ES2908448T3

ES2908448T3 - Método para examinar el cáncer de hígado

Info

Publication number: ES2908448T3
Application number: ES16844478T
Authority: ES
Inventors: Toru Miyazaki; Takeshi Okanoue; Noriyuki Koyama
Original assignee: Sekisui Medical Co Ltd; Social Welfare Organization Saiseikai Imperial Gift Foundation Inc
Current assignee: Sekisui Medical Co Ltd; Social Welfare Organization Saiseikai Imperial Gift Foundation Inc
Priority date: 2015-09-10
Filing date: 2016-09-09
Publication date: 2022-04-29
Anticipated expiration: 2036-09-09
Also published as: EP3349011A4; WO2017043617A1; JPWO2017043617A1; JP6688307B2; US20190317096A1; CN108351358A; EP3349011B1; TW201723186A; EP3349011A1; US20210123917A1; CN108351358B; TWI704228B

Abstract

Un método para examinar cáncer de hígado que comprende una etapa de cuantificación de una cantidad de inhibidor de la apoptosis de macrófagos (AIM) libre en una muestra de suero, plasma o sangre completa procedentes de un sujeto de prueba, en donde una cantidad mayor en comparación con un individuo sano de control indica cáncer de hígado, en donde AIM libre significa proteína AIM que no está en forma de complejo con otros compañeros de unión tal como IgM.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para examinar el cáncer de hígado

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para examinar el cáncer de hígado. De manera específica, la presente invención se refiere a un método para examinar el cáncer de hígado, que comprende cuantificar AIM libre en una muestra biológica de un sujeto de prueba.

Técnica anterior

El AIM (inhibidor de la apoptosis de macrófagos, por sus siglas en inglés); también denominado CD5L, api6 o Spa) es una proteína secretora que tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kDa que se produce de manera específica por macrófagos tisulares (bibliografía no relacionada con patentes 1). El AIM tiene una estructura de tres dominios ricos en cisteína de receptor eliminador (SRCR) conectados en tándem que son secuencias específicas que contienen una gran cantidad de restos de cisteína, y se cree que tiene una conformación esférica compacta debido a que cada resto de cisteína está unido a otro por enlaces disulfuro dentro de cada dominio.

AIM es una proteína adhesiva, y se han informado varias moléculas como compañeros de unión de la misma. Por ejemplo, se sabe que reconoce los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP, por sus siglas en inglés) de bacterias y hongos, como el ácido lipoteicoico (LTA, por sus siglas en inglés) o el lipopolisacárido (LPS), y tiene la capacidad de añadir bacterias (bibliografía no relacionada con patentes 2). También existen muchas células en el organismo que se unen a AIM en su superficie o lo incorporan a la célula, y se ha informado que AIM se incorpora al propio macrófago, que es la célula productora, o que se incorpora por endocitosis a través del receptor eliminador CD36. en las células grasas para inducir la degradación de las grasas (bibliografía no relacionada con patentes 3).

También se sabe desde hace mucho tiempo que AIM se une a IgM en la sangre (bibliografía no relacionada con patentes 4). En los últimos años, se ha informado que la unión a IgM está estrechamente implicada en que los AIM no se excreten en la orina y existan de manera estable en la sangre, y que casi todos los AIM forman un complejo con IgM en la sangre y rara vez están presentes en una forma sin unir (bibliografía no relacionada con patentes 5, 6).

El cáncer de hígado (carcinoma hepatocelular; HCC, por sus siglas en inglés) es una enfermedad que carece de métodos terapéuticos eficaces y es una de las principales causas de muerte entre los carcinomas. Por otro lado, actualmente se ha producido un aumento de las enfermedades del hígado graso no alcohólico (NAFLD, por sus siglas en inglés) junto con las enfermedades relacionadas con el estilo de vida. Entre éstas, debido a que el número de pacientes que han pasado de un estado de presentar únicamente hígado graso (hígado graso no alcohólico; NAFL, por sus siglas en inglés) a esteatohepatitis no alcohólica (NASH, por sus siglas en inglés) acompañada de inflamación y fibrosis está aumentando significativamente, se considera seguro que el número de pacientes que padecerán HCC derivado de NASH aumentará en el futuro (bibliografía no relacionada con patentes 7). A la luz de estos antecedentes, existe una necesidad importante relacionada con la producción de un marcador de diagnóstico de HCC y un método terapéutico eficaz que haga uso del mismo.

Ha habido varios informes hasta ahora sobre la relación entre AIM y el cáncer de hígado. Por ejemplo, se ha informado de un método para medir la concentración de AIM en una muestra recogida de un sujeto de prueba como método para diagnosticar o examinar enfermedades asociadas a AIM, incluido el cáncer de hígado (bibliografía de patentes 1).

Por otro lado, en un método para diagnosticar enfermedades hepáticas, incluido el cáncer de hígado, se informa sobre un método para diagnosticar una enfermedad hepática que comprende determinar que dicho sujeto de prueba tiene una enfermedad hepática o es muy probable que contraiga una enfermedad hepática cuando la concentración de AIM en una muestra de un sujeto de prueba es menor que la concentración de AIM en una muestra de un individuo sano (bibliografía de patentes 2).

Además, se ha informado que el valor de AIM en sangre de los pacientes con HCC es significativamente alto en comparación con los adultos sanos (bibliografía no relacionada con patentes 8), el nivel de AIM circulante puede usarse como marcador de diagnóstico y/o pronóstico de HCC (bibliografía no relacionada con patentes 9), el CD5L aumentó significativamente en muchos individuos con cirrosis hepática y HCC (bibliografía no relacionada con patentes 10), se observó un aumento en la expresión de CD5L en el estadio de HCC en comparación con la cirrosis hepática en pacientes infectados por el HCV (bibliografía no relacionada con patentes 11), etc.

Además, en la bibliografía de patentes 3 se divulgan agentes profilácticos o terapéuticos para enfermedades hepáticas, que contienen AIM o un péptido parcial del mismo, o un ácido nucleico que contiene una secuencia de bases que codifica el mismo, junto con un método de detección de una enfermedad hepática que comprende su uso en animales obtenidos mediante la sobrecarga de un mamífero no humano deficiente en la expresión de AIM con una dieta rica en grasas.

Sin embargo, no ha habido informes hasta el momento con respecto a la relación entre AIM sin unir que no ha formado un complejo con otros compañeros de unión, en particular IgM y el cáncer de hígado. Tampoco ha habido informes sobre un método que pueda discriminar HCC y otras enfermedades hepáticas, incluidas NAFL o NASH, con alta precisión.

Listado de citas

[Bibliografías de patentes]

[Bibliografía de patente 1] Publicación internacional WO2011/145725 A1

[Bibliografía de patente 2] Publicación internacional WO2013/162021 A1

[Bibliografía de patente 3] Documento US 2015/094268

[Bibliografía no relacionada con patentes]

[Bibliografía no relacionada con patentes 1] Miyazaki T et al. Increased Susceptibility of Thymocytes to Apoptosis in Mice Lacking AIM, a Novel Murine Macrophage-derived Soluble Factor Belonging to the Scavenger Receptor Cysteine-rich Domain Superfamily. J Exp Med 189:413-422, 1999

[Bibliografía no relacionada con patentes 2] Sarrias MR et al. A role for human Sp alpha as a pattern recognition receptor. J Biol Chem 280:35391-35398, 2005

[Bibliografía no relacionada con patentes 3] Kurokawa J et al. Macrophage-derived AIM is endocytosed into adipocytes and decreases lipid Ddroplets via inhibition of fatty acid synthase activity. Cell Metab 11:479-492, 2010 [Bibliografía no relacionada con patentes 4] Tissot JD et al. IgM are associated to Sp alpha (CD5 antigen-like). Electrophoresis 23:1203-1206, 2002.

[Bibliografía no relacionada con patentes 5] Miyazaki T et al., "Latest Knowledge on Macrophage-derived Protein AIM - Their Diverse Functions and Association with Lifestyle-related Diseases -", Nippon Rinsho, volumen 71, N.° 9 (2013-9) páginas 1681-1689

[Bibliografía no relacionada con patentes 6] Miyazaki T et al. Obesity-Associated Autoantibody Production Requires AIM to Retain the Immunoglobulin M Immune Complex on Follicular Dendritic Cells, Cell Reports 3, 1187-1198, 25 de abril de 2013

[Bibliografía no relacionada con patentes 7] Ascha MS et al. The incidence and risk factors of hepatocellular carcinoma in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology 51:1972-1978, 2010

[Bibliografía no relacionada con patentes 8] Miyazaki T, Suppression of Fatty Liver Hepatocellular Carcinoma by Steatolysic protein AIM, Oxidative Stress, and Liver Disease <Vol. 10> 99-106, publicado el 27 de marzo de 2015 [Bibliografía no relacionada con patentes 9] Yamazaki T et al. "Circulating AIM as an Indicator of Liver Damage and Hepatocellular Carcinoma in Humans" PlOs ONE, 9 (10); e109123, 2014

[Bibliografía no relacionada con patentes 10] Gray J et al. "A proteomic strategy to identify novel serum biomarkers for liver cirrhosis and hepatocellular cancer in individuals with fatty liver disease" BMC Cancer 2009, 9:271 [Bibliografía no relacionada con patentes 11] Sarvari J et al. "Differentially Expressed Proteins in Chronic Active Hepatitis, Cirrhosis, and HCC Related to HCV Infection in Comparison With HBV Infection: A proteomics study" Hepatitis Monthly. julio de 2013; 13 (7):e8351

Sumario de la invención

Problemas a resolver por la invención

El objeto de la presente invención es proporcionar un método para examinar el cáncer de hígado que es superior en sensibilidad y especificidad.

Medios para resolver los problemas

Como resultado de una extensa investigación repetida por parte de los presentes inventores para resolver el problema anterior, se encontró que AIM libre aumenta significativamente en una muestra biológica de un sujeto de prueba de cáncer de hígado. Como se pensaba que el AIM libre normalmente apenas podía confirmarse en sangre, fue sorprendente que, entre otras cosas, se confirmara un aumento significativo de AIM libre en el suero del sujeto de prueba de cáncer de hígado.

La presente invención se basa en el conocimiento anterior.

En otras palabras, en una realización, la presente invención se refiere a un método para examinar el cáncer de hígado que comprende una etapa de cuantificación de una cantidad de AIM libre en suero, plasma o muestra de sangre completa procedentes de un sujeto de prueba, en donde una cantidad mayor en comparación con un individuo sano de control indica cáncer de hígado, en donde AIM libre significa proteína AIM que no está en forma de complejo con otros compañeros de unión tal como IgM.

En una realización, el método de la presente invención se caracteriza por que dicha cuantificación es mediante inmunoensayo. Por ejemplo, en el método de la presente invención, dicha cuantificación puede ser aquella que se realiza poniendo en contacto una muestra biológica con un anticuerpo que se une de manera específica a AIM libre. Por otro lado, en una realización de la presente invención, dicha cuantificación se puede medir mediante ELISA.

En una realización, el método de la presente invención se caracteriza por que dicha cuantificación se realiza sin exponer el suero, plasma sanguíneo o sangre completa a una condición desnaturalizante de proteínas ni a una condición reductora.

En una realización, el método de la presente invención puede ser uno que comprenda además una etapa de cuantificación del AIM total en una muestra biológica procedente de un sujeto de prueba. En el método de la presente invención, la cantidad de AIM libre se puede calcular como la relación con el AIM total.

En la presente invención, dicho cáncer de hígado puede ser cáncer de hígado causado por esteatohepatitis no alcohólica (NASH).

La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas cuya materia objeto se reproduce a continuación.

(1) Un método para examinar el cáncer de hígado que comprende una etapa de cuantificación de una cantidad de AIM libre en una muestra de suero, plasma o sangre completa procedente de un sujeto de prueba en donde una cantidad mayor en comparación con un individuo sano de control indica cáncer de hígado, en donde AIM libre significa proteína AIM que no está en forma de complejo con otros compañeros de unión tal como IgM.

(2) El método según (1), en donde dicho cáncer de hígado es cáncer de hígado causado por esteatohepatitis no alcohólica (NASH).

(3) El método según (1) o (2), en donde dicha cuantificación es una realizada mediante inmunoensayo.

(4) El método según (3), en donde dicha cuantificación se realiza poniendo en contacto una muestra biológica con un anticuerpo que se une de manera específica a AIM libre.

(5) El método según (3) o (4), en donde dicha cuantificación se mide mediante ELISA.

(6) El método según cualquiera de (2) a (5), caracterizado por que dicha cuantificación se realiza sin exponer el suero, plasma sanguíneo o sangre completa a una condición desnaturalizante de proteínas ni a una condición reductora.

(7) El método según (1) que comprende además una etapa de cuantificación de AIM total en una muestra biológica procedente de un sujeto de prueba.

(8) El método según (7) que comprende además una etapa de cálculo de la relación de AIM libre y AIM total.

Efectos de la invención

Según la presente invención, se proporciona un método para detectar cáncer de hígado o un método para ayudar al diagnóstico de cáncer de hígado que es superior en sensibilidad y especificidad.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra el resultado del análisis de transferencia Western con un anticuerpo anti-AIM en el suero de individuos sanos, pacientes con NAFL, pacientes con NASH y pacientes con cáncer de hígado (HCC) por NASH. En las figuras, (A) muestra el resultado en el que el suero se expuso a una condición reductora y (B) muestra el resultado en una condición no reductora.

La figura 2 muestra el resultado de la detección de AIM libre con el kit ELISA para AIM humano (CY-8080; de CircuLex) en el suero de individuos sanos, pacientes con NAFL, pacientes con NASH y pacientes con cáncer de hígado (HCC) por NASH.

La figura 3 muestra el resultado de la cuantificación de AIM libre en cada estadio de fibrosis en el suero de pacientes con NASH (NASH) y pacientes con cáncer de hígado (HCC) por NASH.

La figura 4 muestra el resultado de la cuantificación de AIM total en cada estadio de fibrosis en el suero de pacientes con NASH (NASH) y pacientes con cáncer de hígado (HCC) por NASH.

La figura 5 muestra un diagrama de dispersión generado basándose en la cantidad de AIM libre y AIM total cuantificado en el suero de pacientes con NAFL, pacientes con NASH (colectivamente sin HCC) y pacientes con cáncer de hígado (HCC) por NASH.

La figura 6 muestra el resultado del análisis ROC realizado con pacientes con NAFL, pacientes con NASH (colectivamente sin HCC) y pacientes con cáncer de hígado (HCC) por NASH.

Descripción de las realizaciones

A continuación, se describirán de manera específica las realizaciones de la presente invención.

El método para examinar el cáncer de hígado según la presente invención comprende una etapa de cuantificación de AIM libre en una muestra biológica procedente de un sujeto de prueba. Tal como se describe anteriormente, AIM es una proteína secretora que tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kDa que se produce de manera específica por macrófagos tisulares y se sabe que se expresa en seres humanos y muchos mamíferos además de seres humanos, así como en aves. También se sabe que para que AIM exista de manera estable en la sangre sin excretarse en la orina, casi todos los AIM forman un complejo con IgM y rara vez están presentes como una forma sin unir (bibliografía no relacionada con patentes 5 y 6). También hay sugerencias de que la posibilidad de tener o contraer una enfermedad hepática es alta cuando la concentración de AIM en una muestra de un sujeto de prueba es un valor más bajo (bibliografía de patentes 2). A pesar de este conocimiento, ahora se ha descubierto que AIM libre en una muestra biológica aumenta significativamente en sujetos de prueba con cáncer de hígado. Por consiguiente, detectando o cuantificando el AIM libre en una muestra biológica procedente de un sujeto de prueba, el cáncer de hígado puede detectarse con buena sensibilidad y especificidad de detección en el sujeto de prueba mencionado anteriormente. "AIM libre", como se usa en el presente documento, se refiere a AIM sin unir en una muestra biológica que no ha formado un complejo con otros compañeros de unión de AIM, en particular con IgM. En cambio, "AIM total" es un término genérico para "AIM libre" y AIM que ha formado un complejo con otros compañeros de unión (tal como IgM) (en lo sucesivo, también denominado AIM en forma de complejo), y "detectar o medir AIM total" se refiere a detectar o medir tanto AIM libre como AIM en forma de complejo en una muestra biológica.

"Examinar el cáncer de hígado" o "ayudar al diagnóstico del cáncer de hígado" como se usa en el presente documento, significa inspeccionar una muestra recogida de un sujeto de prueba para obtener la información necesaria para el diagnóstico. Por consiguiente, el método de la presente invención puede llevarse a cabo no solo en una institución médica sino, por ejemplo, en una compañía de reconocimientos médicos.

En la presente invención, el sujeto de prueba no está particularmente limitado, pero incluye, por ejemplo, un sujeto de prueba que tiene riesgo de padecer o se sospecha que ha adquirido cáncer de hígado. El sujeto de prueba también incluye un sujeto de prueba que ya ha padecido cáncer de hígado, en cuyo caso la presente invención puede llevarse a cabo con el objetivo de determinar el pronóstico de dicho sujeto de prueba o para determinar el efecto de una terapia de cáncer de hígado particular. El sujeto de prueba generalmente se refiere a un ser humano, pero también puede incluir otros animales, incluidos, por ejemplo, otros primates, roedores, un perro, un gato, un caballo, una oveja, un cerdo y similares.

En la presente invención, cáncer de hígado se refiere a un tumor maligno que se forma en el hígado, y significa un carcinoma hepatocelular que se forma en primer lugar en el hígado. En una realización, el cáncer de hígado es un cáncer de hígado causado por esteatohepatitis no alcohólica (NASH).

En otro aspecto más, la presente divulgación puede comprender además una etapa de administración de una terapia o tratamiento de cáncer de hígado a un sujeto de prueba que se ha determinado que tiene riesgo de padecer o se sospecha que ha adquirido cáncer de hígado mediante el método de la presente invención para examinar el cáncer de hígado. Sin embargo, la invención no abarca dicha etapa.

En la presente invención, la muestra es suero, plasma o sangre completa.

Se prefiere emplear particularmente suero. Por otro lado, dicho fluido corporal puede ser un fluido corporal propiamente dicho que se recoge de un sujeto de prueba, o puede ser el que se somete a tratamientos tales como dilución o concentración normalmente realizados en fluidos corporales recogidos. Téngase en cuenta que la persona que recoge y prepara la muestra biológica procedente de un sujeto de prueba empleado en la presente invención puede ser la misma o diferente de la persona que realiza las etapas de la presente invención. Por otro lado, la muestra biológica procedente de un sujeto de prueba empleada en la presente invención puede recogerse o prepararse en el momento de llevar a cabo la presente invención, o recogerse o prepararse con antelación y almacenarse.

El método para detectar o cuantificar AIM libre no está particularmente restringido siempre que sea un método que pueda detectar y discriminar entre AIM libre y AIM en forma de complejo y se pueda aplicar un método de detección de proteínas empleado habitualmente. También se prefiere que dicho método de detección de proteínas sea un método que pueda cuantificar o medir semicuantitativamente AIM libre. Dicho método puede incluir, pero sin limitación, un método que emplee un anticuerpo que se una a AIM libre, cromatografía de tamiz molecular, cromatografía de intercambio iónico, espectrometría de masas y similares.

En la presente invención, el dispositivo empleado para detectar AIM libre no está particularmente restringido y puede seleccionarse de manera adecuada dependiendo del método para detectar o medir AIM libre. Este puede incluir, de manera específica, por ejemplo, un instrumento de HPLC, un instrumento de espectrometría de masas, un instrumento de electroforesis (tal como un dispositivo de electroforesis capilar), un instrumento de inmunoensayo enzimático automático o semiautomático, una lavadora de células, un instrumento de inmunoensayo quimioluminiscente automático o semiautomático, un dispositivo de medición de luminiscencia, un instrumento de inmunoensayo electroquimioluminiscente automático o semiautomático, un dispositivo de medición óptica, un lector de placas, una cámara CCD, un instrumento de inmunoensayo fluorescente automático o semiautomático, un dispositivo de medición de fluorescencia, un instrumento de radioinmunoensayo automático o semiautomático, un contador de centelleo líquido, un contador Coulter, un dispositivo de medición de plasmones superficiales, un dispositivo de transferencia, un densitómetro y similares.

En la presente invención, en términos de sensibilidad, especificidad y conveniencia de detección, se prefiere utilizar un método que emplee un anticuerpo que se una a AIM libre (también denominado en el presente documento "anticuerpo anti-AIM libre"), por ejemplo, un inmunoensayo que emplee un anticuerpo anti-AIM libre. El anticuerpo anti-AIM libre no está particularmente limitado siempre que sea un anticuerpo que pueda reconocer y unirse a AIM.

Para el anticuerpo anti-AIM libre, se pueden producir tanto anticuerpos monoclonales como policlonales según un método bien conocido. Un anticuerpo monoclonal puede obtenerse, por ejemplo, aislando células productoras de anticuerpos de un mamífero no humano inmunizado con un AIM libre o un fragmento de AIM libre, fusionándolos con células de mieloma, etc., para producir hibridomas y purificando el anticuerpo producido por este hibridoma. Por otro lado, se puede obtener un anticuerpo policlonal del suero de un animal inmunizado con un AIM libre o un fragmento de AIM libre. Un fragmento de AIM libre es un péptido parcial de AIM libre y un anticuerpo contra un fragmento de AIM libre reconoce AIM libre. Por otro lado, el inmunógeno incluye, pero sin limitación, por ejemplo, un AIM libre o un fragmento de AIM libre de primates tales como un ser humano o un mono, roedores tales como una rata o un ratón, un perro, un gato, un caballo, una oveja, un cerdo y similares.

Un "anticuerpo" tal como se usa en el presente documento se refiere a una molécula de inmunoglobulina de longitud completa que existe en la naturaleza o se produce mediante una tecnología de recombinación genética, o un fragmento inmunitariamente activo de una molécula de inmunoglobulina tal como un fragmento de anticuerpo. A menos que se indique en particular, el anticuerpo de la presente invención incluye cualquier tipo, clase o subclase, por ejemplo, incluye IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, IgY, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 y similares. Estos anticuerpos se pueden producir con una tecnología convencional y pueden ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal. Un fragmento de anticuerpo incluye F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv y similares. Un fragmento de anticuerpo se puede producir, por ejemplo, mediante tecnología de recombinación genética que emplea un ácido nucleico codificante, o también se puede producir escindiendo un anticuerpo de longitud completa con una enzima. En la presente invención, se prefiere que el anticuerpo anti-AIM libre sea un anticuerpo monoclonal.

En la presente invención, los ejemplos de un anticuerpo anti-AIM libre pueden incluir, por ejemplo, AIM-CL-6 (n.° de registro: NITE BP-1092) y AIM-CL-7 (n.° de registro: NITE BP-1093) depositados en el National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganism Depository.

Se prefiere que el anticuerpo anti-AIM libre usado en la presente invención sea un anticuerpo que se una de manera específica a AIM libre. "Unión específica" se refiere a una unión que es diferente en la medición de una interacción no específica, y además en el presente documento, a un anticuerpo que tiene mayor afinidad de unión por AIM libre que por AIM que ha formado un complejo con IgM. En un aspecto de la presente invención, la "unión específica" puede mostrarse, por ejemplo, con un anticuerpo con una Kd de al menos aproximadamente 10'4 M, o al menos aproximadamente 10'5 M, o al menos aproximadamente 10'6 M, o al menos aproximadamente 10'7 M, o al menos aproximadamente 10'8 M, o al menos aproximadamente 10'9 M, o al menos aproximadamente 10'10 M, o al menos aproximadamente 10'11 M, o al menos aproximadamente 10'12 M o más contra un AIM libre. En otro aspecto, "unión específica" significa unión a AIM libre sin unión sustancial a polipéptidos distintos de AIM libre, incluyendo AIM que ha formado un complejo con IgM.

Se puede emplear un método comúnmente utilizado por los expertos en la materia como inmunoensayo en la presente invención, aunque debe seleccionarse un método o una condición en la que se detecte o cuantifique con discriminación AIM libre y AIM en forma de complejo. Por ejemplo, en el método de la presente invención, se prefiere realizar el fraccionamiento de la muestra biológica en función del peso molecular según sea necesario tras la detección o cuantificación con un anticuerpo anti-AIM libre para que se detecten con discriminación AIM libre y AIM en forma de complejo. También se prefiere realizar la detección o cuantificación con un anticuerpo anti-AIM libre después de separar el AIM libre del AIM en forma de complejo. Por otro lado, en el método de la presente invención, se debe tener cuidado para que dicha muestra biológica no se exponga a una condición desnaturalizante o a una condición reductora de proteínas en la que se disuelva el estado unido del AIM que ha formado un complejo con IgM. Dicha una condición desnaturalizante o condición reductora de proteínas es bien conocida por los expertos en la técnica como un método o condición que destruye o inhibe la conformación de proteínas o la unión proteína-proteína.

Un inmunoensayo emplea un anticuerpo anti-AIM libre marcado de forma detectable, o un anticuerpo contra un anticuerpo anti-AIM libre marcado de forma detectable (anticuerpo secundario). Dependiendo del método de marcado del anticuerpo, se clasifican en inmunoensayo enzimático (EIA o ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayo de fluorescencia (FIA), inmunoensayos de polarización de fluorescencia (FPIA), inmunoensayo quimioluminiscente (CLIA), inmunoensayo electroquimioluminiscente (ECLIA) y similares, pudiendo emplearse cualquiera de ellos en el método de la presente invención.

Un anticuerpo marcado con una enzima tal como peroxidasa y fosfatasa alcalina se emplea en el método ELISA, con un material radiactivo tal como 125I, 131I, 35S y 3H en el método RIA, con una sustancia fluorescente tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de dansilo, ficoeritrina, isotiocianato de tetrametilrodamina y material fluorescente de infrarrojo cercano en el método FPIA y con una sustancia luminiscente tal como luciferasa, luciferina y aecuorina en el método CLIA. Además, también se puede detectar un anticuerpo marcado con una nanopartícula tal como un oro coloidal y un punto cuántico.

En un inmunoensayo, el anticuerpo anti-AlM libre también se puede marcar con biotina y unirse a avidina o estreptavidina marcada con, por ejemplo, una enzima para detectar y medir AIM libre.

Entre los inmunoensayos, se prefiere el método ELISA que emplea un marcador enzimático porque puede medir de forma conveniente y rápida una diana.

En el método ELISA, se puede emplear, por ejemplo, el método sándwich. El anticuerpo anti-AIM libre se fija en un soporte en fase sólida, se añade una muestra biológica tratada adecuadamente y se deja reaccionar, y después se añade adicionalmente un anticuerpo anti-AIM libre que reconoce otro epítopo marcado con una enzima y se deja reaccionar. Después del lavado, la mezcla se hace reaccionar con un sustrato enzimático para la aparición del color y se puede medir la absorbancia para determinar la concentración de AIM libre. Por otro lado, después de permitir que el anticuerpo anti-AIM libre fijado en el soporte en fase sólida y el AIM libre en la muestra biológica reaccionen, se añade un anticuerpo de AIM libre no marcado (anticuerpo primario), y un anticuerpo contra este anticuerpo sin marcar (anticuerpo secundario) puede marcarse con una enzima y añadirse adicionalmente.

Cuando la enzima es una peroxidasa, 3,3'-diaminobencidina (DAB), 3,3'5,5'-tetrametilbencidina (TMB), ofenilendiamina (OPD) y similares pueden emplearse como sustrato enzimático y cuando es una fosfatasa alcalina, se puede emplear p-nitrofenil fosfato (NPP) y similares.

En el inmunoensayo anterior, también se prefiere ECLIA como método para medir proteínas con alta sensibilidad. En el método ECLIA, el anticuerpo anti-AIM libre se fija a las microperlas, se añade una muestra biológica tratada adecuadamente y se deja reaccionar, y después se añade un anticuerpo anti-AIM libre que reconoce otro epítopo marcado con una sustancia electroquimioluminiscente y se deja reaccionar. Después de lavar las microperlas, las microperlas se capturan en un electrodo, se aplica energía eléctrica para permitir la luminiscencia, y la cantidad de luminiscencia se puede medir para determinar la concentración de AIM libre.

En el inmunoensayo anterior, también se prefiere el método de agregación como un método que puede detectar convenientemente una cantidad traza de proteína. Un método de agregación incluye, por ejemplo, el método de agregación de látex que tiene un anticuerpo unido a una partícula de látex.

Cuando una partícula de látex se une a un anticuerpo anti-AIM libre y se mezcla con una muestra biológica, las partículas de látex unidas al anticuerpo se añaden si hay AIM libre. Después, la masa agregada se cuantifica irradiando luz infrarroja cercana sobre la muestra y midiendo la absorbancia (turbidimetría) o la luz dispersada (nefelometría) para determinar la concentración de antígeno.

En la presente invención, se puede emplear un kit que puede detectar de manera específica AIM libre para cuantificar AIM libre. El kit mencionado anteriormente puede incluir, por ejemplo, un kit disponible comercialmente, y este puede emplearse para detectar o cuantificar AIM libre según las instrucciones del kit mencionado anteriormente. Dicho kit puede incluir, pero sin limitación, el kit ELISA para AIM humano (CY-8080; de CircuLex) y similares.

El método de la presente invención puede comprender, además de la detección o la cuantificación de AIM libre, una etapa de cuantificación de AIM total en una muestra biológica procedente de un sujeto de prueba. Por ejemplo, en pacientes con cáncer de hígado por NASH, dependiendo de la estadio de fibrosis hepática, no se observa un aumento significativo de AIM total en la muestra biológica mientras que se observa un aumento significativo de AIM libre. Por consiguiente, por ejemplo, evaluando más a fondo la cantidad de AIM total, el cáncer de hígado se puede examinar con mayor precisión y especificidad. En una realización de la presente invención, la cantidad de AIM libre se calcula como la relación con el a Im total.

La detección o cuantificación de AIM total se puede realizar mediante cualquier método de detección de proteínas convencional para los expertos en la materia y dicho método puede incluir, pero sin limitación, un método que emplea un anticuerpo que se une a AIM, cromatografía de tamiz molecular, cromatografía de intercambio iónico, espectrometría de masas y similares. En una realización de la presente invención, en términos de especificidad y conveniencia, se prefiere medir mediante un inmunoensayo que emplee cualquier anticuerpo que se una a AIM, por ejemplo, ELISA. Por otro lado, en la presente invención, el dispositivo empleado para detectar el AIM total no está particularmente restringido y puede seleccionarse de manera apropiada dependiendo del método para detectar o medir el AIM total.

En la presente invención, se puede emplear un kit que puede detectar de manera específica AIM total para detectar o cuantificar AIM total. El kit antes mencionado puede incluir, por ejemplo, un kit disponible en el mercado, y este puede emplearse para detectar o cuantificar AIM total según las instrucciones del kit mencionado anteriormente. Dicho kit puede incluir, pero sin limitación, el kit ELISA para AIM humano (KK901; de Trans Genic) y similares.

En una realización de la presente invención, la detección o cuantificación del AIM total se puede realizar convirtiendo el AIM en forma de complejo en la muestra biológica en AIM libre exponiendo una muestra biológica procedente de un sujeto de prueba que tiene AIM libre detectado o cuantificado a una condición desnaturalizante o a una condición reductora de proteínas y después cuantificar la cantidad total de AIM libre.

En una realización de la presente invención, la detección o cuantificación de AIM libre y la detección o cuantificación de AIM total también se pueden realizar simultáneamente en una medición. Dicha realización puede incluir un método que combina el método anterior que emplea un anticuerpo que se une a AIM con cromatografía de tamiz molecular. Un anticuerpo que se une a AIM es un anticuerpo que puede reconocer tanto AIM libre como AIM que ha formado un complejo con otros compañeros de unión, y también se denomina en el presente documento "anticuerpo anti-AIM". Por consiguiente, el anticuerpo anti-AIM puede ser un anticuerpo anti-AIM libre y/o un anticuerpo que puede reconocer AIM que ha formado un complejo con otros compañeros de unión. En una realización, el anticuerpo anti-AIM es un anticuerpo anti-AIM libre que reconoce una región en AIM libre que es diferente de la región que forma un complejo con otros compañeros de unión. Cuando se mezclan el anticuerpo anti-AIM y una muestra biológica, el anticuerpo anti-AIM se une a cada AIM en forma de complejo o AIM libre en caso de que estén presentes AIM en forma de complejo y AIM libre en dicha muestra. Cuando dicha muestra mezclada se somete a cromatografía de tamiz molecular, debido a que el AIM libre que tiene el anticuerpo anti-AIM unido al mismo y el AIM en forma de complejo que tiene el anticuerpo anti-AIM unido al mismo se separan y eluyen en tiempos de retención según sus respectivos pesos moleculares, la relación de AIM libre, AIM en forma de complejo, AIM total y AIM libre frente al AIM total pueden medirse simultáneamente en una medición midiendo el pico derivado del AIM libre y el pico derivado del AIM en forma de complejo. El método como el anterior de separar y medir una sustancia de anticuerpo unida y antígeno por cromatografía es bien conocido, por ejemplo, publicación de solicitud de patente japonesa sin examinar n.° H 2-028557 y similares. Tampoco existen restricciones sobre el marcado de un anticuerpo anti-AIM o la aplicación de cromatografía que no sea el tamiz molecular, y pueden seleccionarse y usarse de manera adecuada en combinación a la luz de la descripción en el presente documento sobre la detección o cuantificación de AIM libre y la detección o cuantificación de A iM total.

El método de la presente invención puede comprender además una etapa de determinación del cáncer de hígado según la cantidad de AIM libre en una muestra biológica de dicho sujeto de prueba. La cantidad de AIM libre en la presente invención no está particularmente limitada, siempre que sea la concentración de dicho AIM libre que se encuentra en una muestra biológica de dicho sujeto de ensayo o un valor cuantitativo o un valor semicuantitativo correspondiente al mismo. Los ejemplos de la cantidad de AiM libre en la presente invención pueden incluir el valor de medición de medir directamente la cantidad de dicho AIM libre detectado, el valor de medición de medir indirectamente la cantidad de dicho AIM libre detectado a través de la detección de un marcador y similares.

En la etapa de determinación del método de la presente invención, comparando la cantidad de AIM libre en una muestra biológica de un sujeto de prueba con la cantidad de AIM libre en una muestra biológica de un control individual sano como valor de referencia (valor de corte), el cáncer de hígado se puede determinar si la cantidad de AIM libre en una muestra biológica procedente de dicho sujeto de prueba es mayor.

El individuo sano de control significa un individuo del que se ha demostrado de antemano que no ha adquirido cáncer de hígado. Por otro lado, la cantidad de AIM libre es mayor se refiere a que la cantidad de AIM libre del sujeto de prueba es mayor que el valor de referencia (valor de corte) establecido para discriminar a un individuo sano de un paciente con cáncer de hígado.

Dicho valor de referencia se puede establecer por ejemplo, sometiendo la cantidad de AIM libre en una muestra biológica de un paciente con cáncer de hígado y la cantidad de AIM libre en una muestra biológica de un grupo control de individuos sanos a análisis ROC (análisis de características operativas del receptor) y similares. El análisis ROC es, por ejemplo, un método de análisis que puede evaluar la capacidad de detección y diagnóstico de un método para examinar una enfermedad, tal como un método de análisis que se describió en The Japan Society for Clinical Laboratory Automation Journal "Evaluation Manual for Diagnostic Utility of Clinical Examination", Ver. 1.3 (2004.9.1), Vol. 29 Suppl. 1 (Whole Number 154) (Published Spe. 1, 2004).

El valor de referencia también se puede establecer como, por ejemplo, la suma del valor promedio de los niveles de detección de individuos sanos y dos o tres veces el valor de la desviación estándar, y además se puede establecer de manera adecuada como un valor que cumple con la sensibilidad (tasa de detección) y la especificidad (cómo de baja es la tasa de detección de falsos positivos) de manera equilibrada.

Por ejemplo, esto incluye establecer 1,681 (1,12 0,187 * 3) pg/ml como el valor de la suma del valor promedio de los individuos sanos y tres veces la desviación estándar, o 1,494 (1,12 0,187 * 2) pg/ml como el valor de la suma del valor promedio de individuos sanos y dos veces la desviación estándar (en función del valor de medición del kit ELISA para AiM humano (CY-8080, de CircuLex)) aplicando el protocolo anterior al valor de medición de AIM libre del suero de individuos sanos (1,12 ± 0,187 pg/ml) y el valor de medición de AIM libre del suero de pacientes con cáncer de hígado NASH (2,90 ± 1,375 pg/ml) como se describe en ejemplo 3 a continuación, y ajustándolo adicionalmente a un valor que cumpla con la sensibilidad y la especificidad de manera equilibrada.

Como otro aspecto de la etapa de determinación anterior, por ejemplo, los pacientes también se pueden agrupar según la patología, etc., y se pueden comparar los resultados de medición de AiM libre entre cada grupo de pacientes. Un ejemplo de esto puede incluir la comparación del grupo de pacientes con NAFL y NASH (grupo de pacientes sin HCC) con cáncer de hígado por NASH (grupo de pacientes con HCC) como se describe en los ejemplos a continuación. Por otro lado, el valor de corte para tal caso puede incluir 1,6 |jg/ml o más (según el valor de medición del kit ELISA para AIM humano (CY-8080, de CircuLex)) como se describe en los ejemplos a continuación.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un kit para examinar o ayudar en el diagnóstico de cáncer de hígado. En un aspecto de la presente divulgación, el kit según la presente divulgación es un kit para realizar el método descrito anteriormente para examinar el cáncer de hígado según la presente invención y comprende un anticuerpo anti-AIM libre. En un aspecto del kit de la presente divulgación, un anticuerpo anti-AIM libre es un anticuerpo que se une de manera específica a AIM libre.

El kit mencionado anteriormente para examinar o ayudar al diagnóstico comprende un reactivo y un dispositivo necesario para medir la concentración de AIM libre en la muestra biológica mediante un inmunoensayo que utiliza la reacción antígeno anticuerpo entre AIM libre y un anticuerpo anti-AIM libre.

En un aspecto, el kit de la presente divulgación sirve para medir la concentración de AIM libre mediante un método ELISA sándwich y comprende una placa de microtitulación; un anticuerpo anti-AIM libre para captura; un anticuerpo anti-AIM libre marcado con una fosfatasa alcalina o una peroxidasa; y un sustrato de fosfatasa alcalina (tal como NPP) o un sustrato de peroxidasa (tal como DAB, TMB y OPD en placa de microtitulación). El anticuerpo de captura y el anticuerpo marcado reconocen diferentes epítopos. En dicho un kit, el anticuerpo de captura se fija primero en una placa de microtitulación, se le añade una muestra biológica de manera adecuada tratada y diluida y después se incuba y la muestra se retira y se lava. Posteriormente, se añade el anticuerpo marcado y después se incuba y se añade el sustrato para la aparición de color. Midiendo la aparición de color con, por ejemplo, un lector de placas de microtitulación, se puede determinar la concentración de AIM libre.

En otro aspecto, el kit de la presente divulgación sirve para medir la concentración de AIM libre por el método ELISA sándwich que utiliza un anticuerpo secundario y comprende una placa de microtitulación; un anticuerpo anti-AIM libre para captura; un anticuerpo anti-AIM libre como el anticuerpo primario; un anticuerpo contra un anticuerpo anti-AIM libre marcado con una fosfatasa alcalina o una peroxidasa como el anticuerpo secundario; y un sustrato de fosfatasa alcalina (tal como NPP) o un sustrato de peroxidasa (tal como DAB, TMB y OPD). El anticuerpo de captura y el anticuerpo primario reconocen diferentes epítopos. En dicho un kit, el anticuerpo de captura se fija primero en una placa de microtitulación, se le añade una muestra biológica de manera adecuada tratada y diluida y después se incuba y la muestra se retira y se lava. Posteriormente, se añade el anticuerpo primario seguido de incubación y lavado, se añade e incuba un anticuerpo secundario marcado con enzimas y después se añade el sustrato para la aparición del color. Midiendo la aparición de color con, por ejemplo, un lector de placas de microtitulación, se puede determinar la concentración de a Im libre. Empleando un anticuerpo secundario, la reacción se amplifica y se puede aumentar la sensibilidad de la detección.

También se prefiere que el kit de la presente divulgación comprenda además el tampón, solución de inactivación de la reacción enzimática, lector de microplacas, instrucción y similares necesarios.

El anticuerpo marcado no se limita a un anticuerpo marcado con enzimas y puede ser un anticuerpo marcado con un material radiactivo (tal como 25I, 131I, 35S y 3H), una sustancia fluorescente (tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de dansilo, ficoeritrina, isotiocianato de tetrametilrodamina y material fluorescente de infrarrojo cercano), una sustancia luminiscente (tal como luciferasa, luciferina y aecuorina), una nanopartícula (oro coloidal y punto cuántico), y similares. También es posible emplear un anticuerpo biotinilado como el anticuerpo marcado y añadir una avidina o estreptavidina marcada al kit.

Otro aspecto del kit de diagnóstico de la presente divulgación también incluye aquellos para medir la concentración de AIM libre con alta sensibilidad por el método ECLIA. Este kit comprende microperlas que tienen anticuerpos anti-AIM libre en fase sólida en las mismas, un anticuerpo anti-AIM libre marcado con una sustancia electroquimioluminiscente (tal como rutenio) y similares. En dicho un kit, se añade una muestra biológica tratada de manera adecuada a las microperlas que tienen anticuerpos anti-AIM libre en fase sólida en las mismas y se deja que reaccionen, y después la muestra se retira y se lava. Posteriormente, se añade un anticuerpo anti-AIM libre que reconoce otro epítopo marcado con una sustancia electroquimioluminiscente y se deja reaccionar. Después de lavar las microperlas, las microperlas se capturan en un electrodo, se aplica energía eléctrica para permitir la luminiscencia, y la cantidad de luminiscencia se puede medir para determinar la concentración de AIM libre.

Otro aspecto más del kit de diagnóstico de la presente divulgación también incluye aquellos para medir la concentración de AIM libre por el método de agregación de látex. Este kit contiene látex sensibilizado con anticuerpos anti-AIM libre, en donde la muestra biológica y el anticuerpo anti-AIM libre se mezclan y el aglomerado se cuantifica mediante un método óptico. También se prefiere que el kit comprenda una placa de reacción de agregación para visualizar la reacción de agregación.

La presente invención se describirá ahora de forma más específica con los ejemplos. La presente invención no debe limitarse de ningún modo a los ejemplos que se muestran a continuación.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparación de anticuerpo monoclonal de ratón anti-AlM humano <Sensibilización Animal>

Como antígeno, rAIM humano de longitud completa (2 mg/ml) se mezcló con una cantidad igual de TiterMax Gold (G-1, Funakoshi) para preparar una emulsión. Se emplearon dos ratones hembra Balb/c de 8 semanas de edad (de Charles River) como animales inmunizados y se administraron 50 j l de la solución de antígeno a la región plantar posterior. Se realizó una administración similar después de 2 semanas y se administraron 50 jg de la solución de antígeno a la región plantar posterior después de otras 2 semanas o más para preparar la fusión celular 3 días después.

<Célula de mieloma>

Se empleó P3U1 de ratón como célula de mieloma, y se empleó como cultivo de proliferación un medio que era RPMI1640 (11875-119 GIBCO) complementado con glutamina y ácido pirúvico y que tenía FBS (S1560 de BWT) añadido hasta alcanzar el 10 %. Como antibióticos, se añadieron penicilina y estreptomicina en cantidades adecuadas.

<Fusión celular>

De un ratón del que se extrajo sangre cardiaca con anestesia, los ganglios linfáticos poplíteos se resecaron en asepsia, se colocaron en un vaso de precipitados con malla n.° 200 y se preparó una suspensión celular empujando con una varilla de silicona. Las células se sometieron a lavado por centrifugación dos veces en RPMI1640 y después se contó el número de células. Las células de mieloma en el estado de fase de crecimiento logarítmico se recogieron por centrifugación y se lavaron, después de lo cual se ajustó la relación de linfocitos a células de mieloma para que fuera de 5 a 1 y se realizó una centrifugación mixta. La fusión celular se realizó con PEG1500 (783641, Roche). En otras palabras, se permitió que los sedimentos celulares reaccionaran con 1 ml de solución de PEG durante 3 minutos, esto se diluyó en serie y se lavó por centrifugación, se añadió el medio y se colocaron 200 j l de cada uno en quince placas de 96 pocillos, y se sometieron a 1 semana de cultivo. Como medio, se empleó un medio de células de mieloma complementado con suplemento HAT (21060-017, GIBCO) y la concentración de FBS se ajustó al 15 %.

<Extracción de líquido peritoneal de ratón>

Las células almacenadas en estado congelado se descongelaron, se realizó cultivo de proliferación, después se administraron 1 x 107 células a la cavidad peritoneal de un ratón atímico (BALB/cAJcl-nu/nu, CLEA Japón) con 0,5 ml de pristano (42-002, Cosmo Bio) administrado por vía intraperitoneal 1 semana o más antes, y se obtuvieron 4 - 12 ml de líquido peritoneal después de aproximadamente 2 semanas. Los sólidos se eliminaron por tratamiento de centrifugación y después se almacenaron en estado congelado.

Ejemplo 2: Detección de AIM libre en suero específico para cáncer de hígado (HCC) por NASH

El suero de 4 casos de individuos sanos, 6 casos de pacientes con NAFL, 6 casos de pacientes con NASH y 14 casos de pacientes con cáncer de hígado (HCC) por NASH se sometieron a electroforesis en gel de agarosa en condiciones reductoras o no reductoras, y se realizó transferencia Western con un anticuerpo anti-AIM.

En una condición reductora, el suero del paciente se mezcló con un tampón de muestra que contenía SDS y mercaptoetanol, se dejó reducir a 99 °C durante 5 minutos y después se añadió al gel e-PAGEL (de ATTO) y se separó por el método SDS-PAGE. En una condición no reductora, el suero del paciente se mezcló con un tampón de muestra que no contiene SDS ni mercaptoetanol y se separó mediante el método Native-PAGE. Tras la electroforesis, la proteína se transfirió a una membrana de PVDF (Immobilon, de Millipore) y la reacción del anticuerpo primario se realizó con el anticuerpo monoclonal de ratón anti-AlM humano preparado en el ejemplo 1 a 4 °C durante la noche. El anticuerpo anti-IgG de ratón unido a HRP se empleó como anticuerpo secundario, se empleó sustrato Luminata Forte Western HRP (de Millipore) como reactivo de detección y la detección de señales se realizó con Image Quant LAS 4000 (GE Healthcare).

En una condición reductora (A), se observó una sola banda de AIM libre ya que todas las moléculas de AIM están separadas de la IgM. En una condición no reductora (B), no se detectó banda de AIM libre en individuos sanos, pacientes con NAFL y pacientes con NASH ya que AIM no está separado de IgM, pero se detectó una banda de AIM libre en pacientes con cáncer de hígado (HCC) por NASH. Se confirmaron resultados similares en los experimentos 1 y 2 que utilizaron diferentes sueros de pacientes (figura 1). También se confirmó mediante este experimento que el anticuerpo monoclonal de ratón anti-AIM humano preparado en el ejemplo 1 se une a AIM.

Ejemplo 3: Cuantificación de AIM libre en suero

Se empleó el kit ELISA para AIM humano (CY-8080, de CircuLex) que cuantifica AIM libre para medir la concentración de AIM libre en el suero de 10 casos de individuos sanos, 42 casos de pacientes con NAFL, 135 casos de pacientes con NASH y 26 casos de pacientes con cáncer de hígado (HCC) por NASH. La medición se realizó según las instrucciones del kit. Se empleó la prueba U de Man-Whittney para el análisis estadístico y se consideró que una p < 0,05 era significativamente diferente.

Como resultado, la concentración de AIM libre en pacientes con NAFL y NASH fue de 1,07 ± 0,568 |jg/ml y 1,12 ± 0,632 jg/ml, respectivamente, y no mostró diferencia con los individuos sanos (1,12 ± 0,187 jg/ml), pero los pacientes con cáncer de hígado (HCC) por NASH mostraron un AIM libre significativamente alto a 2,90 ± 1,375 jg/m l (figura 2).

Ejemplo 4: Cuantificación de AIM libre y AIM total en cada estadio de fibrosis de hígado

El kit ELISA para AIM humano mencionado anteriormente (CY-8080, de CircuLex) que cuantifica AIM libre se empleó para medir la concentración de AIM libre en el suero de 135 casos de pacientes con NASH y 26 casos de pacientes con cáncer de hígado (HCC) por NASH.

Además, se empleó ELISA que cuantifica el AIM total para medir la concentración de AIM total en el suero de los pacientes. Tras la medición, se empleó un material convencional que tenía la concentración valorada por el método BCA. En el ELISA mencionado anteriormente, el anticuerpo monoclonal de ratón anti-AIM humano estaba en fase sólida sobre una placa y se añadió el suero del paciente según el método convencional. Después del lavado, éste se hizo reaccionar con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-AIM humano marcado con HRP y se sometió a revelado de color con un sustrato de HRP. Todos los anticuerpos anti-AIM empleados fueron anticuerpos preparados según el método descrito en el ejemplo 1, que son anticuerpos que reconocen tanto AIM libre como AIM en forma de complejo y que cada uno tiene diferentes epítopos.

Debido a que se informa un aumento en el AIM total junto con la progresión de la fibrosis hepática, los pacientes se dividieron en tres grupos de estadios 1 y 2 (F1-F2), estadio 3 (F3) y estadio 4 (F4) de fibrosis para su análisis según la clasificación de Brunt (Am J Gastroenterol. septiembre de 1999; 94 (9): 2467-2674). Entre los pacientes con NASH, con excepción de 27 casos en los que no se observó fibrosis, el número de casos para cada uno de los pacientes con NASH y pacientes con cáncer de hígado (HCC) por NASH analizados fue de 71 y 4 casos para F1-F2, 30 y 10 casos para F3, y 7 y 12 casos para F4.

El AIM libre aumentó significativamente en los pacientes con cáncer de hígado (HCC) por NASH en comparación con los pacientes con NASH en todos los estadios (figura 3). No se observaron diferencias significativas en el AIM total entre los pacientes con NASH y los pacientes con cáncer de hígado por NASH en todos los estadios (figura 4).

Ejemplo 5: Comparación del aumento de AIM libre y el aumento de AIM total junto con la conversión cancerosa

El kit ELISA para AIM humano mencionado anteriormente (CY-8080, de CircuLex) que cuantifica AIM libre y el mismo ELISA que cuantifica AIM total como se usó en el ejemplo 4 se emplearon para medir la concentración de AIM libre y AIM total en el suero de 42 casos de pacientes con NAFl , 135 casos de pacientes con NASH y 26 casos de pacientes con cáncer de hígado (HCC) por NASH. Aunque el AIM libre aumentó junto con el aumento del AIM total, el aumento de AIM libre en pacientes con cáncer de hígado (HCC) por NASH (círculos negros) fue significativo en comparación con los pacientes con NAFL y NASH (colectivamente sin HCC) (círculos blancos) (figura 5).

Ejemplo 6: Análisis ROC de pacientes con NASH y pacientes con cáncer de hígado por NASH, casos de fibrosis avanzada, casos de cirrosis hepática

Se realizó un análisis ROC de la concentración de AIM libre y AIM total en el suero de pacientes con NASH (135 casos) y pacientes con cáncer de hígado (HCC) (26 casos) con NASH (véase la tabla 1).

El AUC (área bajo la curva, por sus siglas en inglés) fue 0,927 para AIM libre y 0,801 para AIM total (tabla 1 (A)). El AIM libre podría discriminar el cáncer de hígado con mayor precisión.

Se sabe que la aparición de cáncer de hígado es más probable que se produzca a medida que progresa la fibrosis hepática. Se realizó un análisis ROC de la concentración de AIM libre y AIM total en el suero de casos de fibrosis avanzada en el estadio de fibrosis 3 (F3) y estadio 4 (F4). En los casos de fibrosis avanzada, el AUC fue 0,918 para AIM libre y 0,709 para AIM total (tabla 1 (B)). El AIM libre podría discriminar el cáncer de hígado con alta precisión también en casos de fibrosis avanzada, pero la precisión con AIM total fue baja.

Los casos de cirrosis hepática con fibrosis avanzada tienen el mayor riesgo de aparición de cáncer de hígado. Se realizó un análisis ROC de la concentración de AIM libre y AIM total en el suero de casos de cirrosis hepática en el estadio 4 (F4). En los casos de cirrosis hepática, el AUC fue 0,869 para AIM libre y 0,506 para AIM total (tabla 1 (C)). El AIM libre podría discriminar el cáncer de hígado con alta precisión también en casos de cirrosis hepática, pero la precisión con AIM total fue baja.

T l 11

Ejemplo 7: Análisis ROC en pacientes sin HCC y pacientes con HCC

En pacientes con NAFL y NASH (colectivamente pacientes sin HCC) (177 casos) y pacientes con cáncer de hígado (HCC) por NASH (26 casos), el análisis ROC se realizó sobre la concentración de AIM libre y AIM total en el suero, así como sobre la relación de las concentraciones de AIM libre y AIM total. El AUC fue 0,929 para AIM libre, 0,806 para AIM total y 0,842 para AIM libre/AIM total, y AIM libre podría discriminar pacientes con cáncer de hígado con mayor eficacia de diagnóstico (véase la figura 6).

Ejemplo 8: Análisis de la sensibilidad y especificidad del diagnóstico

Se midió la concentración de AIM libre en sangre para pacientes con NAFL y NASH (colectivamente sin HCC) (177 casos) y pacientes con cáncer de hígado (HCC) por NASH (26 casos), se investigó el valor diagnóstico del cáncer de hígado mediante AIM libre con el valor de punto de corte a 1,6 pg/ml. Como resultado, los pacientes que mostraron 1,6 pg/ml o más entre los pacientes con cáncer de hígado (HCC) por NASH fueron 23 casos, y la sensibilidad diagnóstica fue de 0,885 (23/26). Por otro lado, los pacientes que mostraron menos de 1,6 pg/ml entre los pacientes que no tenían cáncer de hígado fueron 152 casos, y la especificidad diagnóstica fue de 0,859 (152/177) (tabla 2).

Ejemplo 9: Asociación con marcador tumoral

En 25 casos de pacientes con cáncer de hígado por NASH, se investigó la asociación de marcadores tumorales (PIVKA-II y AFP) con la concentración de AIM libre, la concentración de AIM total y la relación de las concentraciones totales de AIM libre y de AIM total en sangre. Los pacientes se dividieron con los valores de corte para PIVKA-II y AFP como 40 mAU/ml y 20 ng/ml respectivamente y se analizó la concentración de AIM libre, la concentración de AIM total y la relación de las concentraciones de AIM libre y AIM total para cada paciente. Como resultado, no se observaron diferencias significativas entre el grupo de pacientes que mostró el valor de corte o más para cada marcador tumoral y el grupo de pacientes que mostró menos que el valor de corte en cualquiera de la concentración de AIM libre, la concentración de AIM total y la relación de las concentraciones de AIM libre y AIM total (tabla 3).

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Aplicabilidad industrial

Empleando el método de la presente invención, el cáncer de hígado se puede examinar con sensibilidad y especificidad superiores.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para examinar cáncer de hígado que comprende una etapa de cuantificación de una cantidad de inhibidor de la apoptosis de macrófagos (AIM) libre en una muestra de suero, plasma o sangre completa procedentes de un sujeto de prueba, en donde una cantidad mayor en comparación con un individuo sano de control indica cáncer de hígado, en donde AIM libre significa proteína AIM que no está en forma de complejo con otros compañeros de unión tal como IgM.

2. El método según la reivindicación 1, en donde dicho cáncer de hígado es cáncer de hígado causado por esteatohepatitis no alcohólica (NASH).

3. El método según la reivindicación 1 o 2, en donde dicha cuantificación es una realizada mediante inmunoensayo.

4. El método según la reivindicación 3, en donde dicha cuantificación se realiza poniendo en contacto una muestra biológica con un anticuerpo que se une de manera específica a AIM libre.

5. El método según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en donde dicha cuantificación se mide mediante ELISA.

6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado por que dicha cuantificación se realiza sin exponer el suero, plasma sanguíneo o sangre completa a una condición desnaturalizante ni a una condición reductora de proteínas.

7. El método según la reivindicación 1 que comprende además una etapa de cuantificación de AIM total en una muestra biológica procedente de un sujeto de prueba.

8. El método según la reivindicación 7 que comprende además una etapa de cálculo de la relación de AIM libre y AIM total.