TWI527591B - 對人類血管生成素-2具有高親和性之人類抗體 - Google Patents
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Description
本發明是有關於對血管生成素(angiopoietin-2,Ang-2)具有專一性的抗體,及其抗原-結合片段。
血管生成(angiogenesis)是新血管形成的生物過程。異常的血管生成與數種病況有關聯,包括,例如增生性視網膜病變(proliferative retinopathies)、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)以及牛皮癬(psoriasis)。此外,已充分證實血管生成對於腫瘤生長以及維持是不可或缺的。血管生成素-2(Ang-2)是Tie-2受體(Tie-2)的配位體,並且已顯示在血管生成中扮演一角色。Ang-2在該技藝中亦被意指為Tie-2配位體(US 5,643,755;Yancopoulos et al.,2000,Nature 407:242-248)。
在US 6,166,185;7,521,053;7,205,275;2006/0018909以及2006/0246071中提到結合至Ang-2的抗體以及其他胜肽抑制劑。在該技藝中,對於可以用來治療因血管生成所引起或惡化的疾病或病況的新穎Ang-2調節劑(包括Ang-2抗體)是有需求的。
本發明提供結合至人類Ang-2的人類抗體。有鑑於各種證據以及研究,本發明人等已認知到:對於不會結合至或拮抗相關分子Ang-1的Ang-2抑制劑是有需要的。舉例來說,先前研究已證實或暗示,Ang-1在止血(hemostasis)(參見,例如Li et al.,2001,Thrombosis and haemostasis 85:191-374)以及在保護成人血管分布以對抗血漿滲漏(plasma leakage)(參見,例如Thurston et al.,2000,Nature Medicine 6:460-463;Thruston et al.,1999,Science 286:2511-2514)方面發揮有益的作用。本發明人等因而認知到,在某些抗-血管生成的治療情況下,保留Ang-1活性可能是有利的。因此,本發明提供專一地結合至Ang-2但實質上不會結合至Ang-1的抗體。本發明亦包括阻斷Ang-2與其受體Tie-2之間交互作用但實質上不會阻斷Ang-1與Tie-2之間交互作用的抗體。本發明的抗體尤其可應用於抑制Ang-2的血管生成-促進活性並且用於治療因血管生成過程所引起或相關的疾病或不適症。
本發明的抗體可以是全長(例如,IgG1或IgG4抗體)或可以僅僅包含有抗原-結合部分(例如,Fab、F(ab’)2或scFv片段),以及可以被修飾而影響功能性,例如消除殘餘的效應子功能(effector functions)。
在一個具體例中,本發明包含有一抗體或一抗體的抗原-結合片段,其包含有一具有選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的胺基酸序列的重鏈可變區域(HCVR):2、18、22、26、42、46、50、66、70、74、90、94、98、114、118、122、138、142、146、162、166、170、186、190、194、210、214、218、234、238、242、258、262、266、282、286、290、306、310、314、330、334、338、354、358、362、378、382、386、402、406、410、426、430、434、450、454、458、474、478、482、498、502、506、514以及516,或其實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性(sequence identity)的相似序列。在一個具體例中,該抗體或抗體之抗原-結合部分包含有一具有選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的胺基酸序列的HCVR:18、42、66、162、210、266以及434。
在一個具體例中,本發明包含有一抗體或一抗體的抗原-結合片段,其包含有一具有選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的胺基酸序列的輕鏈可變區域(LCVR):10、20、24、34、44、48、58、68、72、82、92、96、106、116、120、130、140、144、154、164、168、178、188、192、202、212、216、226、236、240、250、260、264、274、284、288、298、308、312、322、332、336、346、356、360、370、380、384、394、404、408、418、428、432、442、452、456、466、476、480、490、500以及504,或其實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的相似序列。在一個具體例中,該抗體或抗體之抗原-結合部分包含有一具有選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的胺基酸序列的LCVR:20、44、68、164、212、274以及442。
在特定具體例中,該抗體或其抗原-結合片段包含有一選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的HCVR以及LCVR(HCVR/LCVR)胺基酸序列對:2/10、18/20、22/24、26/34、42/44、46/48、50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、98/106、114/116、118/120、122/130、138/140、142/144、146/154、162/164、166/168、170/178、186/188、190/192、194/202、210/212、214/216、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、266/274、282/284、286/288、290/298、306/308、310/312、314/322、330/332、334/336、338/346、354/356、358/360、362/370、378/380、382/384、386/394、402/404、406/408、410/418、426/428、430/432、434/442、450/452、454/456、458/466、474/476、478/480、482/490、498/500,以及502/504。在一個具體例中,該抗體或其片段包含有一選自於具有下列SEQ ID NO之胺基酸序列對的HCVR以及LCVR:18/20、42/44、66/68、162/164、210/212、266/274以及434/442。
在下一態樣,本發明提供一種抗體或一抗體的抗原-結合片段,其包含有一具有選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的胺基酸序列的重鏈CDR3(HCDR3)功能域:8、32、56、80、104、128、152、176、200、224、248、272、296、320、344、368、392、416、440、464、488以及512,或其實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的相似序列;以及一選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的輕鏈CDR3(LCDR3)功能域:16、40、64、88、112、136、160、184、208、232、256、280、304、328、352、376、400、424、448、472以及496,或其實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的相似序列。
在某些具體例中,該抗體或該抗體的抗原-結合部分包含有一選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的HCDR3/LCDR3胺基酸序列對:8/16、32/40、56/64、80/88、104/112、128/136、152/160、176/184、200/208、224/232、248/256、272/280、296/304、320/328、344/352、368/376、392/400、416/424、440/448、464/472以及488/496。在一個具體例中,該抗體或抗體之抗原-結合部分包含有一選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的HCDR3/LCDR3胺基酸序列對:8/16、32/40、56/64、152/160、200/208、272/280以及440/448。帶有這些HCDR3/LCDR3對的抗-Ang-2抗體的非限定實例是分別被命名為H1H685、H1H690、H1H691、H1H696、H1H706、H1M724以及H2M744的抗體。
在又一個具體例中,本發明包含有一種抗體或其片段,它包含有一具有選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的胺基酸序列的HCDR1功能域:4、28、52、76、100、124、148、172、196、220、244、268、292、316、340、364、388、412、436、460、484以及508,或其實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的相似序列;一具有選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的胺基酸序列的重鏈CDR2(HCDR2)功能域:6、30、54、78、102、126、150、174、198、222、246、270、294、318、342、366、390、414、438、462、486以及510,或其實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的相似序列;具有一選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的胺基酸序列的LCDR1功能域:12、36、60、84、108、132、156、180、204、228、252、276、300、324、348、372、396、420、444、468以及492,或其實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的相似序列;以及一具有選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的胺基酸序列的LCDR2功能域:14、38、62、86、110、134、158、182、206、230、254、278、302、326、350、374、398、422、446、470以及494,或其實質上具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的相似序列。
本發明的某些非限定、例示性抗體以及抗原-結合片段分別包含有HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2以及LCDR3功能域,選自於由下列所構成之群組:(i) SEQ ID NO:4、6、8、12、14以及16(例如H1H685);(ii) SEQ ID NO:28、30、32、36、38以及40(例如H1H690);(iii) SEQ ID NO:52、54、56、60、62以及64(例如H1H691);(iv) SEQ ID NO:148、150、152、156、158以及160(例如H1H696);(v) SEQ ID NO:196、198、200、204、206以及208(例如H1H706);(vi) SEQ ID NO:268、270、272、276、278以及280(例如H1M724);以及(vii) SEQ ID NO:436、438、440、444、446以及448(例如H2M744)。
在一個相關的具體例中,本發明包含有一種專一地結合Ang-2的抗體或抗體的抗原-結合片段,其中該抗體或片段含有被包含在選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的重鏈以及輕鏈可變功能域序列的重鏈以及輕鏈CDR功能域(亦即,CDR1、CDR2以及CDR3):2/10、18/20、22/24、26/34、42/44、46/48、50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、98/106、114/116、118/120、122/130、138/140、142/144、146/154、162/164、166/168、170/178、186/188、190/192、194/202、210/212、214/216、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、266/274、282/284、286/288、290/298、306/308、310/312、314/322、330/332、334/336、338/346、354/356、358/360、362/370、378/380、382/384、386/394、402/404、406/408、410/418、426/428、430/432、434/442、450/452、454/456、458/466、474/476、478/480、482/490、498/500以及502/504。在一個具體例中,該抗體或其片段含有一被包含在具有選自於下列SEQ ID NO之胺基酸序列對的HCVR以及LCVR內的CDR序列:18/20、42/44、66/68、162/164、210/212、266/274以及434/442。
在另一態樣,本發明提供編碼抗-Ang-2抗體或其片段的核酸分子。帶有本發明之核酸的重組型表現載體,以及已引入此等載體的宿主細胞,與藉由在允許生產抗體的條件下培養宿主細胞來生產抗體,以及回收所生產的抗體的方法一樣亦被本發明所涵括。
在一個具體例中,本發明提供一種抗體或其片段,其包含有一由選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的核酸序列所編碼的HCVR:1、17、21、25、41、45、49、65、69、73、89、93、97、113、117、121、137、141、145、161、165、169、185、189、193、209、213、217、233、237、241、257、261、265、281、285、289、305、309、313、329、333、337、353、357、361、377、381、385、401、405、409、425、429、433、449、453、457、473、477、481、497、501、505、513以及515,或其實質上與它具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的相同序列。在一個具體例中,該抗體或其片段包含有一由選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的核酸序列所編碼的HCVR:17、41、65、161、209、265以及433。
在一個具體例中,本發明提供一種抗體或其片段,它包含有一由選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的核酸序列所編碼的LCVR:9、19、23、33、43、47、57、67、71、81、91、95、105、115、119、129、139、143、153、163、167、177、187、191、201、211、215、225、235、239、249、259、263、273、283、287、297、307、311、321、331、335、345、355、359、369、379、383、393、403、407、417、427、431、441、451、455、465、475、479、489、499以及503,或其實質上與它具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的相同序列。在一個具體例中,該抗體或其片段包含有一由選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的核酸序列所編碼的LCVR:19、43、67、163、211、273以及441。
在一個具體例中,本發明提供一種抗體或抗體的抗原-結合片段,它包含有一由選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的核苷酸序列所編碼的HCDR3功能域:7、31、55、79、103、127、151、175、199、223、247、271、295、319、343、367、391、415、439、463、487以及511,或實質上與它具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的相同序列;以及一由選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的核苷酸序列所編碼的LCDR3功能域:15、39、63、87、111、135、159、183、207、231、255、279、303、327、351、375、399、423、447、471以及495,或實質上與它具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的相同序列。在一個具體例中,該抗體或其片段包含有由選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的核酸序列對所編碼的HCDR3以及LCDR3序列:7/15、31/39、55/63、151/159、199/207、271/279以及439/447。
在又一個具體例中,該抗體或其片段進一步包含有:一HCDR1功能域,由選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的核苷酸序列所編碼:3、27、51、75、99、123、147、171、195、219、243、267、291、315、339、363、387、411、435、459、483以及507,或實質上與它具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的相同序列;一HCDR2功能域,由選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的核苷酸序列所編碼:5、29、53、77、101、125、149、173、197、221、245、269、293、317、341、365、389、413、437、461、485以及509,或實質上與它具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的相同序列;一LCDR1功能域,由選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的核苷酸序列所編碼:11、35、59、83、107、131、155、179、203、227、251、275、299、323、347、371、395、419、443、467以及491,或實質上與它具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的相同序列;以及一LCDR2功能域,由選自於由下列SEQ ID NO所構成之群組的核苷酸序列所編碼:13、37、61、85、109、133、157、181、205、229、253、277、301、325、349、373、397、421、445、469以及493,或實質上與它具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的相同序列。
在一個具體例中,該抗體或其片段包含有由下列核酸序列所編碼的重鏈以及輕鏈CDR序列:SEQ ID NO:17與19;SEQ ID NO:41與43;SEQ ID NO:65與67;SEQ ID NO:161與163;SEQ ID NO:209與211;SEQ ID NO:265與273;或SEQ ID NO:433與441。
本發明涵括帶有經修飾之醣化形式(glycosylation pattern)的抗-Ang-2抗體。在某些應用中,移除非所欲醣化位址的修飾可能是有用的。舉例來說,本發明涵括本文所提出的任一種抗體的修飾形式,其中修飾形式在寡醣鏈上缺乏岩藻糖基團(moiety)存在,例如,以增高抗體依賴型細胞性細胞毒性(ADCC)作用(參見Shield et al.(2002) JBC 277:26733)。在其他應用中,為了修飾補體依賴型細胞毒性(CDC),可以作半乳糖基化修飾。
在另一態樣,本發明提供一種包含有重組型人類抗體或其片段的醫藥組成物以及一醫藥上可接受的載體或稀釋劑,該重組型人類抗體或其片段專一地結合Ang-2。在一相關態樣,本發明涉及一種組成物,其為Ang-2抑制劑以及第二治療劑的組合。在一個具體例中,該Ang-2抑制劑是一種抗體或其片段。在一個具體例中,該第二治療劑是任一種有利於與Ang-2抑制劑組合的藥劑。在不受限制的情況下,有利於與Ang-2抑制劑組合的例示性藥劑包括任一種會抑制或減低血管生成的藥劑、其他癌治療劑、抗發炎劑、細胞激素(cytokine)抑制劑、生長因子抑制劑、抗造血因子、非類固醇抗發炎藥(NSAIDs)、抗病毒劑以及抗生素。
在又另一態樣,本發明提供使用本發明的抗-Ang-2抗體或該抗體的抗原-結合部分以抑制Ang-2活性的方法,其中該等治療方法包含有投與一治療有效量的醫藥組成物,該醫藥組成物包含有本發明之抗體或抗體之抗原-結合片段。所治療的不適症是任一種可以藉由移除、抑制或減低Ang-2活性而被增進、改善、抑制或預防的疾病或病況。較佳地,本發明之抗-Ang-2抗體或抗體片段可應用於治療任一種由血管生成過程所引起、相關或惡化的疾病或病況。在本發明的某些具體例中,該抗-Ang-2抗體或其抗原-結合部分可應用於治療癌症。在癌症治療的情況下,本發明的抗-Ang-2抗體或其抗原-結合部分可以單獨或組合其他抗癌治療抗體、化學治療劑和/或放射治療一起投藥。在本發明的其他具體例中,該抗-Ang-2抗體或其抗原-結合片段可應用於治療一或多種眼疾,例如,老化相關的斑點退化(age-related macular degeneration)、糖尿病視網膜病變等等,和/或一或多種發炎或傳染病。
從回顧隨後的詳細說明,其他具體例將變得清楚。
在說明本發明之前,要理解的是本發明不限定於所述的特定方法以及實驗條件,因為此等方法以及條件可能會改變。也要理解的是本文所使用的術語僅是作為說明特定具體例之用,而並非意欲為限制,因為本發明的範圍僅受隨附之申請專利範圍所限制。
除非另有定義,所有本文使用的技術以及科學術語具有與本發明所屬技藝中具有通常技藝者普遍理解相同的意思。如本文所使用的術語“約”,當使用在有關特定引用的數值時,表示該數值可自所引用的數值起改變達不超過1%。舉例來說,如本文所使用者,詞句“約100”包括99與101以及其間的所有數值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等等)。
儘管任何類似或等同於本文所述的方法以及材料可應用於本發明的實施或測試,現將說明較佳的方法以及材料。
如本文所使用者,術語“血管生成素-2”或“Ang-2”意指人類Ang-2或其生物學上有活性的片段(例如,能夠在活體外或活體內誘發血管生成的Ang-2蛋白質的片段),除非另有指明來自於非人類物種(例如“小鼠Ang-2”或“猴Ang-2”等等)。人類Ang-2是由顯示於SEQ ID NO:517的核酸序列所編碼,並且具有SEQ ID NO:518的胺基酸序列。小鼠以及猴Ang-2蛋白質的胺基酸序列可分別依據登錄編號NP_031452以及BAE89705.1而從NCBI蛋白質序列資料庫取得。
術語“血管生成素-1”或“Ang-1”意指人類Ang-1或其生物學上有活性的片段,除非另有指明來自於非人類物種(例如“小鼠Ang-1”、“猴Ang-1”等等)。人類Ang-1具有如NCBI蛋白質序列資料庫中依據登錄編號AAB50557所載示的胺基酸序列。術語“Tie-2”(在本技藝中亦意指為“TEK”)意指人類Tie-2或其生物學上有活性的片段,除非另有指明來自於非人類物種(例如“小鼠Tie-2”、“猴Tie-2”等等)。人類Tie-2具有如NCBI蛋白質序列資料庫中依據登錄編號AAA61130所載示的胺基酸序列。
如本文所使用者,術語“抗體”欲意指包含有4條多胜肽鏈(藉由雙硫鍵而交互連結的2條重鏈(H)以及2條輕鏈(L))的免疫球蛋白分子,還有其集合體(multimer)(例如IgM)。各個重鏈含有1個重鏈可變區域(本文縮寫為HCVR或VH)以及1個重鏈恆定區域。重鏈恆定區域含有3個功能域,CH1、CH2以及CH3。各個輕鏈含有1個輕鏈可變區域(本文縮寫為LCVR或VL)以及1個輕鏈恆定區域。輕鏈恆定區域含有1個功能域(CL1)。VH與VL區域可進一步分為具有超變異性(hypervariability)的區域,被命名為互補決定區域(complementarity determining regions,CDRs),散佈有較為守恆的區域(命名為骨架區域(FR))。各個VH與VL由3個CDRs以及4個FRs所構成,以下列順序從胺基-端往羧基-端排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發明的不同具體例中,抗-Ang-2抗體(或其抗原-結合部分)的FRs可能相同於人類生殖細胞序列,或者可能是天然或經人工修飾的。胺基酸共同序列可以根據並列分析2或多個CDRs而被確定。
如本文所使用的,術語“抗體”亦包括完整抗體分子的抗原-結合片段。如本文所使用的,術語抗體的“抗原-結合部分”、抗體的“抗原-結合片段”以及類似者包括任何專一地結合抗原以形成複合物之天然存在、酵素上可獲得的、合成的或遺傳工程化的多胜肽或醣蛋白。抗體的抗原-結合片段可以使用任何適當的標準技術(諸如蛋白溶解消化,或涉及操作與表現編碼抗體可變及選擇性恆定功能域之DNA的重組遺傳工程技術)而從例如完整的抗體分子衍生而來。這樣的DNA是已知的和/或易於從例如商業來源、DNA庫(包括,例如噬菌體-抗體庫)獲得或可以被合成。舉例來說,DNA可以被定序或在化學上操作或藉由使用分子生物學技術將一或多個可變和/或恆定功能域重排成適當的型態,或引入密碼子、產生半胱胺酸殘基、修飾、加入或刪除胺基酸等等。
抗原-結合片段的非限定實例包括:(i)Fab片段;(ii)F(ab’)2片段;(iii)Fd片段;(iv)Fv片段;(v)單鏈Fv(ScFv)分子;(vi)dAb片段;以及(vii)由模擬抗體之超變異區域的胺基酸殘基所構成的最小辨識單位(例如,分離的互補決定區域(CDR))。其他經工程化的分子,諸如雙鍵抗體(diabodies)、三鍵抗體(triabodies)、四鍵抗體(tetrabodies)以及微抗體(minibodies)亦涵括在如本文所使用的詞句“抗原-結合片段”內。
抗體的抗原-結合片段典型地會包含有至少1個可變功能域。該可變功能域可能是任何的大小或胺基酸組成物並且通常會包含有至少1個鄰接一或多個骨架序列或在一或多個骨架序列內的CDR。在帶有與VL功能域締合之VH功能域的抗原-結合片段中,VH與VL功能域可以任何適當的排列順序彼此相對。舉例來說,可變區域可以是二聚體並且含有VH-VH、VH-VL或VL-VH二聚體。另擇地,抗體的抗原-結合片段可含有單體VH或VL功能域。
在某些具體例中,抗體的抗原-結合片段可含有至少1個共價連結至少1個恆定功能域的可變功能域。可以在本發明之抗體的抗原-結合片段中發現到的可變與恆定功能域的非限定例示性型態包括:(i) VH-CH1;(ii) VH-CH2;(iii) VH-CH3;(iv) VH-CH1-CH2;(v) VH-CH1-CH2-CH3;(vi) VH-CH2-CH3;(vii) VH-CL;(viii) VL-CH1;(ix) VL-CH2;(x) VL-CH3;(xi) VL-CH1-CH2;(xii) VL-CH1-CH2-CH3;(xiii) VL-CH2-CH3;以及(xiv) VL-CL。在可變與恆定功能域的任一種型態中(包括上面列示的任一種例示性型態),可變與恆定功能域可以是彼此直接連結或藉由完整或部分樞紐(hinge)或連接子(linker)區域而連結。樞紐區域是由至少2個(例如5、10、15、20、40、60或更多個)胺基酸所構成,它在單一多胜肽分子中的相鄰可變和/或恆定功能域間導致彈性或半彈性鍵聯。此外,本發明之抗體的抗原-結合片段可包含有上列可變與恆定功能域型態的任一者彼此和/或與一或多個單體VH或VL功能域以非共價締合(例如藉由雙硫鍵(等))所形成的同型二聚體或異型二聚體(或其他集合體)。
就完整抗體分子而言,抗原-結合片段可以是單專一性或多專一性(例如雙專一性)。抗體的多專一性抗原-結合片段典型包含有至少2個不同可變功能域,其中各個可變功能域能夠專一地結合至個別抗原或相同抗原上的不同抗原決定位。任一種多專一性抗體形式,包括本文所揭示的例示性雙專一性抗體形式,可使用該技藝中可獲得之慣用技術而改造成使用於本發明之抗體的抗原-結合片段中。
抗體的恆定區域在抗體固定補體以及媒介細胞依賴型細胞毒性上的能力是重要的。因此,抗體的同型(isotype)可以依據抗體是否要媒介細胞毒性來選定。
如本文所使用者,術語“人類抗體”欲包括帶有從人類生殖細胞免疫球蛋白序列衍生而來之可變以及恆定區域的抗體。本發明的人類抗體包括非由人類生殖細胞免疫球蛋白序列所編碼的胺基酸殘基(例如在活體外藉由隨機或位址-專一性突變誘發或藉由在活體內體突變而引入的突變),例如,在CDRs以及特別是在CDR3中。然而,術語“人類抗體”如本文所使用的,未意欲要包括自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)衍生而來之生殖細胞的CDR序列(已被接枝至人類骨架序列上的抗體)。
如本文所使用者,術語“重組型人類抗體”意欲包括所有藉由重組方法製備、表現、生產或經單離的人類抗體,諸如使用重組型表現載體轉染至宿主細胞中而表現的抗體(如下進一步說明)、由重組型、組合型人類抗體庫所單離出的抗體(如下進一步說明)、分離自經人類免疫球蛋白基因轉殖的動物(例如小鼠)的抗體(參見例如Taylor et al.(1992)Nucl. Acids Res. 20:6287-6295)或藉由任何涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的方法所製備、表現、生產或單離的抗體。此等重組型人類抗體具有自人類生殖細胞免疫球蛋白序列衍生而來的可變以及恆定區域。然而在某些具體例中,此等重組型人類抗體進行活體外突變誘發(或當使用經人類Ig序列轉殖的動物,活體內體細胞突變誘發),而因此重組型抗體的VH與VL區域之胺基酸序列是自人類生殖細胞VH與VL序列衍生而來或與人類生殖細胞VH與VL序列相關時,並不是活體內天然存在於人類抗體生殖細胞全部序列中。
人類抗體能夠以2種與樞紐異質性締合的形式存在。在一種形式中,免疫球蛋白分子包含有約150-160 kDa的穩定4鏈建構物,其中二聚體藉由鏈間重鏈雙硫鍵而扣持在一起。在第2種形式中,二聚體並非經由鏈間雙硫鍵而連結以及約75-80 kDa的分子是由輕鏈與重鏈(半-抗體)共價偶合所形成的。這些形式即使在親和性純化之後也非常難以分離。
在各種完整IgG同型中,第二種形式的出現頻率是因為,但不限於與抗體的樞紐區域同型有關聯的結構差異。在人類IgG4樞紐的樞紐區域中,單一胺基酸置換可能會將第二種形式的出現明顯減低至使用人類IgG1樞紐典型所觀察到的位準(Angel et al.(1993) Molecular Immunology 30:105)。本發明涵括在樞紐(CH2或CH3區域)中帶有一或多個突變的抗體,舉例來說,其在生產以增進所欲抗體形式之產率方面可能是所欲的。
如本文所使用者,“經單離的抗體”欲意指實質上沒有其他具有不同抗原專一性之抗體的抗體(例如,專一地結合人類Ang-2或人類Ang-2片段的經單離抗體實質上沒有專一地結合人類Ang-2以外之抗原的抗體)。術語“專一地結合”或類似者意指抗體或其抗原-結合片段與抗原形成一個在生理條件下相對穩定的複合物。專一性結合的特徵可以是約1x10-8 M或更低的KD。用於決定2個分子是否專一地結合的方法在該技藝中為習知的並包括,例如,平衡透析、表面電漿共振以及類似者。但是,專一地結合人類Ang-2的經單離抗體可能具有與其他抗原(諸如來自於其他物種的Ang-2分子)有交叉反應性。此外,經單離抗體可能實質上沒有其他細胞物質和/或化學品。
如本文所使用者,“中和”或“阻斷”抗體欲意指一種結合至Ang-2而阻斷Ang-2與其受體(Tie-2)交互作用和/或致使Ang-2的至少1種生物功能受到抑制的抗體。由Ang-2中和或阻斷抗體所引起的抑制不必然是完全的,只要它能夠使用適當的分析而被偵測到。用於偵測Ang-2抑制的例示性分析說明於本文的他處。
與對應的生殖細胞序列相較之下,本文所揭示的完整-人類抗-Ang-2抗體在骨架和/或重鏈以及輕鏈可變功能域的CDR區域處可包含有一或多個胺基酸置換、***和/或刪除。此等突變可易於藉由將本文所揭示的胺基酸序列與可得自於例如公開抗體序列資料庫的生殖細胞序列相比對而確認。本發明包括抗體及其抗原-結合片段,它們是自本文所揭示的任何胺基酸序列衍生而來,其中在一或多個骨架和/或CDR區域內的一或多個胺基酸回復突變成對應的生殖細胞殘基(等)或回復突變成對應生殖細胞殘基(等)的守恆性胺基酸置換(天然或非天然)(這樣的序列改變於此意指為“生殖細胞回復突變”)。該技藝中具有通常知識者,由本文所揭示的重鏈以及輕鏈可變區域序列開始,可容易地製造出眾多抗體以及抗原-結合片段,它們包含有一或多個獨立的生殖細胞回復突變或其組合。在某些具體例中,所有在骨架和/或VH和/或VL功能域中的CDR殘基突變回復成生殖細胞序列。在其他具體例中,僅有某些殘基突變回復成生殖細胞序列,例如僅僅在FR1的前8個胺基酸或FR4的最後8個胺基酸中被發現到有突變殘基,或僅僅在CDR1、CDR2或CDR3中發現到有突變殘基。再者,本發明的抗體在骨架和/或CDR區域內可含有2或多個生殖細胞回復突變的組合,亦即,其中某些單獨殘基突變回復成生殖細胞序列,而某些其他不同於生殖細胞序列的殘基仍保留著。在得到之後,含有一或多個生殖細胞回復突變的抗體以及抗原-結合片段可易於測試一或多個所欲特性,諸如增進的結合專一性、增高的結合親和性、增進或增高的拮抗或促效生物特性(視情況)、降低的免疫原性等等。以這樣一般方法所得到的抗體以及抗原-結合片段涵括在本發明中。
本發明亦包括抗-Ang-2抗體,其包含有本文所揭示之具有一或多個守恆性置換的HCVR、LCVR和/或CDR胺基酸序列任一者的變異體。舉例來說,相對於本文所揭示的HCVR、LCVR和/或CDR胺基酸序列任一者,本發明包括具有HCVR、LCVR和/或CDR胺基酸序列有例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少個等守恆性胺基酸置換的抗-Ang-2抗體。在一個具體例中,該抗體包含有一具有SEQ ID NO:18(有8個或更少個守恆性胺基酸置換)之胺基酸序列的HCVR。在另一個具體例中,該抗體包含有一具有SEQ ID NO:18(有6個或更少個守恆性胺基酸置換)之胺基酸序列的HCVR。在另一個具體例中,該抗體包含有一具有SEQ ID NO:18(有4個或更少個守恆性胺基酸置換)之胺基酸序列的HCVR。在另一個具體例中,該抗體包含有一具有SEQ ID NO:18(有2個或更少個守恆性胺基酸置換)之胺基酸序列的HCVR。在一個具體例中,該抗體包含有一具有SEQ ID NO:20(有8個或更少個守恆性胺基酸置換)之胺基酸序列的LCVR。在另一個具體例中,該抗體包含有一具有SEQ ID NO:20(有6個或更少個守恆性胺基酸置換)之胺基酸序列的LCVR。在另一個具體例中,該抗體包含有一具有SEQ ID NO:20(有4個或更少個守恆性胺基酸置換)之胺基酸序列的LCVR。在另一個具體例中,該抗體包含有一具有SEQ ID NO:20(有2個或更少個守恆性胺基酸置換)之胺基酸序列的LCVR。
如本文所使用者,術語“表面電漿共振”,意指一種藉由在生物偵測器基質中偵測蛋白質濃度改變而容許分析即時交互作用的光學現象(例如使用BIAcoreTM系統(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare,Piscataway,NJ))。
如本文所使用者,術語“KD”,欲意指特定抗體-抗原交互作用的平衡解離常數。
術語“抗原決定位”意指在抗體分子的變異區域中與特定抗原結合位址交互反應的抗原性決定位,已知為互補位(paratope)。單一抗原可能具有超過1個的抗原決定位。因此,不同的抗體可能會結合至抗原上的不同區域並且可能具有不同的生物效用。抗原決定位可能是具有構像或線性的。構像抗原決定位是藉由在空間上將線性多胜肽鏈的不同節段的胺基酸並排而產生。線性抗原決定位是藉由在多胜肽鏈中的相鄰胺基酸殘基而產生。在某些情況下,抗原決定位可能在抗原上包括醣、磷酸基基團或磺醯基基團的部分。
當意指核酸或其片段時,術語“實質同一性”或“實質上相同”表示當帶有適當核苷酸***或刪除而與另一個核酸(或其互補股)最適排列時,有至少約95%的核苷酸序列同一性,以及更佳地至少約96%、97%、98%或99%的核苷酸鹼基,依照藉由序列同一性的任何已知演算法(諸如FASTA、BLAST或Gap,如下所討論)所測量的。在某些情況下,帶有實質上與參考核酸分子相同的核酸分子編碼一具有相對於由參考核酸分子所編碼之多胜肽相同或實質上相似的胺基酸序列之多胜肽。
當應用於多胜肽時,術語“實質相似性”或“實質上相似”表示當最適排列(諸如藉由程式GAP或使用預設空位權重的BESTFIT)時,2個胜肽序列共有至少95%序列同一性,又更佳地至少98%或99%序列同一性。較佳地,不完全相同的殘基位置是因為守恆性胺基酸置換而有所差異。“守恆性胺基酸置換”是一種胺基酸殘基置換成另一種帶有類似化學性質(例如電荷或疏水性)之側鏈(R基團)的胺基酸殘基。一般來說,守恆性胺基酸置換實質上不會改變蛋白質的官能性質。在2或多個胺基酸序列彼此不同是在於守恆性置換的情況下,百分比序列同一性或相似性程度可以向上調整而校正置換的守恆性質。用來做這個調整的方法對於習於該技藝者來說是熟知的。參見,例如Pearson(1994)Methods Mol. Biol. 24:307-331。帶有具類似化學性質的側鏈之胺基酸的基團實例包括(1)脂肪族側鏈:甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸與異白胺酸;(2)脂肪族-羥基側鏈:絲胺酸與蘇胺酸;(3)含醯胺的側鏈:天門冬醯胺酸與麩醯胺酸;(4)芳族側鏈:***酸、酪胺酸與色胺酸;(5)鹼性側鏈:離胺酸、精胺酸與組胺酸;(6)酸性側鏈:天門冬胺酸與麩胺酸;以及(7)含硫側鏈為半胱胺酸與甲硫胺酸。較佳的守恆性胺基酸置換基團為:纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、***酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、天門冬胺酸-麩胺酸,以及天門冬醯胺酸-麩醯胺酸。或者,守恆性置換可以是任何在Gonnet et al.(1992) Science 256:1443-1445的PAM250對數-相似矩陣中具有正值的改變。“適度守恆”置換是任何在PAM250對數-相似矩陣中具有非負值的改變。
有關多胜肽的序列相似性,其亦可意指為序列同一性,典型是使用序列分析軟體來測量。蛋白質分析軟體使用分派給各種置換、刪除以及其他修飾(包括守恆性胺基酸置換)的相似性的測量法來配對相似序列。例如,GCG軟體含有諸如Gap與Bestfit的程式,它們可以與預設參數一起使用以決定關係相近之多胜肽(諸如來自於不同物種之生物的同源性多胜肽)或野生型蛋白質與其突變蛋白質之間的序列同源性或序列同一性。參見,例如GCG版本6.1。多胜肽序列也可以使用採預設或建議參數的FASTA(一種在GCG版本6.1中的程式)來比對。FASTA(例如FASTA2與FASTA3)提供查詢以及研究序列之間最多重複區域的排列以及百分比序列同一性(Pearson(2000)上文)。當要將本發明的序列與含有大量來自不同生物之序列的資料庫比對時,另一個較佳的演算法是電腦程式BLAST,特別是BLASTP或TBLASTN,使用預設參數。參見,例如Altschul et al.(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410以及Altschul et al.(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402。
用於生成包括完整人類單株抗體之單株抗體的方法在該技藝中是已知的。任何此種已知方法可用於本發明的上下文內以製造出專一地結合至人類Ang-2並具有一或多個任何本文所揭示之例示性抗-Ang-2抗體的抗原-結合和/或功能特性的人類抗體。
使用VELOCIMMUNETM技術或任何其他已知的方法以生成單株抗體,帶有人類可變區域以及小鼠恆定區域之對Ang-2具高親和性的嵌合抗體首先單離出來。如同在下面實驗段中,鑑定抗體的特徵並且篩選所欲的特性,包括親和性、選擇性、抗原決定位等等。小鼠恆定區域置換成所欲的人類恆定區域以生成本發明的完整人類抗體,例如野生型或經修飾的IgG1或IgG4。雖然篩選出的恆定區域可能依據特定用途、可變區域中的高親和性抗原-結合以及標的專一性特性而改變。
本發明的抗-Ang-2抗體以及抗體片段涵括帶有由那些所述抗體變化而來之胺基酸序列,但仍保有結合人類Ang-2能力的蛋白質。當與親代序列相較之下,此等變異抗體以及抗體片段包含有一或多個胺基酸加入、刪除或置換,但仍展現出基本上與所述抗體等效的生物活性。同樣地,當與所揭示的序列相較之下,本發明之抗-Ang-2抗體編碼DNA序列涵括包含有一或多個核苷酸加入、刪除或置換,但仍編碼基本上與本發明之抗-Ang-2抗體或抗體片段生物等效的抗-Ang-2抗體或抗體片段的序列。上面詳述此等變異胺基酸以及DNA序列的實例。
舉例來說,若2個抗原-結合蛋白或抗體是醫藥等效物或醫藥代用品以相同莫耳劑量在類似實驗條件下投藥的吸收速率或程度未顯示出明顯差異,不論是單一劑量或多劑量,它們被視為生物等效的。若一些抗體在它們的吸收程度上相等但在它們的吸收速率上不相等,它們將會被視為等效物或醫藥代用品,並且還是會因為此等在吸收速率上的差異是有目的並且在標定上被反映出來,對於在例如長期使用上維持有效生體藥物濃度來說不是必要的,並且會被視為生物等效,而就所研究的特定藥物產品來說被視為在醫學上沒有差異。
在一個具體例中,若2個抗原-結合蛋白就臨床而言在其安全性、純度以及效力上並無有意義的差異,它們是生物等效的。
在一個具體例中,若患者在參考產品與生物產品之間可以改變一或多次而沒有預期增高不良反應的風險(包括與持續治療而沒有這樣切換的情況下,在免疫原性上的臨床顯著變化,或減低有效性)時,2個抗原-結合蛋白是生物等效的。
在一個具體例中,若2個抗原-結合蛋白就條件或使用條件來說均藉由共同的機制或作用機制而作用達致此等機制已知的程度,它們是生物等效的。
生物等效性可以藉由活體內或活體內方法證實。生物等效性測量法包括,例如(a)在人類或其他哺乳動物體內活體內測試,其中隨著時間函數測量抗體或其代謝物在血液、血漿、血清或其他生物液中的濃度;(b)已使用人類活體內生物可利用性數據校正並且可合理預測的活體外測試;(c)在人類或其他哺乳動物體內活體內測試,其中隨著時間函數測量抗體(或其標的)之適當急性藥理學效用;以及(d)在已證實抗體的安全性、效力或生物可利用性或生物等效性的充分控制臨床試驗中。
本發明之抗-Ang-2抗體的生物等效變異體可以藉由,例如,製造各種殘基或序列置換,或刪除不是生物活性所必須的末端或內部殘基或序列而建構。舉例來說,對於生物活性來說不是必要的半胱胺酸殘基可以被刪除或置換成其他會防止不必要或不正確分子間雙硫橋在再復性之後形成的胺基酸。
一般來說,當藉由結合至固定在固相或在溶液相中的抗原來測量時,本發明的抗體以少於100 pM的KD結合至人類Ang-2,典型地以少於50 pM的KD,以及在某些具體例中以少於40 pM的KD。
此外,本發明的某些例示性抗-Ang-2抗體展現出一或多種下列特性:(1)結合至人類Ang-2而非小鼠Ang-2的能力;(2)結合至人類Ang-2以及小鼠Ang-2的能力;(3)結合至人類Ang-2而非人類Ang-1、-3或-4的能力;(4)結合至人類Ang-2而非小鼠Ang-1、-3或-4的能力;(5)結合至人類Ang-2以及人類Ang-1、-3或-4的能力;(6)結合至人類Ang-2以及小鼠Ang-1、-3或-4的能力;(7)阻斷人類Ang-2結合至人類Tie-2的能力;(8)阻斷人類Ang-2結合至小鼠Tie-2的能力;(9)阻斷小鼠Ang-2結合至人類Tie-2的能力;(10)阻斷小鼠Ang-2結合至小鼠Tie-2的能力;(11)阻斷人類Ang-1結合至人類Tie-2的能力;(12)阻斷人類Ang-1結合至小鼠Tie-2的能力;(13)阻斷小鼠Ang-1結合至人類Tie-2的能力;(14)阻斷小鼠Ang-1結合至小鼠Tie-2的能力;(15)抑制人類Ang-2誘發人類Tie-2磷酸化的能力;(16)抑制人類-Ang-2誘發小鼠Tie-2磷酸化的能力;(17)抑制小鼠Ang-2誘發人類Tie-2磷酸化的能力;(18)抑制小鼠Ang-2誘發小鼠Tie-2磷酸化的能力;(19)抑制人類Ang-1誘發人類Tie-2磷酸化的能力;(20)抑制人類Ang-1誘發小鼠Tie-2磷酸化的能力;(21)抑制小鼠Ang-1誘發人類Tie-2磷酸化的能力;(22)抑制小鼠Ang-1誘發小鼠Tie-2磷酸化的能力;(23)在實驗模型(例如由含有MCF-7細胞的基質膠栓塞皮下植入裸鼠體內而誘發血管生成)中抑制活體內血管生成的能力;和/或(24)在小鼠異種移植模型中抑制或減低腫瘤體積的能力。
本發明亦包括以高親和性結合至含有Ang-2似纖維連接蛋白功能域但缺乏Ang-2N-端螺旋-螺旋功能域的建構物(此等建構物在此意指為“Ang-2FD”)的抗體。例示性Ang-2FD建構物包括人類Ang-2FD(SEQ ID NO:519)、小鼠Ang-2FD(SEQ ID NO:520),以及猴Ang-2FD(SEQ ID NO:521)。人類、小鼠以及猴Ang-2FD建構物可以是單體或二聚體。Ang-2FD建構物也可以包括其他非-Ang-2胺基酸序列,諸如連結至Ang-2FD分子的人類或小鼠Fc功能域。另一個例示性Ang-2FD建構物在此意指為“hBA2”(或人類“弓-Ang2”),它是一種人類Ang-2似血纖維蛋白原功能域經由人類或小鼠Fc功能域彼此締合而形成似-領結(bow-tie-like)構形的四聚物。hBA2典型是由2個Ang-2二聚體所構成,其中各個Ang-2二聚體含有2個經由Fc功能域彼此連結的Ang-2似血纖維蛋白原功能域。例示性hBA2組份包括命名為hBA2-hIgG1(SEQ ID NO:522)以及hBA2-mIgG2a(SEQ ID NO:523)的多胜肽。本發明的某些抗-Ang-2抗體被發現到出乎預期會以要比已知Ang-2對照組抗體還更高的親和性結合至Ang-2FD建構物(參見本文中所述的實施例)。
在抗-Ang-2抗體結合至人類或小鼠二聚體Ang-2FD建構物的情況下,高親和性結合表示抗-Ang-2抗體以低於300 pM的KD結合人類或小鼠二聚體Ang-2FD。舉例來說,當在25℃下於表面電漿共振分析中測量時,以高親和性結合至人類或小鼠二聚體Ang-2FD的抗-Ang-2抗體包括以低於300 pM、低於250 pM、低於200 pM、低於190 pM、低於180 pM、低於170 pM、低於160 pM、低於150 pM、低於140 pM、低於130 pM、低於120 pM、低於110 pM、低於100 pM、低於90 pM、低於80 pM、低於70 pM、低於60 pM或低於50 pM的KD結合至人類或小鼠二聚體Ang-2FD的抗體。
在抗-Ang-2抗體結合至猴二聚體Ang-2FD建構物的情況下,高親和性結合表示抗-Ang-2抗體以低於500 pM的KD結合至猴二聚體Ang-2FD。舉例來說,當在25℃下於表面電漿共振分析中測量時,以高親和性結合至猴二聚體Ang-2FD的抗-Ang-2抗體包括以低於500 pM、低於450 pM、低於400 pM、低於350 pM、低於300 pM、低於250 pM、低於200 pM、低於190 pM、低於180 pM、低於170 pM、低於160 pM、低於150 pM、低於140 pM、低於130 pM、低於120 pM、低於110 pM、低於100 pM、低於90 pM或低於80 pM的KD結合至猴二聚體Ang-2FD的抗體。
在抗-Ang-2抗體結合至人類單體Ang-2FD建構物的情況下,高親和性結合表示抗-Ang-2抗體以低於40 nM的KD結合人類單體Ang-2FD。舉例來說,當在25℃下於表面電漿共振分析中測量時,以高親和性結合至人類單體Ang-2FD的抗-Ang-2抗體包括以低於40 nM、低於30 nM、低於25 nM、低於20 nM、低於15 nM、低於10 nM、低於9 nM、低於8 nM、低於7 nM、低於6 nM、低於5 nM、低於4 nM、低於3 nM、低於2 nM、低於1 nM、低於0.9 nM、低於0.7 nM或低於0.6 nM的KD結合至人類單體Ang-2FD的抗體。
在抗-Ang-2抗體結合至hBA2建構物的情況下,高親和性結合表示抗-Ang-2抗體以低於80 pM的KD結合hBA2。舉例來說,當在25℃下於表面電漿共振分析中測量時,以高親和性結合至hBA2的抗-Ang-2抗體包括以低於80 pM、低於75 pM、低於70 pM、低於65 pM、低於60 pM、低於55 pM、低於50 pM、低於45 pM、低於40 pM、低於35 pM、低於30 pM、低於25 pM、低於20 pM、低於18 pM、低於16 pM、低於14 pM或低於12 pM的KD結合至hBA2的抗體。
本發明包括結合Ang-2但實質上不會結合Ang-1的抗體。如本文所使用的,當在表面電漿共振分析(抗體捕獲在表面上且濃度約25 nM的全長野生型人類Ang-1在25℃下以約60 μl/min的流速注射通過捕獲有抗體的表面歷時約3分鐘)中測試結合至Ang-1時,若抗體展現出大於約1 nM的KD(例如大於約5 nM、大於約10 nM、大於約50 nM、大於約100 nM、大於約150 nM、大於約200 nM、大於約250 nM、大於約300 nM、大於約350 nM、大於約400 nM、大於約500 nM或更高的KD),抗體“實質上不會結合Ang-1”(參見例如實施例4)。此外,當在這樣的一個分析或其等效分析中測試時,若抗體無法展現結合至Ang-1,抗體“實質上不會結合Ang-1”。
本發明亦包括阻斷Ang-2結合至Tie-2但實質上不會阻斷Ang-1結合至Tie-2的抗體。如本文所使用的,當抗體與Ang-1抗原以約100:1(抗體:抗原)的比例預先混合並容許在25℃下培育歷時約60分鐘並且接著藉由表面電漿共振來測試經校正的混合物通過Tie-2被覆表面(5 μl/min歷時5分鐘,在25℃下)而結合至Tie-2時,若結合至Tie-2的Ang-1數量是在有不相干對照組分子存在下結合至Tie-2的Ang-1數量的至少50%,抗體“實質上不會阻斷Ang-1結合至Tie-2”(參見例如實施例6)。舉例來說,若在與抗體預培育之後,結合至Tie-2的Ang-1數量是在上述實驗條件下與不相干對照組分子預培育之後結合至Tie-2的Ang-1數量的至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少100%,那麼該抗體被視為“實質上不會阻斷Ang-1結合至Tie-2”。
此外,本發明包括阻斷或實質上減弱Ang-2生物活性(例如,Ang-2媒介的Tie-2磷酸化;Ang-2誘發的血管生成;等等),但不會阻斷或實質上不會減弱Ang-1的對應生物活性(例如,Ang-1媒介的Tie-2磷酸化;Ang-1誘發的血管生成;等等)的抗體。可應用於測定抗體是否滿足上列一或多個特質的分析以及測試將會是該技藝中具有通常知識者所易於知悉並且易於實施的和/或可以由本揭示內容中完全清楚。舉例來說,下面詳述的實驗操作步驟可以用來測定一預定抗體會結合或不會結合Ang-2和/或Ang-1;阻斷或不會阻斷Ang-2和/或Ang-1結合至Tie-2;抑制或不會抑制Ang-2和/或Ang-1媒介的Tie-2磷酸化等等。
為了篩選結合至特定抗原決定位的抗體(例如那些會阻斷IgE結合至其高親和性受體者),可施行諸如在“Antibodies”Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中所述的慣用交叉-阻斷分析。其他方法包括丙胺酸篩選突變體、胜肽墨點(Reineke(2004)Methods Mol Biol 248:443-63),或胜肽切割分析。此外,可以採用諸如抗原決定位切除、抗原決定位抽出以及化學修飾抗原的方法(Tomer(2000) Protein Science 9:487-496)。
術語“抗原決定位”意指一個在抗原上B和/或T細胞反應的位址。B細胞抗原決定位可以由連續胺基酸或透過蛋白質的三級摺疊並排的非連續胺基酸而形成。由連續胺基酸所形成的抗原決定位在暴露於變性溶劑時典型會維持著,而由三級摺疊所形成的抗原決定位在以變性溶劑處理時會被破壞。抗原決定位在獨特的空間構形中典型包括至少3個,以及更常見至少5個或8-10個胺基酸。
修飾輔助的剖析(modification-assisted profiling,MAP),亦已知為以抗原結構為基礎的抗體剖析(ASAP),是一種將大量單株抗體(mAbs)針對相同抗原而依據各抗體對化學或酵素修飾之抗原表面的結合圖譜相似性來分類的方法(US 2004/0101920)。各個分類可以反映出清楚不同於另一分類所呈現之抗原決定位或與另一分類所呈現之抗原決定位部分重疊的獨特抗原決定位。這個技術提供快速過濾遺傳上相同的抗體,以使得特徵鑑定可以集中在遺傳上明顯不同的抗體。當應用於融合瘤篩選時,MAP有助於鑑定生產帶有所欲特質之mAbs的罕見融合瘤細胞株。MAP也可以用來將本發明的抗-Ang-2抗體區分成結合不同抗原決定位的抗體群。
抗-Ang-2抗體可以結合至胺基-端螺旋-螺旋功能域內或羧基-端似血纖維蛋白原功能域(“FD”)內的抗原決定位。在本發明的較佳具體例中,該抗-Ang-2抗體及其抗原結合片段結合至FD內的抗原決定位。
已從晶體結構分析確認出會與Tie-2交互作用之Ang-2的FD內的胺基酸。參見Barton et al.,Nat. Struct. Mol. Biol. 13:524-532(2006年5月)。有關於阻斷Ang-2結合至Tie-2但實質上不會阻斷Ang-1結合至Tie-2的抗體(例如H1H685P,參見下面實施例5與6),此等抗體所結合的抗原決定位可能包括一或多個(a)與Tie-2交互作用並且(b)與Ang-1的對應胺基酸不同之Ang-2的胺基酸。(參見第1圖)。因此,此Ang-2抗體所偏好結合的抗原決定位可包括hAng-2(SEQ ID NO:518)的一或多個下列胺基酸:S-417;K-432;I-434;N-467;F-469;Y-475;或S-480。舉例來說,本發明人等已發現,與Ang-2的胺基酸F-469、Y475以及S-480(SEQ ID NO:518)交互作用的抗體偏好與Ang-2交互作用更甚於與Ang-1,而這個偏好結合可能具有治療益處。因此,本發明包括專一地結合人類血管生成素-2(hAng-2)但實質上不會結合hAng-1的抗-Ang-2抗體,其中該等抗體結合hAng-2(SEQ ID NO:518)上的一個抗原決定位,其包含有胺基酸F-469、Y475以及S-480。同樣地,本發明包括阻斷hAng-2結合至hTie-2但實質上不會阻斷hAng-1結合至hTie-2的抗-Ang-2抗體,其中該等抗體結合hAng-2(SEQ ID NO:518)上的一個抗原決定位,其包含有胺基酸F-469、Y475以及S-480。
本發明包括結合至相同抗原決定位的抗-Ang-2抗體,如同本文所述特定例示性抗體的任一者(例如H1H685、H1H690、H1H691、H1H696、H1H706、H1M724和/或H2M744)。同樣地,本發明亦包括與本文所述的特定例示性抗體的任一者(例如H1H685、H1H690、H1H691、H1H696、H1H706、H1M724和/或H2M744)競爭結合至Ang-2的抗-Ang-2抗體。
藉由使用該技藝中所熟知的慣用方法,吾人可易於決定抗體是否如同參考抗-Ang-2抗體般結合至相同抗原決定位,或與參考抗-Ang-2抗體競爭結合。舉例來說,為決定測試抗體是否如同本發明的參考抗-Ang-2抗體般結合至相同抗原決定位,容許參考抗體在飽和條件下結合至Ang-2蛋白質或胜肽。接著,評估測試抗體結合至Ang-2分子的能力。若測試抗體能夠在參考抗-Ang-2抗體飽和結合的情況下結合至Ang-2,可以推斷測試抗體結合至參考抗-Ang-2抗體以外的不同抗原決定位。另一方面,若測試抗體無法在參考抗-Ang-2抗體飽和結合的情況下結合至Ang-2分子,那麼測試抗體可能結合至與本發明之參考抗-Ang-2抗體所結合之抗原決定位相同的抗原決定位。接而可以實行額外的慣用實驗(例如胜肽突變以及結合分析)以確認被觀察到測試抗體沒有結合事實上是因為結合至與參考抗體相同的抗原決定位或若空間阻斷(或另一種現象)是被觀察到沒有結合的原因。可以使用ELISA、RIA、Biacore、流動式細胞測量術或任何其他在該技藝中可供使用之定量或定性抗體-結合分析來執行這類的實驗。依照本發明的某些具體例,當在競爭性結合分析中測量(參見,例如Junghans et al.,Cancer Res. 1990:50:1495-1502)時,2個結合至相同(或重疊)抗原決定位的抗體,若例如一個過量1-、5-、10-、20-或100-倍的抗體抑制另一者結合達到至少50%,但較佳地75%、90%或甚至是99%。另擇地,若基本上在抗原中所有會減低或消除一抗體結合的胺基酸突變也會減低或消除另一者結合,2個抗體被視為是結合至相同抗原決定位。若僅有一部分會減低或消除一抗體結合的胺基酸突變會減低或消除另一者結合,2個抗體被視為是具有“重疊的抗原決定位”。
為決定抗體是否會與參考抗-Ang-2抗體競爭結合,從2個方面實施上述結合方法學:就第1個方面,容許參考抗體在飽和條件下結合至Ang-2分子,接而評估測試抗體結合至Ang-2分子。就第2個方面,容許測試抗體在飽和條件下結合至Ang-2分子,接而評估參考抗體結合至Ang-2分子。若在2個方面中,僅有第一(飽和)抗體能夠結合至Ang-2分子,那麼推斷測試抗體會與參考抗體競爭結合至Ang-2。如同在該技藝中具有通常知識者所知悉的,與參考抗體競爭結合的抗體不必然會結合至與參考抗體相同的抗原決定位,但可能是因為結合重疊或相鄰抗原決定位而在空間上阻斷參考抗體的結合。
依據本發明的某些具體例,抗-Ang-2抗體結合至人類Ang-2而不會結合至源自於其他物種的Ang-2。另擇地,在某些具體例中,本發明的抗-Ang-2抗體結合至人類Ang-2以及源自於一或多個非人類物種的Ang-2。舉例來說,本發明的Ang-2抗體可以結合至人類Ang-2並且視情況結合或不結合至一或多個小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、沙鼠、豬、貓、狗、兔、山羊、綿羊、牛、馬、駱駝、馬來猴、狨猿、恆河猴或黑猩猩Ang-2。
本發明涵括接合至一治療基團(“免疫接合物”)(諸如細胞毒素、化學治療藥物、免疫抑制劑或放射性同位素)的抗-Ang-2單株抗體。細胞毒性劑包括任何對細胞有害的藥劑。用於形成免疫接合物的適當細胞毒性劑以及化學治療劑的實例在該技藝中是已知的,參見例如WO 05/103081。
本發明的抗體可以是單專一性、雙專一性或多專一性。多專一性mAbs可以是對一個標的多胜肽的不同抗原決定位具有專一性或者可能含有對超過一個標的多胜肽具有免疫性的抗原-結合功能域。參見例如Tutt et al.(1999) J. Immunol. 147:60-69。本發明的抗-Ang-2抗體或其部分可以連結至另一個功能性分子(例如另一個胜肽或蛋白質)或與該另一個功能性分子共表現以形成多專一性分子。舉例來說,抗體或其片段在功能上可以連結(例如,藉由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或其他)至一或多個其他分子實體,諸如另一個抗體或抗體片段,以產生帶有第二結合專一性的雙專一性或多專一性抗體。
可以使用於本發明的例示性雙專一性抗體形式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig) CH3功能域以及第二Ig CH3功能域,其中第一與第二Ig CH3功能域因為至少1個胺基酸而彼此不同,以及其中與缺乏該胺基酸差異的雙專一性抗體相較之下,至少1個胺基酸差異會減低該雙專一性抗體結合至蛋白質A。在一個具體例中,該第一Ig CH3功能域結合蛋白質A而該第二Ig CH3功能域含有1個會減低或消除蛋白質A結合的突變,諸如H95R修飾(按照IMGT外顯子編號;按照EU編號為H435R)。該第二CH3功能域可進一步包含有1個Y96F修飾(按照IMGT;按照EU為Y436F)。可以在第二CH3中發現到的更多修飾包括:在IgG1抗體的情況下,D16E、L18M、N44S、K52N、V57M以及V82I(按照IMGT;按照EU為D356E、L358M、N384S、K392V、V397M以及V422I);在IgG2抗體的情況下,N44S、K52N以及V82I(按照IMGT;按照EU為N384S、K392V以及V422I);以及在IgG4抗體的情況下,Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q以及V82I(按照IMGT;按照EU為Q355R、N384S、K392V、V397M、R409K、E419Q以及V422I)。上述雙專一性抗體形式方面的變異在本發明範圍中是可預想的。
本發明提供包含有本發明之抗-Ang-2抗體或其抗原-結合片段的治療組成物。本發明的治療組成物可進一步包含有一或多種醫藥上可接受的載體、賦形劑以及其他併入調配物中以提供改善輸送、遞送、耐受性以及類似者(本文全部意指為“醫藥上可接受的載體或稀釋劑”)的藥劑。可以在對於醫藥化學家來說為熟悉的處方書中找到大量適當的調配物:Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。這些調配物包括,例如粉末、糊劑、軟膏、凝膠、蠟、油、脂質、含有囊泡的脂質(陽離子或陰離子)(諸如LIPOFECTINTM)、DNA接合物、無水吸收糊劑、水中油與油中水乳劑、乳化卡波蠟(Carbowax;具有各種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠以及含有卡波蠟的半固體混合物。亦參見Powell et al.“Compendium of excepients for parenteral formulations”PDA,1998,J Pharm Sci Technol 52:238-311。
抗體的劑量可以視要被投藥的個體的年齡與身材、標的疾病、病況、投藥途徑以及類似者來決定。偏好的劑量典型是依據體重或體表面積計算。當本發明的抗體用於在成人患者體內治療與Ang-2活性有關的病況或疾病時,通常以約0.01至約20 mg/kg體重的單一劑量靜脈內投予本發明之抗體是有益的,更佳地約0.02至約7、約0.03至約5,或約0.05至約3 mg/kg體重。可以視病況的嚴重性調整治療頻率以及持續時間。用於投予Ang-2抗體的有效劑量以及計劃表可以藉由定期評估來監測,並且對應地調整劑量。此外,劑量的物種間比例可以使用該技藝中的已知方法(例如Mordenti et al.,1991,Pharmaceut. Res. 8:1351)來實施。
已知有各種不同的遞送系統並且可用於投予本發明的醫藥組成物,例如封裝在脂質體內、微粒、微膠囊、能夠表現突變病毒的重組型細胞、受體媒介的胞吞作用(參見,例如Wu et al. 1987,J. Biol. Chem. 262:4429-4432)。引入的方法包括,但不限於皮內、肌肉內、腹腔內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜上以及口服途徑。該組成物可以藉由任何習知途徑來投藥,例如藉由輸液或團式(bolus)注射、藉由透過上皮或黏膜內襯(例如口腔黏膜、直腸以及小腸黏膜等等)吸收,並且可以與其他具有生物活性的藥劑一起投藥。投藥可以是全身性或局部的。
本發明的醫藥組成物可以例如使用標準注射針與注射器來皮下或靜脈內投藥。此外,關於皮下遞送,筆式遞送裝置很容易應用於遞送本發明的醫藥組成物。這樣的一種筆式遞送裝置可以是重複使用或拋棄式。可重複使用的筆式遞送裝置通常使用含有醫藥組成物的可換式卡匣。一旦卡匣內的所有醫藥組成物被投藥且卡匣是空的,空的卡匣可易於丟棄並且置換成含有醫藥組成物的新卡匣。那麼筆式遞送裝置可以重複使用。就拋棄式筆式遞送裝置來說,沒有可換式卡匣。更確切地來說,拋棄式筆式遞送裝置在裝置的貯器內預先填充醫藥組成物供選購。一旦貯器沒有醫藥組成物,整個裝置就被丟棄。
許多可重複使用的筆式以及自動注射遞送裝置在皮下遞送本發明之醫藥組成物方面有實用性。實例包括,但不必然限定於AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM pen(Disetronic Medical Systems,Burghdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM pen、HUMALOGTM pen、HUMALIN 70/30TM pen(Eli Lilly and Co.,Indianapois,IN)、NOVOPENTM I、II與III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM pen(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM以及OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany),舉幾個為例。在皮下投遞本發明之醫藥組成物方面有實用性的拋棄式筆式遞送裝置的實例包括,但不必然限於SOLOSTARTM pen(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)以及KWIKPENTM(Eli Lilly)。
就治療眼疾來說,本發明的抗體以及抗原-結合片段可以藉由例如眼部滴劑、結膜下注射、結膜下移植、玻璃體內注射、玻璃體內移植、眼筋膜下(sub-Tenon’s)注射或眼筋膜下移植來投藥。
該醫藥組成物也可以配在囊泡,特別是在脂質體中投藥(參見Langer 1990 Science 249:1527-1533;Treat et al.(1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein and Fidler(eds),Liss,New York,pp.353-365;Lopez-Berestein,ibid.,pp. 317-327;大致上參見出處同上)。
在某些情況下,該醫藥組成物可以以控制釋放系統的方式投遞。在一個具體例中,可以使用泵(參見Lange,上文;Sefton 1987 CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201)。在另一個具體例中,可以使用聚合材料。在又另一個具體例中,控制釋放系統可以置放在組成物之標的鄰近處,因而僅需要全身性劑量的一部分而已(參見,例如Goodson,1984,在Medical Applications of Controlled Release,上文,vol.2,pp. 115-138)。
可注射的製備物可包括用於靜脈內、皮下、皮內以及肌肉內注射、點滴式灌注等等的劑量形式。這些可注射的製備物可以藉由公眾知悉的方法來製備。舉例來說,可注射的製備物可以藉由將上述抗體或其鹽類溶解、懸浮或乳化在習知用於注射的無菌水性媒介或油性媒介中而製備。作為用於注射的水性媒介,有例如生理食鹽水、含有葡萄糖和其他可以與適當助溶劑(諸如醇,(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子性界面活性劑(例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化蓖麻油的聚氧乙烯(50 mol)加成物))一起使用之輔助劑等等的等張溶液可供使用。作為油性媒介,有例如芝麻油、黃豆油(它們可以與諸如苯甲酸苄酯、苄醇等的助溶劑一起使用)等等可供使用。由此所製備的注射劑較佳地填充在適當的安瓿內。
有利地,上述用於口服或非經口使用的醫藥組成物被製備成適於1個劑量活性成分之單位劑量的劑量形式。這種呈1單位劑量的劑量形式包括,例如錠劑、丸劑、囊劑、注射劑(安瓿)、栓劑等等。所含的前述抗體數量通常是1單位劑量中每劑量形式約5至約500 mg;特別是注射劑形式,偏好所述抗體含有約5至約100 mg以及在其他劑量形式約10至約250 mg。
本發明的抗體尤其可應用於治療、預防和/或改善任何與Ang-2活性相關的疾病或不適症,包括與血管生成有關的疾病或不適症。本發明的抗體以及抗原-結合片段可以用來治療例如在腦與腦膜、口咽、肺與氣管分支、胃腸道、男性與女性生殖道、肌肉、骨、皮膚與附肢、結締組織、脾臟、免疫系統、形成血液的細胞與骨髓、肝臟與尿道,以及空間感覺器官(諸如眼)中生成的原發和/或轉移腫瘤。在某些具體例中,本發明的抗體以及抗原-結合片段可以用來治療下列癌症的一或多者:視網膜細胞癌、胰臟癌、乳癌、***癌、惡性神經膠瘤、骨肉瘤、結腸直腸癌、間皮瘤、多發性骨髓瘤、卵巢癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、滑膜肉瘤、甲狀腺炎或黑色素瘤。
本發明的抗體以及抗原-結合片段也可以應用於治療一或多種眼疾。可以使用本發明之抗體以及抗原-結合片段治療的例示性眼疾包括,例如年齡-相關的斑點退化、糖尿病視網膜病變與其他與脈絡膜血管新生、血管滲漏、視網膜水腫和發炎相關的眼疾。此外,本發明的抗-Ang-2抗體可以作為青光眼外科手術的佐劑般投藥以防止早期血-以及***生成並且防止巨噬細胞徵招至青光眼外科手術之後的過濾泡中,以及改善臨床結果。
在本發明的另一個具體例中,抗體或抗原-結合片段可用來治療高血壓、糖尿病(包括非胰島素依賴型糖尿病)、牛皮癬、關節炎(包括類風濕性關節炎)、氣喘、敗血症、腎臟病以及與傷害、中風或腫瘤相關的水腫。
Ang-2表現已證明與各種發炎和/或傳染病的嚴重性相關聯(參見,例如Siner et al.,2009,Shock 31:348-353;Yeo et al.,2008,Proc. Natl. Acad. Sci. (USA):105:17097-17102)。因此,本發明的抗-Ang-2抗體可用來治療、預防或改善一或多種發炎或傳染病。可藉由投予本發明之抗-Ang-2抗體而治療、預防或改善的例示性傳染病包括,但不限於:瘧疾(惡性瘧原蟲感染)、病毒出血熱(例如登革熱)、立克次體感染、毒性休克徵候群、敗血症、C型肝炎、桿狀巴東體感染、利什曼病、分支桿菌感染以及EB病毒感染。
組合療法可包括本發明之抗-Ang-2抗體以及,例如另一種Ang-2拮抗劑(例如,抗-Ang-2抗體、胜肽體或CovX-體,諸如CVX-060(參見US 7,521,425))。本發明之抗-Ang-2抗體也可以與另一種抗血管生成劑一起投藥,諸如,例如VEGF拮抗劑(例如VEGF-Trap,參見例如US 7,087,411(在此亦意指為“VEGF-抑制融合蛋白質”))、抗-VEGF抗體(例如貝伐單抗(bevacizumab))、VEGF受體的小分子激酶抑制劑(例如,舒尼替尼(sunitinib)、蕾莎瓦(sorafenib)或帕唑帕尼(pazopanib))、抗-DLL4抗體(例如,US 2009/0142354中所揭示的抗-DLL4抗體,諸如REGN421等等),或與表皮生長因子受體(EGFR)的拮抗劑(例如抗-EGFR抗體或EGFR活性的小分子抑制劑)一起使用。其他可與本發明的抗-Ang-2抗體一起有益投藥的藥劑包括細胞激素抑制劑(包括小分子細胞激素抑制劑以及結合至諸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18之細胞激素或它們各自受體的抗體)。本發明亦包括含有本文所述之抗-Ang-2抗體的任一者與一或多種VEGF、DLL4、EGFR,或任何上述細胞激素之一者的抑制劑的治療組合,其中該抑制劑是適合體(captamer)、反義股分子、核糖酵素、siRNA、胜肽體、奈米體或抗體片段(例如,Fab片段;F(ab’)2片段;Fd片段;Fv片段;scFv;dAb片段;或其他工程化的分子,諸如雙鍵抗體、三鍵抗體、四鍵抗體、微抗體、迷你抗體以及最小辨識單位)。本發明的抗-Ang-2抗體也可以組合抗病毒劑、抗生素、止痛劑、皮質類固醇和/或NSAIDs一起投藥。本發明的抗-Ang-2抗體也可以作為治療攝生法的部分,該攝生法包括放射線治療和/或傳統化學療法。當組合一或多種額外藥劑時,本發明的抗-Ang-2抗體可以在其他藥劑(等)投藥之前、同時(例如在相同的調配物中或在分開的調配物中)或之後投藥。
本發明的抗-Ang-2抗體也可以用來偵測和/或測量樣品中的Ang-2,例如作診斷之用。舉例來說,抗-Ang-2抗體或其片段可以用來診斷特徵在於異常表現Ang-2(例如過度表現、不足表現、缺乏表現等等)的病況或疾病。有關Ang-2的例示性診斷分析可包含有,例如令得自於一患者的樣品與本發明之抗-Ang-2抗體接觸,其中抗-Ang-2抗體標定有可偵測到的標記或報導分子。或者,未標定的抗-Ang-2抗體可以組合本身可被偵測到標定之二級抗體一起用在診斷應用。可偵測到的標記或報導分子可以是放射性同位素,諸如3H、14C、32P、35S或125I;螢光或化學發光部分,諸如螢光素異氰酸鹽或玫瑰紅;或諸如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化酶,或螢光素酶的酵素。可用來偵測或測量樣品中的Ang-2的特定例示性分析包括酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)以及螢光-活化細胞選別(FACS)。
提出下列實施例來說明那些在該技藝中具有通常知識者如何做出以及使用本發明的方法以及組成物,且並非意欲要限定被發明人視為其發明的範疇。已盡力確保有關所用數字(例如數量、溫度等等)的精度,但應會產生某些實驗誤差以及偏差。除非另有指明,份數係以重量計的份數,分子量為平均分子量,溫度為攝氏溫度,而壓力為在大氣下或接近大氣。
將人類Ang-2抗原與佐劑一起直接投藥給VELOCIMMUNE小鼠(包含有編碼人類免疫球蛋白重鏈以及κ輕鏈可變區域的DNA)以激起免疫反應。抗體免疫反應是藉由Ang-2專一性免疫分析監控。當達致所欲的免疫反應時,收取脾細胞並且與小鼠骨髓瘤細胞融合以保留它們的成活力並形成融合瘤細胞株。篩選並選出融合瘤細胞株以鑑定會生產Ang-2專一性抗體的細胞株。使用這個技術,可以獲得數個抗-Ang-2嵌合抗體(亦即,具有人類可變功能域以及小鼠恆定功能域的抗體);以這個方式所生產出的例示性抗體命名如下:H1M742、H1M727、H1M728、H2M730、H1M732、H1M737、H2M742、H2M743、H2M744、H1M749、H2M750以及H1M810。
抗-Ang-2抗體亦直接從抗原-陽性B細胞中分離出來而沒有融合至骨髓瘤細胞,如同在U.S. 2007/0280945A1中所述般。使用這個方法,可以獲得數個完整人類抗-Ang-2抗體(亦即,具有人類可變功能域以及人類恆定功能域的抗體);以這個方式所生產出的例示性抗體命名如下:H1H685、H1H690、H1H691、H1H693、H1H694、H1H695、H1H696、H1H704、H1H706以及H1H707。
依照本實施例所生產出的例示性抗-Ang-2抗體的生物特性詳細描述於下面的實施例中。
為了分析所生產出之抗體的結構,選殖並定序編碼抗體可變區域的核酸。從抗體的核酸序列以及預測的胺基酸序列,針對各個重鏈可變區域(HCVR)以及輕鏈可變區域(LCVR)鑑定基因利用率(gene usage)(表1)。
表2提出選定抗-Ang-2抗體的重鏈以及輕鏈可變區域胺基酸序列對與它們對應的抗體識別碼。N、P以及G命名意指具有重鏈以及輕鏈的抗體,帶有相同CDR序列但在CDR序列以外的區域(亦即,在骨架區域內)有序列變異的抗體。因此,特定抗體的N、P以及G變異體在它們的重鏈與輕鏈可變區域中具有相同的CDR序列但在骨架區域中含有修飾。
各種對照組建構物(抗-Ang-2抗體以及抗-Ang-2胜肽體)被包括在下面實驗中供比對之用。對照組建構物命名如下:對照組1:人類抗-Ang-2抗體,帶有具如US 2006/0018909中所提及之具有“Ab536(THW)”對應功能域的胺基酸序列的重鏈以及輕鏈可變功能域(亦參見Oliner et al.,2004,Cancer Cell 6:507-516);對照組II:結合人類Ang-2的胜肽體,具有如US 7,205,275中所提及之“2XCon4(C)”的胺基酸序列(亦參見Oliner et al.,2004,Cancer Cell 6:507-516);對照組III:結合人類Ang-2的胜肽體,具有如US 7,138,370中所述之“L1-7”的胺基酸序列;對照組IV:人類抗-Ang-2抗體,帶有具如US 2006/0246071中所提及之“3.19.3”對應功能域的胺基酸序列之重鏈以及輕鏈可變區域;以及對照組V:人類抗-Ang-2抗體,帶有具如WO 2009/097325中所提及之“MEDI1/5”對應功能域的胺基酸序列之重鏈以及輕鏈可變區域。(在每個實施例中並非所有的對照組建構物都有使用到)。在下表中,涵括標記”Ab”以及”Pb”以分別鑑別為抗體以及胜肽體對照組(亦即,對照組1=Ab;對照組II=Pb;對照組III=Pb;對照組IV=Ab;以及對照組V=Ab)。
藉由使用即時生物偵測器表面電漿共振分析的表面動力學,測定有關選定之純化Ang-2抗體結合至接合人類IgG1(SEQ ID NO:528)之人類(SEQ ID NO:519)、小鼠(家鼷鼠;SEQ ID NO:520)以及猴(食蟹猴;SEQ ID NO:521)Ang-2的二聚體似纖維連接蛋白功能域(Ang-2FD)的平衡解離常數(KD值)。在山羊抗-小鼠IgG多株抗體表面、山羊抗-人類κ多株抗體(Southern Biotech,Birmingham,AL)表面或山羊抗-人類IgG多株抗體(Jackson Immuno Research Lab,West Grove,PA)表面(透過胺直接偶合至BIACORETM CM5感測晶片上以形成捕獲抗體表面)上捕獲抗體。將多樣濃度的蛋白質(範圍從50 nM至6.25 nM)以100 μl/min注射通過捕獲抗體表面歷時90秒。在室溫下即時監測抗原-抗體結合與解離。執行動力學分析以計算抗原/抗體複合物解離的KD以及半衰期。結果歸納於下面表3中。
使用被選殖至人類IgG1的選定純化抗-Ang-2抗體重複下列實驗。結果歸納於下面表4中。
在2個不同溫度下使用選定的抗-Ang-2抗體進行額外的結合實驗以進一步評估交叉-物種親和性。以40 μL/min的流速在山羊抗-人類κ多株抗體表面(透過直接化學偶合至BIACORETM晶片上以形成捕獲抗體表面)上捕獲各個選定抗體或對照組建構物歷時1分鐘。人類、猴以及小鼠Ang-2FD-Fc在25 nM或0.78 nM的濃度下以60 μL/min的流速注射通過捕獲抗體表面歷時3分鐘,並且在25℃或37℃下即時監測抗原-抗體解離歷時20分鐘。
結果歸納於下面表5(25℃結合)與表6(37℃結合)中。
在另一個實驗中,針對結合至人類“弓-Ang-2”四聚體建構物(“hBA2”)的選定純化抗體測定(使用上述方法)KD值。hBA2由2個二聚體所構成,各個二聚體含有2個藉由人類Fc功能域而彼此連結的Ang-2似纖維連接蛋白功能域。hBA2的二聚體構成要素的胺基酸序列是以SEQ ID NO:522表示。結果歸納於下面的表7中。
在又另一個實驗中,針對結合至野生型人類Ang-2(hAng-2-WT;SEQ ID NO:518)以及人類Ang-2的似血纖維蛋白原功能域(hAng-2FD)的選定純化抗體測定KD值(如上所述)。結果歸納於下面的表8中。
在25℃以及37℃下進行額外的實驗以測定選定抗-Ang-2抗體對單體hAng-2FD的結合特性。以40 μL/min的流速在山羊抗-人類IgG多株抗體表面(透過直接化學偶合至BIACORETM晶片上以形成捕獲抗體表面)上捕獲各個選定抗體或對照組建構物歷時1分鐘。人類Ang-2FD在500 nM或7.8 nM的濃度下以60 μL/min的流速注射通過捕獲抗體表現歷時3分鐘,並且在25℃或37℃下即時監測抗原-抗體解離歷時20分鐘。
結果歸納於下面表9(25℃)與表10(37℃)中。N/D=未測定。
如本實施例中所示,依據實施例1所生成的抗-Ang-2抗體中的數者以與對照組相同或更高的親和性結合至Ang-2建構物。舉例來說,抗體H1H685、H1H690、H1H724與H1H744分別以71.4、79、115與114 pM的KD結合至二聚體人類Ang-2-FD,而對照組I抗體以339 pM的KD結合至二聚體人類Ang-2-FD(參見表4)。同樣地,抗體H1H685、H1H690、H1H724與H1H744分別以11.9、17.9、23.3與17.2 pM的KD結合至人類BA2(一種四聚體Ang-2似血纖維蛋白原功能域建構物),而對照組I抗體以83 pM的KD結合至hBA2(參見表7)。因此,與對照組建構物相較之下,本發明的許多抗體展現出提高結合至Ang-2。當與對照組建構物相較之下,抗體H1H685P對Ang-2尤其顯示出強烈的結合。
進行結合實驗(電漿共振分析)以確認選定的抗體是否均會結合至Ang-2以及Ang-1這兩者,或它們偏好僅結合至Ang-2。以40 μL/min的流速在山羊抗-人類IgG多株抗體表面(透過直接化學偶合至BIACORETM晶片上以形成捕獲抗體表面)上捕獲各個選定抗體或對照組建構物歷時1分鐘。全長野生型人類Ang-1或Ang-2在25 nM或0.78 nM的濃度下以60 μL/min的流速注射通過捕獲抗體表現歷時3分鐘,並且在25℃或37℃下即時監測抗原-抗體解離歷時20分鐘。
這些實驗的結果歸納於下面表11-14中。N/D=未測定。”無結合”表示在這些實驗所使用的特定實驗條件下沒有觀察到可被偵測到的結合。
這些結果顯示,H1H685P在這個實驗所測試的抗體中是獨特的,因為它以高親和性結合至Ang-2但不會結合至Ang-1。另一個展現結合至Ang-2但不會結合至Ang-1的建構物是對照組III。但是,應強調的是,對照組III是一種胜肽體而且所有在本實驗中所測試的抗體均會結合至Ang-2以及Ang-1這兩者。對於Ang-2結合的選擇性可能賦予H1H685P結合至Ang-2以及Ang-1這兩者的抗體所沒有的治療益處。
Tie-2是Ang-2的天然受體。針對抗-Ang-2抗體阻斷Ang-2結合至人類Tie-2(hTie-2)的能力測試它們。將hTie-2-mFc(一種由人類Tie-2接合至小鼠IgG所構成的嵌合建構物;SEQ ID NO:525)以2 μg/ml的濃度塗覆於96-孔培養盤上並且培育過夜,繼而在洗滌緩衝液(具有0.05% Tween-20的PBS)中洗滌4次。培養盤接著在室溫下以含有0.5% BSA(Sigma-Aldrich Corp.,St. Louis,MO)的PBS(Irvine Scientific,Santa Ana,CA)阻斷歷時1小時。在分開來的培養盤中,將起始濃度為50 nM的純化抗-Ang-2抗體以3為因數(factor)連續稀釋橫跨培養盤。將接合至人類IgG(Ang-2FD-hFC)的人類、小鼠或猴Ang-2FD蛋白質加入至最終濃度分別為2 nM、8 nM或2 nM並且在室溫下培育歷時1小時。接著將抗體/Ang-2FD-Fc混合物加入至含有hTie-2-mFc的培養盤中並且在室溫下培育歷時1小時。偵測結合至hTie-2-mFc蛋白質的Ang-2FD-hFC是使用接合至人類IgG抗體(Jackson Immuno Research Lab,West Grove,PA)的馬-辣根過氧化酶(HRP)來測定並且藉由標準比色反應使用四甲基聯苯胺(TMB)受質(BD Biosciences,San Jose,CA)來成像。在OD450下讀取吸光值歷時0.1秒。結合至hTie-2-mFc蛋白質的Ang-2FD-hFC在16.67 nM的選定抗-Ang-2抗體時的百分比阻斷顯示於表15中。
在一個類似的實驗中,針對選殖到人類IgG1上的選定純化抗-Ang-2抗體測試它們阻斷Ang-2FD結合至hTie-2的能力(如上所述)。結合至hTie-2-mFc的Ang-2FD-hFc在16.67 nM的選定抗-Ang-2抗體時的百分比阻斷顯示於表16中。NT:未測試。
在另一個實驗中,針對選定純化抗-Ang-2抗體測試它們阻斷20 pM經生物素化的hBA2結合至hTie-2的能力(如上所述)。有關這個實驗,以類似於上述Tie-2-mFc的方式使用接合至組胺酸標誌的人類Tie-2(hTie-2-His;SEQ ID NO:526)。抗體濃度從5 nM起連續稀釋3倍。藉由計算阻斷50%生物素-hBA2結合至Tie-2之訊號所需的抗體數量產生IC50(抑制濃度)值。依據2個不同的實驗計算出各個抗體的平均IC50值。結果歸納於表17中。NB:在5 nM濃度下沒有觀察到阻斷。
在一個類似的實驗中,針對選殖到人類IgG1上的選定純化抗-Ang-2抗體測試它們阻斷經生物素化之hBA2結合至hTie-2的能力(如上所述)。結果顯示於表18中。NB:在5 nM濃度下沒有觀察到阻斷。
這個實施例例示說明了依照實施例1的方法所生成的數個抗-Ang-2抗體阻斷Ang-2似血纖維蛋白原功能域與其受體間的交互作用達到與對照組抗體相同或更高的程度。舉例來說,抗體H1H690、H1H691、H1H695、H1H696、H1H704、H1H706、H1H707、H1H724以及H1H744各自引起人類、小鼠與猴Ang-2FD建構物對TIE-2受體超過95%的阻斷,類似於使用對照組建構物所觀察到的結果(參見表16)。
對於Ang-1還有Ang-2來說Tie是一個受體。因此,在本實施例中,測量並比較某些抗-Ang-2抗體阻斷Ang-2或Ang-1結合至人類Tie-2的能力。
以類似於實施例5的實驗的方式進行在本實施例中所示的ELISA實驗。簡言之,將hTie-2-mFc(一種由人類Tie-2接合至小鼠IgG所構成的嵌合建構物;SEQ ID NO:525)以2 μg/ml的濃度塗覆於96-孔培養盤上並且培育過夜,繼而在洗滌緩衝液(具有0.05% Tween-20的PBS)中洗滌4次。培養盤接著在室溫下以含有0.5% BSA(Sigma-Aldrich Corp.,St. Louis,MO)的PBS(Irvine Scientific,Santa Ana,CA)阻斷歷時1小時。在分開來的培養盤中,將起始濃度為300 nM的純化抗-Ang-2抗體與對照組建構物以3為因數連續稀釋橫跨培養盤。將接合至6X組胺酸標誌(R&D Systems,Minneapolis,MN)的全長人類Ang-2或Ang-1蛋白質分別加入至最終濃度為0.6 nM並且在室溫下培育歷時1小時。接著將抗體/抗原混合物加入至含有hTie-2-mFc的培養盤中並且在室溫下培育歷時1小時。偵測結合至hTie-2-mFc蛋白質的Ang-2-His或Ang-1-His是使用接合至五-His抗體(Qiagen,Valencia,CA)的馬-辣根過氧化酶(HRP)來測定並且藉由標準比色反應使用四甲基聯苯胺(TMB)受質(BDBiosciences,San Jose,CA)來成像。在OD450下讀取吸光值歷時0.1秒。藉由計算阻斷50%人類Ang-2或Ang-1結合至Tie-2之訊號所需的抗體數量產生IC50(抑制濃度)值。以名稱IC50表示的結果顯示於表19中,欄(1)以及(2)。抗體或對照組建構物阻斷hAng-2/Tie-2交互作用相對於hAng-1/Tie-2交互作用的程度是以顯示於欄(3)中的IC50差異來反映;換言之,欄(3)中較高的數字表示阻斷hAng-2/Tie-2交互作用要比hAng-1/Tie-2交互作用有較高的能力。
在進一步努力評估選定抗-hAng-2抗體阻斷Ang-1結合至Tie-2的能力時,進行生物感測器表面電漿共振實驗。在這個實驗中,將人類Tie-2全長細胞外功能域建構物(hTie-2-mFc-ecto)經胺偶合至BIACORETM晶片上以產生受體塗覆的表面。將1 μM選定的抗-hAng-2抗體以及對照組建構物(超過抗原100倍)與10 nM的hAng-1-WT預先混合,繼而在25℃下培育歷時60分鐘以容許抗體-抗原結合達到平衡而形成校正溶液。在25℃下以5 μL/min將校正溶液注射通過受體表面。測定共振單位(RU)因為hAng-1-WT結合至hTie-2-mFc所引起的變化。不會結合至hAng-1的不相干胜肽體建構物也涵括在本實驗中以建立0%阻斷基線,而人類Tie-2-mFc建構物作為有關阻斷的陽性對照組。在抗體預培育之後結合至Tie-2的Ang-1數量(以在陰性對照組預培育之後結合至Tie-2的Ang-1數量的百分比來表示)顯示在表20中。(較高數目的Ang-1結合至Tie-2表示較低程度的抗體阻斷)
使用不同數量的Ang-2阻斷劑以及對照組重複前面的實驗。特別地,將人類Tie-2全長細胞外功能域建構物(hTie-2-mFc-ecto)經胺偶合至BIACORETM晶片上以產生受體塗覆的表面。將選定的抗-hAng-2抗體以及對照組建構物(50或150 nM)與hAng-2-WT(25 nM)預先混合,繼而在25℃下培育歷時60分鐘以容許抗體-抗原結合達到平衡。在25℃下以10 μL/min將校正溶液注射通過受體表面歷時5分鐘。為了評估選定抗-hAng-2抗體阻斷Ang-1-WT結合至hTie-2的能力,遵循相似的操作步驟,除了以3種濃度(50、100或1000 nm)的抗體測試並且與10 nM的hAng-1-WT培育。測定共振單位(RU)因為hAng-2-WT或hAng-1-WT結合至hTie-2-mFc所引起的變化。不會結合至血管生成素的不相干抗體也涵括在這些實驗中以建立0%阻斷基線,而人類Tie-2-mFc建構物作為有關阻斷的陽性對照組。結果歸納於表21(應用於hTie-2表面的hAng-1)以及表22(應用於hTie-2表面的hAng-2)中。
由這些實驗所得到的結果與先前結果一致,其顯示出H1H685P偏好結合至Ang-2更甚於Ang-1(參見實施例4)。特別地,由這個實施例的結果顯示,數種抗-Ang-2抗體(例如H1H685P以及H1H706P)並不會明顯地阻斷人類Ang-1結合至人類Tie-2,即使在其他實驗中證實這些抗體有可能阻斷Ang-2與Tie-2之間的交互作用(參見實施例5,表16)。此外,在這些實驗中,除了對照組III胜肽體以外,沒有任何一個對照組建構物展現出與本發明之例示性抗-Ang-2抗體(諸如H1H685P)相同程度的偏好結合/阻斷Ang-2甚過於Ang-1。
本發明的發明人已證實Ang-2表現可以藉由轉錄因子FOXO1而在人類臍帶臍靜脈內皮細胞(HUVECs)中被誘發(Daly et al. 2006 PNAS 103:15491)。再者,發明人已證明以編碼FOXO1的腺病毒感染的HUVECs會造成Ang-2表現以及分泌,繼而活化Tie-2磷酸化(Daly et al. 2006 PNAS 103:15491)。
針對抗-Ang-2抗體抑制Tie-2磷酸化的能力來測試它們。簡言之,將7x105 HUVECs(Vec Technologies,Rensselaer,NY)平盤培養於有3.5 ml MCDB 131完全培養基(Vec Technologies,Rensselaer,NY)的6 cm細胞培養盤中。翌日,以Opti-MEM(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)洗滌細胞並且餵予2 ml的Opti-MEM。以10 pfu/細胞的濃度將編碼綠色螢光蛋白質(GFP;對照組)或人類FOXO1(Daly et al. 2004 Genes Dev. 18:1060)的重組型腺病毒加入至細胞中並且培育歷時4小時。接著以MCDB131洗滌細胞並且餵予2 ml含有濃度為0.5 μg/ml之抗-Ang-2抗體的MCDB131。轉染後的第20小時,溶解細胞並且如Daly et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:15491-15496(2006)所述般進行Tie-2免疫沉澱法。在蛋白質A/G珠粒(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)上收集免疫球蛋白歷時1小時。以冷的溶解緩衝液洗滌珠粒並且再懸浮於SDS樣品緩衝液中供用於藉著使用對磷酸酪胺酸或Tie-2具有專一性的抗體(Millipore,Billerica,MA)的西方墨點法分析。使用HRP-接合二級抗體以及ECL試劑(GE Healthcare,Piscataway,NJ)偵測訊號。掃描X-射線底片並且使用ImageJ軟體定量磷酸Tie-2與Tie-2訊號。使用磷酸-Tie-2/Tie-2比例來決定各個抗-Ang-2抗體的%抑制(亦即,百分比抑制=磷酸-Tie-2/Tie-2相較於對照組的減低)。舉例來說,Tie-2磷酸化減低至在對照組樣品中所觀察到的程度被視為是100%抑制。有關各個測試抗-Ang-2抗體依據所觀察到的百分比抑制(分別為25-50%、50-75%、75-100%)的相對抑制(+、++、+++)顯示於表23中。
如同在本實施例中所證實的,依據實施例1的方法所生成的抗-Ang-2抗體將Tie-2磷酸化抑制到一個要比對照組I抗體還要高的程度。特別在使用抗體H1H685、H1H690、H1H691、H1H693、H1H695、H1H696、H1H704、H1H706、H1H707、H1M724、H1M744以及H1M750的情況下觀察到強烈抑制。
如同在先前實施例中所示的,Ang-2可以媒介Tie-2磷酸化。Ang-1也能夠促進Tie-2磷酸化。在本實施例中,評估選定抗-Ang-2抗體阻斷Ang-1媒介Tie-2磷酸化的能力。
將EA.hy926細胞(Edgell et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3734-3737(1983))以每10 cm平盤有5x106個細胞平盤培養在含有10% FBS、HAT、L-麩醯胺酸與青黴素/鏈黴素的10 ml DMEM中。24小時之後,令細胞在10 ml DMEM+1 mg/ml BSA中匱乏血清歷時1小時。接著在400 nM不相干同型對照組抗體(“9E10”)或濃度範圍從10至400 nM的抗-Ang-2抗體H1H685P或對照組試劑(對照組I、對照組II、對照組IV或對照組V)存在下以500 ng/ml的重組型人類Ang-1(R&D Systems)刺激細胞。
在培育之後,溶解細胞並且如Daly et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:15491-15496(2006)所述般進行Tie-2免疫沉澱法。藉由與蛋白質A/G珠粒(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)培育歷時60分鐘來收集免疫複合物。以冷的溶解緩衝液洗滌珠粒而結合的蛋白質是藉由在SDS樣品緩衝液中加熱而被洗出。樣品接著進行使用對抗Tie-2或磷酸酪胺酸(純系4G10,Millipore,Billerica,MA)之單株抗體的西方墨點法分析。結果顯示於第2圖中。
使用HRP-接合二級抗體以及ECL試劑(GE Healthcare,PiscataWay,NJ)偵測訊號。掃描X-射線底片並且使用ImageJ軟體定量磷酸-Tie-2與Tie-2訊號。使用磷酸-Tie-2/Tie-2比例來決定各個抗體或胜肽體的%抑制。百分比抑制=當與對照組樣品(400 nM同型對照組抗體)相較之下在磷酸-Tie-2/Tie-2方面的降低。
有對照組抗體9E10存在的情況下,Ang-1強烈活化Tie-2磷酸化(第2圖,A區-將道2和3與道1比較)。所有測試的對照組試劑明顯地抑制Tie-2磷酸化,完全抑制就對照組II來說發生在50 nM(第2圖,B區-道17)、就對照組IV來說在100 nM(第2圖,A區-道11)以及就對照組I(第2圖,B區-道24)與對照組V(第2圖,C區-道9)來說在200 nM。相對地,H1H685P即使在400 nM也沒有明顯的抑制效用(第2圖,A區-道4-8)。這些結果為H1H685P對Ang-2具有專一性更甚於Ang-1提供額外確認。
使用2個腫瘤細胞株來測定選定純化抗-Ang-2抗體對於腫瘤生長的效用。
PC3(人類***癌細胞株)簡言之,將配於100 μl生長因子-減低的基質膠(growth factor-reduced Matrigel)(BD Biosciences)中的5x106 PC3細胞皮下注射至6-8週齡雄性NCr裸鼠(Taconic,Hudson,NY)的腹側。在腫瘤體積達到平均約200 mm3之後,將小鼠隨機分組以供處理。將抗-Ang-2抗體、Fc蛋白質或對照組建構物以10 mg/kg的濃度經由腹腔內注射每週2次投藥給各處理組的小鼠歷時約3週(表24),或者以2.5、12.5或25 mg/kg的濃度經由皮下注射每週2次歷時約3週(表25)。在實驗過程中每週測量腫瘤體積2次並且在實驗結束時切下腫瘤測量腫瘤重量。針對各處理組計算出腫瘤重量與生長的平均值(平均+/-標準偏差值)。由與Fc蛋白質測量值相比較而計算出腫瘤重量以及生長的百分比減低。結果歸納於表24以及25中。
如上所示,證實抗體H1H744N以及H1H685P與對照組建構物相較之下在PC3小鼠腫瘤模型中有特別明顯的抗-腫瘤活性。
使用PC3小鼠腫瘤模型以及不同實驗抗體(以2 mg/kg給藥,每週2次)的類似實驗的結果顯示於表26與27中。
COLO 205(人類結腸直腸腺癌細胞株)簡言之,將配於100 μl無血清培養基中的2x106 COLO 205細胞皮下注射至6-8週齡雄性NCr裸鼠(Taconic,Hudson,NY)的腹側。在腫瘤體積達到平均約150 mm3之後,將小鼠隨機分組以供處理抗體或Fc蛋白質。將抗-Ang-2抗體或Fc蛋白質以4 mg/kg的濃度經由腹腔內注射每週2次而投藥給各處理組的小鼠歷時約2週。在實驗過程中每週測量腫瘤體積2次並且在實驗結束時切下腫瘤測量腫瘤重量。針對各處理組計算出腫瘤重量與生長的平均值(平均+/-標準偏差值)。“平均腫瘤生長”表示從處理開始時間(當腫瘤為約150 mm3)起的平均生長。由與Fc蛋白質測量值相比較而計算出腫瘤重量與生長的百分比減低。結果歸納於表28中。
進行類似的實驗以評估H1H685P的效用,特別是對於COLO 205腫瘤生長方面。簡言之,將配於100 μl無血清培養基中的2x106 COLO 205細胞皮下移植至9-11週齡雄性SCID CB17小鼠的右後腹側。當腫瘤達到~125 mm3時,將小鼠隨機分成5組(n=7-8小鼠/組)並且以Fc蛋白質(15 mg/kg)、H1H685P(5或25 mg/kg)或對照組II(5或25 mg/kg)予以處理每週2次歷時19天期間。在實驗過程中每週測量腫瘤體積2次並且在實驗結束時切下腫瘤測量腫瘤重量。針對各組計算出從處理開始時的腫瘤重量與生長的平均值。由與Fc對照組相比較而計算出腫瘤重量與生長的百分比減低。結果歸納於表29中。
如同使用PC3小鼠腫瘤模型般,本發明的數種抗體(包括H1H685P)在COLO 205小鼠模型中展現出至少相同於對照組分子所展現出之抗-腫瘤活性的實質抗-腫瘤活性。
為了測定抗-Ang-2抗體與VEGF抑制劑組合對於COLO 205異種移植物生長的效用,將2x106細胞皮下移植至6-8週齡雌性SCID小鼠的右後腹側。當腫瘤達到平均體積為~350 mm3時,將小鼠隨機分成4組(n=6小鼠/組)並且以下列予以處理:人類Fc蛋白質(7.5 mg/kg)、H1H685P(5 mg/kg)、VEGF Trap(參見US 7,087,411)(2.5 mg/kg)或H1H685P與VEGF Trap的組合。在10天處理的期間給予小鼠總計3次投藥。在實驗過程中每週測量腫瘤體積2次。針對各處理組計算出從處理開始時的腫瘤重量與生長的平均值(平均+/-標準偏差值)。由與Fc對照組相比較所計算出腫瘤生長的百分比減低。結果顯示於表30中。注意到在VEGF Trap以及在H1H685P+VEGF Trap組中,在處理結束時的平均腫瘤尺寸要比開始時還小,亦即觀察到腫瘤清退(tumor regression)。
這個實驗的結果證實,H1H685P+VEGF Trap的組合會導致腫瘤生長減低,比由任何單獨成分所引起的腫瘤生長的百分比減低還要大。
為了提供組合效力的額外證據,評估H1H685P+VEGF Trap組合對於MMT腫瘤生長的效用。將0.5 x 106 MMT細胞皮下移植至6-8週齡雌性SCID小鼠的右後腹側。當腫瘤達到平均體積為~400 mm3時,將小鼠隨機分成4組(n=11小鼠/組)並且以下列予以處理:人類Fc蛋白質(17.5 mg/kg)、H1H685P(12.5 mg/kg)、VEGF Trap(5 mg/kg)或H1H685P+VEGF Trap的組合。Fc組與H1H685P組在9天期間給予3次投藥。VEGF Trap組與組合組在12天期間給予4次投藥。在實驗過程中每週測量腫瘤體積2次並且在實驗結束時切下腫瘤測量腫瘤重量(因為它們的尺寸大,Fc組與H1H685P組的腫瘤要比VEGF Trap組與組合組的腫瘤還要早3天收取)。針對各組計算出從處理開始時的腫瘤生長與腫瘤重量平均值(平均+/-標準偏差值)。由與Fc對照組相比較而計算出腫瘤重量與生長的百分比減低。結果顯示於表31中。
這些結果證實,H1H985P+VEGF Trap相對於單獨試劑處理有增高的腫瘤抑制效用。
為了決定H1H985P+VEGF Trap的組合對於腫瘤血管功能是否要比單獨試劑有更高的效用,使用微-超音波(VisualSonics’ Vevo 770 imaging system)來評估腫瘤清退的變化。COLO 205腫瘤生長至~125 mm3且接著以H1H985P、VEGF Trap或這兩種試劑的組合來處理小鼠歷時24小時。在處理之後,依據對比-增強微-超音波2D影像擷取與“內洗(wash-in)”曲線分析(其表示進入腫瘤的對比劑數量)來測定腫瘤血管清退。針對各組計算出腫瘤清退的平均值(平均+/-標準偏差值)。由與Fc對照組相比較而計算出百分比減低。結果顯示於表32中。
與組合處理對於清退的增強效用一致的是,腫瘤切片的抗-CD31染色證實該組合對於腫瘤血管密度有更為強力的效用(數據未示出)。這個H1H985P+VEGF Trap組合對於腫瘤血管分布功能的增高效用為該組合療法在腫瘤生長方面的增強效用提供強而有力的說明。
為了測試H1H685P組合化學治療劑對於腫瘤生長的效用,將2.5 x 106個COLO 205腫瘤細胞皮下移植至8-9週齡雄性SCID小鼠的右後腹側。當腫瘤達到平均體積為~150 mm3時(種植後第17天),將小鼠隨機分成4組(n=5小鼠/組)並且處理如下:第1組腹腔內(ip)處理以15 mg/kg的hFc加上5-FU載體;第2組sc處理以15 mg/kg的H1H685P;第3組ip處理以75 mg/kg的5-FU;第4組處理以15 mg/kg的H1H685P(sc)加上75 mg/kg的5-FU(ip)。小鼠接受總計3次處理,每3-4天投藥。在實驗過程中每週測量腫瘤體積2次。針對各組計算出從處理開始至第38天的腫瘤生長平均值(平均+/-標準偏差值)。由與對照組相比較而計算出腫瘤生長的百分比減低。結果顯示於表33中。
這個實驗的結果顯示,H1H685P與5-FU的組合要比任何分開投藥的試劑引起更高的腫瘤生長減低。
在這個實施例中,評估選定的抗-Ang-2抗體在小鼠模型中對於視網膜血管化的效用。
在一組實驗中使用野生型小鼠。在另一組中,使用表現人類Ang-2的小鼠取代野生型小鼠Ang-2(命名為“hu-Ang-2小鼠”)。小鼠在2天大時(P2)皮下注射劑量為12.5 mg/kg的對照組Fc或選定抗-Ang-2抗體。3天後(在P5),將小鼠安樂死,摘出眼球並在4% PFA中固定歷時30分鐘。解剖視網膜,以Griffonia simplicifolia凝集素-1染色歷時3小時或在4℃下過夜以視觀到血管分布,並且平整包埋在顯微鏡載玻片上。使用Nikon Eclipse 80i顯微鏡相機攝取影像並且使用Adobe Photoshop CS3,Fovea 4.0以及Scion 1.63軟體分析。
測量被表面血管分布所覆蓋的視網膜面積並且用作為抗體活性的讀數。在以抗體處理的小鼠體內,與Fc-處理的對照組相較之下於血管面積大小方面的減低顯示於表34中。在血管面積的百分比減低反映出抗體的抗-血管生成效力。(ND=未測定)
如同在這個實施例中所示,本發明的選定抗-Ang-2抗體實質上抑制活體內眼血管生成,因而反映出這些抗體在其他治療情況下可能有抗-血管生成的潛力。
為了進一步鑑定出hAng2與本發明之抗-hAng-2 mAbs之間的結合,生成7種變異hAng2-FD-mFc蛋白質,各自含有單一點突變。有關突變所選定的蛋白質是以hAng-2與hAng-1之間在與hTie-2交互作用之區域中的序列差異為基礎(第1圖)。特別地,依據晶體結構分析,在Ang-2的似血纖維蛋白原功能域(FD)中的胺基酸(咸信會與Tie-2交互作用,但它不同於Ang-1的對應胺基酸序列)個別突變成對應的hAng-1殘基。這個實施例的結果指出Ang-2偏好結合抗體與其交互作用之hAng-2的胺基酸殘基。亦即,若hAng-2的特定殘基(或殘基等)是/是改變成hAng-1的對應殘基,且Ang-2偏好結合抗體的結合實質上被減低,那麼可以推斷抗體與hAng-2的那個特定殘基(等)交互作用。
在本實驗中,在透過直接化學偶合至BIACORETM晶片上而生成的抗-小鼠-Fc表面上捕獲hAng-2FD-mFc突變蛋白質的每一者。接著以50 μl/min的流速將100 nM的各個Ang-2抗體(或胜肽體,視情況而定)注射通過捕獲mFc-標定的hAng-2FD蛋白質表面歷時180秒,並且在25℃下即時監測變異hAng2-FD-mFc與抗體的解離歷時20分鐘。結果歸納於表35a-35d與第3圖中。
為了本發明,抗-Ang-2抗體被視為與特定Ang-2胺基酸殘基交互作用,若當該殘基突變成Ang-1的對應殘基時,解離的T要比針對野生型建構物在使用於本實施例的實驗條件下所觀察到的T低上至少5倍。有鑒於這個定義,抗體H1H685P在所有測試的抗體中似乎是獨特的,因為它與F469、Y475以及S480交互作用。因為它強烈偏好結合至Ang-2更甚於Ang-1,H1H685P也是獨特的,可以推斷F469、Y475以及S480包含有能夠讓Ang-2在免疫學上不同於Ang-1的抗原決定位。在這個實驗中所測試的其他抗體/胜肽體似乎會與至多1或2個這些殘基交互作用(亦即,H1H744N以及對照組I與Y475交互作用;對照組III與Y475以及S480交互作用;以及對照組V與F469交互作用)。令人感到興趣的是,顯示出以相同效力阻斷Ang-1與Ang-2結合至Tie-2的對照組II不會與這個實驗中所鑑定出的Ang-2專一性胺基酸交互作用。
本發明就範圍來說並不受到本文所述的特定具體例囿限。更確切地說,除了本文所述者以外,本發明的各種修飾對於那些習於技藝者來說由前面描述來說是清楚的。此等修飾意欲落在隨附申請專利範圍的範疇內。
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第1圖是人類Ang-2的最後88個C-端胺基酸(SEQ ID NO:518的殘基409至496)與人類Ang-1的對應胺基酸序列(SEQ ID NO:531)的排列。在hAng-1與hAng-2之間不同的殘基以白色字體與黑色網底表示。星號(*)表示藉由晶體結構分析而顯示出hAng-2會與人類Tie-2交互作用的胺基酸。參見Barton et al.,Nat. Struct. Mol. Biol. 13:524-532(2006)。三角形(▲)表示在hAng-1與hAng-2之間不同的Tie-2-交互作用胺基酸位置。
第2圖(A-C區)描述西方墨點法的結果,其例示說明Ang-2結合分子抑制或無法抑制Ang-1誘發的Tie-2磷酸化的程度。
第3圖是實施例13的Ang-2FD-mFc點突變結合實驗的歸納,顯示就所測試的各種抗體以及胜肽體而言,相對於野生型在解離的T方面造成高出5倍降低的胺基酸改變(以實心圓圈●表示)。
Claims (16)
- 一種經單離的人類抗體或其抗原-結合片段,其專一地結合人類血管生成素-2(hAng-2)但實質上不會結合hAng-1,其中該抗體或其抗原-結合片段包含具有SEQ ID NO:4之胺基酸序列的重鏈CDR-1(HCDR1)、具有SEQ ID NO:6之胺基酸序列的HCDR-2、具有SEQ ID NO:8之胺基酸序列的HCDR-3、具有SEQ ID NO:12之胺基酸序列的輕鏈CDR-1(LCDR-1)、具有SEQ ID NO:14之胺基酸序列的LCDR-2,以及具有SEQ ID NO:16之胺基酸序列的LCDR-3。
- 如申請專利範圍第1項之經單離的抗體或其抗原-結合片段,其中該抗體或其抗原-結合片段結合hAng-2(SEQ ID NO:518)上的一個抗原決定位,其包含有至少一個選自於F-469、Y-475以及S-480的胺基酸。
- 如申請專利範圍第2項之經單離的抗體或其抗原-結合片段,其中該抗體或其抗原-結合片段結合hAng-2上的抗原決定位,其包含有胺基酸F-469、Y-475以及S-480。
- 如申請專利範圍第1項之經單離的抗體或其抗原-結合片段,其中在表面電漿共振分析中測量時,該抗體或其抗原-結合片段以低於80pM、低於40pM、低於20pM或低於10pM的KD結合hAng-2。
- 如申請專利範圍第1項之經單離的抗體或其抗原-結合片段,其中在表面電漿共振分析中測量時,該抗體或其抗原-結合片段以大於1nM、大於10nM、大於50nM或大於 100nM的KD結合hAng-1。
- 如申請專利範圍第1項之經單離的抗體或其抗原-結合片段,其中在表面電漿共振分析中測試時,該抗體或其抗原-結合片段對hAng-1不會展現出任何結合。
- 如申請專利範圍第2項之經單離的抗體或其抗原-結合片段,其中該抗體或其抗原-結合片段:(a)結合包含有胺基酸F-469、Y-475以及S-480之hAng-2上的抗原決定位;(b)在表面電漿共振分析中測量時,以低於80pM的KD結合hAng-2;以及(c)在表面電漿共振分析中測試時,對hAng-1不會展現出任何結合。
- 如申請專利範圍第1項之經單離的抗體或其抗原-結合片段,其中該抗體或其抗原-結合片段包含具有SEQ ID NO:18之胺基酸序列的HCVR以及具有SEQ ID NO:20之胺基酸序列的LCVR。
- 如申請專利範圍第1項之經單離的抗體或其抗原-結合片段,其中該抗體或其抗原-結合片段阻斷hAng-2結合至hTie-2但實質上不會阻斷hAng-1結合至hTie-2。
- 如申請專利範圍第1至9項中任一項之經單離的抗體或其抗原-結合片段,其供使用於治療帶有腫瘤之患者。
- 如申請專利範圍第1至9項中任一項之經單離的抗體或其抗原-結合片段,其供使用於治療帶有眼疾之患者。
- 一種醫藥組成物,其包含有如申請專利範圍第1至9項中任一項的抗體或其抗原-結合片段以及醫藥上可接受的載體或稀釋劑。
- 如申請專利範圍第12項的醫藥組成物,其進一步包含有VEGF拮抗劑。
- 如申請專利範圍第13項的醫藥組成物,其中該VEGF拮抗劑是選自於抗-VEGF抗體、VEGF受體的小分子激酶抑制劑以及VEGF-抑制融合蛋白質。
- 一種如申請專利範圍第1至9項中任一項之經單離的抗體或其抗原-結合片段在製造供使用於治療帶有腫瘤之患者的醫藥品的用途。
- 一種如申請專利範圍第1至9項中任一項之經單離的抗體或其抗原-結合片段在製造供使用於治療帶有眼疾之患者的醫藥品的用途。
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