TWI704228B - 肝癌的檢查方法 - Google Patents

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Abstract

本發明之課題為提供感度及特異性優異的肝癌的檢查方法或肝癌的診斷之輔助方法、以及能夠使用於此等方法之套組。

本發明之解決手段為提供包含對源自被驗體之生體試料中之free AIM進行檢測或定量之步驟之肝癌的檢測方法或肝癌的診斷之輔助方法、以及包含結合至free AIM之抗體之肝癌的檢查或診斷輔助用套組。

Description

肝癌的檢查方法
本發明係典型地關於肝癌的檢查方法或診斷之輔助方法。具體而言，本發明係關於包含檢測被驗體之生體試料中之游離巨噬細胞凋亡抑制劑(free apoptosis inhibitor of macrophage；free AIM)之肝癌的檢查方法或診斷之輔助方法。本發明係進一步關於肝癌的檢查或診斷輔助用套組。
AIM(巨噬細胞凋亡抑制劑(apoptosis inhibitor of macrophage)；亦稱為CD5L、api6、Sp α)為組織巨噬細胞特異性地產生之分子量約50kDa的分泌型蛋白質(非專利文獻1)。一般認為AIM係呈串列地連接3個屬於包含大量半胱胺酸殘基之特異性序列之清道夫受體富含半胱胺酸(scavenger receptor cysteine-rich(SRCR))結構域而成之結構，各個半胱胺酸殘基係藉由在各結構域內互相進行二硫鍵結而呈緊密的球狀立體結構。
AIM為具接著性之蛋白質，作為其結合配偶體，已有報告指出各式各樣的分子。舉例而言，已知其擁 有識別脂磷壁酸(lipoteichoic acid(LTA))或脂多醣(lipopolysaccharide(LPS))等細菌/菌類之病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns：PAMPs)，並使細菌凝集之能力(非專利文獻2)。此外，已有報告指出在體內亦大量存在有將AIM結合至在其表面或攝入細胞內之細胞，除了攝入至屬於產生細胞之巨噬細胞自身中，在脂肪細胞中係經由清道夫受體CD36藉由內吞作用進行攝入，誘導脂肪分解(非專利文獻3)。
此外，自古以來，已知在血液中，AIM係結合至IgM(非專利文獻4)。近年來，已有報告指出AIM為了不排出至尿中而在血液中安定地存在，係深切涉及與IgM之結合；幾乎所有的AIM在血液中皆與IgM形成複合體，幾乎不以非結合體存在(非專利文獻5、6)。
肝癌(hepatocellular carcinoma；HCC)為缺乏有效的治療法，且就癌種而言位於死亡原因的上位之疾患。此外，目前，與生活習慣病同時地，非酒精性脂肪性肝疾患(non-alcoholic fatty liver diseases；NAFLD)係逐漸增加。此等之中，由僅顯示出脂肪肝之狀態(non-alcoholic fatty liver；NAFL)進展成伴隨著炎症/纖維化之非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis；NASH)之患者數係顯著地增加，因而確實看來今後源自NASH之HCC發作患者數會增加(非專利文獻7)。依據此種背景，存在有關於HCC之診斷標記、及利用該等之 有效的治療法的開發之重大需求。
直至目前為止，針對AIM與肝癌之關連，存在有數篇報告。舉例而言，作為包含肝臟癌之AIM相關疾患的診斷或檢查方法，已有報告指出對採取自被檢者之試料中之AIM濃度進行測定之方法(專利文獻1)。
此外，在包含肝臟癌之肝疾患的診斷方法中，已有報告指出包含在被檢者之試料中之AIM濃度相較於健常者之試料中之AIM濃度而言為較低值之情況，便判斷前述被檢者為肝疾患或演變成肝疾患之可能性較高之肝疾患的診斷方法(專利文獻2)。
再者，已有報告指出相較於健康成人而言，HCC患者之血中AIM值係顯著地較高(非專利文獻8)；進行循環之AIM水平能夠使用作為HCC的診斷及/或預後標記(非專利文獻9)；在罹患HCC之許多肝硬化個體中，CD5L係顯著地上升(非專利文獻10)；以及在感染HCV之患者中，可發現相較於肝硬化而言，在HCC階段之CD5L表現增加(非專利文獻11)等。
然而，直至目前為止，針對未與其他結合配偶體(特定而言IgM)形成複合體之非結合體的AIM與肝癌之關係，則尚未有報告。此外，可以較高的精度區別HCC、與包含NAFL或NASH之其他肝疾患之方法亦尚未有報告。
〔先前技術文獻〕 〔專利文獻〕
〔專利文獻1〕國際公開公報WO2011/145725A1
〔專利文獻2〕國際公開公報WO2013/162021A1
〔非專利文獻〕
〔非專利文獻1〕 Miyazaki T et al. Increased Susceptibility of Thymocytes to Apoptosis in Mice Lacking AIM, a Novel Murine Macrophage-derived Soluble Factor Belonging to the Scavenger Receptor Cysteine-rich Domain Superfamily. J Exp Med 189:413-422, 1999
〔非專利文獻2〕 Sarrias MR et al. A role for human Sp alpha as a pattern recognition receptor. J Biol Chem 280：35391-35398, 2005
〔非專利文獻3〕 Kurokawa J et al. Macrophage-derived AIM is endocytosed into adipocytes and decreases lipid Ddroplets via inhibition of fatty acid synthase activity. Cell Metab 11:479-492, 2010
〔非專利文獻4〕 Tissot JD et al. IgM are associated to Sp alpha(CD5 antigen-like) . Electrophoresis 23:1203-1206, 2002.
〔非專利文獻5〕宮崎徹等人，「源自巨噬細胞之蛋白質AIM之最新見解-其多樣的機能與生活習慣病之關連性-」日本臨床71卷9號(2013-9)，1681頁-1689頁
〔非專利文獻6〕 Miyazaki T et al. Obesity-Associated Autoantibody Production Requires AIM to Retain the Immunoglobulin M Immune Complex on Follicular Dendritic Cells, Cell Reports 3, 1187-1198, April 25, 2013
〔非專利文獻7〕 Ascha MS et al. The incidence and risk factors of hepatocellular carcinoma in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology 51:1972-1978, 2010
〔非專利文獻8〕宮崎徹，脂肪溶解蛋白質AIM所引發之脂肪肝性肝細胞癌的抑制，氧化壓力與肝疾患<第10卷>99-106，2015年3月27日發行
〔非專利文獻9〕 Yamazaki T et al. “Circulating AIM as an Indicator of Liver Damage and Hepatocellular Carcinoma in Humans” PLOS ONE, 9 (10)；e109123, 2014
〔非專利文獻10〕 Gray J et al. “A proteomic strategy to identify novel serum biomarkers for liver cirrhosis and hepatocellular cancer in individuals with fatty liver disease” BMC Cancer 2009, 9:271
〔非專利文獻11〕 Sarvari J et al. “Differentially Expressed Proteins in Chronic Active Hepatitis, Cirrhosis, and HCC Related to HCV Infection in Comparison With HBV Infection: A proteomics study” Hepatitis Monthly. 2013 Jul; 13 (7) :e8351
本發明之課題係在於提供感度及特異性優異的肝癌的檢查方法或肝癌的診斷之輔助方法、以及能夠使用於此等方法之套組。
本發明者等人為了解決上述課題而反覆致力研究，結果發現在肝癌之被驗體之生體試料中，free AIM係顯著地增加。由於在血液中，以往free AIM被認為幾乎無法確認，因而在肝癌之被驗體之血清中確認到free AIM的顯著增加係格外令人驚訝。
本發明係基於上述見解而成者，以下，對本發明之實施態樣進行說明，但此等態樣並不限定本發明之範圍。
即，本發明在一實施態樣中，係關於肝癌的檢查方法，其係包含對源自被驗體之生體試料中之free AIM進行檢測或定量之步驟。本發明在另一態樣中，可為輔助肝癌的診斷之方法，其係包含對源自被驗體之生體試料中之free AIM進行檢測或定量之步驟。本發明在又一態樣中，可為對源自被驗體之生體試料中之free AIM進行檢測或定量之方法，其係用於檢查肝癌。
在本發明之方法中，前述生體試料可設為體液。此外，在本發明之方法之一實施態樣中，前述體液可 設為選自血清、血漿、全血及尿所組成群組者。
本發明之方法在一實施態樣中，其特徵為前述檢測或定量為透過免疫分析而得者。舉例而言，在本發明之方法中，前述檢測或定量可設為藉由使生體試料與結合至free AIM之抗體進行接觸而施行。在本發明之方法之一實施態樣中，前述結合至free AIM之抗體為特異性地結合至free AIM之抗體。此外，在本發明之一實施態樣中，前述檢測或定量可為透過ELISA之測定。
本發明之方法在一實施態樣中，其特徵為前述檢測或定量係在未將選自血清、血漿或全血之血液試料暴露於蛋白質變性條件且未暴露於還原條件之情形下施行。
本發明之方法在一實施態樣中，可設為進一步包含對源自被驗體之生體試料中之總巨噬細胞凋亡抑制劑(total inhibitor of macrophage；total AIM)進行定量之步驟。在本發明之方法中，在進一步包含對free AIM進行定量之步驟之情況，free AIM的量可以相對於total AIM之比率之形式算出。
本發明復關於肝癌的檢查或診斷輔助用套組，其係包含結合至free AIM之抗體。在本發明之套組之一實施態樣中，前述結合至free AIM之抗體為特異性地結合至free AIM之抗體。
在本發明中，前述肝癌為起因於非酒精性脂肪肝炎(NASH)之肝癌。
本發明係非限定性地包含以下特徵。
(1)一種肝癌的檢查方法，其係包含對源自被驗體之生體試料中之free AIM進行檢測或定量之步驟。
(2)一種輔助肝癌的診斷之方法，其係包含對源自被驗體之生體試料中之free AIM進行檢測或定量之步驟。
(3)一種對源自被驗體之生體試料中之free AIM進行檢測或定量之方法，其係用於檢查肝癌。
(4)如(1)~(3)中任一項所記載之方法，其中，前述生體試料為體液。
(5)如(4)所記載之方法，其中，前述體液係選自血清、血漿、全血及尿所組成群組。
(6)如(1)~(5)中任一項所記載之方法，其中，前述肝癌為起因於非酒精性脂肪肝炎(NASH)之肝癌。
(7)如(1)~(6)中任一項所記載之方法，其中，前述檢測或定量為透過免疫分析而得者。
(8)如(7)所記載之方法，其中，前述檢測或定量係藉由使生體試料與結合至free AIM之抗體進行接觸而施行。
(9)如(8)所記載之方法，其中，前述檢測或定量係藉由特異性地結合至free AIM之抗體施行。
(10)如(8)或(9)所記載之方法，其中，前述檢測或定量為透過ELISA之測定。
(11)如(6)~(10)中任一項所記載之方法，其中，前述檢測或定量係在未將選自血清、血漿或全血之血液試料暴露於蛋白質變性條件且未暴露於還原條件之情形下施行。
(12)如(1)或(2)所記載之方法，其係進一步包含對源自被驗體之生體試料中之total AIM進行定量之步驟。
(13)如(12)所記載之方法，其係進一步包含算出free AIM與total AIM之比率之步驟。
(14)一種肝癌的檢查或診斷輔助用套組，其係包含結合至free AIM之抗體。
(15)如(14)所記載之套組，其中，前述抗體為特異性地結合至free AIM之抗體。
(16)如(14)或(15)所記載之套組，其中，前述肝癌為起因於非酒精性脂肪肝炎(NASH)之肝癌。
根據本發明，可提供感度及特異性優異的肝癌的檢測方法或肝癌的診斷之輔助方法、以及能夠使用於此等方法之套組。
〔圖1〕圖1係示出在健常人、NAFL患者、NASH患者及NASH肝癌患者(HCC)的血清中，使用抗AIM抗體之西方墨點法(western blot)分析之結果。圖中，(A)係示出將血清暴露於還原條件之情況之結果，(B)係示出在非還原條件下之結果。
〔圖2〕圖2係示出在健常人、NAFL患者、NASH患者及NASH肝癌患者(HCC)的血清中，使用Human AIM ELISA kit(CY-8080；CircuLex公司)對free AIM進行檢測之結果。
〔圖3〕圖3係示出在NASH患者(NASH)及NASH肝癌患者(HCC)的血清中之每個纖維化階段之free AIM之定量結果。
〔圖4〕圖4係示出在NASH患者(NASH)及NASH肝癌患者(HCC)的血清中之每個纖維化階段之Total AIM之定量結果。
〔圖5〕圖5為基於以NAFL患者、NASH患者(一併而言non-HCC)及NASH肝癌患者(HCC)的血清進行定量而得之free AIM及Total AIM的量所作成之散佈圖。
〔圖6〕圖6係示出在NAFL患者、NASH患者(一併而言non-HCC)、及NASH肝癌患者(HCC)中所實施之ROC解析之結果。
以下，具體說明本發明之實施形態。
本發明所涉及之肝癌的檢查方法係包含對源自被驗體之生體試料中之free AIM進行檢測或定量之步驟。AIM係如上述，為組織巨噬細胞特異性地產生之分子量約50kDa的分泌型蛋白質，已知其係在人類及人類以外之許多哺乳類或鳥類中表現。此外，已知AIM在血液中，為了不排出至尿中而安定地存在，其大部分與IgM形成複合體，幾乎不以非結合體存在(非專利文獻5、6)。此外，亦存在有在被檢者之試料中之AIM濃度為較低值之情況，便暗示為肝疾患或演變成肝疾患之可能性較高(專利文獻2)。儘管有此等見解，此次發現在肝癌之被驗體中，生體試料中之free AIM係顯著地增加。從而，藉由對源自被驗體之生體試料中之free AIM進行檢測或定量，可以良好的檢測感度及特異性檢測出該被驗體中之肝癌。本說明書中，「free AIM」係指在生體試料中，未與 AIM之其他結合配偶體(特定而言IgM)形成複合體之非結合體的AIM。相對於此，「total AIM」係指「free AIM」、及與其他結合配偶體(例如IgM等)形成複合體之AIM(以下，亦稱為複合體AIM)的總稱，「對total AIM進行檢測或測定」係指對生體試料中之free AIM及複合體AIM兩者進行檢測或測定。
在另一態樣中，本發明係關於輔助肝癌的診斷之方法，其係包含對源自被驗體之生體試料中之free AIM進行檢測或定量之步驟。
在本說明書中，「肝癌的檢查」或「肝癌的診斷之輔助」係意味為了獲得診斷所需的情報，而對採取自被驗體之試料進行調查。從而，本發明之方法不僅可由醫療機關，亦可由例如檢驗公司等實施。
再者，在另一態樣中，本發明係關於對源自被驗體之生體試料中之free AIM進行檢測或定量之方法，其係用於檢查肝癌。
在本發明中，被驗體並無特別限制，可列舉例如有肝癌發作之疑慮、或被懷疑正在發作之被驗體。在被驗體中，復亦包含肝癌已發作之被驗體，在該情況，可在判定該種被驗體的預後之目的下、或在判定特定的肝癌治療效果之目的下，實施本發明。被驗體典型地指人類，亦可包含例如其他靈長類、囓齒類、包含犬、貓、馬、羊、豬等之其他動物。
在本發明中，肝癌係指在肝內所發生之惡性 腫瘤，其係意味在肝臟原發性發生之肝細胞癌。在一實施形態中，肝癌為起因於非酒精性脂肪肝炎(NASH)之肝癌。
在又一態樣中，本發明可進一步包含對藉由本發明之檢查方法或肝癌的診斷之輔助方法被判定為有肝癌發作之疑慮、或被懷疑正在發作之被驗體，施行肝癌的治療或處置之步驟。
在本發明中，源自被驗體之生體試料在屬於能夠採取自被驗體者之前提下，即無特別限定，可設為例如組織或體液。作為組織，可非限定地列舉卵巢、子宮、***、甲狀腺、腦、食道、舌、肺、胰臟、胃、小腸、十二指腸、大腸、膀胱、腎臟、肝臟、***、膽囊、咽頭、肌肉、骨及皮膚等，但不限定於此等。作為體液，可非限定地列舉血清、血漿或全血等血液、淋巴液、組織液、髓液、體腔液、消化液、鼻水、淚液、汗及尿等，但不限定於此等。由取得及處理的簡便性而言，較佳係使用血液或尿作為前述生體試料，更佳係使用血液，在血液之中，特佳係使用血清。此外，前述體液可為採取自被驗體之體液本身，亦可為對所採取之體液施行通常所施行之稀釋、濃縮等處理而成者。另外，施行用於本發明之源自被驗體之生體試料的採取或調製者可為與施行本發明之步驟者相同的人物，亦可為另一人物。此外，用於本發明之源自被驗體之生體試料可為在實施本發明時所採取或調製者，亦可為經預先採取或調製並保存者。
free AIM的檢測或定量方法只要是可區別free AIM、與複合體AIM並進行檢測之方法，即無特別限制，可應用通常所使用之蛋白質檢測方法。此外，該種蛋白質檢測方法較佳為可定量或半定量地測定free AIM之方法。作為該種方法，雖然並不限定於此，但可列舉使用結合至free AIM之抗體之方法、分子篩層析、離子交換層析、質量分析等。
在本發明中，用於檢測free AIM之裝置並無特別限制，可因應free AIM的檢測或測定方法而適宜選擇。具體而言，可列舉例如HPLC機器、質量分析機器(質譜儀)、電泳機器(毛細管電泳裝置等)、全自動或半自動酵素免疫測定機器、細胞清洗器、全自動或半自動化學發光免疫測定機器、發光測定裝置、全自動或半自動電化學發光免疫測定機器、光學測定裝置、平板讀數儀、CCD照相機、全自動或半自動螢光免疫測定機器、螢光測定裝置、全自動或半自動放射免疫測定機器、液體閃爍計數器、庫爾特計數器(Coulter counter)、表面電漿測定裝置、轉印裝置、光密度計等。
在本發明中，從檢測感度、特異性及簡便性之觀點而言，較佳係使用：使用結合至free AIM之抗體(本說明書中，亦稱為「抗free AIM抗體」)之方法，例如使用抗free AIM抗體之免疫分析。抗free AIM抗體只要是能夠識別並結合AIM之抗體，即無特別限制。
抗free AIM抗體係單株抗體及多株抗體皆可 依照公知的方法予以製作。單株抗體可藉由例如自以free AIM或free AIM片段進行免疫之非人類哺乳動物中單離出抗體產生細胞，使其與骨髓瘤細胞等進行融合而製作融合瘤，並將此融合瘤所產生之抗體進行精製而獲得。此外，多株抗體可自以free AIM或free AIM片段進行免疫之動物的血清中獲得。free AIM片段為free AIM之部分胜肽，抗free AIM片段抗體係識別free AIM。此外，作為免疫原，可列舉例如人類或猿猴等靈長類、大鼠或小鼠等囓齒類、犬、貓、馬、羊、豬等之free AIM或free AIM片段，但並不限定於此等。
另外，在本說明書中，「抗體」係指天然存在、或藉由基因重組技術所產生之全長的免疫球蛋白分子、或諸如抗體片段般免疫球蛋白分子之免疫學上活性的片段。在無特別斷定之前提下，本發明之抗體係所有類型、群集、亞型皆包含在內，包含例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、IgY、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2等。此等抗體可使用慣用技術予以製作，多株抗體、單株抗體皆可。作為抗體片段，可列舉F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab、Fv、scFv等。抗體片段亦可例如使用編碼出該等之核酸藉由基因重組技術予以製作，亦可將全長的抗體以酵素進行切割而予以製作。在本發明中，抗free AIM抗體較佳為單株抗體。
在本發明中，作為抗free AIM抗體之例，可列舉例如寄存於獨立行政法人製品評估技術基礎機構專利 微生物寄存中心之AIM-CL-6(受託編號：NITE BP-1092)及AIM-CL-7(受託編號：NITE BP-1093)。
在本發明中所使用之抗free AIM抗體較佳為特異性地結合至free AIM之抗體。「特異性結合」係指經測定與非特異性相互作用有所不同之結合，在本發明中進一步指相較於與IgM形成複合體之AIM而言，對free AIM具有更高的結合親和性之抗體。在本發明之一態樣中，「特異性結合」可藉由例如對free AIM保有至少約10-4M、或至少約10-5M、或至少約10-6M、或至少約10-7M、或至少約10-8M、或至少約10-9M、或至少約10-10M、或至少約10-11M、或至少約10-12M、或其以上的Kd之抗體來表示。在另一態樣中，「特異性結合」係意味結合至free AIM，而實質上不結合至包含與IgM形成複合體之AIM在內之與free AIM不同的其他多肽。
作為本發明中之免疫分析，可使用熟習該項技術者一般所使用之方法，但應選擇可區別free AIM、與複合體AIM並進行檢測或定量之方法或條件。舉例而言，在本發明之方法中，在使用尿以外之生體試料，例如選自血清、血漿或全血之血液試料之情況，於使用抗free AIM抗體之檢測或定量時，為了區別free AIM、與複合體AIM並進行檢測，較佳係視需要基於分子量施行生體試料的劃分。此外，亦較佳係自複合體AIM中分離出free AIM後，使用抗free AIM抗體施行檢測或定量。此外，在本發明之方法中，應留意不將前述生體試料暴露於會解 除與IgM結合而形成複合體之AIM的結合狀態之蛋白質變性條件或還原條件。該種蛋白質變性條件或還原條件係作為破壞或阻礙蛋白質的立體結構或蛋白質間之結合之方法或條件而為熟習該項技術者所週知。
免疫分析係使用經可檢測地標識之抗free AIM抗體、或對抗經可檢測地標識之抗free AIM抗體之抗體(二次抗體)。藉由抗體的標識法，可分類成酵素免疫分析(EIA或ELISA)、放射免疫分析(RIA)、螢光免疫分析(FIA)、螢光偏光免疫分析(FPIA)、化學發光免疫分析(CLIA)、電化學發光免疫分析(ECLIA)等，此等皆可用於本發明之方法中。
在ELISA法中，係使用經過氧化酶、鹼性磷酸酶等酵素標識之抗體，在RIA法中，係使用經125I、131I、35S、3H等放射性物質標識之抗體，在FPIA法中，係使用經螢光異硫氰酸鹽、羅丹明(rhodamine)、丹磺醯氯(dansyl chloride)、藻紅素、四甲基羅丹明異硫氰酸鹽、近紅外螢光材料等螢光物質標識之抗體，在CLIA法中，係使用經螢光素酶、螢光素、水母素(aequorin)等發光物質標識之抗體。除此以外，亦可對經金膠體、量子點等奈米粒子標識之抗體進行檢測。
此外，在免疫分析中，亦可使抗free AIM抗體結合經生物素標識、經酵素等標識之抗生物素蛋白(avidin)或鏈黴抗生素蛋白(streptavidin)，而對free AIM進行檢測、測定。
在免疫分析之中，使用酵素標識之ELISA法可簡便且迅速地對標的進行測定，實屬較佳。
在ELISA法中，可使用例如夾心法。將抗free AIM抗體固定於固相載體，添加經適宜處理之生體試料並使其進行反應後，進一步添加經酵素標識之識別另一抗原決定基之抗free AIM抗體並使其進行反應。洗淨後，藉由與酵素基質進行反應，使其顯色，並測定吸光度，可求出free AIM濃度。此外，亦可使固定於固相載體之抗free AIM抗體與生體試料中之free AIM進行反應後，添加非標識free AIM抗體(一次抗體)，將對抗此非標識抗體之抗體(二次抗體)進行酵素標識並進一步進行添加。
酵素基質在酵素為過氧化酶之情況，可使用3,3’-二胺基聯苯胺(3,3’-diaminobenzidine，DAB)、3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB)、鄰苯二胺(o-phenylenediamine，OPD)等，在鹼性磷酸酶之情況，可使用磷酸對硝基苯酯(p-nitrophenyl phosphate，NPP)等。
此外，在上述免疫分析之中，作為高感度地測定蛋白質之方法，ECLIA法亦較佳。在ECLIA法中，係將抗free AIM抗體固定於微珠粒，添加經適宜處理之生體試料並使其進行反應後，添加經標識電化學發光物質之識別另一抗原決定基之抗free AIM抗體並使其進行反應。將微珠粒洗淨後，藉由將微珠粒捕捉至電極上，施加 電能而使其發光，並測定發光量，可求出free AIM濃度。
此外，在上述免疫分析之中，作為可簡便地檢測微量的蛋白質之方法，凝集法亦較佳。作為凝集法，可列舉例如使乳膠粒子結合至抗體之乳膠凝集法。
若使抗free AIM抗體結合至乳膠粒子並混合至生體試料中，則只要free AIM存在，抗體結合乳膠粒子便會凝集。於是，可藉由對試料照射近紅外光，並測定吸光度(比濁法)或測定散射光(比朧法)而對凝集塊進行定量，求出抗原的濃度。
在本發明中，free AIM的檢測或定量可使用能夠特異性地檢測free AIM之套組。作為該套組，可列舉例如市售的套組，可依照該套組之製品說明書用於進行free AIM的檢測或定量。作為該種套組，雖然並不限定於此，但可列舉Human AIM ELISA kit(CY-8080；Circulex公司)等。
本發明之方法係除了free AIM的檢測或定量以外，亦可進一步包含對源自被驗體之生體試料中之total AIM進行定量之步驟。在例如NASH肝癌之患者中，因應肝臟之纖維化階段，在生體試料中之total AIM並未確認到顯著的增加，另一方面，就free AIM而言則可確認到顯著的增加。從而，藉由例如進一步評估total AIM的量，便可以更高的精度及特異性檢查肝癌。在本發明之一實施形態中，free AIM的量係以相對於total AIM之比率 之形式算出。
total AIM的檢測或定量可藉由熟習該項技術者所慣用之任意的蛋白質檢測方法施行，作為該種方法，雖然並不限定於此，但可列舉使用結合至AIM之抗體之方法、分子篩層析、離子交換層析、質量分析等。在本發明之一實施形態中，從特異性及簡便性之觀點而言，較佳係藉由使用結合至AIM之任意的抗體之免疫分析，例如ELISA進行測定。此外，在本發明中，用於檢測total AIM之裝置並無特別限制，可因應total AIM的檢測或測定方法而適宜選擇。
在本發明中，total AIM的檢測或定量可使用能夠特異性地檢測total AIM之套組。作為該套組，可列舉例如市售的套組，可依照該套組之製品說明書用於進行total AIM的檢測或定量。作為該種套組，雖然並不限定於此，但可列舉Human AIM ELISA kit(KK901；TransGenic公司)等。
在本發明之一實施形態中，total AIM的檢測或定量可藉由將已對free AIM進行檢測或定量之源自被驗體之生體試料暴露於蛋白質變性條件或還原條件，而將生體試料中之複合體AIM轉換成free AIM後，對free AIM的總量進行定量而施行。
此外，在本發明之一實施形態中，亦可在一測定中同時施行free AIM的檢測或定量及total AIM的檢測或定量。作為該種實施態樣，可列舉將上述使用結合至 AIM之抗體之方法及分子篩層析組合而成之方法。結合至AIM之抗體為可識別free AIM以及與其他結合配偶體形成複合體之AIM兩者之抗體，在本說明書中，亦記載為「抗AIM抗體」。從而，抗AIM抗體可為抗free AIM抗體、及/或可識別與其他結合配偶體形成複合體之AIM之抗體。在一實施形態中，抗AIM抗體為識別不同於與其他結合配偶體之複合體形成領域的free AIM上之領域之抗free AIM抗體。只要將抗AIM抗體與生體試料進行混合，在前述試料中便存在有複合體AIM或free AIM，抗AIM抗體即會結合至複合體AMI或free AIM各者。若將前述混合試料應用於分子篩層析，則抗AIM抗體所結合之free AIM與抗AIM抗體所結合之複合體AIM會以因應各自的分子量之保持時間進行分離、溶出，故而只要測定源自free AIM之尖峰及源自複合體AIM之尖峰，便可藉由一測定同時測定free AIM、複合體AIM、total AIM、及free AIM相對於total AIM之比率。如上述之藉由層析分離、測定抗體與抗原之結合物之方法係例如因日本專利特開平2-028557等而屬公知，抗AIM抗體的標識或分子篩以外之層析的應用亦無限制，可參考關於free AIM的檢測或定量及total AIM的檢測或定量之本說明書之記載，而適宜選擇及組合使用。
本發明之方法可進一步包含基於前述源自被驗體之生體試料中之free AIM的量而判定為肝癌之步驟。作為本發明中之free AIM的量，只要是前述源自被 驗體之生體試料中所包含之前述free AIM的濃度或其所對應之定量值或半定量值，即無特別限制。舉例而言，作為本發明中之free AIM的量，可列舉直接測定前述free AIM的檢測量而得之測定值、經由標識的檢測間接地測定前述free AIM的檢測量而得之測定值等。
在本發明之方法中之判定步驟中，係將源自被驗體之生體試料中之free AIM的量以例如作為對照之健常人的生體試料中之free AIM的量為基準值(截止值)進行比較，在前述源自被驗體之生體試料中之free AIM的量較大之情況，可判定為肝癌。
作為對照之健常人係意味預先判明肝癌未發作之個體。此外，free AIM的量較大係指相較於為了區別健常者與肝癌患者而設定之基準值(截止值)而言，源自被驗體之free AIM的量較大。
前述基準值可藉由例如將肝癌患者的生體試料中之free AIM的量、及作為對照之健常者群組的生體試料中之free AIM的量交付予ROC解析(Receiver Operating Characteristic analysis)等而設定。ROC解析係例如為日本臨床檢查自動化學會會誌「臨床檢查的診斷有用性評估手冊」Ver.1.3(2004.9.1)，Vol.29 Suppl.1(通卷第154號)(2004年9月1發行)所記載之解析方法，其係能夠評估疾病的檢查方法的檢測能力、診斷能力之解析方法。
此外，基準值亦可定為例如對健常者的檢測 水平之平均值加上將標準偏差倍增2倍或3倍之值所得之值，再者，可適宜定為平衡良好地滿足感度(檢測率)及特異性(偽陽性率低)之值。
可列舉例如對下述實施例3所記載之健常者的血清free AIM測定值(1.12±0.187μg/mL)及NASH肝癌患者的血清free AIM測定值(2.90±1.375μg/mL)應用上述順序，將1.681(1.12+0.187＊3)μg/mL定為對健常者之平均值加上3倍標準偏差所得之值、或者將1.494(1.12+0.187＊2)μg/mL定為對健常者之平均值加上2倍標準偏差所得之值(基於透過Human AIM ELISA kit(CY-8080，CircuLex公司)而得之測定值)，再者，設為平衡良好地滿足感度及特異性之值。
作為上述判定步驟之另一態樣，舉例而言，亦可將患者依病態等進行分組，並將患者群組彼此之free AIM的測定結果進行對比。作為該種例，可列舉下述實施例所記載之NAFL患者及NASH患者之群組(non-HCC患者群組)與NASH肝癌(HCC患者群組)之比較。此外，作為此種情況之截止值，可列舉下述實施例所記載之1.6μg/mL以上(基於透過Human AIM ELISA kit(CY-8080，CircuLex公司)而得之測定值)。
在另一態樣中，本發明係關於肝癌的檢查或診斷輔助用套組。本發明所涉及之套組，在本發明之一態樣中，係用於施行上述之本發明所涉及之肝癌的檢查方法之套組，其係包含抗free AIM抗體。在本發明之套組之 一實施形態中，抗free AIM抗體為特異性地結合至free AIM之抗體。
該檢查或診斷輔助用套組係包含為了藉由利用free AIM、與抗free AIM抗體之抗原抗體反應之免疫分析來測定生體試料中之free AIM濃度所需的試藥及裝置。
本發明之套組，在一態樣中，係用於藉由夾心ELISA法來測定free AIM濃度者，其係包含微量滴定板；捕獲用抗free AIM抗體；經鹼性磷酸酶或過氧化酶標識之抗free AIM抗體；以及鹼性磷酸酶基質(NPP等)或過氧化酶之基質(DAB、TMB、微量滴定板OPD等)。捕獲抗體及標識抗體係識別不同的抗原決定基。在此種套組之情況，首先，將捕獲抗體固定於微量滴定板，於其中添加經適宜處理並稀釋之生體試料後進行培養，去除試料並洗淨。其次，添加標識抗體後進行培養，加入基質而使其顯色。藉由使用微量滴定板讀數儀等測定顯色，可求出free AIM濃度。
本發明之套組，在另一態樣中，係用於藉由使用二次抗體之夾心ELISA法來測定free AIM濃度者，其係包含微量滴定板；捕捉用抗free AIM抗體；作為一次抗體之抗free AIM抗體；作為二次抗體之經鹼性磷酸酶或過氧化酶標識之對抗於抗free AIM抗體之抗體；以及鹼性磷酸酶之基質(NPP等)或過氧化酶之基質(DAB、TMB、OPD等)。捕獲抗體及一次抗體係識別不 同的抗原決定基。在此種套組中，首先，將捕獲抗體固定於微量滴定板，於其中添加經適宜處理並稀釋之生體試料後進行培養，去除試料並洗淨。接著，添加一次抗體並施行培養及洗淨，進一步添加經酵素標識之二次抗體並施行培養後，加入基質而使其顯色。藉由使用微量滴定板讀數儀等測定顯色，可求出free AIM濃度。藉由使用二次抗體，可使反應獲得增幅並提高檢測感度。
本發明之套組亦較佳係進一步包含必要的緩衝液、酵素反應停止液、微量板讀數儀、製品說明書等。
標識抗體並不限定於經酵素標識之抗體，亦可為經放射性物質(25I、131I、35S、3H等)、螢光物質(螢光異硫氰酸鹽、羅丹明、丹磺醯氯、藻紅素、四甲基羅丹明異硫氰酸鹽、近紅外螢光材料等)、發光物質(螢光素酶、螢光素、水母素等)、奈米粒子(金膠體、量子點)等標識之抗體。此外，亦可使用生物素化抗體作為標識抗體，並在套組中加入經標識之抗生物素蛋白或鏈黴抗生素蛋白。
作為本發明之診斷用套組之另一態樣，亦可列舉用於藉由ECLIA法來高感度地測定free AIM濃度者。此套組係包含抗free AIM抗體固相化微珠粒、電化學發光物質(釕等)標識抗free AIM抗體等。在此種套組中，於將抗free AIM抗體固相化之微珠粒中，添加經適宜處理之生體試料並使其進行反應後，去除試料並洗淨。接著，添加經標識電化學發光物質之識別另一抗原決 定基之抗free AIM抗體並使其進行反應。將微珠粒洗淨後，藉由將微珠粒捕捉至電極上，施加電能而使其發光，並測定發光量，可求出free AIM濃度。
作為本發明之診斷用套組之又一態樣，亦可列舉用於藉由乳膠凝集法來測定free AIM濃度者。此套組係包含抗free AIM抗體致敏化乳膠，並將生體試料與抗free AIM抗體進行混合，以光學方法對集塊進行定量。亦較佳係在套組中包含使凝集反應可視化之凝集反應板。
以下，示出實施例而更具體地說明本發明，但本發明不受以下所示之實施例任何限定。
〔實施例〕 (實施例1：小鼠抗人類AIM單株抗體的製作) <動物致敏化>
將作為抗原之全長人類rAIM(2mg/ml)與等量的TiterMax Gold(G-1 Funakoshi)進行混合並製作乳液。使用Balb/c小鼠(Charles River(股))8週齡的雌性2隻當作免疫動物，對後足底部投予抗原溶液50μL。在2週後施行同樣的投予，再相隔2週以上對後足底部投予抗原溶液50μg並為3日後之細胞融合進行準備。
<骨髓瘤細胞>
使用小鼠P3U1當作骨髓瘤細胞，在增殖培養中，係使用在RPMI 1640(11875-119 GIBCO)中加入麩胺酸及丙酮酸並以成為10%之方式添加FBS(S1560 BWT公司)而得之培養基。作為抗生物質，係適量加入青黴素、鏈黴素。
<細胞融合>
在麻醉下自經施行心臟採血之小鼠無菌地摘取膝窩淋巴結，置放於附有# 200篩孔之燒杯中，一面以矽棒按壓一面調製細胞懸浮液。細胞係以RPMI 1640施行2次離心洗淨後，計算細胞數。藉由離心收集並洗淨對數增殖期狀態的骨髓瘤細胞後，以淋巴細胞與骨髓瘤細胞之比率成為5比1之方式進行調製，施行混合離心。細胞融合係使用PEG1500(783641 Roche)施行。即，對細胞團粒澆淋1mL的PEG液3分鐘並使其進行反應，然後，施行階段性稀釋並以離心洗淨後，加入培養基並每200μL裝入至96孔盤共15片，施行1週的培養。使用在骨髓瘤細胞用培養基中加入HAT補充物(21060-017 GIBCO)並使FBS濃度成為15%者當作培養基。
<小鼠腹水採取>
將經凍結保存之細胞進行解凍，施行增殖培養後，對在1週以上之前經腹腔內投予0.5ml的姥鮫烷(42-002 Cosmobio)之裸小鼠(BALB/cAJcl-nu/nu日本 CLEA)的腹腔投予1×107個，在約2週後獲得4~12ml的腹水。以離心處理去除固形物後，施行凍結保存。
(實施例2：對NASH肝癌(HCC)具特異性之血清中free AIM的檢測)
將健常人4例、NAFL患者6例、NASH患者6例、NASH肝癌患者(HCC)14例的血清在還原條件及非還原條件下施行瓊脂凝膠電泳，並以抗AIM抗體施行西方墨點法。
在還原條件下，將患者血清與包含SDS及巰基乙醇之樣品緩衝液進行混合，於99℃進行還原5分鐘後，添加至e-PAGEL(ATTO股份有限公司)凝膠中，以SDS-PAGE法進行分離。在非還原條件下，將患者血清與不含SDS及巰基乙醇之樣品緩衝液進行混合，以Native-PAGE法進行分離。電泳後，將蛋白質轉印於PVDF膜(Immobilon，Millipore公司)，與實施例1所製作之小鼠抗人類AIM單株抗體以4℃、一整夜施行一次抗體反應。使用HRP結合抗小鼠IgG抗體當作二次抗體、Luminata Forte Western HRP Substrate(Millipore公司)作為檢測試藥，以Image Quant LAS 4000(GE Healthcare公司)施行訊號的檢測。
在還原條件(A)下，所有AIM分子皆脫離IgM，因而呈free AIM之單一條帶。在非還原條件(B)下，AIM並未脫離IgM，因而在健常人、NAFL患者、 NASH患者中，並未檢測到free AIM之條帶，而在NASH肝癌患者(HCC)中則可檢測到free AIM之條帶。在使用不同的患者血清之實驗1及實驗2中，可確認到同樣的結果(圖1)。此外，藉由本實驗，可確認實施例1所製作之小鼠抗人類AIM單株抗體會與AIM進行結合。
(實施例3：血清中free AIM的定量)
使用對free AIM進行定量之Human AIM ELISA kit(CY-8080，CircuLex公司)，對健常人10例、NAFL患者42例、NASH患者135例、NASH肝癌患者(HCC)26例的血清中之free AIM濃度進行測定。測定係依照套組之操作順序書實施。統計解析係使用Man-Whittney U測試，將p<0.05視為具顯著差異。
其結果，NAFL患者、NASH患者的free AIM濃度分別為1.07±0.568μg/mL、1.12±0.632μg/mL，與健常人(1.12±0.187μg/mL)無差異，而在NASH肝癌患者(HCC)中，free AIM係顯著地較高，為2.90±1.375μg/mL(圖2)。
(實施例4：肝臟之各纖維化階段中之free AIM及total AIM的定量)
使用前述對free AIM進行定量之Human AIM ELISA kit(CY-8080，CircuLex公司)，測定NASH患者135例、NASH肝癌患者(HCC)26例的血清中之free AIM 濃度。
再者，使用對total AIM進行定量之ELISA，測定患者血清中之total AIM濃度。在測定時，係使用以BCA法對濃度計值之標準物質。在該ELISA中，係依照定則，將小鼠抗人類AIM單株抗體固相化於平板，並添加患者血清。洗淨後，以HRP標識小鼠抗人類AIM單株抗體使其進行反應，並以HRP基質使其顯色。所使用之抗AIM抗體皆為依照實施例1所記載之方法製作而成之抗體，其係識別free AIM及複合體AIM雙方，且抗原決定基各自不同之抗體。
已有報告指出隨著肝臟的纖維化進展，total AIM係增加，因而依照Brunt的分類(Am J Gastroenterol.1999 Sep；94(9)：2467-2674)，將患者分成纖維化之階段1及2(F1-F2)、階段3(F3)、階段4(F4)共3組進行解析。NASH患者之中，未見到纖維化之27例除外，所解析之NASH患者及NASH肝癌患者(HCC)各者之病例數，就F1-F2而言為71例及4例、就F3而言為30例及10例、就F4而言為7例及12例。
free AIM係在所有階段中，相較於NASH患者而言，在NASH肝癌患者(HCC)中皆顯著地增加(圖3)。total AIM係在所有階段中，在NASH患者與NASH肝癌患者之間皆未見到顯著的差異(圖4)。
(實施例5：癌化所伴隨之free AIM的增加及total AIM 的增加之比較)
使用前述對free AIM進行定量之Human AIM ELISA kit(CY-8080，CircuLex公司)、及與實施例4所使用者相同的對total AIM進行定量之ELISA，測定NAFL患者42例、NASH患者135例及NASH肝癌患者(HCC)26例的血清中之free AIM濃度及total AIM濃度。隨著total AIM的增加，free AIM係增加，而相較於NAFL患者、NASH患者(一併而言non-HCC)(白圓圈)而言，NASH肝癌患者(HCC)(黑圓圈)之free AIM的增加係較顯著(圖5)。
(實施例6：NASH患者及NASH肝癌患者、纖維化進展病例、肝硬化病例中之ROC解析)
在NASH患者(135例)、及NASH肝癌患者(HCC)(26例)中，施行血清中之free AIM濃度及total AIM濃度的ROC解析(參照表1)。
AUC就free AIM而言為0.927，就total AIM而言為0.801(表1之(A))。free AIM能夠以較高的精度判別肝癌。
已知肝癌的發作係肝臟的纖維化越進展，便越容易發生。在纖維化階段3(F3)及階段4(F4)之纖維化進展病例中，施行血清中之free AIM濃度及total AIM濃度的ROC解析。在纖維化進展病例中，AUC就free AIM而言為0.918，就total AIM而言為0.709(表1之(B))。 在纖維化進展病例中，亦為free AIM能夠以較高的精度判別肝癌，而total AIM的精度則較低。
在纖維化已進展之肝硬化病例中，肝癌的發作風險最高。在階段4(F4)之肝硬化病例中，施行血清中之free AIM濃度及total AIM濃度的ROC解析。在肝硬化病例中，AUC就free AIM而言為0.869，就total AIM而言為0.506(表1之(C))。在肝硬化病例中，亦為free AIM能夠以較高的精度判別肝癌，而total AIM的精度則較低。
Figure 105129335-A0202-12-0032-1
(實施例7：non-HCC患者及HCC患者中之ROC解析)
以NAFL患者、NASH患者(一併而言non-HCC患者)(177例)、及NASH肝癌患者(HCC)(26例)為對象，針對血清中之free AIM濃度及total AIM濃度、以及free AIM濃度與total AIM濃度之比率施行ROC解析。AUC就free AIM而言為0.929，就total AIM而言為0.806，就free AIM/total AIM比而言為0.842，free AIM能夠以較高的診斷效率判別肝癌患者(參照圖6)。
(實施例8：診斷感度及特異度的解析)
針對NAFL患者、NASH患者(一併而言non-HCC)(177例)、及NASH肝癌患者(HCC)(26例)測定血中之free AIM濃度，將截止值設為1.6μg/mL，檢討透過free AIM之肝癌的診斷之價值。其結果，在NASH肝癌患者(HCC)中顯示出1.6μg/mL以上之患者為23例，診斷感度為0.885(23/26)。此外，在非為肝癌之患者中顯示出未滿1.6μg/mL之患者為152例，診斷特異度為0.859(152/177)(表2)。
Figure 105129335-A0202-12-0033-2
(實施例9：與腫瘤標記之關連性)
以NASH肝癌患者25例作為對象，針對血中之free AIM濃度、total AIM濃度、free AIM濃度與total AIM濃度之比率，檢討與腫瘤標記(PIVKA-II、AFP)之關連性。將PIVKA-II及AFP的截止值分別設為40mAU/mL、20ng/mL而將患者加以分別，針對各患者解析free AIM濃度、total AIM濃度、free AIM濃度與total AIM濃度之比率。其結果，在顯示出各腫瘤標記的截止值以上之患者群組、與顯示出未滿截止值之患者群組間之free AIM濃度、total AIM濃度、free AIM濃度與total AIM濃度之 比率皆未確認到顯著差異(表3)。
Figure 105129335-A0202-12-0034-3
〔產業上之可利用性〕
藉由使用本發明之方法及/或檢查或診斷輔助套組，可以優異的感度及特異性檢查肝癌。

Claims (16)

  1. 一種肝癌的檢查方法，其係包含對源自被驗體之生體試料中之游離巨噬細胞凋亡抑制劑(free apoptosis inhibitor of macrophage；free AIM)進行檢測或定量之步驟。
  2. 一種輔助肝癌的診斷之方法，其係包含對源自被驗體之生體試料中之free AIM進行檢測或定量之步驟。
  3. 一種對源自被驗體之生體試料中之free AIM進行檢測或定量之方法，其係用於檢查肝癌。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中，前述生體試料為體液。
  5. 如請求項4之方法，其中，前述體液係選自血清、血漿、全血及尿所組成群組。
  6. 如請求項1之方法，其中，前述肝癌為起因於非酒精性脂肪肝炎(NASH)之肝癌。
  7. 如請求項1之方法，其中，前述檢測或定量為透過免疫分析而得者。
  8. 如請求項7之方法，其中，前述檢測或定量係藉由使生體試料與結合至free AIM之抗體進行接觸而施行。
  9. 如請求項8之方法，其中，前述檢測或定量係藉由特異性地結合至free AIM之抗體施行。
  10. 如請求項8之方法，其中，前述檢測或定量為透過ELISA之測定。
  11. 如請求項8之方法，其中，前述檢測或定量係在未將選自血清、血漿或全血之血液試料暴露於蛋白質變性條件且未暴露於還原條件之情形下施行。
  12. 如請求項1或2之方法，其係進一步包含對源自被驗體之生體試料中之總巨噬細胞凋亡抑制劑(total inhibitor of macrophage；total AIM)進行定量之步驟。
  13. 如請求項12之方法，其係進一步包含算出free AIM與total AIM之比率之步驟。
  14. 一種肝癌的檢查或診斷輔助用套組，其係包含結合至free AIM之抗體。
  15. 如請求項14之套組，其中，前述抗體為特異性地結合至free AIM之抗體。
  16. 如請求項14或15之套組，其中，前述肝癌為起因於非酒精性脂肪肝炎(NASH)之肝癌。
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