CN110269099B - 多重pH缓冲配方与蛋白质消化助剂的组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种帮助消化蛋白质的组合物,包括至少一酸成分,其中该至少一酸成分是一有机酸、一磷酸及其组合其中之一;至少一碱成分,其中该至少一碱成分是一有机碱、一磷酸碱及其组合其中之一、该至少一酸成分及该至少一碱成分具一共轭关系、且该至少一酸成分及该至少一碱成分形成一缓冲配方;以及一蛋白质消化助剂,其中该蛋白质消化助剂是一抗坏血酸、其盐类及其组合其中之一。
Description
【技术领域】
本发明有关一种在人类或动物中增加消化及吸收效能的组合物。更详细而言,本发明关于一种于跨酸碱范围内提升胃蛋白酶及胰蛋白酶的蛋白质水解效率的组合物及其用途。
【背景技术】
蛋白质进入哺乳动物消化道后,会被胃液里的胃蛋白酶(pepsin)、胰液里的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧基肽酶、肠液里的氨肽酶(aminopeptidase)、二肽酶(dipeptidase)水解,最后成为氨基酸,氨基酸再被小肠上皮细胞吸收。
胃液里含有胃蛋白酶原及胃酸,胃蛋白酶原会在胃里透过胃酸活性化,成为胃蛋白酶。在食物经过胃后,胰脏会分泌出胰液,而经由胰管运送到小肠上游的十二指肠。胰液里的胰蛋白酶原分泌至十二指肠,促进肠内的活性化,其中胰蛋白酶原经肠激酶(enterokinase)活化成胰蛋白酶,可将蛋白质分解为寡肽。胰蛋白酶亦能激活转化肠道内的其他蛋白酶原和胰蛋白酶原。
为了帮助消化道的消化与吸收,并达到促进生长的效果,畜牧业自1950年代起便将抗生素型生长促进剂广泛添加于动物饲料中。然而随着抗药性产生及药物残留等动物健康疑虑渐起,欧盟自2006年起全面禁止以抗生素作为饲料添加剂使用,各国对含药饲料添加剂管理也渐趋严。为了取代抗生素,近年来例如酸化剂等非药物添加剂快速发展。酸化剂可降低饲料在肠胃道中的pH值,使胃蛋白酶的活性提高,因而使蛋白质的消化更有效率。然而,由于酸化剂迅速降低饲料和胃内容物的pH值,反而抑制胃酸正常分泌,长期使用会造成动物消化能力下降、生长变慢的反效果。
鉴于现有抗生素型生长促进剂与酸化剂的上述缺点,本案申请人发展出一种在人类或动物中增加消化及吸收效能的非药物添加剂,能弥补现行产品的不足,以下为本案的简要说明。
【发明内容】
本发明的主要目的在于增加人类或动物的消化及吸收效能。为了不影响肠胃道的正常生理机能,本发明通过提供一种多重pH缓冲配方组合,其在消化道的不同pH环境下能以最适化运作,因而提升蛋白质的整体消化和吸收功能。
有别于现有的饲料添加剂,本发明的多重pH缓冲配方组合配合肠胃道的不同pH值环境,在跨酸碱环境(pH 2~7.5)下均可显著提升消化道的主要蛋白酶的蛋白质水解效率。为了达到上述效果,本发明的多重pH缓冲配方组合包括至少一酸成分、至少一碱成分以及蛋白质消化助剂,其中该至少一酸成分为有机酸、磷酸或其组合,该至少一碱成分为有机碱、磷酸碱或其组合,该蛋白质消化助剂为抗坏血酸、其盐类或其组合。该酸成分与该碱成分形成一缓冲配方,使该蛋白质消化助剂在该缓冲配方中呈现稳定的高活性。
本发明提出一种帮助消化一蛋白质的组合物,包括:至少一酸成分、至少一碱成分以及蛋白质消化助剂,其中该至少一酸成分为一有机酸、一磷酸及其组合其中之一,该至少一碱成分为一有机碱、一磷酸碱及其组合其中之一、该至少一酸成分与该至少一碱成分具一共轭关系、且该至少一酸成分及该至少一碱成分形成一缓冲配方,该蛋白质消化助剂为一抗坏血酸、其盐类及其组合其中之一。
【附图简单说明】
本发明的上述目的及优点在参阅以下详细说明及附随图式之后对那些所属技术领域中具有通常知识者将变得更立即地显而易见。
图1显示pH值对于肠胃道中三种消化酶活性的影响。
图2A为一曲线图,其中显示胃蛋白酶(对照组)及含有不同浓度抗坏血酸的实验组在pH 2.0时在10分钟、1小时、2小时、3小时测得的蛋白水解效率。
图2B为一曲线图,其中显示胃蛋白酶(对照组)及含有不同浓度抗坏血酸的实验组在pH 5.0时在10分钟、1小时、2小时、3小时测得的蛋白水解效率。
图2C为一曲线图,其中显示胃蛋白酶(对照组)及含有不同浓度抗坏血酸的实验组在pH 6.0时在10分钟、1小时、2小时、3小时测得的蛋白水解效率。
图3A为一曲线图,其中显示胰蛋白酶(对照组)及含有不同浓度抗坏血酸的实验组在pH 5.0时在10分钟、1小时、2小时、3小时测得的蛋白水解效率。
图3B为一曲线图,其中显示胰蛋白酶(对照组)及含有不同浓度抗坏血酸的实验组在pH 6.0时在10分钟、1小时、2小时、3小时测得的蛋白水解效率。
图3C为一曲线图,其中显示胰蛋白酶(对照组)及含有不同浓度抗坏血酸的实验组在pH 7.5时在10分钟、1小时、2小时、3小时测得的蛋白水解效率。
【实施方式】
在设计本发明的多重pH缓冲配方组合时,必须考虑肠胃道的pH值环境。请参考图1,其记载于Essentials of Human Physiology(2017)。如图中所示,肠胃道中的三种主要消化酶各有其不同的最适pH环境,例如胃蛋白酶在pH 2~6环境下有最佳活性,而胰蛋白酶在pH 5~7.5环境下有最佳活性。事实上,食物在肠胃道的消化过程中,pH值并非维持恒定,而是在不同pH值之间变化。当食物进入胃上半部时,pH值约在4.0~6.5左右,进入胃下半部时,pH值约达到1.5~4.0左右;同样地,小肠各区段的pH值亦有不同,在十二指肠的pH值约为7.0~8.5,在小肠其它区段的pH值约为4.0~7.0。虽然在胃蛋白酶及胰蛋白酶的最适pH环境下,蛋白质有较佳的水解效率,但在尚未达到最适pH环境时、或者在胃酸分泌不足的个体中(如初生婴儿),若能在跨酸碱环境(pH 2~7.5)中,特别是pH 5~6环境下,提升消化道中胃蛋白酶及胰蛋白酶的蛋白质水解效率,就能提升蛋白质的整体消化和吸收功能。
本发明中提供的缓冲配方组合包括至少一酸成分、至少一碱成分及一蛋白质消化助剂。由于本发明的缓冲配方组合可添加于人类或动物的蛋白质营养补充品,因此所使用成分必须对生物体无毒,酸成分优选为有机酸,碱成分优选为有机碱,蛋白质消化助剂为抗坏血酸、其盐类或其组合。此外,磷酸及磷酸盐是被广泛应用的食物添加剂,因此也在本发明酸成分及碱成分的涵盖范围内。
酸成分与碱成分具有一共轭关系,例如一有机酸与其共轭碱、或者一有机碱与其共轭酸,两者配制成一缓冲配方。缓冲配方的pH值由酸成分的解离常数(pKa)和酸成分与碱成分的比例来决定。一般来说,pH值约在pKa值±1的范围内。常用有机酸、磷酸及抗坏血酸的pKa值如表一所示(参见Lab Manual for Zumdahl/Zumdahl’s Chemistry第6版)。在这些酸成分中,柠檬酸具有3个不同的pKa值且为有机酸,因此是本发明缓冲配方中酸成分的最佳选择。
有机酸 | 碳数 | pKa1 | pKa2 | pKa3 |
(1)甲酸 | (1个碳原子) | 3.75 | -- | -- |
(2)乙酸 | (2个碳原子) | 4.76 | -- | -- |
(3)丙酸 | (3个碳原子) | 4.88 | -- | -- |
(4)丁酸 | (4个碳原子) | 4.82 | -- | -- |
(5)苹果酸 | (4个碳原子) | 3.4 | 5.1 | -- |
(6)延胡索酸 | (4个碳原子) | 3.02 | 4.38 | -- |
(7)乳酸 | (3个碳原子) | 3.83 | -- | -- |
(8)柠檬酸 | (6个碳原子) | 3.13 | 4.76 | 6.4 |
(9)抗坏血酸 | (6个碳原子) | 4.1 | 11.8 | -- |
(10)磷酸 | (0个碳原子) | 2.12 | 7.21 | 12.32/12.66 |
选择合适的酸成分与碱成分搭配所形成的缓冲配方可具有多重pH值,因此可适应肠胃道环境的改变,确保其中的蛋白质消化助剂能在肠胃道中发挥作用。
本发明中使用的酸成分包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、苹果酸、延胡索酸、乳酸、柠檬酸及磷酸。优选地,酸成分为有机酸。在优选实施例中,有机酸为柠檬酸。本发明中使用的碱成分为有机碱或磷酸碱,优选地,有机碱或磷酸碱是指碱金属盐或碱土金属盐。在优选实施例中,有机碱为柠檬酸钠及柠檬酸钾其中之一。
本发明的缓冲配方亦可包括多种有机酸与其共轭碱、或者多种有机碱与其共轭酸。有机酸亦可与磷酸搭配作为本发明缓冲配方中的酸成分,有机碱亦可与磷酸碱搭配作为本发明缓冲配方中的碱成分。只要能调配出适合肠胃道pH值环境的缓冲配方,皆在本发明涵盖的范围内。
本发明中使用的蛋白质消化助剂为抗坏血酸、其盐类或其组合,优选地,抗坏血酸的盐类为其钠盐、钾盐、钙盐、镁盐及其组合其中之一。
抗坏血酸(左旋抗坏血酸)也可称为维它命C,是一种溶于水且易被吸收的化合物。由于抗坏血酸单独存在水溶液中时,在pH大于4的环境下容易降解,本发明的缓冲配方可使抗坏血酸、其盐类或其组合在pH大于4的环境下仍能维持活性,才能达到在跨酸碱环境提升胃蛋白酶及胰蛋白酶的蛋白质水解效率的目的。
另一方面,本发明的组合物可作为一种帮助消化蛋白质的组合物,例如添加于配方奶粉或动物饲料等蛋白质营养补充品的添加物,在pH 2~7.5的环境下提升胃蛋白酶及胰蛋白酶的消化效能,更佳地是在pH 5~6的环境下显著提升胃蛋白酶及胰蛋白酶的消化效能。
根据本发明的构想,在上述组合物中包含至少一酸成分、至少一碱成分及蛋白质消化助剂,其中至少一酸成分与至少一碱成分形成一缓冲配方,该缓冲配方使蛋白质消化助剂在跨酸碱环境下维持高活性。在一实施例中,该蛋白质消化助剂分布于该缓冲配方中。在另一实施例中,该缓冲配方与该蛋白质消化助剂均匀混合。
在本发明中,该蛋白质消化助剂为抗坏血酸、其钠盐、钾盐、钙盐、镁盐或其组合。在一优选实施例中,该蛋白质消化助剂为抗坏血酸,尤其是左旋抗坏血酸,其具有60ppm至1000ppm之间的浓度。优选地,抗坏血酸的浓度介于60ppm至240ppm之间,更佳地为240ppm。当然,只要符合人体每日摄取量的规范(每日最高约2g),本发明的抗坏血酸可以有较高的浓度。
根据本发明的构想,上述组合物的剂型包括粉末、颗粒、锭剂、微米颗粒、液体、胶囊或缓释剂型。
以下为本发明的实施例
(一)实验方法
1.酪蛋白的胃蛋白酶酶解实验(pH=2.0)
1.1对照组:取四支试管,以pH值为2.0的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)与胃蛋白酶(Pepsin,385ppm)的对照溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
1.2实验组(60ppm抗坏血酸):取四支试管,以pH值为2.0的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)、60ppm抗坏血酸、胃蛋白酶(Pepsin,385ppm)的实验溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值与相同抗坏血酸浓度下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
1.3实验组(120ppm抗坏血酸):取四支试管,以pH值为2.0的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)、120ppm抗坏血酸、胃蛋白酶(Pepsin,385ppm)的实验溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值与相同抗坏血酸浓度下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
1.4实验组(240ppm抗坏血酸):取四支试管,以pH值为2.0的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)、240ppm抗坏血酸、胃蛋白酶(Pepsin,385ppm)的实验溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值与相同抗坏血酸浓度下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
2.酪蛋白的胃蛋白酶酶解实验(pH=5.0)
2.1对照组:取四支试管,以pH值为5.0的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)与胃蛋白酶(Pepsin,385ppm)的对照溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
2.2实验组(60ppm抗坏血酸):取四支试管,以pH值为5.0的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)、60ppm抗坏血酸、胃蛋白酶(Pepsin,385ppm)的实验溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值与相同抗坏血酸浓度下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
2.3实验组(120ppm抗坏血酸):取四支试管,以pH值为5.0的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)、120ppm抗坏血酸、胃蛋白酶(Pepsin,385ppm)的实验溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值与相同抗坏血酸浓度下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
2.4备置新试管,并吸取离心后试管中的上清液20μL并加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后利用荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。
2.4实验组(240ppm抗坏血酸):取四支试管,以pH值为5.0的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)、240ppm抗坏血酸、胃蛋白酶(Pepsin,385ppm)的实验溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值与相同抗坏血酸浓度下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
3.酪蛋白的胃蛋白酶酶解实验(pH=6.0)
3.1对照组:取四支试管,以pH值为6.0的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)与胃蛋白酶(Pepsin,385ppm)的对照溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
3.2实验组(60ppm抗坏血酸):取四支试管,以pH值为6.0的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)、60ppm抗坏血酸、胃蛋白酶(Pepsin,385ppm)的实验溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值与相同抗坏血酸浓度下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
3.3实验组(120ppm抗坏血酸):取四支试管,以pH值为6.0的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)、120ppm抗坏血酸、胃蛋白酶(Pepsin,385ppm)的实验溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值与相同抗坏血酸浓度下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
3.4实验组(240ppm抗坏血酸):取四支试管,以pH值为6.0的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)、240ppm抗坏血酸、胃蛋白酶(Pepsin,385ppm)的实验溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值与相同抗坏血酸浓度下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
4.酪蛋白的胰蛋白酶酶解实验(pH=5.0)
4.1对照组:取四支试管,以pH值为5.0的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)与胰蛋白酶(Trypsin,385ppm)的对照溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
4.2实验组(60ppm抗坏血酸):取四支试管,以pH值为5.0的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)、60ppm抗坏血酸、胰蛋白酶(Trypsin,385ppm)的实验溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值与相同抗坏血酸浓度下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
4.3实验组(120ppm抗坏血酸):取四支试管,以pH值为5.0的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)、120ppm抗坏血酸、胰蛋白酶(Trypsin,385ppm)的实验溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值与相同抗坏血酸浓度下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
4.4实验组(240ppm抗坏血酸):取四支试管,以pH值为5.0的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)、240ppm抗坏血酸、胰蛋白酶(Trypsin,385ppm)的实验溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值与相同抗坏血酸浓度下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
5.酪蛋白的胰蛋白酶酶解实验(pH=6.0)
5.1对照组:取四支试管,以pH值为6.0的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)与胰蛋白酶(Trypsin,385ppm)的对照溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
5.2实验组(60ppm抗坏血酸):取四支试管,以pH值为6.0的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)、60ppm抗坏血酸、胰蛋白酶(Trypsin,385ppm)的实验溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值与相同抗坏血酸浓度下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
5.3实验组(120ppm抗坏血酸):取四支试管,以pH值为6.0的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)、120ppm抗坏血酸、胰蛋白酶(Trypsin,385ppm)的实验溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值与相同抗坏血酸浓度下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
5.4实验组(240ppm抗坏血酸):取四支试管,以pH值为6.0的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)、240ppm抗坏血酸、胰蛋白酶(Trypsin,385ppm)的实验溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值与相同抗坏血酸浓度下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
6.酪蛋白的胰蛋白酶酶解实验(pH=7.5)
6.1对照组:取四支试管,以pH值为7.5的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)与胰蛋白酶(Trypsin,385ppm)的对照溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
6.2实验组(60ppm抗坏血酸):取四支试管,以pH值为7.5的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)、60ppm抗坏血酸、胰蛋白酶(Trypsin,385ppm)的实验溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值与相同抗坏血酸浓度下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
6.3实验组(120ppm抗坏血酸):取四支试管,以pH值为7.5的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)、120ppm抗坏血酸、胰蛋白酶(Trypsin,385ppm)的实验溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值与相同抗坏血酸浓度下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
6.4实验组(240ppm抗坏血酸):取四支试管,以pH值为7.5的柠檬酸缓冲溶液制备四份含有酪蛋白(Casein,3.85mg/mL)、240ppm抗坏血酸、胰蛋白酶(Trypsin,385ppm)的实验溶液。将试管定温37℃下反应,四支试管分别反应10分钟、1小时、2小时、3小时后,各加入等量的10%三氯乙酸(TCA)溶液,混合均匀,室温静置10分钟,再以3000rpm转速离心10分钟。新取四支试管,分别加入前述四个时间点的上清液20μL,各加入2.4mL邻苯二甲醛(OPA)试剂,静置2分钟后,以荧光光谱仪于EX.340nm和EM.455nm下测定荧光强度。所得荧光强度以预先在同pH值与相同抗坏血酸浓度下建立的酪氨酸(Tyrosine)检量线换算含量,并以总氨基酸相对当量表示(Total Amino Acid Equivalent(TAAE)μg/mL)。
实验结果
请参阅表二及图2A,其中显示胃蛋白酶(对照组)及含有不同浓度抗坏血酸的实验组在pH 2.0时的蛋白水解效率。由于pH 2.0为胃蛋白酶的最适环境,因此各组别间的水解效率差异不大,但仍可看出含有抗坏血酸的组别相较于对照组有较佳的水解效率。
表二
a.上表中显示的数值单位为总氨基酸相对当量(Total Amino Acid Equivalent,TAAE)μg/mL
请参阅表三及图2B,其中显示胃蛋白酶(对照组)及含有不同浓度抗坏血酸的实验组在pH 5.0时的蛋白水解效率。pH 5.0时并非胃蛋白酶的最适环境,因此胃蛋白酶在此环境下水解效率较差,但可以观察到240ppm的抗坏血酸显著提升胃蛋白酶的水解效率。
表三
a.上表中显示的数值单位为TAAE μg/mL
请参阅表四及图2C,其中显示胃蛋白酶(对照组)及含有不同浓度抗坏血酸的实验组在pH 6.0时的蛋白水解效率。pH 6.0时亦非胃蛋白酶的最适环境,但可看出含有抗坏血酸的组别相较于对照组有较佳的水解效率。
表四
a.上表中显示的数值单位为TAAE μg/mL
请参阅表五及图3A,其中显示胰蛋白酶(对照组)及含有不同浓度抗坏血酸的实验组在pH 5.0时的蛋白水解效率。pH 5.0时并非胰蛋白酶的最适环境,因此胰蛋白酶在此环境下水解效率较差,但可以观察到240ppm的抗坏血酸显著提升胰蛋白酶的水解效率。
表五
a.上表中显示的数值单位为TAAE μg/mL
请参阅表六及图3B,其中显示胰蛋白酶(对照组)及含有不同浓度抗坏血酸的实验组在pH 6.0时的蛋白水解效率。pH 6.0时亦非胰蛋白酶的最适环境,但可看出含有抗坏血酸的组别相较于对照组有较佳的水解效率。
表六
a.上表中显示的数值单位为TAAE μg/mL
请参阅表七及图3C,其中显示胰蛋白酶(对照组)及含有不同浓度抗坏血酸的实验组在pH 7.5时的蛋白水解效率。由于pH 7.5为胰蛋白酶的最适环境,因此各组别间的水解效率差异不大,但仍可看出含有抗坏血酸的组别相较于对照组有较佳的水解效率。
表七
a.上表中显示的数值单位为TAAE μg/mL
比对各pH环境的相对浓度,符合最适化环境所测得的氨基酸浓度最高,而浓度随环境条件变差而相对渐减,无论是胃蛋白酶和胰蛋白酶都有同样的趋势。在pH 2~6环境下,以最适化(pH 2)的对照组为比较指标,观察到抗坏血酸在pH 5、pH 6以及pH 2环境下对胃蛋白酶蛋白水解效率具有显著增益效果。在pH 5~7.5环境下,以最适化(pH 7.5)的对照组为比较指标,观察到抗坏血酸在pH 5、pH 6以及pH7.5环境下对胰蛋白酶蛋白水解效率具有显著增益效果。
由于本发明的组合物中不含药物成分,较无抗药性和食安的疑虑。
本发明实属难能的创新发明,深具产业应用价值,援依法提出申请。此外,本发明可以由所属技术领域中具有通常知识者做任何修改,但不脱离如所附申请专利范围所要保护的范围。
Claims (6)
1.一种组合物在制备增加蛋白质消化及吸收效能的制剂中的应用,用于在人类或动物中增强pH值5至6之间的胃蛋白酶或pH值5至7.5之间的胰蛋白酶的蛋白水解效率,该组合物包括:
至少一种酸成分,其中该至少一种酸成分是柠檬酸;
至少一种碱成分,其中该至少一种碱成分是柠檬酸盐、该至少一种酸成分及该至少一种碱成分具共轭关系、且该至少一种酸成分及该至少一种碱成分形成缓冲配方;以及
蛋白质消化助剂,其中该蛋白质消化助剂是抗坏血酸、其盐类及其组合其中之一,且该蛋白质消化助剂的浓度介于60ppm至240ppm之间。
2.如权利要求1所述的应用,其中该缓冲配方用以提高该抗坏血酸在pH大于4环境下的稳定性。
3.如权利要求1所述的应用,其中该柠檬酸盐为柠檬酸钠及柠檬酸钾其中之一。
4.如权利要求1所述的应用,其中该抗坏血酸的盐类为钠盐、钾盐、钙盐、镁盐及其组合其中之一。
5.如权利要求1所述的应用,其中该组合物的剂型是选自由粉末、颗粒、锭剂、微米颗粒、液体、胶囊及缓释剂型所组成的群组其中之一。
6.如权利要求1所述的应用,其中该抗坏血酸为左旋抗坏血酸。
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