CN112409483A

CN112409483A - 抗pd-l1纳米抗体

Info

Publication number: CN112409483A
Application number: CN201910777959.9A
Authority: CN
Inventors: 姚高峰; 周振兴; 陈永露; 杨志愉; 董佳里; 温晓芳; 黄岩山
Original assignee: Zhejiang Doer Biologics Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Doer Biologics Co Ltd
Priority date: 2019-08-22
Filing date: 2019-08-22
Publication date: 2021-02-26
Also published as: US20220372150A1; AU2020332969B2; JP2022545117A; EP4019550A4; EP4019550A1; JP7373650B2; AU2020332969A1; WO2021031716A1

Abstract

本发明提供了一类特异性抗PD‑L1以及阻断PD‑L1/PD‑1相互作用的纳米抗体，基于所述纳米抗体制备的人源化抗体以及融合蛋白，以及它们的应用。

Description

抗PD-L1纳米抗体

技术领域

本发明涉及生物领域，特别是涉及抗人PD-L1的纳米抗体及其应用。

背景技术

程序性死亡因子1配体1(programmed death 1 ligand 1，PD-L1)最初是作为B7蛋白家族中的成员(称为B7-H1)克隆(Dong等人，1999NatureMed 5:1365)。PD-L1属于I型跨膜蛋白，共290个氨基酸，包含1个IgV样区、1个IgC样区、1个跨膜疏水区和1个由30个氨基酸组成的胞内区。PD-L1广泛表达在多种免疫细胞、上皮细胞和肿瘤细胞表面。PD-L1结合至编程性死亡-1(Programmed Death-1；PD-1)受体及活化负调节信号传导途径，从而抑制T细胞激活或诱导T细胞凋亡，使免疫反应受到抑制(Freeman等人，2000J Exp Med 192:1027)。肿瘤发展过程中，癌细胞会通过上调PD-L1表达，诱导T细胞的凋亡，避免免疫***对其的清除，从而导致疾病的进展。近年来，利用靶向PD-1/PD-L1蛋白的单克隆抗体药物，通过阻断PD-1/PD-L1的结合，进而促进体内T细胞的活化和增殖，达到杀伤肿瘤细胞的目的，已在多种肿瘤，如黑色素瘤、淋巴癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、头颈癌、结肠癌等治疗应用，取得显著的疗效。因此，PD1/PD-L1通路已成为抗肿瘤药物研究的重要靶点。目前，抑制PD1/PD-L1通路的抗体药物，已经在临床上获得巨大成功，其中，百时美施贵宝的Nivolumab，默沙东的MK-3475和罗氏的MPDL3280A先后上市。针对PD1/PD-L1通路的抗体药物，将成为肿瘤治疗市场中的最具潜力的领域。

单克隆抗体在癌症的检测及生物靶向治疗方面成功的应用，引起了肿瘤治疗的变革。然而，传统的单克隆抗体(约150kD)分子质量过大，难穿透组织，造成肿瘤区域的有效浓度较低，治疗效果不充分；传统的抗体具有很高的免疫原性，而改造的抗体很难达到原来的亲和力。此外，完全人源化的传统抗体开发周期长，生产成本高，稳定性不够等诸多因素限制其在临床中的应用及普及。随后出现的纳米抗体有来源于成年骆驼体内重链抗体的最小的功能性抗原结合片段，具有高度稳定性和与抗原结合的高亲合力。纳米抗体和常规抗体相比具有许多独特的性质：1)纳米抗体编码的序列与人VH家族3和4同源性高，使得它免疫原性弱；2)纳米抗体分子量小，仅15kDa左右，结构简单，很容易在微生物中大量表达，易于纯化。纳米抗体的独特性质和低成本使其应用范围大为拓展，显示出其在疾病的治疗和诊断中具有的价值。但是，现有技术中，本领域技术人员在筛选纳米抗体中尚存在困难、不易于获得高亲和力、高特异性且具有产业化前景的纳米抗体，仅以三个互补决定区(CDR)发挥结合抗原作用的抗体的筛选要远远难于以6个CDR区来发挥结合抗原作用的抗体，这也使得目前真正商品化或临床前在研的主流抗体仍然是分子量较大的单克隆抗体。不仅如此，目前本领域所获得的纳米抗体在应用上也存在诸多问题，比如因为其特殊结构导致的免疫原性(ADA)问题。TAS266是一个anti-DR5受体纳米抗体，在Ⅰ期临床研究中就因为存在严重的肝毒性而中止了开发。进一步研究发现其肝脏毒性与受试者体内存在的ADA密切相关(Papadopoulos,K.P.,Isaacs,R.,Bilic,S.et al.Cancer Chemother Pharmacol(2015)75:887.)。在另一个anti-TNFR1的VHH抗体(GSK1995057)Ⅰ期临床试验中，也因为受试者体内存在ADA导致细胞因子风暴而中止了临床研究(Journal of Clinical Immunology,2013,Volume 33,Number 7,Page 1192M.C.Holland,J.U.Wurthner,P.J.Morley)。单重链抗体(VHH)，为了实现在没有轻链的条件下保持高亲和力和稳定性，其框架区和CDR跟常规人源抗体有一定差异。特别是CDR3的结构往往差异更大。很多时候，筛选获得的高亲和力VHH的CDR3区的氨基酸组成和长度与人源抗体序列有着较大的差异(Nature(1993)363:446-8；Protein Eng(1994)7:1129-35.；Mol Immunol(1997)34:1121-31)。比如，高亲和力VHH的CDR3区往往长度更长，还经常存在Cys，甚至会形成二硫键(Protein Engineering,Design&Selection，24(9)：727tein，2011)。WO2017/020801A1中的SEQ ID NO:28的PDL1-56序列中CDR1和CDR3(根据IMGT编码)的各有一个Cys，这增加的2个半胱氨酸会显著增加二硫键错配的几率，导致错误折叠；并且这增加的2个半胱氨酸形成的一对二硫键会使得其跟人抗体差异增大，免疫原性风险可能增加。众所周知，与人源序列差异越大，通俗地说人源化程度越低，潜在免疫原性越高，那么在用于人体时，人体产生抗VHH抗体的可能性越高。生物药物的免疫原性高低，往往决定了其临床应用的有效性和安全性，是其能否成功开发用于临床的一个关键。本发明的一个重要贡献是筛选获得了一些既高亲和力，但是又非常接近人源抗体结构的VHH序列。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种抗人PD-L1纳米抗体，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，在本发明的第一方面，提供一种抗PD-L1纳米抗体，其互补决定区CDR包括氨基酸序列如下所示的CDR1～CDR3：(1)SEQ ID NO:6所示的CDR1，SEQ ID NO:15所示的CDR2，SEQ ID NO:25所示的CDR3；或(2)SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:16所示的CDR2，SEQ ID NO:26所示的CDR3；或(3)SEQ ID NO:8所示的CDR1，SEQ ID NO:16所示的CDR2，SEQ ID NO:27所示的CDR3；或(4)SEQ ID NO:9所示的CDR1，SEQ ID NO:17所示的CDR2，SEQ ID NO:28所示的CDR3；或(5)SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:16所示的CDR2，SEQ ID NO:29所示的CDR3；或(6)SEQ ID NO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:18所示的CDR2，SEQ ID NO:30所示的CDR3。

在一个优选例中，所述抗PD-L1纳米抗体还分别包括框架区FR，所述框架区FR包括氨基酸序列如下所示的FR1～FR4：(1’)SEQ ID NO:1所示的FR1，SEQ ID NO:11所示的FR2，SEQ ID NO:19所示的FR3，SEQ ID NO:31所示的FR4；或(2’)SEQ ID NO:2所示的FR1，SEQ IDNO:12所示的FR2，SEQ ID NO:20所示的FR3，SEQ ID NO:31所示的FR4；或(3’)SEQ ID NO:3所示的FR1，SEQ ID NO:13所示的FR2，SEQ ID NO:21所示的FR3，SEQ ID NO:31所示的FR4；或(4’)SEQ ID NO:4所示的FR1，SEQ ID NO:13所示的FR2，SEQ ID NO:22所示的FR3，SEQ IDNO:31所示的FR4；或(5’)SEQ ID NO:5所示的FR1，SEQ ID NO:12所示的FR2，SEQ ID NO:23所示的FR3，SEQ ID NO:32所示的FR4；或(6’)SEQ ID NO:5所示的FR1，SEQ ID NO:14所示的FR2，SEQ ID NO:24所示的FR3，SEQ ID NO:31所示的FR4。

在另一优选例中，所述抗PD-L1纳米抗体包括：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:33～38任一所示的纳米抗体；或(b)氨基酸序列与SEQ ID NO:33～38任一所示序列具有80％以上(如85％、90％、93％、95％、97％或99％以上)相同性、且具有(a)纳米抗体功能的纳米抗体。

在另一优选例中，所述抗PD-L1纳米抗体为人源化的抗体，较佳地，其框架区FR包括选自下组的氨基酸序列的FR1～FR4：SEQ ID NO:3所示的FR1；SEQ ID NO:59～61所示的FR2；SEQ ID NO:62～64所示的FR3；SEQ ID NO:65所示的FR4。

在另一优选例中，SEQ ID NO:3所示FR1作为(1)～(6)任一所述纳米抗体的FR1。

在另一优选例中，SEQ ID NO:59所示FR2作为(1)所述纳米抗体的FR2；SEQ ID NO:60所示FR2作为(2)或(5)所述纳米抗体的FR2；SEQ ID NO:61所示FR2作为(3)、(4)或(6)所述纳米抗体的FR2。

在另一优选例中，SEQ ID NO:62所示FR3作为(1)所述纳米抗体的FR3；SEQ ID NO:63所示的FR3作为(2)、(3)、(5)或(6)所述纳米抗体的FR3；SEQ ID NO:64所示的FR3作为(4)所述纳米抗体的FR3。

在另一优选例中，SEQ ID NO:65所示FR4作为(1)～(6)任一所述纳米抗体的FR4。

在另一优选例中，所述抗PD-L1纳米抗体为人源化抗体，包括：(i)氨基酸序列如SEQ ID NO:39～44任一所示的纳米抗体；或(ii)氨基酸序列与SEQ ID NO:39～44任一所示序列具有80％以上(如85％、90％、93％、95％、97％或99％以上)相同性、且具有(i)纳米抗体功能的纳米抗体。

在本发明的另一方面，提供一种融合蛋白，包括：第一结构域，其为前面所述的纳米抗体；以及第二结构域，其具有延长体内半衰期作用和/或对效应细胞具有结合作用。

在一个优选例中，所述第二结构域包括(但不限于)：免疫球蛋白Fc区，优选人免疫球蛋白Fc区；和/或血清白蛋白(如人源的HSA)或其片段、结合血清白蛋白的结构域(如抗血清白蛋白抗体，包括纳米抗体)、聚乙二醇、聚乙二醇-脂质体复合体，或其组合；和/或对T细胞表面分子具有亲和力和/或能够与T细胞上存在的表面分子结合的分子；较佳地，所述的表面分子包括(但不限于)：CD3。

在另一优选例中，，所述人免疫球蛋白Fc区中包括用于改变Fc介导的效应功能的突变，所述效应功能包括CDC活性、ADCC活性、ADCP活性中的一种或多种的组合。

在另一优选例中，所述免疫球蛋白为选自IgG、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM中的一种或多种的组合，所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型中的一种或多种的组合。

在另一优选例中，所述免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:45～48其中之一。

在另一优选例中，所述第一结构域和第二结构域之间设有连接肽；所述连接肽优选选自由丙氨酸和/或丝氨酸和/或甘氨酸组成的柔性多肽链，连接肽的长度优选为3～30个氨基酸。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，编码前面任一所述的纳米抗体、或编码前面任一所述的融合蛋白。

在本发明的另一方面，提供一种构建体，含有所述的分离的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种抗体表达***，所述表达***含有所述的构建体或基因组中整合有外源的所述的多核苷酸；较佳地所述表达***为细胞表达***。

在另一优选例中，在适合表达所述抗体的条件下，利用所述的抗体表达***进行表达，从而表达出所述的抗体或融合蛋白；较佳地，还包括纯化分离出所述抗体或融合蛋白。

在本发明的另一方面，提供一种免疫缀合物，其包括：(A)前面任一所述的纳米抗体、或前面任一所述的融合蛋白；以及(B)与(A)连接(包括但不限于共价连接、偶联、附着、吸附)的功能性分子。

在另一优选例中，所述(B)包括(但不限于)：细胞毒素，放射性同位素，生物活性蛋白质，靶向肿瘤表面标志物的分子，抑制肿瘤的分子，靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物，基于嵌合抗原受体技术(CAR)的胞外铰链区、跨膜区及胞内信号区，或其组合。

在另一优选例中，所述靶向肿瘤表面标志物的分子是结合肿瘤表面标志物的抗体或配体；或所述的抑制肿瘤的分子是抗肿瘤的细胞因子或抗肿瘤的毒素。

在另一优选例中，所述的细胞因子例如(但不限于)：IL-12、IL-15、IFN-beta、TNF-alpha。

在另一优选例中，所述的可检测标记物例如(但不限于)：荧光标记物、显色标记物。

在另一优选例中，所述的结合肿瘤表面标志物的抗体是识别PD-L1以外的其它抗原的抗体，所述的其它抗原例如(但不限于)：EGFR，EGFRvIII，mesothelin，HER2，EphA2，Her3，EpCAM，MUC1，MUC16，CEA，Claudin 18.2，叶酸受体，Claudin 6，WT1，NY-ESO-1，MAGE3，ASGPR1或CDH16。

在另一优选例中，所述的胞内信号区如但不限于：CD3ζ链，FcεRIγ酪氨酸激活基序，共刺激信号分子CD27、CD28、CD137、CD134、MyD88、CD40等的胞内信号区；或所述跨膜区如但不限于：CD8或CD28的跨膜区。

在本发明的另一方面，提供一种药物组合物(包括诊断组合物，如诊断试剂)，所述药物组合物包括前面任一所述的纳米抗体、或任一所述的融合蛋白、或任一所述的免疫缀合物。

在另一优选例中，所述的药物组合物中还包括药学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供所述的纳米抗体、所述的融合蛋白、或所述的免疫缀合物、或所述的药物组合物在制备用于诊断、治疗或预防癌症的制剂、试剂盒或药盒中的用途。

在另一优选例中，所述癌症包括：肺癌、黑色素瘤、胃癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、经典霍奇金淋巴瘤、血液恶性肿瘤、头颈癌或鼻咽癌，或其组合。

在本发明的另一方面，提供所述的纳米抗体、或所述的融合蛋白、或所述的免疫缀合物、或所述的药物组合物在制备用于治疗或预防感染性疾病或慢性炎症疾病的用途。

在本发明的另一方面，提供一种试剂盒或药盒，包括所述的纳米抗体、或所述的融合蛋白、或所述的免疫缀合物、或所述的药物组合物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、本发明Anti-PDL1-Fc融合蛋白对PD-L1/PD-1相互作用的阻断曲线。

图2、荧光素酶检测试剂盒检测本发明Anti-PDL1-Fc融合蛋白对Jurkat细胞免疫反应的影响。

图3、本发明Anti-PDL1-Fc融合蛋白对混合淋巴细胞的IL-2分泌的影响。

图4、本发明Anti-PDL1-Fc融合蛋白对肿瘤生长的抑制作用。

具体实施方式

本发明人经过广泛筛选及深入研究，揭示了一类特异性抗PD-L1以及阻断PD-L1/PD-1相互作用的纳米抗体；还揭示了基于所述纳米抗体制备的人源化抗体以及融合蛋白；还揭示了它们的应用。

术语

如本文中所使用，术语“程序性死亡配体1”、“PD-配体1”、“PD-L1”、“PDL1”、“B7同源物1”、“B7-H1”、“CD274”可互换使用，包括变体、同种型、人PD-L1的物种同源物和具有PD-L1的至少一个共同表位的类似物。

术语“抗体”或“免疫球蛋白”在本文中无论是指重链抗体还是指常规4链抗体，均用作一般术语以包括全长抗体、其单个的链以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原结合结构域或片段，分别例如VHH结构域或VH/VL结构域)。此外，本文所用的术语“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“单一可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的术语中)一般应理解为既包括相关氨基酸序列，又包括编码所述序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本文需要更限定的解释。

术语“单克隆抗体”指单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体显示对特定表位的单结合特异性和亲和性。

术语(多肽或蛋白的)“结构域”是指折叠蛋白结构，其能够独立于蛋白的其余部分维持其三级结构。一般而言，结构域负责蛋白的单个的功能性质，且在许多情况下可添加、移除或转移至其他蛋白而不损失蛋白的其余部分和/或结构域的功能。

术语“单(结构)域抗体(VHH)”、“纳米抗体(nanobody)”具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常从羊驼免疫血清中先获得天然缺失轻链和重链恒定区域1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)。

术语“单(结构)域抗体(VHH)”是指包含本领域及下文中分别称为“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”的免疫球蛋白结构域，其中所述框架区由本领域及下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”间隔开。因此，单域抗体(VHH)的一般结构或序列可如下表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。单域抗体(VHH)因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。

术语“重链单域抗体”、“VHH结构域”、“VHH”、“VHH抗体片段”、“VHH抗体”以及“纳米抗体”(“Nanobody”为Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium的商标)可互换使用。

术语“IMGT编号***”是一种专门针对人和其它脊椎动物的免疫球蛋白(IG)、T细胞受体(TCR)和主要组织相容性复合物(MHC)的集成信息***，即THE INTERNATIONALIMMUNOGENETICS INFORMATION

(Lafranc等，2003，Dev.Comp.Immunol.27(1):55-77)。登录IMGT(http://www.imgt.org/IMGT_vquest)，对抗体轻链和重链基因进行分析，以确定可变区的框架区(framework regions，FR)和互补决定区(complementaritydetermining regions，CDR)。CDR在免疫球蛋白可变结构域的结构内的“位置”在物种之间是保守的，并且存在于称为环的结构中，所以通过使用根据结构特征来使可变结构域序列对齐的编号***，易于鉴定CDR和框架残基。这个信息可用于将来自一个物种的免疫球蛋白的CDR残基移植和替换至通常来自人抗体的接受体框架中。除非另有说明，否则在本说明书、权利要求书及附图中，抗PD-L1纳米抗体遵循IMGT编号***方法进行编号，用以确定CDR区和FR区。

术语“人源化抗体”指具有基本来自非人物种免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中所述分子其余的免疫球蛋白结构是基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。所述抗原结合位点可包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域，或者仅包含移植到可变结构域中适当构架区的互补性决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型的，或者通过一个或多个氨基酸替换进行修饰，例如进行修饰以与人免疫球蛋白更为相近。某些形式的人源化抗体保留了全部CDR序列(例如含有来自羊驼的全部三个CDR的人源化纳米抗体)。其他形式具有一个或多个相对于原始抗体而言发生了改变的CDR。

术语“蛋白聚集(aggregates)”：蛋白质结构通过非共价相互作用和两个半胱氨酸残基之间的二硫键来稳定。非共价相互作用包括离子相互作用和弱范德华相互作用。离子相互作用在阴离子和阳离子之间形成，并形成盐桥，有助于稳定蛋白质。它们在蛋白质的二级结构中起重要作用，例如形成α螺旋或β折叠，以及三级结构。特定蛋白质中氨基酸残基之间的相互作用在该蛋白质的最终结构中非常重要。在体外或胞外，常见于活性蛋白的工业制备中，活性蛋白所处的环境，如pH、浓度、离子强度或温度改变时，氨基酸之间的非共价相互作用发生变化，导致一个蛋白质分子的暴露疏水部分可能与其他蛋白质分子暴露的疏水区域相互作用，从而形成无定形聚集体，低聚物和高分子量的聚集物。聚集物影响了活性蛋白的稳定性，在体内，聚集物的形成容易引发免疫***的清除反应，加速药物清除并可能给机体带来免疫风险。

两个多肽序列之间的“序列相同性”指示序列之间相同氨基酸的百分比。“序列相似性”指示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列相同性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列相同性通常使用序列分析软件来测量。例如，可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定相同性。

药剂的“有效量”指引起接受其施用的细胞或组织中的生理学变化所必需的量。

药剂例如药物组合物的“治疗有效量”指在必需的剂量和时间段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、降低、延迟、最小化或预防疾病的不良效果。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，驯养的动物(例如母牛、羊、猫、犬和马)、灵长类(例如人和非人灵长类如猴)、家兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。优选地，所述个体或受试者是人。

术语“药物组合物”指其形式使得其中含有的活性成分的生物学活性有效，且不含对会接受该组合物施用的受试者有不可接受的毒性的别的成分的制剂。

“药学可接受载体”指药物组合物中活性成分以外对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

术语“治疗/预防”(及其语法变体)指试图改变治疗个体中疾病的自然进程，并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、降低疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的形成或延缓病症的进展。

术语“可检测标记物”是指可连接于抗体上的，用于确定待待测对象中特定靶标的存在与否以及存在的量的标志物。所述“可检测标记物”可以是，但不限于：酶、荧光标记、核素、量子点、胶体金等。更具体地例如可选自：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β–D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。

本发明中，所述癌症或肿瘤包括但不限于：肺癌、黑色素瘤、胃癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、经典霍奇金淋巴瘤、血液恶性肿瘤、头颈癌或鼻咽癌等，也包括它们的组合，也包括它们的转移瘤或并发症。

纳米抗体

本发明第一方面提供一种抗PD-L1纳米抗体，所述抗PD-L1纳米抗体的互补决定区CDR包括氨基酸序列如下所示的CDR1～CDR3：(1)SEQ ID NO:6所示的CDR1，SEQ ID NO:15所示的CDR2，SEQ ID NO:25所示的CDR3；或(2)SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:16所示的CDR2，SEQ ID NO:26所示的CDR3；或(3)SEQ ID NO:8所示的CDR1，SEQ ID NO:16所示的CDR2，SEQ ID NO:27所示的CDR3；或(4)SEQ ID NO:9所示的CDR1，SEQ ID NO:17所示的CDR2，SEQ ID NO:28所示的CDR3；或(5)SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:16所示的CDR2，SEQ ID NO:29所示的CDR3；或(6)SEQ ID NO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:18所示的CDR2，SEQ ID NO:30所示的CDR3。

本发明所提供的抗PD-L1抗原的纳米抗体，可以包括框架区FR，所述框架区FR包括氨基酸序列如下所示的FR1～FR4：(1’)SEQ ID NO:1所示的FR1，SEQ ID NO:11所示的FR2，SEQ ID NO:19所示的FR3，SEQ ID NO:31所示的FR4；或(2’)SEQ ID NO:2所示的FR1，SEQ IDNO:12所示的FR2，SEQ ID NO:20所示的FR3，SEQ ID NO:31所示的FR4；或(3’)SEQ ID NO:3所示的FR1，SEQ ID NO:13所示的FR2，SEQ ID NO:21所示的FR3，SEQ ID NO:31所示的FR4；或(4’)SEQ ID NO:4所示的FR1，SEQ ID NO:13所示的FR2，SEQ ID NO:22所示的FR3，SEQ IDNO:31所示的FR4；或(5’)SEQ ID NO:5所示的FR1，SEQ ID NO:12所示的FR2，SEQ ID NO:23所示的FR3，SEQ ID NO:32所示的FR4；或(6’)SEQ ID NO:5所示的FR1，SEQ ID NO:14所示的FR2，SEQ ID NO:24所示的FR3，SEQ ID NO:31所示的FR4。

抗体的抗原结合特性通常由3个互补决定区CDR来决定，所述的CDR区与FR区有序排列，FR区不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，构成了抗体的抗原结合位点。CDR区是免疫学感兴趣的蛋白质的序列，本发明的抗体的CDR区是全新的。

本发明所提供的抗PD-L1抗原的纳米抗体的氨基酸序列可以包括：a)如SEQ IDNO:33～38其中之一所示的氨基酸序列；或，b)与SEQ ID NO:33～38其中之一具有80％以上序列相同性的氨基酸序列、且具有a)所限定的氨基酸序列的功能；具体的，所述b)中的氨基酸序列具体指：如SEQ ID NO:33～38其中之一所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加或减少一个或多个(具体可以是1-50个、1-30个、1-20个、1-10个、1-5个、或1-3个)氨基酸而得到的，且具有氨基酸如SEQ ID NO:33～38其中之一所示的多肽片段的功能的多肽片段，例如，与PD-L1的特异性结合能力。所述b)中的氨基酸序列可与SEQ ID NO:33～38其中之一具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、或99％以上的同源性。本发明所提供的抗PD-L1的纳米抗体，可以与人PD-L1特异性结合，可以阻断PD-L1与PD-1的相互作用，可以提高T淋巴细胞中IFN-γ和/或IL-2表达，且可以抑制肿瘤生长。

本发明所提供的抗PD-L1抗原的纳米抗体可以是人源化抗体，所述人源化纳米抗体可以保留至少一种抗体的功能特性，例如，与PD-L1的特异性结合能力或阻断PD-L1与PD-1的相互作用。在应用本发明中特定互补决定区基础上，根据本领域技术设计的人源化抗体均应被包含在本发明中。

在本发明的优选方式中，本发明人对来自骆驼科天然来源的纳米抗体进行了人源化改造，从而进一步提高其药物安全性，有效降低抗体的免疫原性。完全人源化的重链抗体常常面临溶解性差导致蛋白聚集的问题，从而无法用于实际临床。纳米抗体人源化改造导致的溶解度下降，可能是由于VH结构域缺乏天然单克隆抗体配对的轻链所致(FrontImmunol.2017Nov 22；8:1603)。而本发明获得的经过框架区改造的人源化抗体，仍保持了很高的溶解度，使得用于实际临床应用成为可能。在本发明一具体实施方式中，所述抗PD-L1人源化纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:39～44所示。

融合蛋白

本发明第二方面提供一种抗PD-L1纳米抗体的融合蛋白，包括如本发明第一方面所提供的纳米抗体的第一结构域和用于延长体内半衰期和/或对效应细胞具有结合作用的第二结构域。所述融合蛋白可以是一种结合分子，所述结合分子能够与表达PD-L1的细胞特异性结合。

所述第二结构域中，用于延长体内半衰期的片段可以包括血清白蛋白或其片段、聚乙二醇、结合血清白蛋白的结构域(如抗血清白蛋白的纳米抗体)、聚乙二醇-脂质体复合体等。所述第二结构域中，对效应细胞具有结合作用的片段可以包括免疫球蛋白Fc区等，优选选自人免疫球蛋白Fc区。所述人免疫球蛋白Fc区中包括用于改变Fc介导的效应功能的突变，所述效应功能包括CDC活性、ADCC活性、ADCP活性中的一种或多种的组合。所述免疫球蛋白可以选自IgG、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM等中的一种或多种的组合，所述IgG具体可以选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型等中的一种或多种的组合。纳米抗体融合蛋白中包含的免疫球蛋白Fc区可以使所述融合蛋白形成二聚体，同时延长所述融合蛋白的体内半衰期和增加Fc介导的相关活性。在本发明一具体实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区可以是人IgG1的Fc区，更具体可以是野生型IgG1 Fc序列，所述序列可以被引入用于改变Fc介导的效应功能的突变，例如，a)改变Fc介导的CDC活性的突变；b).改变Fc介导的ADCC活性的突变；或c).改变Fc介导的ADCP活性的突变。此类突变描述于下列文献中：Leonard G Presta，CurrentOpinion in Immunology 2008，20:460-470；Esohe E.Idusogie et al.，J Immunol 2000，164:4178-4184；RAPHAEL A.CLYNES et al.，Nature Medicine，2000，Volume 6，Number 4:443-446；Paul R.Hinton et al.，J Immunol，2006，176:346-356。在本发明另一具体实施方式中，所述免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:45～48其中之一。

本发明所提供的抗PD-L1纳米抗体的融合蛋白中，所述第一结构域和第二结构域之间可以设有连接肽。所述连接肽可以是通过由丙氨酸(A)和/或丝氨酸(S)和/或甘氨酸(G)组成的柔性多肽链，连接肽的长度可以为3～30个氨基酸，优选为3-9个、9-12个、12-16个、16～20个，在本发明另一具体实施方式中，连接肽的长度可以为8个或15个。

分离的多核苷酸

本发明第三方面提供一种分离的多核苷酸，编码本发明第一方面所提供的纳米抗体、或编码本发明第二方面所提供的融合蛋白，所述多核苷酸可以是RNA、DNA或cDNA等。提供所述分离的多核苷酸的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过自动DNA合成和/或重组DNA技术等制备获得，也可以从适合的天然来源加以分离。

构建体

本发明第四方面提供一种构建体，所述构建体含有本发明第三方面所提供的分离的多核苷酸。所述构建体的构建方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，所述构建体可以通过体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等方法构建获得，更具体的，可以由所述的分离的多核苷酸***到表达载体的多克隆位点构建而成。本发明中的表达载体通常指本领域熟知的各种市售表达载体等，例如可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。所述载体还可以包括与这所述多核苷酸序列操作性连接的一个或多个调控序列，所述调控序列可以包括合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达氨基酸序列的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。调控序列还可以包括合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端相连，在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

通常来说，合适的载体可以包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，这些启动子可以是包括但不限于大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、毕赤酵母的甲醇氧化酶启动子和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。标记基因可用于提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，例如，可以是包括但不限于真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。当所述的多核苷酸被表达时，表达载体中还可以包括增强子序列，如果在载体中***增强子序列，则将会使转录得到增强，增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

表达***

本发明第五方面提供一种抗体的表达***，所述表达***含有本发明第四方面所提供的构建体或基因组中整合有外源的本发明第三方面所提供的多核苷酸。任何适用于表达载体进行表达的细胞都可以作为宿主细胞，例如，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，具体可以是包括但不限于大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、丝状真菌、植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、HEK293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等中的一种或多种的组合。构建所述表达***的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是包括但不限于显微注射法、基因枪法、电穿孔法、病毒介导的转化法、电子轰击法、磷酸钙沉淀法等中的一种或多种的组合。

免疫缀合物

本发明第六方面提供一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包括本发明第一方面所提供的纳米抗体、或本发明第二方面所提供的融合蛋白。所述免疫缀合物通常还包括与所述纳米抗体活融合蛋白连接(包括但不限于共价连接、偶联、附着、吸附)的功能性分子，所述功能性分子可以是包括但不限于可检测标记物、细胞毒素、放射性同位素、生物活性蛋白质、靶向肿瘤表面标志物的分子，抑制肿瘤的分子，靶向免疫细胞的表面标志物的分子等，或它们的组合。

制备所述免疫缀合物的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以将所述纳米抗体和/或融合蛋白与功能性分子直接或通过合适长度的间隔物进行连接，连接方式可以是化学交联或基因工程融合表达，从而获得所述免疫缀合物。

为了治疗目的，与治疗效应物基团例如放射性基团可能是合适的，这些放射性基团即由放射性同位素或放射性核素(例如³H、¹⁴C、¹⁵N、³³P、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹ln、¹²³l、¹²⁵l、¹³¹l、²⁰¹TI、²¹³Bi)、毒素或细胞毒性基团例如细胞生长抑制剂组成或包括其的基团。

所述免疫缀合物可包含本发明的纳米抗体或融合蛋白以及可检测标记物。所述的可检测标记物包括但不限于：荧光标记物、显色标记物、蛋白标签；如：酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。也可包含一个以上的标记物。为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记抗体的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。

本发明的纳米抗体或融合蛋白可以与标记基团(标记的多肽)偶联，然后可以使用其例如用于诊断目的。合适的标记基团可以选自放射性同位素(例如上文提到的那些)或含有放射性同位素、放射性核素的基团、荧光基团(例如荧光蛋白例如GFP、RFP等、染料、罗丹明、荧光素及其衍生物例如FITC、花青染料如和)、酶基团(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶)、化学发光基团、生物素基团、金属颗粒(例如金颗粒)、磁性颗粒(例如具有含有磁铁矿(Fe₃O₄)和/或磁赤铁矿(Fe₂O₃)的核心)、预定的多肽基团等。

所述免疫缀合物可包含本发明的纳米抗体或融合蛋白以及靶向免疫细胞的表面标志物的分子。所述靶向免疫细胞的表面标志物的分子可识别免疫细胞，其携带本发明的抗体达到免疫细胞，同时本发明的抗体可将免疫细胞靶向于肿瘤细胞，从而在利用本发明的抗体的杀伤效应的同时，还引发免疫细胞特异性地杀伤肿瘤。

所述免疫缀合物可包含本发明的纳米抗体或融合蛋白以及至少一种靶向肿瘤表面标志物的分子或抑制肿瘤的分子。所述的抑制肿瘤的分子可以是抗肿瘤的细胞因子，或抗肿瘤的毒素。例如，所述的细胞因子可以是但不限于：IL-12、IL-15、IFN-beta、TNF-alpha等。所述的靶向肿瘤表面标志物的分子例如可以与本发明的抗体协同作用，更精准地靶向肿瘤细胞。

所述免疫缀合物还可以是嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)，所述嵌合抗原受体可表达于免疫细胞。所述的“免疫细胞”与“免疫效应细胞”可互换使用，其包括：T淋巴细胞，NK细胞或NKT细胞等，优选的，为NK细胞和T淋巴细胞。所述的嵌合抗原受体一般包含顺序连接的：胞外结合区、跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含本发明的纳米抗体或融合蛋白。基于CAR技术的跨膜区和胞内信号区的设计是本领域公知的：例如跨膜区采用CD8，CD28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)CD3ζ链或FcεRIγ酪氨酸激活继续及共刺激信号分子CD28、CD27、CD137、CD134、MyD88、CD40等的胞内信号区。更具体地，针对T淋巴细胞，胞内信号区仅包含ITAM的为第一代CAR T淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-ITAM，可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应；第二代CAR T淋巴细胞加入了CD28或CD137(又名4-1BB)的胞内信号区，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-ITAM或scFv-TM-/CD137-ITAM；胞内信号区发生的B7/CD28或4-1BBL/CD137共刺激作用引起T淋巴细胞的持续增殖，并能够提高T淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高CAR T在体内的存活周期和抗肿瘤效果；第三代CAR T淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM或scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，进一步提高了CAR T在体内的存活周期和其抗肿瘤效果。

根据上述，应用本发明的纳米抗体或融合蛋白制备的嵌合抗原受体可以是包括如下的顺序连接的胞外结合区、跨膜区和胞内信号区：本发明的纳米抗体或融合蛋白、CD8和CD3ζ；本发明的纳米抗体或融合蛋白、CD8、CD137和CD3ζ；本发明的纳米抗体或融合蛋白、CD28分子的跨膜区(CD28a)、CD28分子的胞内信号区(CD28b)和CD3ζ；或本发明的纳米抗体或融合蛋白、CD28分子的跨膜区、CD28分子的胞内信号区、CD137和CD3ζ。

将该嵌合抗原受体表达于免疫效应细胞的表面，在利用本发明的抗体的杀伤效应的同时，还可使得免疫效应细胞对表达PD-L1的肿瘤细胞具有高度特异性的细胞毒性作用。

药物组合物

本发明第七方面提供一种药物组合物，包括本发明第一方面提供的抗PD-L1纳米抗体、或本发明第二方面所提供的抗PD-L1纳米抗体的融合蛋白、或本发明第六方面所提供的免疫缀合物。

所述药物组合物中还可以包括各种本领域药学上可接受的载体。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，具体可以是包括但不限于：缓冲剂，如乙酸盐、Tris、磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烃基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；蛋白质，如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；张力调节剂，诸如海藻糖和氯化钠；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；表面活性剂，如聚山梨醇酯；成盐抗衡离子，如钠；金属复合物(如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，如

或聚乙二醇(PEG)。用于体内施用的药物制剂一般是无菌的，实现药物制剂无菌的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过无菌滤膜过滤等方法来实现。本领域技术人员还可以根据药物组合物所需的剂型选择合适的药学上可接受的载体，以将其制备成不同的剂型，例如，本发明的药物组合物可以是包括但不限于片剂、注射剂、冻干剂等各种剂型。

所述药物组合物中，所述融合蛋白和免疫缀合物的含量通常是有效量的，所述有效量所对应的活性成分的含量可以根据所治疗的对象和特定给药方式来确定。例如，以药物组合物的总质量计，所述融合蛋白和免疫缀合物的含量范围可以是大约0.01～99％、0.1～70％、1～30％、0.01～0.05％、0.05～0.1％、0.1～0.3％、0.3～0.5％、0.5～1％、1～3％、3～5％、5～10％、10～20％、20～30％、30～50％、50～70％、或70～99％。

本发明的融合蛋白、免疫缀合物和药物组合物可以作为单一有效成分施用，也可以在联合治疗中施用，即与其他药剂联用。例如，所述联合治疗可以是所述融合蛋白、免疫缀合物、药物组合物联合其他至少一种抗肿瘤药物。再例如，所述联合治疗可以是所述融合蛋白、免疫缀合物、药物组合物与靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体联合使用，所述靶向其它肿瘤特异性抗原的抗体包括但不限于，抗EGFR抗体、抗VEGF抗体、抗HER2抗体、或抗Claudin18A2抗体等中的一种或多种的组合，所述抑制剂优选可以是单克隆抗体。

检测试剂盒

本发明第八方面提供一种检测试剂盒，包括本发明第一方面所提供的纳米抗体、本发明第二方面所提供的融合蛋白、或本发明第六方面所提供的免疫缀合物。所述试剂盒中还可根据需要包括：容器、对照物(阴性或阳性对照)、缓冲剂、助剂等，本领域技术人员可根据具体情况对其进行选择。所述试剂盒中也可包括使用说明书，以便于本领域技术人员操作。

本发明还进一步提供利用所述的纳米抗体检测PD-L1蛋白的检测方法，包括但不限于定性检测、定量检测和定位检测。具体地，所述检测方法包括但不限于免疫荧光测定、免疫组化和放射免疫测定等。

一种检测样品中是否存在PD-L1蛋白的方法可以包括：将样品与本发明的纳米抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在PD-L1蛋白。所述的样品可以是细胞和/或组织样品；可以将样品固定或溶解在介质中；检测在所述固定或溶解的样品中PD-L1蛋白的水平。在一些实施方式中，检测对象可以是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。在另一些实施方式中，所述纳米抗体还缀合有可用于检测或可被其他试剂检测到的荧光染料、化学物质、多肽、酶、同位素、标签等。

用途

本发明第九方面提供本发明第一方面所提供的纳米抗体、或本发明第二方面所提供的融合蛋白、或本发明第六方面所提供的免疫缀合物、或本发明第八方面所提供的药物组合物在制备用于诊断、治疗或预防与表达PD-L1的细胞相关的疾病的用途。

本发明所提供的融合蛋白、免疫缀合物、药物组合物的“治疗有效量”优选地导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于PD-L1相关肿瘤的治疗(包括如黑色素瘤)，相对于未接受治疗的对象，“治疗有效量”优选地将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％。抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物模型***中评价。或者，也可以通过检查抑制细胞生长的能力来评价，这种抑制可以通过本领域技术人员公知的试验在体外测定。治疗有效量的融合蛋白、免疫缀合物、药物组合物通常能够减小肿瘤大小，或者以其他方式缓解对象的症状。本领域技术人员可以根据实际情况选择合适的治疗有效量，例如，可以是对象的大小、对象症状的严重性和选择的特定组合物或给药途径。治疗的处方(例如，对剂量的决定等)可以是由医生确定的，通常考虑的因素包括但不限于所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及其它因素等。预防有效量指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此“预防有效量”通常低于“治疗有效量”。PD-L1本发明可诊断、治疗和/或预防的与表达PD-L1的细胞相关的疾病的实例可以包括所有表达PD-L1的癌症和肿瘤实体，具体可以是包括但不限于肺癌、黑色素瘤、胃癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、经典霍奇金淋巴瘤、血液恶性肿瘤、头颈癌和鼻咽癌，这些癌症可以为早期、中期或晚期，例如转移癌。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明。

实施例1、Anti-PDL1纳米抗体文库构建

将PDL1胞外域序列和人血清白蛋白序列构成的融合蛋白PDL1-HSA(SEQ ID NO:49)1mg和1ml的弗氏完全佐剂(sigma)混合、乳化，免疫健康羊驼(Vicugnapacos)，相隔21天后再次免疫，共免疫3次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体。3次免疫后一周，用真空采血管采取30ml羊驼血，经淋巴细胞分离液(天津市灏洋华科生物科技有限公司)分离淋巴细胞，用Trizol法提取总RNA。用反转录试剂盒(Invitrogen)按照说明书将3μg的总RNA反转录成cDNA，并利用巢氏PCR扩增VHH。回收目标VHH核酸片段，利用限制性内切酶SfiI(NEB)进行酶切，***同样酶切的噬菌体展示载体pcomb3xss(Addgene plasmid#63890；RRID:Addgene_63890)中，通过T4连接酶(Takara)连接。将连接产物转化至电转感受态细胞ER2738中，构建Anti-PDL1纳米抗体文库。通过梯度稀释铺板，测定库容大小为1.25×10⁸。与此同时，随机挑取24个克隆进行菌落PCR检测，结果表明所建文库的***率为100％。

实施例2、Anti-PDL1纳米抗体的筛选和鉴定

2.1Anti-PDL1纳米抗体的筛选

将构建的Anti-PDL1纳米抗体文库采用辅助噬菌体M13KO7(NEB)对其进行包装，并测展示文库重组噬菌体滴度为2.88×10¹³PFU/ml。将PDL1-HSA用100mM NaHCO₃ pH 8.2的包被液稀释至2μg/ml，加入100μL/孔包被酶标板，4℃放置过夜。第二天，加入200μL 3％BSA在37℃封闭1h后，加入100μL重组噬菌体(约2.88×10¹¹PFU/孔，来自实施例1构建的文库)，室温作用1h。之后用PBST(PBS中含有0.1％吐温20)洗5遍，去除非特异结合的噬菌体。将清洗好的ELISA孔，用1ml的0.1M gly-HCl 1mg/ml BSA(pH2.2)缓冲液孵育10分钟洗脱，并用1MpH8.0Tris-HCl中和。测定噬菌体滴度，滴度为5.25×10⁶PFU/ml。将上述噬菌体洗脱液进行扩增，并测定滴度为1.3×10¹³PFU/ml。使用PD-L1胞外域序列和人IgG1 FC构成的融合蛋白PDL1-FC(SEQ ID NO:50)作为包被蛋白，3％卵清蛋白(OVA)进行封闭，相同筛选过程进行第二轮筛选，第二轮淘洗的噬菌体滴度测定结果为2.54×10⁸PFU/ml。

2.2酶联免疫方法(ELISA)和TEPITOPE双筛选

从第二轮淘洗洗脱的噬菌体滴度测定板上挑取380个单克隆在96孔板进行培养，并用M13KO7辅助噬菌体进行侵染、包装，以获得重组噬菌体在上清的积累。将PDL1-HSA以200ng/孔包板，并用3％BSA室温封闭1h，以不同浓度梯度的PD1-FC(SEQ ID NO:51)进行ELISA，绘制结合曲线，计算出EC90为2.4μg/mL。将单克隆重组噬菌体上清在96孔板分别和4μg/mL的PD1-FC进行等比例混合后，取100μl/孔孵育于包被PDL1-HSA的96孔板(其中，只加终浓度2μg/mL PD1-FC的孔作为对照)，37℃孵育1小时。PBST清洗3次后，每孔加入1:20000稀释的100μl HRP-Goat anti-Human IgG Fc(Novex)，37℃孵育1小时。PBS清洗3次后加入TMB显色工作液(北京康为世纪生物科技有限公司)，室温孵育5分钟显色后，加1M硫酸终止反应，OD450nm读数。其中，对照孔PD1-FC显色明显(OD450nm值为3.375)，噬菌体竞争阳性克隆孔显色较弱或基本不显色(OD450nm数值低于0.3)。挑选竞争阳性克隆测序，去除重复序列。对获得的高亲和力阳性序列进一步进行免疫原性分析，通过基于QAM方法的预测工具TEPITOPE(Sturniolo T等，Nat.Biotechnol.17:555-561)计算跟人体免疫原性密切相关的DRB1*03:01、DRB1*07:01、DRB1*15:01、DRB3*01:01、DRB3*02:02、DRB4*01:01和DRB5*01:01等位基因的得分，排除CDR3TEPITOPE总得分高于4的序列，进一步筛选获得了高人源化程度的抗PD-L1纳米抗体序列。本发明最终获得的抗PD-L1纳米抗体的CDR3 TEPITOPE总得分大部分都<-2.0，明显低于同类抗PD-L1纳米抗体，意味着本发明抗PD-L1纳米抗体具有更低的潜在免疫原性风险。

经过多轮筛选，本发明人最终挑取其中6个竞争强阳性克隆并且TEPITOPE得分较低的Anti-PDL1纳米抗体序列。其全长序列如表1a，其中下划线所标示为CDR区。

表1a

各个抗体的框架区(FR)以及互补决定区(CDR区)如表1b。

表1b

CDR3 TEPITOPE得分见表1c。

表1c

注：PDL1-56 dAb来源于WO2017/020801A1，InnoventNb来源于CN107686520A，Nb43来源于WO2018/233574A1。InnoventNb预测了其CDR3 2-26位氨基酸的TEPITOPE。

实施例3、Anti-PDL1纳米抗体的初步评价鉴定

3.1纳米抗体在宿主大肠杆菌中表达和纯化

以筛选获得的特异性阳性序列质粒为模板，用高保真酶GVP8(通用生物***(安徽)有限公司)进行PCR扩增，在序列3’端引入组氨酸标签编码序列，PCR产物电泳并切胶回收约600bp左右的条带，将回收的PCR产物与内切酶NdeI(NEB公司)和EcoRI(NEB公司)酶切的pET32a+载体(Novagen)用重组试剂盒(近岸蛋白质科技有限公司)进行重组连接，构建大肠杆菌表达质粒，转化大肠杆菌感受态Top10F’，涂布氨苄抗性平板，培养箱37℃培养过夜。分别挑取氨苄抗性平板上的克隆，提质粒测序，确定序列在pET32a+载体上的正确***。将测序确定的大肠杆菌表达质粒，转化大肠杆菌表达宿主Rosetta(DE3)，构建大肠杆菌表达菌株。在氨苄抗性平板上挑取重组克隆、培养，并用1mM的IPTG 30℃诱导表达过夜。将诱导表达过夜的菌液进行超声破碎，12000g 4℃离心10分钟后，取上清，用Ni柱(博格隆生物技术有限公司)进行纯化，最终蛋白纯度达到90％以上。

3.2 Anti-PDL1纳米抗体对人PD-L1的特异性结合

将人PDL1-HSA或HSA(购于Sigma)200ng/孔4℃包板过夜，并用5％脱脂奶粉室温封闭1小时，将纯化的组氨酸标签融合的Anti-PDL1纳米抗体稀释至1μg/mL，100μL每孔37℃孵育1小时。PBST洗涤3次之后加入100μl/孔1:5000稀释的mouse anti his tag抗体(R&DSystems，Inc)，室温孵育1小时。PBST洗涤后加入1:10000稀释的HRP-Goat anti mouse IgG抗体(Thermo Scientific)，每孔100μl加入，室温孵育1小时。PBST洗涤之后加TMB显色工作液(北京康为世纪生物科技有限公司)显色，450nm下检测OD值。

检测结果见表2，结果显示，前述筛选到的6个克隆特异性结合人PDL1。

表2

3.3 Anti-PDL1纳米抗体对小鼠PD-L1的结合

将小鼠mPDL1-HSA融合蛋白(SEQ ID NO:52)以200ng/孔4℃包板过夜，并用5％脱脂奶粉室温封闭1小时，将纯化的组氨酸标签融合的Anti-PDL1纳米抗体稀释至1μg/mL，100μL每孔37℃孵育1小时。PBST洗涤3次之后加入100μl/孔1:5000稀释的mouse anti his tag抗体(R&D Systems，Inc)，室温孵育1小时。PBST洗涤后加入1:10000稀释的HRP-Goat antimouse IgG抗体(Thermo Scientific)，每孔100μl加入，室温孵育1小时。PBST洗涤之后加TMB显色，450nm下检测OD值。

结果显示，Anti-PDL1纳米抗体对应的OD值与不加Anti-PDL1纳米抗体的空白对照组没有明显差异，说明筛选获取的6个克隆对小鼠PDL1均不结合。

3.4 Anti-PDL1的纳米抗体蛋白的竞争性ELISA检测

将PDL1-HSA以200ng/孔4℃包板过夜，并用5％脱脂奶粉室温封闭1小时，将纯化的组氨酸标签融合的Anti-PDL1纳米抗体经梯度稀释后分别和4.8μg/mL的PD1-FC等体积混合，100μl每孔37℃孵育1小时。PBST清洗3次后，每孔加入1:20000稀释的100μl HRP-Goatanti-Human IgG Fc(Novex)，室温孵育1小时。PBS清洗3次后加入TMB底物，37℃孵育。孵育5分钟显色后，加1M硫酸终止反应，OD450nm读数，计算获得半抑制浓度(IC50值)，IC50的数值越小则抗体的特异性能越强。

结果见表3，说明本发明筛选获得的纳米抗体具有良好的结合特异性。

表3

克隆号	IC50(ng/ml)
		1A7	50.5
1D1	45.2
		1D7	55.1
1G10	62.8
		5A8	43.6
6F1	52.7

实施例4、Anti-PDL1纳米抗体的人源化

人源化方法采用VHH人源化框架移植法来进行(Vincke C，Loris R，Saerens D，Martinez-Rodriguez S，Muyldermans S，Conrath K.J Biol Chem.2009；284(5):3273-3284)。根据序列同源性设计完成的通用性人源化VHH框架h-NbBcII10FGLA(PDB编号：3EAK)，将对应的CDR区替换为Anti-PDL1纳米抗体的CDR区，并对FR2区的个别氨基酸根据人源化抗体DP-47的序列进行进一步的人源化，每个Anti-PDL1纳米抗体分别获取多种人源化变体，，在尽可能引入更多人源氨基酸的同时，从中选择溶解度高，聚体形成量少的人源化方案，从中选择溶解度高、聚体形成量少的人源化方案。对人源化的纳米抗体按实施例3.1进行表达纯化。

优选的人源化后的VHH氨基酸序列为SEQ ID NO:39～44，如表4a，其中下划线所标示为CDR区。

表4a

各个人源化变体的框架区(FR)及互补决定区(CDR区)如表4b。

表4b

各个人源化纳米抗体的人源化程度(通过与最接近的人类基因和等位基因进行序列相同性的比较)，通过IMGT/3Dstructure-DB(网站http://www.imgt.org)进行分析，可参考文献：Use of

Databases and Tools for Antibody Engineering andHumanization，Marie-Paule Lefranc等，Methods Mol Biol，907:3-37，2012。结果如表4c。

表4c

	最接近的人类基因和等位基因	序列相同性(％)
			hu1A7V3	IGHV3-6601、IGHJ401	84.2
hu1D1V3	IGHV3-2304、IGHJ401	88.7
			hu1D7V3	IGHV3-2304、IGHJ401	88.7
hu1G10V3	IGHV3-2304、IGHJ401	85.6
			hu5A8V3	IGHV3-2304、IGHJ401	88.7
hu6F1V3	IGHV3-6404、IGHJ401	87.6
			hu56V1	IGHV3-6404、IGHJ101	78.4
hu56V2	IGHV3-6404、IGHJ101	81.4
			Innovent Nb	IGHV3-6601、IGHJ502	81.2
Hualan Nb 1	IGHV3-NL101、IGHJ601	72.2
			Hualan Nb 2	IGHV3-2301、IGHJ401	78.4
Bevacizumab VH	IGHV3-3002、IGHJ401	76.8
			Adalimumab VH	IGHV3-901、IGHJ401	93.9

注：hu56V1和hu56V2分别来源于WO2017/020801A1的SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34，Innovent Nb来源于CN107686520A的SEQ ID NO:14，Hualan Nb 1和Hualan Nb 2分别来源于WO2018/233574A1的SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:14。Bevacizumab和Adalimumab为上市单抗。

实施例5、用哺乳动物细胞制备Anti-PDL1-Fc融合蛋白

5.1Anti-PDL1纳米抗体与Fc融合蛋白(Anti-PDL1-Fc)的表达和纯化

将筛选获得的特异性阳性序列(SEQ ID NO:33-38)和人源化序列(SEQ ID NO:39-44)根据CHO细胞密码子偏好性分别将氨基酸序列转换成各碱基序列，通过基因合成(南京金斯瑞生物科技有限公司)获得全长DNA。以各个DNA为模板，用高保真酶GVP8(安徽通用生物技术有限公司)进行PCR扩增，PCR产物电泳并切胶回收约600bp左右的条带，将回收的PCR产物与含有信号肽和人IgG1 Fc序列(SEQ ID NO:45)的pCDNA3.1载体进行重组连接，构建Anti-PDL1的纳米抗体与人IgG1Fc融合的细胞表达质粒，用去内毒素质粒大抽试剂盒(Biomiga)提取Anti-PDL1的纳米抗体人IgG1 Fc融合的细胞表达质粒，将质粒与转染试剂PEI(Polysciences，Inc.)1:3混合均匀后静置30min，然后加入到HEK293F细胞中，37℃，5％CO₂摇床培养箱中培养7天后，离心取上清。将上清调至pH7.0后上样ProteinA亲和层析柱(博格隆生物技术有限公司)，100％0.1M Gly-HCl(pH3.0)洗脱；洗脱液预先加入10％1MTris-HCl(pH8.5)。100％洗脱液稀释至电导4ms/cm，调pH5.5后，离心(8000rpm，4℃，10min)，上清液调pH5.0上样至DSP层析柱(博格隆生物技术有限公司)，0～60％洗脱液(20mM NaAc，0.5M NaCl，pH5.0)线性洗脱，2ml/min，15min。纯度检测使用SEC-HPLC-UV分析。检测器：Agilent 1100LC；检测波长：214nm；流动相：150mM pH7.0 PB+5％异丙醇；色谱柱：Superdex 200Increase 5/150GL；运行时间：15分钟；柱温25℃。纯度都大于95％。

实施例6、鉴定Anti-PDL1-Fc融合蛋白在体外的功能

6.1Anti-PDL1-Fc融合蛋白对PD-L1结合能力鉴定

将PDL1-HSA以200ng/孔4℃包板过夜，并用5％脱脂奶粉室温封闭1小时，将Anti-PDL1-Fc融合蛋白分别用1％BSA进行梯度稀释，37℃孵育1小时。PBST清洗3次后，每孔加入1:20000稀释的100μl HRP-Goat anti-Human IgG Fc(Novex)，室温孵育1小时。PBST清洗3次后加入TMB底物，37℃孵育。孵育5分钟显色后，加1M硫酸终止反应，OD450nm读数。结果见表5。

表5

样品名	EC50(nM)
		Anti-PDL1-1A7-FC	0.07
Anti-PDL1-1D1-FC	0.07
		Anti-PDL1-1D7-FC	0.07
Anti-PDL1-1G10-FC	0.08
		Anti-PDL1-5A8-FC	0.11
Anti-PDL1-6F1-FC	0.09
		Anti-PDL1-1A7V3-Fc	0.09
Anti-PDL1-1D1V3-Fc	0.10
		Anti-PDL1-1D7V3-Fc	0.08
Anti-PDL1-1G10V3-Fc	0.10
		Anti-PDL1-5A8V3-Fc	0.08
Anti-PDL1-6F1V3-Fc	0.09

6.2鉴定anti-PD-L1纳米抗体Fc融合蛋白对PDL1-PD1相互作用的阻断效果(竞争ELISA法)

将PDL1-HSA以200ng/孔4℃包板过夜，并用5％脱脂奶粉室温封闭1小时，将Anti-PDL1-Fc融合蛋白分别用1％BSA从4μg/mL的起始浓度进行5倍梯度稀释后，分别和等体积的生物素标记的4μg/mL的bio-PD1-FC等体积混合，分别取100μL混合液至96孔板37℃孵育1小时。PBST清洗3次后，每孔加入1:50000稀释的100μL HRP-Streptavidin(JacksonImmunoResearch Inc.)，室温孵育1小时。PBST清洗3次后加入TMB底物，37℃孵育。孵育5分钟显色后，加1M硫酸终止反应，OD450nm读数，结果见表6和图1。

表6

样品名	IC50(ng/ml)
		Anti-PDL1-1A7-FC	43.52
Anti-PDL1-1D1-FC	33.50
		Anti-PDL1-1D7-FC	43.31
Anti-PDL1-1G10-FC	41.22
		Anti-PDL1-5A8-FC	46.79
Anti-PDL1-6F1-FC	39.18
		Anti-PDL1-1A7V3-Fc	33.50
Anti-PDL1-1D1V3-Fc	34.60
		Anti-PDL1-1D7V3-Fc	37.74
Anti-PDL1-1G10V3-Fc	38.65
		Anti-PDL1-5A8V3-Fc	33.50
Anti-PDL1-6F1V3-Fc	39.62

上述结果说明，本发明的纳米抗体对PDL1-PD1相互作用的阻断效果非常显著。

实施例7、鉴定Anti-PDL1-Fc融合蛋白在人类T淋巴细胞系中的功能活性

7.1细胞检测株的构建

合成CD5L-OKT3scFv-CD14(GenBank:ADN42857.1)，并用HindIII-EcoRI(Takara)酶切，***载体pCDNA3.1，构建pCDNA3.1-antiCD3TM。以人PD-L1为模板，高保真扩增得到PDL1片段重组连接***pCDNA3.1-antiCD3TM，构建pCDNA3.1-antiCD3TM-PDL1。转染CHO细胞(Thermo)，然后用G418选择10-14d来产生稳定细胞系CHO-antiCD3TM-PDL1。

以人PD1为模板扩增所得片段，与经HindIII-BamHI(Takara)酶切的PB513B1-dual-puro载体(优宝生物)重组连接，构建质粒pB-PD1。以模板pGL4.30(优宝生物)高保真扩增所得片段，与经SfiI-XbaI(Takara)酶切的pB-PD1载体重组连接，构建pB-NFAT-Luc2p-PD1质粒。质粒成功构建后用去内毒素质粒大抽试剂盒(Biomiga)提取质粒用于转染jurkat细胞(中国科学院干细胞库)。参考专利CN 107022571A中的方法，通过使用0.1mg/ml的多聚-D-赖氨酸将jurkat细胞处理成相对贴壁的状态，然后根据脂质体转染试剂盒(Lipofectamine 3000；invitrogen)中的转染说明对jurkat细胞进行转染；第三天用含有10％FBS的RPMI1640培养基(Thermo)含嘌呤霉素2.5μg/ml进行加压筛选；此后每隔一段时间补加培养基，待细胞活率恢复后逐渐增加嘌呤霉素的含量为4μg/ml。最终获得Jurkat-NFAT-Luc2p-PD1细胞株。

7.2鉴定Anti-PDL1-FC融合蛋白阻断PDL1和PD1通路的能力

取CHO-CD3TM-PD-L1、Jurkat-NFAT-Luc2p-PD-1细胞并计数，调整细胞密度为4×10⁶/ml，96孔板中每孔每个细胞各加入25μl；本实验将Anti-PDL1-Fc融合蛋白、阳性对照组Durvalumab(阿斯利康)和56-Fc(来源于WO2017/020801A1的SEQ ID NO:42)、阴性对照组ch-175D10(来源于US9751934B2专利)分别用1％BSA进行梯度稀释，加入50μl上述抗体至细胞中，使得抗体的终浓度为130、43.4、14.5、4.82、1.61、0.536、0.179、0.0595nM；37℃、5％CO₂共培养6h后，每孔加入10μl荧光素酶底物，振荡器上震荡2min，读数。操作如试剂盒说明(荧光素酶检测试剂盒；Lot:0000339727；Promega)。

图2结果显示，加入Anti-PDL1抗体后可以阻断效靶细胞表面PD-1/PD-L1的结合，有剂量反应曲线；同时具有特异性，ch-175D10(靶点为Claudin18.2)不能阻断PD-L1和PD1通路结合。

由图2也可见，本发明优化获得的Anti-PDL1抗体的阻断效靶细胞表面PD-1/PD-L1的结合的能力优于阳性对照Durvalumab和56-Fc。

实施例8、鉴定Anti-PDL1-Fc融合蛋白对PBMC的激活作用

使用淋巴细胞分离液(天津市灏洋华科生物科技有限公司)从健康人外周血中分离PBMC。将包含终浓度5μg/ml的重组抗CD3单抗(近岸蛋白质科技有限公司，货号GMP-A018)以50μl/孔在4℃包板过夜，用含2μg/ml的重组CD28单抗(近岸蛋白质科技有限公司，货号GMP-A063)稀释细胞至2×10⁶/ml，上述包被板弃去上清，用200μl/孔的PBS清洗两遍，每孔中加入200μl细胞，进行活化细胞活化24h后，加入5nM Durvalumab(阿斯利康)和5nM Anti-PDL1-Fc融合蛋白进行刺激，刺激3天后，1500rpm、5min后收集上清，取上清根据试剂盒(购自达科为公司)说明书进行细胞因子IL2的检测。

结果见图3，抗PDL1纳米抗体融合蛋白能增强PBMC分泌IL2，且其导致的IL2的倍数增加显著高于阳性对照Durvalumab。

实施例9、Anti-PDL1-Fc融合蛋白的肿瘤抑制活性研究

通过对NOD/SCID小鼠皮下移植表达人PD-L1的MC38细胞(MC38-PDL1)(南京银河公司)和人的外周单个核细胞PBMC的实验来研究Anti-PDL1-Fc融合蛋白的肿瘤抑制活性。

实验设计如下：在7-8周NOD/SCID小鼠右体侧处皮下接种50％基质胶(购自BD)中3×10⁶个MC38细胞。在肿瘤接种后15天，使带肿瘤大小100-250mm³的小鼠随机分组，每组实验组4-6只小鼠。瘤内注射来自两个健康供体的100μl汇集PBMCs(5×10⁵)。在PBMCs植入后3天，经由皮下注射以1mg/kg的剂量分别给予抗PDL1抗体及人IgG1 Fc，之后每周给药一次。在平行组中注射PBS作为阴性对照。肿瘤体积测定：采用游标卡尺测定肿瘤的最大长轴(L)和最大宽轴(W)，肿瘤体积按如下公式计算：V＝L×W²/2。

实验结果如图4所示，随着时间的推移，接种了Anti-PDL1-Fc的小鼠，其肿瘤体积相对于对照组得到了很好的控制，并没有出现显著增加的情况，说明Anti-PDL1-Fc有明显的肿瘤抑制作用。

实施例10、Anti-PDL1-Fc融合蛋白的溶解度研究

将经纯化的100mg纳米抗体用超滤管(Merck Millipore Ltd.)超滤，置换溶液为5mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)或5mM醋酸-钠(pH5.5)，25℃3500g超滤浓缩，并置换溶液2次，浓缩至不能再浓缩(离心20分钟体积无明显改变)，浓缩液8000g离心10min后测定蛋白含量，该浓度即为该条件下的溶解度。

表7

蛋白名称	序列号(SEQ ID NO:)	溶解度(mg/ml)
			Anti-PDL1-1A7V3-Fc	53	128.8
Anti-PDL1-1D1V3-Fc	54	225.3
			Anti-PDL1-1D7V3-Fc	55	132.6
Anti-PDL1-1G10V3-Fc	56	113.41
			Anti-PDL1-5A8V3-Fc	57	257.11
Anti-PDL1-6F1V3-Fc	58	59.53

根据表7，本发明优化获得的人源化Anti-PDL1-Fc融合蛋白具有良好的溶解度。本实施例中的PDL1纳米抗体是将原FR2区44位和45位的亲水性氨基酸人源化成普通人抗体的相当保守的疏水性残基G和L(表4a)，但并未影响其溶解度。

综上所述，本发明有效地克服了现有技术中的种种缺点，获得了具高度产业利用价值的抗体产品。

本发明中涉及的序列的汇总如表8。

表8

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 浙江道尔生物科技有限公司

<120> 抗PD-L1纳米抗体

<130> 195633

<160> 68

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 2

<211> 25

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 2

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 3

<211> 25

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 4

<211> 25

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 5

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 6

Gly Ser Ile Phe Ser Ala Asn Leu

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 7

Gly Gly Thr Phe Ile Thr Tyr Ala

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 8

Gly Arg Ala Phe Leu Thr Tyr Ala

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 9

Gly Arg Pro Phe Ile Thr Tyr Ala

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 10

Gly Arg Thr Phe Ser Thr His Ser

1 5

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 11

Ile Asp Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10 15

Val

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 12

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10 15

Gly

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 13

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10 15

Ala

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 14

Met His Trp Phe Arg Gln Ala Pro Glu Lys Glu Arg Val Phe Val Ala

1 5 10 15

Ala

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 15

Ile Ser Ser Arg Gly Ile Thr

1 5

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 16

Ile Ser Trp Ser Gly Ser Ser Thr

1 5

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 17

Ile Asn Trp Ser Gly Ser Ile Thr

1 5

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 18

Ile Asn Trp Asn Gly Asp Ser Thr

1 5

<210> 19

<211> 38

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 19

Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 20

<211> 38

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 20

Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Gly Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 21

<211> 38

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 21

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 22

<211> 38

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 22

Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Ala Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 23

<211> 38

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 23

Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Gln Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Arg Lys Pro Gly Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 24

<211> 38

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 24

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Val Cys

35

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 25

His Leu Phe His Thr Asp Gly Leu Gly Tyr

1 5 10

<210> 26

<211> 18

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 26

Ala Ala Lys Ile Ser Gly Ala Thr Arg Glu His Leu Met Thr Ser Tyr

1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 27

<211> 18

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 27

Ala Ala Lys Val Ser Gly Ala Thr Arg Asp His Leu Met Thr Thr Tyr

1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 28

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 28

Ala Ser Lys Arg Thr Ala Val Ala Pro Arg Ala Leu Asn Asp Tyr Asp

1 5 10 15

Phe

<210> 29

<211> 18

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 29

Ala Ala Lys Ile Ser Gly Ala Thr Arg Glu His Leu Arg Thr Ser Tyr

1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 30

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 30

Ala Ala Arg Pro Gly Ala Pro Ser Thr Ile Val Ala Met Leu Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 31

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 31

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 32

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 32

Gly Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 33

<211> 116

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 33

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ala Asn

20 25 30

Leu Ile Asp Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Ser Arg Gly Ile Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His

85 90 95

Leu Phe His Thr Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 34

<211> 125

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 34

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ile Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Trp Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Lys Ile Ser Gly Ala Thr Arg Glu His Leu Met Thr Ser Tyr

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 35

<211> 125

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 35

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Phe Leu Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Lys Val Ser Gly Ala Thr Arg Asp His Leu Met Thr Thr Tyr

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 36

<211> 124

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 36

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ile Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asn Trp Ser Gly Ser Ile Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Lys Arg Thr Ala Val Ala Pro Arg Ala Leu Asn Asp Tyr Asp

100 105 110

Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 37

<211> 125

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 37

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ile Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Trp Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Arg Lys Pro Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Lys Ile Ser Gly Ala Thr Arg Glu His Leu Arg Thr Ser Tyr

100 105 110

Asp Tyr Gly Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 38

<211> 123

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 38

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr His

20 25 30

Ser Met His Trp Phe Arg Gln Ala Pro Glu Lys Glu Arg Val Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asn Trp Asn Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Asp

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Val Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Pro Gly Ala Pro Ser Thr Ile Val Ala Met Leu Asp Tyr

100 105 110

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<212> PRT

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<221> CHAIN

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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ala Asn

20 25 30

Leu Ile Asp Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Ser Arg Gly Ile Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His

85 90 95

Leu Phe His Thr Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<222> (1)..(125)

<223> hu1D1V3

<400> 40

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ile Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Trp Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Lys Ile Ser Gly Ala Thr Arg Glu His Leu Met Thr Ser Tyr

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<222> (1)..(125)

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<400> 41

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Phe Leu Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Lys Val Ser Gly Ala Thr Arg Asp His Leu Met Thr Thr Tyr

100 105 110

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<212> PRT

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<220>

<221> CHAIN

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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Pro Phe Ile Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asn Trp Ser Gly Ser Ile Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120

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<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<222> (1)..(125)

<223> hu5A8V3

<400> 43

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ile Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Trp Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Lys Ile Ser Gly Ala Thr Arg Glu His Leu Arg Thr Ser Tyr

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 44

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CHAIN

<222> (1)..(123)

<223> hu6F1V3

<400> 44

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr His

20 25 30

Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asn Trp Asn Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Pro Gly Ala Pro Ser Thr Ile Val Ala Met Leu Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 45

<211> 231

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(231)

<223> 天然IgG1 FC，去K

<400> 45

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

225 230

<210> 46

<211> 228

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 46

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly

225

<210> 47

<211> 231

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(231)

<223> 免疫球蛋白Fc区(减弱，去K)

<400> 47

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Gly Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

225 230

<210> 48

<211> 231

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(231)

<223> 免疫球蛋白Fc区(增强，去K)

<400> 48

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

225 230

<210> 49

<211> 815

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(815)

<223> PDL1-HSA

<400> 49

Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser

1 5 10 15

Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu

20 25 30

Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln

35 40 45

Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg

50 55 60

Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala

65 70 75 80

Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys

85 90 95

Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val

100 105 110

Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro

115 120 125

Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys

130 135 140

Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys

145 150 155 160

Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr

165 170 175

Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr

180 185 190

Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile

195 200 205

Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr Gly Gly Gly

210 215 220

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg

225 230 235 240

Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala

245 250 255

Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu

260 265 270

Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser

275 280 285

Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu

290 295 300

Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys

305 310 315 320

Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys

325 330 335

Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val

340 345 350

Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr

355 360 365

Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu

370 375 380

Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln

385 390 395 400

Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg

405 410 415

Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser

420 425 430

Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg

435 440 445

Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu

450 455 460

Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu

465 470 475 480

Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu

485 490 495

Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro

500 505 510

Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met

515 520 525

Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp

530 535 540

Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe

545 550 555 560

Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu

565 570 575

Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala

580 585 590

Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys

595 600 605

Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu

610 615 620

Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg

625 630 635 640

Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val

645 650 655

Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu

660 665 670

Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn

675 680 685

Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr

690 695 700

Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala

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Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Arg Pro Gly Ala Pro Ser Thr Ile Val Ala Met Leu Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys

115 120 125

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

145 150 155 160

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

165 170 175

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

180 185 190

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

195 200 205

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

210 215 220

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

225 230 235 240

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

245 250 255

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

260 265 270

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

275 280 285

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

290 295 300

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

305 310 315 320

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

325 330 335

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

340 345 350

Pro Gly

<210> 59

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(17)

<223> hu1A7V3 FR2

<400> 59

Ile Asp Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val Ala

1 5 10 15

Val

<210> 60

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(17)

<223> hu1D1V3/ hu5A8V3 FR2

<400> 60

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val Ala

1 5 10 15

Gly

<210> 61

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(17)

<223> hu1D7V3/ hu1G10V3/ hu6F1V3 FR2

<400> 61

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val Ala

1 5 10 15

Ala

<210> 62

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(38)

<223> hu1A7V3 FR3

<400> 62

Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 63

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(38)

<223> hu1D1V3/ hu1D7V3/ hu5A8V3/ hu6F1V3 FR3

<400> 63

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 64

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(38)

<223> hu1G10V3 FR3

<400> 64

Ala Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 65

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(17)

<223> hu1A7V3/ hu1D1V3/ hu1D7V3/ hu1G10V3/ hu5A8V3/ hu6F1V3 FR4

<400> 65

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 66

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(21)

<223> PDL1-56 dAb

<400> 66

Ala Ala Asp Ser Phe Glu Asp Pro Thr Cys Thr Leu Val Thr Ser Ser

1 5 10 15

Gly Ala Phe Gln Tyr

20

<210> 67

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(26)

<223> Innovent Nb

<400> 67

Ala Ala Pro Lys Val Gly Leu Gly Pro Arg Thr Ala Leu Gly His Leu

1 5 10 15

Ala Phe Met Thr Leu Pro Ala Leu Asn Tyr

20 25

<210> 68

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(19)

<223> Nb 43

<400> 68

Ala Ala Asp Asp Asp Tyr Tyr Ala Phe Leu Ser Arg Gly Ala Arg Asp

1 5 10 15

Phe Arg Tyr

Claims

1.一种抗PD-L1纳米抗体，其互补决定区CDR包括氨基酸序列如下所示的CDR1～CDR3：

(1)SEQ ID NO:6所示的CDR1，SEQ ID NO:15所示的CDR2，SEQ ID NO:25所示的CDR3；或

(2)SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:16所示的CDR2，SEQ ID NO:26所示的CDR3；或

(3)SEQ ID NO:8所示的CDR1，SEQ ID NO:16所示的CDR2，SEQ ID NO:27所示的CDR3；或

(4)SEQ ID NO:9所示的CDR1，SEQ ID NO:17所示的CDR2，SEQ ID NO:28所示的CDR3；或

(5)SEQ ID NO:7所示的CDR1，SEQ ID NO:16所示的CDR2，SEQ ID NO:29所示的CDR3；或

(6)SEQ ID NO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:18所示的CDR2，SEQ ID NO:30所示的CDR3。

2.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述抗PD-L1纳米抗体还分别包括框架区FR，所述框架区FR包括氨基酸序列如下所示的FR1～FR4：

(1’)SEQ ID NO:1所示的FR1，SEQ ID NO:11所示的FR2，SEQ ID NO:19所示的FR3，SEQID NO:31所示的FR4；或

(2’)SEQ ID NO:2所示的FR1，SEQ ID NO:12所示的FR2，SEQ ID NO:20所示的FR3，SEQID NO:31所示的FR4；或

(3’)SEQ ID NO:3所示的FR1，SEQ ID NO:13所示的FR2，SEQ ID NO:21所示的FR3，SEQID NO:31所示的FR4；或

(4’)SEQ ID NO:4所示的FR1，SEQ ID NO:13所示的FR2，SEQ ID NO:22所示的FR3，SEQID NO:31所示的FR4；或

(5’)SEQ ID NO:5所示的FR1，SEQ ID NO:12所示的FR2，SEQ ID NO:23所示的FR3，SEQID NO:32所示的FR4；或

(6’)SEQ ID NO:5所示的FR1，SEQ ID NO:14所示的FR2，SEQ ID NO:24所示的FR3，SEQID NO:31所示的FR4。

3.如权利要求1或2所述的纳米抗体，其特征在于，所述抗PD-L1纳米抗体包括：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:33～38任一所示的纳米抗体；或

(b)氨基酸序列与SEQ ID NO:33～38任一所示序列具有80％以上相同性、且具有(a)纳米抗体功能的纳米抗体。

4.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述抗PD-L1纳米抗体为人源化的抗体，较佳地，其框架区FR包括选自下组的氨基酸序列的FR1～FR4：

SEQ ID NO:3所示的FR1；

SEQ ID NO:59～61所示的FR2；

SEQ ID NO:62～64所示的FR3；

SEQ ID NO:65所示的FR4。

5.如权利要求1或4所述的纳米抗体，其特征在于，所述抗PD-L1纳米抗体为人源化抗体，包括：

(i)氨基酸序列如SEQ ID NO:39～44任一所示的纳米抗体；或

(ii)氨基酸序列与SEQ ID NO:39～44任一所示序列具有80％以上相同性、且具有(i)纳米抗体功能的纳米抗体。

6.一种融合蛋白，包括：

第一结构域，其为权利要求1～4任一所述的纳米抗体；以及

第二结构域，其具有延长体内半衰期作用和/或对效应细胞具有结合作用。

7.如权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二结构域包括：

免疫球蛋白Fc区，优选人免疫球蛋白Fc区；和/或

血清白蛋白或其片段、结合血清白蛋白的结构域、聚乙二醇、聚乙二醇-脂质体复合体，或其组合；和/或

对T细胞表面分子具有亲和力和/或能够与T细胞上存在的表面分子结合的分子；较佳地，所述的表面分子包括：CD3。

8.如权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，所述人免疫球蛋白Fc区中包括用于改变Fc介导的效应功能的突变，所述效应功能包括CDC活性、ADCC活性、ADCP活性中的一种或多种的组合；或

所述免疫球蛋白为选自IgG、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM中的一种或多种的组合，所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型中的一种或多种的组合；或

所述免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:45～48其中之一；或

所述第一结构域和第二结构域之间设有连接肽；所述连接肽优选选自由丙氨酸和/或丝氨酸和/或甘氨酸组成的柔性多肽链，连接肽的长度优选为3～30个氨基酸。

9.一种分离的多核苷酸，编码如权利要求1～5任一所述的纳米抗体、或编码如权利要求6～8任一所述的融合蛋白。

10.一种构建体，含有如权利要求9所述的分离的多核苷酸。

11.一种抗体表达***，所述表达***含有如权利要求10所述的构建体或基因组中整合有外源的如权利要求9所述的多核苷酸；较佳地所述表达***为细胞表达***。

12.如权利要求1～5任一所述的纳米抗体、或如权利要求6～8任一所述的融合蛋白的制备方法，包括：在适合表达所述抗体的条件下，利用如权利要求11所述的抗体表达***进行表达，从而表达出所述的抗体或融合蛋白；较佳地，还包括纯化分离出所述抗体或融合蛋白。

13.一种免疫缀合物，其包括：

(A)如权利要求1～5任一所述的纳米抗体、或如权利要求5～7任一所述的融合蛋白；以及

(B)与(A)连接的功能性分子。

14.如权利要求12所述的免疫缀合物，其特征在于，所述(B)包括：

细胞毒素，放射性同位素，生物活性蛋白质，靶向肿瘤表面标志物的分子，抑制肿瘤的分子，靶向免疫细胞的表面标志物的分子或可检测标记物，基于嵌合抗原受体技术的胞外铰链区、跨膜区及胞内信号区，或其组合；

较佳地，所述靶向肿瘤表面标志物的分子是结合肿瘤表面标志物的抗体或配体；或所述的抑制肿瘤的分子是抗肿瘤的细胞因子或抗肿瘤的毒素。

15.一种药物组合物，所述药物组合物包括如权利要求1～5任一所述的纳米抗体、或如权利要求6～7任一所述的融合蛋白、或如权利要求13～14任一所述的免疫缀合物。

16.如权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，还包括药学上可接受的载体。

17.如权利要求1～5任一所述的纳米抗体、或如权利要求6～8任一所述的融合蛋白、或如权利要求13～14任一所述的免疫缀合物、或如权利要求15～16任一所述的药物组合物在制备用于诊断、治疗或预防癌症的制剂、试剂盒或药盒中的用途。

18.如权利要求17所述的用途，其特征在于所述癌症包括：肺癌、黑色素瘤、胃癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、经典霍奇金淋巴瘤、血液恶性肿瘤、头颈癌或鼻咽癌，或其组合。

19.如权利要求1～5任一所述的纳米抗体、或如权利要求6～8任一所述的融合蛋白、或如权利要求13～14任一所述的免疫缀合物、或如权利要求15～16任一所述的药物组合物在制备用于治疗或预防感染性疾病或慢性炎症疾病的用途。

20.一种试剂盒或药盒，包括如权利要求1～5任一所述的纳米抗体、或如权利要求6～8任一所述的融合蛋白、或如权利要求13～14任一所述的免疫缀合物、或权利要求15～16任一所述的药物组合物。