TWI551688B - 發酵纖維素水解液來生成乙醇的方法 - Google Patents

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Description

發酵纖維素水解液來生成乙醇的方法
本發明是有關於一種用於製備乙醇的方法，其包括下列步驟：提供一纖維素水解液(cellulosic hydrolysate)，其含有一可發酵糖(fermentable sugars)與至少一種選自於由下列所構成之群組中的發酵抑制物(fermentation inhibitor)：醋酸、羥甲糠醛(hydroxymethyl furfural)、糠醛(furfural)以及酚類化合物(phenolic compounds)；添加一含氨之水性溶液(aqueous solution comprising ammonia)至該纖維素水解液中，以形成一具有一pH值落在5.5至7.0內的混合液；以及將一木糖-利用的釀酒酵母菌(xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae)添加至該混合液中，並容許該釀酒酵母菌來發酵該混合液，而使得乙醇被生成。
木質纖維素生質(lignocellulosic biomass)是一種經由工業與農林業運作而被大量地生產的可再生能量資源(renewable energy resources)。利用化學方法或生物學方法來將木質纖維素生質轉換成生質能[亦即纖維素酒精 (cellulosic ethanol)]已被廣泛地研究與探討。相較於化學方法，生物學方法因為對於生態環境較為有利並且能源需求較低而特別受到重視。
由於木質纖維素具有一特殊的結晶結構(crystalline structure)，其主要含有纖維素(cellulose)、半纖維素(hemicellulose)以及木質素(lignin)，因此在生成纖維素酒精的過程中必須經過下面2個步驟：(1)將木質纖維素經過適當的前處理(pretreatment)與水解處理(hydrolysis process)而使得纖維素與半纖維素釋出六碳糖(主要為葡萄糖)與五碳糖(主要為木糖)；以及(2)將所得到的六碳糖與五碳糖進行微生物發酵(microbial fermentation)以產生乙醇。在利用木質纖維素生質來生成乙醇的過程中會得到一纖維素水解液，該纖維素水解液除了含有六碳糖與五碳糖等之外，還具有部分因上述前處理造成五碳糖或六碳糖以及木質素降解而釋放出的發酵抑制物[例如醋酸、糠醛、羥甲糠醛(HMF)以及酚類化合物等]。
釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)具有將一纖維素水解液中的六碳糖(例如葡萄糖)轉化為乙醇的代謝能力，因而已被廣泛地利用於工業發酵產業上。但是，釀酒酵母菌無法有效利用該纖維素水解液中所存在的大量五碳糖(例如木糖、***糖等)。因此，近年來有許多研究是藉由遺傳代謝工程(genetic metabolic engineering)的方式來改善上述問題。例如，將木糖-發酵細菌(xylose-fermentation bacteria)中與木糖代謝路徑有關聯的 基因導入至釀酒酵母菌中，由此所得到的木糖-發酵釀酒酵母菌(xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae)可以有效地共發酵五碳糖與六碳糖，進而增加乙醇的產量(B.Hahn-Hägerdal et al.(2007),Appl.Microbiol.Biotechnol.,74：937-953)。
此外，於TW I450963(對應於US 20140087438 A1和CN 103695329 A)當中，申請人亦揭示一種具有木糖還原酶基因(xylose reductase gene)、木糖醇脫氫酶基因(xylitol dehydrogenase gene)與木酮糖激酶基因(xylulokinase gene)的釀酒酵母菌，其以寄存編號DSM 25508被寄存於德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,DSMZ)，並且以寄存編號BCRC 920077被寄存於新竹食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)。這件前案專利的全部揭露內容在此併入本案以作為參考。
雖然已有文獻揭示藉由對釀酒酵母菌進行基因修飾來提高乙醇的產量，但是纖維素水解液中所含有的發酵抑制物會抑制釀酒酵母菌的生長與發酵，而使得五碳糖與六碳糖的利用率降低，進而影響乙醇的產量。
為了降低發酵抑制物所造成的不利影響，已有研究是利用菌種的馴化(acclimation)或基因改造(genetic modification)的方式來提高釀酒酵母菌對於這些發酵抑制物的耐受性，藉此提升乙醇的產量。例如，在Carlos Martín et al.(2007),Biosource Technology,98：1767-1773 中，Carlos Martín等人將一基因重組的木糖-利用的釀酒酵母菌培養於一添加有甘蔗渣水解液(sugarcane bagasse hydrolysates)的培養基中，並將含有各種抑制物[包括酚類化合物、糠醛以及脂族酸(aliphatic acid)]的甘蔗渣水解液，以持續進料的方式添加至該培養基中以提高抑制物的濃度，藉此讓該木糖-利用的釀酒酵母菌可以進行適應(adaptation)。所得到之經適應的菌株可以一較快的速率來轉化糠醛與HMF，並且相較未經適應的原始菌株具有一較高的乙醇產量。
在Petersson A.et al.(2006),Yeast,23：455-464中，Petersson A.等人藉由基因轉殖的方式讓釀酒酵母菌可以大量表現負責還原HMF的NADPH-依賴的乙醇脫氫酶(NADPH-dependant alcohol dehydrogenase)ADH6基因，所得到之過度表現ADH6基因的酵母菌菌株經由實驗證實在糠醛存在下可以有效地利用人工培養基中所含有的葡萄糖，並且具有一較高的HMF轉換率(conversion rate)[亦即可將更多的HMF還原成5-羥甲糠醇(5-hydroxymethylfurfuryl alcohol)]，這表示該過度表現ADH6的菌株對於HMF更具耐受性。
另外，在Gorsich SW et al.(2006),Appl Microbiol Biotechnol.,71：339-349中，Gorsich SW等人發現過度表現ZWF-1的釀酒酵母菌菌株在一添加有毒性濃度之糠醛的人工葡萄糖培養基中可以生長，這表示該會過度表現ZWF-1的菌株對於糠醛具有耐受性並且能更有效地將 木質纖維素轉化為乙醇。
雖然上述涉及基因工程之研究已可提高釀酒酵母菌對於發酵抑制物的適應性，但是轉殖基因的穩定性須長期追蹤與確認，若要將之大規模地應用於發酵工業上來達致大量發酵產乙醇之目的，仍有其限制並且存在有高風險。
為此，即有人提出在無須使用經特殊基因轉殖之菌株的情況下，藉由去毒處理(detoxification)來移除纖維素水解液中的發酵抑制物，以降低發酵抑制物的不利影響。常見的去毒處理包括：(1)物理去毒處理(physical detoxification)，諸如蒸發(evaporation)以及膜媒介的去毒處理(membrane mediated detoxification)；(2)化學去毒(chemical detoxification)，諸如中和(neutralization)、氫氧化鈣超施石灰(calcium hydroxide overliming)、活性炭處理(activated charcoal treatment)以及離子交換樹脂(ion exchange resins)；以及(3)生物去毒(biological detoxification)，諸如使用蟲漆酶(laccase)或木質素過氧化酶(lignin peroxidase)等。但是，這些去毒處理會使得纖維素酒精的製程變得較為繁雜，而所需要的成本亦相對提高，同時可能會使纖維素水解液中的還原糖流失。
因此，發展出一種無須經去除發酵抑制物之處理且直接對纖維素水解液進行發酵產乙醇的方法，俾以能簡化操作程序、降低成本與耗能，以及有效地利用有機廢棄物來生產乙醇以供作為乾淨的生質能源，會是吾人所企 望達成的。
發明概要
於是，在第一個方面，本發明提供一種用於製備乙醇的方法，其包括：提供一纖維素水解液，其含有一可發酵糖與至少一種選自於由下列所構成之群組中的發酵抑制物：醋酸、羥甲糠醛、糠醛以及酚類化合物；添加一含氨之水性溶液至該纖維素水解液中，以形成一具有一pH值落在5.5至7.0內的混合液；以及將一木糖-利用的釀酒酵母菌添加至該混合液中，並容許該釀酒酵母菌來發酵該混合液，而使得乙醇被生成。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。
發明的詳細說明
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本 發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
為了有效解決能源枯竭的問題以及避免生態環境持續遭受破壞，本技術領域之研究人員致力於開發潔淨的生質能。利用生質性廢棄物作為酵母菌的發酵原料來生產乙醇不但可以解決廢棄物所造成的環保問題，亦可達到廢棄物再利用之目的，因而成為目前最受重視的研究方向。
植物性生質含有大量的纖維素、半纖維素及木質素等成分，這些成分會互相纏繞包覆而形成複雜且堅韌的網狀結構，這會使得在利用植物性生質來生產乙醇的過程中受到限制，因此該植物性生質通常會先經過一適當的前處理[如熱化學分解(thermochemical degradation)]來幫助它的網狀結構打開，繼而經由纖維素分解酶將之水解成五碳糖以及六碳糖。然而，植物性生質在經過上述處理之後所產生的發酵抑制物(例如，醋酸、糠醛以及羥甲糠醛等)會影響酵母菌發酵產乙醇的能力。為了解決此問題，目前較常使用的方法是對酵母菌菌株進行基因改造或馴化，或是進一步將該等發酵抑制物移除，俾以提高乙醇的整體產率。但是，經基因改造或馴化的酵母菌菌株需要定期追蹤以確保其所具有的特性仍存在，而移除抑制物會使得製程複雜化且導致成本遽增。
基於上述，申請人致力於發展一種可供工業發酵產業更有效地利用纖維素並大規模地生成乙醇的方法，特別地，該方法不需要對纖維素水解液進行去毒處理，也 不需要藉由馴化或基因重組的方式來降低發酵抑制物對於釀酒酵母菌菌株的影響，同時能提升木糖-利用的釀酒酵母菌對於纖維素水解液的木糖利用率，並降低木糖醇的累積，進而增加乙醇的產量。
於是，申請人經多方研究之後，於本發明中提供一種用於製備乙醇的方法，其包括下列步驟：提供一纖維素水解液，其含有一可發酵糖與至少一種選自於由下列所構成之群組中的發酵抑制物：醋酸、羥甲基糠醛、糠醛以及酚類化合物；添加一含氨之水性溶液至該纖維素水解液中，以形成一具有一pH值落在5.5至7.0內的混合液；以及將一木糖-利用的釀酒酵母菌添加至該混合液中，並容許該釀酒酵母菌來發酵該混合液，而使得乙醇被生成。
依據本發明，在發酵該混合液的過程中，藉由添加該含氨之水性溶液而使得該混合液的pH值被維持落在5.5至7.0的範圍內。
較佳地，該混合液的pH值被維持在一為5.5至6.5的範圍內。更佳地，該混合液的pH值被維持在一為5.8至6.2的範圍內。在本發明的一個較佳具體例中，該混合液的pH值被維持在6.0。
如本文中所用的，術語“木糖-利用的釀酒酵母菌”與“木糖-發酵的釀酒酵母菌”係可被交替地使用，其意欲涵蓋具有木糖發酵能力的所有釀酒酵母菌菌株，其中包括那些為熟習此項技術人士所易於獲得者(例如，可購自 於國內或國外寄存機構者)，或者利用本技藝中所慣用的基因改造方法將不具有木糖發酵能力的天然釀酒酵母菌菌株進行基因轉殖而製得者。有關木糖-利用的釀酒酵母菌菌株可參見，但不限於：Carlos Marín et al.(2002),Enzyme and Microbial Technology,31：274-282；Miroslav Sedlak and Nancy W.Y.Ho(2004),Applied Biochemistry and Biotechnology,113-116：405-416；B.Hahn-Hägerdal et al.(2007)(同上述)；Zhang A.et al.(2007),Letters in Applied Microbiology,44：212-217；Hubmann G.et al.(2011),Applied and Environmental Microbiology,77：5857-5867；US 20130196399 A1；以及TW I450963等。
在本發明的一個較佳具體例中，該木糖發酵的釀酒酵母菌是一株fps1基因與gpd2基因皆被刪除或破壞的釀酒酵母菌菌株。在本發明的一個更佳具體例中，該木糖發酵的釀酒酵母菌是藉由將一株以寄存編號BCRC 920077被寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)的釀酒酵母菌之基因組DNA中的fps1基因與gpd2基因進行刪除或破壞而被製得。
如本文中所用的，術語“含氨之水性溶液(aqueous solution comprising ammonia)”意指在一水性介質中添加下列物質：氨氣(ammonia gas)(NH3)、包含銨離子(ammonium ions)(NH4)之化合物[諸如，氫氧化銨(ammonium hydroxide)、氯化銨(ammonium chloride)或硫酸銨(ammonium sulfate)]、在分解之後釋放氨的化合物(諸 如尿素)，以及它們的組合。
依據本發明，該含氨之水性溶液是氫氧化銨水溶液(即氨水)或氯化銨水溶液。在本發明的一個較佳具體例中，該含氨之水性溶液是氨水。
依據本發明，該纖維素水解液是藉由對一纖維素生質(cellulosic biomass)依序地進行一前處理以及一水解處理而被製得。
如本文中所用的，術語“纖維素水解液”與“木質纖維素水解液”和“生質水解液(biomass hydrolysate)”係可被交替地使用，並且意指由生質之糖化(saccharification)所產生的產物，其中術語“糖化(saccharification)”表示從多醣產生可發酵醣。
如本文中所用的，術語“纖維素生質”與“木質纖維素生質(lignocellulosic biomass)”係可被交替地使用，並且意指任何包括纖維素、半纖維素、木質素、澱粉、寡醣和/或單醣之纖維素材料。
依據本發明，該纖維素生質可以衍生自一單一來源，或者該纖維素生質可以包含一衍生自多種來源的混合物。例如，該纖維素生質可以為一由玉米秸稈(corn stover)與玉米穗軸(corn cobs)所構成之混合物，或者一由禾草(grass)與葉所構成之混合物。
適用於本發明的纖維素生質包括，但不限於：生物能源作物(bioenergy crops)、農業殘餘物(agricultural residues)、都市固體廢棄物(municipal solid waste)、工業 固體廢棄物(industrial solid waste)、來自造紙的淤泥(sludge from paper manufacture)、庭園廢棄物(yard waste)、廢材(wood waste)與林業廢棄物(forestry waste)，以及它們的組合。
較佳地，該纖維素生質是選自於下列所構成的群組：芒草(miscanthus)、軟木(softwood)、硬木(hardwood)、玉米穗軸(corn cobs)、作物殘渣(crop residues)[諸如玉米殼(corn husks)]、玉米秸稈(corn stover)、禾草(grasses)、麥稈(wheat straw)、大麥稈(barley straw)、乾草(hay)、稻稈(rice straw)、柳枝稷(switchgrass)、廢紙(waste paper)、甘蔗渣(sugarcane bagasse)、蜀黍植物材料(sorghum plant material)、大豆植物材料(soybean plant material)、得自穀粒(grains)之研磨的組分、樹木、樹枝、根、葉、木屑(sawdust)、灌木(shrubs)與灌木叢(bushes)、蔬菜、水果以及花，以及它們的組合。
適用於本發明的前處理包括，但不限於：蒸氣爆裂(steam explosion)、熱化學前處理法(thermal chemical pretreatment)、機械粉碎、酸處理、有機溶解(organosolve)、亞硫酸鹽前處理(sulfite pretreatment)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該纖維素生質在被進行該水解處理之前有先經過蒸氣爆裂處理。
依據本發明，該纖維素水解液在加入該含氨之水性溶液之前可進一步被混合以一營養鹽組成物。在本發 明的一個較佳具體例中，該營養鹽組成物包含有下列鹽類：(NH4)2SO4、MgSO4‧7H2O以及KH2PO4。
實施例
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。
一般實驗材料： 1.製備△ fps1 △ gpd2雙突變的釀酒酵母菌接種源(inoculum of the △ fps1 △ gpd2 double mutant of Saccharomyces cerevisiae)：
在下面實驗中所使用的釀酒酵母菌菌株是△ fps1 △ gpd2雙突變的釀酒酵母菌，其大體上是依據Zhang A.et al.(2007)(同上述)以及Hubmann G.et al.(2011)(同上述)當中所述的方法而被製備。簡言之，首先，依據Zhang A.et al.(2007)(同上述)當中所述的方法，將一可共發酵五碳糖與六碳糖的釀酒酵母菌BCRC 920077(得自於申請人先前專利案TW I450963，亦以寄存編號DSM 25508被寄存於DSMZ)的fps1基因剔除，繼而將所得到的△ fps1突變菌株進一步依據Hubmann G.et al.(2011)(同上述)當中所揭示的方法來進行gpd2基因的剔除，藉此而得到△ fps1 △ gpd2雙突變的釀酒酵母菌菌株(下面簡稱“經雙突變的釀酒酵母菌”)。
之後，將上述所得到的經雙突變的釀酒酵母菌接種於YPD培養基中，並於一恆溫振盪培養箱(30℃、200 rpm)內進行培養直到OD600值達至20。接著，將所形成的培養物予以離心，然後收集細胞沉澱物並使用無菌水予以清洗數次，繼而以無菌水來充份懸浮菌體，由此所得到的細胞懸浮液被拿來作為下面實施例中的經雙突變的釀酒酵母菌接種源。
2.纖維素水解液(cellulosic hydrolysate)之製備：
在下面實施例中所使用的纖維素生質包括：稻稈(得自於弘遠農產商行)以及芒草(得自於嘉義大學農改場)。首先，將芒草或稻稈切成適當的尺寸，繼而以粉碎機予以粉碎，接著加入3wt%硫酸溶液予以混合均勻，並在60℃下進行反應歷時60分鐘。之後，將所得到的混合物置於一立式圓筒型高壓蒸煮槽(購自於七福工業股份有限公司)，繼而通入蒸氣並在一為190至200℃的溫度下進行加熱歷時7分鐘。接著，將藉由上述酸催化蒸氣爆裂前處理(acid-catalyzed steam explosion steam explosion pretreatment)所得到的蒸煮液以NaOH來調整pH值至5.0，繼而加入一由纖維素酶(cellulase)與半纖維素酶(hemicellulase)所構成之混合物(Novozymes Cellic® CTec3，使用量為0.12克酵素混合物/克纖維素生質)，並在一為50℃的溫度下以及一為120rpm的攪拌速率下進行纖維素分解處理(cellulolytic processes)歷時72小時，藉此而得到一經酸催化蒸氣爆裂的稻桿或芒草纖維素水解液。
另外，一經蒸氣爆裂的稻桿或芒草纖維素水解液大體上是依據上述方式來進行製備，不同之處在於：在 進行前處理時，以水代替硫酸溶液來與經粉碎的纖維素生質進行混合。
3.在下面的實施例中，用於添加至纖維素水解液的營養鹽組成物具有下面表1所示的配方。
一般實驗方法： 1.高效能液相層析(high performance liquid chromatography,HPLC)分析：
在下面的實施例中，纖維素水解液以及發酵代謝物(fermentation metabolites)中所含有的成分及其濃度(g/L)是參考美國國家再生能源實驗室(National Renewable Energy Laboratory,NREL)所頒布的有關標準生物質分析之實驗室分析程序(laboratory analytical procedures,LAPs)，並藉由使用一配備有一個折射率(RI)偵測器(refractive index detector)的高效能液相層析儀(DIONEX Ultimate 3000)來進行測定，其中所使用的管柱以及操作條件如下：分析管柱為Aminex HPX-87H管柱(BioRad)；流動相為5mM硫酸(配於水中)；流速被控制為0.6mL/分鐘；樣品注射體積為20μL；RI溫度控制在65℃。
此外，為供比對，使用不同濃度之葡萄糖 (1.2-24mg/mL)、木糖(1.2-24mg/mL)、木糖醇(0.2-6mg/mL)、甘油(0.2-8mg/mL)、羥甲糠醛(HMF)(0.2-8mg/mL)、醋酸(0.2-12mg/mL)、乙醇(1.0-15mg/mL)、糠醛(0.2-8mg/mL)以及酚類化合物(0.2-8mg/mL)來分別作為校正標準品(control standard)並進行相同的分析，這些化學物質是購自於Sigma。
實施例1. 在使用一經酸催化蒸氣爆裂的稻桿纖維素水解液作為基質下，添加NH4OH對於經雙突變的釀酒酵母菌發酵產乙醇的影響
在本實施例中，依據上面“一般實驗材料”的第2項「纖維素水解液之製備」所得到之一經酸催化蒸氣爆裂的稻桿纖維素水解液被拿來作為基質，並探討於發酵過程中NH4OH鹼性溶液的添加與否，對於經雙突變的釀酒酵母菌利用葡萄糖與木糖來進行發酵產乙醇的影響。
此外，為供比較，一經去毒處理的稻桿纖維素水解液(下稱“去毒水解液”)被拿來一起進行相同的發酵實驗。有關稻桿纖維素水解液的去毒處理是依據Jing-Ping Ge et al.(2011),African Journal of Microbiology Research,5：1163-1168當中所述的超施石灰(overliming)以及使用活性炭(activated charcoal)來進行，並略作修改。簡言之，將依據上面“一般實驗材料”的第2項「纖維素水解液之製備」所得到之一經酸催化蒸氣爆裂的稻桿纖維素水解液以適量的Ca(OH)2來調整pH值至10，繼而置於室溫下反應歷時120分鐘，接著於10000rpm下予以離心歷時5分鐘， 然後收集上清液並以H2SO4溶液來調整pH值至5.0。之後，加入5%活性炭(購自於和泰股份有限公司，型號MAX-703)並在40℃下反應歷時60分鐘，接著經由過濾以及離心處理來移除活性碳濾餅(filter cake)等不可溶物質，所得到的濾液即為該去毒水解液。
在進行發酵產乙醇之前，該經酸催化蒸氣爆裂的稻桿纖維素水解液以及該去毒水解液分別依照上面“一般實驗方法”的第1項「高效能液相層析分析」所述的方法來測量各種醣類以及抑制物的濃度，而所測得的結果被顯示於下面表2中。
從表2可見，與該經酸催化蒸氣爆裂的稻桿纖維素水解液相較之下，該去毒水解液中不含有HMF、糠醛以及酚類化合物，而僅含有較少量的醋酸。此外，該去毒水解液中的葡萄糖濃度亦較低。由此可知，去毒處理會去除大部分之抑制物，但同時會使得葡萄糖的含量被降低。
實驗方法：
將該經酸催化蒸氣爆裂的稻桿纖維素水解液分成2組(包括對照組以及NH4OH組)，接著將一如表1中所 示之營養鹽組成物添加至各組水解液中，繼而分別以NH4OH來調整pH值至6。之後，將依據上面“一般實驗材料”的第1項「製備△ fps1 △ gpd2雙突變的釀酒酵母菌的接種源」所得到之經雙突變的釀酒酵母菌接種源以一為1：20(v/v)的接種量接種至各個培養瓶中並予以混合均勻，繼而置於一恆溫震盪培養室內，並在一為30℃的溫度下以及一為150rpm的震盪速率下進行發酵反應歷時72小時。在整個發酵期間，對NH4OH組適時地添加NH4OH以使其pH值被維持在6。至於對照組則不作任何處理。
另外，該去毒水解液是大體上是參照上面NH4OH組的方式來進行相同的實驗，唯獨使用NaOH來取代NH4OH。之後，將各組的發酵培養物於12000rpm下予以離心歷時10分鐘，所得到之發酵代謝物分別依照上面“一般實驗方法”的第1項「高效能液相層析分析」當中所述的方法來進行葡萄糖、木糖、木糖醇以及乙醇的含量分析。有關葡萄糖或木糖的利用率是以所測得之葡萄糖或木糖的總量相對於發酵前各自所測得的總量的百分比值(%)來表示。此外，將發酵後所測得之木糖醇的總量與發酵期間木糖的總利用量(即發酵前所測得的木糖總量減去發酵後所測得者)相比較，俾以獲得一個比值(即木糖醇生成量)，若該比值越低，代表越多的木糖被轉化為乙醇，而非以木糖醇之形式累積。至於乙醇產量(yield)，則是藉由將發酵後所生成的乙醇總量與發酵期間葡萄糖和木糖的總利用量(即發酵前所測得之葡萄糖與木糖的總量減去發酵 後所測得者)相比較而被計算出。
結果：
本實驗所測得的結果被顯示於下面表3中。
從表3可見，當以經酸催化蒸氣爆裂的稻桿纖維素水解液作為基質(無論在發酵過程中是否添加NH4OH)，或者直接以去毒水解液作為基質，各組發酵代謝物所測得的葡萄糖利用率皆為100%，至於木糖利用率以及乙醇產量，NH4OH組則皆顯著優於對照組。由此可知，在發酵過程中添加NH4OH可以顯著地提升木糖利用率，進而增加乙醇的產量。
此外，將經酸催化蒸氣爆裂的稻桿纖維素水解液的NH4OH組與去毒水解液作一比較可發現，以經酸催化蒸氣爆裂的稻桿纖維素水解液作為基質並且以NH4OH來調整該水解液之成分或在發酵過程中添加NH4OH可以產生更佳的木糖利用率與乙醇產量。這個實驗結果顯示，本發明所揭示之技術不需要進一步經過水解液的去毒處理步驟即 可以有效地提高木糖利用率與乙醇產量。
實施例2. 在使用經酸催化蒸氣爆裂的稻稈與芒草纖維素水解液作為基質下，添加不同鹼性溶液對於經雙突變的釀酒酵母菌發酵產乙醇的影響
本實施例是使用依據上面“一般實驗材料”的第2項「纖維素水解液之製備」所製得之經酸催化蒸氣爆裂的稻稈或芒草纖維素水解液作為基質，並探討以不同的鹼性溶液(包括NH4OH、KOH以及NaOH溶液)來調整水解液的pH值，並於發酵過程中添加該等鹼性溶液對於經雙突變的釀酒酵母菌利用葡萄糖與木糖來進行發酵產乙醇的影響。
在進行發酵產乙醇之前，該經酸催化蒸氣爆裂的稻稈或芒草纖維素水解液分別依照上面“一般實驗方法”的第1項「高效能液相層析分析」所述的方法來測量各種醣類以及醋酸的濃度，而所測得的結果被顯示於下面表4中。
實驗方法：
首先，將該經酸催化蒸氣爆裂的稻稈與芒草纖維素水解液各自分成3組(包括KOH組、NaOH組以及 NH4OH組)，接著各自以KOH、NaOH以及NH4OH來調整pH值至6，所得到的各組稻稈與芒草纖維素水解液大體上是依據上面實施例1所述的實驗方法來進行經雙突變的釀酒酵母菌的發酵產乙醇實驗，不同之處在於：在整個發酵期間，分別對KOH組、NaOH組以及NH4OH組適時地添加NaOH、KOH以及NH4OH，而使得它們的pH值皆被維持在6.0。
之後，各組的發酵代謝物分別依照上面“一般實驗方法”的第1項「高效能液相層析分析」當中所述的方法來進行葡萄糖、木糖、木糖醇以及乙醇的含量分析，繼而依據實施例1當中的所述的方式來分別計算出醣類利用率、木糖醇生成量與乙醇產量。
結果：
本實驗所測得的結果被顯示於下面表5中。
從表5可見，無論是以稻稈或芒草纖維素水解液作為基質，各組發酵代謝物所測得的葡萄糖利用率皆為100%，至於木糖利用率以及乙醇產量，NH4OH組皆顯著優於NaOH組或KOH組。由此可知，與NaOH與KOH相較之下，以NH4OH來調整水解液的pH值並在發酵過程中添加NH4OH可以更加顯著地提升木糖利用率，並降低木糖醇累積，進而增加乙醇的產量。
實施例3. 在使用一經蒸氣爆裂的芒草纖維素水解液作為基質下，藉由添加NH 4 OH來調整pH值對於經雙突變的釀酒酵母菌發酵產乙醇的影響
本實施例是使用依據上面“一般實驗材料”的第2項「纖維素水解液之製備」所製得之經蒸氣爆裂的芒草纖維素水解液作為基質，並探討於發酵過程中藉由添加NH4OH來將該芒草纖維素水解液的pH值分別維持在5、6或7下，對於經雙突變的釀酒酵母菌利用葡萄糖與木糖來進行發酵產乙醇的影響。
在進行發酵產乙醇之前，該經蒸氣爆裂的芒草纖維素水解液依照上面“一般實驗方法”的第1項「高效能液相層析分析」所述的方法而被測量到含有7.3g/L之醋酸、81.8g/L之葡萄糖以及34.7g/L之木糖。
實驗方法：
首先，將該經蒸氣爆裂的芒草纖維素水解液分為3組(包括pH 5組、pH 6組以及pH 7組)，接著以NH4OH 來將pH 5組、pH 6組以及pH 7組的pH值分別調整至5、6以及7，所得到的各組芒草纖維素水解液大體上是依據上面實施例1所述的實驗方法來進行經雙突變的釀酒酵母菌的發酵產乙醇實驗，不同之處在於：在整個發酵期間，分別對各組適時地添加NH4OH，而使得它們的pH值被維持在最初所既定的數值下。
之後，各組的發酵代謝物分別依照上面“一般實驗方法”的第1項「高效能液相層析分析」當中所述的方法來進行葡萄糖、木糖、木糖醇以及乙醇的含量分析，繼而依據實施例1當中的所述的方式來分別計算出醣類利用率、木糖醇生成量與乙醇產量。
結果：
本實驗所測得的結果被顯示於下面表6中。
從表6可見，無論該經蒸氣爆裂的芒草纖維素水解液的pH值是維持在5、6或7，各組發酵代謝物所測得的葡萄糖利用率皆為100%，至於木糖利用率、木糖醇 生成量以及乙醇產量，pH 6組皆顯著優於pH 7組與pH 5組。申請人據此而認為，在發酵過程中，藉由添加NH4OH來控制纖維素水解液的pH值在6.0可以達至最佳的木糖利用率，並有效降低木糖醇之累積，進而提高乙醇的產量。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

Claims (7)

  1. 一種用於製備乙醇的方法，其包含下列步驟：提供一纖維素水解液，其含有一可發酵糖與至少2種選自於由下列所構成之群組中的發酵抑制物：醋酸、羥甲基糠醛、糠醛以及酚類化合物；添加一含氨之水性溶液至該纖維素水解液中，以形成一具有一pH值落在5.5至7.0內的混合液；以及將一木糖-利用的釀酒酵母菌添加至該混合液中，並容許該釀酒酵母菌來發酵該混合液，而使得乙醇被生成。
  2. 如請求項1的方法，其中在發酵該混合液的過程中，藉由添加該含氨之水性溶液而使得該混合液的pH值被維持落在5.5至7.0的範圍內。
  3. 如請求項1的方法，其中該混合液具有一pH值落在5.5至6.5的範圍內。
  4. 如請求項1的方法，其中該混合液具有一pH值落在5.8至6.2的範圍內。
  5. 如請求項1的方法，其中該含氨之水性溶液是選自於下列所構成的群組：氫氧化銨水溶液、硫酸銨水溶液、氯化銨水溶液，以及它們的組合。
  6. 如請求項1的方法，其中該可發酵糖包含一種五碳糖以及一種六碳糖。
  7. 如請求項6的方法，其中該可發酵糖包含葡萄糖與木糖。
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