CN102549015B

CN102549015B - 针对人血管生成素-2的高亲和力人抗体

Info

Publication number: CN102549015B
Application number: CN201080043266.4A
Authority: CN
Inventors: G·瑟斯顿; C·戴利
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2009-07-29
Filing date: 2010-07-27
Publication date: 2014-10-15
Anticipated expiration: 2030-07-27
Also published as: JP2013500970A; RS55054B1; ES2582405T3; MX2012001094A; HRP20161043T1; AU2010276544B2; CA2769334C; CN102549015A; HK1166806A1; NI201200014A; CR20120086A; US20180186869A1; CN104258390B; SMT201600251B; US20110027286A1; US8987420B2; IL217680A; UY32812A; ECSP12011694A; MY156816A

Abstract

本发明提供了结合血管生成素-2(Ang-2)的抗体及其使用方法。根据本发明的某些实施方案，所述抗体是结合人Ang-2的全人抗体。本发明的抗体特别用于治疗与一种或多种Ang-2生物学活性(包括血管生成)相关的病或疾病。

Description

针对人血管生成素-2的高亲和力人抗体

发明领域

本发明涉及特异性针对人血管生成素-2(angiopoietin-2)(Ang-2)的抗体，及其抗原结合片段。

背景

血管生成是形成新血管的生物学过程。异常的血管生成与包括例如增殖性视网膜病变、类风湿性关节炎和银屑病的若干疾病病症相关。另外，众所周知血管生成对肿瘤生长和维持是关键的。血管生成素-2(Ang-2)是Tie-2受体(Tie-2)的配体，并已显示在血管生成中起作用。Ang-2在本领域中又被称为Tie-2配体(US 5,643,755；Yancopoulos等人，2000，Nature407：242-248)。

在US 6,166,185；7,521,053；7,205,275；2006/0018909和2006/0246071中提及结合Ang-2的抗体和其他肽抑制剂。在本领域中需要可用于治疗由血管生成导致的或恶化的疾病和病症的新的Ang-2调节剂，包括Ang-2抗体。

发明概述

本发明提供了结合人Ang-2的人抗体。鉴于多种证据和调查，本发明者意识到需要不结合或拮抗相关分子Ang-1的Ang-2抑制剂。例如，以前的研究已证明或提示Ang-1在止血(见，例如Li等人，2001，Thrombosisand Haemostasis 85：191-374)和保护成人维管结构免于血浆渗漏(见，例如Thurston等人，2000，Nature Medicine 6：460-463；Thurston等人，1999，Science 286：2511-2514)中的有益作用。因此，本发明者意识到，在某些抗血管生成的治疗状况下，保存Ang-1活性可能是有益的。因此，本发明提供了特异性结合Ang-2但基本上不结合Ang-1的抗体。本发明也包括阻碍Ang-2和其受体Tie-2之间的相互作用但基本上不阻碍Ang-1和Tie-2之间的相互作用的抗体。本发明的抗体在抑制Ang-2的促血管生成活性和治疗由血管生成过程导致的或与其相关的疾病和病症中特别有用。

本发明的抗体可为全长的(例如，IgG1或IgG4抗体)或仅包含抗原结合部分(例如，Fab，F(ab’)₂或scFv片段)，并可经修饰以影响功能，例如消除残留的效应功能。

在一个实施方案中，本发明包含抗体或抗体的抗原结合片段，所述抗体或抗体的抗原结合片段包含具有选自SEQ ID NO：2，18，22，26，42，46，50，66，70，74，90，94，98，114，118，122，138，142，146，162，166，170，186，190，194，210，214，218，234，238，242，258，262，266，282，286，290，306，310，314，330，334，338，354，358，362，378，382，386，402，406，410，426，430，434，450，454，458，474，478，482，498，502，506，514，和516的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列的重链可变区(HCVR)。在一个实施方案中，抗体或抗体的抗原结合部分包含具有选自SEQ ID NO：18，42，66，162，210，266，和434的氨基酸序列的HCVR。

在一个实施方案中，本发明包含抗体或抗体的抗原结合片段，所述抗体或抗体的抗原结合片段包含具有选自SEQ ID NO：10，20，24，34，44，48，58，68，72，82，92，96，106，116，120，130，140，144，154，164，168，178，188，192，202，212，216，226，236，240，250，260，264，274，284，288，298，308，312，322，332，336，346，356，360，370，380，384，394，404，408，418，428，432，442，452，456，466，476，480，490，500，和504的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列的轻链可变区(LCVR)。在一个实施方案中，抗体或抗体的抗原结合部分包含具有选自SEQ ID NO：20，44，68，164，212，274，和442的氨基酸序列的LCVR。

在特定的实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO：2/10，18/20，22/24，26/34，42/44，46/48，50/58，66/68，70/72，74/82，90/92，94/96，98/106，114/116，118/120，122/130，138/140，142/144，146/154，162/164，166/168，170/178，186/188，190/192，194/202，210/212，214/216，218/226，234/236，238/240，242/250，258/260，262/264，266/274，282/284，286/288，290/298，306/308，310/312，314/322，330/332，334/336，338/346，354/356，358/360，362/370，378/380，382/384，386/394，402/404，406/408，410/418，426/428，430/432，434/442，450/452，454/456，458/466，474/476，478/480，482/490，498/500，和502/504的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)氨基酸序列对。在一个实施方案中，抗体或其片段包含选自氨基酸序列对SEQ ID NO：18/20，42/44，66/68，162/164，210/212，266/274，和434/442的HCVR和LCVR。

在下一个方面，本发明提供了抗体或抗体的抗原结合片段，所述抗体或抗体的抗原结合片段包含具有选自SEQ ID NO：8，32，56，80，104，128，152，176，200，224，248，272，296，320，344，368，392，416，440，464，488，和512的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列的重链CDR3(HCDR3)结构域；和选自SEQ ID NO：16，40，64，88，112，136，160，184，208，232，256，280，304，328，352，376，400，424，448，472，和496，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列的轻链CDR3(LCDR3)结构域。

在某些实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含选自SEQ ID NO：8/16，32/40，56/64，80/88，104/112，128/136，152/160，176/184，200/208，224/232，248/256，272/280，296/304，320/328，344/352，368/376，392/400，416/424，440/448，464/472，和488/496的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分包含选自SEQ ID NO：8/16，32/40，56/64，152/160，200/208，272/280，和440/448的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。具有这些HCDR3/LCDR3对的抗Ang-2抗体的非限制性实例是分别名为H1H685，H1H690，H1H691，H1H696，H1H706，H1M724，和H2M744的抗体。

在另外的实施方案中，本发明包含抗体或其片段，所述抗体或其片段还包含具有选自SEQ ID NO：4，28，52，76，100，124，148，172，196，220，244，268，292，316，340，364，388，412，436，460，484，和508的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列的HCDR1结构域；具有选自SEQ ID NO：6，30，54，78，102，126，150，174，198，222，246，270，294，318，342，366，390，414，438，462，486，和510的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列的重链CDR2(HCDR2)结构域；具有选自SEQ ID NO：12，36，60，84，108，132，156，180，204，228，252，276，300，324，348，372，396，420，444，468，和492的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列的LCDR1结构域；和具有选自SEQ ID NO：14，38，62，86，110，134，158，182，206，230，254，278，302，326，350，374，398，422，446，470的氨基酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本相似的序列的LCDR2结构域。

本发明的某些非限制性代表性抗体和抗原结合片段分别包含选自(i)SEQ ID NO：4，6，8，12，14和16(e.g.，H1H685)；(ii)SEQ ID NO：28，30，32，36，38和40(e.g.，H1H690)；(iii)SEQ ID NO：52，54，56，60，62和64(e.g.，H1H691)；(iv)SEQ ID NO：148，150，152，156，158和160(e.g.，H1H696)；(v)SEQ ID NO：196，198，200，204，206和208(e.g.，H1H706)；(vi)SEQ ID NO：268，270，272，276，278和280(e.g.，H1M724)；和(vii)SEQ ID NO：436，438，440，444，446和448(e.g.，H2M744)的HCDR1，HCDR2，HCDR3，LCDR1，LCDR2和LCDR3结构域。

在相关的实施方案中，本发明包含特异性结合Ang-2的抗体或抗体的抗原结合片段，其中抗体或片段包含重链和轻链CDR结构域(即CDR1，CDR2和CDR3)，其被包含在选自SEQ ID NO：2/10，18/20，22/24，26/34，42/44，46/48，50/58，66/68，70/72，74/82，90/92，94/96，98/106，114/116，118/120，122/130，138/140，142/144，146/154，162/164，166/168，170/178，186/188，190/192，194/202，210/212，214/216，218/226，234/236，238/240，242/250，258/260，262/264，266/274，282/284，286/288，290/298，306/308，310/312，314/322，330/332，334/336，338/346，354/356，358/360，362/370，378/380，382/384，386/394，402/404，406/408，410/418，426/428，430/432，434/442，450/452，454/456，458/466，474/476，478/480，482/490，498/500，和502/504的重链和轻链可变结构域序列中。在一个实施方案中，抗体或其片段包含CDR序列，其被包含在选自氨基酸序列对SEQ ID NO：18/20，42/44，66/68，162/164，210/212，266/274，和434/442的HCVR和LCVR中。

在另一个方面，本发明提供了编码抗Ang-2抗体或其片段的核酸分子。本发明也包括携带本发明的核酸的重组表达载体，和已引入这样的载体的宿主细胞，以及通过在允许抗体产生的条件下培养宿主细胞，并回收产生的抗体从而生产抗体的方法。

在一个实施方案中，本发明提供了抗体或其片段，所述抗体或其片段包含由选自SEQ ID NO：1，17，21，25，41，45，49，65，69，73，89，93，97，113，117，121，137，141，145，161，165，169，185，189，193，209，213，217，233，237，241，257，261，265，281，285，289，305，309，313，329，333，337，353，357，361，377，381，385，401，405，409，425，429，433，449，453，457，473，477，481，497，501，505，513，和515的核酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的基本相同的序列编码的HCVR。在一个实施方案中，抗体或其片段包含由选自SEQ ID NO：17，41，65，161，209，265，和433的核酸序列编码的HCVR。

在一个实施方案中，本发明提供了抗体或其片段，所述抗体或其片段包含由选自SEQ ID NO：9，19，23，33，43，47，57，67，71，81，91，95，105，115，119，129，139，143，153，163，167，177，187，191，201，211，215，225，235，239，249，259，263，273，283，287，297，307，311，321，331，335，345，355，359，369，379，383，393，403，407，417，427，431，441，451，455，465，475，479，489，499，和503的核酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的基本相同的序列编码的LCVR。在一个实施方案中，抗体或其片段包含由选自SEQ ID NO：19，43，67，163，211，273，和441的核酸序列编码的LCVR。

在一个实施方案中，本发明提供了抗体或抗体的抗原结合片段，所述抗体或抗体的抗原结合片段包含由选自SEQ ID NO：7，31，55，79，103，127，151，175，199，223，247，271，295，319，343，367，391，415，439，463，487，和511的核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的基本相同的序列编码的HCDR3结构域；和由选自SEQ IDNO：15，39，63，87，111，135，159，183，207，231，255，279，303，327，351，375，399，423，447，471，和495的核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的基本相同的序列编码的LCDR3结构域。在一个实施方案中，抗体或其片段包含由选自SEQ ID NO：7/15，31/39，55/63，151/159，199/207，271/279，和439/447的核酸序列对编码的HCDR3和LCDR3序列。

在另外的实施方案中，抗体或其片段还包含：由选自SEQ ID NO：3，27，51，75，99，123，147，171，195，219，243，267，291，315，339，363，387，411，435，459，483，和507的核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的基本相同的序列编码的HCDR1结构域；由选自SEQ ID NO：5，29，53，77，101，125，149，173，197，221，245，269，293，317，341，365，389，413，437，461，485，和509的核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的基本相同的序列编码的HCDR2结构域；由选自SEQ ID NO：11，35，59，83，107，131，155，179，203，227，251，275，299，323，347，371，395，419，443，467，和491的核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的基本相同的序列编码的LCDR1结构域；和由选自SEQ IDNO：13，37，61，85，109，133，157，181，205，229，253，277，301，325，349，373，397，421，445，469，和493的核苷酸序列，或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的基本相同的序列编码的LCDR2结构域。

在一个实施方案中，抗体或其片段包含由选自SEQ ID NO：17和19；SEQID NO：41和43；SEQ ID NO：65和67；SEQ ID NO：161和163；SEQ ID NO：209和211；SEQ ID NO：265和273；或SEQ ID NO：433和441的核酸序列编码的重链和轻链CDR序列。

本发明包括具有修饰的糖基化模式的抗Ang-2抗体。在一些应用中，去除不理想的糖基化位点的修饰可能是有用的。例如，本发明包括本文陈述的任意抗体的修饰形式，其中修饰形式缺乏在寡糖链上存在的岩藻糖部分，例如以提高抗体依赖的细胞毒性(ADCC)功能(见Shield等人(2002)JBC 277：26733)。在其他应用中，可进行半乳糖基化的修饰以修饰补体依赖的细胞毒性(CDC)。

在另一个方面，本发明提供了包含特异性结合Ang-2的重组人抗体或其片段的药物组合物和可药用的载体或赋形剂。在相关的方面，本发明涉及由Ang-2抑制剂和第二种治疗剂的组合的组合物。在一个实施方案中，Ang-2抑制剂是抗体或其片段。在一个实施方案中，第二种治疗剂是与Ang-2抑制剂有利组合的任意试剂。可与Ang-2抑制剂有利组合的代表性试剂包括，但不限于，任何抑制或减少血管生成的试剂，其他癌症治疗剂，抗炎剂，细胞因子抑制剂，生长因子抑制剂，抗造血因子，非甾体抗炎药物(NSAID)，抗病毒剂和抗生素。

在另一个方面，本发明提供了使用本发明的抗Ang-2抗体或抗体的抗原结合部分抑制Ang-2活性的方法，其中所述治疗方法包括施用治疗有效量的包含本发明的抗体或抗体的抗原结合片段的药物组合物。治疗的疾病是通过去除、抑制或减少Ang-2活性改善、减轻、抑制或预防的任意疾病或病症。优选地，本发明的抗Ang-2抗体或抗体片段在治疗由血管生成过程导致的、与其相关的或通过其持续的任意病或病症中有用。在本发明的某些实施方案中，抗Ang-2抗体或其抗原结合部分在治疗癌症中有用。在癌症治疗的情况下，本发明的抗Ang-2抗体或其抗原结合部分可单独施用或与其他抗癌治疗抗体、化学治疗剂和/或放射治疗组合施用。在本发明的其他实施方案中，抗Ang-2抗体或其抗原结合片段在治疗一种多种眼部疾病，例如年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变等和/或一种或多种炎症或传染性疾病中有用。

在检阅了随后的详细描述后，其他实施方案将变得显而易见。

附图简述

图1是人Ang-2的最后88个C端氨基酸(SEQ ID NO：518的残基409至496)与人Ang-1(SEQ ID NO：531)的相应氨基酸序列的比对。用白色文本和黑色阴影指示hAng-1和hAng-2之间有差异的残基。星号(*)指示通过晶体结构分析显示与人Tie-2相互作用的hAng-2的氨基酸。见Barton等人，Nat.Struct.Mol.Biol.13：524-532(2006)。三角形(▲)指示在hAng-2和hAng-1之间有差异的与Tie-2相互作用的氨基酸的位置。

图2(图A-C)描述了蛋白质印迹的结果，其说明Ang-2结合分子抑制或无法抑制Ang-1诱导的Tie-2磷酸化的程度。

图3是实施例13的Ang-2FD-mFc点突变结合实验的总结，其显示了相对检测的多种抗体和肽抗体(peptibody)的野生型，导致解离T1/2减少超过5倍的氨基酸变化(用实心圆●描述)。

发明详述

在描述本发明之前，应该理解，本发明并非局限于所描述的具体方法和实验条件，因为这些方法和条件是可以改变的。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，并非意在限制本发明，因为本发明之范围仅受所附权利要求书的限制。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语将具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。如本文使用的，术语“约”当在有关特定陈述的数值时使用时，指数值与陈述值可有不超过1％的改变。例如，如本文使用的，措辞“约100”包括99和101和所有在中间的数值(例如99.1，99.2，99.3，99.4等)。

尽管与本文所述的方法和材料类似或相当的任何方法和材料都可用于本发明之实施或试验，但现将描述的是首选的方法和材料。

定义

如本文使用的，除非被指定为来自非人物种(例如“小鼠Ang-2”，“猴Ang-2”等)，术语“血管生成素-2”或“Ang-2”指人Ang-2或其生物活性片段(例如能够在体外或体内诱导血管生成的Ang-2蛋白的片段)。人Ang-2由SEQ ID NO：517中所示的核酸序列编码并具有SEQ ID NO：518的氨基酸序列。小鼠和猴Ang-2蛋白的氨基酸序列可从NCBI蛋白质序列数据库中分别以NP_031452和BAE89705.1的登记号得到。

除非被指定为来自非人物种(例如“小鼠Ang-1”，“猴Ang-1”等)，术语“血管生成素-1”或“Ang-1”指人Ang-1或其生物活性片段。人Ang-1具有如在NCBI蛋白质序列数据库中以登记号AAB50557陈述的氨基酸序列。除非被指定为来自非人物种(例如“小鼠Tie-2”，“猴Tie-2”等)，术语“Tie-2”(在本领域中又称“TEK”)指人Tie-2或其生物活性片段。人Tie-2具有如在NCBI蛋白质序列数据库中以登记号AAA61130陈述的氨基酸序列。

如本文使用的术语“抗体”意指由四条多肽链即两条重链(H)和两条轻链(L)以二硫键相互连接而组成的免疫球蛋白分子，以及其多聚体(例如IgM)。每条重链包含一个重链可变区(本文简称HCVR或V_H)和一个重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域，C_H1、C_H2和C_H3。每条轻链包含一个轻链可变区(本文简称LCVR或V_L)和一个轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(C_L1)。V_H和V_L区可进一步分成被称为互补决定区(CDR)的高变区，其中散布着保守性更好的被称为框架区(FR)的区域。每个V_H和V_L由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同实施方案中，抗Ang-2抗体(或其抗原结合部分)的FR可与人种系序列相同，或可为天然的或人工改造的。可基于2个或多个CDR的并排分析确定氨基酸共有序列。

如本文使用的术语“抗体”也包括完整抗体分子的抗原结合片段。如本文使用的，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等等包括特异性结合抗原从而形成复合物的任意天然存在的、可酶促获得的、合成的或基因工程的多肽或糖蛋白。可使用任意合适的标准技术例如蛋白水解消化或涉及操纵和表达编码抗体可变结构域和任选的恒定结构域的DNA的重组基因工程技术从例如完整的抗体分子抗体得到抗原结合片段。这样的DNA是已知的，和/或容易从例如商业来源、DNA文库(包括，例如噬菌体抗体文库)中得到，或可被合成。可化学地或使用分子生物学技术测序和操纵DNA，例如将一个或多个可变和/或恒定结构域排列为合适的构型，或引入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、加入或缺失氨基酸等。

抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab′)₂片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体的高变区(例如分离的互补决定区(CDR))的氨基酸残基组成的最小识别单元。如本文使用的措辞“抗原结合片段”也包含其他经改造的分子，例如双抗体、三链抗体、四链抗体和微抗体(minibody)。

抗体的抗原结合片段将通常包含至少一个可变结构域。可变结构域可为任意大小或氨基酸组成，并将一般包含至少一个CDR，所述CDR邻近一个或多个框架序列或与一个或多个框架序列处于同一个读框中。在具有与V_L结构域相连的V_H结构域的抗原结合片段中，V_H和V_L结构域可处于相对彼此任意合适的排列。例如，可变区可为二聚的并包含V_H-V_H，V_H-V_L或V_L-V_L二聚体。可选地，抗体的抗原结合片段可包含单体的V_H或V_L结构域。

在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可包含与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。在本发明的抗体的抗原结合片段中可找到的可变和恒定结构域的非限制性代表性构型包括：(i)V_H-C_H1；(ii)V_H-C_H2；(iii)V_H-C_H3；(iv)V_H-C_H1-C_H2；(v)V_H-C_H1-C_H2-C_H3；(vi)V_H-C_H2-C_H3；(vii)V_H-C_L；(viii)V_L-C_H1；(ix)V_L-C_H2；(x)V_L-C_H3；(xi)V_L-C_H1-C_H2；(xii)V_L-C_H1-CH₂-C_H3；(xiii)V_L-C_H2-C_H3；和(xiv)V_L-C_L。在包括上面列出的任意代表性构型的任意可变和恒定结构域的构型中，可变和恒定结构域可直接彼此连接或可通过完整或部分的铰链或连接区连接。铰链区可由至少2个(例如5，10，15，20，40，60或更多个)氨基酸组成，其导致在单个多肽分子中邻近的可变和/或恒定结构域之间的弹性的或半弹性的连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可包含与彼此和/或与一个或多个单体V_H或V_L结构域非共价连接(例如通过二硫键)的上面列出的任意可变和恒定结构域构型的同源二聚体或异源二聚体(或其他多聚体)。

如同完整的抗体分子，抗原结合片段可为单特异性或多特异性的(例如双特异性)。抗体的多特异性抗原结合片段将通常包含至少2个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性结合单独的抗原或相同抗原上的不同表位。在本发明的抗体的抗原结合片段的上下文中可使用本领域现有的常规技术改造任意的多特异性抗体形式(包括本文公开的代表性双特异性抗体形式)。

抗体的恒定区对抗体固定补体和介导细胞依赖的细胞毒性的能力是很重要的。因此，可基于是否期望抗体介导细胞毒性选择抗体的同种型。

本文所用的术语“人抗体”意在包括含有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明之人抗体可包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机诱变或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变而引入的突变)，例如可在CDR中尤其是在CDR3中包括这样的氨基酸残基。但是，本文所用的术语“人抗体”并不意在包括其中衍生自另一哺乳动物物种如小鼠的CDR序列被嫁接到人构架序列上的抗体。

如本文使用的，术语“重组人抗体”意在包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染进宿主细胞(下文进一步描述)的重组表达载体表达的抗体，从重组的组合人抗体文库(下文进一步描述)分离的抗体，从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)中分离的抗体(见例如Taylor等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)或通过任意其他涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接为其他DNA序列的手段制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在某些实施方案中，这样的重组人抗体经历了体外突变(或，当使用人Ig序列的转基因动物时，经历了体内体细胞突变)，且因此重组抗体的V_H和V_L区的氨基酸序列尽管源自人种系V_H和V_L序列并与人种系V_H和V_L序列相关，但可能不天然地存在于体内的人抗体种系库中。

人抗体可以两种与铰链异质性相关的形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含约150-160kDa的稳定的四链构造，其中通过链间的重链二硫键将二聚体维持在一起。在第二种形式中，二聚体不通过链间二硫键连接，而形成由共价连接的轻和重链组成的约75-80kDa的分子(半抗体)。这两种形式的分离一直极为困难，甚至在亲和纯化后亦如此。

第二种形式在多种完整IgG同种型中出现的频率取决于(但不限于)与抗体的铰链区同种型相关的结构差异。在人IgG4铰链的铰链区中的单个氨基酸取代可将第二种形式的出现显著降低(Angal等人(1993)Molecular Immunology 30：105)至通常使用人IgG1铰链所观察到的水平。本发明包含在铰链、C_H2或C_H3区中具有一个或多个突变的抗体，其可理想地用于，例如在生产中提高期望的抗体形式的产量。

本文所用的“分离抗体”意指基本上不含其它具有不同抗原特异性的抗体(例如特异性结合人Ang-2或人Ang-2片段的分离抗体在实质上不含特异性结合人Ang-2之外抗原的抗体)。术语“特异性结合”或类似术语指抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合可通过约1x10^-8M或更小的K_D表征。测定两个分子是否特异性结合的方法是本领域熟知的，并包括例如平衡透析、表面等离子共振，等等。但是，特异性结合人Ang-2的分离抗体对于其它抗原如来自其它物种的Ang-2分子可具有交叉反应性。此外，分离抗体可基本上不含其他细胞物质和/或化学品。

如本文使用的，“中和”或“封闭”抗体意指其与Ang-2的结合将阻断Ang-2与其受体(Tie-2)的相互作用和/或导致Ang-2的至少一种生物活性被抑制的抗体。通过Ang-2中和/或阻断抗体引起的抑制不需要是完全的，只要其可使用合适的测定被检测出即可。用于检测Ang-2抑制的代表性测定在本文别处描述。

本文公开的全人抗Ang-2抗体与相应的种系序列相比，可在重和轻链可变结构域的框架和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、***和/或缺失。通过比较本文公开的氨基酸序列和可由例如公开的抗体序列数据库获得的种系序列，可容易地确定这些突变。本发明包括源自本文公开的任意氨基酸序列的抗体及其抗原结合片段，其中在一个或多个框架和/或CDR区内的一个或多个氨基酸被回复突变为相应的种系残基或相应的种系残基的(天然或非天然的)保守氨基酸取代(这样的序列变化在本文中被称为“种系回复突变”)。本领域普通技术人员从本文公开的重和轻链可变区序列开始，可容易地产生许多包含一个或多个单独的种系回复突变或其组合的抗体和抗原结合片段。在某些实施方案中，在V_H和/或V_L结构域内的所有框架和/或CDR残基被回复突变为种系序列。在其他实施方案中，只有某些残基被回复突变为种系序列，例如只有在FR1的开始8个氨基酸内或在FR4的最后8个氨基酸内找到的突变残基，或只有在CDR1，CDR2或CDR3内找到的突变残基。此外，本发明的抗体可包含在框架和/或CDR区内的2种或多种种系回复突变的任意组合，即其中某些单独的残基被回复突变为种系序列，而某些不同于种系序列的其他残基被保留。一旦得到后，可容易地检测包含一种或多种种系回复突变的抗体和抗原结合片段的一种或多种期望的性能，例如提高的结合特异性、增强的结合亲和力、提高或增强的拮抗或激动的生物性能(看情形而定)、降低的免疫原性等等。本发明包含以此一般方式得到的抗体和抗原结合片段。

本发明也包括包含具有一个或多个保守取代的本文公开的任意HCVR，LCVR和/或CDR氨基酸序列变体的抗Ang-2抗体。例如，本发明包括相对本文公开的任意HCVR，LCVR和/或CDR氨基酸序列具有例如10个或更少，8个或更少，6个或更少，4个或更少等的保守氨基酸取代的HCVR，LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗Ang-2抗体。在一个实施方案中，抗体包含具有8个或更少的保守氨基酸取代的具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HCVR。在另一个实施方案中，抗体包含具有6个或更少的保守氨基酸取代的具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HCVR。在另一个实施方案中，抗体包含具有4个或更少的保守氨基酸取代的具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HCVR。在另一个实施方案中，抗体包含具有2个或更少的保守氨基酸取代的具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HCVR。在一个实施方案中，抗体包含具有8个或更少的保守氨基酸取代的具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的LCVR。在另一个实施方案中，抗体包含具有6个或更少的保守氨基酸取代的具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的LCVR。在另一个实施方案中，抗体包含具有4个或更少的保守氨基酸取代的具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的LCVR。在另一个实施方案中，抗体包含具有2个或更少的保守氨基酸取代的具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的LCVR。

如本文使用的术语“表面等离子共振”指通过例如使用BIAcore^TM***(GE Healthcare，Piscataway，NJ的Biacore Life Sciences部门)检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的改变，允许分析实时相互作用的光学现象。

本文所用的术语“K_D”意指特定的抗体-抗原相互作用的平衡离解常数。

术语“表位”指与被称为互补位的抗体分子可变区中的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可具有多于一个表位。因此，不同的抗体可结合抗原的不同区域并可具有不同的生物学效应。表位可为构象的或线性的。构象表位通过来自线性多肽链的不同片段的空间并列的氨基酸产生。线性表位是通过多肽链中的邻近氨基酸残基产生的表位。在某些情况下，表位可包括在抗原上的糖、磷酸基或磺酰基部分。

术语“基本上同一性”或“基本上相同”当指核酸或其片段时，表示当以适当的核苷酸***或删除与另一个核酸(或其互补链)最佳比对时，用下述任何著名的序列同一性算法如FASTA、BLAST或GAP测量，在至少约95％，更优选的至少约96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中具有核苷酸序列同一性。与参考核酸分子具有基本上同一性的核酸分子可在某些情况下编码具有与参考核酸分子编码的多肽相同或基本上相似的氨基酸序列的多肽。

当应用于多肽时，术语“基本上相似”指两个肽序列用诸如GAP或BESTFIT等程序的默认间隙权重达排列到最佳比对时，两者至少有95％的序列相同性，更优选地至少有98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置的差别仅在于保守的氨基酸取代。“保守的氨基酸取代”是指这样一种取代，即一个氨基酸残基被另一个含有化学性质(例如电荷或疏水性)相似侧链(R基团)的氨基酸残基所取代。一般来说，保守的氨基酸取代不会在实质上改变蛋白质的功能性质。在两个或更多的氨基酸序列相互之间的差别仅在于某些保守取代的情况中，可将序列相似性程度向上调整，以针对取代的保守特性作出校正。进行这种调整的方法是本领域技术人员所熟知的。参阅例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331。含有化学性质相似侧链的氨基酸类别的实例包括：1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬氨酸和谷氨酰胺；4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和6)含硫侧链：天冬氨酸盐和谷氨酸盐，以及7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守的取代是Gonnet等人(1992)Science 256：144345中所公开的PAM250对数似然矩阵(PAM250 log-likelihood matrix)中任何正值的变化。“中度保守的”取代是PAM250对数似然矩阵中非负值的任何变化。

多肽的序列相似性(又称序列同一性)通常用序列分析软件来测量。蛋白质分析软件是用指定给各种取代(包括保守氨基酸取代)、缺失和其它修饰的相似性程度对相似的序列进行比对。例如，GCG软件含有诸如Gap和Bestfit的程序，可以默认参数使用这些程序，以确定紧密相关的多肽例如来自不同生物物种的同源多肽之间的序列同源性或序列同一性，或者野生型蛋白质及其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参阅例如GCG版本6.1。还可以用GCG版本6.1中的FASTA程序以默认参数或推荐参数来比较多肽序列。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)能提供被查询序列和被搜索序列之间的最佳重迭区域的比对和序列同一性百分数(Pearson(2000)，出处同上)。当将本发明之序列与含有大量的源自不同生物的序列的数据库进行比较时，另一优选的算法是BLAST计算机程序，尤其是BLASTP或TBLASTN，使用默认参数。参阅如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403410及(1997)Nucleic Acids Res.25：3389 402.

人抗体的制备

产生单克隆抗体，包括全人单克隆抗体的方法是本领域已知的。在本发明的上下文中可使用任意这样的已知方法用于产生特异性结合人Ang-2和具有本文公开的任意代表性抗Ang-2抗体的一种或多种抗原结合和/或功能特征的人抗体。

使用VELOCIMMUNE^TM技术或任意其他已知的用于产生单克隆抗体的方法，最初分离了具有人可变区和小鼠恒定区的针对Ang-2的高亲和力嵌合抗体。在如下实施例章节中，表征抗体和并选择理想的特征，包括亲和力、选择性、表位等。用期望的人恒定区替换小鼠恒定区以产生本发明的全人抗体，例如野生型或修饰的IgG1或IgG4。尽管选择的恒定区可根据特定用途而改变，高亲和力抗原结合和靶特异性特征驻留在可变区中。

生物等价物

本发明的抗Ang-2抗体和抗体片段包含具有与所述抗体不同的氨基酸序列，但保留结合人Ang-2的能力的蛋白质。当与亲本序列比较时，这样的变体抗体和抗体片段包含一个或多个氨基酸加入、缺失或取代，但展示与所述抗体基本上等价的生物学活性。类似地，当与公开的序列比较时，本发明的抗Ang-2抗体的DNA编码序列包含一个或多个核苷酸加入、缺失或取代，但编码与本发明的抗Ang-2抗体或抗体片段基本上生物等价的抗Ang-2抗体或抗体片段。这样的变体氨基酸和DNA序列的实例已在上文讨论。

如果两种抗原结合蛋白或抗体是医药等效物或医药替代物，当在相似实验条件下无论以单剂或以多剂方式以相同摩尔剂量给药时，其吸收速率和程度均未显示显著差别，则它们被认为是生物等效的。某些抗体如果它们的吸收程度相当但吸收速率不相当，它们将被认为是等效物或药物替代物，并仍可被认为是生物等效的，因为这种吸收速率的差别是有意设计的并反映在标签上，这种差别对于达到有效的体内药物浓度是非关键性的(例如对于慢性用途)，并被认为对于所研究的特定医药产品在医学上是无关重要的。

在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在安全性、纯度和药效方面没有临床意义上的差别，则它们是生物等效的。

在一个实施方案中，如果一名患者可以在对照产品和生物产品之间转换一次或多次而不良副作用的风险并未如预期那样增加，包括与无这种转换的连续治疗相比在免疫原性方面无显著的临床变化或效率降低，则两种抗原结合蛋白就是生物等效的。

在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在使用条件下都以一种或多种共同的作用机制起作用，且这类机制是众所周知的，则它们就是生物等效的。

生物等效性可以体内和体外的方法演示。生物等效性的测量包括，例如，(a)一种在人类或其它哺乳类动物体内的试验，其中血液、血浆、血清或其它生物体液中抗体或其代谢物的浓度是作为时间的函数测定的；(b)一种体外试验，该试验已与人的体内试验生物利用率数据建立相关联系并可根据人的体内试验生物利用率数据合理预测；(c)一种人类或其它哺乳类动物的体内试验，其中抗体(或其目标)适当的急性药理作用是作为时间的函数测定的；以及(d)一种控制良好的临床试验，该试验确定抗体的安全性、有效性，或生物利用率或生物等效性。

本发明抗Ang-2抗体的生物等效变体可通过例如取代生物活性不需要的各种残基或序列或删除生物活性不需要的端部或内部残基或序列而构建。例如，对于生物活性并非必需的半胱氨酸残基可被删除或被其它氨基酸取代，以防在复原时形成不必要或不正确的分子内二硫化物桥。

抗体的生物和治疗特性

大体上，当通过与固定在固相上的或在溶液相中的抗原结合测量时，本发明的抗体以小于100pM的K_D，一般以小于50pM的K_D，和在某些实施方案中，以小于40pM的K_D与人Ang-2结合。

另外，本发明的某些代表性抗Ang-2抗体可展示一种或多种以下特征：(1)结合人Ang-2但不结合小鼠Ang-2的能力；(2)结合人Ang-2和结合小鼠Ang-2的能力；(3)结合人Ang-2但不结合人Ang-1，-3或-4的能力；(4)结合人Ang-2但不结合小鼠Ang-1，-3或-4的能力；(5)结合人Ang-2和结合Ang-1，-3或-4的能力；(6)结合人Ang-2和结合小鼠Ang-1，-3或-4的能力；(7)阻断人Ang-2结合人Tie-2的能力；(8)阻断人Ang-2结合小鼠Tie-2的能力；(9)阻断小鼠Ang-2结合人Tie-2的能力；(10)阻断小鼠Ang-2结合小鼠Tie-2的能力；(11)阻断人Ang-1结合人Tie-2的能力；(12)阻断人Ang-1结合小鼠Tie-2的能力；(13)阻断小鼠Ang-1结合人Tie-2的能力；(14)阻断小鼠Ang-1结合小鼠Tie-2的能力；(15)抑制人Ang-2诱导的人Tie-2的磷酸化的能力；(16)抑制人Ang-2诱导的小鼠Tie-2的磷酸化的能力；(17)抑制小鼠Ang-2诱导的人Tie-2的磷酸化的能力；(18)抑制小鼠Ang-2诱导的小鼠Tie-2的磷酸化的能力；(19)抑制人Ang-1诱导的人Tie-2的磷酸化的能力；(20)抑制人Ang-1诱导的小鼠Tie-2的磷酸化的能力；(21)抑制小鼠Ang-1诱导的人Tie-2的磷酸化的能力；(22)抑制小鼠Ang-1诱导的小鼠Tie-2的磷酸化的能力；(23)在一个实验模型中抑制体内血管生成的能力(例如通过在裸鼠皮下植入包含MCF-7细胞的基质胶栓(Matrigelplug)诱导血管生成)；和/或(24)在小鼠异种移植模型中抑制或减少肿瘤体积的能力。

本发明也包括以高亲和力与包含Ang-2纤连蛋白样结构域但缺乏Ang-2N端卷曲螺旋结构域的构建体(这样的构建体在本文中被称为“Ang-2FD”)结合的抗体。代表性Ang-2FD构建体包括人Ang-2FD(SEQ IDNO：519)，小鼠Ang-2FD(SEQ ID NO：520)和猴Ang-2FD(SEQ ID NO：521)。人、小鼠和猴Ang-2FD构建体可为单体或二聚体。Ang-2FD构建体也可包括其他非Ang-2氨基酸序列，例如与Ang-2FD分子连接的人或小鼠Fc结构域。另一种代表性Ang-2FD构建体在本文中被称为“hBA2”(或人“bow-Ang2”)，其是通过人或小鼠Fc结构域彼此连接从而形成类似蝴蝶结的构型的人Ang-2纤连蛋白样结构域的四聚体。hBA2一般由2个Ang-2二聚体组成，其中每个Ang-2二聚体包含2个通过Fc结构域彼此连接的Ang-2纤连蛋白样结构域。代表性hBA2成分包括名为hBA2-hIgG1(SEQ IDNO：522)和hBA2-mIgG2a(SEQ ID NO：523)的多肽。出人意料地，发现本发明的某些抗Ang-2抗体以比已知的Ang-2对照抗体高得多的亲和力结合Ang-2FD构建体(见本文陈述的实施例)。

在抗Ang-2抗体结合人或小鼠二聚体Ang-2FD构建体的上下文中，高亲和力结合指抗Ang-2抗体以小于300pM的K_D结合人或小鼠二聚体Ang-2FD。例如，如在25℃下在表面等离子共振测定中测量的，以高亲和力结合人或小鼠二聚体Ang-2FD的抗Ang-2抗体包括以小于300pM、小于250pM、小于200pM、小于190pM、小于180pM、小于170pM、小于160pM、小于150pM、小于140pM、小于130pM、小于120pM、小于110pM、小于100pM、小于90pM、小于80pM、小于70pM、小于60pM或小于50pM的K_D结合人或小鼠二聚体Ang-2-FD的抗体。

在抗Ang-2抗体结合猴二聚体Ang-2FD构建体的上下文中，高亲和力结合指抗Ang-2抗体以小于500pM的K_D结合猴二聚体Ang-2FD。例如，如在25℃下在表面等离子共振测定中测量的，以高亲和力结合猴二聚体Ang-2FD的抗Ang-2抗体包括以小于500pM、小于450pM、小于400pM、小于350pM、小于300pM、小于250pM、小于200pM、小于190pM、小于180pM、小于170pM、小于160pM、小于150pM、小于140pM、小于130pM、小于120pM、小于110pM、小于100pM、小于90pM或小于80pM的K_D结合猴二聚体Ang-2-FD的抗体。

在抗Ang-2抗体结合人单体Ang-2FD构建体的上下文中，高亲和力结合指抗Ang-2抗体以小于40nM的K_D结合人单体Ang-2FD。例如，如在25℃下在表面等离子共振测定中测量的，以高亲和力结合人单体Ang-2FD的抗Ang-2抗体包括以小于40nM、小于30nM、小于25nM、小于20nM、小于15nM、小于10nM、小于9nM、小于8nM、小于7nM、小于6nM、小于5nM、小于4nM、小于3nM、小于2nM、小于1nM、小于0.9nM、小于0.8nM、小于0.7nM或小于0.6nM的K_D结合人单体Ang-2-FD的抗体。

在抗Ang-2抗体结合hBA2构建体的上下文中，高亲和力结合指抗Ang-2抗体以小于80pM的K_D结合hBA2。例如，如在25℃下在表面等离子共振测定中测量的，以高亲和力结合hBA2的抗Ang-2抗体包括以小于80pM、小于75pM、小于70pM、小于65pM、小于60pM、小于55pM、小于50pM、小于45pM、小于40pM、小于35pM、小于30pM、小于25pM、小于20pM、小于18pM、小于16pM、小于14pM或小于12pM的K_D结合hBA2的抗体。

本发明包括结合Ang-2但基本不结合Ang-1的抗体。如本文使用的，当在表面等离子共振测定中检测与Ang-1的结合时，如果抗体展示大于约1nM的K_D，例如大于约5nM、大于约10nM、大于约50nM、大于约100nM、大于约150nM、大于约200nM、大于约250nM、大于约300nM、大于约350nM、大于约400nM、大于约450nM、大于约500nM或更高的K_D，则抗体“基本不结合Ang-1”，在所述测定中抗体被捕获在表面上，且全长野生型人Ang-1以约25nM的浓度以约60μl/分钟的流速在25℃下注射在捕获抗体表面上约3分钟。(见例如实施例4)。另外，当在这样的测定或其等价测定中检测时，如果抗体不能展示与Ang-1的任何结合，则抗体“基本不结合Ang-1”。

本发明也包括阻断Ang-2结合Tie2但基本不阻断Ang-1结合Tie-2的抗体。如本文使用的，如果当抗体与Ang-1抗原以约100∶1(抗体∶抗原)的比例预混合并允许在25℃下孵育约60分钟，然后通过表面等离子共振在Tie-2覆盖的表面上检测平衡的混合物与Tie-2的结合(5μl/分钟进行5分钟，在25℃下)，与Tie-2结合的Ang-1的量是在不相关的对照分子的存在下的与Tie-2结合的Ang-1量的至少50％时，抗体“基本不阻断Ang-1结合Tie-2”。(见，例如实施例6)。例如，如果在与抗体预孵育后与Tie-2结合的Ang-1的量是在上述实验条件下与不相关的对照分子预孵育后与Tie-2结合的Ang-1的量至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％，则认为抗体“基本不阻断Ang-1结合Tie-2”。

另外，本发明包括阻断或实质减弱Ang-2的生物学活性(例如Ang-2介导的Tie-2的磷酸化；Ang-2诱导的血管生成；等)但不阻断或实质减弱Ang-1的相应的生物学活性(例如Ang-1介导的Tie-2的磷酸化；Ang-1诱导的血管生成；等)的抗体。用于测定抗体是否满足一种或多种上面列出的特征的测定和试验将是本领域普通技术人员容易知道和容易实践的，和/或可通过本公开充分确定。例如，下面详细描述的实验程序可用于测定给定的抗体是否结合或不结合Ang-2和/或Ang-1；阻断或不阻断Ang-2和/或Ang-1结合Tie-2；抑制或不抑制Ang-2和/或Ang-1介导的Tie-2的磷酸化；等。

表位作图和相关技术

为筛选能与特定表位结合的抗体(例如能阻断IgE与其高亲和力受体结合的抗体)，可进行常规的交联-阻断分析，如“Antibodies”，Harlow和Lane(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harb.，NY)中所述。其它方法包括丙氨酸扫描突变体分析、肽印迹分析(Reineke(2004)Methods Mol Biol 248：443-63)或肽切割分析。另外，还可采用诸如抗原的表位切除、表位提取和化学修饰的方法(Tomer(2000)Protein Science9：487-496)。

术语“表位”是指抗原上B细胞和/或T细胞对其作出响应的位点。B细胞表位可由毗连的氨基酸形成，或者由通过蛋白质的三级折迭而并列在一起的非毗连氨基酸形成。由毗连氨基酸形成的表位在接触变性溶剂时通常可得以保留，而通过三级折迭形成的表位在用变性溶剂处理时通常会失去。表位通常包括至少3个、更经常是至少5个或8-10个以独特空间构象出现的氨基酸。

修饰辅助概况分析(Modification-Assisted Profiling，MAP)，也被称为基于抗原结构的抗体谱分析(Antigen Structure-based AntibodyProfiling，ASAP)，是一种根据每种抗体与经化学或酶学修饰的抗原表面的结合状况的相似性对大量的抗同一抗原的单克隆抗体(mAb)进行分类的方法(美国专利2004/0101920号)。每一类均可反映与另一类所代表的表位截然不同或部分重迭的独特表位。这种技术可以快速过滤遗传上相同的mAb，从而可使鉴定工作集中在遗传上不同的mAb上。当应用于杂交瘤筛选时，MAP有助于鉴定某些罕见杂交瘤克隆，后者能产生具有所需特性的mAbs。MAP可用来将本发明的抗Ang-2抗体分类成结合不同表位的抗体组。

抗Ang-2抗体可结合氨基端卷曲螺旋结构域内的表位或羧基端纤连蛋白样结构域(“FD”)内的表位。在本发明的优选实施方案中，抗Ang-2抗体及其抗原结合片段结合FD内的表位。

已从晶体结构分析中确定了Ang-2的FD内的与Tie-2相互作用的氨基酸。见Barton等人，Nat.Struct.Mol.Biol.13：524-532(2006年5月)。就阻断Ang-2结合Tie-2但基本不阻断Ang-1结合Tie-2的抗体(例如H1H685P，见下面的实施例5和6)而言，这些抗体结合的表位可包含Ang-2的(a)与Tie-2相互作用和(b)与Ang-1中的相应氨基酸不相同的一个或多个氨基酸。(见图1)。因此，这样的Ang-2优先抗体结合的表位可包含hAng-2(SEQ ID NO：518)的一个或多个以下氨基酸：S-417；K-432；I-434；N-467；F-469；Y-475；或S-480。例如，本发明者已发现，与Ang-2(SEQ ID NO：518)的氨基酸F-469，Y-475，和S-480相互作用的抗体优先与Ang-2而不是Ang-1相互作用，且此优先的结合可具有治疗益处。因此，本发明包括特异性结合人血管生成素-2(hAng-2)但基本不结合hAng-1的抗Ang-2抗体，其中所述抗体结合包含氨基酸F-469，Y-475，和S-480的hAng-2(SEQ ID NO：518)上的表位。类似地，本发明包括阻断hAng-2结合hTie-2但基本不阻断hAng-1结合hTie-2的抗Ang-2抗体，其中所述抗体结合包含氨基酸F-469，Y-475，和S-480的hAng-2(SEQ IDNO：518)上的表位。

本发明包括与本文描述的任意特定的代表性抗体(例如H1H685，H1H690，H1H691，H1H696，H1H706，H1M724和/或H2M744)结合相同表位的抗Ang-2抗体。同样地，本发明也包括与本文描述的任意特定的代表性抗体(例如H1H685，H1H690，H1H691，H1H696，H1H706，H1M724和/或H2M744)竞争结合Ang-2的抗Ang-2抗体。

使用本领域内已知的常规方法，可以容易地确定一种抗体是否与本发明之对照抗Ang-2抗体一样与同样的表位结合，或在结合过程中竞争。例如，为了确定一种试验抗体是否与本发明之对照抗Ang-2抗体一样与同样的表位结合，让该对照抗体与Ang-2蛋白或肽在饱和条件下结合。然后，评估试验抗体与该Ang-2分子结合的能力。如果该试验抗体在与对照抗Ang-2抗体饱和结合之后能够与Ang-2结合，就可得出结论，该试验抗体和对照抗Ang-2抗体与不同的表位结合。在另一方面，如果该试验抗体在与对照抗Ang-2抗体饱和结合之后不能与Ang-2分子结合，那么该试验抗体就可与本发明之对照抗Ang-2抗体所结合的同一表位结合。然后可进行其它常规实验(例如肽突变和结合分析)以确定是否观察到的试验抗体的结合不足实际上是由于与对照抗体所结合的同一表位结合，或是否空间阻断(或另一现象)是观察到的结合不足的原因。这类实验可采用ELISA、RIA、表面等离子体共振技术、流式细胞计量法或本领域内所具备的任何其它定量或定性的抗体结合分析。依照本发明的某些实施方案，如果，例如，如在竞争结合测定中所测量的，1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量的一种抗体抑制至少50％，但优选75％，90％或甚至99％的另一种抗体的结合(见例如Junghans等人，Cancer Res.199050：1495-1502)，则两种抗体结合相同(或重叠)的表位。可选地，如果抗原中降低或消除一种抗体结合的几乎所有的氨基酸突变能降低或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体具有相同的表位。如果降低或消除一种抗体结合的仅部分氨基酸突变能降低或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体具有“重叠的表位”。

为了确定一种抗体是否与对照抗Ang-2抗体在结合过程中竞争，在两个方向实施上述结合方法：在第一个方向，让对照抗体与Ang-2分子在饱和条件下结合，然后评估试验抗体与该Ang-2分子的结合。在第二个方向，让试验抗体与Ang-2分子在饱和条件下结合，然后评估对照抗体与该Ang-2分子的结合。如果在这两个方向只有第一个(饱和)抗体能够与Ang-2分子结合，那就可以得出结论，该试验抗体与对照抗体在与Ang-2结合的过程中竞争。如同本领域普通技术人员所能理解的，与对照抗体在结合过程中竞争的抗体未必与对照抗体所结合的同一表位结合，但可与一个重叠或邻近的表位结合而在空间上阻断该对照抗体。

物种选择性和物种交叉反应性

根据本发明的某些实施方案，抗Ang-2抗体结合人Ang-2但不结合来自其他物种的Ang-2。可选地，本发明的抗Ang-2抗体在某些实施方案中结合人Ang-2并结合来自一种或多种非人物种的Ang-2。例如，本发明的Ang-2抗体可结合人Ang-2，且可结合或不结合(视情况而定)一种或多种小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、猕猴(cynomologous)、绒猴(marmoset)、恒河猴(rhesus)或黑猩猩Ang-2。

免疫缀合物

本发明包括一种与治疗基团(“免疫缀合物”)如细胞毒素、化疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素等缀合的抗Ang-2单克隆抗体。细胞毒素包括任何损害细胞的试剂。适宜于形成免疫缀合物的细胞毒素和化疗剂的例子是本领域内众所周知的。参阅如WO 05/103081。

多特异性抗体

本发明之抗体可以是单特异性的、双特异性的，或多特异性的。多特异性mAb可以针对同一目标多肽的不同表位，或可含有针对一个以上目标多肽的抗原结合域。参阅，如Tutt等人(1991)J.Immunol.147：60-69。本发明的抗Ang-2抗体或其部分可连接到另一个功能分子，例如另一个肽或蛋白质上，或与之共同表达以形成多特异性分子。例如，一种抗体或其片段可与一种或多种其它分子实体如另一种抗体或抗体片段实现功能性(例如以化学偶联、基因融合、非共价键连接或其它方式)连接，以产生具有第二种结合特异性的双特异性或多特异性抗体。

可用于本发明的代表性双特异性抗体形式涉及使用第一个免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二个Ig CH3结构域，其中第一个和第二个Ig CH3结构域相互之间相差至少一个氨基酸，且与无氨基酸差别的双特异性抗体相比，其中至少一个氨基酸的差别降低了双特异性抗体与蛋白A的结合力。在一个实施方案中，第一个Ig CH3结构域与蛋白A结合，第二个Ig CH3结构域含有一个降低或消除与蛋白A结合的突变，例如一个H95R修饰(按照IMGT表现序列编号法；按照欧盟编号法则为H435R)。第二个CH3结构域可进一步包含一个Y96F修饰(按照IMGT编号法；按照欧盟编号法则为Y436F)。可在第二个CH3域内找到的其它修饰包括：在IgG1抗体的情况下为D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(按照IMGT编号法；按照欧盟编号法则为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2抗体的情况下为N44S、K52N和V82I(按照IMGT编号法；按照欧盟编号法则为N384S、K392N和V422I)；以及在IgG4抗体的情况下为Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(按照IMGT编号法；按照欧盟编号法则为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上述双特异性抗体的各种变化形式均被认为是在本发明的范围之内。

治疗配方和施用

本发明提供了含有本发明之抗Ang-2抗体或其抗原结合片段的治疗组合物。本发明之治疗组合物可还包含一种或多种可药用的载体、赋形剂以及其它加入配方中以提供改善的转移、递送、耐受性等的试剂(在本文中统称为“可药用的载体或稀释剂”)。在药剂化学师所熟知的处方集里可以找到大量的适宜配方：雷氏药学大全：Remington′s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Company，Easton，PA.。这些配方包括，如粉剂、糊剂、油膏、凝胶、蜡剂、油剂、脂类、含有脂(阳离子或阴离子)的泡囊(如LIPOFECTIN)、DNA缀合物、无水吸收性糊剂、水包油或油包水乳剂、乳胶状碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体状凝胶以及含有聚乙二醇的半固体状混合物。还可参阅Powell等人Compendium ofExcipients for Parenteral Formulations(非肠道用配方赋形剂概论)，PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311。

抗体的剂量可根据待施用的受试者的年龄和体形大小、目标疾病、病症、施用途径等因素而改变。一般根据体重或体表面积计算优选剂量。当本发明之抗体用于治疗在成年患者中与Ang-2活性相关的病症和疾病时，通过静脉内施用本发明之抗体是有利的，通常是按照约0.01至约20mg/kg体重，更优选的是按照约0.02至7、约0.03至约5，或约0.05至约3mg/kg体重的单一剂量。取决于病症的严重程度，治疗的频率和持续时间可以调节。用于施用Ang-2抗体的有效剂量和时间表可通过经验确定；例如可通过周期性评估监控患者的进展，并相应地调节剂量。另外，可使用本领域熟知的方法进行剂量的物种间缩放(例如，Mordenti等人，1991，Pharmaceut.Res.8：1351)。

各种递送***是已知的并可用于施用本发明之药物组合物，例如封装于脂质体、微粒、微胶囊中、能表达突变体病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参阅例如Wu等人(1987)J.Biol.Chem.262：4429-4432)。给药方法包括但不限于皮内、肌内、腹腔内、静脉、皮下、经鼻、硬膜外以及经口给药。该组合物可以任何方便的途径给药，例如，输注或快速注射，经上皮或粘膜(例如口腔黏膜、直肠和肠黏膜等)吸收，并可与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身性或局部性的。

本发明之药物组合物可用标准的针头和针筒经皮下或静脉递送。此外，对于皮下递送，一种笔型递送装置可方便地用于递送本发明之药物组合物。这种笔型递送装置可以重复使用或一次性使用。可重复使用的笔型递送装置一般采用一种可更换的含药物组合物的药筒。一旦药筒内所有药物组合物均已施用、药筒变空，则可方便地丢弃空药筒，并用一个含药物组合物的新药筒取代。然后该笔型递送装置可重复使用。在一次性使用的笔型递送装置中，没有可更换的药筒。而是，该一次性使用的笔型递送装置有一个预先充满药物组合物的贮液器。一旦该贮液器内药物组合物用完，整个装置则被丢弃。

许多可重复使用的笔型和自动注射递送装置已用于本发明之药物组合物的皮下给药。其例子包括但当然不限于AUTOPEN^TM(Owen Mumford，Inc.，Woodstock，英国)、DISETRONIC^TM笔(Disetronic Medical Systems，Burghdorf，瑞士)、HUMALOG MIX 75/25^TM笔、HUMALOG^TM笔、HUMALIN 70/30^TM笔(Eli Lilly and Co.，印第安纳州印第安纳波利斯)、NOVOPEN^TM I、II和III型(Novo Nordisk，哥本哈根，丹麦)、NOVOPEN JUNIOR^TM(NovoNordisk，哥本哈根，丹麦)、BD^TM笔(Becton Dickinson，新泽西州富兰克林湖)、OPTIPEN^TM、OPTIPEN PRO^TM、OPTIPEN STARLET^TM，以及OPTICLIK^TM(sanofi-aventis，德国法兰克福)，此处仅列举几个品牌。用于本发明之医药组合物皮下给药的一次性使用的笔型给药装置的例子包括但当然不限于SOLOSTAR^TM笔(sanofi-aventis)，FLEXPEN^TM(Novo Nordisk)，以及KWIKPEN^TM(Eli Lilly)。

用于治疗眼部疾病，可例如通过眼药水、结膜下注射、结膜下植入、玻璃体内注射、玻璃体内植入、眼球囊下(sub-Tenon)注射或眼球囊下植入施用本发明抗体和抗原结合片段。

该医药组合物也可以囊泡尤其是脂质体形式递送(参阅Langer(1990)Science 249：1527-1533；Treat等人(1989)in Liposomes in the Therapyof Infectious Disease and Cancer(脂质体用于传染病和癌症治疗)，Lopez-Berestein和Fidler(编)，Liss，New York，pp.353-365；Lopez-Berestein，ibid.，pp.317-327；一般参阅同上)。

在某些情况下，该药物组合物可以一种控制性释放***给药。在一个实施方案中，可使用一个泵(参阅Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201)。在另一个实施方案中，可采用聚合物材料。在又一个实施方案中，可将一种控制释放***置于该组合物目标的附件，从而只需要全身性剂量的一部分(参阅例如，Goodson，1984，in Medical Applicationsof Controlled Release(控制释放的医学应用)，出处同上，vol.2，pp.115-138)。

可注射制剂可包括静脉、皮下、皮内和肌内注射、滴注输液等剂型。这些可注射制剂可以公知的方法制备。例如，可以将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在无菌水介质或通常用于注射的油性介质中，以此方式制备该可注射制剂。作为注射用的水介质有例如生理盐水、含葡萄糖和其它助剂的等渗溶液等，可结合使用适当的增溶剂，如醇(如乙醇)、多元醇(如丙二醇、聚乙二醇)，非离子型表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50摩尔)加合物)]等。作为油性介质，可采用例如芝麻油、豆油等，可结合使用增溶剂，如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等。将如此制备的注射液优选地装入一种适当的安瓿瓶中。

有利地，上述口服或注射用药物组合物被制备成单位剂量的剂型，以适合一定剂量的活性成分。这种单位剂量的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射液(安瓿)、栓剂等。单位剂量的上述抗体含量一般为每剂约5至约500mg；尤其是注射剂型，优选的是上述抗体含量为约5至约100mg，其它剂型中抗体含量为约10至约250mg。

抗体的治疗用途

本发明的抗体特别用于治疗、预防和/或改善与Ang-2活性相关的任意病或疾病，包括与血管生成相关的病或疾病。本发明的抗体和抗原结合片段可用于治疗，例如在脑和脑膜、口咽、肺和支气管树、胃肠道、雄性和雌性生殖***、肌肉、骨、皮肤和附件、***、脾、免疫***、造血细胞和骨髓、肝和泌尿道，和特别是感觉器官例如眼中出现的原发性和/或转移性肿瘤。在某些实施方案中，本发明的抗体和抗原结合片段用于治疗一种或多种以下癌症：肾细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、***癌、恶性胶质瘤(malignant gliomas)、骨肉瘤、结直肠癌、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、滑膜肉瘤、甲状腺癌或黑色素瘤。

本发明的抗体和抗原结合片段也可用于治疗一种或多种眼部疾病。可用本发明的抗体和抗原结合片段治疗的代表性眼部疾病包括，例如老年性黄斑退化症、糖尿病视网膜病变和与脉络膜新生血管性疾病、血管渗漏、视网膜水肿和炎症有关的其他眼部疾病。另外，本发明的抗Ang-2抗体也可作为青光眼手术的佐剂施用，以预防在青光眼手术后的早期血管和***生成(hem-and lymphangiogenesis)和巨噬细胞至结膜滤过性小泡的募集，并改善临床效果。

在本发明的其他实施方案中，抗体或抗原结合片段用于治疗高血压、糖尿病(包括非胰岛素依赖性糖尿病)、银屑病、关节炎(包括类风湿性关节炎)、哮喘、脓毒症、肾病和与损伤、中风或肿瘤相关的水肿。

Ang-2表达已显示与多种炎症和/或传染性疾病的严重度相关(见例如Siner等人，2009，Shock 31：348-353；Yeo等人，2008，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)：105：17097-17102)。相应地，本发明的抗Ang-2抗体可用于治疗、预防或改善一种或多种炎症或传染性疾病。可通过施用本发明的抗Ang-2抗体治疗、预防或改善的代表性传染性疾病包括，但不限于：疟疾(恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)感染)、病毒性出血热(例如登革热)、立克次氏体感染、中毒性休克综合症、脓毒症、丙型肝炎、杆状巴尔通体(Bartonella bacilliformis)感染、利什曼病、分枝杆菌感染和埃-巴二氏病毒感染。

组合治疗

组合治疗可包括本发明的抗Ang-2抗体和例如另一种Ang-2拮抗剂(例如抗Ang-2抗体、肽抗体或CovX-体如CVX-060(见US 7,521,425))。本发明的抗Ang-2抗体可与另一种抗血管生成剂如，例如VEGF拮抗剂(例如VEGF陷阱，见例如US 7,087,411(在本文中又被称为“VEGF抑制性融合蛋白”))，抗VEGF抗体(例如贝伐单抗)，VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如舒尼替尼、索拉非尼或帕唑帕尼(pazopanib))，抗DLL4抗体(例如在US 2009/0142354中公开的抗DLL4抗体，如REGN421)等，或与表皮生长因子受体(EGFR)的拮抗剂(例如抗EGFR抗体或EGFR活性的小分子抑制剂)一起施用。可有益地与本发明的抗Ang-2抗体组合施用的其他试剂包括细胞因子抑制剂，包括小分子细胞因子抑制剂和结合细胞因子如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12，IL-13，IL-17，IL-18或其相应受体的抗体。本发明也包括治疗组合，其包含本文提及的任意抗Ang-2抗体和VEGF，DLL4，EGFR或任意上述细胞因子中的一种或多种的抑制剂，其中所述抑制剂是适体、反义分子、核酶、siRNA、肽抗体、纳米抗体或抗体片段(例如Fab片段；F(ab′)₂片段；Fd片段；Fv片段；scFv；dAb片段；或其他改造的分子，如双抗体、三链抗体、四链抗体、微抗体和最小识别单元)。本发明的抗Ang-2抗体也可与抗病毒剂、抗生素、镇痛药、皮质类固醇和/或NSAID组合施用。本发明的抗Ang-2抗体也可作为治疗方案的一部分施用，所述治疗方案也包括放射治疗和/或常规的化学治疗。当与一种或多种其他试剂组合时，本发明的抗Ang-2抗体可在其他试剂的施用前施用，与其他试剂的施用同时施用(例如在同一制剂中或在单独的制剂中)，或在其他试剂的施用后施用。

抗体的诊断用途

本发明的抗Ang-2抗体也可用于检测和/或测量样品中的Ang-2，例如用于诊断用途。例如，抗Ang-2抗体或其片段可用于诊断以Ang-2的异常表达(例如过表达、低表达、缺乏表达等)为特征的病症或疾病。用于Ang-2的代表性诊断测定可包括，例如使从患者处取得的样品接触本发明的抗Ang-2抗体，其中所述抗Ang-2抗体用可检测的标签或报告分子标记。可选地，未标记的抗Ang-2抗体可与自身经过可检测标记的第二抗体组合用于诊断应用。可检测的标签或报告分子可为放射性同位素，例如³H，¹⁴C，³²P，³⁵S，或¹²⁵I；荧光或化学发光基团如异硫氰酸荧光素或罗丹明；或例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶的酶。可用于检测或测量样品中的Ang-2的特定代表性测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分类术(FACS)。

实施例

举出以下实施例是为了向本领域一般技术人员就如何利用本发明之方法和组合物提供一个完整的披露和说明，并非是为了限制被发明者视为其发明的范围。已作出许多努力以确保所用数字(例如量、温度等)的准确性，但也应考虑到某些实验误差和偏差。除非另有说明，部分是以重量计的部分，分子量是指平均分子量，温度是指摄氏度，压力是指大气压或接近大气压。

实施例1.抗人Ang-2的人抗体的产生

对包含编码人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的DNA的小鼠直接施用人Ang-2抗原和刺激免疫应答的佐剂。通过Ang-2特异性免疫测定监控抗体免疫应答。当取得期望的免疫应答时收获脾细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合，以维持其活力和形成杂交瘤细胞系。筛选和选择杂交瘤细胞系以鉴定产生Ang-2特异性抗体的细胞系。使用此技术得到几种抗Ang-2嵌合抗体(即，具有人可变结构域和小鼠恒定结构域的抗体)；以此方式产生的代表性抗体定名如下：H1M724，H1M727，H1M728，H2M730，H1M732，H1M737，H2M742，H2M743，H2M744，H1M749，H2M750和H1M810。

如在U.S.2007/0280945A1中描述的，也可从未与骨髓瘤细胞融合的抗原阳性B细胞中直接分离抗Ang-2抗体。使用此方法，得到几种全人抗Ang-2抗体(即具有人可变结构域和人恒定结构域的抗体)；以此方式产生的代表性抗体定名如下：H1H685，H1H690，H1H691，H1H693，H1H694，H1H695，H1H696，H1H704，H1H706和H1H707。

依照此实施例的方法产生的代表性抗Ang-2抗体的生物学性能在下面陈述的实施例中详细描述。

实施例2.可变区基因应用分析

为了分析产生的抗体的结构，对编码抗体可变区的核酸进行了克隆和测序。从抗体的核酸序列和预测的氨基酸序列出发，鉴定了每个抗体重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)的基因使用。

表1

表2陈述了选定的抗Ang-2抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列对及其对应的抗体标识。名称N、P和G指具有相同的CDR序列的重链和轻链但在CDR序列以外的区域中(即在框架区中)具有序列变化的抗体。因此，特定抗体的N、P和G变体在其重链和轻链可变区内具有相同的CDR序列，但在框架区内包含修饰。

表2

*H1M737的LCVR的氨基酸序列未显示。

在以下实施例中使用的对照构建体

为了比较的目的，在以下实施例中包括多种对照构建体(抗Ang-2抗体和抗Ang-2肽抗体)。对照构建体定名如下：对照I：具有如在US2006/0018909(又见Oliner等人，2004，Cancer Cell 6：507-516)中陈述的“Ab536(THW)”的对应结构域的氨基酸序列的重链和轻链可变结构域的人抗Ang-2抗体；对照II：具有如在US 7,205,275(又见Oliner等人，2004，Cancer Cell 6：507-516)中陈述的“2XCon4(C)”的氨基酸序列的结合人Ang-2的肽抗体；对照III：具有如在US 7,138,370中陈述的“L1-7”的氨基酸序列的结合人Ang-2的肽抗体；对照IV：具有如在US 2006/0246071中陈述的“3.19.3”的对应结构域的氨基酸序列的重链和轻链可变区的人抗Ang-2抗体；和对照V：具有如在WO 2009/097325中陈述的“MEDI1/5”的对应结构域的氨基酸序列的重链和轻链可变区的人抗Ang-2抗体。(在每个实施例中不是使用全部的对照构建体)。在后面的表中，包括符号“Ab”和“Pb”，用于分别识别抗体和肽抗体对照(即，对照I＝Ab；对照II＝Pb；对照III＝Pb；对照IV＝Ab；和对照V＝Ab)。

实施例3.抗原结合亲和力测定

使用实时生物传感器表面等离子共振测定，通过表面动力学测定选定的纯化Ang-2抗体与缀合至人IgG1(SEQ ID NO：528)的人(SEQ ID NO：519)、小鼠(小家鼠(Mus musculus)；SEQ ID NO：520)和猴(食蟹猴(Maccafascicularis)；SEQ ID NO：521)Ang-2的二聚体纤连蛋白样结构域(Ang-2FD)结合的平衡解离常数(K_D值)。在通过直接的胺连接连接至BIACORE^TM CM5传感器芯片以形成捕获抗体表位而产生的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体表面、山羊抗人κ多克隆抗体(Southern Biotech，Birmingham，AL)表面或山羊抗人IgG多克隆抗体(Jackson Immuno Research Lab，WestGrove，PA)表面上捕获抗体。以100μl/分钟在捕获抗体表面上注入多种浓度(范围从50nM至6.25nM)的蛋白质90秒。在室温下实时监控抗原-抗体结合和解离。进行动力学分析计算抗原/抗体复合物解离的K_D和半衰期。结果总结在下表3中。

表3

使用克隆在人IgG1上的选定的纯化抗Ang-2抗体重复上述实验。结果总结在下表4中。

表4

在2个不同的温度下使用选定的抗Ang-2抗体进行了另外的结合实验，以进一步评估物种间交叉亲和力。每种选定的抗体或对照构建体在通过直接的化学连接连接至BIACORE^TM芯片以形成捕获抗体表面而产生的山羊抗人κ多克隆抗体表面上以40μL/分钟的流速捕获1分钟。以60μL/分钟的流速在捕获抗体表面上以25nM或0.78nM的浓度注入人、猴和小鼠Ang-2FD-Fc 3分钟，在25℃或37℃下实时监控20分钟抗原-抗体解离。

结果总结在下表5(25℃结合)和6(37℃结合)中。

表5

在25℃下的结合

表6

在37℃下的结合

在另一个实验中，(使用上述方法)测定了结合人“bow-Ang-2”四聚体构建体(“hBA2”)的选定的纯化抗体的K_D值。hBA2由2个二聚体组成，每个二聚体包含2个通过人Fc结构域彼此连接的Ang-2纤连蛋白样结构域。hBA2的二聚体组分的氨基酸序列由SEQ ID NO：522代表。结果总结在下表7中。

表7

在另一个实验中，(如上述)测定了结合野生型人Ang-2(hAng-2-WT；SEQ ID NO：518)和人Ang-2的纤连蛋白样结构域(hAng-2FD)的选定的纯化抗体的K_D值。结果总结在下表8中。

表8

进行了另外的实验以测量选定的抗Ang-2抗体与单体hAng-2FD在25℃和37℃下的结合性能。每种选定的抗体或对照构建体在通过直接的化学连接连接至BIACORE^TM芯片以形成捕获抗体表面而产生的山羊抗人IgG多克隆抗体表面上，以40μL/分钟的流速捕获1分钟。以60μL/分钟的流速在捕获抗体表面上以500nM或7.8nM的浓度注入人Ang-2FD 3分钟，并在25℃或37℃下实时监控抗原-抗体解离20分钟。

结果总结在下表9(25℃)和10(37℃)中。N/D＝未测定。

表9

表10

如在此实施例中所示，依照实施例1的方法产生的几种抗Ang-2抗体以等于或高于对照的亲和力结合Ang-2构建体。例如，抗体H1H685，H1H690，H1H724和H1H744分别以71.4，79，115，和114pM的K_D结合二聚体人Ang-2-FD，而对照I抗体以339pM的K_D结合二聚体人Ang-2-FD(见表4)。类似地，抗体H1H685，H1H690，H1H724和H1H744分别以11.9，17.9，23.3和17.2pM的K_D结合人BA2(四聚体Ang-2纤连蛋白样结构域构建体)，而对照I抗体以83pM的K_D结合hBA2(见表7)。因此，与对照构建体相比，本发明的许多抗体展示了与Ang-2的增强的结合。抗体H1H685P相比对照构建体显示了特别强的与Ang-2的结合性能。

实施例4.与Ang-2而不是Ang-1的优先结合

进行了结合实验(等离子共振测定)以确定选定的抗体是否与Ang-2和Ang-1都结合，或其是否仅优先结合Ang-2。在通过直接的化学连接连接至BIACORE^TM芯片以形成捕获抗体表面而产生的山羊抗人IgG多克隆抗体表面上以40μL/分钟的流速捕获1分钟每种选定的抗体或对照构建体。以60μL/分钟的流速在捕获抗体表面上以25nM或0.78nM的浓度注入全长野生型人Ang-1或Ang-23分钟，并在25℃或37℃下实时监控抗原-抗体解离20分钟。

这些实验的结果总结在下表11-14中。N/D＝未测定。“无结合”表示，在这些实验中使用的特定实验条件下未观察到可检测的结合。

表11a

表11b

表12a

表12b

表13a

表13b

表14a

表14b

这些结果显示，H1H685P在此实验中检测的抗体中是独特的，因为其以高亲和力结合Ang-2但不结合Ang-1。展示与Ang-2结合但不与Ang-1结合的唯一的其他构建体是对照III。然而，应当强调，对照III是肽抗体且在此实验中检测的所有其他抗体与Ang-2和Ang-1都结合。对Ang-2结合的选择性可赋予H1H685P治疗益处，所述治疗益处是与Ang-2和Ang-1都结合的抗体所不具有的。

实施例5.Ang-2结合人Tie-2的抑制

Tie-2是Ang-2的天然受体。检测了抗Ang-2抗体阻断Ang-2结合人Tie-2(hTie-2)的能力。以2μg/ml的浓度用hTie-2-mFc(由缀合至小鼠IgG的人Tie-2组成的嵌合构建体；SEQ ID NO：525)包被96孔板并孵育过夜，然后在洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的PBS)中洗4次。然后用含0.5％BSA(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)的PBS封闭板，室温1小时。在单独的板中，以50nM的起始浓度以3的系数在板上连续稀释纯化的抗Ang-2抗体。分别以2nM，8nM，或2nM的终浓度加入缀合至人IgG的人、小鼠或猴Ang-2FD蛋白(Ang-2FD-hFc)，并在室温孵育1小时。然后将抗体/Ang-2FD-Fc混合物加至含有hTie-2-mFc的板，并在室温孵育1小时。使用缀合至人IgG抗体的辣根过氧化物酶(HRP)(Jackson ImmunoResearch Lab，West Grove，PA)测定与hTie-2-mFc蛋白结合的Ang-2FD-hFc进行检测，并使用四甲基联苯胺(TMB)底物(BD Biosciences，San Jose，CA)通过标准比色反应显影。在OD₄₅₀处读取吸光度0.1秒。在表15中显示了被16.67nM选定的抗Ang-2抗体阻断的Ang-2FD-hFc与hTie-2-mFc结合的阻断百分比。

表15

在类似的实验中，检测了选定的纯化的克隆至人IgG1上的抗Ang-2抗体阻断Ang-2FD结合hTie-2的能力(如上所述)。在表16中显示了被16.67nM的选定的抗Ang-2抗体阻断的Ang-2FD-hFc与hTie-2-mFc结合的阻断百分比。NT：未检测。

表16

在另一个实验中，检测了选定的纯化抗Ang-2抗体阻断20pM生物素化hBA2与hTie-2结合的能力(如上所述)。用于此实验，以与上述hTie-2-mFc类似的方式使用缀合了组氨酸标签的人Tie-2(hTie-2-His；SEQ IDNO：526)。3倍连续稀释从5nM开始的抗体浓度。通过计算阻断50％的生物素hBA2与Tie-2结合信号所需的抗体量产生IC₅₀(抑制浓度)值。基于2个单独的实验计算每种抗体的平均IC₅₀值。结果总结在图17中。NB：在5nM浓度上没有观察到阻断。

表17

在类似的实验中，检测了在人IgG1上克隆的选定的纯化抗Ang-2抗体阻断生物素化hBA2与hTie-2结合的能力(如上所述)。结果显示在表18中。NB：在5nM浓度上没有观察到阻断。

表18

此实施例说明，依照实施例1的方法产生的几种抗Ang-2抗体阻断了Ang-2纤连蛋白样结构域及其受体(TIE-2)之间的相互作用，阻断的程度与对照抗体相当或比对照抗体更高。例如，抗体H1H690，H1H691，H1H695，H1H696，H1H704，H1H706，H1H707，H1H724和H1H744各导致人、小鼠和猴Ang-2FD与TIE-2受体的大于95％的阻断，这与使用对照构建体所观察到的结果类似(见表16)。

实施例6：全长Ang-2和Ang-1结合人Tie-2的抑制

Tie-2是Ang-1以及Ang-2的受体。因此，在本实施例中，测量和比较了某些抗Ang-2抗体阻断Ang-2或Ang-1结合人Tie-2的能力。

以与实施例5的实验类似的方式进行在此实施例中显示的ELISA实验。简言之，以2μg/ml的浓度用hTie-2-mFc(由缀合至小鼠IgG的人Tie-2组成的嵌合构建体；SEQ ID NO：525)包被96孔板并孵育过夜，然后在洗涤缓冲液(含0.05％Tween-20的PBS)中洗4次。然后用含0.5％BSA(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)的PBS(Irvine Scientific，SantaAna，CA)封闭板，室温1小时。在单独的板中，以300nM的起始浓度以3的系数在板上连续稀释纯化的抗Ang-2抗体和对照构建体。以0.6nM的终浓度加入缀合了6X组氨酸标签(R&D Systems，Minneapolis，MN)的全长人Ang-2或Ang-1蛋白，并在室温孵育1小时。然后将抗体/抗原混合物加至含有hTie-2-mFc的板，并在室温孵育1小时。使用缀合至五His抗体的辣根过氧化物酶(HRP)(Qiagen，Valencia，CA)测定与hTie-2-mFc蛋白结合的Ang-2-His或Ang-1-His进行检测，并使用四甲基联苯胺(TMB)底物(BDBiosciences，San Jose，CA)通过标准比色反应显影。在OD₄₅₀处读取吸光度0.1秒。通过计算阻断50％的人Ang-2或Ang-1与Tie-2结合的信号所需的抗体量产生IC₅₀(抑制浓度)值。以IC₅₀表示的结果显示在表19，第(1)和(2)列中。以第(3)列中显示的IC₅₀的倍数差异反映抗体或对照构建体阻断hAng-2/Tie-2相互作用相对hAng-1/Tie-2相互作用的程度；即，在第(3)列中的较大数值指示阻断hAng-2/Tie-2相互作用相比hAng-1/Tie-2相互作用的更强的能力。

表19

*通过用hAng-1阻断IC₅₀(第2列)除以hAng-2阻断IC₅₀(第1列)计算。

为了进一步评估选定的抗hAng-2抗体阻断Ang-1结合Tie-2的能力，进行了生物传感器表面等离子共振实验。在此实验中，将人Tie-2全长胞外结构域构建体(hTie-2-mFc-ecto)胺连接在BIACORE^TM芯片上以产生受体包被的表面。选定的抗hAng-2抗体和对照构建体以1μM(100倍过量于抗原)与10nM hAng-1-WT预混合，然后在25℃下孵育60分钟以允许抗体-抗原结合达到平衡以形成平衡溶液。以5μL/分钟在受体表面上注入平衡溶液，在25℃下进行5分钟。测定由于hAng-1-WT与hTie-2-mFc的结合导致的共振单位(RU)的变化。在此实验中包括与hAng-1不结合的不相关的肽抗体构建体以建立0％阻断基线，并使用人Tie-2-mFc构建体作为阻断的阳性对照。在抗体预孵育后与Tie-2结合的Ang-1量被表示为相对阴性对照预孵育后的与Tie-2结合的Ang-1量的百分比，并显示在表20中。(与Tie-2结合的Ang-1量较大表示较低程度的抗体阻断)。

表20

使用不同量的Ang-2阻断剂和对照重复了前面的实验。具体来说，将人Tie-2全长胞外结构域构建体(hTie-2-mFc-ecto)胺连接在BIACORE^TM芯片上以产生受体包被的表面。选定的抗hAng-2抗体和对照构建体(50或150nM)与hAng-2-WT(25nM)混合，然后在25℃下孵育60分钟以允许抗体-抗原结合达到平衡。以10μL/分钟在受体表面上注入平衡溶液，在25℃下进行5分钟。为了评估选定的抗hAng-2抗体阻断Ang-1-WT结合hTie-2的能力，遵照类似的程序，除了以3个浓度(50，100或1000nM)检测抗体和与10nM hAng-1-WT孵育以外。测定由于Ang-2-WT或hAng-1-WT与hTie-2-mFc的结合导致的共振单位(RU)的变化。在此实验中包括与任一种血管生成素不结合的不相关的抗体以建立0％阻断基线，并使用人Tie-2-mFc构建体作为阻断的阳性对照。结果总结在表21(对hTie-2表面应用hAng-1)和22(对hTie-2表面应用hAng-2)中。

表21(hAng-1WT)

表22(hAng-2WT)

从这些实验中得到的结果与以前的显示H1H685P优先结合Ang-2而不是Ang-1的结果(见实施例4)一致。具体来说，从此实施例得到的结果显示，几种抗Ang-2抗体(例如H1H685P和H1H706P)不显著阻断人Ang-1与人Tie-2的结合，尽管在其他实验中证明这些抗体有效地阻断Ang-2和Tie-2之间的相互作用(见实施例5，表16)。另外，在这些实验中，除了对照III肽抗体以外，没有一种对照构建体展示与本发明的代表性抗Ang-2抗体如H1H685P相同程度的优选结合/阻断Ang-2而不是Ang-1。

实施例7.抗Ang-2抗体对Ang-2介导的Tie-2磷酸化的抑制

本发明的发明者已证明，通过转录因子FOXO1可在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中诱导Ang-2的表达(Daly等人2006 PNAS 103：15491)。此外，发明者已显示，用编码FOXO1的腺病毒感染HUVEC导致Ang-2的表达和分泌，随后是Tie-2磷酸化的激活(Daly等人2006 PNAS 103：15491)。

检测了抗Ang-2抗体抑制Tie-2磷酸化的能力。简言之，在3.5mlMCDB131完全培养基(Vec Technologies，Rensselaer，NY)中用7x105HUVEC(Vec Technologies，Rensselaer，NY)接种6厘米细胞培养皿。第二天，用Opti-MEM(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)洗涤细胞并用2mlOpti-MEM饲养。以10pfu/细胞的浓度将编码绿色荧光蛋白(GFP；对照)或人FOXO1(Daly等人2004Genes Dev.18：1060)的重组腺病毒加入细胞并孵育4小时。然后用MCDB131洗涤细胞并用2ml包含0.5μg/ml浓度的抗Ang-2抗体的MCDB131饲养。在感染后20小时，裂解细胞并进行如Daly等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：15491-15496(2006)中所描述的Tie-2免疫沉淀。在蛋白质A/G珠(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)上收集免疫球蛋白1小时。用冷裂解缓冲液洗涤珠子并在SDS样品缓冲液中重悬，用于通过蛋白质印迹使用特异性针对磷酸酪氨酸(Millipore，Billerica，MA)或Tie-2的抗体分析。使用HRP缀合的第二抗体和ECL试剂(GE Healthcare，Piscataway，NJ)检测信号。扫描X射线胶片并使用ImageJ软件定量磷酸-Tie-2和Tie-2信号。使用磷酸-Tie-2/Tie-2的比例测定每种抗Ang-2抗体的％抑制(即，百分比抑制＝相比对照，磷酸-Tie-2/Tie-2的减少)。例如，认为Tie-2磷酸化降低至在对照样品中观察到的水平是100％抑制。根据观察到的百分比抑制(分别是25-50％，50-75％，75-100％)，检测的每种抗Ang-2抗体的相对抑制(+，++，+++)显示在表23中。

表23

如在此实施例中证明的，依照实施例1的方法产生的抗Ang-2抗体比对照I抗体抑制Tie-2的程度更深。在抗体H1H685，H1H690，H1H691，H1H693，H1H695，H1H696，H1H704，H1H706，H1H707，H1M724，H1M744和H1M750中观察到特别显著的抑制。

实施例8.Ang-1介导的Tie-2磷酸化的抑制

如在前面的实施例中所示，Ang-2可介导Tie-2的磷酸化。Ang-1也能够促进Tie-2磷酸化。在本实施例中，评估了选定的抗Ang-2抗体阻断Ang-1介导的Tie-2磷酸化的能力。

在10ml含有10％FBS、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的DMEM中用5x10⁶细胞EA.hy926细胞(Edgell等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：3734-3737(1983))覆盖每个10厘米培养皿。24小时后，在10ml DMEM+1mg/ml BSA中使细胞血清饥饿(serum-starved)1小时。然后用500ng/ml重组的人Ang-1(R&D Systems)在存在400nM的不相关的同种型对照抗体(″9E10″)或浓度从10-400nM范围的抗Ang-2抗体H1H685P或对照试剂(对照I、对照II、对照III或对照IV)的情况下刺激细胞10分钟。

孵育后，裂解细胞并如Daly等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103：15491-15496(2006)描述的免疫沉淀Tie-2。通过与蛋白质A/G珠(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)孵育60分钟收集免疫复合物。用冷裂解缓冲液洗涤珠子并通过在SDS样品缓冲液中加热洗脱结合的蛋白质。然后使用针对Tie-2或磷酸酪氨酸(克隆4G10，Millipore，Billerica，MA)的单克隆抗体对样品进行蛋白质印迹分析。结果显示在图2中。

使用HRP缀合的第二抗体和ECL试剂(GE Healthcare，Piscataway，NJ)检测信号。扫描X射线胶片并使用ImageJ软件定量磷酸-Tie-2和Tie-2信号。使用磷酸-Tie-2/Tie-2的比例测定每种抗体或肽抗体的％抑制。百分比抑制＝相比对照样品(400nM同种型对照抗体)磷酸-Tie-2/Tie-2的减少。

在存在对照抗体9E10的情况下，Ang-1显著激活Tie-2磷酸化(图2，图A——比较第2和3道对第1道)。所有检测的对照试剂显著抑制Tie-2磷酸化，在50nM对照II(图2，图B——第17道)，100nM对照IV(图2，图A——第11道)和200nM对照I(图2，图B——第24道)和对照V(图2，图C——第9道)时出现完全抑制。相反地，H1H685P甚至在400nM时也没有显著的抑制作用(图2，图A——第4-8道)，这些结果提供了H1H685P针对Ang-2而不是Ang-1的特异性的另外的证明。

实施例9.抗Ang-2抗体抑制肿瘤生长

使用2个肿瘤细胞系测定选定的纯化抗Ang-2抗体对肿瘤生长的影响。

PC3(人***癌细胞系)简言之，将在100μl生长因子减少的基质胶(BD Biosciences)中的5x10⁶PC3细胞皮下注射进6-8周龄雄性NCr裸鼠(Taconic，Hudson，NY)的侧腹。在肿瘤体积达到平均约200mm³时，将小鼠随机分组用于治疗。对每个治疗组中的小鼠施用抗Ang-2抗体、Fc蛋白或对照构建体，以10mg/kg浓度通过每周2次腹膜内注射施用约3周(表24)，或以2.5，12.5，或25mg/kg的浓度通过每周2次皮下注射施用约3周(表25)。在实验过程中每周2次测量肿瘤体积，并在实验结束时切除肿瘤后测量肿瘤重量。计算每个治疗组的肿瘤重量和生长的平均值(平均值+/-标准差)。通过与Fc蛋白测量的比较计算肿瘤重量和生长的百分比减少。结果总结在表24和25中。

表24

表25

如上所示，相比对照构建体，在PC3小鼠肿瘤模型中抗体H1H744N和H1H685P证明了特别显著的抗肿瘤活性。

使用PC3小鼠肿瘤模型和不同实验抗体(以2mg/kg的剂量，每周2次)的类似实验的结果显示在表26和27中。

表26

表27

COLO205(人结直肠腺癌细胞系)简言之，将在100μl无血清培养基中的2x10⁶COLO 205细胞皮下注射进6-8周龄雄性NCr裸鼠(Taconic，Hudson，NY)的侧腹。在肿瘤体积达到平均约150mm³时，将小鼠随机分组用于用抗体或Fc蛋白治疗。对每个治疗组中的小鼠施用抗Ang-2抗体或Fc蛋白，以4mg/kg的浓度通过腹膜内注射，每周2次施用约2周。在实验过程中每周2次测量肿瘤体积，并在实验结束时切除肿瘤后测量肿瘤重量。计算每个治疗组的肿瘤重量和生长的平均值(平均值+/-标准差)。“平均肿瘤生长”表示从治疗开始时(当肿瘤为约150mm³时)的平均生长。通过与Fc蛋白测量的比较计算肿瘤重量和生长的百分比减少。结果总结在表28中。

表28

进行了类似的实验以特别地评估H1H685P对COLO 205肿瘤生长的影响。简言之，将在100μl无血清培养基中的2x10⁶ COLO 205细胞皮下植入9-11周龄雄性SCID CB17小鼠的右后侧腹。当肿瘤达到～125mm³时，将小鼠随机分为5组(n＝7-8只小鼠/组)并每周用Fc蛋白(15mg/kg)，H1H685P(5或25mg/kg)或对照II(5或25mg/kg)治疗2次，为期19天。在实验过程中每周2次测量肿瘤体积，并在实验结束时切除肿瘤后测量肿瘤重量。计算每组的肿瘤重量和从治疗开始时的生长的平均值。通过与Fc对照组的比较计算肿瘤重量和生长的百分比减少。结果显示在表29中。

表29

如同PC3小鼠肿瘤模型，几种本发明的抗体(包括H1H685P)在COLO 205小鼠模型中展示了至少与对照分子展示的抗肿瘤活性相当的显著的抗肿瘤活性。

实施例10.抗Ang-2抗体和VEGF抑制剂的组合抑制肿瘤生长和灌流

为了测定抗Ang-2抗体和VEGF抑制剂的组合对COLO 205异种移植物生长的影响，将2x10⁶细胞皮下植入6-8周龄雌性SCID小鼠的右后侧腹。当肿瘤达到～350mm³的平均体积时，将小鼠随机分为4组(n＝6只小鼠/组)并用人Fc蛋白(7.5mg/kg)，H1H685P(5mg/kg)，VEGF陷阱(见US7,087,411)(2.5mg/kg)或H1H685P+VEGF陷阱的组合治疗。在10天的治疗中对小鼠施用总共3个剂量。在实验过程中每周2次测量肿瘤体积。计算每个治疗组从治疗开始时的肿瘤生长的平均值(平均值+/-标准差)。通过与Fc对照组的比较计算肿瘤生长的百分比减少。结果显示在表30中。注意，在VEGF陷阱和H1H685P+VEGF陷阱组中，平均肿瘤大小在治疗结束时小于治疗开始时，即观察到肿瘤的衰退。

表30

此实验的结果证明，H1H685P+VEGF陷阱的组合导致肿瘤生长的减少，此减少比单独的任一成分导致的肿瘤生长的百分比减少更明显。

为了提供组合效力的另外证据，评估了H1H685P+VEGF陷阱组合对MMT肿瘤生长的影响。将0.5x10⁶MMT细胞皮下植入6-8周龄雌性SCID小鼠的右后侧腹。当肿瘤达到～400mm³的平均体积时，将小鼠随机分为4组(n＝11只小鼠/组)并用人Fc蛋白(17.5mg/kg)，H1H685P(12.5mg/kg)，VEGF陷阱(5mg/kg)或H1H685P+VEGF陷阱的组合治疗。在9天中对Fc和H1H685P组施用3个剂量。在12天中对VEGF陷阱和组合组施用4个剂量。在实验过程中每周2次测量肿瘤体积，并在实验结束时切除肿瘤后测量肿瘤重量(由于Fc和H1H685P组的肿瘤大小较大，在收集VEGF陷阱和组合组的肿瘤前3天收集Fc和H1H685P组的肿瘤)。计算每个组从治疗开始时的肿瘤生长和肿瘤重量的平均值(平均值+/-标准差)。通过与Fc对照组的比较计算肿瘤重量和生长的百分比减少。结果显示在表31中。

表31

这些结果证实了相对单种试剂治疗，H1H685P+VEGF陷阱的增强的肿瘤抑制作用。

为了测定H1H685P+VEGF陷阱组合是否比单种试剂对肿瘤血管功能具有更大的影响，使用显微超声(VisualSonics’Vevo 770成像***)评估肿瘤灌流的变化。将COLO 205肿瘤培养至～125mm³，然后用H1H685P，VEGF陷阱或两种试剂的组合处理小鼠。在治疗后，基于对比度增强的显微超声2D图像获取和“wash-in”曲线(其代表进入肿瘤的对比剂的量)的分析测定肿瘤血管灌流。计算每个组的平均肿瘤灌流(平均值+/-标准差)。通过与Fc对照组的比较计算百分比减少。结果显示在表32中。

表32

与组合治疗对灌流的增强的效果一致，肿瘤切片的抗CD31染色证明了组合治疗对肿瘤血管密度的更有效的影响(数据未显示)。H1H685P+VEGF陷阱组合对肿瘤维管结构功能的增强的影响为组合治疗对肿瘤生长的增强的影响提供了可能的解释。

实施例11.抗Ang-2抗体和化疗剂的组合抑制肿瘤生长

为了检测H1H685P和化疗剂的组合对肿瘤生长的影响，将2.5x10⁶COLO 205肿瘤细胞皮下植入8-9周龄雄性SCID小鼠的右后侧腹。当肿瘤达到～150mm³的平均体积时(植入后第17天)，将小鼠随机分为4组(n＝5只小鼠/组)并如下处理：用15mg/kg hFc皮下和用5-FU载体腹膜内(ip)处理第一组；用15mg/kg H1H685P皮下处理第二组；用75mg/kg 5-FU腹膜内处理第三组；用15mg/kg H1H685P皮下和75mg/kg 5-FU腹膜内的组合处理第四组。小鼠接受总共3次治疗，每3-4天施用1次。在实验过程中每周测量2次肿瘤体积。计算每组从治疗开始直到第38天的平均(平均值+/-标准差)肿瘤生长。通过与对照组的比较计算肿瘤生长的百分比减少。结果显示在表33中。

表33

此实施例的结果显示，H1H685P和5-FU的组合比单独施用任一种试剂导致肿瘤生长的更明显的减少。

实施例12.抗Ang-2抗体在体内减弱眼部血管生成

在此实施例中，评估了选定的抗Ang-2抗体在小鼠模型中对视网膜血管形成的影响。

在一个实验组中使用野生型小鼠。在另一组中，使用表达人Ang-2而不是野生型小鼠Ang-2的小鼠(称为“hu-Ang-2小鼠”)。对年龄为2天(P2)的小鼠以12.5mg/kg的剂量皮下注射对照Fc或选定的抗Ang-2抗体。3天后(在P5)，对幼鼠实施安乐死，剜出眼球并在4％PFA中固定30分钟。剥离视网膜，用Griffonia simplicifolia植物凝集素-1在4℃染色3小时或过夜以显像维管结构，并平置于显微镜载片上。使用NikonEclipse 80i显微镜相机采集图像并使用Adobe Photoshop CS3，Fovea 4.0，和Scion 1.63软件分析。

测量覆盖表面维管结构的视网膜区域，并用作抗体活性的读出。在表34中显示了相比Fc处理的对照，用抗体处理的小鼠中血管区大小的减少。血管面积的百分比减少反映了抗体的抗血管生成效能。(N/D＝未测定)

表34

相比Fc对照，在血管面积中的减少％

抗体	野生型小鼠	hAng-2小鼠
			H1H685P	39.7	N/D
H1H690P	30.7	41.5
			H1H691P	30.4	N/D
H1H696P	31.1	N/D
			H1H724N	32.2	33.2
H1H744N	35.8	50.5
			对照I(Ab)	26.9	35.6

如在此实施例中所示，本发明的选定的抗Ang-2抗体基本上在体内抑制了眼部血管生成，因此反映了这些抗体在其他治疗情况中可能的抗血管生成潜能。

实施例13.对抗体结合重要的Ang-2的氨基酸

为了进一步表征hAng2和本发明的抗hAng2 mAb之间的结合，生成了7种变体hAng2-FD-mFc蛋白，每种包含单个点突变。基于hAng-2和hAng-1在与hTie-2相互作用的区域中的序列差异选择突变的氨基酸(图1)。具体来说，在Ang-2的纤连蛋白样结构域(FD)内的基于晶体结构分析被认为与Tie-2相互作用的，但与Ang-1中相应的氨基酸不同的氨基酸被分别突变为相应的hAng-1残基。此实施例的结果指示与Ang-2优先结合抗体相互作用的hAng-2的氨基酸残基。即，如果hAng-2的特定残基(或多个特定残基)变为hAng-1的相应残基后，Ang-2优先结合抗体的结合在实质上减少，则可以推断抗体与hAng-2的此特定残基(或多个特定残基)相互作用。

在此实验中，在通过直接化学连接至BIACORE^TM芯片产生的抗小鼠Fc表面上捕获7种hAng-2FD-mFc突变蛋白中的每一种(～147-283RU)。然后，以50μl/分钟的流速在捕获的mFc-标记的hAng-2FD蛋白表面上以100nM注入每种Ang-2抗体(或肽抗体，视情况而定)180秒，在25℃实时监控20分钟变体hAng2-FD-mFc和抗体的解离。结果总结在表35a-35d和图3中。

表35a

表35b

表35c

表35d

[1]氨基酸编号是基于SEQ ID NO：518的氨基酸编号。

[2]WT＝野生型Ang-2FD-mFc构建体。

N/B＝未观察到结合。

用于本发明的目的，在下述情况下认为抗Ang-2抗体与特定的Ang-2氨基酸残基相互作用，即，如果当所述残基被突变为Ang-1的相应残基时，在此实施例使用的实验条件下观察到的解离T¹/₂比野生型构建体的解离T¹/₂至少低5倍。鉴于此定义，抗体H1H685P在检测的抗体中似乎是独特的，因为其与F469，Y475和S480相互作用。由于H1H685P明显的优先结合Ang-2而不是Ang-1的另一独特性，可以推断F469，Y475和S480包含能够在免疫上区别Ang-2和Ang-1的表位。在此实验中检测的其他抗体/肽抗体似乎至多与1个或2个这些残基相互作用；即H1H744N和对照I与Y475相互作用；对照III与Y475和S480相互作用；和对照V与F469相互作用。有趣地是，显示以相同的效能阻断Ang-1和Ang-2二者结合Tie-2的对照II与在此实验中鉴定的任意Ang-2特异性氨基酸都不相互作用。

本发明的范围不受限于本文描述的特定实施方案。事实上，通过前面的描述，除了本文描述的这些实施方案以外的本发明的多种修改对本领域技术人员将是显而易见的。这些修改旨在属于随附的权利要求书的范围内。

Claims

1.当在表面等离子共振测定中检测时特异性结合人血管生成素-2(hAng-2)但不结合hAng-1的分离的抗体或其抗原结合Fab，F(ab’)₂或scFv片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：包含由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成的重链CDR-1，由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成的重链CDR-2，和由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成的重链CDR-3的重链可变区，和包含由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成的轻链CDR-1，由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成的轻链CDR-2，和由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成的轻链CDR-3的轻链可变区。

2.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合hAng-2，即SEQ ID NO:518上的表位，所述表位包含选自F-469,Y-475和S-480的至少一个氨基酸。

3.权利要求2的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合hAng-2上的表位，所述表位包含氨基酸F-469,Y-475和S-480。

4.权利要求3的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段以如表面等离子共振测定中测量的小于80pM的K_D结合hAng-2。

5.权利要求4的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成的HCVR和由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成的LCVR。

6.包含权利要求1至5中任一项的抗体或抗原结合片段和可药用的载体或稀释剂的药物组合物。

7.权利要求6的药物组合物，其还包含VEGF拮抗剂。

8.权利要求7的药物组合物，其中所述VEGF拮抗剂选自抗VEGF抗体、VEGF受体的小分子激酶抑制剂和VEGF抑制性融合蛋白。