TWI736908B - 提升山芙蓉花抗氧化萃取物的萃取率及抗氧化力的方法 - Google Patents

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Abstract

一種提升山芙蓉花抗氧化萃取物的萃取率及抗氧化力的方法，包含步驟(a)至步驟(d)。在該步驟(a)中，對山芙蓉花進行碎化處理及乾燥處理，形成乾燥粉體。在該步驟(b)中，將乾燥粉體與萃取劑混合，形成混合物。在該步驟(c)中，使用一台超音波震盪裝置對該混合物進行超音波循環萃取處理，形成經處理的混合物。在該步驟(d)中，於該經處理的混合物中，加入碳源、氮源與菌，形成待發酵混合物，並對該待發酵混合物進行醱酵處理。

Description

提升山芙蓉花抗氧化萃取物的萃取率及抗氧化力的方法
本發明是有關於一種萃取方法，特別是指一種提升山芙蓉花抗氧化萃取物的萃取率及抗氧化力的方法。
抗氧化物，例如多酚類化合物等，具有抑制自由基生成，及消除自由基等的特性，而被廣泛地應用於食品、保健品或保養品中。長期以來，人工合成的抗氧化物具有毒性及副作用，以至於廣泛地傾向于用天然抗氧化物來取代。因此，如何有效地獲得天然的抗氧化物，甚至是具有還原力的天然的抗氧化物，成為研究的重點。
因此，本發明的目的，即在提供一種提升山芙蓉花抗氧化萃取物的萃取率及抗氧化力的方法。
於是，本發明提升山芙蓉花抗氧化萃取物的萃取率及抗氧化力的方法包含步驟(a)至步驟(d)。在該步驟(a)中，對山芙蓉花進行碎化處理及乾燥處理，形成乾燥粉體。在該步驟(b)中，將乾燥粉體與萃取劑混合，形成混合物。在該步驟(c)中，使用一台超音波震盪裝置對該混合物進行超音波循環萃取處理，形成經處理的混合物。在該步驟(d)中，於該經處理的混合物中，加入碳源、氮源與菌，形成待發酵混合物，並對該待發酵混合物進行醱酵處理。
本發明的功效在於：透過該超音波循環萃取處理搭配該醱酵處理，該山芙蓉花抗氧化萃取物的製備方法能夠有效地獲得含有大量多酚類或Flavanones類黃酮的抗氧化物質的山芙蓉花抗氧化萃取物，甚至能夠獲得具有優異的還原力的山芙蓉花抗氧化萃取物。
本發明提升山芙蓉花抗氧化萃取物的萃取率及抗氧化力的方法包含步驟(a)至步驟(d)。在該步驟(a)中，對山芙蓉花進行碎化處理及乾燥處理，形成乾燥粉體。在該步驟(b)中，將乾燥粉體與萃取劑混合，形成混合物。在該步驟(c)中，使用一台超音波震盪裝置對該混合物進行超音波循環萃取處理，形成經處理的混合物。在該步驟(d)中，於該經處理的混合物中，加入碳源、氮源與菌，形成待發酵混合物，並對該待發酵混合物進行醱酵處理。
以下將就本發明內容進行詳細說明。
＜步驟(a)＞
山芙蓉花是來自山芙蓉(學名為Hibiscus taiwanensis S.Y.Hu)所開的花。山芙蓉是台灣原生植物，屬於錦葵科(Malvaceae)木槿屬(Hibiscus)。山芙蓉是一種高大灌木，且枝、葉及花萼均被毛。在本發明的一些實施例中，該山芙蓉花為台灣阿里山種植的大葉山芙蓉的白色花朵。
該碎化處理並無特別限制，只要能讓該山芙蓉花變的細小即可。該碎化處理能夠利用切葉機或輾碎機等機械器具來進行。該乾燥處理並無特別的限制，且能夠利用乾燥機等機械器具來進行。該乾燥機例如熱風乾燥機。在本發明的一些實施例中，使用熱風乾燥機，且該乾燥處理的溫度為35℃至45℃、風速為2m/s至4m/s，且時間為24小至48小時。該乾燥處理條件並不以上述為限，依據該乾燥粉體所需的含水率進行調整，大致上，將該乾燥粉體的含水率控制在5%至10%。在該步驟(a)中，還包括對該乾燥粉體進行滅菌處理的程序。該滅菌處理例如是利用紫外光來進行。該滅菌處理的時間並無特別限制，依據該乾燥粉體的含菌數進行調整。在本發明的一些實施例中，該滅菌處理的時間為15分鐘至30分鐘。
＜步驟(b)＞
該萃取劑只要不會使該步驟(d)的菌種死亡或抑制該菌種的功能，則該萃取劑並無特別的限制，例如水或乙醇水溶液。該乙醇水溶液的乙醇濃度為20wt%至80wt%。在本發明的一些實施例中，該萃取劑為水。該萃取劑的用量是依據該乾燥粉體所需濃度進行調整。在本發明的一些實施例的混合物中，該乾燥粉體的濃度為0.1毫克/毫升至10毫克/毫升。
＜步驟(c)＞
該超音波循環萃取處理指的是透過該超音波震盪裝置的一循環管路使一預定量的混合物在該超音波震盪裝置內不斷地循環，以回流至該超音波震盪裝置的一處理槽內而進行超音波萃取處理。在本發明的一些實施例中，該超音波震盪裝置的操作功率為25瓦至45瓦，該超音波循環萃取處理的萃取時間為15分鐘至50分鐘、萃取溫度為30℃至70℃，及循環流速為200毫升/分鐘至950毫升/分鐘。在本發明的一些實施例中，該超音波循環萃取處理的循環流速為800毫升/分鐘至950毫升/分鐘。
＜步驟(d)＞
在本發明的一些實施例中，該菌選自於lactobacillus paracasei ssp. paracasei (簡稱LPSP)或凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans ，簡稱BC)。該lactobacillus paracasei ssp. paracasei 為副乾酪乳酸桿菌。該凝結芽孢桿菌例如以寄存編號BCRC10606被寄存於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute，FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center，BCRC)。
該氮源並無特別的限制，依據該菌進行選擇。該氮源可單獨一種使用或混合多種使用，且該氮源例如奶粉、酵母萃取物、黃豆粉或米糠等。在本發明的一些實施例中，以該待發酵混合物的總量為100毫升計，該氮源的用量為3重量份至9重量份。
該碳源並無特別的限制，依據該菌進行選擇。該碳源例如葡萄糖。在本發明的一些實施例中，該碳源為葡萄糖。在本發明的一些實施例中，以該待發酵混合物的總量為100毫升計，該碳源的用量為5重量份至18重量份。在本發明的一些實施例中，以該待發酵混合物的總量為100毫升計，該碳源的用量為15重量份至18重量份。
在本發明的一些實施例中，該醱酵處理的醱酵溫度為35℃至70℃且醱酵時間為48小時。在本發明的一些實施例中，該醱酵處理的醱酵溫度為45℃至70℃且醱酵時間為48小時。該醱酵處理是在搖晃狀態下進行。該搖晃狀態是利用一台搖晃設備來產生圓周式搖晃。在本發明的一些實施例中，該搖晃狀態的操作轉速為100rpm。該搖晃設備例如往復式精密恆溫振盪設備。
本發明將就以下實施例來作進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為本發明實施之限制。
實施例1
步驟(a)：提供於8月份至10月份所採收的阿里山種植的大葉山芙蓉的白色整朵花朵，並利用一台切葉機對該等花朵進行第一碎化處理，形成平均尺寸為7公分至13公分的碎花，然後，置於45℃的環境中進行32小時的乾燥處理，接著，再以紫外線照射30分鐘，以進行滅菌處理，最後，再進行第二碎化處理，並經網目數為80的篩網過濾，獲得乾燥粉體。
步驟(b)：將該乾燥粉體與水(萃取劑)混合，形成混合物，其中，在該混合物中，該乾燥粉體的濃度為0.88毫克/毫升。
步驟(c)：將該步驟(b)的混合物設置於一台高功率超音波震盪機(廠商：Qsonica；型號：Q700)的一處理槽內，並進行超音波循環萃取處理，形成經處理的混合物。該超音波震盪裝置的操作功率設定為45瓦，且該超音波循環萃取處理的萃取時間為15鐘、萃取溫度設定為70℃，且循環流速為851.61毫升/分鐘。
步驟(d)：提供容置有第一混合液的第一錐形瓶、容置有第二混合液的第二錐形瓶，及第三混合液。以鋁箔紙封住該第一錐形瓶及該第二錐形瓶的瓶口，並將該第一錐形瓶及該第二錐形瓶置於高壓滅菌釜中，以121℃進行20分鐘的滅菌處理，接著，將該第二混合液加入至該第一混合液中，然後，加入1毫升的第三混合液，形成待發酵混合物。將該待發酵混合物設置於一台往復式精密恆溫振盪設備(廠商：Hipoint；型號：SB-9D)的一處理槽內，並於搖晃狀態下進行醱酵處理，形成含有抗氧化物的混合物。該往復式精密恆溫振盪設備的操作轉速設定為100rpm。該醱酵處理的醱酵溫度為45℃且醱酵時間為48小時。該第一混合液的配置是將8克的奶粉(作為氮源)置於該第一錐形瓶中並加入步驟(c)的經處理的混合物至總體積為60毫升。該第二混合液的配置是將17.9克的葡萄糖(做為碳源)置於該第二錐形瓶中並加入去離子水至總體積為39毫升。該第三混合液的配置是利用以下步驟來獲得：以三角玻棒均勻地將0.2毫升的包含LPSP的菌液塗抹在容置有MRS固態培養基的第一培養皿的MRS固態培養基上，以讓該菌液被該MRS固態培養基吸收為止，接著，將該第一培養皿倒置並設置於37℃的培養箱中培養48小時，形成含有菌的第一培養物。利用接種環從該第一培養物中取適量菌，並置於容置有MRS固態培養基的第二培養皿中，其中，該MRS固態培養基的表面被劃分為四個區域，接著，利用該接種環於該四個區域中劃直線，而分離出單菌落，然後，將該第二培養皿倒置並設置於37℃的培養箱中培養48小時，形成含有菌的第二培養物。利用接種環從該第二培養物中取適量菌，並置於容置有MRS液態培養基中，然後，設置於37℃的培養箱中培養48小時，獲得該第三混合液，其中，該MRS液態培養基的配置是將4克的MRS培養基置於含有磁石的錐形瓶中，接著，加入去離子水至總體積為500毫升，然後，以該磁石進行攪拌至均勻，最後，以鋁箔紙封住該錐形瓶的瓶口。將該錐形瓶置於高壓滅菌釜中，並以121℃進行20分鐘的滅菌處理，然後，冷卻至45℃。
步驟(e)：將該含有抗氧化物的混合物進行過濾處理，而獲得濾液，即為山芙蓉花抗氧化萃取物。
實施例2、4至6
該實施例2、4至6與該實施例1的方法類似，不同在於：改變各步驟中的條件，參閱表1。
實施例3
該實施例3與該實施例1的方法類似，不同在於：步驟(d)。在該實施例3的步驟(d)中，提供容置有第一混合液的第一錐形瓶、容置有第二混合液的第二錐形瓶，及第三混合液。以鋁箔紙封住該第一錐形瓶及該第二錐形瓶的瓶口，並將該第一錐形瓶及該第二錐形瓶置於高壓滅菌釜中，以121℃進行20分鐘的滅菌處理，接著，將該第二混合液加入至該第一混合液中，然後，加入1毫升的第三混合液，形成待發酵混合物。將該待發酵混合物設置於一台往復式精密恆溫振盪設備(廠商：Hipoint；型號：SB-9D)的一處理槽內，並於搖晃狀態下進行醱酵處理，形成含有抗氧化物的混合物。該往復式精密恆溫振盪設備的操作轉速設定為100rpm。該醱酵處理的醱酵溫度為45℃且醱酵時間為48小時。該第一混合液的配置是將8克的奶粉(作為氮源)置於該第一錐形瓶中並加入步驟(c)的經處理的混合物至總體積為60毫升。該第二混合液的配置是將17.9克的葡萄糖(做為碳源)置於該第二錐形瓶中並加入去離子水至總體積為39毫升。該第三混合液的配置是利用以下步驟來獲得：以三角玻棒均勻地將0.2毫升的包含凝結芽孢桿菌的菌液塗抹在容置有固態培養基的第一培養皿的固態培養基上，以讓該菌液被該固態培養基吸收為止，接著，將該第一培養皿倒置並設置於37℃的培養箱中培養48小時，形成含有菌的第一培養物，其中，該固態培養基包含胰化蛋白(tryptone)、酵母萃取物(yeast extract)、MnSO4 、KH2 PO4 ，及MnCl2 。利用接種環從該第一培養物中取適量菌，並置於容置有上述固態培養基的第二培養皿中，其中，該固態培養基的表面被劃分為四個區域，接著，利用該接種環於該四個區域中劃直線，而分離出單菌落，然後，將該第二培養皿倒置並設置於37℃的培養箱中培養48小時，形成含有菌的第二培養物。利用接種環從該第二培養物中取適量菌，並置於容置有液態培養基中，然後，設置於37℃的培養箱中培養48小時，獲得該第三混合液，其中，該液態培養基的配置是利用以下步驟來獲得：將胰化蛋白、酵母萃取物、MnSO4 、KH2 PO4 ，及MnCl2 置於含有磁石的錐形瓶中，接著，加入去離子水至總體積為500毫升，然後，以該磁石進行攪拌至均勻，最後，以鋁箔紙封住該錐形瓶的瓶口，而獲得第一溶液。將葡萄糖置於含有磁石的錐形瓶中，接著，加入40毫升的去離子水並攪拌至透明清澈，然後，再加入去離子水至總體積為50毫升，最後，以鋁箔紙封住該錐形瓶的瓶口，而獲得第二溶液。將該第一溶液與該第二溶液置於高壓滅菌釜中，並以121℃進行20分鐘的滅菌處理，然後，冷卻至45℃，接著，將該第二溶液倒入至該第一溶液中，並混合均勻。
比較例1
該比較例1與該實施例1的方法類似，不同在於：不進行該步驟(d)，且在步驟(e)中，將步驟(c)的該經處理的混合物進行過濾處理，而獲得濾液，即為山芙蓉花抗氧化萃取物。
比較例2
該比較例2與該實施例1的方法類似，不同在於：不進行該步驟(c)。
比較例3及5
該比較例3及5與該比較例1的方法類似，不同在於：改變各步驟中的條件，參閱表2。
比較例4
該比較例4與該比較例2的方法類似，不同在於：改變各步驟中的條件，參閱表2。
比較例6
該比較例6與該實施例3的方法類似，不同在於：不進行該步驟(c)，參閱表2。
評價項目
[總多酚類含量量測]
為能夠清楚描述量測過程，以下以實施例1的濾液進行說明，而其餘實施例及比較例皆依照該過程進行量測。將實施例1的濾液與乙醇溶液(包含乙醇及水，且該乙醇的濃度為95wt%)以振盪搖晃方式混合均勻，接著，利用一台轉速設定在3500rpm的離心機進行5分鐘的離心處理。接著，吸取1毫升的上清液並與1mL的乙醇溶液(包含乙醇及去離子水，且該乙醇的濃度為95wt%)、5毫升的去離子水、0.5毫升的50%(v/v)的Folin-Ciocalteu試劑(廠商：Merck)混合，然後，靜置於35℃的恆溫水槽中5分鐘，再加入1毫升碳酸鈉溶液(包含碳酸鈉及去離子水，且該碳酸鈉的濃度為5wt%)，接著，靜置於35℃的恆溫水槽中60分鐘，形成待測物，最後，利用一台雙光束紫外光可見光光譜儀(廠牌：Hitach；型號：U-2009)測定該待測物於波長為725nm的吸光值。提供不同濃度的沒食子酸溶液[包含沒食子酸(gallic acid)、乙醇、Folin-Ciocalteu試劑、碳酸鈉，及去離子水]與725nm的吸光值的關係座標圖，並獲得標準曲線公式。將該待測物的吸光值帶入該標準曲線公式，而求得該實施例1的濾液中總多酚類含量，且單位為mg/mL。
[Flavanones類黃酮含量量測]
為能夠清楚描述量測過程，以下以實施例1的濾液進行說明，而其餘實施例及比較例皆依照該過程進行量測。將實施例1的濾液與乙醇溶液(包含乙醇及水，且該乙醇的濃度為95wt%)以振盪搖晃方式混合均勻，形成混合液。將該混合液利用一台轉速設定在3500rpm的離心機進行5分鐘的離心處理。接著，吸取1毫升的上清液並與2mL的2,4-二硝基苯肼(2,4-Dinitrophenylhydrazine，簡稱DNP)溶液及2毫升的甲醇混合，然後，靜置於50℃的恆溫水槽中50分鐘，接著，冷卻並加入5毫升的氫氧化鉀溶液(包含氫氧化鉀及甲醇)，然後，靜置2分鐘，接著，取出1毫升並加入5毫升的甲醇，然後，利用轉速設定在3500rpm的該離心機進行10分鐘的離心處理，接著，取出1毫升的上清液並加入4毫升的甲醇，形成待測物，然後，以利用一台雙光束紫外光可見光光譜儀(廠牌：Hitach；型號：U-2009)測定該待測物於波長為494nm的吸光值。提供不同濃度的橙皮素溶液[包含橙皮素(hesperetin)、DNP溶液、甲醇、氫氧化鉀，及去離子水]與494nm的吸光值的關係座標圖，並獲得標準曲線公式。將該待測物的吸光值帶入該標準曲線公式，而求得該實施例1的濾液中Flavanones類黃酮含量，且單位為mg/mL。
[還原力量測]
提供pH為6.6的0.2M的磷酸緩衝液，是由0.2M的K2 HPO4 溶液及0.2M的KH2 PO4 所配製而成。該0.2M的K2 HPO4 溶液是由0.7克的K2 HPO4 與20.023毫升的去離子水所形成。該0.2M的KH2 PO4 溶液是由0.5克的KH2 PO4 與18.37毫升的去離子水所形成。為能夠清楚描述量測過程，以下以實施例1的濾液進行說明，而其餘實施例及比較例皆依照該過程進行量測。將實施例1的濾液與甲醇混合均勻，形成2毫升的混合液。將該混合液與2mL的0.2M的磷酸緩衝液及1%(v/v)的赤血鹽溶液以振盪搖晃方式混合均勻，然後，靜置於50℃的恆溫水槽中20分鐘，接著，加入2毫升的10%(v/v)的三氯醋酸溶液，然後，利用一台轉速設定在3000rpm的離心機進行10分鐘的離心處理，接著，取出2毫升的上層液，並與2毫升的去離子水及0.4毫升的0.1%(v/v)的氯化鐵溶液混合均勻，待10分鐘後，形成待測物。然後，利用一台雙光束紫外光可見光光譜儀(廠牌：Hitach；型號：U-2009)測定該待測物於波長為700nm的吸光值。提供不同濃度的2,6-二丁基羥基甲苯(簡稱BHT)溶液(包含BHT、甲醇、0.2M的磷酸緩衝液、赤血鹽、三氯醋酸、氯化鐵，及去離子水)與700nm的吸光值的關係座標圖，並獲得標準曲線公式。將該待測物的吸光值帶入該標準曲線公式，而求得該實施例1的濾液的還原力，且單位為mg/mL。
表1
「--」：未量測 實施例 實施例
1 2 3 4 5 6
步驟(b) 混合物 萃取劑 水 水
乾燥粉體的濃度 (毫克/毫升) 0.88 0.56 0.44 0.88
步驟(c) 超音波震盪裝置 操作功率 45 45 45 25
超音波循環萃取處理 萃取時間 (分鐘) 15 15 15 15 50 15
萃取溫度 (℃) 70 70 70 30 30 70
循環流速 (毫升/分鐘) 851.61 901.34 901.94 400
步驟(d) 醱酵處理 第三混合液用量(毫升) 1 1 1 1
氮源 種類 奶粉 奶粉
用量(克) 8 8.29 8 8
碳源 種類 葡萄糖 葡萄糖
用量(克) 17.9 15 15 17.9
醱酵溫度 (℃) 45 45 60.14 45 45 60
醱酵時間(小時) 48 48 48 48
搖晃狀態 操作轉速(rpm) 100 100 100 100
評價項目 總多酚類含量(mg/mL) -- 1423.42 -- 598.56 584.41 559.29
Flavanones類黃酮含量(mg/mL) -- -- 11523.58 8807.70 1216.64 8458.88
還原力(mg/mL) 1514.67 -- -- 376.02 382.74 477.79
表2
「－」：未進行 「--」：未量測 比較例
1 2 3 4 5 6
步驟(b) 混合物 萃取劑 濃度為80wt%的乙醇水溶液 水 濃度為80wt%的乙醇水溶液 水 濃度為80wt%的乙醇水溶液 水
乾燥粉體的濃度 (毫克/毫升) 0.88 0.88 0.56 0.56 0.44 0.44
步驟(c) 超音波震盪裝置 操作功率 45 － 45 － 45 －
超音波循環萃取處理 萃取時間 (分鐘) 15 15 15
萃取溫度 (℃) 70 70 70
循環流速 (毫升/分鐘) 851.61 901.34 901.34
步驟(d) 醱酵處理 第三混合液的用量 (毫升) － 1 － 1 － 1
氮源 種類 奶粉 奶粉 奶粉
用量 (克) 8 8.29 8
碳源 種類 葡萄糖 葡萄糖 葡萄糖
用量 (克) 17.9 15 15
醱酵溫度 (℃) 45 45 60.14
醱酵時間(小時) 48 48 48
搖晃狀態 操作轉速(rpm) 100 100 100
評價項目 總多酚類含量(mg/mL) -- -- 98.41 144.54 -- --
Flavanones類黃酮含量(mg/mL) -- -- -- -- 86.8321 1850.4007
還原力(mg/mL) 106.81 223.29 -- -- -- --
綜上所述，透過該超音波循環萃取處理搭配該醱酵處理，本發明山芙蓉花抗氧化萃取物的製備方法能夠有效地獲得含有大量總多酚類或Flavanones類黃酮的抗氧化物質的山芙蓉花抗氧化萃取物，甚至能夠獲得具有優異的還原力的山芙蓉花抗氧化萃取物，故確實能達成本發明的目的。
惟以上所述者，僅為本發明的實施例而已，當不能以此限定本發明實施的範圍，凡是依本發明申請專利範圍及專利說明書內容所作的簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋的範圍內。
無。

Claims (3)

  1. 一種提升山芙蓉花抗氧化萃取物的萃取率及抗氧化力的方法，包含：步驟(a)，對山芙蓉花進行碎化處理及乾燥處理，形成乾燥粉體；步驟(b)，將乾燥粉體與水混合，形成混合物；步驟(c)，使用一台超音波震盪裝置對該混合物進行超音波循環萃取處理，形成經處理的混合物，其中，該超音波震盪裝置的操作功率為25瓦至45瓦，該超音波循環萃取處理的萃取時間為15分鐘至50分鐘、萃取溫度為30℃至70℃，及循環流速為400毫升/分鐘至950毫升/分鐘；步驟(d)，於該經處理的混合物中，加入葡萄糖、氮源與菌，形成待發酵混合物，並對該待發酵混合物進行醱酵處理，其中，該菌選自於lactobacillus paracasei ssp.paracasei或凝結芽孢桿菌，該醱酵處理的醱酵溫度為35℃至70℃，以該待發酵混合物的總量為100毫升計，該氮源的用量為3重量份至9重量份，且該碳源的用量為5重量份至18重量份，該氮源選自於奶粉、酵母萃取物、黃豆粉、米糠，或上述任意的組合。
  2. 如請求項1所述的提升山芙蓉花抗氧化萃取物的萃取率及抗氧化力的方法，其中，在該步驟(d)中，該醱酵處理是在搖晃狀態下進行。
  3. 如請求項1所述的提升山芙蓉花抗氧化萃取物的萃取率及抗氧化力的方法，其中，在該步驟(b)中，在該混合物中， 該乾燥粉體的濃度為0.1毫克/毫升至10毫克/毫升。
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