TWI648258B - 純化不飽和脂肪酸以及二十碳五烯酸的方法 - Google Patents

純化不飽和脂肪酸以及二十碳五烯酸的方法 Download PDF

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Abstract

一種純化不飽和脂肪酸以及二十碳五烯酸的方法。純化不飽和脂肪酸的方法包括提供乙酯化魚油。以模擬移動床層析法將乙酯化魚油中的包含二十碳五烯酸以及二十二碳六烯酸的不飽和脂肪酸分離開來，藉此得到高純度包含二十碳五烯酸以及二十二碳六烯酸的不飽和脂肪酸。

Description

純化不飽和脂肪酸以及二十碳五烯酸的方法
本發明是有關於一種純化方法，且特別是有關於一種純化不飽和脂肪酸以及二十碳五烯酸的方法。
魚油是從魚體內提取的油類物質的統稱，其所含的營養成分對機體有極高的生理活性，是腦、神經組織、骨髓、心、肝、卵和脾中不可缺少的組成部分，同時也有助於脂的消化吸收、轉運和形成，又是生物膜的重要結構物質。
二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）及二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）是魚油的主要營養成分。DHA屬於ω-3系列多不飽和脂肪酸，是神經系統細胞生長及維持的一種主要元素，是大腦細胞膜和視網膜的重要構成成分，在人體大腦皮層中含量高達20%，在視網膜中所占比例最大，約占50%〜60% ；它的缺乏可影響大腦智力發育、降低大腦思維、學習、分析及記憶能力，影響大腦分化成熟，影響視力敏感度，減退眼睛視網膜反射力，造成遠視或近視，影響精神集中能力等。
EPA同樣屬於ω-3系列多不飽和脂肪酸，是人體自身不能合成但又不可缺少的重要營養素，具有幫助降低膽固醇和甘油三酯的含量，促進體內飽和脂肪酸代謝，從而起到降低血液粘稠度、增進血液迴圈、提高組織供氧而消除疲勞、防止脂肪在血管壁的沉積以及預防動脈粥樣硬化的形成和發展、預防腦血栓、腦溢血、高血壓等心血管疾病。
現有魚油分離純化方法主要有：分子蒸餾法、低溫結晶法、尿素包合法，脂肪酶法、銀樹脂層析法、硝酸銀絡合法和高效液相色譜法。其中，分子蒸餾法、低溫結晶法、尿素包合法、脂肪酶法通常制得的為EPA乙酯（EPA-EE）和DHA乙酯（DHA-EE）的混合物，其單體的純度較低，純度很難達到80%以上。分離純化高純度EPA-EE和DHA-EE 多採用銀樹脂層析法、硝酸銀絡合法和高效液相色譜法。而銀樹脂層析法和硝酸銀絡合法需要使用大量昂貴的硝酸銀，不僅生產成本相對較高，而且硝酸銀難以回收，會造成嚴重污染，且若操作控制不當，硝酸銀還有進入產品的風險。常規的高效液相色譜法很難直接分離純化低純度的魚油原料，難以得到高純度的EPA-EE和DHA-EE，並且由於樣品在純化過程中被高度稀釋。
因此，如何找出一種可從魚油中純化出高純度DHA以及EPA的方法，是目前研究人員急欲解決的問題。
本發明提供一種純化不飽和脂肪酸的方法，可有效地分離出高純度的包含二十碳五烯酸以及二十二碳六烯酸的不飽和脂肪酸。
本發明提供一種純化二十碳五烯酸的方法，可有效地分離出高純度的二十碳五烯酸。
本發明的實施例提供一種純化不飽和脂肪酸的方法。所述方法包括以下步驟。首先，提供乙酯化魚油。接著，以模擬移動床層析法將乙酯化魚油中的不飽和脂肪酸分離開來，其中所分離的不飽和脂肪酸包括二十碳五烯酸以及二十二碳六烯酸，模擬移動床層析法包含：（i）提供模擬移動床，模擬移動床依序包括第一區段、第二區段以及第三區段，其中模擬移動床是由移動相及固定相所組成，固定相顆粒內部是具有孔隙，移動相對於模擬移動床中是朝同一方向從沖滌端入口流經第一區段、第二區段以及第三區段之間，固定相是相對於移動相朝反方向模擬移動，移動相為包含超臨界二氧化碳與純乙醇的沖滌劑；（ii）將乙酯化魚油從進料入口注入模擬移動床的第二區段與第三區段之間，並使不飽和脂肪酸隨固定相移動至第一區段與第二區段之間的萃出端並使乙酯化魚油中的其它混合物隨移動相移動至第三區段的萃餘端，以分離不飽和脂肪酸。
在本發明的一實施例中，以沖滌劑的總量計，純乙醇的含量為1 wt%~8 wt%。
在本發明的一實施例中，以沖滌劑的總量計，純乙醇的含量為5 wt%。
在本發明的一實施例中，上述的固定相例如是無規二氧化矽。
在本發明的一實施例中，上述的第一區段、第二區段以及第三區段各自包含2根管柱，且每根管柱內填充顆粒內部具有孔隙的固定相。
在本發明的一實施例中，上述的模擬移動床使用的分離條件為：二氧化碳流速在沖滌端入口為9.0 克/分鐘、在進料入口為0.64 克/分鐘、在萃出端為4.0 克/分鐘以及在萃餘端為5.64 克/分鐘，且純乙醇流速在沖滌端入口為0.599 毫升/分鐘、在進料入口為0.042 毫升/分鐘、在萃出端為0.268 毫升/分鐘以及在萃餘端為0.378 毫升/分鐘。
在本發明的一實施例中，上述的模擬移動床的切換時間為2分鐘50秒至3分鐘20秒。
在本發明的一實施例中，上述的第一區段、第二區段以及第三區段各自包含2根管柱、3根管柱與3根管柱，且每根管柱內填充顆粒內部具有孔隙的固定相。
在本發明的一實施例中，上述的模擬移動床使用的分離條件為：二氧化碳流速在沖滌端入口為26.5 公斤/小時、在進料入口為1.05 公斤/小時、在萃出端為11.78 公斤/小時以及在萃餘端為15.77 公斤/小時，且純乙醇流速在沖滌端入口為29.39 毫升/分鐘、在進料入口為1.12 毫升/分鐘、在萃出端為13.1毫升/分鐘以及在萃餘端為17.4 毫升/分鐘。
在本發明的一實施例中，上述的模擬移動床的切換時間為4分鐘。
本發明的實施例提供一種純化不飽和脂肪酸的方法。所述方法包括以下步驟。首先，提供乙酯化魚油。接著，進行第一模擬移動床層析製程，以將乙酯化魚油中的不飽和脂肪酸分離開來，其中所分離的不飽和脂肪酸包括二十碳五烯酸以及二十二碳六烯酸，其中第一模擬移動床層析製程包含：（i）提供模擬移動床，模擬移動床依序包括第一區段、第二區段以及第三區段，其中模擬移動床是由移動相及固定相所組成，固定相顆粒內部是具有孔隙，移動相對於模擬移動床中是朝同一方向從沖滌端入口流經第一區段、第二區段以及第三區段之間，固定相是相對於移動相朝反方向模擬移動，其中第一模擬移動床層析製程中的移動相為包含超臨界二氧化碳與純乙醇的第一沖滌劑；（ii）將乙酯化魚油從進料入口注入模擬移動床的第二區段與第三區段之間，並使不飽和脂肪酸隨固定相移動至第一區段與第二區段之間的萃出端並使乙酯化魚油中的其它混合物隨移動相移動至第三區段的萃餘端，以分離不飽和脂肪酸。然後，進行第二模擬移動床層析製程，以將所分離的不飽和脂肪酸中的二十碳五烯酸分離開來，其中第二模擬移動床層析製程包括將所分離的不飽和脂肪酸從進料入口注入模擬移動床的第二區段與第三區段之間，並使不飽和脂肪酸中的二十二碳六烯酸隨固定相移動至第一區段與第二區段之間的萃出端並使不飽和脂肪酸中的二十碳五烯酸隨移動相移動至第三區段的萃餘端，以分離二十碳五烯酸以及二十二碳六烯酸，其中第二模擬移動床層析製程中的移動相為包含超臨界二氧化碳與純乙醇的第二沖滌劑。
在本發明的一實施例中，以第一沖滌劑的總量計，純乙醇的含量為1 wt%~8 wt%。
在本發明的一實施例中，以第一沖滌劑的總量計，純乙醇的含量為5 wt%。
在本發明的一實施例中，以第二沖滌劑的總量計，純乙醇的含量為1 wt%~8 wt%。
在本發明的一實施例中，以第二沖滌劑的總量計，純乙醇的含量為2.5 wt%。
在本發明的一實施例中，上述的固定相例如是無規二氧化矽。
在本發明的一實施例中，上述的第一區段、第二區段以及第三區段各自包含2根管柱、3根管柱與3根管柱，且每根管柱內填充顆粒內部具有孔隙的固定相。
在本發明的一實施例中，上述的第一模擬移動床層析製程的分離條件為：二氧化碳流速在沖滌端入口為26.5 公斤/小時、在進料入口為1.05 公斤/小時、在萃出端為11.78 公斤/小時以及在萃餘端為15.77 公斤/小時，且純乙醇流速在沖滌端入口為29.39 毫升/分鐘、在進料入口為1.12 毫升/分鐘、在萃出端為13.1毫升/分鐘以及在萃餘端為17.4 毫升/分鐘，且模擬移動床的切換時間為4分鐘。
在本發明的一實施例中，第二模擬移動床層析製程的分離條件為：二氧化碳流速在沖滌端入口為26.5 公斤/小時、在進料入口為0.3 公斤/小時、在萃出端為11.78 公斤/小時以及在萃餘端為15.02 公斤/小時，且純乙醇流速在沖滌端入口為14.7 毫升/分鐘、在進料入口為0.165 毫升/分鐘、在萃出端為6.55毫升/分鐘以及在萃餘端為8.315 毫升/分鐘，且模擬移動床的切換時間為5分鐘15秒至5分鐘40秒。
基於上述，本發明的不飽和脂肪酸的純化方法透過應用模擬移動床層析法來從魚油中分離出包含EPA以及DHA的不飽和脂肪酸，不僅可有效提升分離效率，更可獲得高純度的包含EPA以及DHA的不飽和脂肪酸。此外，本發明的二十碳五烯酸的純化方法可藉由進行二次模擬移動床層析製程而進一步從魚油中純化出二十碳五烯酸，同樣地，不僅可有效提升分離效率，更可獲得高純度的二十碳五烯酸。
為讓本發明的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。
本發明實施例的純化EPA的方法，是可用以將EPA以及其它混合物從魚油中分離純化出來的方法。藉此，能夠得到高純度的EPA。
以下列舉實施例以說明本發明純化方法之細節或條件，並且下述實施例主要分成兩大部分。第一部分是關於魚油中不飽脂肪酸的純化，更具體來說，是關於魚油中包含EPA以及DHA的不飽脂肪酸的純化。純化不飽脂肪酸的方法包括：提供乙酯化魚油；以及以模擬移動床層析法將乙酯化魚油中的不飽和脂肪酸分離開來，其中所分離的不飽和脂肪酸包括二十碳五烯酸以及二十二碳六烯酸。
第二部分是關於魚油中EPA的純化，更具體來說，是先將包含EPA以及DHA的不飽脂肪酸從魚油中分離，再將EPA從包含EPA以及DHA的不飽脂肪酸中分離。純化EPA的方法包括：提供乙酯化魚油；進行第一模擬移動床層析製程，以將乙酯化魚油中的不飽和脂肪酸分離開來，其中所分離的不飽和脂肪酸包括二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）以及二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）；以及進行第二模擬移動床層析製程，以將所分離的不飽和脂肪酸中的二十碳五烯酸以及二十二碳六烯酸分離開來。
以下的實施例非用以限制本發明保護範圍。所繪圖式係為示意圖僅為說明方便而繪製，並非代表限制其實際之方法、條件或裝置等。 實施例1： 不飽脂肪酸的純化
在本實施例中，可使用如圖1所示的超臨界流體模擬移動床（Supercritical Fluid-Simulated Moving Bed，SF-SMB）設備來進行模擬移動床層析法。圖1是依照本發明實施例的一種超臨界流體模擬移動床設備的管線流程圖。請參照圖1，模擬移動床100包括第一區段、第二區段與第三區段。在本實施例中，第一區段包含2根管柱C1與C2，第二區段包含3根管柱C3、C4與C5，且第三區段包含3根管柱C6、C7與C8，上述8根管柱串聯，但本發明不限於此。在另一實施例中，第一區段包含2根管柱，第二區段包含2根管柱，且第三區段包含2根管柱，上述6根管柱串聯。
模擬移動床100是由移動相（未繪示）及固定相（未繪示）所組成。移動相是相對於模擬移動床100中是朝同一方向從沖滌端入口D1流經第一區段、第二區段以及第三區段之間，而固定相是相對於移動相朝反方向模擬移動。
每根管柱內填充有顆粒內部具有孔隙的固定相。在本實施例中，固定相例如是無規二氧化矽（irregular silica）。但本發明不限於此，固定相可以為習知常用的固定相材料。在本實施例中，移動相（或沖滌劑）例如是包含超臨界二氧化碳與輔助溶劑的沖滌劑。在本實施例中，輔助溶劑為純乙醇（無水乙醇）。包含超臨界二氧化碳與輔助溶劑的沖滌劑可藉由二氧化碳液泵產生高壓二氧化碳並與輔助溶劑混合後而形成。
再次參照圖1，模擬移動床100包括兩個入料口，分別為樣品進料入口F1（即管柱C6入口位置）與沖滌端入口D1（即管柱C1入口位置），且包括兩個出料口，分別為萃出端E1（即管柱C2出口位置）與萃餘端R1（即管柱C8出口位置）。如果讓所有入料口以及出料口的位置在經過一段時間後，同時轉換至下一支管柱，則可模擬固定相移動（即向圖1的下方移動）。舉例來說，進料入口由原來在管柱C6入口位置切換至管柱C7入口位置，其餘的入料口以及出料口亦同時往下一支管柱變換，在此同時，沖滌劑與進料則仍然一直連續不斷地往萃餘端流動。如果不斷地連續切換進料口以及出料口的位置，則會形成讓固體連續向下流動並一再循環，因此可達成固體與超臨界流體連續逆向流動接觸的過程。
由於本發明實施例是使用超臨界二氧化碳作為沖滌劑（移動相），因此需要設置一個高壓的二氧化碳供應源110。模擬移動床100是利用二氧化碳液泵115從二氧化碳供應源110產生高壓二氧化碳，並暫存於高壓緩衝槽120之中。接著，再以前端壓力調壓閥122或後端壓力調壓閥123、質量流量計並搭配控制閥（未繪示）來控制進料的二氧化碳流速。
除了二氧化碳質量流量的控制以外，輔助溶劑的輸入則從輸入口D2藉由高效能液相層析液泵125a加以控制，而樣品的輸入則從輸入口F2藉由高效能液相層析液泵125b加以控制。詳細來說，待樣品的進料溶解於輔助溶劑中後，其是利用高效能液相層析液泵125b從輸入口F2輸入與二氧化碳混合後再進入模擬移動床100中。相同地，做為移動相，包含超臨界二氧化碳以及輔助溶劑的沖滌液是藉由二氧化碳液泵115產生的高壓二氧化碳與從輸入口D2輸入的輔助溶劑混合後而形成。此外，上述的高壓二氧化碳與輔助溶劑混合的步驟可藉由混合器130來達成。
超臨界流體在連續切換進料口以及出料口位置的同時，雖然超臨界流體不斷向上流動（即向圖1的上方移動），但是並沒有直接循環回到管柱C1位置。傳統以液體為流動相的模擬移動床裝置，經常會增設第四區段，用以再生流動相進而直接循環回流使用。在本實施例中，使用降壓分離方式而輕易達成超臨界流體的再生，因此從萃餘端R1以及萃出端E1流出的超臨界流體，經過分離槽145a、145b的簡單降壓後將二氧化碳汽化，便可將二氧化碳氣體經過二次冷卻沉澱出殘留的輔助溶劑與溶質後達成二氧化碳再生之目的。如此便可以減少第四區段的管柱使用、降低設備的成本以及填料需求的成本。
由分離槽155回收的二氧化碳氣體經過冷凝回收以後，暫存於工作儲槽160，再經預冷後以二氧化碳液泵115加壓暫存於高壓緩衝槽120中，並以後端壓力調壓閥123控制其壓力。高壓緩衝槽120內的二氧化碳經過適度的調壓與計量後，分別由管柱C1與管柱C6位置注入到系統之中，注入之前並與定量輸入的輔助溶劑或是進料溶液混合。經過模擬移動床的分離作用之後，兩個出料則由萃出端E1與萃餘端R1流出系統外。萃餘端R1流出的超臨界流體先經過後端壓力調壓閥123後在分離槽145b中分離出輔助溶劑與溶質，然後回收二氧化碳氣體。在萃餘端R1出口的後端壓力調壓閥123也負責控制著整個SF-SMB的操作壓力。萃出端E1流出的超臨界流體則藉由一個質量流量控制閥控制其流出的流速，然後進入分離槽145a分離出輔助溶劑與溶質。從萃出端E1與萃餘端R1分離槽流出的二氧化碳氣體合併後再一起循環回收。
接著，以下將對利用模擬移動床層析法將包含EPA以及DHA的不飽脂肪酸從魚油中分離開來的方式進行說明。在提供如圖1所示的模擬移動床100之後，是將乙酯化魚油從進料入口F1注入模擬移動床100的第二區段以及第三區段之間，並且使包含EPA以及DHA的不飽脂肪酸隨固定相移動至第一區段與第二區段之間的萃出端E1並使乙酯化魚油中的其它混合物隨移動相移動至第三區段的萃餘端R1。為了達到上述的分離結果，移動相選擇包含超臨界二氧化碳與純乙醇的沖滌劑。在本實施例中，以沖滌劑的總量計，純乙醇的含量為1 wt%~8 wt%。在一實施例中，以沖滌劑的總量計，純乙醇的含量為5%。 分析方法建立
分析方法中是使用安捷倫氣相層析質譜儀（GC/MS）（型號7890A/59770B）進行乙酯化魚油的分析，所使用的分析毛細管柱為DB-5MS (30 m× 250 μm)，並選用1.0毫升/分鐘氦氣作為挾帶氣體。氣相層析質譜儀的升溫條件設定如下：起始120℃並以10℃/分鐘升溫至220℃後持溫6分鐘，再以10℃/分鐘升溫至250℃持溫12分鐘，再以5℃/分鐘升溫至300℃持溫5分鐘，進樣量為1μL，採用分流30:1。
樣品的GC/MS圖譜如圖2與圖3所示。圖2為10%乙酯化魚油的氣相色譜質譜分析圖。圖3為25%乙酯化魚油的氣相色譜質譜分析圖。在圖2與圖3中，內標準品IS採用167毫克/升的十五烷。依據MS資料庫數據比對，在滯留時間為17.5 分鐘處為EPA，而在滯留時間為20.5分鐘處為DHA。從GC/MS圖譜可以清楚判讀出DHA、EPA以及其它混合物102的波鋒位置，藉由此結果做為分析標準。 [SF-SMB 分離試驗 ] [ 包含 EPA 與 DHA 的不飽和脂肪酸 的純度以及回收率計算 ]
首先，將乙酯化魚油樣品直接溶解於純乙醇當作進料溶液。然後，再利用液泵輸入SF-SMB系統以分離成兩種不同組成的樣品。由萃出端E1取樣得到的樣品需進行其中EPA與DHA的含量計算，並與進料入口F1中EPA與DHA的含量相比較，以判定分離的效果。從萃出端E1得到的樣品中量取一定體積的樣品後，先稀釋10倍，然後按照體積比為9:1的比例與已知濃度的內標物均勻混和後，以GC/MS分析得圖譜中EPA與DHA的面積分率，因此EPA與DHA的含量計算公式如下式1所示。在本實施例中，EPA與DHA的含量可定義為純度。 (式1) 在式1中，A EPA與A DHA分別為GC/MS圖譜中EPA與DHA的峰面積，SA i表示圖譜中所有的峰面積總和。
EPA與DHA從乙酯化魚油中分離以後，其回收率則依以下式2來估算。 (式2) 在式2中，A EPA與A DHA分別為GC/MS圖譜中EPA與DHA的峰面積，上標E與R分別代表萃出端以及萃餘端，而Q EtOH為乙醇的體積流速。 實驗例 1 [SF-SMB 的操作條件 ]
在實驗例1中，10%乙酯化魚油原料（常州嘉眾新材料科技有限公司）先配製成20 克/升的乙醇溶液。接著，使用類似於圖1所示的超臨界流體模擬移動床設備來進行包含EPA與DHA的不飽和脂肪酸的純化。與圖1的超臨界流體模擬移動床設備的差別僅在於在實驗例1中是使用6根填充管柱被設計成三個區段的模擬移動床。填充管柱為10 mm × 150 mm的不銹鋼管柱，所採用的填料（固定相）為無規二氧化矽，而移動相為包含超臨界二氧化碳與5wt%純乙醇的沖滌劑。6根填充管柱被設計成三個區段的模擬移動床，而且每一個區段各有2支管柱。分離的條件為：溫度固定為50℃，萃餘端出口壓力為1700 psi，而沖滌劑入口壓力2200 psi。各入口與出口端的二氧化碳流速設定如下：沖滌端入口為9.0 克/分鐘；進料入口為0.64 克/分鐘；萃出端為4.0 克/分鐘；萃餘端為5.64 克/分鐘（經質量守恆計算）。入料口的純乙醇流速設定如下：沖滌端入口為0.599 毫升/分鐘；進料入口為0.042 毫升/分鐘。依據質量守恆，萃出端與萃餘端的純乙醇流速分別為0.268毫升/分鐘以及0.378 毫升/分鐘。此外，在實驗例1中，在固定各出入口的流速條件下，改變SF-SMB設備上閥門的切換時間（2分鐘40秒、2分鐘50秒與3分鐘），然後觀察二個出料口所收集樣品的組成隨切換時間的變化。採用上述條件進行模擬移動床層析法所得到的結果分析如圖4至圖6所示，且由式1與式2所計算含量（定義為純度）與回收率的結果如表1所示。
表1 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> </td><td> 純度(EPA+DHA) (%) </td><td> 回收率 (%) </td></tr><tr><td> 進料入口 </td><td> 65.8 </td><td> </td></tr><tr><td> 切換時間 2分鐘40秒 </td><td> 65.9 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 切換時間 2分鐘50秒 </td><td> 88.7 </td><td> 83.3 </td></tr><tr><td> 切換時間 3分鐘 </td><td> 92 </td><td> 83.3 </td></tr></TBODY></TABLE>
圖4至圖6為本發明實驗例利用模擬移動床層析法從10%魚油中分離純化出包含EPA以及DHA的不飽和脂肪酸的結果分析圖。請參照圖4至圖6以及表1。由圖4可以看出，在切換時間為2分鐘40秒時，並無法將包含DHA以及EPA的不飽和脂肪酸由魚油中分離純化出來。而由圖5以及圖6可以看出，包含DHA以及EPA的不飽和脂肪酸是從萃出端E1分離出來，而大部分的其它混合物102是從萃餘端R1分離出來。且在切換時間為3分鐘時，包含DHA以及EPA的不飽和脂肪酸的純度可由原本的65.8%提高至92%。 實驗例 2
採用與實驗例1相同的設備和條件來進行純化，其差別僅在於將25%乙酯化魚油原料製成10 克/升的乙醇溶液，以及進行五種不同切換時間（2分鐘50秒、2分鐘55秒、3分鐘、3分鐘20秒以及3分鐘40秒）的試驗。採用上述條件進行模擬移動床層析法所得到的結果分析如圖7至圖11所示，且由式1與式2所計算含量（定義為純度）與回收率的結果如表2所示。
表2 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> </td><td> 純度(EPA+DHA) (%) </td><td> 回收率 (%) </td></tr><tr><td> 進料入口 </td><td> 55.3 </td><td> </td></tr><tr><td> 切換時間 2分鐘50秒 </td><td> 85.5 </td><td> 96.5 </td></tr><tr><td> 切換時間 2分鐘55秒 </td><td> 86.8 </td><td> 95.6 </td></tr><tr><td> 切換時間 3分鐘 </td><td> 87.2 </td><td> 93.8 </td></tr><tr><td> 切換時間 3分鐘20秒 </td><td> 89.3 </td><td> 39.9 </td></tr></TBODY></TABLE>
圖7至圖11為本發明實驗例利用模擬移動床層析法從25%魚油中分離純化出包含EPA以及DHA的不飽和脂肪酸的結果分析圖。請參照圖7至圖11以及表2。由圖7以及圖11可以看出，EPA以及DHA是從萃出端E1分離出來，而大部分的其它混合物102是從萃餘端R1分離出來。在切換時間為3分鐘時，包含DHA以及EPA的不飽和脂肪酸的純度可由原本的55.3%提高至87.2%，且具有93.8的回收率。
由上述可知，本實施例的模擬移動床使用包含超臨界二氧化碳與純乙醇的沖滌劑作為移動相，因此可將魚油中的包含DHA以及EPA的不飽和脂肪酸純化分離出來，純度可由原本的55%~66%提升到92%，回收率也可高達84%~96%。 實施例2： EPA 的純化
實驗例2的超臨界流體模擬移動床設備與實施例1（即圖1）所使用的超臨界流體模擬移動床設備相同，因此，相同元件以相同標號表示，且不予贅述。實驗例2的分離純化可以分為兩次的分離步驟（第一模擬移動床層析製程與第二模擬移動床層析製程）。
詳細來說，在本實驗例的第一模擬移動床層析製程中，是將乙酯化魚油從進料入口F1注入模擬移動床100的第二區段以及第三區段之間，並且使包含EPA以及DHA的不飽脂肪酸隨固定相移動至第一區段與第二區段之間的萃出端E1並使乙酯化魚油中的其它混合物隨移動相移動至第三區段的萃餘端R1。為了達到上述的分離結果，移動相選擇包含超臨界二氧化碳與純乙醇的第一沖滌劑。在本實施例中，以第一沖滌劑的總量計，純乙醇的含量為1 wt%~8 wt%。在一實施例中，以第一沖滌劑的總量計，純乙醇的含量為5 wt%。
為了進一步將EPA從包含EPA以及DHA的不飽脂肪酸中分離，將上述從萃出端所收集的不飽脂肪酸（含EPA以及DHA）進行第二模擬移動床層析製程。在本實驗例的第二模擬移動床層析製程中，是將第一模擬移動床層析製程中在萃出端E1所收集到的不飽和脂肪酸（含EPA以及DHA）注入模擬移動床100的第二區段與第三區段之間，並使不飽和脂肪酸中的DHA隨固定相移動至第一區段與第二區段之間的萃出端E1，並使不飽和脂肪酸中的EPA隨移動相移動至第三區段的萃餘端R1，以分離EPA以及DHA。為了達到上述的分離結果，移動相選擇包含超臨界二氧化碳與純乙醇的第二沖滌劑。在本實施例中，以第二沖滌劑的總量計，純乙醇的含量為1 wt%~8 wt%。在一實施例中，以第二沖滌劑的總量計，純乙醇的含量為2.5wt%。 分析方法建立
分析方法中是使用安捷倫氣相層析質譜儀（GC/MS）（型號7890A/59770B）進行乙酯化魚油的分析，所使用的分析毛細管柱為DB-5MS (30 m L× 250 μm ID，0.25 μm)，並選用1.0毫升/分鐘氦氣作為挾帶氣體。氣相層析質譜儀的升溫條件設定如下：起始120℃並以10℃/分鐘升溫至210℃後持溫10分鐘，再以10℃/分鐘升溫至270℃持溫12分鐘，再以5℃/分鐘升溫至270℃持溫6分鐘，進樣量為1μL，採用分流30:1。
樣品的GC/MS圖譜如圖12所示。圖12為乙酯化魚油的氣相色譜質譜分析圖。在圖12中，內標準品IS採用500毫克/升的十五烷。依據MS資料庫數據比對，在滯留時間為17.5 分鐘處為EPA，而在滯留時間為20.5分鐘處為DHA。從GC/MS圖譜可以清楚判讀出DHA、EPA以及其它混合物102的波鋒位置，藉由此結果做為分析標準。
在本實施例中，製作了EPA以及DHA的檢量線，所得到的響應因子分別為0.308及0.244，上述檢量線搭配十五碳直鏈烷作為內標準品的響應因子（ m），定義如下： (式3) 在式3中， A與 A is 分別為樣品及內標準品在分析圖譜中的面積， C與 C is 為樣品以及內標準品的濃度， V和 V is 為注射料液中樣品與內標準品的體積。 [SF-SMB 分離試驗 ] [ 包含 EPA 與 DHA 的不飽和脂肪酸、 EPA 與 DHA 的純度以及回收率計算 ]
在第一模擬移動床層析製程的分離實驗主要是先移除圖12中滯留時間短於15分鐘的其它混合物102。由於缺少其它混合物102的標準品，為方便評估分離的成效，因此分離後產物的純度與回收率僅以波鋒面積加以計算。首先，將進料溶液輸入SF-SMB系統以分離成兩種不同組成的樣品。從萃出端得到的樣品按照體積比為9:1的比例與已知濃度的內標物（500毫克/分鐘）均勻混和後，以GC/MS分析得圖譜中EPA與DHA的面積分率，由分析所得圖譜面積計算EPA與DHA兩者的純度及回收率，其計算公式如下式4與式5所示。在本實施例中，EPA與DHA的含量可定義為純度。 (式5) 在式1中，P代表純度，A EPA與A DHA分別為GC/MS圖譜中EPA與DHA的峰面積，SA i表示圖譜中所有的峰面積總和。
回收率則依以下式6來估算。 (式6) 在式6中，Y代表回收率，A EPA與A DHA分別為GC/MS圖譜中EPA與DHA的峰面積，上標E與R分別代表萃出端以及萃餘端，而Q為乙醇的體積流速。
第二模擬移動床層析製程的主要目的在分離DHA與EPA，同時EPA與DHA也容易製作出檢量線，因此針對第二模擬移動床層析製程的實驗，本實施例定義兩個出口端的純度與回收率如以下式7與式8所示。 (式7) 在式1中，P代表純度，C EPA與C DHA分別為GC/MS圖譜中回歸計算所得到的EPA與DHA的濃度，上標E與R分別代表萃出端以及萃餘端。
回收率則依以下式8來估算。 (式8) 在式8中，Y代表回收率，C EPA與C DHA分別為GC/MS圖譜中回歸計算所得到的EPA與DHA的濃度，上標E與R分別代表萃出端以及萃餘端，而Q為乙醇的體積流速。 實驗例 3 [SF-SMB 的操作條件 ]
在實驗例3中，將乙酯化魚油原料先配製成9.823 克/升的乙醇溶液。接著，使用圖1所示的超臨界流體模擬移動床設備來進行模擬移動床層析法。填充管柱為80 mm的DAC管柱，所採用的填料（固定相）為無規二氧化矽（Zeoprep60，40 μm~60 μm，Zeochem），填充高度為230 mm。而移動相為包含超臨界二氧化碳與5wt%純乙醇的沖滌劑。分離的條件為：溫度固定為50℃，萃餘端出口壓力為121 bar，而沖滌劑入口壓力130 bar。各入口與出口端的二氧化碳流速設定如下：沖滌端入口為26.5 公斤/小時；進料入口為1.51 公斤/小時；萃出端為11.78 公斤/小時；萃餘端為16.32 公斤/小時（經質量守恆計算）。入料口的純乙醇流速設定如下：沖滌端入口為29.39 毫升/分鐘；進料入口為1.65 毫升/分鐘；萃出端為13.1毫升/分鐘；萃餘端的乙醇流速為17.94 毫升/分鐘（經質量守恆計算）。此外，在實驗例3中，在固定各出入口的流速條件下，改變SF-SMB設備上閥門的切換時間（3分鐘30秒、4分鐘15秒與5分鐘），然後觀察二個出料口所收集樣品的組成隨切換時間的變化。
切換時間3分鐘30秒以及5分鐘的分離結果分別為萃出端以及萃餘端的泛流。圖13為模擬移動床的切換時間為4分鐘15秒的結果分析圖，且依據式5以及式6所計算純度與回收率的結果如表3所示。由圖13的結果可以看出，在切換時間為4分鐘15秒時，可以從魚油中分離純化出包含DHA以及EPA的不飽和脂肪酸，而且可推測DHA為為魚油中最強滯留成分，其次為EPA。 實驗例 4 [SF-SMB 的操作條件 ]
在實驗例4中，將乙酯化魚油原料先配製成9.823 克/升的乙醇溶液。接著，使用圖1所示的超臨界流體模擬移動床設備來進行模擬移動床層析法。填充管柱為80 mm的DAC管柱，所採用的填料（固定相）為無規二氧化矽（Zeoprep60，40 μm~60 μm，Zeochem），填充高度為230 mm。而移動相為包含超臨界二氧化碳與5wt%純乙醇的沖滌劑。分離的條件為：溫度固定為50℃，萃餘端出口壓力為121 bar，而沖滌劑入口壓力130 bar。各入口與出口端的二氧化碳流速設定如下：沖滌端入口為26.5 公斤/小時；進料入口為1.05 公斤/小時；萃出端為11.78 公斤/小時；萃餘端為15.77 公斤/小時（經質量守恆計算）。入料口的純乙醇流速設定如下：沖滌端入口為29.39 毫升/分鐘；進料入口為1.12 毫升/分鐘；萃出端為13.1毫升/分鐘；萃餘端的乙醇流速為17.4 毫升/分鐘（經質量守恆計算）。此外，在實驗例4中，模擬移動床的切換時間為4分鐘。採用上述條件進行模擬移動床層析法所得到的結果分析如圖14所示，且依據式5以及式6所計算純度與回收率的結果如表3所示。
表3 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> </td><td> 純度 (%) </td><td> 回收率 (%) </td></tr><tr><td> 實驗例3 切換時間 4分鐘15秒 </td><td> 86.8 </td><td> 27.6 </td></tr><tr><td> 實驗例4 切換時間 4分鐘 </td><td> 87.8 </td><td> 91.6 </td></tr></TBODY></TABLE>
圖14為模擬移動床的切換時間為4分鐘的結果分析圖。請參照圖13、圖14以及表3，實驗例4 的操作條件由於降低進料流速以及縮短切換時間（相對於實驗例3的操作條件），可以成功地分離從魚油中分離純化出包含DHA以及EPA的不飽和脂肪酸，其純度及回收率可分別達87.8%以及91.6%。 實驗例 5 [SF-SMB 的操作條件 ]
在實驗例5中，將實驗例4中在萃出端E1所收集的包含DHA以及EPA的不飽和脂肪酸作為進行第二模擬移動床層析製程的進料，且將上述進料調整為20.23 克/升的乙醇溶液。此外，在實驗例5中，使用與實驗例3相同的超臨界流體模擬移動床設備來進行模擬移動床層析法。填充管柱為80 mm的DAC管柱，所採用的填料（固定相）為無規二氧化矽（Zeoprep60，40 μm~60 μm，Zeochem），填充高度為230 mm。而移動相為包含超臨界二氧化碳與2.5wt%純乙醇的沖滌劑。分離的條件為：溫度固定為50℃，萃餘端出口壓力為121 bar，而沖滌劑入口壓力130 bar。各入口與出口端的二氧化碳流速設定如下：沖滌端入口為26.5 公斤/小時；進料入口為0.3 公斤/小時；萃出端為11.78 公斤/小時；萃餘端為15.02 公斤/小時（經質量守恆計算）。入料口的純乙醇流速設定如下：沖滌端入口為14.7 毫升/分鐘；進料入口為0.165 毫升/分鐘；萃出端為6.55毫升/分鐘；萃餘端的乙醇流速為8.315 毫升/分鐘（經質量守恆計算）。此外，在實驗例5中，在固定各出入口的流速條件下，改變SF-SMB設備上閥門的切換時間（5分鐘15秒、5分鐘30秒與5分鐘40秒），然後觀察二個出料口所收集樣品的組成隨切換時間的變化。採用上述條件進行模擬移動床層析法所得到的結果分析如圖15至圖17所示，且依據式7以及式8所計算純度與回收率的結果如表4所示。
表4 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td> 切換時間 </td><td> 濃度(m克/升) </td><td> 純度(%) </td><td> 回收率(%) </td></tr><tr><td> 萃出液 </td><td> 萃餘液 </td><td> EPA </td><td> DHA </td><td> EPA </td><td> DHA </td></tr><tr><td> EPA </td><td> DHA </td><td> EPA </td><td> DHA </td></tr><tr><td> 進料 </td><td> 11445.8 </td><td> 3144.0 </td><td> － </td><td> － </td><td> 78.5 </td><td> － </td><td> － </td><td> － </td></tr><tr><td> 5分鐘15秒 </td><td> 82.1 </td><td> 50.1 </td><td> 20.7 </td><td> 0.0 </td><td> 100.0 </td><td> 62.1 </td><td> 24.4 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> 5分鐘30秒 </td><td> 71.5 </td><td> 50.0 </td><td> 192.8 </td><td> 4.7 </td><td> 97.6 </td><td> 58.8 </td><td> 77.5 </td><td> 89.3 </td></tr><tr><td> 5分鐘40秒 </td><td> 72.2 </td><td> 67.0 </td><td> 132.1 </td><td> 3.8 </td><td> 97.2 </td><td> 51.8 </td><td> 70.0 </td><td> 93.2 </td></tr></TBODY></TABLE>
圖15至圖17為本發明實驗例利用模擬移動床層析法從不飽和脂肪酸中分離純化出EPA以及DHA的結果分析圖。請參照圖15至圖17以及表4。在切換時間為5分鐘15秒時，萃餘端可以收集到純度高達100%的EPA。在切換時間為5分鐘30秒時，EPA的純度為97.6%，且回收率也可達77.5%。且在切換時間為5分鐘40秒時，EPA的純度為97.2%，且回收率也可達70%。由上述的內容可知，由於實驗例5的第二模擬移動床層析製程的操作條件採用較低的純乙醇濃度（2.5wt%），因此可純化出高純度的EPA。
綜上所述，本發明的不飽和脂肪酸的純化方法透過應用模擬移動床層析法來從魚油中分離包含EPA以及DHA的不飽和脂肪酸，不僅可有效提升分離效率，更可獲得高純度的包含EPA以及DHA的不飽和脂肪酸。此外，本發明的二十碳五烯酸的純化方法可藉由進行二次模擬移動床層析製程而進一步從魚油中純化出二十碳五烯酸，同樣地，不僅可有效提升分離效率，更可獲得高純度的二十碳五烯酸。
雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。
100‧‧‧模擬移動床
102‧‧‧其它混合物
110‧‧‧二氧化碳供應源
115‧‧‧二氧化碳液泵
120‧‧‧高壓緩衝槽
122‧‧‧前端壓力調壓閥
123‧‧‧後端壓力調壓閥
125a、125b‧‧‧高效能液相層析液泵
130‧‧‧混合器
145a、145b、155‧‧‧分離槽
160‧‧‧工作儲槽
C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8‧‧‧管柱
D1‧‧‧沖滌端入口
D2、F2‧‧‧輸入口
E1‧‧‧萃出端
F1‧‧‧進料入口
IS‧‧‧內標準品
R1‧‧‧萃餘端
圖1是依照本發明實施例的一種超臨界流體模擬移動床設備的管線流程圖。 圖2為10%乙酯化魚油的氣相色譜質譜分析圖。 圖3為25%乙酯化魚油的氣相色譜質譜分析圖。 圖4至圖6為本發明實驗例利用模擬移動床層析法從10%魚油中分離純化出包含EPA以及DHA的不飽和脂肪酸的結果分析圖。 圖7至圖11為本發明實驗例利用模擬移動床層析法從25%魚油中分離純化出包含EPA以及DHA的不飽和脂肪酸的結果分析圖。 圖12為乙酯化魚油的氣相色譜質譜分析圖。 圖13為模擬移動床的切換時間為4分鐘15秒的結果分析圖。 圖14為模擬移動床的切換時間為4分鐘的結果分析圖。 圖15至圖17為本發明實驗例利用模擬移動床層析法從不飽和脂肪酸中分離純化出EPA以及DHA的結果分析圖。

Claims (17)

  1. 一種純化不飽和脂肪酸的方法，包括：提供乙酯化魚油；以及以模擬移動床層析法將所述乙酯化魚油中的不飽和脂肪酸分離開來，其中所分離的所述不飽和脂肪酸包括二十碳五烯酸以及二十二碳六烯酸，其中所述模擬移動床層析法包含：(i)提供模擬移動床，所述模擬移動床依序包括第一區段、第二區段以及第三區段，其中所述模擬移動床是由移動相及固定相所組成，所述固定相顆粒內部是具有孔隙，所述移動相對於所述模擬移動床中是朝同一方向從沖滌端入口流經所述第一區段、所述第二區段以及所述第三區段之間，所述固定相是相對於所述移動相朝反方向模擬移動，所述移動相為包含超臨界二氧化碳與純乙醇的沖滌劑；(ii)將所述乙酯化魚油從進料入口注入所述模擬移動床的所述第二區段與所述第三區段之間，並使所述不飽和脂肪酸隨所述固定相移動至所述第一區段與所述第二區段之間的萃出端並使所述乙酯化魚油中的其它混合物隨所述移動相移動至所述第三區段的萃餘端，以分離所述不飽和脂肪酸，其中所述模擬移動床使用的分離條件為：二氧化碳流速在所述沖滌端入口為26.5公斤/小時、在所述進料入口為1.05公斤/小時、在所述萃出端為11.78公斤/小時以及在所述萃餘端為15.77公斤/小時，且所述純乙醇流速在所述沖滌端入口為29.39毫升/分鐘、在所述進料入口為1.12毫升/分鐘、在 所述萃出端為13.1毫升/分鐘以及在所述萃餘端為17.4毫升/分鐘。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的純化不飽和脂肪酸的方法，其中以所述沖滌劑的總量計，所述純乙醇的含量為1wt%~8wt%。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的純化不飽和脂肪酸的方法，其中以所述沖滌劑的總量計，所述純乙醇的含量為5wt%。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的純化不飽和脂肪酸的方法，其中所述固定相為無規二氧化矽。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的純化不飽和脂肪酸的方法，其中所述第一區段、所述第二區段以及所述第三區段各自包含2根管柱，且每根管柱內填充顆粒內部具有所述孔隙的所述固定相。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的純化不飽和脂肪酸的方法，其中所述模擬移動床使用的分離條件為：二氧化碳流速在所述沖滌端入口為9.0克/分鐘、在所述進料入口為0.64克/分鐘、在所述萃出端為4.0克/分鐘以及在所述萃餘端為5.64克/分鐘，且所述純乙醇流速在所述沖滌端入口為0.599毫升/分鐘、在所述進料入口為0.042毫升/分鐘、在所述萃出端為0.268毫升/分鐘以及在所述萃餘端為0.378毫升/分鐘。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的純化不飽和脂肪酸的方法，其中所述模擬移動床的切換時間為2分鐘50秒至3分鐘20秒。
  8. 如申請專利範圍第1項所述的純化不飽和脂肪酸的方法，其中所述第一區段、所述第二區段以及所述第三區段各自包含2根管柱、3根管柱與3根管柱，且每根管柱內填充顆粒內部具有所述孔隙的所述固定相。
  9. 如申請專利範圍第1項所述的純化不飽和脂肪酸的方法，其中所述模擬移動床的切換時間為4分鐘。
  10. 一種純化二十碳五烯酸的方法，包括：提供乙酯化魚油；進行第一模擬移動床層析製程，以將所述乙酯化魚油中的不飽和脂肪酸分離開來，其中所分離的所述不飽和脂肪酸包括二十碳五烯酸以及二十二碳六烯酸，所述第一模擬移動床層析製程包含：(i)提供模擬移動床，所述模擬移動床依序包括第一區段、第二區段以及第三區段，其中所述模擬移動床是由移動相及固定相所組成，所述固定相顆粒內部是具有孔隙，所述移動相對於所述模擬移動床中是朝同一方向從沖滌端入口流經所述第一區段、所述第二區段以及所述第三區段之間，所述固定相是相對於所述移動相朝反方向模擬移動，其中所述第一模擬移動床層析製程中的所述移動相為包含超臨界二氧化碳與純乙醇的第一沖滌劑；(ii)將所述乙酯化魚油從進料入口注入所述模擬移動床的所述第二區段與所述第三區段之間，並使所述不飽和脂肪酸隨所述固定相移動至所述第一區段與所述第二區段之間的萃出端並使所述乙酯化魚油中的其它混合物隨所述移動相移動至所述第三區段的萃餘 端，以分離所述不飽和脂肪酸；以及進行第二模擬移動床層析製程，以將所分離的所述不飽和脂肪酸中的二十碳五烯酸分離開來，其中所述第二模擬移動床層析製程包括將所分離的所述不飽和脂肪酸從所述進料入口注入所述模擬移動床的所述第二區段與所述第三區段之間，並使所述不飽和脂肪酸中的二十二碳六烯酸隨所述固定相移動至所述第一區段與所述第二區段之間的所述萃出端並使所述不飽和脂肪酸中的二十碳五烯酸隨所述移動相移動至所述第三區段的所述萃餘端，以分離二十碳五烯酸以及二十二碳六烯酸，其中所述第二模擬移動床層析製程中的所述移動相為包含所述超臨界二氧化碳與所述純乙醇的第二沖滌劑，其中所述第一模擬移動床層析製程的分離條件為：二氧化碳流速在所述沖滌端入口為26.5公斤/小時、在所述進料入口為1.05公斤/小時、在所述萃出端為11.78公斤/小時以及在所述萃餘端為15.77公斤/小時，且所述純乙醇流速在所述沖滌端入口為29.39毫升/分鐘、在所述進料入口為1.12毫升/分鐘、在所述萃出端為13.1毫升/分鐘以及在所述萃餘端為17.4毫升/分鐘，且所述模擬移動床的切換時間為4分鐘。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的純化二十碳五烯酸的方法，其中以所述第一沖滌劑的總量計，所述純乙醇的含量為1wt%~8wt%。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的純化二十碳五烯酸的方法，其中以所述第一沖滌劑的總量計，所述純乙醇的含量為5wt%。
  13. 如申請專利範圍第10項所述的純化二十碳五烯酸的方法，其中以所述第二沖滌劑的總量計，所述純乙醇的含量為1wt%~8wt%。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的純化二十碳五烯酸的方法，其中以所述第二沖滌劑的總量計，所述純乙醇的含量為2.5wt%。
  15. 如申請專利範圍第10項所述的純化二十碳五烯酸的方法，其中所述固定相為無規二氧化矽。
  16. 如申請專利範圍第10項所述的純化二十碳五烯酸的方法，其中所述第一區段、所述第二區段以及所述第三區段各自包含2根管柱、3根管柱與3根管柱，且每根管柱內填充顆粒內部具有所述孔隙的所述固定相。
  17. 如申請專利範圍第10項所述的純化二十碳五烯酸的方法，其中所述第二模擬移動床層析製程的分離條件為：二氧化碳流速在所述沖滌端入口為26.5公斤/小時、在所述進料入口為0.3公斤/小時、在所述萃出端為11.78公斤/小時以及在所述萃餘端為15.02公斤/小時，且所述純乙醇流速在所述沖滌端入口為14.7毫升/分鐘、在所述進料入口為0.165毫升/分鐘、在所述萃出端為6.55毫升/分鐘以及在所述萃餘端為8.315毫升/分鐘，且所述模擬移動床的切換時間為5分鐘15秒至5分鐘40秒。
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