CN110734937A - 用于生产乳酸的方法 - Google Patents

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王楚钧
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施淑银
张玴群
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Abstract

一种以生质制备乳酸的方法，其包括：将一能够借由消耗五碳糖以及六碳糖来产生乳酸的芽孢杆菌属物种和/或重组型假丝酵母菌属物种的菌株培养于一含有糖蜜以及玉米浸液的种菌培养基中，以在该种菌培养基中获得该菌株的种菌培养物；以及利用该菌株的种菌培养物来对该生质进行发酵；其中，该生质包含一可发酵糖以及该重组型假丝酵母菌属物种的基因组DNA包括一编码乳酸去氢酶的基因，并且其基因组DNA中的pdc基因被删除、破坏或已失效。由此所制得的种菌培养物对于发酵制程中所产生的抑制物具有优异的抵抗性，因此能够有效地利用葡萄糖与木糖来进行发酵，进而提升乳酸产率。

Description

用于生产乳酸的方法
技术领域
本发明是有关于一种以生质制备乳酸的方法，其包括：将一能够借由消耗五碳糖以及六碳糖来产生乳酸的芽孢杆菌属物种和/或重组型假丝酵母菌属物种的菌株培养于一含有糖蜜以及玉米浸液的种菌培养基中，以在该种菌培养基中获得该菌株的种菌培养物；以及利用该菌株的种菌培养物来对该生质进行发酵；其中，该生质包含一可发酵糖以及该重组型假丝酵母菌属物种的基因组DNA包括一编码乳酸去氢酶的基因，并且其基因组DNA中的pdc基因被删除、破坏或已失效。
背景技术
乳酸(lactic acid)是一种具有发展价值的化合物，它被广泛地应用于食品、化妆品(cosmetic)、药品(pharmaceutical)以及化学工业(chemical industry)，特别是现今环保意识抬头，乳酸经常被用来合成生物可降解塑料(biodegradable plastics)。近年来，在物质和原料逐渐缺乏的情况下，借由废弃物再利用的方式来产生生质能(biomass energy)已开始受到重视，其中纤维素生质(cellulosic biomass)是较常被使用的可再生能量资源(renewable energy resources)之一。目前有许多化学方法或生物学方法可以将纤维素生质转换成乳酸(lactic acid)，由于生物学方法对于生态环境较为友善并且所需要的成本较为低廉，因此，在产业应用上，生物学方法已被广泛地用来处理有机废弃物(organicwaste)。
生物学方法主要是利用微生物发酵来将纤维素生质转化成为乳酸，而乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)[包括乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、小球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)以及芽孢杆菌属(Bacillus)]是最常被用来发酵产乳酸的微生物。
在利用纤维素生质来生成乳酸的过程中通常会得到一纤维素生质水解液(cellulosic biomass hydrolysate)，该纤维素生质水解液除了含有还原糖(reducingsugars)(包括五碳糖以及六碳糖)外，还会含有因着半纤维素(hemicellulose)与还原糖的降解所产生的发酵抑制物[例如醋酸、糠醛(furfural)、羟甲糠醛(hydroxymethylfurfural,HMF)、乙酰丙酸(levulinic acid)以及酚类化合物(phenolic compounds)等]，这些发酵抑制物会抑制微生物的生长与发酵，而使得还原糖的利用率无法获得有效提升，甚至会被降低，进而影响乳酸的产量。
为了降低发酵抑制物所造成的不利影响，已有研究是借由对菌种进行驯化(acclimation)来提高微生物对于这些发酵抑制物的耐受性，并促使微生物能有效利用还原糖来生成乳酸。例如，在Jiang T.et al.(2016),PLoS One.,11:e0149101中，Jiang T.等人借由以氦气为基础的氛围与室温电浆(Helium-based atmospheric and roomtemperature plasma,Helium-based ARTP)来对凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)NL01分离株进行突变，而得到一突变株，然后将该突变株培养于玉米秆的经浓缩的稀酸水解液[condensed dilute-acid hydrolysate(CDH)of corn stover]来进行演化实验(evolution experiment)，借此而得到一高抑制物-耐受性的突变株(high inhibitor-tolerance mutant)(它被命名为凝结芽孢杆菌GKN316分离株)。接着，将凝结芽孢杆菌NL01分离株与GKN316分离株分别接种至含有25％以及50％CDH的木糖培养基(xylose medium)中并进行发酵培养，继而将所得到的培养物拿来进行细胞生长(cell growth)与乳酸产率(lactic acid yield)的分析。实验结果显示，无论是使用含有25％或50％CDH的木糖培养基来进行发酵培养时，凝结芽孢杆菌GKN316分离株的生长速度以及乳酸产率皆高于凝结芽孢杆菌NL01分离株所具者，特别是在使用含有50％CDH的木糖培养基来进行发酵培养时，凝结芽孢杆菌GKN316分离株与NL01分离株间存在有明显的差异性。
已知大多数的酵母菌(yeast)因不具有LDH基因[其编码乳酸去氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)]，而使得它们在发酵产乳酸上的效率较低，甚至是无法生产乳酸。因此，有研究借由对酵母菌进行基因修饰(gene modification)来使其具有生产乳酸的能力或提高乳酸的产量。例如，在Ikushima S.et al.(2009),Biosci.Biotechnol.Biochem.,73:1818-1824中，Ikushima S.等人将高蛋白假丝酵母菌(Candida utilis)的pdc基因[其编码丙酮酸去羧酶(pyruvate decarboxylase,PDC)]剔除，而得到一Cupdc1无效突变株(Cupdc1-null mutant)。接着，在CuPDC1启动子(CuPDC1 promoter)的调控下，将来自于家牛(Bos taurus)的2个LDH基因复本并入至该Cupdc1无效突变株的基因体中，由此所得到的重组型高蛋白假丝酵母菌Cupdc1Δ4-LDH2菌株(recombinant Candida utilis Cupdc1Δ4-LDH2strain)经由发酵实验而被证实具有优异的乳酸生成效率(efficiency of lacticacid production)。在Tamakawa H.et al.(2012),J.Biosci.Bioeng.,113:73-75中，Tamakawa H.等人进一步将木糖-发酵细菌(xylose-fermentation bacteria)中与木糖代谢路径有关联的基因(包括xr基因、xdh基因以及xk基因)导入至依据Ikushima S.et al.(2009)(同上述)当中所述方法而被制备的重组型高蛋白假丝酵母菌菌株中，由此所得到的重组型高蛋白假丝酵母菌XR/XDH/XK菌株(recombinant Candida utilis XR/XDH/XKstrain)可以有效地共发酵五碳糖与六碳糖，进而提高乳酸的产量。
许多食品工业的副产物由于富含许多可供微生物生长所需的营养源(nutrientsource)，因而具有可供再利用的价值。已有研究指出，使用含有糖蜜和/或玉米浸液的发酵培养基来进行发酵，可以促进乳酸菌细胞的增生，进而提升乳酸的产量。例如，在LeeK.B.et al.(2013),Afr.J.Biotechnol.,12:2013-2018中，Lee K.B.等人将唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)L29分离株培养于MRS肉汤培养基(MRS broth)中而得到一接种源，接着将该接种源接种至含有不同浓度[包括2％、4％、6％、8％以及10％(v/v)]的蔗糖蜜与不同浓度[包括2％、4％、6％、8％以及10％(v/v)]的玉米浸液的发酵培养基中并进行发酵培养，继而将所得到的培养物拿来进行活细胞数目(number of viable cell)与乳酸产率(lactic acid yield)的分析。实验结果显示，使用含有6％(v/v)的蔗糖蜜与6％(v/v)的玉米浸液的发酵培养基来进行培养可以促进唾液乳酸杆菌L29分离株的生长，并且提高乳酸产量。
虽然已存在有上述文献报导，申请人仍致力于发展一种可供工业发酵产业更有效地利用生质来生产乳酸的方法，特别地，该方法不需要对纤维素生质水解液进行去毒处理，而是以含有糖蜜与玉米浸液的种菌培养基来对芽孢杆菌属物种或重组型假丝酵母菌属物种的菌株进行种菌培养，由此所得到的种菌培养物(seed culture)对于发酵制程中所产生的抑制物(例如醋酸、糠醛以及羟甲糠醛等)具有优异的抵抗性，因此能够有效地利用葡萄糖与木糖来进行发酵，进而提升乳酸产率。
发明内容
于是，本发明提供一种以生质制备乳酸的方法，其包括：
将一能够借由消耗五碳糖以及六碳糖来产生乳酸的芽孢杆菌属物种和/或重组型假丝酵母菌属物种的菌株培养于一含有糖蜜以及玉米浸液的种菌培养基中，以在该种菌培养基中获得该菌株的种菌培养物；以及
利用该菌株的种菌培养物来对该生质进行发酵；
其中，该生质包含一可发酵糖以及该重组型假丝酵母菌属物种的基因组DNA包括一编码乳酸去氢酶的基因，并且其基因组DNA中的pdc基因被删除、破坏或已失效。
较佳地，当该菌株是重组型假丝酵母菌属物种时，以该种菌培养基的总体积为计算基础，该糖蜜具有一范围落在4至6％(v/v)的浓度，该玉米浸液具有一范围落在1至3％(v/v)的浓度。
较佳地，当该菌株是芽孢杆菌属物种时，以该种菌培养基的总体积为计算基础，该糖蜜具有一范围落在6至7％(v/v)的浓度，该玉米浸液具有一范围落在6.5至7.5％(v/v)的浓度。
较佳地，该重组型假丝酵母菌属物种是选自于由下列所构成的群组：重组型高蛋白假丝酵母菌(recombinant Candida utilis)、重组型博伊丁假丝酵母(recombinantCandida boidinii)、重组型热带念珠菌(recombinant Candida tropicalis)、重组型***滑念珠菌(recombinant Candida parapsilosis)，以及它们的组合。
较佳地，该重组型假丝酵母菌属物种是重组型高蛋白假丝酵母菌。
较佳地，该重组型高蛋白假丝酵母菌的基因组DNA进一步包括一编码木糖还原酶的基因、一编码木酮糖激酶的基因及一编码木糖醇脱氢酶的基因。
较佳地，该芽孢杆菌属物种是选自于由下列所构成的群组：凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、液化淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)，以及它们的组合。
较佳地，该芽孢杆菌属物种是凝结芽孢杆菌。
较佳地，该发酵步骤是在实质上没有糖蜜以及玉米浸液的条件下被进行。
较佳地，该可发酵糖包含葡萄糖与木糖。
较佳地，该生质是一纤维素生质水解液。
较佳地，该纤维素生质水解液包含至少一种选自于由下列所构成的群组中的发酵抑制物：醋酸、糠醛、羟甲糠醛、乙酰丙酸以及酚类化合物。
生物材料保藏信息说明
保藏编号：CCTCC M 2018310，
分类命名：凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)RBE4-4，
保藏日期：2018年05月28日，
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，
保藏单位地址：中国湖北省武汉市武昌区八一路299号。
附图说明
下面结合附图及实施例来对本发明进行详细说明，所以本发明在上述以及其他目的与特征，可借由参照下文的描述、随文检附的权利要求书和伴随的图式而变得更为明显，附图中：
图1显示在存在有醋酸的发酵条件下，由含有不同浓度的蔗糖蜜与3％(v/v)的玉米浸液的种菌培养基所得到的重组型高蛋白假丝酵母菌的种菌培养物对于发酵产乳酸的影响；
图2显示在存在有醋酸的发酵条件下，由含有不同浓度的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所得到的重组型高蛋白假丝酵母菌的种菌培养物对于发酵产乳酸的影响；
图3显示在含有不同浓度的醋酸的发酵条件下，各组发酵产物所测得的乳酸产率；
图4显示在含有不同浓度的糠醛的发酵条件下，各组发酵产物所测得的乳酸产率；
图5显示在含有不同浓度的羟甲糠醛的发酵条件下，各组发酵产物所测得的乳酸产率；
图6显示在含有不同种类的发酵抑制物的发酵条件下，各组发酵产物所测得的乳酸产率；
图7显示在使用稻秆纤维素生质水解液作为底物来进行发酵反应的情况下，由含有3％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所得到的重组型高蛋白假丝酵母菌的种菌培养物对于发酵产乳酸的影响；
图8显示在存在有醋酸的发酵条件下，由含有不同浓度的蔗糖蜜与7％(v/v)的玉米浸液的种菌培养基所得到的凝结芽孢杆菌BCRC 910831的种菌培养物对于发酵产乳酸的影响；
图9显示在存在有醋酸的发酵条件下，由含有不同浓度的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所得到的凝结芽孢杆菌BCRC 910831的种菌培养物对于发酵产乳酸的影响；
图10显示在含有不同浓度的醋酸的发酵条件下，各组发酵产物所测得的乳酸产率；
图11显示在含有不同浓度的糠醛的发酵条件下，各组发酵产物所测得的乳酸产率；
图12显示在含有不同浓度的羟甲糠醛的发酵条件下，各组发酵产物所测得的乳酸产率；
图13显示在含有不同浓度的乙酰丙酸的发酵条件下，各组发酵产物所测得的乳酸产率；以及
图14显示在使用稻秆纤维素生质水解液作为底物来进行发酵反应的情况下，由含有7％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所得到的凝结芽孢杆菌BCRC910831的种菌培养物对于发酵产乳酸的影响。
具体实施方式
为了清楚地说明本发明的目的，将被了解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限于”，以及文字“包括(comprises)”具有一对应的意义。
除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领域技术人员所共同了解的意义。一熟悉本领域者会认知到许多与那些被描述于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。
相较于化学方法，利用微生物发酵来将纤维素生质(cellulosic biomass)转换成乳酸因为对于生态环境较为有利并且较少能源上的需求而受到重视。然而，在利用纤维素生质来生成乳酸的过程中通常会伴随着发酵抑制物的生成，进而影响微生物的发酵能力以及乳酸产量。为了让微生物能有效地利用纤维素生质来产乳酸，申请人经由研究发现，以含有糖蜜与玉米浸液的种菌培养基来对芽孢杆菌属物种或重组型假丝酵母菌属物种的菌株进行种菌培养，由此所制得的种菌培养物对于发酵制程中所产生的抑制物具有优异的抵抗性，因而可以有效地利用葡萄糖与木糖来进行发酵，并达到提升乳酸产率的目的。
于是，本发明提供一种以生质制备乳酸的方法，其包括：
将一能够借由消耗五碳糖以及六碳糖来产生乳酸的芽孢杆菌属物种和/或重组型假丝酵母菌属物种的菌株培养于一含有糖蜜以及玉米浸液的种菌培养基中，以在该种菌培养基中获得该菌株的种菌培养物；以及
利用该菌株的种菌培养物来对该生质进行发酵；
其中，该生质包含一可发酵糖以及该重组型假丝酵母菌属物种的基因组DNA包括一编码乳酸去氢酶的基因，并且其基因组DNA中的pdc基因被删除、破坏或已失效。
依据本发明，该生质(biomass)可以是一纤维素生质(cellulosic biomass)、一半纤维素生质(hemicellulosic biomass)、一木质纤维素生质(lignocellulosic biomass)，或它们的一混合物。在本发明的一个较佳具体例中，该生质是一纤维素生质。
适用于本发明的纤维素生质包括，但不限于：生物能源作物(bioenergy crops)、农业残余物(agricultural residues)、都市固体废弃物(municipal solid waste)、工业固体废弃物(industrial solid waste)、来自造纸的淤泥(sludge from papermanufacture)、庭园废弃物(yard waste)、废材(wood waste)与林业废弃物(forestrywaste)，以及它们的组合。
较佳地，该纤维素生质是选自于下列所构成的群组：芒草(miscanthus)、软木(softwood)、硬木(hardwood)、玉米穗轴(corn cobs)、作物残渣(crop residues)[诸如玉米壳(corn husks)]、玉米秸秆(corn stover)、禾草(grasses)、麦秆(wheat straw)、大麦秆(barley straw)、干草(hay)、稻秆(rice straw)、柳枝稷(switchgrass)、废纸(wastepaper)、甘蔗渣(sugarcane bagasse)、蜀黍植物材料(sorghum plant material)、大豆植物材料(soybean plant material)、得自谷粒(grains)的研磨的组分、树木、树枝、根、叶、木屑(sawdust)、灌木(shrubs)与灌木丛(bushes)、蔬菜、水果以及花，以及它们的组合。
依据本发明，该生质是借由对纤维素生质进行糖化(saccharification)而产生的一纤维素生质水解液(cellulosic biomass hydrolysate)。
依据本发明，该生质在进行糖化前可被进行一前处理(pretreatment)。
适用于本发明的前处理包括，但不限于：蒸气爆裂(steam explosion)、热化学前处理法(thermal chemical pretreatment)、机械粉碎、酸处理、有机溶解(organosolve)、亚硫酸盐前处理(sulfite pretreatment)，以及它们的组合。
如本文中所使用的，术语“纤维素生质水解液(cellulosic biomasshydrolysate)”与“木质纤维素生质水解液(lignocellulosic biomass hydrolysate)”可被交替地使用。
在本发明的一个较佳具体例中，该纤维素生质水解液是借由对稻秆依序进行稀酸处理(dilute acid treatment)、蒸气爆裂处理(steam explosion treatment)以及糖化而被制得。
依据本发明，该纤维素生质水解液包含至少一种选自于由下列所构成的群组中的发酵抑制物：醋酸、糠醛、羟甲糠醛、乙酰丙酸以及酚类化合物。
较佳地，该纤维素生质水解液含有1至8g/L的醋酸。更佳地，该纤维素生质水解液含有3至7g/L的醋酸。
较佳地，该纤维素生质水解液含有0.5至7g/L的糠醛。更佳地，该纤维素生质水解液含有1至6g/L的糠醛。
较佳地，该纤维素生质水解液含有0.5至7g/L的羟甲糠醛。更佳地，该纤维素生质水解液含有1至6g/L的羟甲糠醛。
较佳地，该纤维素生质水解液含有1至8g/L的乙酰丙酸。更佳地，该纤维素生质水解液含有3至7g/L的乙酰丙酸。
较佳地，该纤维素生质水解液含有0.1至5g/L的酚类化合物。更佳地，该纤维素生质水解液含有0.5至4g/L的酚类化合物。
如本文中所使用的，术语“可发酵糖(fermentable sugars)”意指在一发酵制程(fermentation process)中可被微生物作为碳源来使用的单醣(monosaccharide)以及寡醣(oligosaccharide)。较佳地，该可发酵糖包含一种五碳糖以及一种六碳糖。在本发明的一个较佳具体例中，该可发酵糖包含葡萄糖与木糖。
如本文中所使用的，术语“芽孢杆菌属物种”意欲涵盖所有能够借由消耗葡萄糖以及木糖来产生乳酸的芽孢杆菌属物种的菌株，适用于本发明的芽孢杆菌属物种的菌株包括，但不限于，源自于下列的菌株：凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、液化淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)，以及它们的组合。在本发明的一个较佳具体例中，该芽孢杆菌属物种是凝结芽孢杆菌。
如本文中所使用的，术语“重组型假丝酵母菌属物种”意欲涵盖所有能够借由消耗葡萄糖以及木糖来产生乳酸的重组型假丝酵母菌属物种的菌株，其中该重组型假丝酵母菌属物种的基因组DNA包括一编码乳酸去氢酶的基因，并且其基因组DNA中的pdc基因被删除、破坏或已失效。
如本文中所使用的，术语“删除(delete)”意指删除一基因的全部或部分的编码区域。
如本文中所使用的，术语“破坏(disrupt)”意指在一基因中进行核苷酸的删除、***(insertion)或突变(mutation)，而使得该基因无法表现产生一活性酶(activeenzyme)，或使该基因表现产生一具有被严重降低活性(severely reduced activity)的酶。
如本文中所使用的，术语“已失效(disable)”意指一基因或其所编码的蛋白质被去活化(inactive)，进而失去原有的活性或功能。
依据本发明，适用于本发明的重组型假丝酵母菌属物种的菌株包括，但不限于，源自于下列的菌株：重组型高蛋白假丝酵母菌(recombinant Candida utilis)、重组型博伊丁假丝酵母(recombinant Candida boidinii)、重组型热带念珠菌(recombinant Candidatropicalis)、重组型***滑念珠菌(recombinant Candida parapsilosis)，以及它们的组合。在本发明的一个较佳具体例中，该重组型假丝酵母菌属物种是重组型高蛋白假丝酵母菌(recombinant Candida utilis)。
依据本发明，该重组型高蛋白假丝酵母菌的基因组DNA进一步包括一编码木糖还原酶(xylose reductase,XR)的基因、一编码木酮糖激酶(xylulose kinase,XK)的基因及一编码木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase,XDH)的基因。
在本发明的一个较佳具体例中，该重组型假丝酵母菌属物种是借由将一株以保藏编号BCRC 20325被保藏于食品工业发展研究所的生物资源保存及研究中心(BCRC ofFIRDI)的高蛋白假丝酵母菌[亦以保藏编号ATCC 9950被保藏于美国类型培养物收集中心(American Type Culture Collection,ATCC)]的基因组DNA中的pdc基因[其编码丙酮酸去羧酶(pyruvate decarboxylase,PDC)]进行剔除并导入LDH基因[其编码乳酸去氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)]、xr基因、xk基因及xdh基因至该高蛋白假丝酵母菌的基因组DNA中而制得。
如本文中所使用的，术语“糖蜜(molasses)”意指在精制来自于一植物的糖的过程中在移去糖膏(massecuite)中的蔗糖结晶(sucrose crystal)后所得到的残余的糖浆(syrup)。适用于本发明的糖蜜种类没有特别限制，而可包括各种商业上可购得的产品。较佳地，该糖蜜是选自于由下列所构成的群组：蔗糖蜜、甜菜糖蜜、柑橘糖蜜、玉米糖蜜，以及它们的组合。在本发明的一个较佳具体例中，该糖蜜是蔗糖蜜。
如本文中所使用的，术语“玉米浸液(corn steep liquor)”意指在玉米湿磨制程中借由稀酸浸泡玉米所得到的浓缩液。适用于本发明的玉米浸液种类没有特别限制，而可包括各种商业上可购得的产品。
依据本发明，当该菌株是重组型假丝酵母菌属物种时，以该种菌培养基的总体积为计算基础，该糖蜜具有一范围落在4至6％(v/v)的浓度，该玉米浸液具有一范围落在1至3％(v/v)的浓度。在本发明的一个较佳具体例中，以该种菌培养基的总体积为计算基础，该糖蜜具有一为6％(v/v)的浓度，该玉米浸液具有一为3％(v/v)的浓度。
依据本发明，当该菌株是芽孢杆菌属物种时，以该种菌培养基的总体积为计算基础，该糖蜜具有一范围落在6至7％(v/v)的浓度，该玉米浸液具有一范围落在6.5至7.5％(v/v)的浓度。在本发明的一个较佳具体例中，以该种菌培养基的总体积为计算基础，该糖蜜具有一为6％(v/v)的浓度，该玉米浸液具有一为7％(v/v)的浓度。
依据本发明，该发酵步骤是在实质上没有糖蜜以及玉米浸液的条件下被进行。
如本文中所使用的，术语“实质上没有(substantially free of)”意指一被具体指明的成分缺少有意义的数量。较佳地，该发酵步骤是在完全没有该成分的条件下被进行，或者该成分的数量对于该发酵步骤不具有可测量的影响(measurable effect)。
本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，该等实施例只是供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。
<实施例>
一般实验材料：
1.制备重组型高蛋白假丝酵母菌(recombinant Candida utilis)的接种源：
在下面实验中所使用的高蛋白假丝酵母菌是一种能够借由消耗五碳糖与六碳糖来产生乳酸的重组型高蛋白假丝酵母菌，其大体上是依据Ikushima S.et al.(2009)(同上述)以及Tamakawa H.et al.(2012)(同上述)当中所述的方法而被制备。简言之，首先，依据Ikushima S.et al.(2009)(同上述)当中所述的方法，将一高蛋白假丝酵母菌BCRC 20325[购自于中国台湾的食品工业发展研究所(Food Industry Research and DevelopmentInstitute,FIRDI)的生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and ResearchCenter,BCRC)(300新竹市食品路331号，中国台湾)，亦以保藏编号ATCC 9950被保藏于美国类型培养物收集中心(American Type Culture Collection,ATCC)]的pdc基因[其编码丙酮酸去羧酶(pyruvate decarboxylase,PDC)]剔除，继而将来自于牛(bovine)的LDH基因[其编码乳酸去氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)]***(insert)至该经剔除的pdc基因位置中，借此而得到一能够表现LDH基因的ΔPDC突变菌株。接着，依据Tamakawa H.et al.(2012)(同上述)当中所述的方法，将一编码木酮糖激酶(xylulose kinase,XK)的基因、一编码木糖还原酶(xylose reductase,XR)的基因以及一编码木糖醇脱氢酶(xylitoldehydrogenase,XDH)的基因导入至该ΔPDC突变菌株的基因组DNA中，由此所得到的重组型高蛋白假丝酵母菌能够借由消耗葡萄糖与木糖来产生乳酸。
2.在下面实施例中所使用的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)BCRC 910831已于公元2018年3月2日被保藏于中国台湾的食品工业发展研究所(FIRDI)的生物资源保存及研究中心(BCRC)，亦以保藏编号CCTCC M 2018310被保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection,CCTCC)。
3.在下面实施例中，被拿来作为比较之用的重组型酿酒酵母菌(recombinantSaccharomyces cerevisiae)是得自于申请人先前美国专利案US 9382557B2，并已以保藏编号DSM 26705被保藏于德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH,DSMZ)，亦以保藏编号BCRC 920083被保藏于中国台湾的食品工业发展研究所(FIRDI)的生物资源保存及研究中心(BCRC)。
4.在下面实施例中，用于配制种菌培养基的蔗糖蜜(cane molasses)以及玉米浸液(corn steep liquor)分别是购自于台湾糖业股份有限公司(Taiwan SugarCorporation)以及丰年丰和企业股份有限公司(Fonen And FonHer Enterprise Co.,LTD)，其中蔗糖蜜含有435g/L的蔗糖、36.5g/L的葡萄糖以及86g/L的果糖，而玉米浸液含有60.88％(w/w)的水、17.67％(w/w)的粗蛋白质、6.49％(w/w)的粗灰分以及177.94ppm的二氧化硫。
5.在下面实施例中所使用的葡萄糖以及木糖是购自于景明化工股份有限公司(Echo Chemical Co.,LTD)。
6.在下面实施例中所使用的乳酸、醋酸、糠醛(furfural)、羟甲糠醛(hydroxymethylfurfural,HMF)、乙酰丙酸(levulinic acid)以及CaCO3是购自于Sigma-Aldrich。
7.在下面实施例中所使用的YPD40培养基具有一如下面表1所示的配方。
表1.YPD40培养基的配方
Figure BDA0001737457340000131
8.在下面实施例中所使用的YPD50培养基具有一如下面表2所示的配方。
表2.YPD50培养基的配方
Figure BDA0001737457340000132
9.在下面实施例中，用于发酵培养重组型高蛋白假丝酵母菌的发酵培养基具有一如下面表3所示的配方。
表3.用于发酵培养重组型高蛋白假丝酵母菌的发酵培养基的配方
Figure BDA0001737457340000141
10.在下面实施例中，用于发酵培养凝结芽孢杆菌BCRC 910831的发酵培养基具有一如下面表4所示的配方。
表4.用于发酵培养凝结芽孢杆菌BCRC 910831的发酵培养基的配方
一般实验方法：
1.高效能液相层析(high performance liquid chromatography,HPLC)分析：
在下面的实施例中，被用来进行HPLC分析的待测样品中所含有的成分及其浓度(g/L)是参考美国国家再生能源实验室(National Renewable Energy Laboratory,NREL)所颁布的有关标准生物质分析的实验室分析程序(laboratory analytical procedures,LAPs)，并借由使用一配备有一个折射率侦测器(refractive index detector,RIdetector)(L2400,Hitachi)的高效能液相层析仪(DIONEX Ultimate 3000)来进行测定，其中所使用的管柱以及操作条件如下：分析管柱为Aminex HPX-87H管柱(BioRad)；流动相：5mM硫酸(配于水中)；流速被控制为0.6mL/分钟；样品注射体积为20μL；管柱烘箱(columnoven)温度控制在65℃；RI温度控制在45℃。
实施例1.在存在有醋酸的发酵条件下，由含有不同浓度的蔗糖蜜与3％(v/v)的玉米浸液的种菌培养基所制得的重组型高蛋白假丝酵母菌的种菌培养物对于发酵制程的乳酸产率的影响
实验方法：
首先，将依据上面“一般实验材料”的第1项所得到的重组型高蛋白假丝酵母菌菌株分成6组，其中包括5个实验组(也就是实验组1至5)以及1个对照组。接着，将实验组1至5的菌株分别接种至具有如下面表5中所示的配方的种菌培养基(100mL)中，以及将对照组的菌株接种至如上面表1中所示的YPD40培养基(100mL)中。
表5.各个实验组的种菌培养基的配方
Figure BDA0001737457340000151
之后，将各组菌株置于一恒温振荡培养箱(30℃、150-200rpm)内并于一好氧条件下进行培养历时24小时，而使得该培养物的OD600值能达至20(约4.6g菌体/L)。接着，所形成的细菌培养物以6,000g来进行离心历时10分钟，然后收集细胞沉淀物并使用无菌水予以清洗1次，继而以如上面表3中所示的发酵培养基来充份悬浮菌体，由此所得到的细胞悬浮液被拿来作为重组型高蛋白假丝酵母菌的种菌培养物。
之后，将各组种菌培养物分别以4×108细胞/mL的接种量接种于一含有100mL的如上面表3中所示的发酵培养基的锥形瓶中，然后于一好氧条件下以及一恒温培养箱(33℃、100-150rpm)中进行发酵反应历时72小时。
之后，所得到的各组发酵培养物以16,800rpm来进行离心历时1分钟，接着收集上清液[即发酵产物(fermentation product)]并依据上面“一般实验方法”的第1项「高效能液相层析分析」当中所述的方法来进行乳酸含量的分析。
乳酸产率是借由将所测得的乳酸含量以及发酵前发酵培养基中所含有的葡萄糖含量以及木糖含量代入下列公式(1)而被计算出：
公式(1)：A＝[B/(C+D)]×100
其中：A＝乳酸产率(％)
B＝所测得的乳酸含量(g/L)
C＝发酵前发酵培养基中所含有的葡萄糖含量(g/L)
D＝发酵前发酵培养基中所含有的木糖含量(g/L)
结果：
本实验所测得的结果被显示于图1中。这个实验结果显示，在存在有醋酸的发酵条件下，由含有4、5或6％(v/v)的蔗糖蜜与3％(v/v)的玉米浸液的种菌培养基所制得的重组型高蛋白假丝酵母菌的种菌培养物皆能够有效地利用葡萄糖与木糖来进行发酵，进而提升乳酸产率，其中以含有3％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基的效果最佳。
实施例2.在存在有醋酸的发酵条件下，由含有不同浓度的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的重组型高蛋白假丝酵母菌的种菌培养物对于发酵制程的乳酸产率的影响
实验方法：
首先，将依据上面“一般实验材料”的第1项所得到的重组型高蛋白假丝酵母菌菌株分成4组，其中包括3个实验组(也就是实验组1至3)以及1个对照组。接着，将实验组1至3的菌株分别接种至具有如下面表6中所示的配方的种菌培养基(100mL)中，以及将对照组的菌株接种至如上面表1中所示的YPD40培养基(100mL)中。
表6.各个实验组的种菌培养基的配方
Figure BDA0001737457340000171
之后，依照实施例1当中所述的方式来进行种菌培养物的制备、发酵反应、乳酸含量的分析以及乳酸产率的计算。
结果：
本实验所测得的结果被显示于图2中。这个实验结果显示，在存在有醋酸的发酵条件下，由含有1或3％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的重组型高蛋白假丝酵母菌的种菌培养物皆能够有效地提升发酵制程的乳酸产率，其中以含有3％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基的效果最佳。
实施例3.在存在有不同的发酵抑制物的发酵条件下，由含有3％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的重组型高蛋白假丝酵母菌的种菌培养物对于发酵制程的乳酸产率的影响
于本实施例中，申请人使用含有醋酸、糠醛或羟甲糠醛的发酵培养基来模拟含有醋酸、糠醛或羟甲糠醛的生质(例如，纤维素生质水解液)，并探讨依据本发明所制得的重组型高蛋白假丝酵母菌的种菌培养物在发酵过程中对于不同发酵抑制物的抵抗性。
实验方法：
A、含有不同浓度的醋酸的发酵培养基对于乳酸产率的影响：
首先，将依据上面“一般实验材料”的第1项所得到的重组型高蛋白假丝酵母菌菌株分成8组，其中包括4个实验组(也就是实验组1至4)以及4个对照组(也就是对照组1至4)。接着，将各个实验组的菌株分别接种至含有3％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基(100mL)中，以及将各个对照组的菌株分别接种至如上面表1中所示的YPD40培养基(100mL)中。
之后，依照实施例1当中所述的方式来进行种菌培养物的制备与发酵反应，不同处在于：各组菌株在一好氧条件下进行培养所得到的培养物的OD600值达至12(约2.76g菌体/L)，以及所得到的种菌培养物是以2.4×108细胞/mL的接种量来进行发酵反应历时48小时。而有关各组的发酵培养基大体上是参照上面表3中所示的配方来进行制备，不同处在于：各组发酵培养基的醋酸浓度是分别依据下面表7中所示者来作调整。
表7.各组发酵培养基的醋酸浓度
Figure BDA0001737457340000181
之后，所得到的各组发酵培养物是参照实施例1当中所述的方式来进行乳酸含量的分析以及乳酸产率的计算。
B、含有不同浓度的糠醛的发酵培养基对于乳酸产率的影响：
首先，将依据上面“一般实验材料”的第1项所得到的重组型高蛋白假丝酵母菌菌株分成8组，其中包括4个实验组(也就是实验组1至4)以及4个对照组(也就是对照组1至4)，接着，依照上面第A项当中所述的方式来进行种菌培养物的制备、发酵反应、乳酸含量的分析以及乳酸产率的计算，不同处在于：各组发酵培养基的醋酸被替换为下面表8中所示的不同浓度的糠醛。
表8.各组发酵培养基的糠醛浓度
Figure BDA0001737457340000191
C、含有不同浓度的羟甲糠醛的发酵培养基对于乳酸产率的影响：
首先，将依据上面“一般实验材料”的第1项所得到的重组型高蛋白假丝酵母菌菌株分成8组，其中包括4个实验组(也就是实验组1至4)以及4个对照组(也就是对照组1至4)，接着，依照上面第A项当中所述的方式来进行种菌培养物的制备、发酵反应、乳酸含量的分析以及乳酸产率的计算，不同处在于：各组发酵培养基的醋酸被替换为下面表9中所示的不同浓度的羟甲糠醛。
表9.各组发酵培养基的羟甲糠醛浓度
Figure BDA0001737457340000192
结果：
A、含有不同浓度的醋酸的发酵培养基对于乳酸产率的影响：
本实验所测得的结果被显示于图3中。这个实验结果显示，在存在有0.3、0.5或0.7％(w/v)的醋酸的发酵条件下，由含有3％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的重组型高蛋白假丝酵母菌的种菌培养物皆能够有效地提升发酵制程的乳酸产率。
B、含有不同浓度的糠醛的发酵培养基对于乳酸产率的影响：
本实验所测得的结果被显示于图4中。这个实验结果显示，在存在有0.1、0.3或0.5％(w/v)的糠醛的发酵条件下，由含有3％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的重组型高蛋白假丝酵母菌的种菌培养物皆能够有效地提升发酵制程的乳酸产率。
C、含有不同浓度的羟甲糠醛的发酵培养基对于乳酸产率的影响：
本实验所测得的结果被显示于图5中。这个实验结果显示，在存在有0.1、0.3或0.5％(w/v)的羟甲糠醛的发酵条件下，由含有3％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的重组型高蛋白假丝酵母菌的种菌培养物皆能够有效地提升发酵制程的乳酸产率。
基于上述的实验结果，申请人认为：由含有3％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的重组型高蛋白假丝酵母菌的种菌培养物对于发酵制程中所产生的抑制物(即醋酸、糠醛以及羟甲糠醛)具有优异的抵抗性，因此能够有效地利用葡萄糖与木糖来进行发酵，进而提升乳酸产率。
实施例4.在存在有不同的发酵抑制物的发酵条件下，由含有3％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的重组型酿酒酵母菌(recombinantSaccharomyces cerevisiae)的种菌培养物对于发酵制程的乳酸产率的影响
于本实施例中，申请人使用重组型酿酒酵母菌BCRC 920083作为试验菌株，并使用含有醋酸、糠醛或羟甲糠醛的发酵培养基来模拟含有醋酸、糠醛或羟甲糠醛的生质(例如，纤维素生质水解液)，以评估由含有3％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的重组型酿酒酵母菌BCRC 920083的种菌培养物在发酵过程中对于不同发酵抑制物的抵抗性。
实验方法：
首先，将重组型酿酒酵母菌菌株BCRC 920083分成6组，其中包括3个实验组(也就是实验组1至3)以及3个对照组(也就是对照组1至3)，接着，依照实施例3的“实验方法”的第A项当中所述的方法来进行种菌培养物的制备、发酵反应、乳酸含量的分析以及乳酸产率的计算，不同处在于：各组发酵培养基所含有的发酵抑制物及浓度是分别依据下面表10中所示者来作调整。
表10.各组发酵培养基所含有的发酵抑制物及浓度
Figure BDA0001737457340000211
结果：
本实验所测得的结果被显示于图6中。这个实验结果显示，在存在有醋酸、糠醛或羟甲糠醛的发酵条件下，由含有3％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的重组型酿酒酵母菌BCRC 920083的种菌培养物对于发酵制程中所产生的抑制物(即醋酸、糠醛以及羟甲糠醛)不具有抵抗性，因而无法有效地利用葡萄糖与木糖来进行发酵产乳酸。
实施例5.使用一经稀酸催化蒸气爆裂的稻秆纤维素生质水解液作为底物对于由含有3％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的重组型高蛋白假丝酵母菌的种菌培养物在发酵生成乳酸上的影响
于本实施例中，申请人使用一经稀酸催化蒸气爆裂的稻秆纤维素生质水解液作为底物，并探讨由含有3％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的重组型高蛋白假丝酵母菌的种菌培养物利用该底物来发酵生成乳酸的情形。
实验材料：
1.稻秆纤维素生质水解液(cellulosic biomass hydrolysate of rice straw)的制备：
首先，将稻秆(得自于弘远农产商行)切成适当的尺寸，继而以粉碎机予以粉碎，接着加入3％(w/w)硫酸溶液并予以充分混合，然后在121℃下进行反应历时120至180分钟。之后，使用立式压榨机(vertical press)(购自于丰映科技股份有限公司)在一为1MPa的压力下来进行压榨，继而分别收取液体与固体部分。接着，将该固体部分置于一蒸气爆裂反应***(购自于七福工业股份有限公司)，继而通入蒸气并在一为190至200℃的温度下进行加热历时3至5分钟。接着，将该蒸气爆裂反应***的压力快速地降低至1atm，以进行蒸气爆裂处理，然后收集所得到的渣料(pulp)，继而加入上述固液分离步骤所收取的液体并予以充分混合。接着，利用NaOH将所得到的混合物的初始pH值调整至5.5，继而加入一由纤维素酶(cellulase)与半纤维素酶(hemicellulase)所构成的混合物(Novozymes
Figure BDA0001737457340000221
CTec3，使用量为30FPU/克纤维素生质)，并在一为50℃的温度下以及一为70rpm的搅拌速率下进行糖化作用(saccharification)历时72小时，并且在糖化作用开始后的第2、4、8以及24小时，对该混合物添加5N的NaOH溶液以使其pH值被维持在5.0，借此而得到一经酸催化蒸气爆裂的稻秆纤维素生质水解液(下面简称“稻秆纤维素生质水解液”)。之后，依据上面“一般实验方法”的第1项「高效能液相层析分析」当中所述的方法来分析该稻秆纤维素生质水解液中的醣类以及抑制物的浓度，而分析结果显示出该稻秆纤维素生质水解液含有7％(w/v)葡萄糖、1.5％(w/v)木糖、0.3％(w/v)醋酸、0.1％(w/v)糠醛以及0.05％(w/v)羟甲糠醛。
实验方法：
首先，将依据上面“一般实验材料”的第1项所得到的重组型高蛋白假丝酵母菌菌株分成1个实验组以及1个对照组。接着，将实验组的菌株接种至含有3％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基(100mL)中，以及将对照组的菌株接种至如上面表1中所示的YPD40培养基(100mL)中。
之后，依照实施例1当中所述的方式来进行种菌培养物的制备、发酵反应、乳酸含量的分析以及乳酸产率的计算，不同处在于：以稻秆纤维素生质水解液作为发酵培养基，以及将发酵反应时间调整至48小时。
结果：
本实验所测得的结果被显示于图7中。这个实验结果显示，在使用稻秆纤维素生质水解液作为底物下，由含有3％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的重组型高蛋白假丝酵母菌的种菌培养物能够有效地利用葡萄糖与木糖来进行发酵，进而提升乳酸产率。
实施例6.在存在有醋酸的发酵条件下，由含有不同浓度的蔗糖蜜与7％(v/v)的玉米浸液的种菌培养基所制得的凝结芽孢杆菌BCRC 910831的种菌培养物对于发酵制程的乳酸产率的影响
实验方法：
首先，将凝结芽孢杆菌BCRC 910831菌株分成7组，其中包括6个实验组(也就是实验组1至6)以及1个对照组。接着，将实验组1至6的菌株分别接种至具有如下面表11中所示的配方的种菌培养基(100mL)中，以及将对照组的菌株接种至如上面表2中所示的YPD50培养基(100mL)中。
表11.各个实验组的种菌培养基的配方
Figure BDA0001737457340000231
之后，将各组菌株置于一恒温振荡培养箱(50℃、150rpm)内并于一好氧条件下进行培养历时24小时，而使得该培养物的OD420值能达到8(约0.8g菌体/L)。接着，所形成的细菌培养物以6,000g来进行离心历时10分钟，然后收集细胞沉淀物并使用无菌水予以清洗1次，继而以如上面表4中所示的发酵培养基来充份悬浮菌体，由此所得到的细胞悬浮液被拿来作为凝结芽孢杆菌BCRC 910831的种菌培养物。
之后，将各组种菌培养物分别以4×109细胞/mL的接种量接种于一含有100mL的如上面表4中所示的发酵培养基的锥形瓶中，然后于一厌氧条件下以及一恒温培养箱(50℃、150rpm)中进行发酵反应历时48小时。
之后，所得到的各组发酵培养物是参照实施例1当中所述的方式来进行乳酸含量的分析以及乳酸产率的计算。
结果：
本实验所测得的结果被显示于图8中。这个实验结果显示，在存在有醋酸的发酵条件下，由含有6或7％(v/v)的蔗糖蜜与7％(v/v)的玉米浸液的种菌培养基所制得的凝结芽孢杆菌BCRC 910831的种菌培养物皆能够有效地利用葡萄糖与木糖来进行发酵，进而提升乳酸产率，其中以含有7％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基的效果最佳。
实施例7.在存在有醋酸的发酵条件下，由含有不同浓度的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的凝结芽孢杆菌BCRC 910831的种菌培养物对于发酵制程的乳酸产率的影响
实验方法：
首先，将凝结芽孢杆菌BCRC 910831菌株分成7组，其中包括6个实验组(也就是实验组1至6)以及1个对照组。接着，将实验组1至6的菌株分别接种至具有如下面表12中所示的配方的种菌培养基(100mL)中，以及将对照组的菌株接种至如上面表2中所示的YPD50培养基(100mL)中。
表12.各个实验组的种菌培养基的配方
Figure BDA0001737457340000251
之后，依照实施例6当中所述的方式来进行种菌培养物的制备、发酵反应、乳酸含量的分析以及乳酸产率的计算，不同处在于：将发酵反应时间调整至72小时。
结果：
本实验所测得的结果被显示于图9中。这个实验结果显示，在存在有醋酸的发酵条件下，由含有7％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的凝结芽孢杆菌BCRC 910831的种菌培养物能够有效的提升发酵制程的乳酸产率。
实施例8.在存在有不同的发酵抑制物的发酵条件下，由含有7％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的凝结芽孢杆菌BCRC 910831的种菌培养物对于发酵制程的乳酸产率的影响
于本实施例中，申请人使用含有醋酸、糠醛、羟甲糠醛或乙酰丙酸的发酵培养基来模拟含有醋酸、糠醛、羟甲糠醛或乙酰丙酸的生质(例如，纤维素生质水解液)，并探讨依据本发明所制得的凝结芽孢杆菌BCRC 910831的种菌培养物在发酵过程中对于不同发酵抑制物的抵抗性。
实验方法：
A、含有不同浓度的醋酸的发酵培养基对于乳酸产率的影响：
首先，将凝结芽孢杆菌BCRC 910831菌株分成8组，其中包括4个实验组(也就是实验组1至4)以及4个对照组(也就是对照组1至4)。接着，将各个实验组的菌株分别接种至含有7％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基(100mL)中，以及将各个对照组的菌株分别接种至如上面表2中所示的YPD50培养基(100mL)中。
之后，依照实施例6当中所述的方式来进行种菌培养物的制备与发酵反应，不同处在于：将发酵反应时间调整至72小时。而有关各组的发酵培养基大体上是参照上面表4中所示的配方来进行制备，不同处在于：各组发酵培养基的醋酸浓度是分别依据下面表13中所示者来作调整。
表13.各组发酵培养基的醋酸浓度
Figure BDA0001737457340000261
之后，所得到的各组发酵培养物是参照实施例1当中所述的方式来进行乳酸含量的分析以及乳酸产率的计算。
B、含有不同浓度的糠醛的发酵培养基对于乳酸产率的影响：
首先，将凝结芽孢杆菌BCRC 910831菌株分成8组，其中包括4个实验组(也就是实验组1至4)以及4个对照组(也就是对照组1至4)。接着，依照上面第A项当中所述的方法来进行种菌培养物的制备、发酵反应、乳酸含量的分析以及乳酸产率的计算，不同处在于：各组发酵培养基的醋酸被替换为下面表14中所示的不同浓度的糠醛。
表14.各组发酵培养基的糠醛浓度
C、含有不同浓度的羟甲糠醛的发酵培养基对于乳酸产率的影响：
首先，将凝结芽孢杆菌BCRC 910831菌株分成8组，其中包括4个实验组(也就是实验组1至4)以及4个对照组(也就是对照组1至4)。接着，依照上面第A项当中所述的方法来进行种菌培养物的制备、发酵反应、乳酸含量的分析以及乳酸产率的计算，不同处在于：各组发酵培养基的醋酸被替换为下面表15中所示的不同浓度的羟甲糠醛。
表15.各组发酵培养基中的羟甲糠醛浓度
Figure BDA0001737457340000272
D、含有不同浓度的乙酰丙酸的发酵培养基对于乳酸产率的影响：
首先，将凝结芽孢杆菌BCRC 910831菌株分成8组，其中包括4个实验组(也就是实验组1至4)以及4个对照组(也就是对照组1至4)。接着，依照上面第A项当中所述的方法来进行种菌培养物的制备、发酵反应、乳酸含量的分析以及乳酸产率的计算，不同处在于：各组发酵培养基的醋酸被替换为下面表16中所示的不同浓度的乙酰丙酸。
表16.各组发酵培养基的乙酰丙酸浓度
Figure BDA0001737457340000281
结果：
A、含有不同浓度的醋酸的发酵培养基对于乳酸产率的影响：
本实验所测得的结果被显示于图10中。这个实验结果显示，在存在有0.3、0.5或0.7％(w/v)的醋酸的发酵条件下，由含有7％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的凝结芽孢杆菌BCRC 910831的种菌培养物皆能够有效地提升发酵制程的乳酸产率。
B、含有不同浓度的糠醛的发酵培养基对于乳酸产率的影响：
本实验所测得的结果被显示于图11中。这个实验结果显示，在存在有0.2、0.4或0.6％(w/v)的糠醛的发酵条件下，由含有7％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的凝结芽孢杆菌BCRC 910831的种菌培养物皆能够有效地提升发酵制程的乳酸产率。
C、含有不同浓度的羟甲糠醛的发酵培养基对于乳酸产率的影响：
本实验所测得的结果被显示于图12中。这个实验结果显示，在存在有0.2、0.4或0.6％(w/v)的羟甲糠醛的发酵条件下，由含有7％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的凝结芽孢杆菌BCRC 910831的种菌培养物皆能够有效地提升发酵制程的乳酸产率。
D、含有不同浓度的乙酰丙酸的发酵培养基对于乳酸产率的影响：
本实验所测得的结果被显示于图13中。这个实验结果显示，在存在有0.3、0.5或0.7％(w/v)的乙酰丙酸的发酵条件下，由含有7％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的凝结芽孢杆菌BCRC 910831的种菌培养物皆能够有效地提升发酵制程的乳酸产率。
基于上述的实验结果，申请人认为：由含有7％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的凝结芽孢杆菌BCRC 910831的种菌培养物对于发酵制程中所产生的抑制物(即醋酸、糠醛、羟甲糠醛以及乙酰丙酸)具有优异的抵抗性，因此能够有效地利用葡萄糖与木糖来进行发酵，进而提升乳酸产率。
实施例9.使用一经稀酸催化蒸气爆裂的稻秆纤维素生质水解液作为底物对于由含有7％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的凝结芽孢杆菌BCRC910831的种菌培养物在发酵生成乳酸上的影响
于本实施例中，申请人使用依据上面实施例5所得到的稻秆纤维素生质水解液作为底物，并探讨由含有7％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的凝结芽孢杆菌BCRC 910831的种菌培养物利用该底物来发酵生成乳酸的情形。
实验方法：
首先，将凝结芽孢杆菌BCRC 910831菌株分成1个实验组以及1个对照组。接着，将实验组的菌株接种至含有7％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基(100mL)中，以及将对照组的菌株接种至如上面表2中所示的YPD50培养基(100mL)中。
之后，依照实施例6当中所述的方式来进行种菌培养物的制备、发酵反应、乳酸含量的分析以及乳酸产率的计算，不同处在于：以稻秆纤维素生质水解液作为发酵培养基。
结果：
本实验所测得的结果被显示于图14中。这个实验结果显示，在使用稻秆纤维素生质水解液作为底物下，由含有7％(v/v)的玉米浸液与6％(v/v)的蔗糖蜜的种菌培养基所制得的凝结芽孢杆菌BCRC 910831的种菌培养物能够有效地利用葡萄糖与木糖来进行发酵，进而提升乳酸产率。
综合以上的实验结果，申请人认为：以含有玉米浸液与蔗糖蜜的种菌培养基来对芽孢杆菌属物种或重组型假丝酵母菌属物种的菌株进行种菌培养，由此所制得的种菌培养物对于发酵制程中所产生的抑制物具有优异的抵抗性，因此能够有效地利用葡萄糖与木糖来进行发酵，进而提升乳酸产率。
于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本案作为参考数据。若有所冲突时，本案详细说明(包含界定在内)将占上风。
虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明只受如随文检附的权利要求书所示者的限制。

Claims (12)

1.一种以生质制备乳酸的方法，其特征在于：该方法包括：
将一能够借由消耗五碳糖以及六碳糖来产生乳酸的芽孢杆菌属物种和/或重组型假丝酵母菌属物种的菌株培养于一含有糖蜜以及玉米浸液的种菌培养基中，以在该种菌培养基中获得该菌株的种菌培养物；以及
利用该菌株的种菌培养物来对该生质进行发酵；
其中，该生质包含一可发酵糖以及该重组型假丝酵母菌属物种的基因组DNA包括一编码乳酸去氢酶的基因，并且其基因组DNA中的pdc基因被删除、破坏或已失效。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：当该菌株是重组型假丝酵母菌属物种时，以该种菌培养基的总体积为计算基础，该糖蜜具有一范围落在4至6％(v/v)的浓度，该玉米浸液具有一范围落在1至3％(v/v)的浓度。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：当该菌株是芽孢杆菌属物种时，以该种菌培养基的总体积为计算基础，该糖蜜具有一范围落在6至7％(v/v)的浓度，该玉米浸液具有一范围落在6.5至7.5％(v/v)的浓度。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：该重组型假丝酵母菌属物种是选自于由下列所构成的群组：重组型高蛋白假丝酵母菌(recombinant Candida utilis)、重组型博伊丁假丝酵母(recombinant Candida boidinii)、重组型热带念珠菌(recombinant Candidatropicalis)、重组型***滑念珠菌(recombinant Candidaparapsilosis)，以及它们的组合。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：该重组型假丝酵母菌属物种是重组型高蛋白假丝酵母菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：该重组型高蛋白假丝酵母菌的基因组DNA进一步包括一编码木糖还原酶的基因、一编码木酮糖激酶的基因及一编码木糖醇脱氢酶的基因。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：该芽孢杆菌属物种是选自于由下列所构成的群组：凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、液化淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)，以及它们的组合。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：该芽孢杆菌属物种是凝结芽孢杆菌。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该发酵步骤是在实质上没有糖蜜以及玉米浸液的条件下被进行。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该可发酵糖包含葡萄糖与木糖。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该生质是一纤维素生质水解液。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：该纤维素生质水解液包含至少一种选自于由下列所构成的群组中的发酵抑制物：醋酸、糠醛、羟甲糠醛、乙酰丙酸以及酚类化合物。
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