TWI662961B - 多重ｐＨ緩衝配方與胃蛋白酶和胰蛋白酶的共同蛋白質水解效率增益劑之緩衝組合物及其用途 - Google Patents

多重ｐＨ緩衝配方與胃蛋白酶和胰蛋白酶的共同蛋白質水解效率增益劑之緩衝組合物及其用途 Download PDF

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Abstract

本發明為一種有助提升胃蛋白酶和胰蛋白酶的蛋白質水解效率之緩衝組合物，包括至少一酸成分，其中該至少一酸成分係一有機酸；至少一鹽成分，其中該至少一鹽成分係一有機鹽、該至少一酸成分及該至少一鹽成分具一共軛關係、且該至少一酸成分及該至少一鹽成分形成一緩衝配方；以及一蛋白質水解效率增益劑，其中該蛋白質水解效率增益劑係一抗壞血酸、其鹽類及其組合其中之一。

Description

多重pH緩衝配方與胃蛋白酶和胰蛋白酶的共同蛋白質水解效率增益劑之緩衝組合物及其用途
本發明有關一種有助提升人類胃蛋白酶和胰蛋白酶的蛋白質水解效率及吸收效能的緩衝組合物。更詳細而言，本發明關於一種於跨酸鹼範圍內(pH5-7.5)提昇胃蛋白酶及胰蛋白酶的蛋白質水解效率的緩衝組合物及其用途.
蛋白質進入哺乳動物消化道後，會被胃液裡的胃蛋白酶(pepsin)、胰液裡的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧基肽酶、腸液裡的胺肽酶(aminopeptidase)、二肽酶(dipeptidase)水解，最後成為胺基酸，胺基酸再被小腸上皮細胞吸收。
胃液裡含有胃蛋白酶原及胃酸，胃蛋白酶原會在胃裡透過胃酸活性化，成為胃蛋白酶。在食物經過胃後，胰臟會分泌出胰液，而經由胰管運送到小腸上游的十二指腸。胰液裡的胰蛋白酶原分泌至十二指腸，促進腸內的活性化，其中胰蛋白酶原經腸激酶(enterokinase)活化成胰蛋白酶，可將蛋白質分解為寡肽。胰蛋白酶亦能激活轉化腸道內之其他蛋白酶原和胰蛋白酶原。
畜牧業自1950年代起便將抗生素型生長促進劑廣泛添加於動物飼料中。然而隨著抗藥性產生及藥物殘留等動物健康疑慮漸起，歐盟自2006年起全面禁止以抗生素作為飼料添加劑使用，各國對含藥飼料添加劑管理也漸趨嚴。為了取代抗生素，近年來例如酸化劑等非藥物添加劑快速發展。酸化劑可降低飼料在腸胃道中的pH值，使胃蛋白酶的活性提高，因而使蛋白質的消化更有效率。然而，由於酸化劑迅速降低飼料和胃內容物的pH值，反而抑制胃酸正常分泌，長期使用會造成動物消化能力下降、生長變慢的反效果。
為了幫助消化道的消化與吸收，本案申請人發展出一種有助全面提升人類胃腸道之胃蛋白酶和胰蛋白酶的蛋白質水解效率及吸收效能的非藥物添加劑，能彌補現行產品之不足，以下為本案之簡要說明。
本發明之主要目的係在於提升人類胃蛋白酶和胰蛋白酶的蛋白質水解效率及吸收效能。為了不影響胃腸道的正常生理機能，本發明藉由提供一種多重pH緩衝配方組合，其在胃腸道之不同pH環境下能以最適化運作，因而提升蛋白質在胃腸道的整體水解效率和吸收效能。
本發明的多重pH緩衝配方組合配合胃腸道的不同pH值環境，在跨酸鹼環境(pH 5~7.5)中均可顯著提升胃腸道之主要蛋白酶之蛋白質水解效率。為了達到上述效果，本發明之多重pH緩衝配方組合包括至少一酸成分、至少一鹽成分以及蛋白質水解效率增益劑，其中該至少一酸成分為有機酸，該至少一鹽成分為有機鹽，該蛋白質水解效率增益劑為抗壞血酸、其鹽類或其組合。該酸成分與該鹽成分形成一緩衝配方，使該蛋白質 水解效率增益劑在該緩衝配方中呈現穩定之高活性。
本發明提出一種有助全面提升胃蛋白酶和胰蛋白酶在胃腸道的蛋白質水解效率之緩衝組合物，包括：至少一酸成分、至少一鹽成分以及蛋白質水解效率增益劑，其中該至少一酸成分為一有機酸，該至少一鹽成分為一有機鹽、該至少一酸成分與該至少一鹽成分具一共軛關係、且該至少一酸成分及該至少一鹽成分形成一緩衝配方，該蛋白質水解效率增益劑為一抗壞血酸、其鹽類及其組合其中之一。
本發明的上述目的及優點在參閱以下詳細說明及附隨圖式之後對那些所屬技術領域中具有通常知識者將變得更立即地顯而易見。
第一圖顯示pH值對於腸胃道中三種消化酶活性的影響。
第二A圖為一曲線圖，其中顯示胃蛋白酶(對照組)及含有不同濃度抗壞血酸的實驗組在pH 2.0時在10分鐘、1小時、2小時、3小時測得的蛋白水解效率。
第二B圖為一曲線圖，其中顯示胃蛋白酶(對照組)及含有不同濃度抗壞血酸的實驗組在pH 5.0時在10分鐘、1小時、2小時、3小時測得的蛋白水解效率。
第二C圖為一曲線圖，其中顯示胃蛋白酶(對照組)及含有不同濃度抗壞血酸的實驗組在pH 6.0時在10分鐘、1小時、2小時、3小時測得的蛋白水解效率。
第三A圖為一曲線圖，其中顯示胰蛋白酶(對照組)及含有不同濃度抗壞血酸的實驗組在pH 5.0時在10分鐘、1小時、2小時、3小時測得 的蛋白水解效率。
第三B圖為一曲線圖，其中顯示胰蛋白酶(對照組)及含有不同濃度抗壞血酸的實驗組在pH 6.0時在10分鐘、1小時、2小時、3小時測得的蛋白水解效率。
第三C圖為一曲線圖，其中顯示胰蛋白酶(對照組)及含有不同濃度抗壞血酸的實驗組在pH 7.5時在10分鐘、1小時、2小時、3小時測得的蛋白水解效率。
在設計本發明之多重pH緩衝配方組合時，必須考慮胃腸道的pH值環境。請參考第一圖，其記載於Essentials of Human Physiology(2017)。如圖中所示，腸胃道中的三種主要消化酶各有其不同的最適pH環境，例如胃蛋白酶在pH 1.5~2環境下有最佳活性，而胰蛋白酶在pH 7.5~8環境下有最佳活性。事實上，食物在胃腸道的消化過程中，pH值並非維持恆定，而是在不同pH值之間變化。當食物進入胃上半部時，pH值約在4.0~6.5左右，進入胃下半部時，pH值約達到1.5~4.0左右；同樣地，小腸各區段的pH值亦有不同，在十二指腸的pH值約為6.0~7.5，在小腸其它區段的pH值約為5.0~7.5。雖然在胃蛋白酶及胰蛋白酶的最適pH環境下，蛋白質有較佳的水解效率，但在尚未達到最適pH環境時、或者在胃酸分泌不足的個體中(如初生嬰兒或老年人，甚至初斷乳仔豬)，若能在跨酸鹼環境(pH 5~7.5)中，特別是pH 5~6環境中，提昇胃腸道中胃蛋白酶及胰蛋白酶的蛋白質水解效率，就能提升蛋白質在胃腸道的整體水解效率和吸收效能。
本發明中提供的緩衝配方組合包括至少一酸成分、至少一鹽 成分及一蛋白質水解效率增益劑。由於本發明之緩衝配方組合可添加於人類的蛋白質營養補充品，因此所使用成分必須對生物體無毒，酸成分較佳為有機酸，鹽成分較佳為有機鹽，蛋白質水解效率增益劑為抗壞血酸、其鹽類或其組合。此外，磷酸及磷酸鹽是被廣泛應用的食物添加劑，因此也在本發明酸成分及鹽成分的涵蓋範圍內。
酸成分與鹽成分具有一共軛關係，例如一有機酸與其共軛鹽、或者一有機鹽與其共軛酸，兩者配製成一緩衝配方。緩衝配方的pH值係由酸成分的解離常數(pKa)和酸成分與鹽成分的比例來決定。一般來說，pH值約在pKa值±1的範圍內。常用有機酸、磷酸及抗壞血酸的pKa值如表一所示(參見Lab Manual for Zumdahl/Zumdahl’s Chemistry第6版)。在這些酸成分中，檸檬酸具有3個不同的pKa值且為有機酸，因此是本發明緩衝配方中酸成分的最佳選擇。
選擇合適的酸成分與鹽成分搭配所形成的緩衝配方可在一定pH範圍內穩定胃腸道環境的pH變化，確保其中的蛋白質水解效率增益劑能在胃腸道中發揮應有之效用。
本發明中使用的酸成分包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、蘋果酸、延胡索酸、乳酸、檸檬酸及磷酸。較佳地，酸成分為有機酸。在較佳實施例中，有機酸為檸檬酸。本發明中使用的鹽成分為有機鹽或磷酸鹽，較佳地，有機鹽或磷酸鹽係指鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽。在較佳實施例中，有機鹽為檸檬酸鈉及檸檬酸鉀其中之一。
本發明之緩衝配方亦可包括多種有機酸與其共軛鹽、或者多種有機鹽與其共軛酸。有機酸亦可與磷酸搭配作為本發明緩衝配方中的酸成分，有機鹽亦可與磷酸鹽搭配作為本發明緩衝配方中的鹽成分。只要能調配出適合胃腸道pH值環境的緩衝配方，皆在本發明涵蓋的範圍內。
本發明中使用的蛋白質水解效率增益劑為抗壞血酸、其鹽類或其組合，較佳地，抗壞血酸的鹽類為其鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽及其組合其中之一。
抗壞血酸(左旋抗壞血酸)也可稱為維它命C，是一種溶於水且易被吸收的化合物。由於抗壞血酸單獨存在水溶液中時，在pH大於4的環境下容易降解，本發明的緩衝配方可使抗壞血酸、其鹽類或其組合在pH大於4的環境下仍能維持活性，才能達到在跨酸鹼環境提升胃蛋白酶及胰蛋白 酶的蛋白質水解效率之目的。
另一方面，本發明的緩衝組合物可作為一種有助全面提升胃蛋白酶和胰蛋白酶在胃腸道中的蛋白質水解效率之緩衝組合物，例如添加於配方奶粉等蛋白質營養補充品之添加物，在pH 5~7.5的環境中提升胃蛋白酶及胰蛋白酶的蛋白質水解效能，更佳地是在pH 5~6的環境中顯著提升胃蛋白酶及胰蛋白酶的蛋白質水解效能。
根據本發明之構想，在上述組合物中包含至少一酸成分、至少一鹽成分及蛋白質水解效率增益劑，其中至少一酸成分與至少一鹽成分形成一緩衝配方，該緩衝配方使蛋白質水解效率增益劑在跨酸鹼環境下維持高活性。在一實施例中，該蛋白質水解效率增益劑分佈於該緩衝配方中。在另一實施例中，該緩衝配方與該蛋白質水解效率增益劑均勻混合。
在本發明中，該蛋白質水解效率增益劑為抗壞血酸、其鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽或其組合。在一較佳實施例中，該蛋白質水解效率增益劑為抗壞血酸，尤其是左旋抗壞血酸，其具有60ppm至1000ppm之間的濃度。較佳地，抗壞血酸的濃度介於60ppm至240ppm之間，更佳地為240ppm。當然，只要符合人體每日攝取量的規範(每日最高約2g)，本發明的抗壞血酸可以有較高的濃度。
根據本發明之構想，上述緩衝組合物的劑型包括粉末、顆粒、錠劑、微米顆粒、液體、膠囊或緩釋劑型。
以下為本發明的實施例
(一)實驗方法
1.酪蛋白之胃蛋白酶酶解實驗(pH=2.0)
1.1對照組：取四支試管，以pH值為2.0的檸檬酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)與胃蛋白酶(Pepsin，385ppm)的對照溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
1.2實驗組(60ppm抗壞血酸)：取四支試管，以pH值為2.0的檸檬酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)、60ppm抗壞血酸、胃蛋白酶(Pepsin，385ppm)的實驗溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值與相同抗壞血酸濃度下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
1.3實驗組(120ppm抗壞血酸)：取四支試管，以pH值為2.0的檸檬酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)、120ppm抗壞血酸、胃蛋白酶(Pepsin，385ppm)的實驗溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三 氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值與相同抗壞血酸濃度下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
1.4實驗組(240ppm抗壞血酸)：取四支試管，以pH值為2.0的檸檬酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)、240ppm抗壞血酸、胃蛋白酶(Pepsin，385ppm)的實驗溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值與相同抗壞血酸濃度下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
2.酪蛋白之胃蛋白酶酶解實驗(pH=5.0)
2.1對照組：取四支試管，以pH值為5.0的檸檬酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)與胃蛋白酶(Pepsin，385ppm)的對照溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測 定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
2.2實驗組(60ppm抗壞血酸)：取四支試管，以pH值為5.0的檸檬酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)、60ppm抗壞血酸、胃蛋白酶(Pepsin，385ppm)的實驗溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值與相同抗壞血酸濃度下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
2.3實驗組(120ppm抗壞血酸)：取四支試管，以pH值為5.0的檸檬酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)、120ppm抗壞血酸、胃蛋白酶(Pepsin，385ppm)的實驗溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值與相同抗壞血酸濃度下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。2.4備置新試管，並吸取離心後試管中之上清液20μL並加入2.4mL鄰苯二 甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後利用螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。
2.4實驗組(240ppm抗壞血酸)：取四支試管，以pH值為5.0的檸檬酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)、240ppm抗壞血酸、胃蛋白酶(Pepsin，385ppm)的實驗溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值與相同抗壞血酸濃度下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
3.酪蛋白之胃蛋白酶酶解實驗(pH=6.0)
3.1對照組：取四支試管，以pH值為6.0的檸檬酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)與胃蛋白酶(Pepsin，385ppm)的對照溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
3.2實驗組(60ppm抗壞血酸)：取四支試管，以pH值為6.0的檸檬 酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)、60ppm抗壞血酸、胃蛋白酶(Pepsin，385ppm)的實驗溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值與相同抗壞血酸濃度下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
3.3實驗組(120ppm抗壞血酸)：取四支試管，以pH值為6.0的檸檬酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)、120ppm抗壞血酸、胃蛋白酶(Pepsin，385ppm)的實驗溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值與相同抗壞血酸濃度下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
3.4實驗組(240ppm抗壞血酸)：取四支試管，以pH值為6.0的檸檬酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)、240ppm抗壞血酸、胃蛋白酶(Pepsin，385ppm)的實驗溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速 離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值與相同抗壞血酸濃度下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
4.酪蛋白之胰蛋白酶酶解實驗(pH=5.0)
4.1對照組：取四支試管，以pH值為5.0的檸檬酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)與胰蛋白酶(Trypsin，385ppm)的對照溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
4.2實驗組(60ppm抗壞血酸)：取四支試管，以pH值為5.0的檸檬酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)、60ppm抗壞血酸、胰蛋白酶(Trypsin，385ppm)的實驗溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH 值與相同抗壞血酸濃度下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
4.3實驗組(120ppm抗壞血酸)：取四支試管，以pH值為5.0的檸檬酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)、120ppm抗壞血酸、胰蛋白酶(Trypsin，385ppm)的實驗溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值與相同抗壞血酸濃度下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
4.4實驗組(240ppm抗壞血酸)：取四支試管，以pH值為5.0的檸檬酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)、240ppm抗壞血酸、胰蛋白酶(Trypsin，385ppm)的實驗溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值與相同抗壞血酸濃度下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
5.酪蛋白之胰蛋白酶酶解實驗(pH=6.0)
5.1對照組：取四支試管，以pH值為6.0的檸檬酸緩衝溶液製備四份 含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)與胰蛋白酶(Trypsin，385ppm)的對照溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
5.2實驗組(60ppm抗壞血酸)：取四支試管，以pH值為6.0的檸檬酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)、60ppm抗壞血酸、胰蛋白酶(Trypsin，385ppm)的實驗溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值與相同抗壞血酸濃度下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino AcidEquivalent(TAAE)μg/mL)。
5.3實驗組(120ppm抗壞血酸)：取四支試管，以pH值為6.0的檸檬酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)、120ppm抗壞血酸、胰蛋白酶(Trypsin，385ppm)的實驗溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速 離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值與相同抗壞血酸濃度下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
5.4實驗組(240ppm抗壞血酸)：取四支試管，以pH值為6.0的檸檬酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)、240ppm抗壞血酸、胰蛋白酶(Trypsin，385ppm)的實驗溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值與相同抗壞血酸濃度下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
6.酪蛋白之胰蛋白酶酶解實驗(pH=7.5)
6.1對照組：取四支試管，以pH值為7.5的檸檬酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)與胰蛋白酶(Trypsin，385ppm)的對照溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算 含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
6.2實驗組(60ppm抗壞血酸)：取四支試管，以pH值為7.5的檸檬酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)、60ppm抗壞血酸、胰蛋白酶(Trypsin，385ppm)的實驗溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值與相同抗壞血酸濃度下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
6.3實驗組(120ppm抗壞血酸)：取四支試管，以pH值為7.5的檸檬酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)、120ppm抗壞血酸、胰蛋白酶(Trypsin，385ppm)的實驗溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值與相同抗壞血酸濃度下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
6.4實驗組(240ppm抗壞血酸)：取四支試管，以pH值為7.5的檸檬酸緩衝溶液製備四份含有酪蛋白(Casein，3.85mg/mL)、240ppm抗壞 血酸、胰蛋白酶(Trypsin，385ppm)的實驗溶液。將試管定溫37℃下反應，四支試管分別反應10分鐘、1小時、2小時、3小時後，各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，室溫靜置10分鐘，再以3000rpm轉速離心10分鐘。新取四支試管，分別加入前述四個時間點的上清液20μL，各加入2.4mL鄰苯二甲醛(OPA)試劑，靜置2分鐘後，以螢光光譜儀於EX.340nm和EM.455nm下測定螢光強度。所得螢光強度以預先在同pH值與相同抗壞血酸濃度下建立之酪胺酸(Tyrosine)檢量線換算含量，並以總胺基酸相對當量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
實驗結果
請參閱表二及第二A圖，其中顯示胃蛋白酶(對照組)及含有不同濃度抗壞血酸的實驗組在pH 2.0時的蛋白水解效率。由於pH 2.0為胃蛋白酶的最適環境，因此各組別間的水解效率差異不大，但仍可看出含有抗壞血酸的組別相較於對照組有較佳的水解效率。
a.上表中顯示的數值單位為總胺基酸相對當量(Total Amino Acid Equivalent，TAAE)μg/mL
請參閱表三及第二B圖，其中顯示胃蛋白酶(對照組)及含有不同濃度抗壞血酸的實驗組在pH 5.0時的蛋白水解效率。pH 5.0時並非胃蛋 白酶的最適環境，因此胃蛋白酶在此環境下水解效率較差，但可以觀察到240ppm的抗壞血酸顯著提升胃蛋白酶的水解效率。
a.上表中顯示的數值單位為TAAE μg/mL
請參閱表四及第二C圖，其中顯示胃蛋白酶(對照組)及含有不同濃度抗壞血酸的實驗組在pH 6.0時的蛋白水解效率。pH 6.0時亦非胃蛋白酶的最適環境，但可看出含有抗壞血酸的組別相較於對照組有較佳的水解效率。
a.上表中顯示的數值單位為TAAE μg/mL
請參閱表五及第三A圖，其中顯示胰蛋白酶(對照組)及含有不同濃度抗壞血酸的實驗組在pH 5.0時的蛋白水解效率。pH 5.0時並非胰蛋 白酶的最適環境，因此胰蛋白酶在此環境下水解效率較差，但可以觀察到240ppm的抗壞血酸顯著提升胰蛋白酶的水解效率。
a.上表中顯示的數值單位為TAAE μg/mL
請參閱表六及第三B圖，其中顯示胰蛋白酶(對照組)及含有不同濃度抗壞血酸的實驗組在pH 6.0時的蛋白水解效率。pH 6.0時亦非胰蛋白酶的最適環境，但可看出含有抗壞血酸的組別相較於對照組有較佳的水解效率。
a.上表中顯示的數值單位為TAAE μg/mL
請參閱表七及第三C圖，其中顯示胰蛋白酶(對照組)及含有不同濃度抗壞血酸的實驗組在pH 7.5時的蛋白水解效率。由於pH 7.5為胰蛋 白酶的最適環境，因此各組別間的水解效率差異不大，但仍可看出含有抗壞血酸的組別相較於對照組有較佳的水解效率。
a.上表中顯示的數值單位為TAAE μg/mL
比對各pH環境的相對濃度，符合最適化環境所測得的胺基酸濃度最高，而濃度隨環境條件變差而相對漸減，無論是胃蛋白酶和胰蛋白酶都有同樣的趨勢。在pH 2~6環境下，以最適化(pH 2)之對照組為比較指標，觀察到抗壞血酸在pH 5、pH 6以及pH 2環境下對胃蛋白酶蛋白水解效率具有顯著增益效果。在pH 5~7.5環境下，以最適化(pH 7.5)之對照組為比較指標，觀察到抗壞血酸在pH 5、pH 6以及pH7.5環境下對胰蛋白酶蛋白水解效率具有顯著增益效果。從pH2(極-高氫離子濃度)到pH5(弱-高氫離子濃度)和pH6(弱偏中性-高氫離子濃度)，再到pH7.5(低氫離子濃度)觀察到本案緩衝組合物皆呈現明顯蛋白質水解效率增益，明顯和pH無關(pH-independent)。
由於本發明的緩衝組合物中不含藥物成分，較無抗藥性和食安之疑慮。
本發明實屬難能的創新發明，深具產業應用價值，援依法提出申請。此外，本發明可以由所屬技術領域中具有通常知識者做任何修改， 但不脫離如所附申請專利範圍所要保護的範圍。

Claims (11)

  1. 一種緩衝組合物之用途，其係用於製備提升人體中一胃蛋白酶及一胰蛋白酶的一蛋白質水解效率的增益劑，該緩衝組合物包括：一酸成分，其中該酸成分係一檸檬酸；一鹽成分，其中該鹽成分係一檸檬酸鹽；以及一胃蛋白酶和胰蛋白酶的共同蛋白質水解效率增益劑，其中該胃蛋白酶和胰蛋白酶的共同蛋白質水解效率增益劑係一抗壞血酸、其鹽類及其組合其中之一，其中該酸成分及該鹽成分具共軛關係，且該酸成分及該鹽成分形成一緩衝配方，且其中該緩衝配方在pH 5~7.5的環境中穩定該胃蛋白酶和胰蛋白酶的共同蛋白質水解效率增益劑的活性，以提升人體中該胃蛋白酶及該胰蛋白酶的該蛋白質水解效率。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，該緩衝組合物係添加於一蛋白質營養補充品，該蛋白質營養補充品為一配方奶粉或一高蛋白營養補充品。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該緩衝配方與該胃蛋白酶和胰蛋白酶的共同蛋白質水解效率增益劑均勻混合。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該胃蛋白酶和胰蛋白酶的共同蛋白質水解效率增益劑的濃度介於60ppm至1000ppm之間。
  5. 一種提升人體中一胃蛋白酶及一胰蛋白酶的一蛋白質水解效率之緩衝組合物，包括：一酸成分，其中該酸成分係一檸檬酸；一鹽成分，其中該鹽成分係一檸檬酸鹽；以及一胃蛋白酶和胰蛋白酶的共同蛋白質水解效率增益劑，其中該胃 蛋白酶和胰蛋白酶的共同蛋白質水解效率增益劑係一抗壞血酸、其鹽類及其組合其中之一，其中該酸成分及該鹽成分具共軛關係，且該酸成分及該鹽成分形成一緩衝配方，且其中該緩衝配方在pH 5~7.5的環境中穩定該胃蛋白酶和胰蛋白酶的共同蛋白質水解效率增益劑的活性，提升人體中該胃蛋白酶及該胰蛋白酶的該蛋白質水解效率。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之緩衝組合物，其中該檸檬酸鹽為一鹼金屬鹽及一鹼土金屬鹽其中之一。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之緩衝組合物，其中該檸檬酸鹽為檸檬酸鈉及檸檬酸鉀其中之一。
  8. 如申請專利範圍第5項所述之緩衝組合物，其中該抗壞血酸的濃度介於60ppm至1000ppm之間。
  9. 如申請專利範圍第5項所述之緩衝組合物，其中該抗壞血酸之鹽類為一鈉鹽、一鉀鹽、一鈣鹽、一鎂鹽及其組合其中之一。
  10. 如申請專利範圍第5項所述之組合物，其中該緩衝組合物的劑型係選自由粉末、顆粒、錠劑、微米顆粒、液體、膠囊及緩釋劑型所組成的群組其中之一。
  11. 如申請專利範圍第5項所述之緩衝組合物，其中該抗壞血酸為一左旋抗壞血酸。
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