链变体N32Q，N34S)；SEQ ID NO:22(轻链变体N32Q，N34Q)；以及SEQ ID NO:23(轻链变体N32S，N34Q)。
该单克隆抗体或其表位结合片段，适当地包括
(a)轻链CDR1，其包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:37；和SEQ ID NO:38；(b)轻链CDR2，其包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(c)轻链CDR3，其包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列；(d)重链CDR1，其包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(e)重链CDR2，其包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；和SEQ ID NO:30；以及(f)重链CDR3，其包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:39。
变体的组合的有趣的实施例包括，其中选自下组的这些抗体，该组由以下各项组成：抗体N32S，A101T；抗体N32Q，A101T；抗体N32S，D55E；和抗体N32Q，D55E，优选地抗体N32S，A101T。如从实例可以看出，抗体N32S和抗体N32S，A101T是优选的实施例。
总之，这些实例示出包括C10-2的本发明的抗体有效地结合至AD-P3抗原包被的MSD板上。相比之下，商业抗体如PHF-13，具有低的结合活性。此外PHF-13证实了相比于本发明的抗体而言实质上更高程度的非特异性结合。在C10-2包被的板中，Pτ蛋白抗原捕获的C10-2液相抑制是有效的(IC50＝10nM-20nM)，然而PHF-13是无效的(IC50＝500nM-1000nM)。
本发明的一个方面是针对一种抗体，该抗体包含
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5氨基酸序列；以及
(d)重链，其选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、以及SEQ ID NO:27。
本发明的一个方面是针对一种抗体，该抗体包含
(a)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(b)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；
(c)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列；以及
(d)轻链，其选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、和SEQ ID NO:23。
本发明的该单克隆抗体或其表位结合片段，典型地抑制在液相抑制分析中的AD-P3，这样使得该信号在该抗体的100nM或更少的浓度下降低50％，例如从该抗体的10nM至100nM，例如在50nM或更少的浓度下，例如从该抗体的10nM至50nM。典型地根据对阿尔茨海默病脑提取物的免疫耗减研究后的pS396τ蛋白的蛋白质印迹信号，本发明的单克隆抗体或其表位结合片段能够从AD脑匀浆物中以约75ng的抗体去除在丝氨酸396处的至少15％的τ蛋白磷酸化。
该抗体或其表位结合片段优选地是人类抗体或人源化的抗体。
根据一个实施例，以上所述的抗体及其表位结合片段可以进一步包括这种轻链和/或重链CDR1、CDR2或CDR3的变体(具有不多于4个氨基酸差异，或不多于3个氨基酸差异，或不多于2个氨基酸差异，或不多于1个氨基酸差异)。
如从图18可以看出，在至少一个实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、和LC CDR3对于结合至τ蛋白的392-398区域是重要的。在本发明的一个实施例中，本发明的该抗体或其表位结合片段包括：在本发明的一个方面中，本发明是针对一种抗体或其表位结合片段，它们形成疏水口袋，该疏水口袋是由L3:H3、L3:F8*、H1:H13、H2:Y1、H2:Y3与τ肽的Y394形成。在一个实施例中，本发明针对一种抗体，该抗体与在此进一步描述的抗体相竞争以在溶剂化的{p}S396与L3:T4、H1:R10、H1:T11、H3:R1、H3:T3之间形成氢键网络；(*)L3:F8是CDRL3的C-端侧翼框架残基(参见图11)。
如可以从x-射线晶体结构所见，本发明的抗体以两个水平的选择性结合。第一水平的选择性是针对过度磷酸化病理性τ蛋白的选择性，并且第二水平的选择性是针对磷酸化丝氨酸残基的选择性，其中所述磷酸化丝氨酸的磷酸盐通过氢键键合到由来自所述磷酸化丝氨酸的一个残基分离的酪氨酸残基的侧链上。因此，本发明的令人感兴趣的方面针对一种对过度磷酸化τ蛋白的氨基酸基序具有选择性的单克隆抗体或其表位结合片段，该过度磷酸化τ蛋白的基序包括由单个残基分隔的磷酸化丝氨酸残基和酪氨酸残基。典型地，该氨基酸基序具有以下序列：
Y-X-S(磷酸化)-P-
其中Y是酪氨酸，X是天然存在的氨基酸，P是脯氨酸，并且S(磷酸化)是具有磷酸化羟基侧链的丝氨酸。
类似地，本发明的令人感兴趣的一个方面是针对一种抗体或其表位结合片段，其结合至磷酸化τ蛋白、优选地至过度磷酸化τ蛋白，其中所述抗体或其表位结合片段对于氨基酸残基基序IA具有选择性，其中R是天然存在的氨基酸的侧链。
不受具体理论的束缚，认为当氨基酸基序IA处于病理性τ蛋白采用的构象中时，本发明的抗体对于所述基序具有选择性。因此，该氨基酸基序IA是典型地由本发明的抗体选择性识别的序列。因此，本发明的令人感兴趣的一个方面是针对一种抗体或其表位结合片段，其结合至磷酸化τ蛋白、优选地至过度磷酸化τ蛋白，其中所述抗体或其表位结合片段对于氨基酸残基基序IA具有选择性，其中R是天然存在的氨基酸的侧链。
在本发明的此方面的一个典型实施例中，本发明是针对一种抗体或其表位结合片段，其结合至磷酸化τ蛋白、优选地至过度磷酸化τ蛋白，其中所述抗体或其表位结合片段对于氨基酸残基基序IB具有选择性，其中R是天然存在的氨基酸的侧链，但不限于IC或ID。
在本发明的一个方面中，本发明的抗体的HC CDR1区域中，Asp Arg Thr Ile His(SEQ.ID.NO.7)与过度磷酸化τ蛋白的基序IA-ID相互作用。
如从图18可以看出，在本发明的此方面中，在两个连续的带电荷的残基(即天冬氨酸和精氨酸)的存在下，HC CDR1在与靶标τ蛋白表位中的基序氢键中起作用，其中该抗体针对过度磷酸化τ蛋白的氨基酸基序具有选择性，该过度磷酸化τ蛋白的基序包括由单个残基分隔的磷酸化丝氨酸残基和酪氨酸残基。因此，本发明的一个方面针对抗体或其表位结合片段，其结合磷酸化τ蛋白，优选地结合过度磷酸化τ蛋白，其中所述抗体或其表位结合片段对于氨基酸残基基序IA-ID是具有选择性的，其中该抗体包括含有两个连续带电荷的氨基酸残基(例如，天冬氨酸和精氨酸)的HC CDR1区域。在另外可替代的本发明的此方面中，本发明的抗体或其表位结合片段结合至过度磷酸化τ蛋白，其中所述抗体或其表位结合片段对包括丝氨酸396和酪氨酸394的表位具有选择性，其中PO4基团形成与所述丝氨酸396和酪氨酸394之一的共价键，以及与其他丝氨酸396和酪氨酸394的氢键，其中该抗体包括含有两个连续的带电荷的残基(例如，天冬氨酸和精氨酸)的HC CDR1区域。HC CDR1区域的带电荷的氨基酸残基可以选自下组，该组由以下各项组成：精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、和谷氨酸，其中至少一个所述残基是天冬氨酸或精氨酸，优选地其中一个带电荷的残基是精氨酸，并且另一个是天冬氨酸。
在本发明的此方面的另外的实施例，两个连续的带电荷的氨基酸残基的之一或二者均由极性氨基酸残基侧接，优选地选自苏氨酸和酪氨酸。此外，两个连续的带电荷的氨基酸残基的之一或二者由极性残基-疏水性残基-极性残基的3-氨基酸残基基序侧接。
在一个实施例中，HC CDR1包括5-残基基序极性AA-疏水性AA-极性AA-带电荷的AA-带电荷的AA，其中至少一个所述残基是天冬氨酸或精氨酸，优选地其中一个带电荷的残基是精氨酸，并且另一个是天冬氨酸。优选地，该5-残基基序具有基序极性AA-疏水性AA-极性AA-Asp-Arg。更优选地，该HC CDR1的5-残基基序具有序列Thr-Phe-Thr-Asp-Arg。
有趣地注意到，本发明的抗体的HC CDR1包括在两个连续的带电荷的氨基酸残基的两侧的极性-疏水性-极性-带电荷的基序，该氨基酸残基涉及与涉及S396和Y394之间的静电相互作用的磷酸盐基团的氢键。因此，在优选的实施例中，本发明的HC CDR1包括回文的8-残基基序极性AA-疏水性AA-极性AA-带电荷的AA-带电荷的AA-极性AA-疏水性AA-极性AA。优选地，该HC CDR1的8-残基基序包括基序Thr-Phe-Thr-Asp-Arg-极性AA-疏水性AA-极性AA。更优选地，该HC CDR1的8-残基基序包括基序Thr-Phe-Thr-Asp-Arg-Thr-Ile-His。
在一个实施例中，该抗体识别包括丝氨酸396和酪氨酸394的过磷酸化的τ蛋白的残基392-398的表位，其中丝氨酸396是磷酸化的，并且其中该抗体包括含有两个连续的带电荷的氨基酸残基的HC CDR1区域。在一个优选的实施例中，该抗体识别包括丝氨酸396和酪氨酸394的过磷酸化的τ蛋白的残基392-398的表位，其中丝氨酸396是磷酸化的，并且其中该抗体包括含有5-残基基序极性AA-疏水性AA-极性AA-带电荷的AA-带电荷的AA的HCCDR1区域。在一个更优选的实施例中，该抗体识别包括丝氨酸396和酪氨酸394的过磷酸化的τ蛋白的残基392-398的表位，其中丝氨酸396是磷酸化的，并且其中该抗体包括含有基序极性AA-疏水性AA-极性AA-带电荷的AA-带电荷的AA-极性AA-疏水性AA-极性AA的HC CDR1区域。
在另外的优选的实施例中，该抗体包括如在此定义的HC CDR1区域，并且包括含有至少两个带电荷的残基的6-残基基序的HC CDR3区域。
本发明还提供了一种在患者中降低τ蛋白缠结形成的方法，该方法包括向需要这种治疗的患者给予治疗有效量的本发明的抗体或其表位结合片段。
本发明的一个方面是针对一种使用本发明的抗体或其表位结合片段治疗τ蛋白病变的方法。典型地该τ蛋白病变选自下组，该组由以下各项组成：阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；皮克病；原发性年龄相关性τ蛋白病变(PART)；神经原纤维缠结为主型老年性痴呆(Neurofibrillary tangle-predominant seniledementia)；拳击员痴呆；慢性创伤性脑病；中风；中风恢复；与帕金森病相关的神经变性；与染色体关联的帕金森综合征；利缇可-伯蒂格病(关岛型帕金森病-痴呆复合征)；神经节胶质瘤和神经节细胞瘤；脑膜血管瘤病；脑炎后帕金森综合征；亚急性硬化性全脑炎；亨廷顿氏病；铅中毒脑病；结节性硬化症；哈勒沃登-施帕茨病以及脂褐质沉积症。更典型地，该τ蛋白病变选自下组，该组由以下各项组成：阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；以及皮克病。具体地，该τ蛋白病变可以选自阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状。
因此，本发明的另一个方面是针对本发明的抗体或其表位结合片段，用于在治疗τ蛋白病变中使用。典型地该τ蛋白病变选自下组，该组由以下各项组成：阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；皮克病；原发性年龄相关性τ蛋白病变(PART)；神经原纤维缠结为主型老年性痴呆；拳击员痴呆；慢性创伤性脑病；中风；中风恢复；与帕金森病相关的神经变性；与染色体关联的帕金森综合征；利缇可-伯蒂格病(Lytico-Bodig disease)(关岛型帕金森病-痴呆复合征)；神经节胶质瘤和神经节细胞瘤；脑膜血管瘤病；脑炎后帕金森综合征；亚急性硬化性全脑炎；亨廷顿氏病；铅中毒脑病；结节性硬化症；哈勒沃登-施帕茨病以及脂褐质沉积症。更典型地，该τ蛋白病变选自下组，该组由以下各项组成：阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；因AD导致的情感冷漠或患有AD的患者中的情感冷漠；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；以及皮克病。特别地，该τ蛋白病变可以选自阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；因AD导致的情感冷漠或患有AD的患者中的情感冷漠；以及患有路易体痴呆症的患者的精神病症状。
本发明的一个方面针对一种疗法，该疗法包括给予：i)τ蛋白抗体；和ii)选自下组的化合物，该组由以下各项组成：
a)BACE抑制剂；
b)在主动或被动τ蛋白免疫疗法中有用的化合物；
c)在主动或被动Aβ肽免疫疗法中有用的化合物；
d)NMDA受体拮抗剂；
e)另外的τ蛋白聚集抑制剂；
e)乙酰胆碱酯酶抑制剂；
f)抗癫痫药；
g)抗炎药；以及
h)SSRI。
本发明的另外的方面针对一种组合物，该组合物包括i)τ蛋白抗体，和ii)选自下组的化合物，该组由以下各项组成：
a)BACE抑制剂；
b)在主动或被动τ蛋白免疫疗法中有用的化合物；
c)在主动或被动Aβ肽免疫疗法中有用的化合物；
d)NMDA受体拮抗剂；
e)另外的τ蛋白聚集抑制剂；
e)乙酰胆碱酯酶抑制剂；
f)抗癫痫药；
g)抗炎药；以及
h)SSRI。
本发明的另外的方面针对试剂盒，该试剂盒包括i)包含τ蛋白抗体的组合物，以及ii)包含选自下组的化合物的组合物，该组由以下各项组成：
a)BACE抑制剂；
b)在主动或被动τ蛋白免疫疗法中有用的化合物；
c)在主动或被动Aβ肽免疫疗法中有用的化合物；
d)NMDA受体拮抗剂；
e)另外的τ蛋白聚集抑制剂；
f)乙酰胆碱酯酶抑制剂；
g)抗癫痫药；
h)抗炎药；以及
i)抗抑郁药。
a)将τ蛋白抗体与BACE 1抑制剂组合
在本发明的疗法、组合物或试剂盒中，可以将τ蛋白抗体与BACE 1抑制剂组合。该BACE1抑制剂可以是小分子BACE I抑制剂，例如LY2886721、MK-8931、AZD3293或E2609。
在另外的实施例中，该BACE 1抑制剂具有化学式I，
其中Ar选自下组，该组由以下各项组成：苯基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基，并且其中Ar任选地被一个或多个选自卤素、CN、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6氟烷基、或C1-C6烷氧基的取代基取代；并且R1是一个或多个氢、卤素、C1-C3氟烷基、或C1-C3烷基；并且R2代表氢或氟。
具有化学式I的示例性的化合物包括
此外，合适的BACE 1抑制剂可以具有化学式II
其中Ar选自下组，该组由以下各项组成：苯基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、吡唑基、1,2,4-***基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、1,3,4-噻二唑基、异噻唑基、1,3,4-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、呋咱基和1,2,4-噻二唑基，并且其中该Ar被一个或多个卤素、CN、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6氟烷基或C1-C6烷氧基任选地取代；R1是C1-C3烷基或C1-C3氟烷基；R2是氢、卤素、C1-C3氟烷基或C1-C3烷基；并且R3是C1-C3烷基。
具有化学式II的BACE 1抑制剂的示例性化合物包括选自下组的化合物，该组由以下各项组成：N-(3-((2R,5S)-6-氨基-3,3,5-三氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4氟苯基)-5-氟吡啶酰胺；N-(3-((2R,5S)-6-氨基-3,3,5-三氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4氟苯基)-5-甲氧基吡嗪-2-甲酰胺；N-(3-((2R,5S)-6-氨基-3,3,5-三氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡啶酰胺；N-(3-((2R,5S)-6-氨基-3,3,5-三氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4氟苯基)-5-氰基-3-甲基吡啶酰胺；以及N-(3-((2R,5R)-6-氨基-3,3,5-三氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4氟苯基)-5-(二氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺。
其他BACE抑制剂可以选自以下化学式
其中Ar选自下组，该组由以下各项组成：苯基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基，并且其中该Ar任选地被一个或多个选自卤素、CN、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6氟烷基或C1-C6烷氧基的取代基取代；并且
R1是一个或多个氢、卤素、C1-C3氟烷基或C1-C3烷基；
R2表示氢或氟；
或其药学上可接受的盐。
例如化合物，如
N-(3-((2S,5S)-6-氨基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡啶酰胺；
N-(3-((2S,5S)-6-氨基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡啶酰胺；
N-(3-((2S,5S)-6-氨基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氰基-3-甲基吡啶酰胺；
N-(3-((2S,5S)-6-氨基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氯吡啶酰胺；
N-(3-((2S,5S)-6-氨基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡嗪-2-甲酰胺；
N-(3-((2S,5S)-6-氨基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-2-甲基噁唑-4-甲酰胺；
N-(3-((2S,5S)-6-氨基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-4-溴-1-甲基-1H-咪唑-2-甲酰胺；
N-(3-((2S,5S)-6-氨基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-4-甲基噻唑-2-甲酰胺；
N-(3-((2S,5S)-6-氨基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-2-(二氟甲基)噁唑-4-甲酰胺；
N-(3-((2S,5S)-6-氨基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-1-(二氟甲基)-1H-吡唑-3-甲酰胺；
N-(3-((2S,5S)-6-氨基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(二氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺；
N-(3-((2S,5S)-6-氨基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-4-氯苯甲酰胺；
N-(3-((2S,5S)-6-氨基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氟吡啶酰胺；
N-(3-((2S,5R)-6-氨基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡啶酰胺；
N-[3-[(2S,5S)-6-氨基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-3,4-二氢吡啶-2-基]-4,5-二氟-苯基]-5-氟-吡啶-2-甲酰胺；
N-[3-[(2S,5S)-6-氨基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-3,4-二氢吡啶-2-基]-4,5-二氟-苯基]-5-甲氧基-吡啶-2-甲酰胺；
N-[3-[(2S,5S)-6-氨基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-3,4-二氢吡啶-2-基]-4,5-二氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺；
N-[3-[(2S,5R)-6-氨基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-3,4-二氢吡啶-2-基]-4,5-二氟-苯基]-5-氟-吡啶-2-甲酰胺；
N-[3-[(2S,5R)-6-氨基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-3,4-二氢吡啶-2-基]-4,5-二氟-苯基]-5-甲氧基-吡啶-2-甲酰胺；
N-[3-[(2S,5R)-6-氨基-5-氟-5-(氟甲基)-2-甲基-3,4-二氢吡啶-2-基]-4,5-二氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺；
N-[3-[(2S,5S)-6-氨基-5-氟-2,5-双(氟甲基)-3,4-二氢吡啶-2-基]-4-氟-苯基]-5-氟-吡啶-2-甲酰胺；
N-[3-[(2S,5S)-6-氨基-5-氟-2,5-双(氟甲基)-3,4-二氢吡啶-2-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡啶-2-甲酰胺；
N-[3-[(2S,5S)-6-氨基-5-氟-2,5-双(氟甲基)-3,4-二氢吡啶-2-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺；
N-[3-[(2S,5R)-6-氨基-5-氟-2,5-双(氟甲基)-3,4-二氢吡啶-2-基]-4-氟-苯基]-5-氟-吡啶-2-甲酰胺；
N-[3-[(2S,5R)-6-氨基-5-氟-2,5-双(氟甲基)-3,4-二氢吡啶-2-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡啶-2-甲酰胺以及
N-[3-[(2S,5R)-6-氨基-5-氟-2,5-双(氟甲基)-3,4-二氢吡啶-2-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺；
或所述化合物的药学上可接受的盐。
其他BACE抑制剂可以具有以下化学式
其中Ar选自下组，该组由以下各项组成：苯基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、噻唑基和异噁唑基，并且其中该Ar任选地被一个或多个卤素、CN、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6氟烷基或C1-C6烷氧基取代；并且
R1和R2独立地是氢、卤素、C1-C3氟烷基或C1-C3烷基；
或其药学上可接受的盐。
例如化合物，如
(S)-N-(3-(6-氨基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氯吡啶酰胺
(S)-N-(3-(6-氨基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氟吡啶酰胺
(S)-N-(3-(6-氨基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡嗪-2-甲酰胺
(S)-N-(3-(6-氨基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-1-(二氟甲基)-1H-吡唑-3-甲酰胺
(S)-N-(3-(6-氨基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-2-(二氟甲基)噁唑-4-甲酰胺
(S)-N-(3-(6-氨基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氰基吡啶酰胺
(S)-N-(3-(6-氨基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-2-甲基噁唑-4-甲酰胺
(S)-N-(3-(6-氨基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基嘧啶-2-甲酰胺
(S)-N-(3-(6-氨基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(二氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺
(S)-N-(3-(6-氨基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4,5-二氟苯基)-2-甲基噁唑-4-甲酰胺
(S)-N-(3-(6-氨基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4,5-二氟苯基)-5-甲氧基吡嗪-2-甲酰胺
(S)-N-(3-(6-氨基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4,5-二氟苯基)-5-氟吡啶酰胺
(S)-N-(3-(6-氨基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4,5-二氟苯基)-5-氯吡啶酰胺
(S)-N-(3-(6-氨基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4,5-二氟苯基)-5-氰基吡啶酰胺
(S)-N-(3-(6-氨基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4,5-二氟苯基)-5-甲氧基吡啶酰胺
(S)-N-(3-(6-氨基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4,5-二氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡啶酰胺
(S)-N-(3-(6-氨基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4,5-二氟苯基)-5-氰基-3-甲基吡啶酰胺
(S)-N-(3-(6-氨基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡啶酰胺(S)-N-(3-(6-氨基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-溴吡啶酰胺
(S)-N-(3-(6-氨基-3,3-二氟-2-(氟甲基)-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-溴吡啶酰胺
或所述化合物的药学上可接受的盐。
其他BACE化合物可以来自以下化学式
其中Ar选自下组，该组由以下各项组成：苯基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基，并且其中该Ar任选地被一个或多个选自卤素、CN、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6氟烷基或C1-C6烷氧基的取代基取代；并且
R1是氢、卤素、C1-C3氟烷基或C1-C3烷基；
或其药学上可接受的盐。
这些化合物可以是
(S)-N-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氯吡啶酰胺，
(S)-N-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氟吡啶酰胺，
(S)-N-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡嗪-2-甲酰胺，
(S)-N-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-2-甲基噁唑-4-甲酰胺，
(S)-N-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡啶酰胺，
(S)-N-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(二氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺，
(S)-N-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氰基吡啶酰胺，
(S)-N-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-4-甲基噻唑-2-甲酰胺，
(S)-N-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基嘧啶-2-甲酰胺，
(S)-N-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基-3-甲基吡嗪-2-甲酰胺，
(S)-N-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氰基-3-甲基吡啶酰胺，
(S)-N-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-溴吡啶酰胺，
(S)-N-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡啶酰胺，以及
(S)-N-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡嗪-2-甲酰胺；
或所述化合物的药学上可接受的盐。
其他BACE抑制剂可以具有以下化学式
其中Ar选自下组，该组由以下各项组成：苯基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基，并且其中该Ar任选地被一个或多个选自卤素、CN、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6氟烷基或C1-C6烷氧基的取代基取代；并且
R1是一个或多个氢、卤素、C1-C3氟烷基或C1-C3烷基；
或其药学上可接受的盐。
该化合物可以是：
N-(3-((2R,3S,5S)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氟吡啶酰胺，
N-(3-((2R,3S,5S)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡嗪-2-甲酰胺，
N-(3-((2R,3S,5S)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡啶酰胺，
N-(3-((2R,3S,5R)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氟吡啶酰胺，
N-(3-((2R,3S,5R)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡嗪-2-甲酰胺，
N-(3-((2R,3S,5R)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-2-甲基噁唑-4-甲酰胺，
N-(3-((2R,3S,5R)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡啶酰胺，
N-(3-((2R,3S,5R)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡啶酰胺，
N-(3-((2R,3S,5R)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氯吡啶酰胺，
N-(3-((2R,3S,5R)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-1-甲基-1H-咪唑-2-甲酰胺，
N-(3-((2R,3S,5R)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺，
N-(3-((2R,3S,5R)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-4-甲基噻唑-2-甲酰胺，
N-(3-((2R,3S,5R)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-2-(二氟甲基)噁唑-4-甲酰胺，
N-(3-((2R,3S,5R)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-1-(二氟甲基)-1H-吡唑-3-甲酰胺，
N-(3-((2R,3S,5R)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(二氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺，
N-(3-((2R,3S,5R)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-4-氯苯甲酰胺，
N-(3-((2R,3S,5R)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氰基吡啶酰胺，
N-(3-((2R,3S,5R)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4,5-二氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡啶酰胺，
N-(3-((2R,3S,5S)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡啶酰胺，
N-(3-((2R,3S,5S)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡嗪-2-甲酰胺，
N-(3-((2R,3S,5S)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氰基-3-甲基吡啶酰胺，
N-(3-((2R,3S,5S)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4,5-二氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡啶酰胺，
N-(3-((2R,3R,5S)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡啶酰胺，
N-(3-((2R,3S,5S)-6-氨基-3,5-二氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-溴吡啶酰胺
或所述化合物的药学上可接受的盐。
b)将τ蛋白抗体与N3PGLUABETA抗体组合
在本发明的疗法、组合物或试剂盒中，可以将τ蛋白抗体与N3PGLU ABETA抗体组合。
c)将τ蛋白抗体与在主动或被动Aβ肽免疫疗法中有用的化合物组合
在本发明的疗法、组合物或试剂盒中，可以将τ蛋白抗体与在主动或被动Aβ肽免疫疗法中有用的化合物组合。
d)将τ蛋白抗体与NMDA受体拮抗剂组合
在本发明的疗法、组合物或试剂盒中，可以将τ蛋白抗体与NMDA受体拮抗剂组合。该NMDA受体拮抗剂可以选自下组，该组由以下各项组成：美金刚、钠门达、Namzaric(美金刚/多奈哌齐)、以及其类属形式。该NMDA受体拮抗剂可以选自抗精神药。突触前神经元通过负反馈机制禁止过量的谷氨酸释放，但是在诸如AD的细胞应激条件下，这种机制受到损害。突触裂缝中过量的谷氨酸导致突触后钙通道不断打开，从而导致神经元内的细胞内钙水平升高，引起严重的神经元损伤和/或死亡。通过在过量钙流入条件下拮抗NMDA受体，抗精神药减少钙向神经元中的过度流入，减少细胞损伤并改善正常的神经元信号，并且因此改善认知功能。
e)将τ蛋白抗体与另外的τ蛋白聚集抑制剂组合；
在本发明的疗法、组合物或试剂盒中，可以将τ蛋白抗体与τ蛋白聚集抑制剂组合。
f)将τ蛋白抗体与乙酰胆碱酯酶抑制剂组合
在本发明的疗法、组合物或试剂盒中，可以将τ蛋白抗体与乙酰胆碱酯酶抑制剂(AChEI)组合。AChEI通常被用作针对在轻度至中度AD中的认知症状的一线治疗。AChEI还被广泛地用于治疗中度至重度AD，包括批准用于该亚群的多奈哌齐。在AD患者中观察到AChEI减轻胆碱能缺乏症，并且提高患者进行日常活动的能力。在一个实施例中，本发明包括一种疗法，该疗法包括如本文定义的τ蛋白抗体，以及乙酰胆碱酯酶抑制剂。
在一个实施例中，该AChEI选自下组，该组由以下各项组成：多奈哌齐、加兰他敏以及利凡斯的明。该AChEI可以是口服片剂、胶冻剂、糖浆剂或口服溶液制剂的其他形式。AChEI也可能是透皮给药的贴剂。
g)将τ蛋白抗体与抗癫痫药组合；
在本发明的疗法、组合物或试剂盒中，可以将τ蛋白抗体与抗癫痫药组合。
h)将τ蛋白抗体与抗炎药组合；
在本发明的疗法、组合物或试剂盒中，可以将τ蛋白抗体与抗炎药组合。
i)将τ蛋白抗体与抗抑郁药组合
在本发明的疗法、组合物或试剂盒中，可以将τ蛋白抗体与抗抑郁药组合。
抑郁症是常见的AD痴呆症早期并发症状。三环抗抑郁药曾经是针对AD中抑郁症状的优选治疗方法，但SSRI已经在很大程度上取代了这些药物。在一个实施例中，依他普仑是抗抑郁药，因为它有利于副作用特征和最小的药物相互作用，因此经常被用于治疗AD。在另外的实施例中，西酞普兰或舍曲林是抗抑郁药，因为它们也经常被使用。在另外的实施例中，沃替西汀是抗抑郁药，因为它与在患有MDD的患者的神经疗效的认知性能和神经功能的成像证据的改善有关。该抗抑郁药可以选自下组，该组由以下各项组成：依他普仑、舍曲林、西酞普兰、帕罗西汀、氟西汀、文拉法辛、曲唑酮、米氮平、沃替西汀以及其类属形式。
本发明的另一个方面是针对在一种组合物中的本发明的抗体或其表位结合片段，连同药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂和/或稳定剂。本发明的抗体或其表位结合片段可以在用于治疗τ蛋白病变的疗法中使用。典型地，该τ蛋白病变选自下组，该组由以下各项组成：阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；因AD导致的情感冷漠或患有AD的患者中的情感冷漠；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；皮克病；原发性年龄相关性τ蛋白病变(PART)；神经原纤维缠结为主型老年性痴呆；拳击员痴呆；慢性创伤性脑病；中风；中风恢复；与帕金森病相关的神经变性；与染色体关联的帕金森综合征；利缇可-伯蒂格病(关岛型帕金森病-痴呆复合征)；神经节胶质瘤和神经节细胞瘤；脑膜血管瘤病；脑炎后帕金森综合征；亚急性硬化性全脑炎；亨廷顿氏病；铅中毒脑病；结节性硬化症；哈勒沃登-施帕茨病以及脂褐质沉积症。更典型地，该τ蛋白病变选自下组，该组由以下各项组成：阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；因AD导致的情感冷漠或患有AD的患者中的情感冷漠；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；以及皮克病。特别地，该τ蛋白病变可以选自阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；因AD导致的情感冷漠或患有AD的患者中的情感冷漠；以及患有路易体痴呆症的患者的精神病症状。
通过本发明所设想的治疗可以是长期的并且患者可以接受至少2周(如至少持续1个月、6个月、1年或更久)治疗。
本发明的这些抗体可以例如是通过杂交瘤方法产生的单克隆抗体，该杂交瘤方法首次描述于Kohler等人，Nature[自然]256，495(1975)，或可以是通过重组DNA或其他方法产生的单克隆抗体，或更优选可以通过披露的新颖方法产生。还可以使用例如，在Clackson等人(Nature[自然]352，624-628(1991))和Marks等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]222，581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体展示文库中分离单克隆抗体。单克隆抗体可以从任何适合的来源获得。因此，例如，单克隆抗体可以从制备自鼠类脾脏B淋巴细胞的杂交瘤获得，这些淋巴细胞获得自用感兴趣的抗原或编码感兴趣的抗原的核酸免疫的小鼠，例如，这些淋巴细胞处于在表面表达该抗原的细胞的形式。单克隆抗体还可以从来源于免疫的人的或来自非人哺乳动物(如大鼠、兔、狗、绵羊、山羊、灵长类动物等)的表达抗体的细胞的杂交瘤获得。
在一个实施例中，本发明的抗体是人抗体。可以使用携带部分人免疫***而不是小鼠***的转基因或转染色体小鼠产生针对τ蛋白的人类单克隆抗体。此类转基因和转染色体小鼠包括分别在本文中称为HuMAb(人类单克隆抗体)小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在本文中统称为“转基因小鼠”。
HuMAb小鼠包含人类免疫球蛋白基因迷你座位(mini-locus)，该迷你座位编码未重排的人类重链可变和恒定(μ和Y)以及轻链可变和恒定(κ)链免疫球蛋白序列，连同靶向的突变，所述突变使内源性μ和K链座位失活(Lonberg,N.等人，Nature[自然]368，856-859(1994))。因此，这些小鼠展示出小鼠IgM或κ的表达减少，并且响应于免疫，所引入的人类重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人类IgG、κ单克隆抗体(Lonberg,N.等人(1994)，同上；评论于Lonberg,N.，Handbook ofExperimentalPharmacology[实验药物学手册]113，49-101(1994)中；Lonberg,N.和Huszar,D.，Intern.Rev.Immunol.[国际免疫学评论]第13卷65-93(1995)，以及Harding,F.和Lonberg,N.，Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年刊]764536-546(1995))。HuMAb小鼠的制备详细描述于Taylor,L.等人，Nucleic Acids Research[核酸研究]20，6287-6295(1992)，Chen,J.等人，International Immunology[国际免疫学]5，647-656(1993)，Tuaillon等人，J.Immunol.[免疫学杂志]152，2912-2920(1994)，Taylor,L.等人，InternationalImmunology[国际免疫学]6，579-591(1994)，Fishwild,D.等人，Nature Biotechnology[自然生物技术]14，845-851(1996)。还参见US 5,545,806、US 5,569,825、US 5,625,126、US5,633,425、US 5,789,650、US 5,877,397、US5,661,016、US 5,814,318、US 5,874,299、US5,770,429、US 5,545,807、WO 98/24884、WO 94/25585、WO 93/1227、WO 92/22645、WO92/03918以及WO 01/09187。
Hco7、HCo12、HCo17和HCo20小鼠在其内源轻链(κ)基因中具有JKD破坏(如描述于Chen等人，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12，811-820(1993))，在其内源重链基因中具有种CMD破坏(如描述于WO 01/14424的实例1)以及KCo5人κ轻链转基因(如描述于Fishwild等人，Nature Biotechnology[自然生物技术]14，845-851(1996))。此外，HCo7小鼠具有HCo7人重链转基因(如描述于US 5,770,429)，HCo12小鼠具有HCo12人重链转基因(如描述于WO 01/14424的实例2)，HCo17小鼠具有HCo17人重链转基因(如描述于WO 01/09187的实例2)并且HCo20小鼠具有HCo20人重链转基因。所得小鼠在对内源小鼠重链和κ轻链座位破坏纯合的背景下表达人免疫球蛋白重链和κ轻链转基因。
在KM小鼠品系中，内源小鼠κ轻链基因已经被同型结合地破坏，如描述于Chen等人，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12，811-820(1993)，并且内源小鼠重链基因已经被同型结合地破坏，如描述于WO 01/09187的实例1。这个小鼠品系携带人κ轻链转基因KCo5，如描述于Fishwild等人，Nature Biotechnology[自然生物技术]14，845-851(1996)中。这个小鼠品系还携带由染色体14片段hCF(SC20)构成的人重链转染色体，如描述于WO 02/43478中。HCo12-Balb/c、HCo17-Balb/c和HCo20-Balb/c小鼠可以通过将HCo12、HCo17和HCo20与KCo5[J/K](Balb)杂交来产生，如描述于WO09/097006中。
rTg4510小鼠是已知的τ蛋白病变模型，提供了突变体τ蛋白转基因表达上的时空控制。在KM小鼠品系中，内源性小鼠κ轻链基因已经纯合地破坏，如Chen等人EMBO J.12，811-820(1993)中所述，并且内源性小鼠重链基因已经纯合地破坏，如在WO 01/09187的实例1中所述。这个小鼠品系携带人κ轻链转基因KCo5，如描述于Fishwild等人，NatureBiotechnology[自然生物技术]14，845-851(1996)中。该小鼠品系还携带由染色体14表位结合片段hCF(SC20)构成的人类重链转染色体，如在WO 02/43478中所述。
来自这些转基因小鼠的脾细胞可以用于根据熟知的技术产生分泌人单克隆抗体的杂交瘤。本发明的人单克隆抗体或多克隆抗体或者源于其他物种的本发明的抗体还可以通过产生对于感兴趣的免疫球蛋白重链和轻链序列而言转基因的另一非人哺乳动物或植物并且从其中产生可回收形式的抗体而转基因地产生。与哺乳动物中的转基因生产相结合，抗体可以从山羊、奶牛或其他哺乳动物的乳中产生和回收(参考，例如US 5,827,690；US5,756,687；US 5,750,172和US 5,741,957)。
本发明的抗体可以具有任何同种型。同种型的选择典型地将由希望的效应子功能(如ADCC诱导)来指导。示例性同种型是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可以使用人轻链恒定结构域κ或λ中任一者。如果希望的话，本发明的抗τ蛋白抗体的类别可以通过已知的方法转换。例如，最初是IgM的本发明的抗体可以经类别转换变为本发明的IgG抗体。此外，类别转换技术可以用来将一个IgG亚类转化成另一亚类，例如从IgGl到IgG2。因此，本发明的抗体的效应子功能可以通过同种型切换变为例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体，用于各种治疗用途。在一个实施例中，本发明的抗体是IgG1抗体，例如IgG1,κ。抗体被说成属于特定同种型，如果其氨基酸序列相对于其他同种型与该同种型大部分同源的话。
在一个实施例中，本发明的抗体是全长抗体，优选IgG抗体，特别是IgG1,κ抗体。在另一个实施例中，本发明的抗体是抗体表位结合片段或单链抗体。
抗体及其表位结合片段可以例如通过使用常规技术的表位结合片段化获得，并且以与在此对完整抗体所述的相同方式针对效用筛选表位结合片段。例如，F(ab')2表位结合片段可以通过用胃蛋白酶处理抗体产生。可以处理所得F(ab')2表位结合片段以减少二硫桥，以产生Fab'表位结合片段。可以通过用木瓜蛋白酶处理IgG抗体来获得Fab表位结合片段；可以用IgG抗体的胃蛋白酶消化来获得Fab'表位结合片段。F(ab')表位结合片段还可以通过经由硫醚键或二硫键结合以下描述的Fab'来产生。Fab'表位结合片段是通过切割F(ab')2的铰链结构域的二硫键获得的抗体表位结合片段。Fab'-表位结合片段可以通过用还原剂如二硫苏糖醇处理F(ab')2表位结合片段获得。抗体表位结合片段还可以通过在重组细胞中表达编码此类表位结合片段的核酸产生(参见例如Evans等人，J.Immunol.Meth.[免疫学方法杂志]184，123-38(1995))。例如，编码F(ab')2表位结合片段一部分的嵌合基因可以包括编码CH1结构域和H链的铰链结构域的DNA序列，随后为翻译终止密码子，以产生这样一种截短的抗体表位结合片段分子。
在一个实施例中，抗τ蛋白抗体是单价抗体，优选如在WO 2007059782中所述的具有铰链区缺失的单价抗体(将其通过引用以其全文结合在此)。因此，在一个实施例中，该抗体是单价抗体，其中所述抗τ蛋白抗体通过一种方法构建，该方法包括：i)提供编码所述单价抗体的轻链的核酸构建体，所述构建体包括编码所选的抗原特异性抗τ蛋白抗体的VL区的核苷酸序列，和编码Ig的恒定CL区的核苷酸序列，其中编码所选的抗原特异性抗体的VL区的所述核苷酸序列和编码Ig的CL区的所述核苷酸序列被可操作地连接在一起，并且其中在IgG1亚型的情况下，编码该CL区的核苷酸序列已经被修饰，这样使得在多克隆人类IgG的存在下或当给予给动物或人类时，该CL区不含有能够与包含该CL区的一致氨基酸序列的其他肽形成二硫键或共价键的任何氨基酸；ii)提供编码所述单价抗体的重链的核酸构建体，所述构建体包含编码所选抗原特异性抗体的VH区的核苷酸序列和编码人类Ig的恒定CH区的核苷酸序列，其中编码CH区的核苷酸序列已经被修饰，这样使得在多克隆人类IgG的存在下或当给予给动物、人时，对应于铰链区和(如由Ig亚型所要求的)CH区的其他区域(如CH3区)的区域不包含参与和包含人Ig的CH区的一致氨基酸序列的其他肽形成二硫键或共价或稳定的非共价重链间键的任何氨基酸残基，其中编码所选抗原特异性抗体的VH区的所述核苷酸序列和编码所述Ig的CH区的所述核苷酸序列被可操作地连接在一起；iii)提供用于产生所述单价抗体的细胞表达***；iv)通过在(iii)的细胞表达***的细胞中共表达(i)和(ii)的核酸构建体来产生所述单价抗体。
类似地，在一个实施例中，本发明的抗τ蛋白抗体是单价抗体，其包含：
(i)如在此描述的本发明抗体的可变结构域或所述结构域的表位结合部分，以及
(ii)免疫球蛋白的CH域或其包含CH2和CH3域的结构域，其中该CH域或其结构域已经被修饰，这样使得对应于铰链域和(如果该免疫球蛋白不是IgG4亚型的话)CH域的其他结构域(如CH3域)的结构域不包含任何氨基酸残基，这些任何氨基酸残基能够与相同CH域形成二硫键或在多克隆人IgG的存在下与相同CH域形成其他共价或稳定的非共价重链间键。
在另外的实施例中，本发明的单价抗体的重链已经被修饰为使得整个铰链区已缺失。
在另一个另外的实施例中，单价抗体的序列已经被修饰，这样使得它不包含用于N-连接的糖基化的任何受***点。
本发明还包括“双特异性抗体”，其中抗τ蛋白结合区(例如抗τ蛋白单克隆抗体的τ蛋白-结合区)是靶向多于一个表位(例如第二表位可以包括活性运输受体的表位，使得双特异性抗体可以展现出改善的跨生物屏障例如血脑屏障的转胞吞作用)的二价或多价双特异性支架的部分。因此，在另一个另外的实施例中，抗τ蛋白抗体的单价Fab可以连接到另外的靶向不同蛋白的Fab或scfv上，以产生双特异性抗体。双特异性抗体可以具有双重功能，例如由抗τ蛋白结合结构域赋予的治疗功能，以及可以结合至受体分子以增强跨生物屏障如血脑屏障的转移的运输功能。
本发明的抗体及其表位结合片段还包括单链抗体。单链抗体是重链和轻链Fv域被连接的肽。在一个实施例中，本发明提供了单链Fv(scFv)，其中在本发明的抗τ蛋白抗体的Fv中的重链和轻链与柔性肽接头(典型地具有约10、12、15或更多个氨基酸残基)连接在单一肽链中。产生此类抗体的方法描述于例如US 4,946,778；Pluckthun，在ThePharmacology ofMonoclonal Antibodies[单克隆抗体药理学]，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，施普林格出版公司(Springer-Verlag)，纽约，第269-315页(1994)；Bird等人，Science[科学]242，423-426(1988)；Huston等人，PNAS USA 85，5879-5883(1988)和McCafferty等人，Nature[自然]348，552-554(1990)。单链抗体可以是单价的，如果仅使用单个VH和VL的话；可以是二价的，如果使用两个VH和VL的话；或可以是多价的，如果使用两个以上VH和VL的话。
可以通过包含任何适合数目的经修饰的氨基酸和/或与此类偶联取代基缔合来修饰在此描述的抗体及其表位结合片段。在该背景中的适合性通常是通过至少基本上保留与未衍生化的亲本抗τ蛋白抗体关联的τ蛋白选择性和/或τ蛋白特异性的能力来确定。该一个或多个修饰氨基酸的包含在以下方面可以是有利的，例如，增加多肽血清半衰期，降低多肽抗原性，或增加多肽贮存稳定性。对一种或多种氨基酸进行修饰，例如，在重组产生的过程中与翻译同时进行或在翻译之后进行(例如，在哺乳动物细胞中表达过程中在N-X-S/T基序上的N-连接的糖基化作用)，或通过合成手段进行修饰。经修饰的氨基酸的非限制性实例包括：糖基化的氨基酸、硫酸化的氨基酸、异戊二烯化(例如，法尼基化、香叶基-香叶基化(geranyl-geranylated))的氨基酸、乙酰化的氨基酸、酰化的氨基酸、聚乙二醇化的氨基酸、生物素酰化的氨基酸、羧基化的氨基酸、磷酸化的氨基酸、以及类似氨基酸。足够指导本领域中的普通技术人员进行氨基酸修饰的参考在文献中相当充分。实例方案可见于Walker(1998)Protein Protocols on CD-ROM[关于CD-ROM的蛋白质方案]胡玛纳出版社(HumanaPress)，托瓦塔(Towata)，NJ。该经修饰的氨基酸可例如选自：糖基化的氨基酸、聚乙二醇化的氨基酸、法尼基化的氨基酸、乙酰化的氨基酸、生物素酰化的氨基酸、偶联到脂类部分上的氨基酸、或偶联到有机衍化剂上的氨基酸。
本发明的抗体及其表位结合片段还可以通过共价缀合到聚合物上进行化学修饰，以例如增加它们的循环半衰期。示例性聚合物以及将它们附接到肽的方法说明于例如US4,766,106；US4,179,337；US 4,495,285和US 4,609,546中。另外的说明性聚合物包括聚氧乙基化的多元醇和聚乙二醇(PEG)(例如，分子量在约1,000与约40,000之间，如在约2,000与约20,000之间，例如约3,000-12,000g/mol的PEG)。
本发明的抗体及其表位结合片段可以进一步用于诊断方法中或用作诊断成像配体。
在一个实施例中，提供了包含一种或多种放射性标记的氨基酸的本发明的抗体及其表位结合片段。经放射性标记的抗τ蛋白抗体可以用于诊断和治疗目的两者(缀合至经放射性标记的分子是另一种可能的特征)。此类标记的非限制性实例包括但不限于：铋(213Bi)、碳(11C、13C、14C)、铬(51Cr)、钴(57Co、60Co)、铜(64Cu)、镝(165Dy)、铒(169Er)、氟(18F)、钆(153Gd、159Gd)、镓(68Ga、67Ga)、锗(68Ge)、金(198Au)、钬(166Ho)、氢(3H)、铟(111In、112In、113In、115In)、碘(121I、123I、125I、131I)、铱(192Ir)、铁(59Fe)、氪(81mKr)、镧(140La)、镥(177Lu)、锰(54Mn)、钼(99Mo)、氮(13N、15N)、氧(15O)、钯(103Pd)、磷(32P)、钾(42K)、镨(142Pr)、钷(149Pm)、铼(186Re、188Re)、铑(105Rh)、铷(81Rb、82Rb)、钌(82Ru、97Ru)、钐(153Sm)、钪(47Sc)、硒(75Se)、钠(24Na)、锶(85Sr、89Sr、92Sr)、硫(35S)、锝(99Tc)、铊(201Tl)、锡(113Sn、117Sn)、氙(133Xe)、镱(169Yb、175Yb、177Yb)、钇(90Y)、锌(65Zn)以及锆(89Zr)。锆(89Zr)是特别感兴趣的。用于制备放射性标记的氨基酸和相关肽衍生物的方法在本领域是已知的(参见例如，Junghans等人，在Cancer Chemotherapy andBiotherapy[癌症化疗和生物疗法]655-686(第2版，Chafner和Longo编辑，利平科特瑞文公司(Lippincott Raven)(1996)中)以及US 4,681,581、US4,735,210、US 5,101,827、US 5,102,990(US RE35,500)、US 5,648,471和US 5,697,902)。例如，放射性同位素可以氯胺T方法进行偶联(Lindegren,S.等人(1998)“Chloramine-TInHigh-Specific-Activity Radioiodination Of Antibodies Using N-Succinimidyl-3-(Trimethylstannyl)Benzoate As An Intermediate[使用N-琥珀酰亚胺基-3-(三甲基锡烷基)苯甲酸酯作为中间体的抗体的高比活放射性碘化中的氯胺-T]”，Nucl.Med.Biol.[核医学与生物学]25(7):659-665；Kurth,M.等人(1993)“Site-Specific Conjugation Of ARadioiodinated Phenethylamine Derivative To A Monoclonal Antibody Results InIncreased Radioactivity Localization In Tumor[放射性碘化的苯乙胺衍生物至单克隆抗体的位点特异性偶联在肿瘤中产生增加的放射性]”，J.Med.Chem.[药物化学杂志]36(9):1255-1261；Rea,D.W.等人(1990)“Site-specifically radioiodinated antibodyfor targeting tumors[用于靶向肿瘤的位点特异性放射性碘化的抗体]”，Cancer Res.[癌症研究]50(3增刊):857s-861s)。
本发明还提供了使用以下项可检测地标记的抗τ蛋白抗体及其表位结合片段：荧光标记(如稀土螯合物(例如，铕螯合物))、荧光素型标记(例如，荧光素、荧光素异硫氰酸酯、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素、二氯三嗪基胺荧光素)、罗丹明型标记(例如，ALEXA568(英杰公司(Invitrogen))、或丹磺酰氯)、VIVOTAG 680 XLFLUOROCHROMETM(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))、藻红蛋白；伞形酮、丽丝胺；花菁；藻红蛋白、德克萨斯红、BODIPY(英杰公司(Invitrogen))或其类似物，所有这些都适用于光学检测。可以采用化学发光标记(例如，鲁米诺、荧光素酶、荧光素和水母蛋白)。这种诊断和检测还可以通过将本发明的诊断分子偶合至可检测物质(包括但不限于各种酶，酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶)或者偶合至辅基复合体(如但不限于链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素)来完成。
可以采用化学发光标记(例如，鲁米诺、荧光素酶、萤光素、以及水母蛋白)。这种诊断和检测还可以通过将本发明的诊断分子偶联至可检测物质或辅基复合物来完成，这些可检测物质包括但不限于：各种酶、包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶的酶，这些辅基复合物例如但不限于链霉亲和素/生物素以及抗生物素蛋白/生物素。还可以采用顺磁性标记，并且优选使用正电子发射断层摄影(PET)或单光子发射型计算机断层摄影(SPECT)来检测。这样的顺磁性标记包括但不限于含有铝(Al)、钡(Ba)、钙(Ca)、铈(Ce)、镝(Dy)、铒(Er)、铕(Eu)、钆(Gd)、钬(Ho)、铱(Ir)、锂(Li)、镁(Mg)、锰(Mn)、钼(M)、钕(Nd)、锇(Os)、氧(O)、钯(Pd)、铂(Pt)、铑(Rh)、钌(Ru)、钐(Sm)、钠(Na)、锶(Sr)、铽(Tb)、铥(Tm)、锡(Sn)、钛(Ti)、钨(W)和锆(Zi)并且特别是Co+2、CR+2、Cr+3、Cu+2、Fe+2、Fe+3、Ga+3、Mn+3、Ni+2、Ti+3、V+3和V+4的顺磁离子的化合物，使用各种正电子发射断层术的正电子发射金属以及非放射性顺磁金属离子。
因此，在一个实施例中，本发明的抗τ蛋白抗体或其τ蛋白-结合片段可以用荧光标记、化学发光标记、顺磁性标记、放射性同位素标记或酶标记来标记。标记的抗体或片段可以用于检测或测量所述τ蛋白在受试者脑中的存在。这种方法可以包括检测或测量结合至所述τ蛋白上的抗τ蛋白抗体或τ蛋白-结合片段的体内成像，并且可以包括结合至此类τ蛋白的所述抗τ蛋白抗体或τ蛋白-结合片段的离体成像。
在一个另外的方面，本发明涉及编码本发明的抗体或其τ蛋白结合片段的一种或多种多肽链的表达载体。此类表达载体可以用于重组产生本发明的抗体或其表位结合片段。
在本发明的背景下，表达载体可以是任何适合的DNA或RNA载体，包括染色体载体、非染色体载体和合成核酸载体(包含一组适合的表达控制元件的核酸序列)。此类载体的实例包括SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、衍生自质粒与噬菌体DNA的组合的载体以及病毒核酸(RNA或DNA)载体。在一个实施例中，编码抗τ蛋白抗体的核酸被包含在包含例如直链表达元件的裸DNA或RNA载体(如例如Sykes和Johnston，Nat Biotech[自然生物技术]12，355-59(1997)中所述)，压缩核酸载体(如例如US 6,077,835和/或WO00/70087中所述)，质粒载体如pBR322、pUC19/18、或pUC 118/119，“midge”最小尺寸的核酸载体(如例如Schakowski等人，MoI Ther[分子理论]3，793-800(2001)中所述)中，或作为沉淀核酸载体构建体，如CaPO4-沉淀构建体(如例如WO00/46147，Benvenisty和Reshef，PNASUSA 83，9551-55(1986)，Wigler等人，Cell[细胞]14，725(1978)，以及Coraro和Pearson，Somatic Cell Genetics[体细胞遗传学]2，603(1981)中所述)。这种核酸载体及其使用在本领域中是熟知的(参见例如US 5,589,466和US 5,973,972)。
在一个实施例中，该载体适合用于在细菌细胞中表达本发明的抗τ蛋白抗体或其表位结合片段。此类载体的实例包括表达载体，例如BlueScript(Stratagene)、pIN载体(Van Heeke和Schuster，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]264，5503-5509(1989))，pET载体(诺沃根(Novagen)，麦迪逊(Madison)，WI)。
表达载体还可以是或可替代地是适用于在酵母***中进行表达的载体。可以采用任何适用于在酵母***中进行表达的载体。适合的载体包括例如包含组成型或诱导型启动子(如α因子、醇氧化酶和PGH)的载体(综述于：F.Ausubel等人编辑的Current Protocolsin Molecular Biology[分子生物学实验指南]，格林出版和威利国际科学(GreenePublishing and Wiley InterScience)纽约(1987)；Grant等人，Methods in Enzymol[酶学方法]153，516-544(1987)；Mattanovich,D.等人，Methods Mol.Biol.[分子生物学方法]824，329-358(2012)；Celik,E.等人，Biotechnol.Adv.[生物技术进展]30(5)，1108-1118(2012)；Li,P.等人，Appl.Biochem.Biotechnol.[应用生物化学与生物技术]142(2)，105-124(2007)；E.等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]77(3)，513-523(2007)；van der Vaart,J.M.，Methods Mol.Biol.[分子生物学方法]178，359-366(2002)和Holliger,P.，ethods Mol.Biol.[分子生物学方法]178，349-357(2002))。
在本发明的表达载体中，编码抗τ蛋白抗体的核酸可以包括任何适合的启动子、增强子、以及其他表达辅助元件或与其相关联。此类元件的实例包括强表达型启动子(例如，人CMV IE启动子/增强子连同RSV、SV40、SL3-3、MMTV和HIV LTR启动子)、有效的聚(A)终止序列、用于在大肠杆菌中产生质粒的复制起点、作为选择性标记的抗生素抗性基因和/或便利的克隆位点(例如，多聚接头)。核酸还可以包含与组成型启动子(如CMV IE)相对的诱导型启动子(本领域的技术人员应认识到此类术语实际上是在某些条件下的基因表达程度的描述语)。
在一个甚至另外的方面，本发明涉及重组真核或原核宿主细胞，如转染瘤，其产生如在此定义的本发明的抗体或其表位结合片段或者如在此定义的本发明的双特异性分子。宿主细胞的实例包括酵母、细菌、和哺乳动物细胞，例如CHO或HEK细胞。例如，在一个实施例中，本发明提供了一种细胞，该细胞包含稳定地整合到细胞基因组中的核酸，该核酸包含编码用于表达本发明的抗τ蛋白抗体或其表位结合片段的序列。在另一个实施例中，本发明提供了一种细胞，该细胞包含一种非整合的核酸，如质粒、粘粒、噬菌粒或线性表达元件，该非整合的核酸包含编码用于表达本发明的抗τ蛋白抗体或其表位结合片段的序列。
在一个另外的方面，本发明涉及一种用于产生抗τ蛋白抗体的方法，所述方法包括以下步骤：a)培养杂交瘤或如以上定义的本发明的宿主细胞，并且b)从培养基纯化本发明的抗体。
在一个实施例中，本发明涉及一种制品，在这种术语在此使用时，该制品包含如在此定义的抗τ蛋白抗体，并且基本上不含天然产生的不能结合至τ蛋白或者不实质性地改变该制品的抗τ蛋白功能的抗体。因此，这种制品不包含天然产生的血清、或这种血清的纯化衍生物，该血清或其纯化衍生物包含抗τ蛋白抗体与另一种不改变该制品的抗τ蛋白抗体的功能的抗体的混合物，其中这种功能是：
(i)基本上不能结合至非磷酸化τ蛋白；
(ii)基本上不能结合至在S404处磷酸化且在S396处非磷酸化的τ蛋白；
(iii)能够结合至在S396处磷酸化的τ蛋白；
(iv)能够结合至在S396和S404两者处均磷酸化的τ蛋白；
(v)能够选择性地在磷酸化τ蛋白残基S396和S404之间区分，使其基本上不能结合磷酸化404残基；
(vi)能够结合来自人类阿尔茨海默病脑的过度磷酸化τ蛋白；
(vii)能够在病理性人类τ蛋白和非病理性人类τ蛋白之间区分；和/或
(viii)当如在此所述与经免疫耗减的来自转基因小鼠的rTg4510提取物一起使用时，能够特异性地将过度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa条带减少至少90％，同时没有将55kDaτ蛋白条带减少多于10％，或者当如在此所述与来自人类AD尸体解剖后脑的提取物一起使用时，特异性地将S396磷酸化的过度磷酸化τ蛋白条带减少至少90％，同时没有将非过度磷酸化τ蛋白条带减少多于10％。
本发明具体涉及这样一种抗τ蛋白抗体的制品，该抗体在氨基酸序列方面(在其CDR、可变结构域、框架残基和/或恒定结构域中的任一个中)相对于天然存在的抗τ蛋白抗体的结构而言具有结构变化，其中相对于由所述天然存在的抗τ蛋白抗体展现出的功能而言，所述结构变化引起抗τ蛋白抗体展现出显著改变的功能(即在功能方面多于20％的差异，多于40％的差异，多于60％的差异，多于80％的差异，多于100％的差异，多于150％的差异，多于2倍的差异，多于4倍的差异，多于5倍的差异，或多于10倍的差异)；其中这样的功能性是：
(i)基本上不能结合至非磷酸化τ蛋白；
(ii)基本上不能结合至在S404处磷酸化且在S396处非磷酸化的τ蛋白；
(iii)能够结合至在S396处磷酸化的τ蛋白；
(iv)能够结合至在S396和S404二者处均磷酸化的τ蛋白；
(v)能够选择性地在磷酸化τ蛋白残基S396和S404之间区分，使其基本上不能结合磷酸化404残基；
(vi)能够结合来自人类阿尔茨海默病脑的过度磷酸化τ蛋白；
(vii)能够在病理性人类τ蛋白和非病理性人类τ蛋白之间区分；和/或
(viii)当如在此所述与经免疫耗减的来自转基因小鼠的rTg4510提取物一起使用时，能够特异性地将过度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa条带减少至少90％，同时没有将55kDaτ蛋白条带减少多于10％，或者当如在此所述与来自人类AD尸体解剖后脑的提取物一起使用时，特异性地将S396磷酸化的过度磷酸化τ蛋白条带减少至少90％，同时没有将非过度磷酸化τ蛋白条带减少多于10％。
术语“基本不含”天然产生的抗体是指在此类制品中完全不存在此类天然产生的抗体，或者在此类制品中包含不会实质性影响这些制品的τ蛋白结合特性的一个浓度的此类天然产生的抗体。如果抗体不具有天然产生的对应物或已经从天然伴随该抗体的组分中分离或纯化，则认为该抗体是“分离的”。
术语“天然产生的抗体”，在它涉及此类制品时，是指在活人或其他动物内引发的抗体(包括天然产生的自身抗体)，作为对活人或其他动物的免疫***发挥作用的自然结果。
因此，本发明的制品不排除并且事实上明确涵盖此类包含抗τ蛋白抗体和有意添加的能够结合至未由τ蛋白拥有的表位上的另外抗体的制品。此类制品特别包括其实施例，其中该制品在治疗阿尔茨海默病(AD)、嗜银颗粒痴呆(AGD)、进行性核上性麻痹(PSP)、和皮质基底节变性(CBD)中展现出增强的功效。此外，本发明是针对包含抗τ蛋白抗体、或其表位结合片段的制品，预期在治疗精神病(特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病)，因AD导致的情感冷漠或患有AD的患者中的情感冷漠，以及患有路易体痴呆症的患者的精神病症状中使用。此外，本发明的制品包含抗τ蛋白抗体或其表位结合片段，其可以用于治疗中风、中风恢复、与帕金森病相关的神经变性。
在甚至另外的方面，本发明涉及药物组合物，其包含：
(i)如均在此定义的τ蛋白抗体或其表位结合片段，或包含这种抗τ蛋白抗体或其表位结合片段的制品(在这种术语在此定义时)；和
(ii)药学上可接受的载体。
这些药物组合物可以用药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的佐剂和赋形剂根据常规技术配制，这些常规技术是例如在以下中披露的技术：Remington:TheScience and Practice of Pharmacy[雷明顿：药学科学与实践]，第22版，Gennaro编，马克出版公司(MackPublishing Co.)，伊斯顿，宾夕法尼亚，2013。
药学上可接受的载体或稀释剂连同任何其他已知的佐剂和赋形剂应该适合于本发明的所选化合物和所选给药方式。基于就表位结合而言对本发明的所选化合物或药物组合物的所希望的生物特性的显著不利影响的缺少(例如，小于实质性影响(10％或更少相对抑制、5％或更少相对抑制等))来确定药物组合物的载体和其他组分的适合性。
本发明的药物组合物还可以包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、洗涤剂(例如，非离子型洗涤剂(如Tween-20或Tween-80)、稳定剂(例如，无糖或无蛋白氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂、和/或其他适合用于包含于药物组合物中的材料。以不影响组合物的生物活性为目的来选择稀释剂。此类稀释剂的实例为蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克氏溶液。此外，药物组合物或配制品还可以包含其他载体，或无毒的、非治疗性的、非免疫原性的稳定剂等。组合物还可以包含大的、缓慢代谢的大分子，如蛋白质、多糖(像壳聚糖)、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(例如，乳胶功能化的交联琼脂糖、琼脂糖、纤维素等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物以及脂质聚集体(例如，油滴或脂质体)。
本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得对于特定患者、组合物和给药方式而言有效实现所希望的治疗应答的活性成分量。所选的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本发明具体组合物或其酰胺的活性，给药路径，给药时间，所采用的具体化合物的***速率，治疗持续时间，与所采用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗患者的年龄、性别、体重、病情、一般健康状况和既往病史以及医学领域熟知的类似因素。
药物组合物可以通过任何适合的途径和方式给予，包括：用于预防性和/或治疗性治疗的胃肠外、局部、口服或鼻内手段。在一个实施例中，胃肠外地给予本发明的药物组合物。如在此使用的短语“胃肠外给药(parenteral administration)”和“胃肠外地给药(administered parenterally)”意指除肠内和局部给药之外的给药方式，通常是通过注射，并且包括表皮、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、腱内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、颅内、胸腔内、硬膜外以及胸骨内注射和输注。
另外的适合的在体内和在体外给予本发明化合物的途径在本领域是熟知的并且可以由本领域的普通技术人员进行选择。
在一个实施例中，通过静脉内或皮下注射或输注给予该药物组合物。
药学上可接受的载体包括任何和所有适合的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂、抗氧化剂和吸收延迟剂以及可与本发明的化合物生理上兼容的类似物。
可以用于本发明的药物组合物中的适合的水性和非水性载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇、右旋糖、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、以及类似物)、以及其适合的混合物、植物油(如橄榄油、玉米油、花生油、棉籽油、以及芝麻油)、羧甲基纤维素胶体溶液、黄蓍胶以及可注射的有机酯(例如油酸乙酯)和/或各种缓冲剂。在药物领域中其他载体是熟知的。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉剂。使用此类介质和试剂用于药物活性物质在本领域是已知的。除了在任何常规介质或试剂与活性化合物不兼容的情况下，考虑了其在本发明药物组合物中的使用。
可例如通过使用包衣材料如卵磷脂，通过维持所需的颗粒大小(在分散剂的情况下)和通过使用表面活性剂，来维持适当的流动性。
本发明的药物组合物还可以包含药学上可接受的抗氧化剂，例如(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本发明的药物组合物还可以在组合物中包含等渗剂，如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇、甘油)或氯化钠。
本发明的药物组合物还可以含有一种或多种适用于所选给药途径的佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、防腐剂或缓冲剂，这些试剂可以增强药物组合物的保质期或有效性。本发明的化合物可以与载体一起制备，这些载体可以保护化合物免于被快速释放，如控释配制品，包括植入物、透皮贴剂和微囊化递送***。此类载体可以包括明胶、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、可生物降解的生物兼容聚合物(如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸)(单独的或与蜡一起)或本领域熟知的其他材料。用于制备此类配制品的方法通常是本领域普通技术人员已知的。参见例如，Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems[缓释和控释递药***]，J.R.Robinson编辑，马歇尔德克公司(Marcel Dekker,Inc.)，纽约，1978。
在一个实施例中，可以将本发明的化合物配制成确保在体内恰当分布。用于胃肠外给药的药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉剂。使用此类介质和试剂用于药物活性物质在本领域是已知的。除了在任何常规介质或试剂与活性化合物不兼容的情况下，考虑了其在本发明药物组合物中的使用。还可以将补充活性化合物掺入组合物中。
注射用药物组合物通常在生产和保存条件下典型地必须是无菌且稳定的。可以将组合物配制为溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适合的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯(如油酸乙酯)的水性或非水性溶剂或分散介质。可以例如通过使用包衣材料(如卵磷脂)，通过维持所需的粒度(在分散体的情况下)和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选的是在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘油、甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟抗体吸收的试剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来实现。无菌可注射溶液可以通过按需要将所需量的活性化合物与一种例如像上文列举的成分或成分的组合掺在适当溶剂中，随后灭菌微孔过滤来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备分散体，该无菌载体含有基础分散介质和例如来自上文列举的那些的其他所需成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，这从其之前的无菌过滤溶液得到活性成分和任何另外的所希望成分的粉剂。
无菌可注射溶液可以通过按需要将所需量的活性化合物与一种上文列举的成分或成分的组合掺在适当溶剂中，随后灭菌微孔过滤来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备分散体，该无菌载体含有基础分散介质和来自上文列举的那些的其他所需成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，这从其之前的无菌过滤溶液得到活性成分和任何另外的所希望成分的粉剂。
调整在以上治疗方法和在此描述的使用中的剂量方案，以提供最佳期望应答(例如，治疗应答)。例如，可以给予单次推注，可以随时间给予若干分次剂量或者可以由治疗情况的紧迫性所指示的按比例减少或增加剂量。为了便于给药和剂量统一，胃肠外组合物可以被配制为剂量单位形式。本文使用的剂量单位形式是指适合作为单一剂量用于待治疗受试者的物理上离散的单位；每个单位含有经计算以产生与所需的药物载体组合产生期望的治疗效果的活性化合物的预定量。针对本发明的剂量单位形式的描述受指示于并且直接取决于(a)活性化合物的独特特征和待达到的具体治疗效果，以及(b)在复合这样的活性化合物以在个体中获得灵敏治疗的领域中固有的限制。
针对本发明的抗体或其表位结合片段的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病症，并且可以由本领域的普通技术人员确定。在给予一个剂量的任何给定日，该剂量的范围可以是从约0.0001mg/kg至约100mg/kg、并且更通常是从约0.01mg/kg至约5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg体重范围内。因此示例性剂量包括：从约0.1至约10mg/kg/体重、从约0.1至约5mg/kg/体重、从约0.1至约2mg/kg/体重、从约0.1至约1mg/kg/体重，例如约0.15mg/kg/体重、约0.2mg/kg/体重、约0.5mg/kg/体重、约1mg/kg/体重、约1.5mg/kg/体重、约2mg/kg/体重、约5mg/kg/体重、或约10mg/kg/体重。
具有本领域普通技术的医师可以容易地确定并且开出所需药物组合物的有效量。例如，该医师可以按低于用以实现所希望的治疗效果所需的水平，起始用于药物组合物中的本发明的抗体或其表位结合片段的剂量，并且逐渐增加剂量直到实现所希望的效果。一股而言，本发明组合物的适合的日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物量。这种有效剂量通常将取决于上述因素。给予可以是例如静脉内、肌内、腹膜内、或皮下。如果希望的话，药物组合物的有效日剂量可以在一整天以适当的时间间隔分开为两个、三个、四个、五个、六个或更多个子剂量来给予，任选地以单位剂型给予。虽然本发明的化合物可以单独给予，但是优选的是作为如上描述的药物组合物给予该化合物。
标记的本发明的抗体或其表位结合片段可以用于诊断目的以检测、诊断、或监测疾病或障碍。本发明提供了用于对神经退行性或认知疾病或障碍的检测或诊断，所述疾病或障碍包括但不限于阿尔茨海默病、嗜银颗粒痴呆(AGD)、进行性核上性麻痹(PSP)、以及皮质基底节变性(CBD)，该检测或诊断包括：(a)使用特异性地结合至τ蛋白的一种或多种抗体，测定焦谷氨酸化的Aβ片段在受试者细胞或组织样品中的存在；并且(b)将该抗原的水平与对照水平(例如，在正常组织样品中的水平)进行比较，借此相比于该抗原的对照水平而言该抗原的测定水平的增加指示该疾病或失调，或指示该疾病或失调的严重性。
本发明的抗体或其表位结合片段可以用于使用在本领域中熟知的免疫组织化学方法测定生物样品中的τ蛋白或τ蛋白片段。有用于检测蛋白质的其他基于抗体的方法包括免疫测定(如酶联免疫测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA))以及基于中型发现平台(mesoscale discoveryplatform)的测定(MSD)。适合的抗体标记可以用在此类试剂盒和方法中，并且本领域已知的标记包括酶标记，如碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶；放射性同位素标记，如碘(125I、131I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(121In)和锝(99mTc)；和发光标记，例如鲁米诺和荧光素酶；和荧光标记，例如荧光素和罗丹明。
可以在体内检测经标记的抗τ蛋白抗体或其τ蛋白结合片段的存在，以用于诊断目的。在一个实施例中，诊断包括：a)向受试者给予有效量的这种经标记分子；b)在给予之后等待一个时间间隔，以允许经标记的分子在Aβ沉积位点(如果有的话)浓缩，并且以允许未结合的经标记的分子被清除至背景水平；c)测定背景水平；并且d)检测受试者中经标记的分子，使得对超过背景水平的经标记的分子的检测指示受试者患有该疾病或障碍，或者指示该疾病或障碍的严重性。根据这样的实施例，用成像部分标记分子，该成像部分适于使用本领域的普通技术人员已知的具体成像***进行检测。背景水平可以通过本领域已知的多种方法测定，包括将检测到的标记抗体的量与先前针对具体成像***测定的标准值进行比较。可以用于本发明诊断方法的方法和***包括但不限于计算机断层术(CT)、全身扫描如正电子发射断层术(PET)、磁共振成像(MRI)以及超声检查。
在一个另外的方面，本发明提供了一种如在此定义的单克隆抗体或其表位结合片段，用于在疗法中使用。
在一个另外的方面，本发明提供了一种如在此定义的单克隆抗体或其表位结合片段，用于在τ蛋白病变的治疗、诊断或成像中使用。
在一个另外的方面，本发明提供了一种如在此定义的单克隆抗体或其表位结合片段，用于在治疗阿尔茨海默病、嗜银颗粒痴呆(AGD)、进行性核上性麻痹(PSP)、以及皮质基底节变性(CBD)中使用。
在一个另外的方面，本发明提供了一种如在此定义的单克隆抗体或其表位结合片段，用于在制造一种用于对τ蛋白病变进行治疗、诊断或成像的药剂中使用。
优选地，该药剂是用于治疗阿尔茨海默病(AD)、嗜银颗粒痴呆(AGD)、进行性核上性麻痹(PSP)、以及皮质基底节变性(CBD)，最优选阿尔茨海默病(AD)。该药物还优选用于治疗精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；因AD导致的情感冷漠或患有AD的患者中的情感冷漠；以及患有路易体痴呆症的患者的精神病症状。
在一个另外的方面，本发明提供了一种在受试者中对阿尔茨海默病或其他τ蛋白病变进行治疗、诊断或成像的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的如在此定义的药剂单克隆抗体或其表位结合片段。
在一个优选实施例中，该治疗是长期的，优选持续至少2周，例如至少持续1个月、6个月、1年或更久。
在一个另外的方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包括如在此定义的用于在疗法中使用的抗体或其片段。
实施例列表
1.一种单克隆抗体或其表位结合片段，能够特异性地结合至人类τ蛋白(SEQ IDNO:1)的磷酸化残基396，这样使得当残基396未被磷酸化时，该抗体或其表位结合片段基本上不结合至在残基404处磷酸化的SEQ ID NO:1。
2.根据实施例1所述的单克隆抗体或其表位结合片段，抑制在液相抑制测试中的AD-P3，这样使得该单克隆抗体或其表位结合片段具有100nM或更小的IC50，例如从0.1nM至100nM，例如在50nM或更低的浓度下，例如从0.1nM至50nM。
3.根据实施例1或2中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其中根据对阿尔茨海默病脑提取物的免疫耗减研究后pS396τ蛋白的蛋白质印迹信号，能够从阿尔茨海默脑匀浆物中以约75ng的抗体去除至少15％的在丝氨酸396处磷酸化的τ蛋白。
4.一种单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32；SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:34；SEQ ID NO:35；SEQ ID NO:36；SEQ ID NO:37；SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:40；和SEQ ID NO:46；
(b)轻链CDR2，其包括SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:41；和SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其包括SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:42；和SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其包括SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:43；SEQ ID NO:49；SEQ ID NO:52；和SEQ ID NO:55的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:28；SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:44；SEQ ID NO:50；SEQ ID NO:53；和SEQ ID NO:56；以及
(f)重链CDR3，其包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:39；SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:51；SEQ ID NO:54；和SEQ ID NO:57。
5.一种单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)选自下组的轻链，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:16；SEQ IDNO:17；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22和SEQID NO:23；以及
(b)选自下组的重链，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:13；SEQ IDNO:14；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:26；和SEQ ID NO:27。
6.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其中
(a)该轻链是SEQ ID NO:12；并且
(b)该重链选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26以及SEQ ID NO:27。
7.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其中
(a)该轻链选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:17；SEQ IDNO:18；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；并且
(b)该重链是SEQ ID NO:11。
8.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列，以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
9.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；
(b)重链，其包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
10.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括以下各项中的至少一个
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列，以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
11.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
12.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
13.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括以下各项中的至少一个
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
14.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
15.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
16.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括以下各项中的至少一个
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
17.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
18.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
19.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；以及
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
20.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
21.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
22.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
23.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
24.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
25.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
26.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
27.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
28.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
29.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
30.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
31.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
32.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
33.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列；
(b)重链，其包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
34.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
35.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
36.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
37.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
38.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
39.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
40.根据实施例4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
41.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
42.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
43.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括以下各项中的至少一个
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
44.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
45.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(b)重链，其包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
46.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
47.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
48.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
49.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列；和
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
50.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
51.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(b)重链，其包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
52.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
53.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
54.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列；
(b)重链，其包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
55.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列；和
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
56.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
57.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
58.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列；和
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；和
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
59.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
60.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
61.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列；和
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括以下各项中的至少一个
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
62.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
63.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
64.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
65.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
66.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
67.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括：
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
68.根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
69.根据实施例1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
70根据实施例1或4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；和
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
并且进一步包括
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列；和
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
71.根据实施例1至5中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其针对过度磷酸化τ蛋白的氨基酸基序具有选择性，该过度磷酸化τ蛋白的基序包括由单个残基分隔的磷酸化丝氨酸残基和酪氨酸残基。
72.根据实施例71所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其中该氨基酸基序具有以下序列：
-Y-X-S(磷酸化)-P-
其中Y是酪氨酸，X是天然存在的氨基酸，P是脯氨酸，并且S(磷酸化)是具有磷酸化羟基侧链的丝氨酸。
73.根据前述实施例中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，包括Fc区。
74.根据前述实施例中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，进一步包括用于增加药剂(agent)在体内半衰期的部分。
75.根据前述实施例中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，根据以下测试准则其特异性地结合至包括磷酸化残基396的人类τ蛋白：i)该抗体基本上不结合至非磷酸化τ蛋白；ii)当396未被磷酸化时，该抗体基本上不结合至在404处磷酸化的τ蛋白；iii)该抗体确实结合至在396处磷酸化的τ蛋白；以及iv)当396和404二者均是磷酸化时，该抗体确实结合至τ蛋白。
76.根据前述实施例中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，针对双磷酸化肽而被引发，该双磷酸化肽包含覆盖2N4Rτ蛋白的残基386-408的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:2)之内的至少18个连续的氨基酸残基，例如至少20个连续的氨基酸残基。
77.根据实施例76所述的单克隆抗体或其表位结合片段，针对双磷酸化肽而被引发，该双磷酸化肽包含18-40个，例如18-30个，例如20-30个连续的氨基酸残基，这些连续的氨基酸残基包含覆盖2N4Rτ蛋白的残基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ IDNO:2)。
78.根据实施例1至70中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，具有超过年龄匹配健康对照的、对于来自AD患病患者的磷酸化τ蛋白(pτ)的特异性，从而使得所述单克隆抗体或其表位结合片段具有对于来自AD患病患者的磷酸化τ蛋白(pτ)超过对于来自年龄匹配健康对照的τ蛋白的大于50倍的特异性差异，例如，与健康对照材料相比，对于AD疾病材料的特异性具有大于100倍的增加，上述是在基于ELISA的测定中，使用磷酸化-和多聚体-特异性设置1ELISA在来自AD和来自健康对照受试者的脑匀浆物中检测磷酸化τ蛋白(pτ)。
79.根据实施例78所述的单克隆抗体或其表位结合片段，具有对于AD患病τ蛋白的特异性，从而使得所述单克隆抗体或其表位结合片段具有对于AD超过对于年龄匹配健康对照的多于50倍的特异性差异，例如，与健康对照材料相比，对于AD疾病材料的特异性具有大于100倍的增加，上述是在基于ELISA的测定中，使用磷酸化-和多聚体-特异性设置1ELISA在来自AD和来自健康对照受试者的脑匀浆物中检测磷酸化τ蛋白(pτ)。
80.根据实施例1至70中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，针对以下双磷酸化肽而被引发：
覆盖2N4Rτ蛋白的残基386-410的TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(SEQ ID NO:2)，或其表位结合片段，能够特异性地结合至人类τ蛋白的磷酸化残基396。
81.根据实施例1至70中任一项所定义的抗体或其表位结合片段，其已经在细胞系中被产生或制造，该细胞系例如是人类细胞系、非人类哺乳动物细胞系、昆虫细胞系、酵母细胞系或细菌细胞系，或通过重组技术进行产生或制造。
82.根据实施例81所述的抗体或其表位结合片段，在CHO细胞系、HEK细胞系、BHK-21细胞系、鼠类细胞系(例如骨髓瘤细胞系)、纤维肉瘤细胞系、PER.C6细胞系、HKB-11细胞系、CAP细胞系以及HuH-7人类细胞系中产生。
83.根据实施例1至70中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其中所述单克隆抗体是由杂交瘤表达，该杂交瘤是通过用人类病理性τ蛋白和非病理性τ蛋白筛选杂交瘤以分离以下克隆来分离的，这些克隆i)特异性地针对磷酸化表位S396，并且ii)特异性地识别来自人类阿尔茨海默病脑的过度磷酸化τ蛋白，其中所述抗体或其表位结合片段能够在病理性人类τ蛋白和非病理性人类τ蛋白之间区分。
84.根据实施例1至70中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其中该抗体或其表位结合片段进一步包括可检测部分。
85.根据实施例84所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其中该可检测部分是荧光标记、化学发光标记、顺磁性标记、放射性同位素标记或酶标记。
86.一种制品，其包括如实施例1至70中任一项所定义的抗体或其表位结合片段，其中所述制品基本上不含天然产生的抗体，这些天然产生的抗体不能结合至τ蛋白或不实质性地改变该制品的抗-τ蛋白功能，其中所述功能选自下组，该组由以下各项组成：
(i)基本上不能结合至非磷酸化τ蛋白；
(ii)基本上不能结合至在S404处磷酸化且在S396处非磷酸化的τ蛋白；
(iii)能够结合至在S396处磷酸化的τ蛋白；
(iv)能够结合在S396和S404二者处均磷酸化的τ蛋白；
(v)能够选择性地在磷酸化τ蛋白残基S396和S404之间区分，使得该制品基本上不能结合该磷酸化404残基或使得该制品优先结合至S396；
(vi)能够结合来自人类阿尔茨海默病脑的过度磷酸化τ蛋白；
(vii)能够在病理性人类τ蛋白和非病理性人类τ蛋白之间区分；和/或
(viii)当如在实例中描述的与来自转基因小鼠的经免疫耗减的rTg4510提取物一起使用时，能够特异性地将过度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa条带减少至少90％，同时没有将55kDaτ蛋白条带减少多于10％。
87.一种制品，其包括由实施例1至70所定义的抗体或其表位结合片段，其中相对于天然存在的抗τ蛋白抗体的结构，所述抗体或所述其表位结合片段在其氨基酸序列方面具有结构改变，其中所述结构改变导致所述抗体或所述片段展现出相对于由所述天然存在的抗τ蛋白抗体展现出的功能而言改变的功能，其中所述功能选自下组，该组由以下各项组成：
(i)基本上不能结合至非磷酸化τ蛋白；
(ii)基本上不能结合至在S404处磷酸化且在S396处非磷酸化的τ蛋白；
(iii)能够结合至在S396处磷酸化的τ蛋白；
(iv)能够结合至在S396和S404二者处均磷酸化的τ蛋白；
(v)能够选择性地在磷酸化τ蛋白残基S396和S404之间区分，使得该制品基本上不能结合该磷酸化404残基或使得该制品优先结合至S396；
(vi)能够结合来自人类阿尔茨海默病脑的过度磷酸化τ蛋白；
(vii)能够在病理性人类τ蛋白和非病理性人类τ蛋白之间区分；和/或
(viii)当如在此所述的与来自转基因小鼠的经免疫耗减的rTg4510提取物一起使用时，能够特异性地将过度磷酸化τ蛋白64kDa和70kDa条带减少至少90％，同时没有将55kDaτ蛋白条带减少多于10％。
88.一种药物组合物，其包括在实施例1至70中的任一项中所定义的单克隆抗体或其表位结合片段，或根据实施例86至87中任一项所述的制品，以及药学上可接受的载体。
89.一种核酸，其编码根据实施例1至70中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段或者编码其组成链。
90.在实施例1至70中的任一项中所定义的单克隆抗体或其表位结合片段、或根据实施例86至87中任一项所述的制品、或如实施例88所述的药物组合物，用于在疗法中使用。
91.根据实施例1至70中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段、或根据实施例86至87中任一项所述的制品、或如实施例88所述的药物组合物，用于在τ蛋白病变的治疗、诊断或成像中使用。
92.根据实施例1至70中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段、或根据实施例86至87中任一项所述的制品、或如实施例88所述的药物组合物，用于在治疗选自下组的τ蛋白病变中使用，该组由以下各项组成：阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；因AD导致的情感冷漠或患有AD的患者中的情感冷漠；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；皮克病，原发性年龄相关性τ蛋白病变(PART)；神经原纤维缠结为主型老年性痴呆；拳击员痴呆；慢性创伤性脑病；中风；中风恢复；与帕金森病相关的神经变性；与染色体关联的帕金森综合征；利缇可-伯蒂格病(关岛型帕金森病-痴呆复合征)；神经节胶质瘤和神经节细胞瘤；脑膜血管瘤病；脑炎后帕金森综合征；亚急性硬化性全脑炎；亨廷顿氏病；铅中毒脑病；结节性硬化症；哈勒沃登-施帕茨病以及脂褐质沉积症。
93.根据实施例1至70中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，用于在治疗阿尔茨海默病中使用。
94.根据实施例1至70中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段、或根据实施例86至87中任一项所述的制品、或如实施例88所述的药物组合物，用于制造对τ蛋白病变进行治疗、诊断或成像的药剂中的用途。
95.根据实施例1至70中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段、或根据实施例86至87中任一项所述的制品、或如实施例88所述的药物组合物，在作为用于治疗选自下组的疾病的药物而使用，该组由以下各项组成：阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；因AD导致的情感冷漠或患有AD的患者中的情感冷漠；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；皮克病；原发性年龄相关性τ蛋白病变(PART)；神经原纤维缠结为主型老年性痴呆；拳击员痴呆；慢性创伤性脑病；中风；中风恢复；与帕金森病相关的神经变性；与染色体关联的帕金森综合征；利缇可-伯蒂格病(关岛型帕金森病-痴呆复合征)；神经节胶质瘤和神经节细胞瘤；脑膜血管瘤病；脑炎后帕金森综合征；亚急性硬化性全脑炎；亨廷顿氏病；铅中毒脑病；结节性硬化症；哈勒沃登-施帕茨病以及脂褐质沉积症。
96.一种在受试者中对阿尔茨海默病或其他τ蛋白病变进行治疗、诊断或成像的方法，所述方法包括向所述受试者给予治疗有效量的根据实施例1至70中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，根据实施例86至87中任一项所述的制品，或如实施例88所述的药物组合物。
97.根据实施例96所述的方法，其中该治疗是长期的。
98.根据实施例97所述的方法，其中该长期的治疗持续至少2周，例如至少持续1个月，至少持续6个月，或至少持续1年。
99.根据实施例96至98中任一项所述的方法，其中该受试者是人类。
100.一种试剂盒，该试剂盒包含根据实施例1-70中任一项所述的抗体或其片段、根据实施例86至87中任一项所述的制品、或根据实施例88所述的药物组合物，用于在疗法中使用。
101.如实施例1至70所述的单克隆抗体或其表位结合片段，或包括所述抗体或片段的制品或药物组合物，用于检测或测量所述τ蛋白在受试者的脑中的存在或量中。
102.根据实施例88所述的单克隆抗体或其表位结合片段、制品或药物组合物，其中所述检测或测量包括对结合至所述τ蛋白的所述抗τ蛋白抗体进行体内成像。
103.根据实施例99至100所述的单克隆抗体或其表位结合片段、制品或药物组合物，其中所述检测或测量包括对结合至所述τ蛋白的所述抗τ蛋白抗体或其所述片段进行体外成像。
104.一种从缠结(tangle)中去除至少90％的过度磷酸化τ蛋白的方法，所述缠结包括过度磷酸化τ蛋白，所述方法包括用单克隆抗体或其表位结合片段接触过度磷酸化τ蛋白，所述抗体或其表位结合片段针对具有磷酸化残基396的τ蛋白具有选择性并且如在实施例1至70中的任一项中所定义。
105.一种延迟患者中阿尔茨海默病的进展的方法，所述方法包括通过给予单克隆抗体或其表位结合片段，从而减少或衰减所述患者中的病理性τ蛋白的积累，所述抗体或其表位结合片段针对具有磷酸化残基396具有选择性并且如在实施例1至70中的任一项中所定义。
106.一种药物组合物，该药物组合物包含i)根据实施例1-70并且特别是实施例17、18、44或45所述的τ蛋白抗体，以及ii)选自下组的化合物，该组由以下各项组成
a)BACE抑制剂；
b)在主动或被动τ蛋白免疫疗法中有用的化合物；
c)在主动或被动Aβ肽免疫疗法中有用的化合物；
d)NMDA受体拮抗剂；
e)另外的τ蛋白聚集抑制剂；
e)乙酰胆碱酯酶抑制剂；
f)抗癫痫药；
g)抗炎药；和
h)SSRI；以及
iii)一种或多种药学上可接受的赋形剂。
107.一种治疗阿尔茨海默病、降低AD的进程或减少AD的症状的方法，该方法包括疗法，该疗法包括给予i)根据实施例1-70并且特别是实施例17、18、44或45所述的τ蛋白抗体，以及ii)选自下组的化合物，该组由以下各项组成
a)BACE抑制剂；
b)在主动或被动τ蛋白免疫疗法中有用的化合物；
c)在主动或被动Aβ肽免疫疗法中有用的化合物；
d)NMDA受体拮抗剂；
e)另外的τ蛋白聚集抑制剂；
e)乙酰胆碱酯酶抑制剂；
f)抗癫痫药；
g)抗炎药；和
h)SSRI。
108.一种试剂盒，该试剂盒包括i)包含根据实施例1-70并且特别是实施例17、18、44或45所述的τ蛋白抗体的组合物，以及ii)包含选自下组的化合物的组合物，该组由以下各项组成
a)BACE抑制剂；
b)在主动或被动τ蛋白免疫疗法中有用的化合物；
c)在主动或被动Aβ肽免疫疗法中有用的化合物；
d)NMDA受体拮抗剂；
e)另外的τ蛋白聚集抑制剂；
f)乙酰胆碱酯酶抑制剂；
g)抗癫痫药；
h)抗炎药；以及
i)抗抑郁药。
109.根据权利要求106所述的组合物、根据权利要求107所述的方法、根据权利要求108所述的试剂盒，其中所述BACE1抑制剂是选自下组的小分子BACE I抑制剂，该组由以下各项组成：LY2886721、MK-8931、AZD3293或E2609。
110.根据权利要求106所述的组合物、根据权利要求107所述的方法、根据权利要求108所述的试剂盒，其中所述BACE1抑制剂具有化学式I
其中Ar选自下组，该组由以下各项组成：苯基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基，并且其中Ar任选地被一个或多个选自卤素、CN、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6氟烷基或C1-C6烷氧基的取代基取代；并且R1是一个或多个氢、卤素、C1-C3氟烷基或C1-C3烷基；并且R2代表氢或氟。
111.根据权利要求110所述的组合物、方法或试剂盒，其中具有化学式I的化合物选自下组，该组由以下各项组成
112.根据权利要求106所述的组合物、根据权利要求107所述的方法、根据权利要求108所述的试剂盒，其中所述BACE1抑制剂具有化学式II
其中Ar选自下组，该组由以下各项组成：苯基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、吡唑基、1,2,4-***基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、1,3,4-噻二唑基、异噻唑基、1,3,4-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、呋咱基(furazanyl)和1,2,4-噻二唑基，并且其中该Ar任选地被一个或多个卤素、CN、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6氟烷基或C1-C6烷氧基取代；R1是C1-C3烷基或C1-C3氟烷基；R2是氢、卤素、C1-C3氟烷基或C1-C3烷基；并且R3是C1-C3烷基。
113.根据权利要求106所述的化合物、根据权利要求107所述的方法、根据权利要求108所述的试剂盒，其中所述BACE1抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：N-(3-((2R,5S)-6-氨基-3,3,5-三氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4氟苯基)-5-氟吡啶酰胺；N-(3-((2R,5S)-6-氨基-3,3,5-三氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4氟苯基)-5-甲氧基吡嗪-2-甲酰胺；N-(3-((2R,5S)-6-氨基-3,3,5-三氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡啶酰胺；N-(3-((2R,5S)-6-氨基-3,3,5-三氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4氟苯基)-5-氰基-3-甲基吡啶酰胺；以及N-(3-((2R,5R)-6-氨基-3,3,5-三氟-2,5-二甲基-2,3,4,5-四氢吡啶-2-基)-4氟苯基)-5-(二氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺。
114.根据权利要求106所述的组合物、根据权利要求107所述的方法、根据权利要求108所述的试剂盒，其中所述NMDA受体拮抗剂选自下组，该组由以下各项组成：美金刚(Memantine)、钠门达(Namenda)、Namzaric(美金刚/多奈哌齐)，以及其类属形式(genericform)。
115.根据权利要求106所述的组合物、根据权利要求107所述的方法、根据权利要求108所述的试剂盒，其中所述乙酰胆碱酯酶抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：多奈哌齐(Donepezil)、加兰他敏(Galantamine)以及利凡斯的明(Rivastigmine)。
116.根据权利要求106所述的组合物、根据权利要求107所述的方法、根据权利要求108所述的试剂盒，其中所述抗抑郁药选自下组，该组由以下各项组成：依他普仑(Escitalopram)、舍曲林(Sertraline)、西酞普兰(Citalopram)、帕罗西汀(Paroxetine)、氟西汀(Fluoxetine)、文拉法辛(Venlafaxine)、曲唑酮(Trazodone)、米氮平(Mirtazapine)、沃替西汀(Vortioxetine)，以及其类属形式。
117.根据权利要求106所述的组合物、根据权利要求107所述的方法、根据权利要求108所述的试剂盒，用于在治疗选自下组的τ蛋白病变中使用，该组由以下各项组成：阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；皮克病；原发性年龄相关性τ蛋白病变(PART)；神经原纤维缠结为主型老年性痴呆；拳击员痴呆；慢性创伤性脑病；中风；中风恢复；与帕金森病相关的神经变性；与染色体关联的帕金森综合征；利缇可-伯蒂格病(关岛型帕金森病-痴呆复合征)；神经节胶质瘤和神经节细胞瘤；脑膜血管瘤病；脑炎后帕金森综合征；亚急性硬化性全脑炎；亨廷顿氏病；铅中毒脑病；结节性硬化症；哈勒沃登-施帕茨病以及脂褐质沉积症。
118.根据权利要求106所述的组合物、根据权利要求107所述的方法、根据权利要求108所述的试剂盒，用于制造对τ蛋白病变进行治疗、诊断或成像的药剂中的用途。
119.根据权利要求106所述的组合物、根据权利要求107所述的方法、根据权利要求108所述的试剂盒，用于治疗阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；进行性核上性麻痹(PSP)；皮质基底节变性(CBD)；因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；以及患有路易体痴呆症的患者的精神病症状。
实例
实例1：用τ蛋白磷酸化肽396/404免疫小鼠
将C56/BL6和FVB小鼠用在TiterMax佐剂中配制的10μg P30缀合的磷酸化τ蛋白肽386-408(pS396/pS404)(SEQ ID NO:2)进行免疫。
将小鼠(C56/BL6和FVB品系，雌性和雄性，2至3月龄小鼠)用缀合肽表位P30的磷酸化τ386-408进行免疫。
遵循TiterMax/供应商方案，将缀合免疫原性P30的磷酸化τ386-408(pS396/pS404)肽配制于TiterMax(400μg/ml肽，以1:1vol:vol混合)中，并且将小鼠皮下注射20μg抗原肽(100μl)。对于对照小鼠仅注射佐剂。将所有用肽免疫的小鼠用0.5μg肽/Titermax(10μg/ml肽，如上所述配制并且注射)以隔月进行强化。在不用Titermax的情况下，将小鼠用P30缀合的磷酸化τ蛋白386-408(pS396/pS404)进行强化，3天后收获脾细胞，将这些脾细胞与SP-2细胞融合。如通过ELISA检测展示阳性结合至磷酸化τ蛋白386-408(pS396/pS404)，并且展示出优先结合至来自AD和TG4510脑裂解物的S1和P3抗原的活性后，选择生成的原代杂交瘤用于再克隆循环(描述于以下实例2B中)。使用斑点印迹和脑裂解物包被的ELISA或MSD板，将这种结合与此类抗体结合到来自对照的脑裂解物的活性进行比较。
实例2A：杂交瘤产生
在不用Titermax的情况下，将小鼠用P30缀合的磷酸化τ蛋白386-408(pS396/pS404)进行强化，3天后从对应的小鼠的脾脏中收获脾细胞，将这些脾细胞用SP-2细胞融合。在通过ELISA检测阳性结合至磷酸化τ蛋白386-408(pS396/pS404)后，并且在使用斑点印迹和脑裂解物包被的ELISA或MSD板相比于来自对照的脑裂解物，优选的与来自AD和TG4510脑裂解物的S1和P3抗原的结合活性后，选择杂交瘤用于再克隆循环。
实例2B：特异性抗体的蛋白质印迹和斑点印迹分析
τ蛋白生物化学分级
将来自过表达人类τ蛋白突变P301L的人类或rTg4510小鼠的脑组织匀浆化于10个体积的如下包含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的Tris-缓冲盐水中：50mM Tris/HCl(pH7.4)；274mM NaCl；5mM KCl；1％蛋白酶抑制剂混合物(罗氏公司(Roche))；1％磷酸酶抑制剂混合物I和II(西格玛公司(Sigma))；以及1mM苯甲基磺酰氯(PMSF；西格玛公司(Sigma))。在4℃下，将匀浆物在27,000x g下离心20分钟，以获得上清液(S1)和沉淀部分。将沉淀重新匀浆化于5个体积的高盐/蔗糖缓冲液(0.8M NaCl、10％蔗糖、10mM Tris/HCl[pH 7.4]、1mMEGTA、1mM PMSF)中，并且如上离心。将上清液收集并且与肌氨酰(1％最终浓度；西格玛公司(Sigma))在37℃一起孵育一小时，随后在150,000x g下4℃离心一小时，以获得肌氨酰不可溶的沉淀，在此称为P3部分。将P3沉淀重悬浮于TE缓冲液(10mM Tris/HCl[pH 8.0]、1mMEDTA)中到一个体积，该体积相当于对于脑匀浆所使用的原始体积的一半。
蛋白质印迹和斑点印迹
将分级的组织提取物S1和P3溶解于含有0.1M DTT的SDS-样品缓冲液中。将经热处理的样品(95℃持续10分钟)通过在4％-12％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶(英杰公司(Invitrogen))上的凝胶电泳进行分离，并且转移到PVDF膜(BioRad Laboratories[伯乐实验室]，赫拉克勒斯(Hercules)，加利福尼亚州)上。将斑点印迹样品以跨样品已知的浓度直接点样到硝酸纤维素膜(Amersham，匹兹堡，宾夕法尼亚州)上。将蛋白质印迹和斑点印迹膜在TBS-Tween(0.5％)pH 7.4中的5％脱脂奶粉中封闭，随后在1μg/ml的C10-2中于4℃孵育过夜。将膜进行洗涤，并且与缀合过氧化物酶的抗小鼠IgG一起孵育(1:5000；杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)，美国宾夕法尼亚州西格罗夫(West Grove，PA))。使用增强的化学发光***(ECL PLUS试剂盒；珀金埃尔默(PerkinElmer))检测结合的抗体。使用连接计算机的LAS-4000生物成像分析仪***(富士胶片(Fujifilm)，东京，日本)和MultiGauge v3.1软件(富士胶片)进行蛋白质印迹和斑点印迹免疫反应性的定量和视觉分析。将蛋白加载通过原始部分的体积进行调节，并且可以转化为原始的组织湿重。
实例3.用于AD-P3捕获的液相抑制分析
实例3A的目的：为了量化在AD-P3脑材料中结合至pS396τ蛋白抗原的人类C10-2和突变的变体对鼠类C10.2的抑制。将MSD板用小鼠C10-2包被，然后用利用感兴趣的C10.2变体预孵育的AD-P3或AD-P3孵育。抑制的程度被表示为IC50值，反映液相抗体结合至抗原的表观亲和力。通过使用Graph Pad Prism软件拟合到一个或两个位点结合模型获得IC50值。加入与P(404)τ蛋白反应的阴性对照抗体(小鼠C10-1)进行比较(数据未显示)。
方法：在室温下，将MSD板用捕获抗体(在碳酸盐缓冲液pH 8.5中的750ng/ml鼠类C10-2)包被过夜，随后封闭(30分钟在PBS中，3％BSA，0.1％NP40)，并且洗涤5次(PBS，0.1％BSA，0.1％NP40)。如以上的描述，在室温下，将成梯度浓度(0-1000nM)的抗体与AD-P3材料孵育60分钟，并且随后在室温下在包被小鼠C10-2的MSD板中孵育1小时。将板洗涤5次(在PBS中，0.1％BSA，0-.1％NP40)，并且添加抗人类总τ蛋白(MSD硫标记1:50)以检测捕获的τ蛋白，后者反映了不受抑制的游离τ蛋白抗原。
结果：数据显示使用人类C10-2和变体(图1)的τ蛋白捕获的剂量依赖性抑制。变体C10-2_N32S和C10-2_N32S:A101T抑制更强(IC50分别＝44nM和14nM，拟合至一个位点结合模型)，然而C10-2示出由最佳拟合至两位点结合模型(IC50 14nM/630nM)反映的非均质的抑制。该低亲和力结合(IC50＝630)是主要的，因为高亲和力抗体结合(IC50＝14nM)占总结合的少于25％。结果在图1中示出。
实例3B的目的：为了在液相抑制分析中量化人类C10-2和突变的变体结合pS396τ蛋白386-408肽的抑制。抑制的程度被表示为反映抗体结合的表观亲和力的IC50值。通过使用Graph Pad Prism软件拟合到一个或两个位点结合模型获得IC50值。加入与P(404)τ蛋白反应的阴性对照抗体(小鼠C10-1)进行比较(数据未显示)。
方法：在室温下，将MSD板用在碳酸盐缓冲液(pH 9.5)中的pS396τ蛋白386-408肽包被过夜，随后封闭(在PBS、3％BSA、0.1％NP40中，30分钟)，并且洗涤5次(PBS，0.1％BSA，0.1％NP40)。如以上的描述，在室温下，将成梯度浓度(0-1000nM)的pS396τ蛋白386-408与1ng/ml抗体孵育60分钟，并且随后在室温下，在包被有pS396τ蛋白386-408的MSD板中孵育1小时。将板洗涤5次(在PBS 0.1％BSA，0.1％NP40中)，并且添加抗人类总τ蛋白(MSD硫标记1:50)，以检测结合抗体，后者反映了不受抑制的游离抗体。结果在图2中示出。
实例4.抗体的免疫组织化学谱
组织
小鼠：从8个月龄rTg4510小鼠中收集小鼠脑组织。这些转基因小鼠表达在CamK2阳性神经元中在tet-off响应元件下的人类突变的τ蛋白(P301L 0N4R)，并且从6个月龄起显示出显著的τ蛋白过度磷酸化作用以及缠结形成。非转基因的同窝仔充当对照。通过浸入4％多聚甲醛中并且包埋在石蜡中，将小鼠脑固定。人类:从组织方案公司(TissueSolutions)(格拉斯哥，英国)获得***固定的石蜡包埋的人类额叶皮质的脑样品。将来自诊断患有末期阿尔茨海默病(AD；Braak阶段V-VI)的3个供体的组织与年龄匹配的非痴呆对照供体进行比较。
免疫组织化学：
在薄片切片机上切割小鼠和人类组织的4μm厚的切片，脱石蜡，并且通过在10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6)中微波处理切片10分钟，使其抗原修复。将内源性过氧化物酶用在PBS，1％BSA，0.3％Triton X-100(PBS-BT)中的1％过氧化氢随后是5％正常猪血清进行封闭。在图1中示出的浓度范围内，在4℃下，将切片与稀释于PBS-BT中的hC10-2、hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T抗体孵育过夜。将这些切片在PBS，0.25％BSA，0.1％TritonX-100中洗涤，之后与生物素酰化的二级猪抗人类抗体(#B1140；西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))以1:200孵育1小时。在另外的洗涤后，使用链霉亲和素-生物素复合物试剂盒(载体实验室(Vector Laboratories)，伯林盖姆(Burlingame)，加利福尼亚州)，并且最后用0.05％二氨基联苯胺使免疫反应性可视化。将这些切片用苏木精复染，以显示细胞核的位置。
结果
hC10-2、hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T标记的结构与在3个AD脑(即，缠结、神经毡线、营养不良性神经突)中的病理性τ蛋白一致。免疫反应性的强度是浓度依赖性的。没有检测出例如神经胶质细胞或血管的明显标记。在来自对照脑的切片中没有检测到免疫反应性。同样地，所有的3种抗体导致针对在rTg4510脑的海马体和皮质二者中的磷酸化τ蛋白的预期模式。在来自非转基因小鼠的脑切片中，没有检测出免疫反应性。
实例5.静脉内注射后在rTg4510小鼠的τ蛋白结构的修饰
方法
10个月龄的rTg4510小鼠。这些转基因小鼠表达在CamK2阳性神经元中在tet-off响应元件下的人类突变的τ蛋白(P301L0N4R)，并且自6个月龄起显示出显著的τ蛋白过度磷酸化作用以及缠结形成。另外，在10个月龄的rTg4510小鼠的具有强烈病变的区域中出现神经退行性变。单个转基因的tTA同窝仔充当对照。，该小鼠经尾静脉接受单次注射浓度为80mg/kg的hC10-2、hC10-2_N32S或hC10-2_N32S_A101T抗体。以150μL的体积注射每只小鼠。注射后3天，将小鼠用PBS灌注2分钟，随后用4％多聚甲醛灌注10分钟。将这些脑在30％蔗糖中低温保护，并且将其切成40微米自由浮动的冷冻切片。将这些切片用在PBS/1％BSA/0.3％Triton X-100中的5％正常猪血清孵育20分钟，在PBS中洗涤，并且最后与AlexaFluor488缀合的二级抗人类IgG以1:200(#709-545-149；杰克逊免疫研究实验室公司(Jackson ImmunoResearch Laboratories)，美国宾夕法尼亚州西格罗夫(West Grove，USA))进行孵育。用Hoechst核染色。将这些切片在PBS中洗涤，封片，并且通过荧光显微镜检术进行检测。
结果
hC10-2、hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T的静脉内注射导致体内结合至年老rTg4510小鼠脑中的海马体和皮质的靶结构(图4-7)。观察到的阳性结构的数量在个体rTg4510动物之间变化。在tTA对照小鼠中，注射三种抗体中任一者后，均没有检测到特异性荧光信号(图4-7)。作为阴性对照，rTg4510小鼠中注射对照人类IgG没有导致信号(数据未示出)。在rTg4510脑中的阳性信号没有容易地作为细胞内染色出现，并且可以代表在神经退行性变过程中释放的细胞外的τ蛋白物质。总体上，这些数据表明hC10-2、hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T抗体能够穿透脑薄壁组织，并且在体内特异性地修饰在rTg4510小鼠中的靶标。
实例6.阿尔茨海默病脑中的τ蛋白免疫反应性的表征
组织：
从组织方案公司(Tissue Solutions)(格拉斯哥，英国)获取石蜡包埋的人类额皮质的脑样品。将来自诊断患有末期阿尔茨海默病(AD；Braak阶段V-VI)的供体的组织包括在内。
免疫组织化学
在薄片切片机上切割4μm厚的人类组织的切片，脱石蜡，并且通过在10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6)中微波处理切片10分钟，使其抗原修复。将切片用在PBS，1％BSA，0.3％Triton X-100(PBS-BT)中的5％正常猪血清孵育过夜，随后在4℃下，与稀释于PBS-BT中的hC10-2或hC10-2_N32S_A101T抗体进行孵育。将这些切片在PBS，0.25％BSA，0.1％TritonX-100中洗涤。通过AlexaFluor488缀合的二级抗人类IgG(1:200；#709-545-149，杰克逊免疫研究实验室公司(Jackson ImmunoResearch Laboratories)，美国宾夕法尼亚州西格罗夫(West Grove，USA))将免疫反应性可视化。对于双免疫荧光，将切片与AT8(1:500；#MN1020，赛默飞世尔公司(ThermoFisher)，沃尔瑟姆，美国)或E1总人类τ蛋白抗体(针对N-端τ蛋白19-33产生的定做兔抗体(Crowe等人，1991))共孵育。将AT8和E1的免疫反应性分别用抗小鼠AlexaFluor568(1:400；#A10037，赛默飞世尔公司)和抗兔AlexaFluor568(1:400；#A10042，赛默飞世尔公司)可视化。通过荧光显微镜检术分析这些切片。
结果
在针对N-端总τ蛋白和pS396τ蛋白的双染色的AD切片中，通过E1以及hC10-2和hC10-2_N32S_A101T抗体标记了具有缠结神经元的群体(图7)。许多τ蛋白缠结是仅由hC10-2和hC10-2_N32S_A101T抗体标记的(图7，箭头)。细胞外的τ蛋白(血影缠结)先前已经示出没有被N-端τ蛋白抗体染色(例如，Bondareff等人，1990；Braak等人，1994；Flores-Rodrigues等人，2015)。因此，由单独地hC10-2或hC10-2_N32S_A101T抗体标记的τ蛋白种类可能代表细胞外的血影缠结(ghosttangle)。
蛋白质印迹和免疫沉淀反应
实验流程和实验描述
使用转基因的rTg4510小鼠：将具有P301L突变(4R0Nτ蛋白P301L)的人类τ蛋白cDNA置于四环素-操纵子-效应器(TRE)构建体的下游。为了激活转基因，该效应器必须与由四环素条件基因表达***(tTA)组成的激活剂构建体共表达。将该tTA激活剂***置于CaMKIIα启动子的下游，因此将TRE的表达主要限制至前脑结构。将该τ蛋白转基因效应器在FVB/N(Taconic)小鼠品系中表达，并且将该tTA激活剂***在129S6(Taconic)小鼠品系上保持。它们的F1子代携带效应器和激活剂转基因(rTg4510)连同非转基因的(非-tg)和单个转基因的同窝仔小鼠。仅使用F1小鼠用于实验。将所有的小鼠饲养在Taconic，丹麦，并且使用引物对的针对tTA激活剂转基因的5′-GATTAACAGCGCATTAGAGCTG-3′和5′-GCATATGATCAATTCAAGGCCGATAAG-3′以及针对突变τ蛋白效应器转基因的5′-TGAACCAGGATGGCTGAGCC-3′和5′-TTGTCATCGCTTCCAGTCCCCG-3′，通过尾部DNA的分析来进行基因分型。将小鼠分组笼养，并以随意量获得水和食物(Brogaarden，丹麦)以及浓缩物质。光/暗循环是12小时；室温是21℃±2℃，并且相对湿度是55％±5％。根据丹麦对实验动物的法律进行实验(许可证号2014-15-0201-00339)。
通过颈脱位将小鼠安乐死，以保护大脑的代谢环境，并且防止可能改变τ蛋白生物学特征的人为现象。将小鼠大脑在中线下对切为矢状，以产生两个半球。将每只动物右半球的大脑皮质和海马体在干冰上迅速冷冻并在-80℃下储存直至使用。来自阿尔茨海默病(AD)患者和年龄健康的对照(HC)供体的冷冻人类皮质是购自组织方案公司(TissueSolutions)(格拉斯哥，英国)。人脑标本具有相似的<6小时的死后处理时间，并且其特征为淀粉样蛋白和τ蛋白病变，并且将所选择的AD标本分类为Braak阶段V-VI。
为了免疫沉淀来自脑裂解物的τ蛋白，遵循制造商的说明书使用交联免疫沉淀反应(Crosslink Immunoprecipitation)试剂盒(Thermo Fisher Pierce 26147)。简言之，将抗体结合至蛋白A/G加琼脂糖，随后将结合的抗体与DSS(丁二酰亚胺辛二酸酯)交联。将脑匀浆在Tris缓冲液(25mM Tris/HCl pH 7.6，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，以及完整的蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物)中制备，并且在4℃下用对照琼脂糖树脂预澄清。在4℃下，将预澄清的裂解物与抗体交联的树脂孵育过夜，随后用50μl洗脱缓冲液(pH2.8)将抗原进行洗脱，并且立即离心至含有5μl 1M Tris，pH 9.5的收集管中。如下文描述的，将免疫沉淀的τ蛋白溶解于含有二硫苏糖醇(DTT，100mM)的SDS-样品缓冲液中，加热处理(95℃持续10分钟)，并且进行蛋白质印迹。
遵循制造商的说明书(英杰公司(Invitrogen))，通过ELISA，针对总人类τ蛋白测量在脑匀浆物和预澄清的裂解物中的人类τ蛋白浓度。
将组织匀浆化于10个体积的如下含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的Tris-缓冲盐水(TBS)中：50mM Tris/HCl(pH 7.4)；274mM NaCl；5mM KCl；1％蛋白酶抑制剂混合物(罗氏公司(Roche))；1％磷酸酶抑制剂混合物I和II(西格玛公司(Sigma))；以及1mM苯甲基磺酰氯(PMSF)。在4℃下，将这些匀浆物在27,000x g下离心20分钟，以获得上清液(S1)和沉淀级分。将沉淀重新匀浆化于5个体积的高盐/蔗糖缓冲液(0.8M NaCl、10％蔗糖、10mM Tris/HCl[pH7.4]、1mM EGTA、1mM PMSF)中，并且如上离心。将上清液收集，并且与肌氨酰(1％终浓度；西格玛公司(Sigma))在37℃下一起孵育1小时，随后在150,000x g下4℃离心1小时，以获得盐和肌氨酰-可提取物(S3)和肌氨酰不可溶性(P3)级分。将P3沉淀重悬浮于TE缓冲液(10mM Tris/HCl[pH 8.0]、1mM EDTA)中到一个体积，该体积相当于对于脑匀浆所使用的原始体积的一半。为了丰富针对过度磷酸化τ蛋白种类的S1级分，通过在150,000x g下进一步离心20分钟，将一部分的S1级分分离，以形成上清液(S1)和沉淀物(S1p)级分。将该S1p沉淀重悬浮于TBS缓冲液中至相当于使用的原始S1体积的五分之一的体积。将分级的组织提取物S1、S1p和P3溶解于含有DTT(100mM)的SDS-样品缓冲液中。将经热处理的样品(95℃持续10分钟)通过在4％-12％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶(英杰公司(Invitrogen))上的凝胶电泳进行分离，并且转移到PVDF膜(伯乐实验室(BioRad Laboratories)，赫拉克勒斯(Hercules)，加利福尼亚州)上。用在TBS中含有5％脱脂奶和0.1％Triton-X100的封闭液封闭后，将膜与1μg/ml hC10.2、hC10-2_N32S、hC10-2_N32S_A101T或兔抗pS396τ蛋白(英杰公司(Invitrogen))孵育。将膜洗涤，并且与过氧化物酶缀合的抗人类IgG或抗兔抗体(1:5000；杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch)，美国宾夕法尼亚州西格罗夫(WestGrove，PA))进行孵育。使用增强的化学发光***(ECL PLUS试剂盒；珀金埃尔默(PerkinElmer))检测结合的抗体。使用连接计算机的LAS-4000生物成像分析仪***(富士胶片公司(Fujifilm)，东京，日本)和Multi Gauge v3.1软件(富士胶片公司(Fujifilm))进行蛋白质印迹和印迹免疫反应性的定量和视觉分析。为了检测τ蛋白，加载来自小鼠的大约2μg S1，来自人脑的20μg S1，并且是不同级分(S1、S1p和P3)的相同的体积，用于SDS-PAGE。
通过蛋白质印迹检测病理性τ蛋白
将从3只32周龄的rTg4510小鼠和非转基因的(非-tg)对照同窝仔中收集的前脑匀浆物，以及从4个AD和4个健康的对照(HC)供体中收集的皮质标本分离为可溶性(S1)、TBS-可溶性沉淀(S1p)和肌氨酰不可溶性级分(P3)。以1μg/ml在蛋白质印迹上使用hC10.2、hC10-2_N32S、hC10-2_N32S_A101T，并且检测来自rTg4510小鼠和AD的病理性τ蛋白。我们观察来自32周龄的rTg4510小鼠的在S1中的55kDa和64kDaτ蛋白，以及在P3和S1p级分中的64kDa和70kDaτ蛋白的检测。另外地，在该P3级分中观察到三种平截的τ蛋白条带<50kDa。在来自不表达人类转基因τ蛋白的非-tg对照同窝仔的S1p和P3中没有检测到信号。在来自非-tg小鼠的S1级分中检测到大约50kDa的弱信号，最可能代表在S396残基处磷酸化的内源性鼠类τ蛋白(图8A-8C)。总结为hC10.2、hC10-2_N32S、hC10-2_N32S_A101T检测到pS396τ蛋白，以及在rTg4510小鼠中的正常磷酸化55kDa和过度磷酸化64kDaτ蛋白种类。用hC10-2_N32S_A101T观察到最强的信号。
在来自AD供体的S1、S1p和P3级分中，hC10.2、hC10-2_N32S、hC10-2_N32S_A101T检测到典型的ADτ蛋白涂片以及病理性的4个τ蛋白带型(54kDa、64kDa、69kDa和74kDaτ蛋白。如预期的，从P3级分中分离的肌氨酰不可溶性过度磷酸化τ蛋白种类是最显著的，随后是富集于S1p级分中的可溶性过度磷酸化τ蛋白。来自健康的对照(HC)的P3级分中没有检测到信号。在来自HC的S1和S1p级分中，检测到大约55kDa的弱信号，可能代表在S396残基处正常磷酸化的τ蛋白(图8A-8C)。总结为hC10.2、hC10-2_N32S、hC10-2_N32S_A101T检测到针对AD的特征性的典型的τ蛋白涂片，以及代表过度磷酸化τ蛋白的病理性4个τ蛋白带型。用hC10-2_N32S_A101T观察到最强的信号。
病理性τ蛋白的免疫沉淀反应
为了确定在非变性条件下hC10.2、hC10-2_N32S、hC10-2_N32S_A101T结合τ蛋白的能力，建立τ蛋白免疫沉淀反应(IP)方案，其中τ蛋白抗体共价交联至蛋白A/G树脂上，并由此给出不受抗体污染的IP。对于通过SDS-PAGE的τ蛋白分析，针对IP使用的抗体的重链的存在可能闯入信号，因为两种蛋白在大约50kDa检测到。研究hC10.2、hC10-2_N32S、hC10-2_N32S_A101T拉下来自人类脑的病理性τ蛋白的功效。作为抗原，分别使用含有0.1μg和0.15μg人类τ蛋白(通过人类τ蛋白ELISA确定)的来自4个汇集的AD和HC供体的来自脑匀浆物的500μg预澄清的裂解物。hC10.2、hC10-2_N32S、hC10-2_N32S_A101T(10μg)拉下54kDa、64kDa、69kDa和74kDaτ蛋白种类(4种病理性τ蛋白条带)和通过多克隆兔抗pS396τ蛋白抗体可视化的来自预澄清的AD匀浆物(抗原/ab 1:100比率)的AD弥散(图9)。将用hC10.2、hC10-2_N32S、hC10-2_N32S_A101T拉下的来自AD脑的τ蛋白条带的强度与对照人类IgG抗体和与HC脑相比，可以总结的是hC10.2、hC10-2_N32S、hC10-2_N32S_A101T仅从AD脑中免疫沉淀在pS396位点处过度磷酸化的τ蛋白，并且以1:100的抗原/抗体比率是有效的。
细胞和聚集测定
在6孔板中在铺板后24小时，将HEK293细胞用人类τ蛋白-P301L-FLAG瞬时转染，24小时后接着与脑匀浆一起孵育24小时，随后分离并重铺板细胞，并且在再一个24小时之后收获。将细胞在补充有1％tritonX、Phos-stop和完全的磷酸酶和蛋白酶抑制剂(罗氏公司(Roche))缓冲液的PBS中溶解并且超声处理，并且在100,000x g下超速离心30分钟。将该沉淀重悬浮于SDS中，超声处理和在100,000x g下超速离心30分钟。通过蛋白质印迹分析上清液。表达人类τ-P301L的细胞在用来自rTg4510τ蛋白转基因小鼠的总脑匀浆接种后，显示不溶性(SDS级分，E1/FLAG检测)过度磷酸化的(pS396检测)τ蛋白。
来自tTA小鼠对照脑匀浆处理的细胞显示不存在聚集的过度磷酸化人类τ蛋白。此外，使用来自Cisbio的τ蛋白聚集测定来分析HEK293细胞的总细胞裂解物。这种测定是基于在FRET中的时间分辨荧光，对于供体(Tb3+缀合的)和受体(d2缀合的)Ab而言使用的是相同抗体。将10μl样品与10μl抗体混合物进行混合，并且孵育20小时。在Pherastar酶标仪上读取板以评估时间分辨荧光(在切换激发光之后，测量的/积分的FRET信号)。该测定以高特异性和灵敏性测量在人类尸体解剖材料、rTg4510小鼠以及接种的HEK细胞两者中聚集的τ蛋白。结果在图10中示出。
实例7.τ蛋白的免疫耗减
在10x体积的无菌冷PBS中，从冷冻的尸体解剖后前额叶皮质中制备阿尔茨海默脑提取物。使用刀匀浆器将组织匀浆化，然后超声处理，在输出2中5x 0.9秒脉冲(Branson超声波仪)。然后将该匀浆以3000g在4℃下离心5分钟。将上清液等分，快速冷冻，并且在-80℃下储存直到使用。
将25μg抗体(人源化的C10-2变体和2.10.3，小鼠AT8，Thermo Scientific mn1020)固定到125μl的磁珠(Magnetic dynabead)悬浮物(免疫沉淀反应试剂盒磁珠蛋白(Immunoprecipitation Kit Dynabeads Protein)GNovex，目录号10007D)上。在彻底洗涤之后，将包被的珠粒与可变量的非包被洗涤珠粒进行混合。从100％Ab包被的珠粒(对应于5μg抗体)开始，直到100％未包被的珠粒。珠粒的总量在所有样品中是相同的。将这些珠粒与20μl AD提取物混合，并且在室温下孵育10分钟。将磁珠从该提取物中分离，并且将该提取物等分，快速冷冻，并且保持在-80℃下直到使用。
使用蛋白质印迹对耗减的分析
将样品在1x SDS加载缓冲液和100mM DTT中煮沸。将对应于3μl提取物的体积加载在4％-12％Bis-Tris NuPAGE凝胶(LifeTech Novex)上。在电泳后，将蛋白质印迹在Immobilon–FL PVDF膜(0.45μm，IPFL10100，密理博公司(Millipore))上。将膜用SEA封闭缓冲液(Prod#37527，赛默(Thermo))封闭。使用τ5(τ5是可商购的抗τ蛋白抗体，其表位被描述为在τ蛋白氨基酸210-241的中间处)，在该样品中评估τ蛋白和P-τ蛋白水平。它是对τ蛋白的小鼠单克隆。艾博抗公司(Abcam)ab80579，1:2000)小鼠C10-2(1μg/ml)、P-S199/202(英杰公司(Invitrogen)44768G，1:1000)、P-S422(艾博抗公司(Abcam)ab79415，1:750)、人类IPN(1μg/ml)。将磷酸甘油醛脱氢酶(Gapdh)和肌动蛋白用作加载对照(艾博抗公司(Abcam)ab9484，1:2000，西格玛公司(Sigma)A5441，1:20000)。使用二级荧光团缀合的IgG抗体(IRDye 800CW山羊抗-人，IRDye800CW，山羊抗-兔，IRDye 680山羊抗-小鼠，LI-COR生物科学)，并且使用Odyssey CLx和Image studio软件(LI-COR生物科学)对信号定量。进行对整个泳道中单独条带以及信号的定量，并且据此绘制S形剂量反应曲线，并且可能时，评价最大效应和EC50值。
结果
2.10.3和C10-2抗体二者去除来自阿尔茨海默病脑制品的τ蛋白的小级分。这表明在总τ蛋白质含量内针对τ蛋白的子集的选择性。被设计为对PS422τ蛋白具有特异性的2.10.3去除了高达24％的总τ蛋白量，而C10-2去除了高达15％的总τ蛋白(参见图11)。这可以解释为pS396子集是τ蛋白的较小子集，所有其他因素是相等的。可替代地，该数据被解释为相比对于pS422具有选择性的2.10.3抗体，C10-2抗体对于pS396是更具选择性的。
2.10.3和C10-2二者去除多于90％的在丝氨酸422处磷酸化的τ蛋白，但去除50％的pS422τ蛋白所需的抗体的量不同，对相同效果而言，对于2.10.3需要0,42μg抗体，并且对于C10-2需要0.27μg(参见图12)。在本发明的一个实施例中，该抗体对于在386-404内的表位是特异性的，其中人类τ蛋白的丝氨酸残基396是磷酸化的，并且使用少于1μg的抗体将其中80％的pS422τ蛋白去除(在免疫耗减研究中通过蛋白质印迹分析)。
C10-2有效地去除了在丝氨酸396处磷酸化的τ蛋白(最大效应：88％，并且通过使用0.30μg抗体达到该效应的一半)。2.10.3去除了更少部分的在丝氨酸396处磷酸化的τ蛋白(最大效应：60％，并且当使用0.63g抗体时达到该效应的一半)(参见图13)。这指示所有的在丝氨酸422处磷酸化的τ蛋白在丝氨酸396处也被磷酸化，但在位置422处不存在磷酸化丝氨酸时，存在在丝氨酸396处磷酸化的一部分过度磷酸化τ蛋白。在本发明的一个实施例中，该抗体对于在386-404内的表位是特异性的，其中人类τ蛋白的残基396是磷酸化的，并且使用少于1μg的抗体将其中80％的pS396τ蛋白去除(在免疫耗减研究中通过蛋白质印迹分析)。
通过C10-2去除的大部分τ蛋白在丝氨酸199/202处也被磷酸化，因为69％的具有该磷酸化的τ蛋白受到免疫耗减的影响(当使用0.34g抗体时，50％的该效应)。2.10.3免疫耗减并不对PS199/202τ蛋白给出S形剂量反应，但可看到信号随递增量的抗体而降低，当使用抗体的最大量(5μg)时降低最大值52％(参见图14)。在本发明的一个实施例中，该抗体对于在386-404内的表位是特异性的，其中人类τ蛋白的丝氨酸残基396是磷酸化的，并且使用少于1μg的抗体将其中80％的P-S199/202τ蛋白去除(在免疫耗减研究中通过蛋白质印迹分析)。
这些结果指示，与靶向在422位置处的磷酸化丝氨酸的2.10.3抗体相比，靶向磷酸化丝氨酸396的C10-2抗体结合更大量(pool)的过度磷酸化τ蛋白。
在免疫耗减后，在蛋白质印迹上研究个体条带，25kDa条带被鉴定为在丝氨酸396处磷酸化。该片段通过C10-2免疫耗减，但是2.10.3和AT8不耗减该片段(参见图15)。因此，C10-2具有从阿尔茨海默病脑提取物中去除该平截形式的τ蛋白的独特特征。
实例8.比较C10-2变体
在免疫耗减测定中，所有的C10-2变体具有相同的功效(参见图16)。这些结果表明引入的突变没有改变与阿尔茨海默脑特异性τ蛋白的功能性结合。
8a.在接种的rTg4510小鼠中的抗体处理
使用表达在CamK2阳性神经元(rTg4510)中在tet-关(tet-off)响应元件下的人类突变τ蛋白(P301L 0N4R)的转基因小鼠。该模型正常地在3月龄开始发展τ蛋白病理学，但通过在妊娠期间用多西环素饲养母鼠并且持续到小鼠生命的前3周，病理学在后期(在六月龄之后开始)发展。将多西环素预处理的小鼠用mC10-2、hC10-2、2.10.3或对照抗体进行长期处理，15mg/kg/周，从2个月龄开始。2.5个月大后，将阿尔茨海默脑提取物输注到海马体中。将20只小鼠通过固定于立体定位架中的异氟烷吸入进行麻醉。将颅骨暴露并且调节直至前囱和人字点在水平向上。在颅骨中在前囱侧向2mm(右)和后部2.4mm处钻孔。使用10μl的注射器斜尖(SGE)在脑表面侧部1.4mm以上文所述的坐标注射接种材料。将实例7中描述的2μl的提取物缓慢输注在位点处(1μl/分钟)，并且将注射器保留5分钟之后将其移除。通过缝线将伤口闭合并且在小鼠醒来时加热。将小鼠笼养3个月，并且然后处死，并且用4％PFA进行灌注固定。将该小鼠用抗体处理，直到接种后3个月处死。
免疫组织化学
将固定的脑在NSA 30上切成35μm冠状切片，并且将每第6个切片针对τ蛋白缠结(Gallyas银染)染色。将阳性染色的神经元(胞体)在所有脑的海马体的同侧和对侧中进行计数。包括海马体的所有亚区。每个脑计数八个切片。结果反映来自这8个切片的阳性神经元的总和。
统计分析：当比较各组时，差异是显著不同的。因此，使用非参数Kruskal-Wallis检验和Dunn的多重比较检验。
结果：这些提取物导致在同侧的海马体中的缠结病变的接种。该mC10-2处理显著地以57％(P<0.05)降低了在接种的海马体中的缠结病变。存在明显的趋势表明hC10-2降低病变。2.10.3没有显示出效果(参见图17)。
实例8b.C10.2变体的抗接种效果
研究目标
已经提出τ蛋白聚集体的跨细胞传播有助于阿尔茨海默病在CNS中的病理性发展和拓扑扩散。建立体外接种模型，其中将在HEK293细胞中表达的细胞人类τ蛋白与细胞外应用的病理性τ蛋白聚集体接种。本研究的目的是评估和比较在治疗范例中接种时单克隆人类C10.2和变体的治疗性效果。接种(seed)旨在意指引入一定量的引起细胞表达的τ蛋白的过度磷酸化作用/错折叠的过度磷酸化τ蛋白(种子)。
建立研究相关性的背景
Aβ的细胞外斑块和τ蛋白的神经元内成对的螺旋纤丝的沉积是阿尔茨海默病的标志。τ蛋白的神经元内内含物主要由τ蛋白的洗涤剂不溶性的、过度磷酸化的、淀粉样蛋白形式组成，并且在AD患者中以空间-时间模式中沉积，表明聚集体在CNS内的扩散。实验表明，τ蛋白聚集体在体内和体外均以朊病毒样机制从细胞传播至细胞。这种细胞外扩散影响疾病传播的存在为利用CNS渗透抗体的免疫疗法开辟了道路。
τ蛋白聚集体/种子的应用已经示出了导致体外细胞的τ蛋白的聚集(Frost等人，2009，Guo和Lee 2011，Yanamandra等人，2013)。我们已经建立了体外接种模型，其中使用来自Tg4510小鼠(含有聚集的人类τ蛋白)的粗脑匀浆物来接种在HEK293细胞中瞬时表达的具有P301L突变的人类0N4Rτ蛋白。重要的是，在接种的pcDNA对照细胞中不能检测到残余的τ蛋白聚集体(种子)，因此所有读数都检测到细胞τ蛋白的转化，并且没有检测到来自外源接种材料的任何信号。在该测试中测定hC10.2的不同变体的抗接种效果。
变体
抗体C10-2(hC10.2)
抗体N32S(hC10.2 N32S)
抗体N32Q(hC10.2 N32Q)
抗体N32S，D55E(hC10.2 N32S D55E)
抗体N32Q，D55E(hC10.2 N32Q D55E)
抗体N32S，A101T(hC10.2 N32S A101T)
一个或多个参考项
对照hIgG1(B12)
测试***/动物
用hτ-P301L(0N4R)瞬时地转染HEK293细胞。
试验设计
接种材料：通过珠匀浆化作用并且超声处理，将来自12个月龄小鼠的Tg4510匀浆物(和对照)匀浆化为在不含抑制剂的TBS中的10％匀浆物。将匀浆物在21000x g下旋转15分钟，并且使用可溶性级分用于接种。
HEK293接种测定：在该测定中，在第0天在6孔板中将600,000HEK293细胞置于每孔中。遵循制造商的说明书，在第1天，使用10μl脂质体2000将细胞用4μg质粒DNA转染。4小时后更换介质。在第2天，用来自12个月龄的Tg4510或tTa小鼠的粗脑匀浆接种细胞。将含有40μg总蛋白(对于tg4510匀浆物，大约65ng总人类τ蛋白)的匀浆物应用于每孔的介质中。对于抗体处理实验，在4度下具有或不具有抗体的情况下，将匀浆物预孵育过夜。将6小时接种后的培养基更换为低血清培养基，以减少细胞增殖，并且将这些抗体再次应用。
在第3天(接种后24小时)，将细胞胰蛋白酶化3分钟以降解细胞外的种子，并且通过高含量成像，在6孔板中以800,000细胞/孔用于分级实验，20,000细胞/96-孔用于Cisbioτ蛋白聚集测定，并且以10,000细胞/96-孔用于抗体摄取评估。将抗体再次应用至每个孔。
细胞分级：接种后48小时，将用于分级的细胞刮入冷的PBS中收集，将其沉淀并且在含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂、1％triton-X的TBS中进行裂解，并且超声处理。超速离心后(在4℃下，100,000x g持续30分钟)，将沉淀重悬浮于1％SDS中，超声处理并且再次超速离心。通过蛋白质印迹来分析Triton-X和SDS-可溶性级分的总τ蛋白(E1)和在S396(D1.2)上的τ蛋白的磷酸化作用。通过在Odyssey成像仪上的免疫荧光来量化D1.2信号。
Cisbioτ蛋白聚集测定：接种后48小时，将用于Cisbio聚集测定的细胞在冰冷的PBS中洗涤，并且将其冻干。将细胞于含有磷酸酶/蛋白酶抑制剂和核酸酶(核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶)的1％triton-X中裂解，并且在定轨振荡器上孵育，在650RPM 4℃下，持续40分钟。通过Cisbioτ蛋白聚集测定分析总细胞裂解物的τ蛋白聚集，该测定是使用均匀时间分辨荧光(Cisbio)，基于针对FRET测量使用偶联至供体和受体的相同的抗体进行的测定。单体τ蛋白只能结合受体或供体抗体，因为它们竞争相同的结合表位＝无FRET。相比之下，寡聚物τ蛋白可以结合供体和受体＝FRET信号。通过BCA测定所有样品的总蛋白，并针对蛋白质将该样品的信噪比归一化，并使用8个技术重复绘制为相对τ蛋白聚集。
抗体摄取：接种后48小时，将用于抗体摄取的板固定在4％多聚甲醛和4％蔗糖中，并且用抗人类二级抗体染色。使用Cellomics确定抗体摄取。
数据分析/统计
将数据表示为在不同的两周+/-S.E.M进行和分析的四个独立的生物学重复的汇总数据。使用单因素方差分析与Tukey多重比较测验分析数据，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
结果
相比对照，hC10.2对接种和不可溶性过度磷酸化τ蛋白具有大约40％的降低效应。所有其他的抗体示出与hC10.2相似的或优越的效果。特别地，hC10.2的N32S和N32S_A101T变体示出了在聚集的τ蛋白中更强的45％和62％的降低效果。相比hC10.2，该N32S_A101T变体示出了对聚集显著更强的效果。
实例8C：对本发明的hC10.2和变体的稳定性研究
研究目标
进行本研究以评估本发明的抗体的基本稳定性问题，聚焦胁迫条件以揭示变体中的任何潜在差异。
研究设计
将所有样品最初制备成相同的起始条件(缓冲液、浓度和聚集水平)。这将消除潜在地可能影响样品行为的后续发展的初始特性的差异。将对照保持在-80℃下，并且用胁迫的样品(40℃)进行平行分析。将样品在不同时间点从40℃下去除，并通过SEC-uplc在最后同时进行分析，通过液相色谱-质谱(LCMS)和差示扫描荧光测定法(DSF)进行肽图谱分析。
变体
抗体C10-2(hC10.2)
抗体N32S(hC10.2 N32S)
抗体N32Q(hC10.2 N32Q)
抗体N32S，D55E(hC10.2 N32S D55E)
抗体N32Q，D55E(hC10.2 N32Q D55E)
抗体N32S，A101(hC10.2 N32S A101T)
抗体A101T(hC10.2 A101T)
抗体D55E(hC10.2 D55E)
抗体N32Q，A101T(hC10.2 N32Q A101T)
参考项
作为参考，使用研究期间保存在-80℃下的抗体样品。
背景信息
单克隆抗体的稳定性方面对于药物的制造、最终储存以及药品制剂的两个方面都是重要的。在这项研究中，我们通过冻融循环、高温和低pH来胁迫抗体，以揭示在任何候选物中是否存在明显的问题。
材料与方法
对于脱酰胺研究，将样品以1ml样品装入小瓶中，并且在40℃下孵育。在预定义的时间点，将样品移至-80℃并且储存直到分析。
脱酰胺研究
在肽水平下研究Asn残基的脱酰胺作用，以获得有关所讨论的实际残基的详细信息。因此，使用标准化方案在还原和烷基化(碘乙酸)后，用猪胰蛋白酶消化mAb。将肽在CSHT130 C181.7μm柱上分离，并且引入XEVO QTOF(Waters)MS仪，以MSe模式操作。在整个系列中使用相同的参数。在BiopharmaLynx上分析来自所有时间点的肽图，并且用以下限制进行量化：仅包括阳性鉴定的脱酰胺肽，不包括源片段。随着时间的推移监测每个经鉴定的肽的％脱酰胺作用。
SEC方法概述
通过SEC色谱法在ACQUITYBEH200SEC 1.7μm 4.6x 150mm柱上在具有TUV检测器(waters)的Acquity UPLC中测定聚集。将20μl的样品调节至100μg/ml(在运行缓冲液中稀释：Gibco PBS-英杰公司(Invitrogen)#14190-094+0.1M NaCl)，0.4ml/min应用到柱上，并且通过等度洗脱在6分钟内分离。
通过MassLynx分析数据，并且使用AUC量化聚集的水平。
低pH实验
将hC10.2应用到蛋白G柱，并且使用标准的条件在pH2.8下洗脱。将样品保持在pH2.8下，并且在时间0、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟和180分钟处移出等分试样，并且在PBS中脱盐之前进行中和。分析样品的结合亲和力、聚集和脱酰胺作用。
在胁迫条件下hC10.2的特性：在40℃和28天的脱酰胺作用
在由肽LC:T2、HC:T36和HC:T25覆盖的若干次要和三个主要位点处观察到Asn的脱酰胺作用。这些脱酰胺作用随着时间的推移增长，分别结束在75％、38％和28％。对比肽HC:T36和T25，基于计算机模拟分析(序列基序)，没有预期到LC:T2肽中的Asn残基(LC N32和N34)易于脱酰胺作用，，但令人惊讶的是在实际实验它们与hC10.2中的其他Asn残基明显区别。该肽的增加的脱酰胺作用与针对双磷酸化肽的结合活性的降低有关，并表明脱酰胺化和IC50之间存在机理关系。该观察还表明改变hC10.2 LC中的Asn残基32和/或34可以减少在这些位点处的脱酰胺作用。
在这些变体的分析中，很明显，简单地将Asn32修饰为Ser或Gln完全预防Asn34上的脱酰胺反应(图20)。此外，我们没有检测到具有该突变的变体中Gln32的任何脱酰胺作用。
在低pH下的脱酰胺作用
在本研究中，我们以按上述描述的相同的方式分析hC10.2用于40℃稳定性研究。仅在这种情况下，使用胰蛋白酶和Lys-C的混合物(Promega商品)来优化赖氨酸残基的切割。没有观察到额外的脱酰胺作用的位点或程度，而再次最突出的肽是LC-T2、HC-T25和HC-T36。此外，在低pH处理的样品中没有观察到IC50中的变化。
SEC分析
在所有制品中聚集水平均低于3％，并且在40℃下28天内观察到聚集度没有变化。
实例9
来自rTg4510小鼠的τ蛋白种子的分离
该rTg4510小鼠是双重转基因的共表达具有P301L突变的4R0Nτ蛋白(在四环素-操纵子-效应器(TRE)下游的人MAPT基因中)和活化剂构建体(由四环素条件基因表达***(tTA)构成)。该P301L突变是导致与17号染色体(FTDP-17)相关的帕金森综合征的额颞叶痴呆的显性突变。在rTg4510小鼠中，P301L hτ蛋白的表达导致τ蛋白病变，包括年龄依赖性方式的预-缠结和神经原纤维缠结(NFT)形成、神经元缺失和行为异常。NFT是神经元间的τ蛋白聚集，由成对的螺旋纤丝(PHF)、扭曲的带状结构或直的丝状体制成，是洗涤剂不可溶性的，并且主要含有过度磷酸化τ蛋白。过度磷酸化作用意味着相比来自成年健康脑的τ蛋白，该τ蛋白在更多的位点处磷酸化，并且对于给定的位点相比正常百分比，更高百分比的τ蛋白分子被磷酸化(>8磷酸化摩尔/τ蛋白摩尔)。NFT的解剖分布是与阿尔茨海默病(AD)认知衰退和正常老化中的记忆丧失和轻度认知障碍相关的尸体解剖后组织病理学标志。AD患者的脑中NFT的分布格局是高度分级的，并且分为六个阶段。NFT变化对大脑的逐渐入侵也已经被生物化学证实，并根据受影响区域分类为十个阶段。来自AD脑的不同τ蛋白种类的生物化学特征最初基于使用1％肌氨酰用于分离不可溶性τ蛋白的分级方案。基于此方法，在肌氨酰-不可溶性沉淀(P3)级分中分离的该肌氨酰不可溶性过度磷酸化τ蛋白种类被定义为PHF-τ蛋白，并且被认为是生物化学的NFT等效物。在可溶性级分(S1)中分离的缓冲液可溶性过度磷酸化τ蛋白种类被定义为非原纤维寡聚体τ蛋白种类并且被认为是生物化学的预缠结τ蛋白等效物。在rTg4510小鼠中，正常单体磷酸化和非磷酸化人类4R0N转基因的τ蛋白存在于该可溶性级分(S1)中，并且在SDS-PAGE上可视化为55kDaτ蛋白种类。具有P301L突变的过度磷酸化4R0Nτ蛋白展示为在可溶性(S1)中流动性转移的64kDa和70kDa的τ蛋白，并且仅在Tris-缓冲盐水(TBS)-可溶性沉淀物(S1p)和肌氨酰-不可溶性沉淀(P3)级分中。在P3中分离的肌氨酰不可溶性64kDa和70kDaτ蛋白种类是τ蛋白原纤维(PHF-τ蛋白)和生物化学的NFT等效物。在S1中和在TBS-可溶性沉淀物级分(S1p)中富集的缓冲液可溶性64kDa和70kDaτ蛋白种类是寡聚τ蛋白和生物化学预缠结τ蛋白等效物。这些70kDaτ蛋白种类对于P301L突变是特异性的，并且还被发现于FTDP-17患者的脑中。将来自40周龄的rTg4510小鼠的脑组织匀浆化于10个体积的含有50mM Tris/HCl(pH 7.4)、274mM NaCl以及5mM KCl的TBS中。将这些匀浆物在27,000x g下4℃离心20分钟以获得上清液(S1)和沉淀(P1)级分。将TBS-可提取的S1级分通过在150,000x g下4℃离心1小时，分离为上清液(S1s)和沉淀物(S1p)级分。将S1p沉淀物重新悬浮在10mM Tris/HCl[pH 8.0]中至相当于初始S1体积的五分之一的体积。将P1沉淀再匀浆化于5个体积的高盐/蔗糖缓冲液(0.8M NaCl，10％蔗糖，10mM Tris/HCl，[pH 7.4])中，并且在27,000x g下4℃离心20分钟。将该上清液收集并且在37℃下用肌氨酰(1％终浓度；西格玛公司(Sigma))孵育1小时，随后在150,000x g下4℃离心1小时以获得肌氨酰不可溶性沉淀(被称为P3级分)。将P3沉淀重悬浮于10mM Tris/HCl[pH 8.0]中到一个体积，该体积相当于对于脑匀浆所使用的原始体积的一半。来自rTg4510小鼠脑的病理性τ蛋白表征为在SDS-page上64kDa和70kDa的过度磷酸化τ蛋白，仅存在于S1p和P3级分中分别作为TBS可溶性寡聚物和肌氨酰不可溶性原纤维τ蛋白。该S1s级分含有在SDS-page上展示为55kDaτ蛋白的正常的非磷酸化和磷酸化τ蛋白。在S1p和P3级分中分别分离的病理性τ蛋白(可溶性寡聚物和不可溶性原纤维)被用作过度磷酸化τ蛋白种子，以将内源性单体人类τ蛋白募集入聚集的τ蛋白内含物中，并诱导从rTg4510小鼠分离的原代皮质培养物中的人类τ蛋白接种。
从rTg4510小鼠中分离的初级神经元培养物中的接种测定。
鼠类皮质神经元(CTX)分离自第E14-16天的rTg4510小鼠胚胎。将单个转基因tTA激活小鼠与单个转基因突变τ蛋白效应器小鼠进行时间匹配。在怀孕后14-16天将怀孕的雌性安乐死，并且将胚胎用脑DNA使用针对tTA激活剂转基因的引物对5′-GATTAACAGCGCATTAGAGCTG-3′和5′-GCATATGATCAATTCAAGGCCGATAAG-3′以及针对突变τ蛋白效应器转基因的5′-TGAACCAGGATGGCTGAGCC-3′和5′-TTGTCATCGCTTCCAGTCCCCG-3′进行基因分型，同时将分离的胚胎皮质在4℃下保存在不含有氯化钙的Hibernate E(BrainBitsLLC)中。选择来自rTg4510小鼠胚胎的皮质，并且将离解的神经元以0.13x106个细胞/cm2(420,000个细胞/ml，100μl/孔，96孔板)的密度置于100μg/ml聚-L-赖氨酸包被的平盘中，并且在用含有抗氧化剂、0.5mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素(所有溶液来自Gibco-BRL英杰公司(Invitrogen))的2％B-27补充物补充的神经胶质条件化的Neurobasal[神经基础]培养基中进行培养。24小时孵育后，通过融合和非增殖的原代鼠类星形胶质细胞培养物产生神经胶质条件化的Neurobasal[神经基础]培养基。通过用新鲜神经胶质条件化的Neurobasal[神经基础]培养基替换一半的培养基，然后每7天进食一次，在体外4天(DIV)喂食神经元。在DIV4处理后，将神经元培养物用1μM胞嘧啶***糖苷处理以终止增殖细胞。在DIV15，如通过针对神经胶质-原纤维-酸性蛋白(GFAP)的抗体的评估，培养物中的神经胶质细胞的比例少于10％。来自rTg4510小鼠的CTX表达内源性鼠类τ蛋白和转基因的人类τ蛋白4R0N。来自rTg4510小鼠的CTX仅含有在SDS-page上展现为55kDaτ蛋白条带的正常的人类单体的非磷酸化和磷酸化τ蛋白；在来自rTg4510小鼠的初次接受试验的CTX中不存在过度磷酸化τ蛋白种类(64kDa和70kDa)。在DIV7通过将CTX与病理性τ蛋白种子(在S1p和P3级分中分别分离的可溶性寡聚的或不可溶性原纤维的过度磷酸化τ蛋白)孵育诱导τ蛋白接种。在DIV11引入了完全培养基更换，以防止连续摄取病理性τ蛋白种子，并在DIV15测量CTX中的τ蛋白接种。τ蛋白接种的特征在于将单体可溶性人类τ蛋白募集到聚集的和过度磷酸化的τ蛋白的内含物中，其在SDS-page上展示为64kDa、70kDa和140kDa较高分子量的流动性转移的τ蛋白条带。分别来自S1p和P3级分中的过度磷酸化τ蛋白种子(可溶性寡聚物或不可溶性原纤维)同样诱导在CTX中的τ蛋白接种。为了研究τ蛋白抗体对τ蛋白接种的影响，将CTX用分离自40周龄rTg4510小鼠的0.1μl P3或0.2μl S1p级分(含有0.2ng总人类τ蛋白)和10μg抗体(hC10.2、hC10.2_N32S、hC10.2_A101T_N32S、人类IgG对照)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)的混合物处理。将该τ蛋白种子–抗体混合物在4℃下预孵育2小时，然后添加至CTX。在DIV11，进行将完全培养基更换为新鲜的神经胶质条件化的Neurobasal[神经基础]培养基。遵循制造商的说明书，在DIV15，在200rpm摇动下4℃，将神经元在具有1％蛋白酶抑制剂混合物(罗氏公司(Roche))、1％磷酸酶抑制剂混合物I和II(西格玛公司(Sigma))和0.2％核酸酶(西格玛公司(Sigma))的冰冷的triton裂解缓冲液(在50mM Tris中1％triton X-100，150mM NaCl(pH 7.6)中裂解45分钟，并且在Cisbio体外聚集测定中使用裂解物，并且通过二喹啉甲酸(BCA)测定来确定该蛋白含量。遵循制造商的说明书，来自Cisbio的τ蛋白聚集测定是基于在荧光共振能量转移(FRET)中使用针对供体(Tb3+缀合的)和受体(d2缀合的)抗体二者相同的抗体的时间分辨荧光。简言之，将9μl样品与9μl抗体混合物混合，并孵育20小时。在Pherastar平板读数器上读板以评估时间分辨荧光(激发光切换后测量/积分的FRET信号)。该测定法以高特异性和灵敏度测量τ蛋白聚集，τ蛋白寡聚物和τ蛋白原纤维两者，在来自rTg4510小鼠的脑材料中以及在从rTg4510胚胎分离的τ蛋白接种的CTX的神经元裂解物中。结果可以在图21中看出。将P3或S1p种子与人类IgG对照抗体孵育导致来自接种的CTX的τ蛋白聚集信号类似于，将P3或S1p种子与PBS孵育。将来自PBS和人类IgG对照抗体的信号平均，并设置为100％τ蛋白聚集。在DIV15，τ蛋白抗体hC10.2、hC10.2N32S和hC10.2A101T-N32S显著降低了来自P3和S1p诱导的τ蛋白接种的τ蛋白聚集信号。将来自2个个体实验的结果进行总结。hC10.2抗体将P3和S1p诱导的τ蛋白接种降低23％。变体hC10.2N32S和hC10.2A101T-N32S分别将P3和S1p诱导的τ蛋白接种降低41％-53％和48％-60％。变体hC10.2N32S和hC10.2A101T-N32S在降低来自分别由寡聚体或原纤维的τ蛋白构成的S1p或P3的过度磷酸化τ蛋白种子诱导的rTg4510的CTX中的τ蛋白接种方面优于hC10.2。
实例10
静脉内注射hC10-2_N32S_A101T后，在rTg4510小鼠中τ蛋白结构的剂量依赖性修饰。
方法：
12个月龄的rTg4510小鼠。这些转基因小鼠表达在CamK2阳性神经元中在tet-关(tet-off)响应元件下的人类突变的τ蛋白(P301L 0N4R)，并且显示出显著的τ蛋白过度磷酸化作用，以及自6个月龄起的缠结形成。另外，在12个月龄的rTg4510小鼠的具有强烈病变的区域中出现神经退行性变。该小鼠经尾静脉用hC10-2_N32S抗体，以80mg/kg、20mg/kg、8mg/kg和0.8mg/kg的剂量接受单个静脉内注射。以100微升的体积注射每只小鼠。注射后3天，将小鼠用PBS灌注2分钟，随后用4％多聚甲醛灌注10分钟。将这些脑在30％蔗糖中低温保护，并且将其切成40微米自由浮动的冷冻切片。将这些切片用PBS/1％BSA/0.3％TritonX-100中的5％正常猪血清孵育20分钟，在PBS中洗涤，并且最后与AlexaFluor488缀合的二级抗人类IgG以1:200(#709-545-149；杰克逊免疫研究实验室公司(JacksonImmunoResearch Laboratories)，美国宾夕法尼亚州西格罗夫(West Grove，USA))进行孵育。将这些切片在PBS中洗涤，封片，并且通过荧光显微镜检术进行检测。
结果：
hC10-2_N32S的静脉内注射导致在年老的rTg4510小鼠脑中主要在海马体和皮质内与体内靶标结构结合(图1)。观察到的阳性结构的数量在个体rTg4510动物之间变化。在rTg4510脑中的阳性信号没有容易地显示为细胞内染色，并且可以代表在神经退行性变过程中释放的细胞外的τ蛋白材料。通过半定量评分，在以20mg/kg和80mg/kg给药的所有小鼠中检测到最强信号(荧光强度和阳性结构数)(表6)。标记的结构在4只小鼠中的3只中在8mg/kg时存在，但相比20mg/kg和80mg/kg明显处于低水平。使用应用的可视化方法，静脉注射0.8mg/kg不会导致高于背景的信号。总体上，这些数据表明hC10-2_N32S抗体以剂量依赖性方式能够穿透到脑薄壁组织中，并且在体内特异性地修饰rTg4510小鼠中的靶标。图22
表6
静脉内注射hC10-2_N32S后，在脑切片中检测荧光标记的τ蛋白结构。半定量评分：+++强；++中等；+弱；0没有检测到。
实例11在τ蛋白中接种τ蛋白病变
种子制品
来自AD供体的冷冻的皮质组织样品获得自组织方案公司(Tissue Solutions)(格拉斯哥，英国)。将脑组织称重，并且使用刀匀浆器在无菌冷的PBS(10倍体积的脑样品)匀浆化。然后在Branson超声波仪上在输出2，将匀浆通过5x 0.9sec脉冲进行超声处理。将匀浆在3000g下4℃离心5分钟，并且将上清液等分，在干冰上快速冷冻，并且在-80℃下储存直到使用。
在研究中使用的动物
使用表达在CamKII-阳性神经元(rtg4510)中的四环素控制的反式激活因子下的人突变的τ蛋白(P301L 0N4R)的转基因小鼠。该模型正常地在3-4个月龄的小鼠中开始发展τ蛋白病理学。通过在妊娠期间用多西环素饲养母鼠并且持续到小鼠生命的前3周，病理学在后期(在六月龄之后)发展。用于研究中的经多西环素预处理的小鼠在在接种时为2.5月大。
抗体处理
将抗体以1,5mg/ml的浓度在无菌PBS中进行制备，并制备成具有足够用于一次剂量时间点的抗体的等分试样。将等分试样在4℃下储存直到使用。从2个月龄到在5.5个月龄处死的小鼠每周接受IP给予抗体(15mg/kg等于10ml/kg)。使用的抗体：对照人类B12-IgGI、hC10-2、hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T。
立体定位注射
刚接受第3次抗体给药后，通过吸入异氟烷使小鼠麻醉，并固定于立体定位架中。将颅骨暴露，并且定位调节直到前囱和人字点在水平上。在颅骨中在前囱侧向2mm(右)和后部2.4mm处钻孔。使用具有26容量规格，斜尖(SGE)的10μl注射器，将接种材料在脑表面侧部1.4mm注射。
在该部位缓慢注入2μl物质(0.5μl/min)，并且其后在注射器撤出之前再保留5分钟。将伤口封闭并用缝合线密封，并在麻醉恢复期间将小鼠进行热支持。然后将小鼠饲养3个月，然后用4％多聚甲醛灌注固定。
组织学
使用技术，将固定的脑在神经科学协会(诺克斯维尔，田纳西州)加工。每块最多25个小鼠大脑包埋在一起，并通过整个大脑在冠状面以35μm冷冻切片。将每第6个切片用Gallyas银染染色以显示神经原纤维缠结。将切片封固，盖玻片，并且将Gallyas银-阳性神经元(soma)在所有脑的海马体的注射侧计数。包括海马体的所有亚区。每个脑计数八个切片。结果反映来自这8个切片的阳性神经元的总和。
结果
hC10-2、hC10-2_N32S和hC10-2_N32S_A101T均显著地降低了在经注射的海马体中τ蛋白缠结的接种(单因素方差分析和Turkey多重比较测验)。hC10-2：50％；hC10-2_N32S：47％；以及hC10-2_N32S_A101T：60％，与对照处理的小鼠相比。图23。SEQ ID NO.1人类τ蛋白
SEQ ID NO.2τ蛋白残基386-408(pS396，pS404)
SEQ ID NO.3C10-2轻链CDR1
SEQ ID NO.4C10-2轻链CDR2
SEQ ID NO.5C10-2轻链CDR3
SEQ ID NO.6C10-2重链CDR1
SEQ ID NO.7C10-2重链CDR2
SEQ ID NO.8C10-2重链CDR3
SEQ ID NO.9小鼠C10-2轻链
SEQ ID NO.10小鼠C10-2重链
SEQ ID NO.11人源化的C10-2重链
SEQ ID NO.12人源化的C10-2轻链
SEQ ID NO.13人源化的C10-2重链变体D55E
SEQ ID NO.14人源化的C10-2重链变体D55Q
SEQ ID NO.15人源化的C10-2重链变体D55S
SEQ ID NO.16人源化的C10-2轻链变体N32S
SEQ ID NO.17人源化的C10-2轻链变体N32Q
SEQ ID NO.18人源化的C10-2轻链变体N34S
SEQ ID NO.19人源化的C10-2轻链变体N34Q
SEQ ID NO.20人源化的C10-2轻链变体N32S，N34S
SEQ ID NO.21人源化的C10-2轻链变体N32Q，N34S
SEQ ID NO.22人源化的C10-2轻链变体N32Q，N34Q
SEQ ID NO.23人源化的C10-2轻链变体N32S，N34Q
SEQ ID NO.24人源化的C10-2重链变体A101T
SEQ ID NO.25人源化的C10-2重链变体D55E，A101T
SEQ ID NO.26人源化的C10-2重链变体D55Q，A101T
SEQ ID NO.27人源化的C10-2重链变体D55S，A101T
SEQ ID NO.28人源化的C10-2重链CDR2变体D55E
SEQ ID NO.29人源化的C10-2重链CDR2变体D55Q
SEQ ID NO.30人源化的C10-2重链CDR2变体D55S
SEQ ID NO.31人源化的C10-2轻链CDR1变体N32S
SEQ ID NO.32人源化的C10-2轻链CDR1变体N32Q
SEQ ID NO.33人源化的C10-2轻链CDR1变体N34S
SEQ ID NO.34人源化的C10-2轻链CDR1变体N34Q
SEQ ID NO.35人源化的C10-2轻链CDR1变体N32S，N34S
SEQ ID NO.36人源化的C10-2轻链CDR1变体N32Q，N34S
SEQ ID NO.37人源化的C10-2轻链CDR1变体N32Q，N34Q
SEQ ID NO.38人源化的C10-2轻链CDR1变体N32S，N34Q
SEQ ID NO.39人源化的C10-2重链CDR3变体A101T
SEQ ID NO.40 IMGT C10.2 LC CDR1
SEQ ID NO.41 IMGT C10.2 LC CDR2
SEQ ID NO.42 IMGT C10.2 LC CDR3
SEQ ID NO.43 IMGT C10.2 HC CDR1
SEQ ID NO.44 IMGT C10.2 HC CDR2
SEQ ID NO.45 IMGT C10.2 HC CDR3
SEQ ID NO.46 IMGT N32S/N32S,A101T LC CDR1
SEQ ID NO.47 IMGT N32S/N32S,A101 T LC CDR2
SEQ ID NO.48 IMGT N32S/N32S,A101 T LC CDR3
SEQ ID NO.49 IMGT A101T/N32S,A101T HC CDR1
SEQ ID NO.50 IMGT A101T/N32S,A101T HC CDR2
SEQ ID NO.51 IMGT A101T/N32S,A101T HC CDR3
SEQ ID NO.52 Chotia C10.2/N32S HC CDR1
SEQ ID NO.53 Chotia C10.2/N32S HC CDR2
SEQ ID NO.54 Chotia C10.2/N32S HC CDR3
SEQ ID NO.55 Chotia A101 T/N32S,A101T HC CDR1
SEQ ID NO.56 Chotia A101 T/N32S,A101T HC CDR2
SEQ ID NO.57 Chotia A101 T/N32S,A101T HC CDR3

Claims (22)

1.一种单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:3，SEQID NO:31，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:36，SEQID NO:37，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:40，和SEQ ID NO:46；
(b)轻链CDR2，其包括SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:41，和SEQ ID NO:47的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其包括SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:42，和SEQ ID NO:48的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其包括SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:52，和SEQ ID NO:55的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:7，SEQID NO:28，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:53，和SEQ ID NO:56；以及
(f)重链CDR3，其包括选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:8，SEQID NO:39，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:54，和SEQ ID NO:57。
2.一种单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)选自下组的轻链，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22和SEQ IDNO:23；以及
(b)选自下组的重链，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26，和SEQ ID NO:27。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其中
(a)该轻链是SEQ ID NO:12；并且
(b)该重链选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27。
4.根据前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其中
(a)该轻链选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；并且
(b)该重链是SEQ ID NO:11。
5.根据前述权利要求中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
6.根据权利要求1或5所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，该轻链包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列；和
(b)重链，该重链包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
7.根据权利要求1至4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
8.根据权利要求7所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，该轻链包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列；以及
(b)重链，该重链包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
9.根据权利要求1至4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，该轻链包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列；和
(b)重链，该重链包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
11.根据权利要求1至4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
12.根据权利要求11所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，该轻链包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列；以及
(b)重链，该重链包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
13.根据权利要求1至4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
14.根据权利要求13所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，其包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列；以及
(b)重链，其包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
15.根据权利要求1至4所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链CDR1，其具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列；
(b)轻链CDR2，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(c)轻链CDR3，其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；
(d)重链CDR1，其具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列；
(e)重链CDR2，其具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列；以及
(f)重链CDR3，其具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
16.根据权利要求15所述的单克隆抗体或其表位结合片段，其包括
(a)轻链，该轻链包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列；
(b)重链，该重链包括SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
17.一种药物组合物，该药物组合物包括权利要求1-16所述的单克隆抗体或其表位结合片段，以及药学上可接受的载体。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，用于在治疗选自下组的τ蛋白病变中使用，该组由以下各项组成：阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；因AD导致的情感冷漠或患有AD的患者中的情感冷漠；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；皮克病；原发性年龄相关性τ蛋白病变(PART)；神经原纤维缠结为主型老年性痴呆；拳击员痴呆；慢性创伤性脑病；中风；中风恢复；与帕金森病相关的神经变性；与染色体关联的帕金森综合征；利缇可-伯蒂格病(关岛型帕金森病-痴呆复合征)；神经节胶质瘤和神经节细胞瘤；脑膜血管瘤病；脑炎后帕金森综合征；亚急性硬化性全脑炎；亨廷顿氏病；铅中毒脑病；结节性硬化症；哈勒沃登-施帕茨病以及脂褐质沉积症。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，用于在阿尔茨海默病治疗中使用。
20.根据权利要求1至16中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段，用于作为治疗选自下组的疾病的药物而使用，该组由以下各项组成：阿尔茨海默病；嗜银颗粒痴呆(AGD)；精神病，特别是因AD导致的精神病或患有AD的患者中的精神病；因AD导致的情感冷漠或患有AD的患者中的情感冷漠；患有路易体痴呆症的患者的精神病症状；进行性核上性麻痹(PSP)；额颞痴呆(FTD或其变体)；TBI(急性或慢性创伤性脑损伤)；皮质基底节变性(CBD)；皮克病；原发性年龄相关性τ蛋白病变(PART)；神经原纤维缠结为主型老年性痴呆；拳击员痴呆；慢性创伤性脑病；中风；中风恢复；与帕金森病相关的神经变性；与染色体关联的帕金森综合征；利缇可-伯蒂格病(关岛型帕金森病-痴呆复合征)；神经节胶质瘤和神经节细胞瘤；脑膜血管瘤病；脑炎后帕金森综合征；亚急性硬化性全脑炎；亨廷顿氏病；铅中毒脑病；结节性硬化症；哈勒沃登-施帕茨病以及脂褐质沉积症。
21.一种在受试者中对阿尔茨海默病或其他τ蛋白病变进行治疗、诊断或成像的方法，所述方法包括向所述受试者给予治疗有效量的权利要求1至16中任一项所述的单克隆抗体或其表位结合片段。
22.根据权利要求21所述的方法，其中该治疗是长期的。
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WO (1) WO2018011073A1 (zh)
ZA (1) ZA201808329B (zh)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102053484B1 (ko) 2012-12-21 2019-12-06 국립연구개발법인 양자과학기술연구개발기구 뇌 안에 축적된 타우 단백질을 이미징하기 위한 신규한 화합물
AU2016270858B2 (en) 2015-06-05 2022-04-28 Ac Immune Sa Anti-Tau antibodies and methods of use
JO3711B1 (ar) 2015-07-13 2021-01-31 H Lundbeck As أجسام مضادة محددة لبروتين تاو وطرق استعمالها
PE20190227A1 (es) 2016-07-12 2019-02-13 H Lundbeck As Anticuerpos especificos para la tau hiperfosforilada y sus metodos de uso
KR20240035636A (ko) 2016-12-07 2024-03-15 제넨테크, 인크. 항-타우 항체 및 이의 이용 방법
TW202328181A (zh) 2016-12-07 2023-07-16 美商建南德克公司 抗-tau抗體及使用方法
US10995137B2 (en) 2017-01-04 2021-05-04 H. Lundbeck A/S Antibodies specific for hyperphosphorlated tau for the treatment of ocular diseases
CN110520440A (zh) 2017-02-17 2019-11-29 戴纳立制药公司 抗τ抗体及其使用方法
KR102225178B1 (ko) 2017-10-16 2021-03-10 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 항-타우 항체 및 그의 용도
AU2019214370A1 (en) * 2018-02-01 2020-07-30 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Binding molecules that specifically bind to tau
CA3093200A1 (en) * 2018-03-05 2019-09-12 Janssen Pharmaceutica Nv Anti-phf-tau antibodies and uses thereof
WO2020123492A1 (en) * 2018-12-10 2020-06-18 New York University Monoclonal antibodies targeting c-terminal region of phosphorylated tau
EP3948295A1 (en) 2019-03-28 2022-02-09 H. Lundbeck A/S Use of a ps396 assay to diagnose tauophaties
EP4007773A1 (en) * 2019-08-06 2022-06-08 Aprinoia Therapeutics Limited Antibodies that bind to pathological tau species and uses thereof
EP4058065A4 (en) 2019-11-13 2023-05-03 Aprinoia Therapeutics Limited COMPOUNDS FOR DEGRADING TAU PROTEIN AGGREGATES AND THEIR USES
JPWO2023008415A1 (zh) 2021-07-27 2023-02-02

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4681581A (en) 1983-12-05 1987-07-21 Coates Fredrica V Adjustable size diaper and folding method therefor
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5101827A (en) 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4861581A (en) 1986-12-05 1989-08-29 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
US5648471A (en) 1987-12-03 1997-07-15 Centocor, Inc. One vial method for labeling antibodies with Technetium-99m
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5102990A (en) 1989-08-09 1992-04-07 Rhomed Incorporated Direct radiolabeling of antibodies and other proteins with technetium or rhenium
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
JPH06508880A (ja) 1991-07-08 1994-10-06 ユニバーシティ　オブ　マサチューセッツ　アット　アムハースト サーモトロピック液晶セグメント化ブロックコポリマー
US6200768B1 (en) 1991-12-06 2001-03-13 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Method of screening for compounds that dissolve paired helical filaments
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
PT804070E (pt) 1993-03-09 2000-11-30 Genzyme Corp Isolamento de componentes de interesse a partir do leite.
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
EP1150918B1 (en) 1999-02-03 2004-09-15 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Method of manufacturing therapeutic calcium phosphate particles
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
DE60037896D1 (de) 1999-07-29 2008-03-13 Medarex Inc Menschliche antikörper gegen her2/neu
EP1792991A1 (en) 1999-08-24 2007-06-06 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
US20030162230A1 (en) * 2000-09-27 2003-08-28 Reagan Kevin J. Method for quantifying phosphokinase activity on proteins
US7041870B2 (en) 2000-11-30 2006-05-09 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
AT500379B8 (de) * 2001-02-02 2009-08-15 Axon Neuroscience Tau-proteine
EP2298809A3 (en) 2001-07-12 2012-02-15 FOOTE, Jefferson Super humanized antibodies
US8003108B2 (en) 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
US20070134724A1 (en) 2005-08-04 2007-06-14 Peter Davies Phosphorylation of tau by abl
KR20080090406A (ko) 2005-11-28 2008-10-08 젠맵 에이/에스 재조합 １가 항체 및 그의 제조 방법
JP5588866B2 (ja) 2007-08-10 2014-09-10 メダレックス エル．エル．シー． Ｈｃｏ３２およびｈｃｏ２７、ならびに関連実施例
WO2009033743A1 (en) * 2007-09-13 2009-03-19 University Of Zurich Prorektorat Forschung Monoclonal amyloid beta (abeta)-specific antibody and uses thereof
EP4218794A3 (en) 2009-06-10 2023-09-13 New York University Immunological targeting of pathological tau proteins
US8609097B2 (en) 2009-06-10 2013-12-17 Hoffmann-La Roche Inc. Use of an anti-Tau pS422 antibody for the treatment of brain diseases
CA2812865C (en) * 2010-10-07 2021-01-26 Ac Immune S.A. Phosphospecific antibodies recognising tau
WO2012049570A1 (en) 2010-10-11 2012-04-19 Panima Pharmaceuticals Ag Human anti-tau antibodies
US9506051B2 (en) * 2011-05-20 2016-11-29 Oligomerix, Inc. Tau protease compositions and methods of use
CN104080806B (zh) * 2011-10-07 2018-01-19 Ac免疫有限公司 识别Tau的磷酸化特异抗体
EP2834270B1 (en) 2012-04-05 2019-10-30 AC Immune S.A. Humanized tau antibody
WO2014008404A1 (en) 2012-07-03 2014-01-09 Washington University Antibodies to tau
US9567395B2 (en) 2012-08-16 2017-02-14 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
SG11201506244VA (en) 2013-03-13 2015-09-29 Prothena Biosciences Ltd Tau immunotherapy
US20160068818A1 (en) 2013-04-16 2016-03-10 Glykos Finland Oy A method for generating induced pluripotent stem cells
GB201312226D0 (en) * 2013-07-08 2013-08-21 Adx Neurosciences Improved antibodies
MX2016009674A (es) 2014-01-23 2017-05-09 Asahi Chemical Ind Composicion de copolimero de bloque y composicion adhesiva.
CN107073297B (zh) 2014-07-08 2021-09-14 纽约大学 Tau显像配体和其在Tau蛋白病的诊断和治疗中的用途
JO3711B1 (ar) 2015-07-13 2021-01-31 H Lundbeck As أجسام مضادة محددة لبروتين تاو وطرق استعمالها
PE20190227A1 (es) 2016-07-12 2019-02-13 H Lundbeck As Anticuerpos especificos para la tau hiperfosforilada y sus metodos de uso
US10364286B2 (en) 2016-12-22 2019-07-30 H. Lundbeck A/S Monoclonal anti-alpha-synuclein antibodies for preventing tau aggregation
US10995137B2 (en) 2017-01-04 2021-05-04 H. Lundbeck A/S Antibodies specific for hyperphosphorlated tau for the treatment of ocular diseases
US10934438B2 (en) 2017-04-27 2021-03-02 Axalta Coating Systems Ip Co., Llc Coatings and methods for using and producing the same

Also Published As

Publication number Publication date
US10472415B2 (en) 2019-11-12
RU2760875C1 (ru) 2021-12-01
SG11201811015RA (en) 2019-01-30
ZA201808329B (en) 2020-02-26
EP3484916B1 (en) 2021-03-03
PL3484916T3 (pl) 2021-07-19
MA45655B1 (fr) 2021-04-30
DOP2018000281A (es) 2019-02-15
PE20190227A1 (es) 2019-02-13
SI3484916T1 (sl) 2021-08-31
JP2019529336A (ja) 2019-10-17
MX2019000476A (es) 2019-06-10
JOP20180117A1 (ar) 2019-01-30
IL263530B2 (en) 2023-02-01
US20200109192A1 (en) 2020-04-09
CN109618556A (zh) 2019-04-12
NZ748983A (en) 2022-12-23
JP7029415B2 (ja) 2022-03-03
AU2017295608A1 (en) 2018-12-20
KR102551971B1 (ko) 2023-07-07
CY1123995T1 (el) 2022-05-27
CN109618556B (zh) 2022-10-21
RS61646B1 (sr) 2021-04-29
US20190284266A1 (en) 2019-09-19
MA45655A (fr) 2019-05-22
MY197836A (en) 2023-07-20
KR20190028436A (ko) 2019-03-18
DK3484916T3 (da) 2021-04-06
TW201809004A (zh) 2018-03-16
EP3878864A1 (en) 2021-09-15
MA56165A (fr) 2022-04-20
JOP20180117B1 (ar) 2022-03-14
PH12018502613A1 (en) 2019-09-30
US10487142B2 (en) 2019-11-26
UA124104C2 (uk) 2021-07-21
WO2018011073A1 (en) 2018-01-18
HRP20210522T1 (hr) 2021-05-14
JP2022023096A (ja) 2022-02-07
JP7244600B2 (ja) 2023-03-22
SV2019005807A (es) 2019-02-13
IL263530A (en) 2019-01-31
IL263530B (en) 2022-10-01
BR112018004916A2 (pt) 2018-12-11
AU2017295608B2 (en) 2024-01-04
US10647762B2 (en) 2020-05-12
US20220177557A1 (en) 2022-06-09
PT3484916T (pt) 2021-03-31
CL2019000082A1 (es) 2019-04-05
CA3027561A1 (en) 2018-01-18
GEP20217222B (en) 2021-02-10
HUE053679T2 (hu) 2021-07-28
TN2018000419A1 (en) 2020-06-15
US20190284265A1 (en) 2019-09-19
CO2018014325A2 (es) 2019-01-18
EP3484916A1 (en) 2019-05-22
LT3484916T (lt) 2021-04-26
AU2024201450A1 (en) 2024-03-28
ECSP19005417A (es) 2019-01-31
US11111290B2 (en) 2021-09-07
ES2862427T3 (es) 2021-10-07
TWI747922B (zh) 2021-12-01
US20180016330A1 (en) 2018-01-18
NI201900003A (es) 2020-04-27

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