EA011866B1

EA011866B1 - Агенты, специфически связывающие ангиопоэтин-2

Info

Publication number: EA011866B1
Application number: EA200700876A
Authority: EA
Inventors: Джонатон Даниел Олайнер; Кевин Грэхэм
Original assignee: Амджен Инк.
Priority date: 2004-10-19
Filing date: 2005-10-19
Publication date: 2009-06-30
Also published as: SG156668A1; ZA200704020B; MX2007004247A; JP2008520188A; JP2011207882A; BRPI0518209A; RU2010132956A; RU2007118670A; EA200700876A1; RU2404992C2; CN101495513B; CN101495513A; MA29015B1; IL182279A0

Abstract

Раскрыты специфические связывающие агенты, такие как полностью человеческие антитела, которые связывают ангиопоэтин-2. Кроме того, раскрыты фрагменты тяжёлых цепей, фрагменты лёгких цепей и участки, определяющие комплементарность, в составе антител, а также способы получения и применения этих антител.

Description

Заявка на данное изобретение является частичным продолжением заявки И8 10/269805, поданной 10 октября 2002 г., и международной заявки РСТ/И8 02/32613, поданной 11 октября 2002 г., испрашивающих приоритет предварительной заявки И8 60/328604, поданной 11 октября 2001 г.; все эти документы включены в заявку на изобретение путем ссылки. Заявка также испрашивает приоритет предварительной заявки И8 60/620161, поданной 19 октября 2004 г., и заявки И8 10/982440, поданной 4 ноября 2004 г., которые включены в заявку путем ссылки.

Область техники

Настоящее изобретение относится к специфическим связывающим агентам, которые распознают и связывают ангиопоэтин-2 (Лид-2). Более конкретно, настоящее изобретение относится к получению, применению в диагностике и применению в лечении моноклональных и поликлональных антител и их фрагментов, которые специфически связываются Апд-2.

Уровень техники

Ангиогенез, т.е. образование новых кровеносных сосудов из уже существующих, лежит в основе многих физиологических и патологических процессов. В норме ангиогенез строго регулируется про- и антиангиогенными факторами, но в случае заболеваний, таких как рак, болезни, связанные с неоваскуляризацией глаз, артриты и псориаз, регуляция может нарушаться (Ро1ктап - 1. ΝηΙ. Меб., 1995, 1: 27-31).

Существует множество заболеваний, известных как связанные с нарушением регуляции ангиогенеза или с нежелательным ангиогенезом. Перечень этих заболеваний включает, не ограничиваясь указанным, неоваскуляризацию глаз, в частности ретинопатии (в том числе диабетическую ретинопатию), возрастную макулодегенерацию; псориаз, гемангиобластому, гемангиому, артериосклероз, воспалительные заболевания, такие как ревматоидные или ревматические воспалительные заболевания, в частности артрит (в том числе ревматоидный артрит), или другие хронические воспалительные расстройства, такие как хроническая астма, артериальный или посттрансплантационный атеросклероз, эндометриоз и новообразования, например так называемые солидные опухоли и жидкие (или гематопоэтические) опухоли (такие как лейкемии и лимфомы). Прочие заболевания, связанные с нежелательным ангиогенезом, хорошо известны специалистам в области техники.

В регуляцию ангиогенеза вовлечены многие системы передачи сигнала, однако одной из самых изученных и наиболее избирательных в отношении эндотелиальных клеток является система с участием Т1е-2 - рецептора тирозинкиназы (известного как Т1е-2 или Т1е-2К, а также ОКК; Т1е-2 мыши известен также как !ек) и его лигандов, т.е. ангиопоэтинов (Оа1е Ν.Α., Уапсорои1оз Ο.Ό. - Сепез Оеу., 1999, 13: 1055-1066). Известны четыре ангиопоэтина: ангиопоэтин-1 (Апд-1)-ангиопоэтин-4 (Апд-4). Эти ангиопоэтины называют ещё лигандами Т1е-2 (Όανίδ 8. е! а1. - Се11, 1996, 87: 1161-1169; Сгозюз К. е! а1. - Су!одепе! Се11 Сепе!.. 1999, 84, 118-120; Нойазй 1. е! а1. - 1пуезбда!ще Орй1йа1то1оду&У1зиа1 8с1епсе, 1999, 32, 1617-1625; КоЬНхек Т.1. е! а1. - Сиггеп! Вю1оду, 1998, 8, 529-532; Ьш Р. е! а1. - Ргос. №111. Асаб. 8с1. США, 1998, 95, 8829-8834; Макопр1егге Р.С. е! а1. - 8с1епсе, 1887, 277, 55-60; Рараре!горои1оз А. е! а1. - ЬаЬ. 1пуез!, 1999, 79, 213-223; 8а!о Έ.Ν. е! а1. - Уинге, 1998, 375, 70-74; 8йуи К.С. е! а1. - С1гси1а!юп, 1998, 98, 2081-2087; 8ил С. е! а1. - Се11, 1996, 87, 1171-1180; 8ип С. е! а1. - 8аепсе, 1998, 282, 468-471; V а1еп/иеН1. М. е! а1. - Ргос. Ыаб. Асаб. 8ск США, 1999, 96, 1904-1909; \\'П/епЬ1с111ег В. е! а1. - 1. Вю1. Сйет., 1998, 273, 18514 -18521). При том что связывание ангиопоэтина-1 с Т1е-2 стимулирует фосфорилирование рецептора в культуре эндотелиальных клеток, было замечено, Апд-2 может выступать как агонист и как антагонист фосфорилирования рецептора Т1е-2 (Эа\зз 8. е! а1. - см. выше; МаЬопр1егге Р.С. е! а1. - см. выше; К1т I., К1т 1.Н. е! а1. - Опсодепе, 2000, 19 (39), 4549-4552; Те1с11ег1-Ки11з/е\\'зка К., Макопр1егге Р.С. е! а1. - Сагбюуазси1аг Кезеагсй, 2001, 49 (3), 659-670).

Фенотипы мышей с нокаутом генов Т1е-2 и Апд-1 сходны между собой и позволяют предполагать, что фосфорилирование Т1е-2, вызванное Апд-1, опосредует перестройку и стабилизацию развивающихся сосудов в утробе посредством поддержания адгезии эндотелиальных клеток, поддерживающих эндотелий (Эитоп! Ό.Ι е! а1. - Сепез&Эеуе1ортепЕ 1994, 8, 1897-1909; 8а!о Έ.Ν. е! а1. - У-Лиге, 1995, 376, 70-74; 8ип С. е! а1., 1996 - см. выше). Предположительно, роль Апд-1 в стабилизации сосудов сохраняется и во взрослом организме, где он широко и конститутивно экспрессируется (Напбайап Ό. - 8с1епсе, 1997, 277, 48-50; 2адхад Ό. е! а1. - Ехрептеп!а1 №иго1оду, 1999, 159, 391-400). Напротив, экспрессия Апд-2 исходно ограничена участками перестройки сосудов, где он, по-видимому, блокирует функцию Апд-1, тем самым вызывая состояние сосудистой пластичности, приводящей к ангиогенензу (Напайап Ό., 1997 - см. выше; Но1азй 1. е! а1. - 8с1епсе, 1999, 284, 1994-1998; Ма1зопр1егге Р.С. е! а1., 1997 - см. выше).

В сущности, многочисленные опубликованные исследования доказали ангиоселективность экспрессии Апд-2 при болезненных состояниях, связанных с ангиогенезом. Такие патологические состояния включают, например, псориаз, макулодегенерацию и рак (Випопе С. е! а1. - Ат. 1. Ра!йо1., 1999, 155, 1967-1976; Е!ой Т. е! а1. - Сапсег Рез., 2001, 61, 2145-2153; Напда1 М. е! а1. - 1пуез11да11уе орй!йа1то1оду&У1зиа1 8сг, 2001, 42, 1617-1625; Но1азй 1. е! а1., 1999 - см. выше; Кигоба К. е! а1. - 1. 1пуезбда!гуе Оегта!о1оду, 2001, 116, 713-720; О!ап А. е! а1. - 1пуезбда!гуе Орй1йа1то1оду&У1зиа1 8ск, 1999, 40, 19121920; 8!га!тапп А. е! а1. - Ат. 1. Ра!йо1., 1998, 153, 1459-1466; Тапака 8. е! а1. - 1. С1ш. 1пуез!, 1999, 103, 34-345; УозЫба У. е! а1. - 1п!етабопа1 1. Опсо1., 1999, 15, 1221-1225; Уиап К. е! а1. - 1. Регобоп!а1 Кез., 2000, 35, 165-171; 2адхад Ό. е! а1., 1999 - см. выше). Большая часть этих исследований сосредоточена на

- 1 011866 проблеме рака, поскольку многие типы опухолей, как оказалось, проявляют экспрессию Аид-2 в сосудах. В противоположность экспрессии Апд-2 при патологическом ангиогенезе его экспрессия в нормальных тканях чрезвычайно ограничена (Ма1копр1егге Р. е! а1., 1997 - см. выше; Ме/с.|ш1а 1. е! а1. - Вюсйет. Βίοрйук. Век. Соттип, 1999, 260, 492-498). В норме у взрослых существует три основных участка ангиогенеза: яичники, плацента и матка; это первые нормальные (т.е. не раковые) ткани, в которых была выявлена мРНК Апд-2.

Некоторые функциональные исследования позволяют предполагать, что Апд-2 может быть вовлечён в опухолевый ангиогенез. Айтаб е! а1. (Айтаб е! а1. - Сапсег Век., 2001, 61, 1255-1259) описывают сверхэкспрессию Апд-2 и показывают, что она в значительной степени связана с увеличением роста опухоли на модели гетеротрансплантанта у мышей. См. также Εΐοΐι е! а1. и Тапака е! а1. (см. выше), где представлены данные о существенной связи сверхэкспрессии Апд-2 с гиперваскуляризацией опухолей. Однако Уи е! а1. (Уи е! а1. - Ат. 1. Ра!йо1., 2001, 158, 563-570), напротив, приводят данные, показывающие, что повышенная экспрессия Апд-2 в клетках лёгочной карциномы Льюиса и карциномы молочной железы ТА3 существенно продлевала срок жизни мышей, которым была сделана инъекция соответствующих трансфектантов.

В последние несколько лет в различных публикациях Апд-1, Апд-2 и/или Т1е-2 рассматривались как возможные мишени для противоопухолевой терапии. Например, в патентах ϋδ 6166185, ϋδ 5650490 и ϋδ 5814464 раскрывается концепция антител к лигандам Т1е-2 и рецепторных тел. Ьт и др. (Ьт е! а1. Ргос. №11. Асаб. 8с1. США, 1998, 95, 8829-8834) вводили мышам аденовирус, экспрессирующий растворимую форму Т1е-2; Растворимый Т1е-2 существенно снижал количество и размер развивающихся у мышей опухолей. В исследовании, связанном с предыдущим (Ьш е! а1. - 1. СИп. 1пуек!., 1997, 100, 20722078), крысам вводили растворимую форму Т1е-2; это вещество существенно снижало размеры опухолей у этих крыс. 81ете1к!ег и др. (81ете1к!ег е! а1. - Сапсег гек. 1999, 59, 3185-3189) создали линии клеток меланомы человека, экспрессирующие внеклеточный домен Т1е-2, вводили эти клеточные линии голым мышам и выяснили, что растворимый Т1е-2 приводит к значительному ингибированию роста опухолей и ангиогенеза в них. Принимая во внимание эти данные, а также тот факт, что как Апд-1, так и Апд-2 связываются с Т1е-2, из этих исследований неясно, Апд-1, Апд-2 или же Т1е-2 могут представлять собой перспективную мишень для противоопухолевой терапии.

Конъюгация некоторых пептидов со стабильными белками плазмы, такими как константная область иммуноглобулинов, для увеличения периода полужизни этих молекул описана, например, в РСТ публикации \νϋ 00/24782, опубликованной 4 мая 2000 г.

Конъюгация белка или фрагмента белка со стабильными белками плазмы, такими как константная область иммуноглобулинов, для увеличения периода полужизни этих молекул неоднократно описана (см., например, патент И8 5480981; 2йепд е! а1. - 1. 1ттипо1., 1995, 154, 5590-5600; Икйег е! а1. - N. Епд1. 1. Меб., 1996, 334, 1697-1702; Уап 2ее К. е! а1. - 1. 1ттипо1., 1996, 156, 2221-2230; патент США 5808029 от 15.09.1998; Сароп е! а1. - №!иге, 1989, 337, 525-531; НагуШ е! а1. - 1ттипо!есй., 1995, 1, 95-105; νθ 97/23614 от 03.07.1997; РСТ/ϋδ 97/23283, поданная 11.12.1997; Ьшк1еу - 1. Ехр. Меб., 1991, 174, 561569; νθ 95/21258 от 10.8.1995).

Эффективная терапия анти-Апд-2 могла бы оказаться полезной для широкой группы раковых больных, поскольку многим солидным опухолям для того, чтобы дорасти до диаметра, превышающего 1-2 мм, необходима неоваскуляризация. Такая терапия могла бы иметь и более широкое применение при других расстройствах, связанных с ангиогенезом, таких как ретинопатии, артрит и псориаз.

Существует не удовлетворенная имеющимися разработками необходимость идентификации новых агентов, специфически распознающих и связывающих Апд-2. Такие агенты были бы полезны для диагностического скрининга и терапевтического вмешательства при болезненных состояниях, связанных с активностью Апд-2.

В соответствии с этим целью настоящего изобретения является получение агентов, специфически связывающих Апд-2 и, тем самым, модулирующих активность Апд-2.

Краткое описание изобретения

Согласно настоящему изобретению предложены антитела, включающие тяжёлую цепь и лёгкую цепь, в которых указанная тяжёлая цепь содержит вариабельную область тяжёлой цепи, выбранную из следующей группы:

526 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 1); 528 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 3); 531 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 5); 533 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 7); 535 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 9); 536 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 11); 537 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 13); 540 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 15);

543 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 17); 544 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 19); 545 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 21); 546 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 23);

551 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 25); 553 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 27); 555 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 29); 558 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 31);

559 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 33); 565 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 35); Е1-С6 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 37); ЕВ1-А7 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 39); ΕΌ-Β2 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 41); ΕΕ-Β7 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 43); Е1-С11 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 45); ΕΚ-Ε3 НС (δΕ() ΙΌ N0: 47); 61Ό4 НС (δΕ() ΙΌ N0: 49); ССШ8 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 51); Н1С12 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 53); ΙΆΜΕ^Ο (δΕΟ ΙΌ N0: 55); ΙΡ-1Ο10 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 57); ΙΚ-2Ε2 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 59); ТР-2С11 НС (δΕΟ ΙΌ N0: 61) и антигенсвязывающие фрагменты указанной области;

- 2 011866 а указанная лёгкая цепь содержит вариабельную область лёгкой цепи, выбранную из следующей группы:

526 каппа (8ЕС ГО N0: 2); 536 (ТН№) каппа (8ЕС ГО N0: 12); 536 (ЬрТ) каппа (8ЕС ГО N0: 210); 543 каппа (5 ЕС) ГО N0: 18); 544 каппа (5 ЕС) ГО N0: 20); 551 каппа (5 ЕС) ГО N0: 26); 553 каппа (8ЕС) ГО N0: 28); 555 5 каппа (8ЕС) ГО N0: 30); 558 каппа (8ЕС) ГО N0: 32); 565 каппа (8ЕС) ГО N0: 36); ЕЕ-В7 каппа (8ЕС) ГО N0: 44); Е1-611 каппа (8ЕС) ГО N0: 46); ЕК-Е3 каппа (5 ЕС) ГО N0: 48); 1А1-1Е7 каппа (5 ЕС) ГО N0: 56); ЕР-2С11 каппа (5 ЕС) ГО N0: 62); 528 лямбда (5 ЕС) ГО N0: 4); 531 лямбда (8ЕС) ГО N0: 6); 533 лямбда (8ЕС) ГО N0: 8); 535 лямбда (8ЕС) ГО N0: 10); 537 лямбда (8ЕС) ГО N0: 14); 540 лямбда (5 ЕС) ГО N0: 16); 545 лямбда (5 ЕС) ГО N0: 22); 546 лямбда (8ЕС) ГО N0: 24); 559 лямбда (5 ЕС) ГО N0: 34); Е1-С6 лямбда (5 ЕС) ГО N0: 38); ЕВ1-А7 лямбда (5 ЕС) ГО N0: 40); ΕΌ-Β2 лямбда (5 ЕС) ГО N0: 42); 61Ό4 лямбда (5 ЕС) ГО N0: 50); СС1Е8 лямбда (5 ЕС) ГО N0: 52); Н1С12 лямбда (8ЕС) ГО N0: 54); 1Е-1С10 лямбда (8ЕС) ГО N0: 58); 1К-2Е2 лямбда (8ЕС) ГО N0: 60) и антигенсвязывающие фрагменты указанной области.

Согласно настоящему изобретению также предложен специфический связывающий агент, содержащий по меньшей мере один пептид, выбранный из следующей группы:

ЕС) ГО N0: 1; 5 ЕС) ГО N0: 3; 5 ЕС) ГО N0: 5; 5 ЕС) ГО N0: 7; 8ЕС) ГО N0: 9; 8ЕС) ГО N0: 11; 8ЕС) ГО N0: 13; 8ЕС) ГО N0: 15; 8ЕС) ГО N0: 17; 8ЕС) ГО N0: 19; 8ЕС) ГО N0: 21; 8ЕС) ГО N0:23;

8ЕС) ГО N0: 25; 8ЕС) ГО N0: 27; 8ЕС) ГО N0: 29; 8ЕС) ГО N0: 31; 8ЕС) ГО N0: 33; 8ЕС) ГО N0:35;

8ЕС) ГО N0: 37; 8ЕС) ГО N0: 39; 8ЕС) ГО N0: 41; 8ЕС) ГО N0: 43; 8ЕС) ГО N0: 45; 8ЕС) ГО N0:47;

8ЕС) ГО N0: 49; 8ЕС) ГО N0: 51; 8ЕС) ГО N0: 53; 8ЕС) ГО N0: 55; 8ЕС) ГО N0: 57; 8ЕС) ГО N0:59;

ЕС) ГО N0: 61; 5 ЕС) ГО N0: 2; 5 ЕС) ГО N0: 12; 5 ЕС) ГО N0: 18; 5 ЕС) ГО N0: 20; 5 ЕС) ГО N0:26;

8ЕС) ГО N0: 28; 8ЕС) ГО N0: 30; 8ЕС) ГО N0: 32; 8ЕС) ГО N0: 36; 8ЕС) ГО N0: 44; 8ЕС) ГО N0:46;

ЕС) ГО N0: 48; 5 ЕС) ГО N0: 56; 5 ЕС) ГО N0: 62; 5 ЕС) ГО N0: 4; 5 ЕС) ГО N0: 6; 5 ЕС) ГО N0: 8; 8ЕС) ГО N0: 10; 8ЕС) ГО N0: 14; 8ЕС) ГО N0: 16; 8ЕС) ГО N0: 22; 8ЕС) ГО N0: 24; 8ЕС) ГО N0:34;

8ЕС) ГО N0: 38; 8ЕС) ГО N0: 40; 8ЕС) ГО N0: 42; 8ЕС) ГО N0: 50; 8ЕС) ГО N0: 52; 8ЕС) ГО N0:54;

8ЕС) ГО N0: 58; и 8ЕС) ГО N0: 60 и их фрагменты.

Следует понимать, что специфический связывающий агент может представлять собой, например, антитело, такое как поликлональное, моноклональное, химерное, гуманизированное или полностью человеческое антитело. Антитело может также представлять собой одноцепочечное антитело. Настоящее изобретение также относится к гибридоме, продуцирующей моноклональное антитело согласно настоящему изобретению.

Также следует понимать, что настоящее изобретение относится к конъюгатам, описанным ниже. Конъюгат может представлять собой, например, специфический связывающий агент (такой как антитело), соответствующий настоящему изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим специфические связывающие агенты (такие как антитело), соответствующие настоящему изобретению, а также к вектору, содержащему такую молекулу нуклеиновой кислоты, равно как и к клетке-хозяину, содержащей такой вектор. В дополнение к сказанному, согласно настоящему изобретению также предложен способ приготовления специфического связывающего агента, включающий:

а) трансформацию клетки-хозяина по меньшей мере одной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей специфический связывающий агент по п.1 формулы изобретения;

б) экспрессию указанной молекулы нуклеиновой кислоты в указанной клетке-хозяине и

в) выделение указанного специфического связывающего агента.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ приготовления антител, включающий:

а) трансформацию клетки-хозяина по меньшей мере одной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, соответствующее настоящему изобретению;

Кроме того, настоящее изобретение также относится к способу ингибирования нежелательного ангиогенеза у млекопитающих посредством введения терапевтически эффективной дозы специфического связывающего агента, соответствующего настоящему изобретению. Согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения раковых заболеваний у млекопитающих путём введения терапевтически эффективной дозы специфического связывающего агента, соответствующего настоящему изобретению.

Настоящее изобретение относится к способу ингибирования нежелательного ангиогенеза у млекопитающих, включающему введение терапевтически эффективного количества антитела, соответствующего настоящему изобретению. Согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения раковых заболеваний у млекопитающих, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела, соответствующего настоящему изобретению.

Следует понимать, что настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим специфический связывающий агент, соответствующий настоящему изобретению, и фарма

- 3 011866 цевтически приемлемое вспомогательное вещество. Указанная фармацевтическая композиция может содержать антитело, соответствующее настоящему изобретению, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ модуляции или ингибирования активности ангиопоэтина-2 путем введения одного или более специфических связывающих агентов, соответствующих настоящему изобретению. Согласно изобретению также предложен способ модуляции или ингибирования активности ангиопоэтина-2 путем введения антитела, соответствующего настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к способу модуляции сосудистой проницаемости или протекания плазмы у млекопитающих, или того и другого, включающему введение терапевтически эффективной дозы специфического связывающего агента, соответствующего настоящему изобретению. Изобретение также относится к способу лечения по меньшей мере одного из следующих состояний: неоваскуляризация глаза, тучность, гемангиобластома, гемангиома, артериосклероз, воспалительное заболевание, воспалительные нарушения, атеросклероз, эндометриоз, неоплазия, заболевание, связанное с костью, или псориаз у млекопитающих, включающему введение терапевтически эффективной дозы специфического связывающего агента, соответствующего настоящему изобретению.

Кроме того, согласно настоящему изобретению предложен способ модуляции сосудистой проницаемости или протекания плазмы у млекопитающего, или того и другого, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела, соответствующего настоящему изобретению. Изобретение также относится к способу лечения по меньшей мере одного из следующих состояний: неоваскуляризация глаза, тучность, гемангиобластома, гемангиома, артериосклероз, воспалительное заболевание, воспалительные нарушения, атеросклероз, эндометриоз, неоплазия, заболевание, связанное с костями, или псориаз у млекопитающих, включающему введение терапевтически эффективного количества антитела, соответствующего настоящему изобретению.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения рака у млекопитающих, включающему введение терапевтически эффективного количества специфического связывающего агента, соответствующего настоящему изобретению, и химиотерапевтического агента. Специалистам понятно, что специфический связывающий агент и химиотерапевтический агент не обязательно вводить одновременно.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения рака у млекопитающих, включающему введение терапевтически эффективного количества антитела, соответствующего настоящему изобретению, и химиотерапевтического агента. Специфический связывающий агент и химиотерапевтический агент не обязательно вводить одновременно.

Согласно настоящему изобретению также предложен специфический связывающий агент, содержащий любой участок, определяющий комплементарность 1, выбранный из:

526 НС (8РС) ГО N0: 1); 528 НС (8РС) ΙΌ N0: 3); 531 НС (8РС) ГО N0: 5); 533 НС (8РС) ГО N0: 7); 535 НС (8РС) ГО N0: 9); 536 НС (8РС) ГО N0: 11); 537 НС (8РС) ГО N0: 13); 540 НС (8РС) ГО N0: 15); 543 НС (8РС) ГО N0: 17); 544 НС (8РС) ГО N0: 19); 545 НС (8РС) ГО N0: 21); 546 НС (8РС) ГО N0: 23); 551 НС (8РС) ГО N0: 25); 553 НС (8РС) ГО N0: 27); 555 НС (8РС) ГО N0: 29); 558 НС (8РС) ГО N0: 31); 559 НС (8 НО ГО N0: 33); 565 НС (8 НО ГО N0: 35); Р1-С6 НС (8 НО ГО N0: 37); РВ1-А7 НС (8НО ГО N0: 39); ΕΌ-Β2 НС (8НО ГО N0: 41); РЕ-В7 НС (8НО ГО N0: 43); Р1-611 НС (8НО ГО N0: 45); РК-Е3 НС (8 НО ГО N0: 47); 20 61Ό4 НС (8 НО ГО N0: 49); 6С1Е8 НС (8 НО ГО N0: 51); Н1С12 НС (8 НО ГО N0: 53); 1А1-1Е7 НС (8НО ГО N0: 55); 1Р-1С10 НС (8 НО ГО N0: 57); 1К-2Е2 НС (8 НО ГО N0: 59); 1Р-2С11 НС (8НО ГО N0: 61); 526 каппа (8 НО ГО N0: 2); 536 (ТН№) каппа (8 НО ГО N0: 12); 536 ДОТ) каппа (8 НО ГО N0: 210); 543 каппа (8 НО ГО N0: 18); 544 каппа (8НО ГО N0: 20); 551 каппа (8НО ГО N0: 26); 553 каппа (8НО ГО N0: 28); 555 каппа (8НО ГО N0: 30);

558 каппа (8НО ГО N0: 32); 565 каппа (8НО ГО N0: 36); РЕ-В7 каппа (8НО ГО N0: 44); Р1-611 каппа (8 НО ГО N0: 46); РК-Е3 каппа (8 НО ГО N0: 48); 1А1-1Е7 каппа (8 НО ГО N0: 56); 1Р-2С11 каппа (8НО ГО N0: 62); 528 лямбда (8НО ГО N0: 4); 531 лямбда (8НО ГО N0: 6); 533 лямбда (8НО ГО N0: 8); 535 лямбда (8НО ГО N0: 10); 537 лямбда (8 НО ГО N0: 14); 540 лямбда (8НО ГО N0: 16); 545 лямбда (8 НО ГО N0: 22); 546 лямбда (8 НО ГО N0: 24); 559 лямбда (8 НО ГО N0: 34); Р1-С6 лямбда (8 НО ГО N0: 38); РВ1-А7 лямбда (8 НО ГО N0: 40); РЭ-В2 лямбда (8 НО ГО N0: 42); 61Ό4 лямбда (8НО ГО N0: 50); 6С1Е8 лямбда (8НО ГО N0: 52); Н1С12 лямбда (8НО ГО N0: 54); 1Р-1С10 лямбда 5 (8НО ГО N0: 58) и 1К-2Е2 лямбда (8НО ГО N0: 60).

Настоящее изобретение, кроме того, относится к специфическому связывающему агенту, содержащему любой участок, определяющий комплементарность 2, выбранный из:

526 НС (8НО ГО N0: 1); 528 НС (8НО ГО N0: 3); 531 НС (8НО ГО N0: 5); 533 НС (8НО ГО N0: 7); 535 НС (8НО ГО N0: 9); 536 НС (8НО ГО N0: 11); 537 НС (8НО ГО N0: 13); 540 НС (8НО ГО N0: 15); 543 НС (8НО ГО N0: 17); 544 НС (8НН) ГО N0: 19); 545 НС (8НО ГО N0: 21); 546 НС (8НО ГО N0: 23); 551 НС (8НО ГО N0: 25); 553 НС (8НО ГО N0: 27); 555 НС (8НО ГО N0: 29); 558 НС (8НО ГО N0: 31);

559 НС (8 НО ГО N0: 33); 565 НС (8 НО ГО N0: 35); Р1-С6 НС (8 НО ГО N0: 37); РВ1-А7 НС (8НО ГО N0: 39); РЭ-В2 НС (8НО ГО N0: 41); РЕ-В7 НС (8НО ГО N0: 43); Р1-611 НС (8НО ГО N0: 45); РК-Е3 НС (8Е ГО N0: 47); 61Ό4 НС (8Е() ГО N0: 49); 6С1Е8 НС (8 НО ГО N0: 51); Н1С12 НС

- 4 011866 (81Т) ΙΌ N0: 53); ΙΑ1-1Ε7 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 55); 1Е-1С10 НС (8 ΕΟ ΙΌ N0: 57); ΙΚ-2Ε2 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 59); ЕР-2С11 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 61); 526 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 2); 536 (ТН№) каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 12); 536 (ЬрТ) каппа (8 ΕΟ ΙΌ N0: 210); 543 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 18); 544 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 20); 551 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 26); 553 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 28); 555 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 30);

558 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 32); 565 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 36); ΕΕ-Β7 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 44); Е1-С11 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 46); ΕΚ-Ε3 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 48); ΙΑ1-1Ε7 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 56); ΕΡ-2Ο1 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 62); 528 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 4); 531 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 6); 533 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 8); 535 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 10); 537 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 14); 540 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 16); 545 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 22); 546 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 24); 559 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 34); Е1-С6 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 38); ΕΒ1-Α7 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 40); ΕΌ-Β2 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 42); 61Ό4 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 50); 6Ό1Ε8 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 52); Н1С12 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 54); ТР-1С10 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 58) и ΙΚ-2Ε2 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 60).

Настоящее изобретение также относится к специфическому связывающему агенту, содержащему любой участок, определяющий комплементарность 3, выбранный из:

526 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 1); 528 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 3); 531 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 5); 533 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 7); 535 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 9); 536 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 11); 537 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 13); 540 НС (8ΕΟ ΙΌ N0:15);

543 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 17); 544 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 19); 545 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 21); 546 НС (8ΕΟ ΙΌ N0:23);

551 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 25); 553 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 27); 555 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 29); 558 НС (8ΕΟ ΙΌ N0:31);

559 НС (8 НО ΙΌ N0: 33); 565 НС (8 НО ΙΌ N0: 35); Е1-С6 НС (8 НО ΙΌ N0: 37); ΕΒ1-Α7 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 39); ΕΌ-Β2 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 41); ΕΕ-Β7 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 43); Е1-С11 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 45); ΕΚ-Ε3 НС (8Ε<3 ΙΌ N0: 47); 61Ό4 НС (8Ε() ΙΌ N0: 49); 6Ό1Ε8 НС (8 НО ΙΌ N0: 51); Н1С12 НС (8 ΕΟ ΙΌ N0: 53); ΙΑ1-1Ε7 НС (8 ΕΟ ΙΌ N0: 55); ΙΡ-1Ο10 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 57); ΕΚ-2Ε2 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 59); ΕΡ-2Ο1 НС (8ΕΟ ΙΌ N0: 61); 526 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 2); 536 (ТН№) каппа (8 ΕΟ ΙΌ N0: 12); 536 (ЬрТ) каппа (8 ΕΟ ΙΌ N0: 210) 543 каппа (8 ΕΟ ΙΌ N0: 18); 544 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 20); 551 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 26); 553 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 28); 555 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 30); 558 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 32); 565 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 36); ΕΕ-Β7 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 44); Е1-С11 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 46); ΕΚ-Ε3 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 48); ΙΑ1-1Ε7 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 56); ΕΡ-2Ο1 каппа (8ΕΟ ΙΌ N0: 62); 528 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 4); 531 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 6); 533 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 8); 535 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 10); 537 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 14); 540 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 16); 545 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 22); 546 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 24); 559 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 34); Е1-С6 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 38); ΕΒ1-Α7 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 40); ΕΌ-Β2 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 42); 61Ό4 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 50); ССШ8 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 52); Н1С12 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 54); ΙΡ-1Ο10 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 58) и ΙΚ-2Ε2 лямбда (8ΕΟ ΙΌ N0: 60).

Согласно настоящему изобретению также предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая специфический связывающий агент, соответствующий настоящему изобретению.

Кроме того, изобретение относится к способу определения уровня эритропоэтина-2 в биологическом образце путём а) приведения специфического связывающего агента, соответствующего настоящему изобретению, в контакт с образцом и б) определения уровня связывания специфического связывающего агента с образцом. Изобретение также относится к способу определения уровня эритропоэтина-2 в биологическом образце путём а) приведения антитела, соответствующего настоящему изобретению, в контакт с образцом и б) определения уровня связывания антитела с образцом.

Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования нежелательного ангиогенеза у млекопитающих, включающему введение терапевтически эффективного количества полипептида или фармацевтической композиции, описанных здесь. Изобретение также относится к способу модуляции ангиогенеза у млекопитающих, включающему введение терапевтически эффективного количества полипептида или фармацевтической композиции, как здесь описано. Кроме того, изобретение относится к способу ингибирования роста опухолей, связанного с нежелательным ангиогенезом, у млекопитающих, включающему введение терапевтически эффективного количества полипептида или фармацевтической композиции, описанных здесь. Также изобретение относится к способу лечения рака, включающему введение терапевтически эффективного количества полипептида или фармацевтической композиции, описанных здесь, и химиотерапевтического агента. В предпочтительном воплощении химиотерапевтический агент представляет собой по меньшей мере один агент из следующего ряда: 5-Εϋ, СРТ-11 или Таксотер. Однако понятно, что можно применять также другие химиотерапевтические агенты, а также другие виды терапии рака.

Понятно, что специфические связывающие агенты, соответствующие настоящему изобретению, можно применять для лечения множества заболеваний, связанных с нарушением регуляции ангиогенеза или с нежелательным ангиогенезом. Список этих заболеваний включает без ограничения, такие заболевания, как неоваскуляризация глаза, такая как ретинопатия (включая диабетическую ретинопатию и старческую макулодегенерацию), псориаз, гемангиобластома, гемангиома, артериосклероз, воспалительные заболевания, такие как ревматоидные или ревматические воспаления, в особенности артрит (включая ревматоидный артрит), или другие хронические воспалительные расстройства, такие как хроническая астма, артериальный или посттрансплантационный атеросклероз, эндометриоз и неоплазии, например

- 5 011866 так называемые солидные опухоли и жидкие опухоли (такие как лейкемии). Специалистам в данной области очевидны и другие заболевания, которые можно лечить введением специфических связывающих агентов. Эти другие заболевания включают, без ограничения, тучность, сосудистую проницаемость, протекание плазмы и заболевания скелета, такие как остеопороз. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способам лечения этих заболеваний, связанных с нарушением регуляции ангиогенеза или нежелательным ангиогенезом.

Другие воплощения настоящего изобретения станут ясны из приведенного здесь раскрытия.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлен график зависимости размера опухоли (ось ординат) от времени (ось абсцисс) у мышей, которым вводили антитело к Апд-2 (клоны 533, 537 или 544), соответствующее настоящему изобретению, контрольное антитело или физиологический фосфатно-буферный раствор (РВ8 - рйокрйа1е Ьийетей ка1ше). Подробности изложены в примерах.

На фиг. 2а-2в представлены данные картирования эпитопов (ΌΌ. 370) для полного человеческого Апд-2 (ЬАид-2) полной длины на Ν-конце йАпд-2 и на С-конце йАид-2 соответственно при помощи антигенсвязывающих пептидов ТШ-Соп-4-С. Ы-7-Ν и 12-9-3-С, соответствующих настоящему изобретению, а также с помощью контрольных антигенсвязывающих пептидов (пептидных антител) Т1е-2Рс, С2В8 или 5В12. Подробности изложены в примерах.

Подробное описание изобретения

Заголовки разделов используются здесь только с целью структурирования текста и ни в коей мере не ограничивают описанные объекты.

Для получения рекомбинантных молекул ДНК, белков и антител, а также клеточных культур и для трансформации клеток могут быть использованы общепринятые методы. Ферментативные реакции и способы очистки, как правило, осуществлялись в соответствии с указаниями производителей или при помощи принятых в данной области широко распространённых процедур, описанных, например, в руководстве 8ашЬтоок и др. (8ашЬтоок е1 а1. Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬогаФгу Мапиа1. - Со1й 8ртшд НагЬог ЬаЬогаФгу Ргекк, Со1й 8ртшд НагЬог, ΝΥ. - 1989) или так, как описано здесь. Если не указано специально, используемая номенклатура, а также лабораторные процедуры и методики из области аналитической химии, химии органического синтеза, медицинской и фармацевтической химии, приведённые здесь, хорошо известны и широко применяются в данной области знания. Для химического синтеза, химического анализа, приготовления лекарственных средств, фармацевтических композиций, а также введения пациентам и лечения пациентов могут применяться стандартные процедуры.

Определения

Используемые в соответствии с настоящим описанием следующие термины, если не указано иначе, должны пониматься как имеющие следующие значения.

Термин Апд-2 относится к полипептиду, приведенному на фиг. 6 патента ϋδ 6166185 (Т1е-2 11даий-2/лиганд-2 рецептора Т1е-2), или его фрагментам, а также к родственным полипептидам, включающим аллельные варианты, варианты сплайсинга, производные, варианты с заменами, делениями и/или вставками, слитые пептиды или полипептиды и гомологи других видов животных. Полипептид Апд-2 может включать или не включать дополнительные концевые аминокислотные остатки, например лидерные последовательности, направляющие последовательности, Ν-концевой остаток метионина, Ν-концевые остатки метионина и лизина и/или дополнительные либо слитые белковые последовательности, в зависимости от способа его получения.

Термин биологически активный, используемый в отношении Апд-2 или специфического агента, связывающего Апд-2, относится к пептиду или полипептиду, обладающему хотя бы одной активностью, характерной для Апд-2 или специфического агента, связывающего Апд-2. Специфический агент, связывающий Апд-2, может обладать агонистической, антагонистической, нейтрализующей или блокирующей активностью в отношении по меньшей мере одной биологической активности Апд-2.

Термин специфический связывающий агент относится к молекуле, предпочтительно к молекуле белковой природы, которая связывает Апд-2 (а также варианты и производные Апд-2, описанные здесь), обнаруживая к последнему большее сродство, нежели к прочим ангиопоэтинам. Специфическим связывающим агентом могут быть белок, пептид, нуклеиновая кислота, углевод, липид или низкомолекулярное вещество, которые предпочтительно связываются с Апд-2. В предпочтительном воплощении специфический связывающий агент, соответствующий настоящему изобретению, представляет собой антитело, такое как поликлональное антитело, моноклональное антитело (тАВ - топос1опа1 апйЬойу), химерное антитело, антитело, конъюгированное с участком, определяющим комплементарность (СЭР - сотрйтейагйу Йе1етт1шпд тедюп), полиспецифическое антитело, биспецифическое антитело, каталитическое антитело, гуманизированное антитело, человеческое антитело, антиидиотипическое антитело, антитела, которые могут быть мечеными в растворимой или связанной форме, а также их фрагменты, варианты или производные, сами по себе или в сочетании с другими аминокислотными последовательностями, получаемые посредством известных методик. Эти методики включают, без ограничения, ферментативное расщепление, химическое расщепление, синтез пептидов или рекомбинантные методики. Специфические агенты, связывающие Апд-2, соответствующие настоящему изобретению, способны

- 6 011866 связывать области Лид-2, которые модулируют, т.е. ингибируют или стимулируют, биологическую активность Апд-2 и/или другие активности, связанные с Апд-2.

Термин поликлональное антитело относится к гетерогенной смеси антител, которые распознают и связывают различные эпитопы одного и того же антигена. Поликлональные антитела могут быть получены из препаратов неочищенной сыворотки или же могут быть очищены при помощи, например, антигенно-аффинной хроматографии или аффинной хроматографии с белком А/белком С.

Термин моноклональные антитела относится к семейству антител, кодируемых одной и той же молекулой нуклеиновой кислоты, которые могут вырабатываться отдельной гибридомой или другой линией клеток, либо трансгенным млекопитающим, так что каждая молекула моноклонального антитела обычно распознаёт один и тот же эпитоп на антигене. Термин моноклональный не ограничивается каким-либо конкретным способом приготовления антител и, кроме того, не ограничивается антителами, получаемыми на каком-либо конкретном виде животных, например на мышах, крысах и пр.

Термин химерные антитела относится к антителам, в которых какая-либо область тяжёлой и/или лёгкой цепи тождественна или гомологична соответствующей последовательности антитела, происходящего из какого-либо конкретного вида животных или принадлежащего к какому-либо конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи (цепей) тождественна или гомологична соответствующей последовательности в молекуле антитела, происходящего из другого вида или принадлежащего к другому классу или подклассу антител. Сюда же включаются и фрагменты таких антител, как проявляющие желаемую биологическую активность (т.е. способность специфически связывать Апд-2) (см. патент И8 4816567 и Могпкоп е! а1. - Ргос. ЫаН. Асаб. 8с1. США 1985, 81, 6851-6855).

Термин антитело, конъюгированное с СЭЯ относится к антителу, в молекуле которого участок, определяющий комплементарность (СЭЯ) одного антитела какого-либо конкретного вида либо изотипа при помощи рекомбинантных методов, вставлен в каркасную область антитела того же или иного вида либо изотипа.

Термин полиспецифическое антитело относится к антителу, обладающему вариабельными областями, распознающими более чем один эпитоп в составе одного или нескольких антигенов. Подклассом этого типа антител являются биспецифические антитела, которые распознают два различных эпитопа в составе одного или нескольких антигенов.

Термин каталитическое относится к антителам, где направляющий связывающий агент конъюгирован с одним или более цитотоксическим или, в более общем виде, биологически активным остатком.

Термин гуманизированное антитело относится к особому типу антител, конъюгированных с СЭЯ, где каркасная область антитела происходит из человеческого организма, однако каждый СЭЯ заменен на СОЯ другого вида, например СОЯ мыши. Термин СОЯ определён ниже.

Термин полностью человеческое антитело относится к антителу, в котором как СЭЯ, так и каркасная область кодируются одной или несколькими молекулами ДНК человека.

Термин антиидиотипическое антитело относится к любому антителу, которое специфически связываются с другим антителом, распознающим антиген. Антиидиотипические антитела могут быть получены любым из описанных здесь способов получения антител, специфических к Апд-2, за исключением того, что эти антитела получают, например, посредством иммунизации животного антителом, специфическим к Апд-2, или его фрагментом, связывающим Апд-2, а не посредством иммунизации самим полипептидом Апд-2 или его фрагментом.

Термин варианты включает полипептиды, в которых имеются вставки, делеции или замены аминокислотных остатков встречающейся в природе (или, по меньшей мере, известной) аминокислотной последовательности связывающего агента. Этот термин охватывает, в частности, конъюгированные белки, описанные ниже.

Термин производные включает связывающие агенты, претерпевшие какие-либо химические модификации, отличные от вставок, делеций или замен.

Термин специфически связывает Апд-2 относится к способности какого-либо специфического связывающего агента (такого как антитело или его фрагмент), соответствующего настоящему изобретению, распознавать и связывать зрелый или непроцессированный полипептид Апд-2, или его фрагмент, или его ортолог, обнаруживая при этом сродство (определяемое, например, при помощи анализа ЕЫ8А (спхуте-Ппкеб шшшпокогЬегИ аккау - твердофазный иммуноферментный анализ) на сродство или анализа с помощью системы В1Асоге, описанных здесь) либо нейтрализующую способность (определяемую, например, при помощи анализа ЕЫ8А на нейтрализацию, описанного здесь, или других подобных анализов), превышающие по меньшей мере в 10 раз, однако в ряде случаев и в 50 раз, в 100, 200, 500 либо даже в 1000 раз их же сродство, или нейтрализующую способность по отношению к любому другому ангиопоэтину либо иному пептиду или полипептиду.

Термины антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающий участок относятся к области специфического связывающего агента (такого как молекула антитела), которая содержит аминокислотные остатки этого специфического связывающего агента (или другие структуры), которые взаимодействуют с антигеном и сообщают связывающему агенту специфичность и сродство к антигену. Антигенсвязывающий домен антитела принято называть участком, определяющим комплементарность

- 7 011866 (СЭЯ - сотр1стсп1ап1у бе!егт1шпд гедюп).

Термин эпитоп относится к области любой молекулы, обладающей способностью быть распознанной и связанной специфическим связывающим агентом, например антителом, при помощи одного или нескольких антигенсвязывающих участков указанного специфического связывающего агента. Обыкновенно эпитопы представляют собой химически активные поверхностные группировки молекул, таких как, например, аминокислоты или боковые цепи углеводородов, и обладают особыми трёхмерными структурными характеристиками, а также специфическим зарядом. Эпитопы, как их следует понимать здесь, могут быть смежными и не смежными. Кроме того, эпитопы могут быть миметическими, под которыми следует понимать трёхмерные структуры, идентичные структуре эпитопов, использованных для выработки антител, однако не содержащие ни одного или содержащие лишь некоторые аминокислотные остатки, входящие в состав Лпд-2, использованного для стимуляции иммунного ответа с выработкой антител.

Термин ингибирующий и/или нейтрализующий эпитоп обозначает эпитоп, который, будучи связан со специфическим связывающим агентом, таким как антитело, приводит к потере (или, по меньшей мере, к снижению) биологической активности молекулы, клетки или организма, содержащих такой эпитоп, ίη νίίτο, ίη νίνο или ίη δίΐιι. В контексте настоящего изобретения нейтрализующий эпитоп расположен в биологически активной области Лпд-2 либо ассоциирован с ней. В противоположность сказанному под активирующим эпитопом следует понимать эпитоп, который, будучи связан со специфическим связывающим агентом, соответствующим настоящему изобретению, таким как антитело, приводит к активации или, по меньшей мере, к поддержанию биологически активной конформации Лпд-2.

Термин фрагмент антитела относится к пептиду или полипептиду, содержащему участок, меньший, чем полная интактная молекула антитела. Полные молекулы антител содержат две функционально независимые части или фрагмента: антигенсвязывающий фрагмент, известный как ЕаЬ (от англ. Егадтеп! апйдеп Ьшбшд) и С-концевой кристаллизуемый фрагмент, известный как Ес (от англ. - Егащпеп! сгуйаШхаЫе). Фрагмент ЕаЬ включает первый константный домен как тяжёлой (СН - сопйап! йеауу). так и лёгкой (СЬ - сопйап! НдН1) цепей (СН1 и СЬ1) совместно с вариабельными участками обеих названных цепей, которые связывают специфический антиген. Вариабельные участки как тяжёлой, так и лёгкой цепей содержат по три участка, определяющих комплементарность (СОЯ), и аминокислотные остатки каркаса, которые разделяют отдельные СЭЯ. Участок Ес содержит второй и третий константные участки тяжёлой цепи (СН2 и СН3) и вовлечён в эффекторные функции, такие как активация комплемента и атака фагоцитов. В некоторых антителах участки ЕаЬ и Ес разделены шарнирным участком и в зависимости от того, как полная молекула антитела расщеплена протеолитически, шарнирный участок может быть связан как с ЕаЬ, так и с Ес-фрагментами. Например, при расщеплении антитела протеазой папаином шарнирный участок остаётся связанным с фрагментом Ес, тогда как при расщеплении протеазой пепсином получается фрагмент, где шарнир остаётся связанным сразу с обоими фрагментами ЕаЬ. Поскольку оба ЕаЬ фактически оказываются ковалентно связанными в результате расщепления пепсином, получаемый при этом фрагмент обозначается термином Е(аЬ')₂.

Домен Ес может обладать сравнительно долгим периодом полужизни в сыворотке крови, тогда как ЕаЬ является короткоживущим (Сароп е! а1. - №1иге, 1989, 337, 525-531). Если же домен Ес экспрессируется как часть слитого белка, это может обеспечивать более долгий период полужизни указанного фрагмента или наделять его такими функциями, как связывание рецептора Ес, связывание белка А, связывание комплемента и, возможно, даже проникновение через плаценту при помощи белка, с которым он конъюгирован. Участок Ес может представлять собой участок Ес, встречающийся в природе, либо может быть модифицирован для улучшения некоторых свойств, таких как терапевтические свойства или время существования в крови.

Термин вариабельный участок, или вариабельный домен относится к области лёгкой и/или тяжёлой цепей молекулы антитела, обычно содержащей приблизительно 120-130 Ν-концевых аминокислот тяжёлой цепи и около 100-110 Ν-концевых аминокислот лёгкой цепи. Обычно вариабельные области существенно отличаются от аминокислотной последовательности даже среди антител одного и того же вида. Вариабельная область антител обыкновенно определяет связывание и специфичность каждого конкретного антитела по отношению к специфичному для него антигену. Изменчивость последовательности сосредоточена в участках, называемых участками, определяющими комплементарность, тогда как более консервативные участки в составе вариабельных доменов называются каркасными участками. СЭЯ лёгкой и тяжёлой цепей содержат в своём составе аминокислоты, которые в наибольшей степени ответственны за прямое взаимодействие антитела с антигеном, однако аминокислоты каркасного участка могут существенно влиять на связывание/распознавание антигена, как это обсуждается ниже.

Термин лёгкая цепь, применяемый по отношению к антителам, одновременно относится к двум различным типам полипептидных цепей, называемых каппа (к) или лямбда (λ) на основании полипептидной последовательности константных областей.

- 8 011866

Термин тяжёлая цепь, применяемый по отношению к антителам, одновременно относится к пяти различным типам полипептидных цепей, называемых альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, на основании аминокислотной последовательности константной области тяжёлой цепи. Сочетание тяжёлой и лёгкой цепей даёт пять известных классов антител: 1дА, 1дО, 1дЕ, 1дС и 1дМ соответственно, включая четыре известных подкласса 1дС, обозначаемых как 1дС₁, 1дС₂, 1дС₃ и 1дС₄.

Термин встречающийся в природе, применяемый по отношению к биологическим объектам, таким как молекулы нуклеиновых кислот, полипептиды, клетки-хозяева и т.п., относится к таким биологическим объектам, которые обнаружены в природе и не модифицированы человеком.

Термин выделенный, употребляемый применительно к Аид-2 или агенту, специфически связывающему Апд-2, относится к соединению, которое не содержит хотя бы от одного из загрязняющих его полипептидов или соединений, обнаруживающихся в его природном окружении, предпочтительно, по существу, не содержит никаких других загрязняющих его полипептидов млекопитающих, которые могли бы помешать его использованию в терапии или диагностике.

Термин зрелый, употребляемый применительно к Апд-2, антителам к Апд-2 либо любому другому агенту белковой природы, специфически связывающему Апд-2, относится к пептиду или полипептиду, в котором отсутствует лидерная или сигнальная последовательность. Если связывающий агент, соответствующий настоящему изобретению, экспрессируется, например, в прокариотической клетке, то зрелый пептид или полипептид может содержать и дополнительные аминокислотные остатки (но всё равно не иметь лидерной последовательности), такие как Ν-концевой метионин либо один или несколько остатков метионина и лизина. Пептид или полипептид, полученный таким образом, может применяться с этими дополнительными аминокислотными остатками или без них, которые в таком случае подлежат удалению.

Термины эффективное количество или терапевтически эффективное количество применительно к агенту, специфически связывающему Апд-2, относятся к количеству специфического связывающего агента, которое способствует или необходимо для обеспечения заметного изменения уровня одного или нескольких видов биологической активности Апд-2. Указанное изменение может состоять в повышении или понижении уровня активности Апд-2. Предпочтительно указанное изменение состоит в понижении активности Апд-2.

Специфические связывающие агенты и антитела.

Используемый здесь термин специфический связывающий агент относится к молекуле, которая обладает специфичностью в отношении распознавания и связывания Апд-2, как описано здесь. Приемлемые специфические связывающие агенты включают, без ограничения, антитела и их производные, полипептиды и низкомолекулярные вещества. Приемлемые специфические связывающие агенты могут быть получены способами, известными в данной области техники. Титичный агент, связывающий полипептид Апд-2, соответствующий настоящему изобретению, способен связывать какую-либо область полипептида Апд-2 и предпочтительно модулировать активность или функцию полипептида Апд-2.

Специфические связывающие агенты, такие как антитела или фрагменты антител, которые специфически связывают полипептиды Апд-2, подпадают в объем настоящего изобретения. Антитела могут быть поликлональными, в том числе моноспецифическими поликлональными; моноклональными (тАЬ§ от Мопос1опа1 апйЬоФек), рекомбинантными, химерными, гуманизированными, например СЭЯ-конъюгированными, человеческими, одноцепочечными, каталитическими, полиспецифическими и/или биспецифическими, а также их фрагментами, вариантами и/или производными.

Поликлональные антитела к полипепиду Апд-2 обыкновенно получают у животных (например, кроликах, хомяках, козах, овцах, лошадях, свиньях, крысах, песчанках, морских свинках, мышах или других подходящих млекопитающих, а также в других видах животных, не принадлежащих к млекопитающим) посредством множественных подкожных или внутрибрюшинных инъекций полипептида Апд-2 или его фрагмента с адъювантом или без него. Такие адьюванты включают, без ограничения, полный или неполный адъюванты Фрейнда, минеральные гели, такие как гидроокись алюминия, и поверхностноактивные вещества, такие как лизолецитин, многоатомные спирты Плюроник (Р1игошс), полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин морского блюдечка и динитрофенол. ВСС (Ьасй11 Са1тс11сСиегт - палочки Кальмета-Герена) и СогупеЬас!егшт рагуит являются потенциально приемлемыми адъювантами для человека. Может быть полезно конъюгировать антигенный полипепид с белкомносителем, иммуногенным для иммунизируемого вида животных, таким как гемоцианин морского блюдечка, сывороточный альбумин, бычий тироглобулин или ингибитор трипсина из соевых бобов. Кроме того, для усиления иммунного ответа применяются агрегирующие вещества, такие как квасцы. После иммунизации у животных осуществляют забор крови и в сыворотке крови определяют титр антител к полипептиду Апд-2, например, так, как описано в разделе Примеры. Поликлональные антитела могут использоваться в виде сыворотки, в составе которой они обнаружены, или же могут быть очищены, например, посредством аффинной хроматографии на сорбенте с иммобилизованным антигеном либо белком А или С.

- 9 011866

Моноклональные антитела к полипептидам Апд-2 могут быть получены в качестве неограничивающего примера традиционным гибридомным способом или более новым способом фаговой экспрессии. Моноклональные антитела, соответствующие настоящему изобретению, могут, например, быть получены гибридомным способом, как описано в статье КоЫег е1 а1. - Ыа1иге, 1975, 256, 495; способом с получением гибридомы из человеческих лимфоцитов В (КокЬог е1 а1. - 1ттипо1. Тойау, 1983, 4, 72; Со1е е1 а1. - Ргос. Ыа11. Асай. 8с1. (США), 1983, 80, 2026-2030ΖΑ; Вгойеиг е1 а1. - в кн.: Мопос1опа1 АпйЬойу Ргойисйоп: Тесйтдие апй Аррйсайоп.- Магсе1 Эескег 1пс., ΝΥ. - 1987. - р. 51-63), и ЕВУ-гибридомным способом (Со1е е1 а1. - в кн.: Мопос1опа1 АпИЬоФек апй Сапсег Тйегару. - А1ап В. Ыкк 1пс., ΝΥ. - 1985. - р. 77-96). Согласно изобретению также предложены гибридомные клеточные линии, которые вырабатывают моноклональные антитела, реагирующие с полипептидами Апд-2.

В случае применения гибридомной методики могут быть использованы клеточные линии миеломы. Такие клеточные линии, применяемые в процедурах слияния клеток для получения гибридом, предпочтительно не производят антител, обладают высокой эффективностью при слиянии клеток и недостатком ряда ферментов, что делает их не способными расти в некоторых селективных средах, которые поддерживают рост только желательных слитых клеток (гибридом). Для слияния используются, например, такие клеточные линии мышей, как 8р-20, Р3-Х63/Ад8, Р3-Х63-Ад8.653, Ν§ 1/1.Ад 4.1, 8р210-Ад14, ΡΘ, ΝδΘ/и, МРС-11, МРС11-Х45-ОТО 1.7 Ь 8194/5ХХ0 Ви1; такие клеточные линии крыс, как Κ210.Κ6Υ3, ΥΙ-Ад 1.2.3, 1В983Р и 4В210. Другими клеточными линиями, используемыми для слияния клеток, являются и-266, 0М1500-0К.02, Е1СК.-ЬО№НМу2 и ИС729-6. Гибридомы и другие клеточные линии, вырабатывающие моноклональные антитела, рассматриваются как новые композиции, соответствующие настоящему изобретению.

Для получения моноклональных антител ряда видов животных может применяться и метод фаговой экспрессии. Этот метод предпочтительно используют для получения полностью человеческих моноклональных антител, в которых полинуклеотид, кодирующий одиночный фрагмент РаЬ или Ρν, экспрессирован на поверхности фаговой частицы (НоодепЬоот е1 а1. - 1. Мо1. Вю1., 1991, 227, 381; Магкк е1 а1. - 1. Мо1. Вю1., 1991, 222, 581; см. также патент США № 5885793). Каждый фаг может быть подвергнут скринингу с использованием тестов на связывание, описанных здесь, для выявления фрагментов антител, имеющих сродство к Апд-2. Этот процесс имитирует иммунный отбор посредством экспрессии фрагмента антител на поверхности нитевидного бактериофага с последующим отбором фагов по их связыванию с Апд-2. Одна из таких процедур описана в международной заявке РСТ/и898/17364, поданной от имени Айатк и др., которая описывает выделение высокоаффинных и функциональных агонистических фрагментов антител к рецепторов МРЬ и ткк с применением такого методического подхода. При таком подходе полная библиотека генов человеческих антител может быть создана посредством клонирования природных комбинаций вариабельных генов из лимфоцитов периферической крови, как это было описано ранее (МиШпах е1 а1. - Ргос. №И. Асай. 8ск (США), 1990, 87, 8095-8099).

После выявления полинуклеотидных последовательностей, которые кодируют каждую из цепей полной молекулы моноклональных антител либо фрагментов РаЬ или Ρν, для экспрессии полинуклеотидов моноклональных антител могут быть использованы прокариотические или эукариотические клеткихозяева с применением рекомбинантных методик, хорошо известных и широко применяемых в данной области техники. В другом случае получают трансгенных животных, где полинуклеотид, кодирующий требуемый специфический связывающий агент, вводят в геном животного-реципиента, такого как, например, мышь, кролик, коза или корова, способом, позволяющим осуществить экспрессию полинуклеотидных молекул, кодирующих моноклональное антитело или другой специфический связывающий агент. В соответствии с одним из аспектов полинуклеотиды, кодирующие моноклональное антитело или другой специфический связывающий агент, могут лигировать с регуляторными последовательностями, специфичными для молочной железы, и такие химерные полинуклеотиды могут быть введены в клетки зародышевого пути животного-мишени. Полученное трансгенное животное при этом продуцирует требуемое антитело с молоком (Ро11ок е1 а1. - 1. 1ттипо1. Ме111.. 1999, 231, 147-157; Ый1е е1 а1. - 1ттипо1. Тойау, 2000, 8, 364-370). В дополнение к сказанному, для экспрессии и производства агентов, специфически связывающих Апд-2, таких как моноклональные антитела, могут использоваться растения посредством трансфекции подходящих растений полинуклеотидами, кодирующими моноклональные антитела либо другие специфические связывающие агенты.

В другом воплощении настоящего изобретения моноклональные или поликлональные антитела либо их фрагменты, происходящие не из человеческого организма, могут быть гуманизированными или химеризованными. Способы гуманизирования нечеловеческих антител хорошо известны в данной области техники (см. патенты США № 5585089 и 5693762). Гуманизирование осуществляют, например, способами, описанными в литературе (Йопек е1 а1. - №1иге, 1986, 321, 522-525; Кэесйтапп е1 а1. - №1иге, 1988, 332, 323-327; Уегйоеуеп е1 а1. - 8с1епсе, 1988, 239, 1534-1536), посредством замещения по меньшей мере части участков, определяющих комплементарность (СЭЯ), например, грызунов, соответствующими участками человеческих антител. Согласно настоящему изобретению также предложены варианты и производные этих человеческих антител, как это обсуждается здесь и известно в области техники.

- 10 011866

Настоящее изобретение охватывает также полностью человеческие антитела, которые связывают полипептиды Лид-2, а также фрагменты, варианты и/или их производные. Такие антитела могут быть получены способом фаговой экспрессии, описанным выше. В ином варианте для выработки таких антител могут быть использованы трансгенные животные (например, мыши), способные производить спектр человеческих антител, не вырабатывая собственных антител. Это может быть осуществлено путём иммунизации животного антигеном Апд-2 или его фрагментами с аминокислотной последовательностью, уникальной для Апд-2. Такие иммуногены, при желании, могут быть конъюгированными с носителем (см., например, 1акоЬоуЙ8 е! а1. - Ргос. №111. Асай. 8ст (США), 1993, 90, 2551-2555; 1акоЬоуЙ8 е! а1. - №а1иге, 1993, 362, 255-258; Вгиддегтапп е! а1. - Уеаг ίη 1ттипо, 1993, 7, 33). Согласно одному из способов таких трансгенных животных получают путём выведения из строя собственных участков генома, кодирующих тяжёлые и лёгкие цепи иммуноглобулинов, и введения участков, кодирующих человеческие белки тяжёлых и лёгких цепей в этот геном. Частично модифицированных животных, несущих неполный набор таких изменений генома, далее скрещивают между собой для получения животных, имеющих все требуемые изменения в иммунной системе. При введении иммуногена такие животные способны вырабатывать антитела с человеческими вариабельными участками, включающими человеческие (а не, например, мышиные) аминокислотные последовательности, иммуноспецифичные по отношению к выбранному антигену (см. международные заявки РСТ/и896/05928 и РСТ/и893/06926). Дополнительные способы описаны в патенте И8 5545807, международных заявках РСТ/и891/245 и РСТ/СВ89/01207, а также в патентах ЕР 546073В1 и ЕР 546073А1. Человеческие антитела могут быть также получены посредством экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках-хозяевах или путём экспрессии в клетках гибридом, как здесь описано.

Трансгенез осуществляют множеством различных способов (см., например, Вгиддетап е! а1. - 1ттипо1. Тойау, 1996, 17, 391-397). При одном из подходов минилокус конструируют таким образом, чтобы участки генов в конфигурации зародышевого пути искусственным образом были сближены друг с другом. Ввиду ограничений по размерам (обычно он содержит менее 30 тыс. пар нуклеотидов) полученный минилокус будет содержать ограниченное число различных генетических фрагментов, но, тем не менее, способен вырабатывать широкий спектр антител. Минилокусы, содержащие только последовательности человеческой ДНК, в том числе промоторы и энхансеры, полностью функциональны в трансгенных мышах.

При желании ввести в трансгенное животное большее количество генетических фрагментов используют искусственные дрожжевые хромосомы (УАС - уеак! атййс1а1 сйтошокошек). Размер таких хромосом варьирует от нескольких сотен тысяч пар нуклеотидов до миллиона, и вводят их в геном мыши (или другого подходящего животного) путём микроинъекции прямо в яйцеклетку либо посредством введения УАС в линии эмбриональных стволовых клеток. Обычно искусственные дрожжевые хромосомы вводят в эмбриональные стволовые клетки путём липофекции очищенной ДНК либо посредством слияния их с дрожжевыми сферопластами, в составе которых очищенная ДНК заключена в мицеллы, при этом слияние осуществляют способом, напоминающим процедуру слияния гибридомы. Отбор желаемых эмбриональных стволовых клеток после переноса ДНК осуществляют, включая в состав искусственной дрожжевой хромосомы любого из селективных маркёров, известных в данной области техники.

В другом варианте используют векторы на основе бактериофага Р1, который размножают в клетках Е.сой. Поскольку такие векторы обычно несут меньше вставочной ДНК, чем искусственные УАС, клоны выращивают в больших количествах, достаточных для эффективной микроинъекции в яйцеклетку мыши. Было показано, что использование смеси различных векторов на основе Р1 приводит к высокому уровню гомологической рекомбинации.

После выявления подходящей трансгенной мыши (или другого подходящего животного) при помощи любой из известных в данной области техники методик определения уровня обращающихся антител в сыворотке крови (например, твердофазный иммуноферментный анализ) трансгенное животное скрещивают с мышью, у которой нарушен собственный участок генома, кодирующий иммуноглобулины. В результате получается потомство, у которого все лимфоциты В экспрессируют человеческие антитела.

Как ещё один вариант локус животного, кодирующий иммуноглобулины, полностью замещают аналогичным участком человеческого генома, при этом полученные животные экспрессируют только человеческие антитела. При другом подходе части локуса животного замещают соответствующими частями человеческого локуса. В некоторых случаях животные, получаемые в итоге такой процедуры, могут экспрессировать химерные антитела, а не полностью человеческие антитела, в зависимости от природы замены в участке генома мыши, кодирующем иммуноглобулины.

Человеческие антитела можно получить и при предъявлении антигена человеческим спленоцитам (лимфоцитам В и Т) ш νίϋΌ, после чего эти клетки вводят в селезёнку мыши, у которой нарушена иммунная система, например 8СГО или пой/8СГО (см. Вгапъ е! а1. - 1. 1шшипо1., 1998, 160, 2051-2058; СагЬаШйо е! а1. - №11. Мей., 2000, 6, 103-106). При одном из подходов имплантация человеческой зародышевой ткани к мыши линии 8СГО (8СГО-йи) приводит к длительному гематопоэзу и развитию человеческих Т-лимфоцитов (МсСипе е! а1. - 8аепсе, 1998, 241, 1532-1539; Итегееп е! а1. - 8еш. 1шшишо1., 1996, 8, 243-248). Любой гуморальный иммунный ответ у таких химерных мышей полностью зависит от одно

- 11 011866 временного развития Т-клеток (Майепккоп е! а1. - 1ттипо1., 1994, 83, 1271-1279). При другом подходе лимфоциты из периферической крови человека внутрибрюшинно (или иным путём) пересаживают мыши линии 8СШ (Мо18ег е! а1. - ЫаШге, 1988, 335, 256-259). Если пересаживаемые клетки обрабатывают активирующим агентом, таким как энтеротоксин А стафилококка (8ЕА - 8!арйу1ососса1 Еп!его!охш А) (Майепккоп е! а1. - 1ттипо1., 1995, 84, 224-230) или моноклональными антителами человеческого СЭ40 (Мигрйу е! а1. - В1ооб, 1995, 86, 1946-1953), то наблюдается более высокий уровень образования В-клеток.

В другом варианте из неизмененных фрагментов гена V создают набор полностью синтетических человеческих тяжёлых цепей путём соединения каждого участка νΗ человека с фрагментами Ό со случайной последовательностью нуклеотидов и с фрагментом 1 человека (НоодепЬоот е! а1. - 1. Мо1. Вю1., 1992, 227, 381-388). Сходным образом, набор лёгких цепей конструируют путём комбинирования каждого человеческого фрагмента V с фрагментом 1 (СгНГПк е! а1. - ЕМВО 1., 1994, 13, 3245-3260). Нуклеотиды, кодирующие полную молекулу антител (т.е. обе цепи: тяжёлую и лёгкую), сцепляют в одноцепочечный фрагмент Εν и такой полинуклеотид лигируют с полинуклеотидом, кодирующим малый белок оболочки нитевидного фага. Когда такой слитый белок экспрессируется на поверхности фага, полинуклеотид, кодирующий специфические антитела, выявляется посредством отбора на иммобилизованном антигене.

Ещё один методический подход состоит в том, что фрагменты антител компонуют в виде двух фрагментов ЕаЬ посредством слияния в одну цепь с белком фага и секреции последнего в периплазму бактерии (НоодепЬоот е! а1. - Ыиск Аабк Век., 1991, 19, 4133-4137; ВагЬак е! а1. - Ргос. №11. Асаб. 8с1. (США), 1991, 88, 7978-7982).

В больших масштабах получение химерных, гуманизированных, СЭВ-конъюгированных и полностью человеческих антител или их фрагментов обыкновенно осуществляют рекомбинантными способами. Молекулы полинуклеотидов, кодирующие тяжёлую и лёгкую цепи каждого из антител, или их фрагментов, могут быть введены в клетки-хозяева и могут вызывать их экспрессию с применением средств и процедур, описанных здесь. В предпочтительном воплощении продукцию антител осуществляют в клетках-хозяевах млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомячка (клетки СНО - сй1па йатк!ег о\'агу). Подробности получения антител таким способом описаны ниже.

Конъюгационные партнёры специфических связывающих агентов.

В другом воплощении настоящего изобретения полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность вариабельных доменов антител к Апд-2, такие как вариабельный участок тяжёлой цепи, с аминокислотой последовательностью, такой, как описана здесь, или вариабельный участок лёгкой цепи, с аминокислотой последовательностью, такой, как описана здесь, могут быть конъюгированы либо с Ν-концом, либо с С-концом одного или более доменов участка Ес человеческого 1дС. В конструкции, где он содержится вместе с терапевтическим белком, таким как ЕаЬ или антитело, специфичное к Апд-2, домен Ес может сообщать ей больший период полураспада или придавать такие функции, как связывание рецептора Ес, связывание белка А, связывание комплемента, а возможно, и проницаемость через плацентарный барьер. (Сароп е! а1. - М-Ииге. 1989, 37, 525-531).

В одном из примеров шарнирная область антител, участок СН2 и участок СН3 могут быть конъюгированы с Ν-концом либо с С-концом полипептидных молекул специфических связывающих агентов, таких как ЕаЬ или Εν, специфичных к Апд-2 (полученные, например, из библиотеки фаговой экспрессии) способами, известными специалисту в области техники. Полученный слитый белок может быть очищен аффинной хроматографией на колонке с иммобилизованным белком А или белком С. Обнаружено, что пептиды и белки, конъюгированные с участком Ес, обладали значительно большим периодом полураспада ίπ ν^νо, чем их неконъюгированные эквиваленты. К тому же конъюгация с участком Ес даёт возможность димеризации/мультимеризации слитого полипептида. Участок Ес может быть природным участком Ес или же может быть модифицирован для улучшения некоторых свойств, таких как терапевтические свойства, время обращения в кровеносном русле, для уменьшения проблемы агрегации и т.д. Другие примеры, известные в области техники, включают такие, в которых участок Ес, человеческий или другого вида животных, или же синтетический, конъюгирует с Ν-концом СО30Ь для лечения болезни Ходжкина, анапластической лимфомы или Т-клеточной лейкемии (патент ϋδ 5480981); участок Ес конъюгирует с рецептором ФНО (фактора некроза опухоли) для лечения септического шока (Е1кйег е! а1., N Епд. 1. Меб, 334: 1697-1702 (1996)) или же участок Ес конъюгирует с рецептором Сб4 для лечения СПИД (Сароп е! а1., ХаШге, 337: 525-31 (1989)).

Каталитические антитела являются другим типом конъюгатов и представляют собой антитела, в составе которых одна или несколько цитотоксических или, в более общем виде, биологически активных субъединиц прикреплены к специфическому связывающему агенту (см., например, Вабег е! а1., Сйет. Еиг. 1. 12: 2091-2095 (2000)). Цитотоксические агенты такого типа повышают цитотоксичность, опосредуемую антителами, и включают такие фрагменты, как цитокины, напрямую или опосредованно вызывающие гибель клеток, радиоизотопы, химиотерапевтические лекарства (в том числе пролекарства), бактериальные токсины (например, эндотоксин псевдомонады, дифтерийный токсин и т.п.), растительные яды (например, рицин, гелонин и т.п.), химические конъюгаты (например, майтансиноидный токсин, калехемицин и т.п.), радиоконъюгаты, конъюгаты ферментов (конъюгаты РНКазы, фермент

- 12 011866 ная/пролекарственная терапия, направляемая антителами (ΆΌΕΡΤ - апйЬобу бйес1еб ГегтеШ/ргобгид 1йегару), и т.п. В одном из аспектов цитотоксический агент может быть прикреплен к одному из компонентов биспецифических или полиспецифических антител посредством связывания такого агента с одним из альтернативных антигенраспознающих участков таких антител. В ином варианте цитотоксины белковой природы могут экспрессироваться как слитые белки со специфическим связывающим агентом после лигирования полинуклеотида, кодирующего токсин, с полинуклеотидом, кодирующим связывающий агент. Ещё в одном варианте специфический связывающий агент может быть ковалентно модифицирован для включения требуемого цитотоксина.

Примерами таких слитых белков являются иммуногенные полипептиды, белки с длительным периодом полураспада в кровяном русле, такие как константные области иммуноглобулинов, белки-метки, белки или полипептиды, облегчающие очистку требуемого специфического связывающего полипептидного агента, и полипептидные последовательности, способствующие образованию мультимерных белков (такие как мотивы лейциновая застёжка, способствующие образованию и устойчивости димеров).

Этот тип инсерции обыкновенно подразумевает связывание целой нативной молекулы или значительной её части с целым вторым полипептидом или его частью. Например, слитые белки часто содержат лидерные последовательности других видов животных для обеспечения рекомбинантной экспрессии белка в гетерологичном хозяине. Другой полезный вариант слитых белков включает в себя дополнительный иммунологически активный домен, такой как эпитоп антитела, для облегчения очистки слитого белка. Включение участка расщепления в участке конъюгации или рядом с ним позволит удалить чужеродный белок после очистки. Другие полезные варианты конъюгации включают связывание с функциональными доменами, такими как активные участки ферментов, участки гликозилирования, сигнальные группировки для клеток-мишеней или трансмембранные области.

Различные системы экспрессии конъюгированных белков, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, поступают в продажу. Особенно пригодные системы включают, без ограничения, систему глутатион-8-трансферазы (С8Т) (РйагтаОа), систему с белком, связывающим мальтозу (ΝΕΒ, ВегеНеу. МА), систему РЬАС 5 (ΙΒΙ, Νο\ν Науеп, СТ) и систему 6хН15 (О1адеп, С11а15\\'ог111. СА). Эти системы способны производить рекомбинантные полипептиды с очень небольшим количеством дополнительных аминокислот, где последние практически не влияют на антигенные свойства рекомбинантного полипептида. Например, и система РЬАС, и система 6хН15 добавляют лишь короткие последовательности, обе из которых слабо антигенны и не оказывают неблгоприятного влияния на укладку полипептида в нативную конформацию. Другой перспективный вариант Ν-концевой конъюгации представляет собой конъюгацию дипептида метионин-лизин к Ν-концу белка или пептида. Это может благоприятно влиять на экспрессию или активность белка.

Особенно полезной конъюгационной конструкцией может являться такая, в которой пептид специфического связывающего агента объединён с гаптеном для усиления иммуногенности такой конструкции, что полезно, например, для получения антиидиотипических антител, соответствующих настоящему изобретению. Такие слитые конструкции с увеличенной иммуногенностью хорошо знакомы специалистам, например конъюгация специфического связывающего агента с антигеном-помощником, таким как Й5р70, или пептидные последовательности, например, из дифтерийного токсина, или цитокины, например интерлейкин-2, будет полезной для стимуляции иммунного ответа. В ином варианте осуществления может быть создана слитая конструкция, которая способствовала бы направленному воздействию специфического связывающего агента на какой-либо орган или тип клеток.

Предложены также и другие слитые конструкции, включающие гетерологичные полипептиды с требуемыми свойствами, например константный участок иммуноглобулина для продления периода полужизни в крови или антитело или его фрагмент для обеспечения направленности действия. В других системах конъюгации получают гибридные полипептиды, где требуется отщепить от нужного полипептида конъюгированный с ним другой полипептид. В одном из вариантов осуществления полипептид, подлежащий удалению, соединён с рекомбинантным специфическим связывающим агентом полипептидной последовательностью, содержащей специфический участок, распознаваемый протеазой. Примерами подходящих последовательностей могут служить последовательности, распознаваемые протеазой вируса табачной мозаики (Ь1Ге Тесйпо1од1е8, СаййегаЬигд, ΜΌ) или фактором Ха (Νονν Епд1апб Вю1аЬ§, Веуег1еу, МА).

Согласно настоящему изобретению предложены также слитые белки, содержащие вариабельный домен антитела к Аид-2 или его фрагмент, например вариабельный участок тяжёлой цепи с аминокислотной последовательностью, описанной здесь, или вариабельный участок лёгкой цепи с аминокислотной последовательностью, описанной здесь, в сочетании с усечённым тканевым фактором (!ТР - !гииса1еб Й88ие Гас1ог), агент сосудистой направленности, представляющий собой усечённую форму человеческого белка-индуктора коагуляции, действующего как опухолевый агент, вызывающий коагуляцию крови в сосудах. Конъюгация !ТР с антителами к Апд-2 или их фрагментами может облегчить доставку специфического связывающего агента к клеткам-мишеням.

- 13 011866

Варианты специфических связывающих агентов.

Варианты специфических связывающих агентов, соответствующих настоящему изобретению, представляют собой варианты с вставками, делециями и/или заменами. В одном из аспектов настоящего изобретения предложены варианты со вставками, где один или несколько аминокислотных остатков дополняют аминокислотную последовательность специфического связывающего агента. Вставки могут быть расположены как на одном из концов белка или на обоих сразу, так и во внутренних областях аминокислотной последовательности специфического связывающего агента. Варианты со вставками дополнительных аминокислотных остатков на одном из концов белка или на обоих сразу могут представлять собой, например, конъюгированные белки либо белки, содержащие аминокислотные хвосты или метки. Варианты со вставками включают в себя и полипептиды специфических связывающих агентов, где к аминокислотной последовательности специфического связывающего агента или его фрагмента добавлены один или несколько аминокислотных остатков.

Вариантами продуктов, соответствующих настоящему изобретению, также являются зрелые продукты на основе специфических связывающих агентов. У таких продуктов удалена лидерная или сигнальная последовательности, однако конечный продукт всё же содержит дополнительные аминокислотные остатки на Ν-конце по сравнению с полипепидом Аид-2 дикого типа. Дополнительные Ν-концевые остатки могут происходить из другого белка либо могут представлять собой один или несколько аминокислотных остатков, которые не могут быть идентифицированы как производные ни одного из известных белков. Также изобретением предложены продукты на основе специфических связывающих агентов, несущие дополнительный остаток метионина в положении -1 (Мет-1-специфический связывающий агент), а также продукты на основе специфических связывающих агентов с дополнительными остатками метионина и лизина в положениях -2 и -1 (Мет-2-Лиз-1-специфический связывающий агент). Варианты специфических связывающих агентов, несущих дополнительные остатки Мет, Мет-Лиз, Лиз (либо один или несколько основных остатков вообще), полезны, в частности, для повышения выработки рекомбинантого белка в бактериальных клетках-хозяевах.

Настоящим изобретением охватываются также варианты специфических связывающих агентов с дополнительными аминокислотными остатками, добавленными в результате использования особых систем экспрессии. Например, при использовании имеющихся в продаже векторов, которые экспрессируют нужный белок в виде конъюгата с глутатион-8-трансферазой (С8Т - д1и1а11иопс-8-1гап5Гсга5С). получается требуемый полипептид с дополнительным остатком глицина в положении -1 после отщепления С8Т от конечного продукта. Также предложены варианты, являющиеся результатом экспрессии в других векторных системах, в том числе с полигистидиновым хвостом, включённым в аминокислотную последовательность, обычно на С- или Ν-конце последовательности.

Варианты со вставками подразумевают и слитые белки, описанные выше, в которых Ν- и/или С-конец полипептидной последовательности специфического связывающего агента конъюгирован с другим полипептидом, его фрагментом или последовательностями, которые не могут быть идентифицированы как часть последовательности какого-либо известного белка.

В другом аспекте настоящего изобретения предложены варианты с делециями, в которых один или более аминокислотных остатков удалены из аминокислотной последовательности специфического связывающего агента. Делеции могут быть осуществлены на одном или на обоих концах аминокислотной последовательности полипептида специфического связывающего агент, либо при удалении одного или нескольких аминокислотных остатков внутри аминокислотной последовательности специфического связывающего агента. Варианты с делециями необходимым образом включают все фрагменты аминокислотной последовательности специфического связывающего агента.

Фрагменты антител включают такие части молекулы антитела, которые связываются с эпитопом или полипептидным антигеном. Примерами таких фрагментов могут служить РаЬ или Р(аЬ')₂, полученные, например, при ферментативном или химическом расщеплении полной молекулы антитела. Другими связывающими фрагментами являются, например, те, что получены рекомбинантным способом, таким как экспрессия рекомбинантных плазмид, содержащих нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельные области антител.

Настоящее изобретение охватывает также полипептидные фрагменты агента, связывающего Апд-2, которые сохраняют свойство специфически связывать полипептид Апд-2. При этом подразумеваются фрагменты, содержащие по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более последовательно расположенных аминокислот пептида или полипептида, соответствующего настоящему изобретению. Предпочтительные полипептидные фрагменты проявляют исключительные или специфические иммунологические свойства, характерные для антигенсвязывающего агента, соответствующего настоящему изобретению. Фрагменты, соответствующие настоящему изобретению, обладающие нужными иммунологическими свойствами, могут быть получены любым из способов, хорошо известных и широко применяемых в данной области техники.

Ещё в одном аспекте изобретения предложены варианты специфических связывающих агентов, соответствующих настоящему изобретению, с заменами.

- 14 011866

Варианты с заменами обыкновенно рассматриваются как сходные с исходным полипептидом или как имеющие определённый процент идентичности с исходным полипептидом и включают полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков были удалены и замещены другими остатками. В одном аспекте природные замены являются консервативными, однако настоящее изобретение охватывает и неконсервативные замены.

Идентичность или сходство соответствующих полипептидов могут быть рассчитаны известными способами. В качестве неограничивающего примера некоторые из таких способов описаны в книгах: Сотри!айопа1 Мо1еси1аг Вю1оду, Ьекк, А.М., еб., ОхГогб Ишуегкйу Ргекк, №\ν Уогк (1988); Вюсотри!тд: 1п!огтайск апб Сепоте Рго)ес18. 8тйй, Ό.ν., еб., Асабетк Ргекк, №\ν Уогк (1993); Сотри!ег Апа1ук1к оГ 8ес.|иепсе Оа!а, Рай 1, СпГйп, А.М., апб СггГйп, Н.С., ебк., Нитапа Ргекк, №\ν 1егкеу (1994); 8ес.|иепсе Апа1ук1к ίπ Мо1еси1аг Вю1оду, уоп Неще, С., Асабетю Ргекк (1987); 8ес.|иепсе Апа1ук1к Рптег, СпЬккоу, М. апб Оеуегеих, к, ебк., М. 81оскЮп Ргекк, №\ν Уогк (1991) и СагШо е! а1., 81ЛМ! Аррйеб Ма1й., 48: 1073 (1988).

Предпочтительные способы определения соответствия или процента идентичности двух полипептидов разработаны так, что обеспечивают возможно более широкое сличение исследуемых последовательностей. Способы определения идентичности представлены в общедоступных компьютерных программах. Предпочтительные компьютерные программы определения идентичности между двумя последовательностями включают, без ограничения, программный пакет ССС, содержащий САР (Эеуегеих е! а1., Ыис1. Ас1б. Яек., 12: 387 (1984); Сепейск Сотри!ег Сгоир, Итуегкйу оГ V^ксоπк^π, Маб1коп, VI, ВЙА8ТР, ВЬА8ТЫ, апб РА8ТА (А1!ксйи1 е! а1. I. Мо1. Вю1., 215: 403-410 (1990)). Программа ВЙА8ТХ общедоступна в Национальном центре биотехнологической информации (Ыайопа1 Сеп!ег Гог Вю!есйпо1оду 1пГогтайоп (ЫСВ1)) и других источниках (ВЙА8Т Мапиа1, А1!ксйи1 е! а1. ЫСВ/Ж-М/МН ВеШекба, МО 20894; А1!ксйи1 е! а1., кирга (1990)). Широко известный алгоритм Смита-Ватермана также может использоваться для определения идентичности.

Некоторые схемы выравнивания двух аминокислотных последовательностей могут приводить к сличению лишь короткой области обеих последовательностей, и в такой малой выравненной области может выявляться очень высокая степень тождественности, даже если не существует значительного родства между двумя полными последовательностями. Соответственно, в некоторых осуществлениях выбранный способ выравнивания (программа САР) приведёт к выравниванию, которое охватывает по меньшей мере 10% полной длины полипептида, подлежащего сравнению, т.е. по меньшей мере 40 сопряжённых аминокислотных остатков, если сравниваются последовательности длиной по меньшей мере в 400 аминокислот, 30 сопряжённых аминокислотных остатков, если сравниваются последовательности длиной по меньшей мере от 300 до приблизительно 400 аминокислот; по меньшей мере 20 сопряжённых аминокислотных остатков, если сравниваются последовательности длиной от 200 до приблизительно 300 аминокислот, и по меньшей мере 10 сопряжённых аминокислотных остатков, если сравниваются последовательности длиной приблизительно от 100 до 200 аминокислот.

Например, при использовании компьютерного алгоритма САР (Сепейск Сотри!ег Сгоир, ИтуегкИу оГ V^ксоπк^π, Маб1коп, VI) два полипептида, для которых нужно определить процент идентичности последовательности, выравниваются по наибольшему совпадению соответствующих аминокислот (участки соответствия). В некоторых вариантах осуществления в сочетании с названным применяются алгоритмы начисления штрафа за наличие пропуска (обычно рассчитываемого как 3Х средняя диагональ; средняя диагональ - это среднее диагонали используемой матрицы сравнения; диагональ - это доля или количество, определённые для каждого точного совпадения аминокислот частной матрицей сравнения), штрафа за ширину пропуска (составляющего обычно 1/10 от количества баллов за наличие пропуска), а также матрицы сравнения, такие как РАМ 250 или ВЬО8ИМ 62. В некоторых воплощениях в этом алгоритме используется и стандартная матрица сравнения (см. ОауйоГГ е! а1., А!1ак оГ Рго!ет 8ес.|иепсе апб 81гис!иге, 5(3), (1978) - для матрицы сравнения РАМ 250; Неп1коГГ е! а1., Ргос. ЫаН. Асаб. 8ск США, 89: 10915-10919 (1992) - для матрицы сравнения ВЬО8ИМ 62).

В некоторых воплощениях параметры сравнения полипептидных последовательностей включают следующее:

алгоритм: Ыееб1етап е! а1., I. Мо1. Вю1., 48: 443-453 (1970);

матрица сравнения: ВЬО8ИМ 62, из НешкоГГ е! а1., см. выше (1992); штраф за наличие пропуска: 12;

штраф за ширину пропуска: 4;

порог сходства: 0.

Программа САР может быть пригодной при использовании вышеприведённых параметров. В некоторых воплощениях вышеуказанные параметры являются параметрами по умолчанию для сравнения полипептидов (без штрафов за пропуски на концах) при помощи алгоритма САР.

- 15 011866

В некоторых воплощениях параметры сравнения последовательностей молекул полинуклеотидов включают следующее:

алгоритм: №ей1етап е! а1., 1. Мо1. Вю1., 48: 443-453 (1970);

матрица сравнения: совпадения = +10, несовпадение = 0;

штраф за наличие пропуска: 50;

штраф за ширину пропуска: 3.

Программа САР может быть также пригодной и при использовании других параметров. Вышеприведённые параметры являются параметрами по умолчанию для сравнения полинуклеотидных молекул.

Могут применяться и другие стандартные алгоритмы, такие как штрафы за наличие пропуска, штрафы за ширину пропуска, матрицы сравнения, порог сходства и т. п., в том числе изложенные в руководстве Ргодгат Мапиа1, ХУЕсогМп Раскаде, УегЦоп 9, 8ер!етЬег, 1997. Выбор той или иной программы не представит затруднений для специалистов в области техники и будет зависеть от особенностей задач сравнения, т.е. сравнивается ли ДНК с ДНК, белок с белком, белок с ДНК; а также от того, сравниваются ли пары последовательностей (в этом случае обыкновенно предпочитают САР или ВейРй) или же отдельная последовательность с целой базой данных о последовательностях (в этом случае предпочтительны РА8ТА или ВЬА8ТА).

При использовании здесь 20 обычных аминокислот и их общепринятые сокращения применяются, как обычно (см. 1ттипо1оду - А 8уп!йе518. - 2'¹ Еййюп, Е.8. Со1иЬ апй Ό.Κ. Сгеп, Ей§., 8таиег А88ос1а!е8, 8ипйег1апй, Ма§8. 10 (1991)), издание включено сюда путем ссылки для любой цели.

Аминокислоты могут быть представлены в стереоконфигурации Ь или Ό (за исключением глицина, который не имеет Ь- и Ό-изомеров), и полипептиды, а также их сочетания, соответствующие настоящему изобретению, могут представлять собой сочетания стереоизомеров. Однако Ь-изомеры являются предпочтительными. Изобретением предусматриваются также реверсивные молекулы, у которых последовательность аминокислот от Ν- до С-конца обращена. Например, по отношению к молекуле с обычной последовательностью Х1-Х₂-Х₃ реверсивной является молекула Х₃-Х₂-Х_Р Предусмотрены настоящим изобретением и ретрореверсивные молекулы, в которых последовательность аминокислот обращена, как значится выше, и аминокислотные остатки, которые обычно являются Ь-энантиомерами, заменены Ό-стереоизомерами.

Приемлемыми составляющими полипептидов, соответствующих настоящему изобретению, могут являться также стереоизомеры (например, Ό-аминокислоты) всех 20 обычных аминокислот, неприродные аминокислоты, такие как α-, α-двузамещённые аминокислоты, Ν-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие нестандартные аминокислоты. Примеры нестандартных аминокислот включают, без ограничения, аминоадипиновую кислоту, бета-аланин, бета-аминопропионовую кислоту, аминомасляную кислоту, пиперидиновую кислоту, аминокаприловую кислоту, аминогептановую кислоту, аминоизомасляную кислоту, аминопимелиновую кислоту, диаминомасляную кислоту, десмозин, диаминопимелиновую кислоту, диаминопропионовую кислоту, Ν-этилглицин, Ν-этиласпарагин, оксилизин, аллооксилизин, оксипролин, изодесмозин, аллоизолейцин, Ν-метилглицин, саркозин, Ν-метилизолейцин, Ν-метилвалин, норвалин, норлейцин, орнитин, 4-оксипролин, гамма-карбоксиглутамат, ε-Ν,Ν,Νтриметиллизин, ε-Ν-ацетиллизин, О-фосфосерин, Ν-ацетилсерин, Ν-формилметионин, 3-метилгистидин, σ-Ν-метиларгинин и прочие подобные аминокислоты и аминокислоты (например, 4-оксипролин).

Сходным образом, если не указано иначе, левый конец однонитевой полинуклеотидной последовательности представляет собой 5'-конец; направление влево на двунитевой полинуклеотидной последовательности представляет собой направление в сторону 5'-конца. Направление 5'-3' при удлинении нативной РНК при транскрипции называется здесь направлением транскрипции; последовательности областей ДНК, совпадающие с последовательностью РНК, у которых 5'-конец совпадает с 5'-концом транскрибируемой РНК, называется последовательностями, расположенными выше, последовательности же областей ДНК, совпадающие с РНК, в которых З'-конец совпадает с З'-концом транскрибированной РНК, называем последовательностями, расположенными ниже.

Среди консервативных аминокислотных замен могут иметь место не встречающиеся в природе аминокислотные остатки, которые характерны для пептидов, синтезированных химически, в отличие от пептидов, синтезируемых в биологических системах. Среди них пептидомиметики и другие реверсивные или инверсивные формы аминокислотных остатков.

Встречающиеся в природе аминокислотные остатки можно разделить на классы по химическим свойствам 20 боковых цепей:

1) гидрофобные: Мет, Ала, Вал, Лей, Иле;

2) нейтральные гидрофильные: Цис, Сер, Тре, Асн, Глн;

3) кислые: Асп, Глу;

4) основные: Гис, Лиз, Арг;

5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: Гли, Про; и

6) ароматические: Три, Тир, Фен.

- 16 011866

При неконсервативных заменах может, например, иметь место замещение члена одного из этих классов на член другого класса. Такие аминокислотные замены можно осуществить в участках человеческих антител, гомологичных участкам антител иного происхождения, либо в негомологичных областях молекулы.

При осуществлении таких замен, в соответствии с некоторыми вариантами их осуществления, может быть оценен гидропатический показатель аминокислот. Каждой аминокислоте присвоен гидропатический показатель на основе характеристик гидрофобности и заряда. Эти показатели таковы: Иле (+4.5); Вал (+4.2); Лей (+3.8); Фен (+2.8); Цис/цистин (+2.5); Мет (+1.9); Ала (+1.8); Гли (-0.4); Тре (-0.7); Сер (-0.8); Трп (-0.9); Тир (-1.3); Про (-1.6); Гис (-3.2); Глу (-3.5); Глн (-3.5); Асп (-3.5); Асн (-3.5); Лиз (-3.9); Арг (-4.5).

Важность гидропатического показателя аминокислот для придания белку интерактивной биологической функции хорошо понятна в данной области техники (Ку Зе е! а1., 1. Мо1. Бю1., 157: 105-131 (1982)). Известно, что некоторые аминокислоты могут быть заменены другими аминокислотами с близким гидропатическим показателем, и при этом будет сохраняться сходная биологическая активность. В некоторых воплощениях при внесении изменений на основе гидропатического показателя осуществляют замены аминокислот, гидропатические показатели которых находятся в пределах ±2, в некоторых воплощениях они находятся в пределах ±1 и в некоторых воплощениях они находятся в пределах ±0,5.

Понятно в данной области техники и то, что замена аминокислот может осуществляться на основании их гидрофобности, в частности, тогда, когда создаваемый при этом биологически функциональный белок или пептид предназначен для применения в воплощениях, относящихся к иммунологии, как в данном случае. В некоторых воплощениях наибольшая локальная средняя гидрофильность белка, определяющаяся гидрофильностью смежных аминокислот, коррелирует с иммуногенностью и антигенностью, т.е. с биологическими свойствами данного белка.

Аминокислотным остаткам присвоены следующие значения гидрофильности: Арг (+3.0); Лиз (+3.0); Асп (+3.0±1); Глу (+3.0±1); Сер (+0.3); Асн (+0.2); Глн (+0.2); Гли (0); Тре (-0.4); Про (-0.5±1); Ала (-0.5); Гис (-0.5); Цис (-1.0); Мет (-1.3); Вал (-1.5); Лей (-1.8); Иле (-1.8); Тир (-2.3); Фен (-2.5); Трп (-3.4). В некоторых воплощениях при внесении изменений на основе близких величин гидрофильности осуществляют замены аминокислот, гидропатические показатели которых находятся в пределах ±2, в некоторых воплощениях они находятся в пределах ±1 и в некоторых воплощениях они находятся в пределах ±0,5. На основе гидрофобности можно также выявить эпитопы в первичной аминокислотной последовательности. Эти участки также обозначаются как участки сердцевины эпитопа.

Примеры замен аминокислот приведены в табл. 1.

Таблица 1

Аминокислотные замены

Исходные аминокислотные остатки	Примеры замен	Предпочтительные замены
Ала	Вал, Лей, Иле	Вал
Арг	Лиз, Глн, Асн	Лиз
Асн	Глн, Глу, Асп	Гли
Асп	Глу, Глн, Асн	Глу
Цис	Сер, Ала	Сер
Глн	Асн, Глу, Асп	Асн
Глу	Асп, Асн, Гли	Асп
Гли	Про, Ала	Ала
Гис	Асн, Глн, Лиз, Арг	Арг
Иле	Лей, Вал, Мет, Ала, Фен, Норлейцин	Лей

Лей

Норлейцин, Иле, Вал, Мет, Ала, Фен

Иле

- 17 011866

Лиз	Арг, 1,4-диаминомасляная кислота, Глн, Асн	Арг
Мет	Лей, Фен, Иле	Лей
Фен	Лей, Вал, Иле, Ала, Тир	Лей
Про	Ала	Г ли
Сер	Тре, Ала, Цис	Тре
Тре	Сер	Сер
Три	Тир, Фен	Тир
Тир	Три, Фен, Тре, Сер	Фен
Вал	Иле, Мет, Лей, Фен, Ала, норлейцин	Лей

Специалист в данной области способен определить приемлемые варианты полипептида в соответствии с приведёнными здесь описаниями и хорошо известными методиками. В некоторых воплощениях специалист может выявить подходящие области белковой молекулы, которые можно изменить, не нарушая активности, нацеливая изменения на участки, которые предположительно не влияют на активность. В некоторых воплощениях можно определить остатки и области молекулы, которые являются консервативными среди родственных полипептидов. В некоторых воплощениях даже те области, которые могут быть важны для биологической активности или структуры, могут быть подвергнуты консервативным аминокислотным заменам без нарушения биологической активности или без неблагоприятного влияния на структуру полипептида.

Кроме того, специалист в данной области может просмотреть структурно-функциональные исследования, где выявляются остатки в сходных полипептидах, которые являются важными для активности или структуры. На основании такого сравнения можно предсказать важность тех аминокислотных остатков в белке, которые соответствуют аминокислотным остаткам, важным для активности или структуры сходных белков. Специалист может сделать выбор в пользу химически сходных аминокислотных замен для аминокислотных остатков, предсказанных, таким образом, как важные.

Специалист в данной области может также проанализировать трёхмерную структуру и аминокислотную последовательность в сравнении с такой же структурой сходных полипептидов. На основании полученных сведений специалист может предсказать расположение аминокислотных остатков в молекуле антител в соответствии с её трёхмерной структурой. В ряде случаев специалист может отказаться от радикальных изменений аминокислотных остатков, для которых предсказано, что они расположены на поверхности белка, поскольку такие остатки могут участвовать в важных взаимодействиях с другими молекулами. Кроме того, специалист может разработать тестовые варианты, содержащие по одной аминокислотной замене на каждый из желательных аминокислотных остатков. Далее варианты могут быть подвергнуты скринингу при помощи тестов на активность, известных специалистам. Такие варианты можно использовать для сбора сведений о приемлемых вариантах. Например, если обнаружено, что та или иная аминокислотная замена приводит к нарушению, нежелательному уменьшению активности или к неприемлемой активности, далее можно избегать вариантов с такой заменой. Иными словами, на основании сведений, полученных в результате таких рутинных экспериментов, специалист может успешно выявить аминокислотные остатки, которые не следует заменять, сами ли по себе или в сочетании с другими мутациями.

Предсказанию вторичной структуры посвящено множество научных публикаций (см. Мои1! I., Сигг. Ор. ίη В1о!есЬ., 7(4): 422-427 (1996), С1ои е! а1., ВюсЬетк!гу, 13(2): 222-245 (1974); С1ои е! а1., ВюсЬетк!гу, 113(2): 211-222 (1974); С1ои е! а1., Αάν. Епгуто1. Ке1а!. Агеак Мо1. Вю1. 47: 45-148 (1978); С1ои е! а1., Αηη. Вет. Вюскет., 47: 251-276 и Ской е! а1., Вюркук. 1, 26: 367-384 (1979)).

Кроме того, в настоящее время доступны компьютерные программы, помогающие в предсказании вторичной структуры. Один из способов предсказания вторичной структуры основан на гомологическом моделировании. Например, два полипептида или белка, которые имеют идентичность аминокислотных последовательностей более 30% или сходство более 40%, часто имеют сходную структурную топологию. В последнее время рост базы данных о структурах белков способствует лучшему предсказанию вторичной структуры, в ряде случаев включая возможность предсказания третичной структуры полипептида или белка (см. Но1т е! а1., №с1. Ас1б. Век., 27(1): 244-247 (1999)). Высказано мнение (Вгеппег е! а1., Сигг. Ор. 81гис1. В1о1., 7(3): 369-376 (1997)), что существует ограниченное количество вариантов укладки данного полипептида или белка и что после того, как будет установлено некоторое пороговое количество структур, структурные предсказания станут значительно точнее.

- 18 011866

Дополнительные способы предсказания вторичной структуры включают протягивание (Йопек, Э., Сигг. Ορίπ. 8!гис!. Вю1., 7(3): 377-87 (1997); 81рр1 е! а1., 81гис!иге, 4(1): 15-19 (1996)), профильный анализ (Во\\зе е! а1., 8аепсе, 253: 164-170 (1991); СйЬккоу е! а1., Ме111. Епхут., 183: 146-159 (1990); СйЬккоу е! а1., Ргос. ΝηΙ. Асай. 8сЕ, 84(13): 4355-4358 (1987)) и эволюционное сцепление (Но1т, см. выше (1999), и Вгеппег, см. выше (1997)).

В некоторых воплощениях варианты антител включают гликозилированные варианты, в которых число и/или тип участков гликозилирования изменены по сравнению с аминокислотной последовательностью исходного полипептида. В некоторых случаях варианты белков содержат большее или меньшее количество участков Ν-гликозилирования, чем нативный белок. Для участка Ν-гликозилирования характерна последовательность Асн-Х-Сер или Асн-Х-Тре, где аминокислотный остаток, обозначенный как X, может быть любым, кроме пролина. Замена аминокислотных остатков для создания такой последовательности приводит к образованию нового потенциального сайта для добавления Ν-связанной углеводной цепи. Напротив, замены, которые удаляют такую последовательность, приводят к удалению существующей Ν-связанной углеводной цепи. Предусматривается и перестановка Ν-связанных углеводных цепей, при которой один или несколько сайтов Ν-гликозилирования (обычно существующих в природе) удаляются и создаётся один или несколько новых участков Ν-гликозилирования. Другие предпочтительные антитела включают цистеиновые варианты, в которых один или несколько остатков цистеина удалены либо заменены другими аминокислотами (например, серином), по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью. Цистеиновые варианты могут быть полезны, когда необходимо изменить конформацию антител с получением биологически активной конформации, например после удаления нерастворимых молекул включения. Обыкновенно цистеиновые варианты содержат меньше остатков цистеина, нежели исходный белок, и обычно чётное их число для сведения к минимуму взаимодействий, обусловленных неспаренными остатками цистеина.

В некоторых воплощениях аминокислотные замены представляют собой такие, которые:

(1) уменьшают подверженность протеолизу;

(2) уменьшают подверженность окислению;

(3) изменяют сродство связывания для формирования белковых комплексов;

(4) изменяют сродство в отношении связывания различных молекул и/или (5) видоизменяют другие свойства таких полипептидов или придают им новые.

В ряде случаев одиночные или множественные аминокислотные замены (в частности, консервативные аминокислотные замены) могут быть сделаны в аминокислотной последовательности, встречающейся в природе (в частности, в той части полипептида, которая расположена вне доменов, участвующих в межмолекулярных контактах).

В некоторых случаях консервативные аминокислотные замены обычно не могут существенно изменять структурные характеристики исходной последовательности (например, замена аминокислоты не должна способствовать разрушению спирали, имеющейся в исходной молекуле, или нарушению других типов вторичной структуры, характерных для исходной последовательности). Примеры известных в области техники вторичной и третичной структур полипептидов описаны в кн.: Рго!е1п8, 81гис!игек апй Мо1еси1аг Рппар1ек (Сге1дй!оп, Ей., XV.Н. Ргеетап апй Сотрапу, №\ν Υо^к (1984)); 1п1гойис!юп !о Рго!ет 81гис!иге (С. Вгапйеп апй ί. Тоохе, ейк. 6аг1апй РиЬНкЫпд, №\ν Υо^к, Ν.Υ. (1991)) и в статье ТйогпЮп е! а!. №11иге 354: 105 (1991).

В молекулах специфических связывающих агентов, соответствующих настоящему изобретению, которые являются вариантами полипептидов или пептидов с заменами, приблизительно до 10-12% исходной аминокислотной последовательности может быть заменено. В вариантах антител тяжёлая цепь может содержать 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замещённую аминокислоту, тогда как лёгкая цепь может содержать 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замещённую аминокислоту.

Производные специфических связывающих агентов.

Согласно изобретению также предложены производные полипептидных молекул специфических связывающих агентов. Производные включают полипептиды специфических связывающих агентов, несущие иные модификации, нежели вставки, делеции или замены аминокислотных остатков. Предпочтительно модификации являются ковалентными по своей природе и включают, например, химическую связь с полимерами, липидами и другими органическими и неорганическими молекулами. Производные, соответствующие настоящему изобретению, могут быть получены для повышения периода полужизни специфического связывающего агента в кровяном русле или же могут иметь цель - улучшение направленности действия полипептида в отношении тех или иных клеток, тканей или органов.

Кроме того, настоящее изобретение охватывает производные связывающих агентов, ковалентно модифицированных включением одной или нескольких водорастворимых группировок, таких как полиэтиленгликоль, полиоксиэтиленгликоль или полипропиленгликоль, как описано в патентах υδ № 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192 и 4179337. Другие подходящие полимеры, известные специалистам, включают монометоксиполиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу или другие полимеры на

- 19 011866 основе углеводов, поли(№-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, кополимер окиси пропилена и окиси этилена, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин) и поливиниловый спирт, а также смеси названных полимеров. Особо предпочтительны производные специфического связывающего агента, ковалентно модифицированные субъединицами полиэтиленгликоля (ПЭГ). Водорастворимые полимеры могут быть прикреплены в особых положениях, например на Ν-конце специфического связывающего агента, либо случайным образом связаны с одним или несколькими боковыми радикалами полипептида. Применение ПЭГ для улучшения терапевтических свойств специфического связывающего агента, в частности гуманизированных антител, описано в патенте И8 6133429 (Сопха1е5 е! а1.), выданного 17.10.2000.

Сайты-мишени для мутагенеза антител.

Для манипулирования специфическими свойствами антител к Апд-2, такими как сродство антител к их мишени, могут применяться различные стратегии. Эти стратегии включают сайтспецифический или случайный мутагенез полинуклеотидной молекулы, кодирующей антитело, для создания вариантов антител с последующим скринингом для выявления вариантов антител, проявляющих изменение свойств в нужную сторону, например повышение или снижение сродства.

Аминокислотные остатки, на которые чаще всего направлены стратегии мутагенеза, представляют собой остатки внутри СОЯ. Как описано выше, в этих областях содержатся остатки, которые непосредственным образом взаимодействуют с Апд-2, и другие аминокислотные остатки, влияющие на пространственное расположение первых. Тем не менее, было показано, что аминокислотные остатки каркасных участков вариабельных доменов за СОЯ также вносят значительный вклад в антигенсвязывающие свойства антител и на них также могут быть нацелены действия по манипуляции этими свойствами (см. Нийкоп, Сигг. Орт. Вю!есй., 9: 395-402 (1999) и ссылки в этой статье).

Меньшие по объёму и библиотеки вариантов антител, которые можно более эффективно подвергать скринингу, можно получить путём сосредоточения случайного или сайтнаправленного мутагенеза в СОЯ, соответствующих областям, подверженным гипермутациям в процессе соматического созревания сродства антител (см. С.’1ю\\'й11игу апй Рак1ап, №а!иге Вю!есй., 17: 568-572 (1999) и ссылки в этой статье). Различные типы элементов ДНК, о которых известно, что они определяют такие участки гипермутаций, включают такие, как обращенные повторы, некоторые консенсусные последовательности, вторичные структуры и палиндромы. Консенсусные последовательности ДНК включают, в частности, четырёхнуклеотидные последовательности пурин-Г-пиримидин-А/Т (т.е А или Г-Г-Ц или Т-А или Т) или сериновый кодон АГУ (где Υ может представлять собой Ц или Т).

Таким образом, одно из воплощений настоящего изобретения включает мутагенные стратегии с целью повышения сродства антител к их мишени. Эти стратегии состоят, в частности, в мутагенезе всей вариабельной области тяжёлой и лёгкой цепей, мутагенезе только внутри СОЯ, мутагенезе в консенсусных участках гипермутаций в составе участков, определяющих комплементарность; мутагенезе в несущих областях или в любом сочетании этих подходов (мутагенез в этом контексте может быть случайным или сайтспецифическим).

Окончательное разграничение СОЯ и выявление аминокислотных остатков, составляющих участок связывания антител, могут быть выполнены посредством определения структуры такой молекулы антител и комплекса антиген-антитело способами, известными специалистам, такими как рентгеновская кристаллография. Различные методы, основанные на анализе и характеризации такой кристаллической структуры антитела, известны специалистам и могут применяться, не являясь, однако, окончательными для приблизительного выявления СОЯ. Примерами таких широко применяемых методов являются, в частности, методы КаЬа!, С1о1Ыа, АЬМ и определение контактов.

Методика определения КаЬа! основана на изменчивости последовательности и является наиболее широко применяемой методикой предсказания участков СОЯ (.Тойпкоп, ^и, №ис1ею Ас1йк Яек, 28: 214-8 (2000)). Способ С1о11иа основан на выявлении расположения областей структурных петель (С1ю11иа е! а1., 1. Мо1. Вю1., 196: 901-17 (1986); С1ю11иа е! а1., №а!иге, 342: 877-83 (1989)). Способ АЬМ является компромиссным между способами Кабат и Клотии. Этот способ интегрирован в программы моделирования структуры антител, выпускаемые Оксфордской молекулярной группой (ОхГогй Мо1еси1аг Огоир (МаПш е! а1., Ргос. №а!1. Асай. 8сг (США), 86: 9268-9272 (1989))); Яеек е! а1., АВМ™, а сошри!ег ргодгат Гог тойе1тд νа^^аЬ1е гедюпк оГ апйЬой1е8, ОхГогй, Великобритания; ОхГогй Мо1еси1аг, Ь!й.). Комплект АЬМ моделирует третичную структуру антител, исходя из первичной последовательности, при помощи сочетания баз данных и методов аЬ шйю. Недавно был создан ещё один способ, известный как определение контактов (МасСа11иш е! а1., 1. Мо1. Вю1., 5: 732-45 (1996)). Этот способ основан на анализе доступных кристаллических структур комплексов.

0ΌΒ тяжёлых цепей условно обозначены как Н1, Н2 и Н3, будучи пронумерованными последовательно от Ν-конца к С-концу. Аналогичные области лёгких цепей условно обозначены как Ь1, Ь2 и Ь3, будучи пронумерованными последовательно от Ν-конца к С-концу.

СОЯ-Н1 имеет длину от 10 до 12 аминокислотных остатков и обыкновенно начинается через 4 остатка после Цис согласно определению способами С1о11иа и АЬМ или обычно через 5 остатков после Цис согласно определению способом КаЬа!. После Н1 обычно следует Трп, чаще всего Трп-Вал, но также и

- 20 011866

Трп-Иле и Трп-Ала. Длина Н1 составляет около 10-12 остатков в соответствии с определением по способу АЬМ, тогда как определение по способу С1о!Ыа исключает последние 4 остатка.

СЭЯ-Н2 обычно начинается на расстоянии 15 аминокислотных остатков от конца Н1 согласно определению по способам КаЬа! и АЬМ. Предшествует Н2 обыкновенно последовательность Лей-Глу-Трп-Иле-Гли, но существует и множество вариаций. После Н2 обычно следует последовательность Лиз/Арг-Лей/Иле/Вал1/Фен/Тре/Ала-Тре/Сер/Иле/Ала. При определении длины Н2 способом КаЬа1 она составляет от 16 до 19 аминокислотных остатков, тогда как способ АЬМ обычно предсказывает длину в 9-12 остатков.

СЭЯ-Н3 начинается обычно на расстоянии 33 аминокислотных остатков от Н2, и ей обыкновенно предшествует аминокислотная последовательность Цис-Ала-Арг. После НЗ обычно следует Гли. Длина Н3 может составлять от 3 до 25 остатков.

СЭЯ-Я1 обычно начинается примерно на расстоянии 24 остатков и обычно следует за Цис. Аминокислотный остаток, следующий за Ь1, всегда является Трп и обычно начинает последовательность Трп-Тир-Глн, Трп-Лей-Глн, Трп-Фен-Глн или Трп-Тир-Лей. Длина Ь1 приблизительно 10-17 аминокислотных остатков. Штрафной СЭЯ-Я1 для антител, соответствующих настоящему изобретению, в точности следует этому правилу, и за Цис следуют 15 аминокислотных остатков и далее Трп-Тир-Глн.

СЭЯ-Я2 начинается примерно на расстоянии 16 остатков после конца Ь1. За ней обычно следуют Иле-Тир, Вал-Тир, Иле-Лиз или Иле-Фен. Длина этой области около 7 остатков.

СЭЯ-Я3 обычно начинается на расстоянии 33 аминокислотных остатков после конца Ь2 и обычно следует за Цис. После Ь3 обычно следует последовательность Фен-Гли-ХХХ-Гли. Длина Ь3 составляет примерно 7-11 аминокислотных остатков.

Были описаны различные способы модифицирования антител. Так, патент И8 5530101 (Оиссп е! а1., от 25.06.1996) описывает способы получения гуманизированных антител, в которых каркас гуманизированного вариабельного участка тяжёлых цепей на 65-95% идентичен последовательности донорного каркаса вариабельных участков тяжёлых цепей. Каждая гуманизированная тяжёлая цепь иммуноглобулина обычно содержит, кроме СОЯ, аминокислоты донорного иммуноглобулинового каркаса, которые, например, способны взаимодействовать с СОЯ, влияя на сродство связывания; имеются в виду, например, одна или несколько аминокислот, непосредственно примыкающих к СОЯ в донорном иммуноглобулине, или аминокислоты, расположенные на расстоянии до 3 ангстрем от такой области в соответствии с предсказанием на основе молекулярного моделирования. И тяжёлые, и лёгкие цепи могут быть сконструированы с использованием одного или всех возможных позиционных критериев. Будучи скомбинированными с интактным антителом, гуманизированные области иммуноглобулинов в значительной степени неиммуногенны в человеческом организме и сохраняют практически то же сродство, что и донорный иммуноглобулин, к антигену, такому как белок или другое соединение, содержащее эпитоп (см. также соответствующие способы в патенте И8 5693761 (Оиссп е! а1., от 02.12.1997) Ро1ушс1еоббе8 епсобтд 1тртоуеб 1шташхеб 1ттипод1оЬи1ш8; патенте США № 5585089 (Оиееп е! а1., от 17.12.1996) Ниташхеб 1ттипод1оЬи1ш8).

В одном из примеров (патент И8 5565332 (НоодепЬоот е! а1. от 15.10.1996) Ртобисбоп о£ сЫтебс апбЬоб1е8 - а сотЬша!оба1 арргоасб) описаны способы получения антител и их фрагментов, которые обладают сходной специфичностью связывания с исходными антителами, но в которых увеличены человеческие характеристики. Гуманизированные антитела получают путём перетасовки цепей, используя, например, технологию фаговой экспрессии, и полипептид, содержащий вариабельные домены тяжёлой и лёгкой цепей нечеловеческих антител, специфичных к интересующему антигену, комбинируют с набором вариабельных доменов комплементарной (лёгкой или тяжёлой) человеческой цепи. Затем выявляют гибриды, специфичные к интересующему антигену, и человеческие цепи в составе отобранных гибридов комбинируют с набором человеческих комплементарных вариабельных доменов лёгкой или тяжёлой цепи. В другом воплощении компонент СОЯ из нечеловеческих антител комбинировали с набором компонентов СЭЯ человеческих антител. Из полученной при этом библиотеки полипептидных иммуноглобулиновых димеров отбирали гибриды и использовали их на второй стадии перетасовки цепей при гуманизации. В других случаях, если гибрид уже обладал достаточными человеческими характеристиками для терапевтического использования, вторую стадию опускали. Способы модификации антител для повышения их человеческих характеристик описаны и в других работах (см. ¥1п1ег. РЕВ8 Ьеб8, 430: 92-92 (1998)).

В качестве другого примера приводится патент И8 6054297 (Сабет е! а1., от 25.04.2000), который описывает способ получения гуманизированных антител путём замены аминокислотной последовательности СЭЯ аминокислотной последовательностью соответствующего человеческого СОЯ и/или замены аминокислотной последовательности каркасного участка соответствующей аминокислотной последовательностью человеческого каркасного участка.

В качестве еще одного примера приводится патент И8 5766886 (8!ибшска е! а1., от 16.06.98) Мобб йеб апбЬобу уапаЫе ботатк, описывающий способы выявления аминокислотных остатков в вариабельном домене антител, которые могут быть модифицированными без снижения нативного сродства антигенсвязывающего домена, но при этом со снижением иммуногенности таких антител в отношении

- 21 011866 гетерологичных видов, а также способы получения таких модифицированных вариабельных доменов антител, которые приемлемы для назначения введения видам (см. также патент И8 5869619 (8!ийшска е! а1.) от 09.02.1999).

Как уже обсуждалось, модификации антител любым из методов, известных в данной области техники, обыкновенно направлены на повышение сродства связывания с антигеном и/или снижение иммуногенности антител в организме-реципиенте. Так, при одном из подходов гуманизированные антитела модифицируют посредством удаления участков гликозилирования с целью повышения сродства антител к их основному антигену (Со е! а1., Мо1. 1ттипо1. 30: 1361-1367 (1993)). С помощью таких методик, как реструктурирование, гиперхимеризация и модификация поверхности/восстановление поверхности, получают гуманизированные антитела с повышенным терапевтическим потенциалом (Уаклуапи е! а1., Аппа1§ оГ А11егду, А8!йта&1ттипо1. 81: 105 (1998); Кодикка е! а1., Рго! Епдтеег, 9: 895-904 (1996); см. также патент США № 6072035 (Нагйтап е! а1.) от 06.06.2000, где описаны способы восстановления реструктурирования антител). Хотя такие методики снижают иммуногенность антител, сокращая число чужеродных аминокислотных остатков, они не предотвращают антиидиотипического и антиаллотипического иммунного ответа при повторном введении таких антител. В литературе описаны и альтернативы этим способам снижения иммуногенности (СИШапй е! а1., I. 1ттипо1. 62(6): 3663-71 (1999)).

Во многих случаях при гуманизации антител снижается антигенсвязывающая способность. Поэтому желательно бывает провести обратную мутацию в гуманизированных антителах посредством введения в них одного или нескольких аминокислотных остатков, наличествующих в исходных антителах (чаще всего, в антителах грызунов), для того, чтобы постараться восстановить исходное сродство таких антител (см., например, 8а1йап11а е! а1., Мо1. 1ттипо1. 36: 709-19 (1999)).

Непептидные аналоги специфических связывающих агентов/белковые миметики.

Также предложены непептидные аналоги специфических связывающих агентов, которые проявляют более стабильную структуру и пониженную биодеградацию. Аналоги, проявляющие свойства пептидных специфических связывающих агентов, могут быть получены посредством замены одного или нескольких аминокислотных остатков непептидными субъединицами. Предпочтительно непептидные субъединицы позволяют пептиду сохранить его природную конформацию или стабилизировать предпочтительную, например биоактивную, конформацию с сохранением способности распознавать и связывать Апд-2. В одном из аспектов получаемый при этом аналог/миметик проявляет повышенную аффинность связывания по отношению к Апд-2. Один из примеров способов получения непептидных миметических аналогов из пептидов специфических связывающих агентов описан Нахманом и др. (№1с1ипап е! а1., Кеди1. Рер!. 57: 359-370 (1995)). При желании, пептиды специфических связывающих агентов, соответствующих настоящему изобретению, могут быть модифицированы, например посредством гликозилирования, амидирования, карбоксилирования или фосфорилироания либо посредством превращения кислотных группировок в соли, амиды, сложные эфиры, в частности С-концевые сложные эфиры; а также образования Ν-ацилпроизводных пептидов, соответствующих настоящему изобретению. Пептиды специфических связывающих агентов могут также быть модифицированы путём получения пептидных производных посредством образования ковалентных или нековалентных комплексов с другими субъединицами. Ковалентно-связанные комплексы можно получить, присоединив химические группировки к функциональным группам или боковым радикалам аминокислот специфического связывающего агента либо к его Ν- или С-концам.

В частности, известно, что пептиды специфических связывающих агентов могут быть конъюгированы с репортерной группой, включающей, без ограничения, радиоактивную метку, флуоресцентную метку, фермент (например, катализирующий реакцию, поддающуюся флуориметрическому или колориметрическому анализу), субстратотвёрдый матрикс или носитель (например, авидин или биотин). Соответственно, согласно изобретению предложена молекула, включающая молекулу антитела и предпочтительно дополнительно содержащая репортёрную группу, выбранную из радиоактивной метки, флуоресцентной метки, фермента, субстрата, твёрдого матрикса или носителя. Такие метки хорошо известны специалистам, в частности особенно распространены биотиновые метки. Применение таких меток хорошо известно специалистам и описано, например, в патентах И8 3817837, 3850752, 3996345 и 4277437. Другие приемлемые метки включают, без ограничения, радиоактивные, флуоресцентные и хемолюминесцентные метки. Применение таких меток описано, например, в патентах И8 3817837, 3850752, 3939350 и 3996345. Любой из пептидов, соответствующих настоящему изобретению, может содержать одну, две или несколько любых из названных меток.

Способы получения специфических связывающих агентов.

Специфические связывающие агенты, соответствующие настоящему изобретению и являющиеся белками, могут быть получены путём химического синтеза в растворе или на твёрдом носителе в соответствии с общепринятыми способами. В настоящее время для твёрдофазного синтеза небольших пептидов часто может применяться химическое линирование с целью получения полипептидов полной длины. В продаже имеются различные автоматические синтезаторы, которые могут использоваться в соответствии с известными протоколами (см., например, 8!е^ай, Уоипд. 8о11й Рйаке Рерййе 8уп!йе515, 2пй ей., Р1егсе СНеииса! Со., (1984); Тагп е! а1., I. Ат. С’Нет. 8ос., 105: 6442, (1983); МетДеИ, 8аепсе, 232: 341

- 22 011866

347 (1986); Вагапу, МегпДе1б. Тйе Рерббек, Сгокк апб Ме1епйо£ег, ебк, Асабетк Ргекк, Νεν Уогк, 1-284; Вагапу е! а1., 1п!. Ί. Рерйбе Рго!ет Век., 30, 705-739 (1987) и патент И8 5424398), каждый из которых включен сюда путем ссылки.

В твердофазных способах синтеза пептидов применяют сополимер стирола и дивинилбензола, содержащий 0,1-1,0 ммоль аминогрупп на 1 г полимера. В этих способах пептидного синтеза применяют защиту альфа-аминогрупп трет-бутилоксикарбонилом (т-БОК) или 9-фторметилоксикарбонилом (ФМОК). Оба способа включают постадийный синтез, при котором на каждой стадии добавляется одиночная аминокислота, начиная от С-конца пептида (см. Сойдап е! а1., Сиггеп! Рго!осо1к 1п 1ттипо1оду, ^11еу 1п!егкс1епсе, 1991, Иш! 9). По завершении химического синтеза с синтетического пептида могут снимать защиту, т.е. удалять т-БОК или ФМОК, отщеплять его от полимера путём обработки кислотой при пониженной температуре (например, жидкий НЕ - 10% анизол примерно от 0,25 до примерно 1 ч при 0°С). После отгонки реагентов пептиды специфического связывающего агента отделяют от полимера 1%-ным раствором уксусной кислоты, которую затем отгоняют при пониженном давлении с получением неочищенного продукта, который обычно может быть очищен такими способами, как гель-фильтрация на Сефадексе (8ерйабех) С-15 с применением 5%-ной уксусной кислоты в качестве растворителя. Лиофилизация соответствующих фракций, собранных с колонки, даёт гомогеный пептид специфического связывающего агента или его производные, которые могут быть далее подвергнуты анализу при помощи таких стандартных процедур, как аминокислотный анализ, тонкослойная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, ультрафиолетовая спектроскопия, определение молярного вращения и растворимости и расщепление по Эдману с количественной оценкой на твёрдой фазе.

При химическом синтезе антител к Апд-2, их производных, вариантов и фрагментов, а также других агентов пептидной природы, связывающих Апд-2, возможно включение в состав агента аминокислот, не встречающихся в природе.

Способы на основе рекомбинантных ДНК также приемлемы для получения антител полной длины и широкого набора других специфических связывающих агентов белковой природы, соответствующих настоящему изобретению, или их фрагментов. Молекулу кДНК, кодирующую антитело или его фрагмент, могут вставлять в вектор для экспрессии, который, в свою очередь, могут вводить в клетку-хозяина для выработки антитела или его фрагмента. Разумеется, кДНК, кодирующая такие антитела, может быть модифицирована и отличаться от исходной кДНК (транслированной с мРНК) с целью исключения нежелательных кодонов или, наоборот, включения предпочтительного кодона для экспрессии в различных клетках-хозяевах.

Обычно молекулу ДНК, кодирующую антитела, можно получить при помощи процедур, описанных в разделе Примеры. При необходимости получить молекулы ЕаЬ или СЭВ, родственные исходной молекуле антител, могут осуществлять скрининг подходящей библиотеки (библиотеки фаговой экспрессии, библиотеки лимфоцитов и т. п.) при помощи стандартных процедур, чтобы выявить и клонировать соответствующие ЕаЬ или СЭВ. Зонды, применяемые для такого скрининга, могут кодировать антитела полной длины или быть усеченными ЕаЬ-зондами, кодирующими субъединицу ЕаЬ исходных антител, либо иными подходящими зондами. Если в качестве зондов применяют фрагменты ДНК, типичными условиями гибридизации являются описанные АикиЬе1 и др. (АикиЬе1 е! а1. Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, Сиггеп! Рго!осо1к Ргекк (1994)).

После гибридизации обработанный зондом блот может быть отмыт в условиях подходящей жёсткости, зависящих от таких факторов, как размер зонда, ожидаемая гомология пробы с клоном, типа библиотеки, подвергаемой скринингу, и количества клонов, подвергаемых скринингу. Примерами скрининга высокой точности могут служить 0,1Х буфер 88С (хорид натрия + цитрат натрия) и 0,1% 8Ό8 (додецилсульфат натрия) при температуре 50-65°С.

Для включения и экспрессии полинуклеотидных молекул, кодирующих полипептиды специфических связывающих агентов, соответствующих настоящему изобретению, могут применять разнообразные системы вектор/хозяин. Эти системы включают, без ограничения, микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным вектором для экспрессии ДНК на основе бактериофагов, плазмид или космид; дрожжи, трансформированные векторами для экспрессии в дрожжах; клеточные системы насекомых, инфицированные векторами для экспрессии на основе вирусов (например, бакуловирусов); растительные клеточные системы, трансфицированные векторами для экспрессии на основе вирусов (например, вирусов мозаики цветной капусты (СаММ), вирусов табачной мозаики (ТММ)), или трансформированные бактериальными экспрессионными векторами (например, плазмидами Т1 или рВВ322); клеточные системы животных.

Клетки млекопитающих, которые также применимы для получения рекомбинантного белка -специфического связывающего агента, включают, без ограничения, клетки МЕВО, НеЬа, линии клеток яичника китайского хомячка (СНО), клетки СО8 (такие как СО8-7), ^138, ВНК, НерС2, 3Т3, В1М МОСК, А549, РС12, К562 и 293, а также гибридомные клеточные линии, описанные здесь. Клетки млекопитающих предпочтительны для получения таких специфических связывающих агентов, например антител и их фрагментов, которые обычно гликозилированы и требуют корректной укладки для проявления активности. Предпочтительными клетками млекопитающих являются, в частности, СНО, гибри

- 23 011866 домы и миелоидные клетки.

Ниже приведены для примера некоторые протоколы для рекомбинантной экспрессии белков - специфических связывающих агентов.

Термин экспрессионный вектор, или вектор для экспрессии, относится к плазмиде, фагу, вирусу или вектору, используемому для экспрессии полипептида исходя из последовательности ДНК (РНК). Экспрессионный вектор может содержать транскрипционный модуль, включающий:

1) генетический элемент или элементы, играющие регуляторную роль в экспрессии генов, например промоторы или энхансеры;

2) последовательность, кодирующую связывающий агент, который транскрибируется в виде мРНК и транслируется в виде белка; и

3) подходящие последовательности, инициирующие и терминирующие транскрипцию.

Структурные модули, предназначенные для применения в дрожжевых или других эукариотических экспрессионных системах, предпочтительно включают лидерную последовательность, способствующую секреции транслированного белка клеткой-хозяином. В противном случае, если рекомбинантный специфический связывающий агент экспрессируется без лидирующей последовательности, он может содержать на №конце остаток метионина. Этот остаток может быть затем отщеплён от экспрессированного рекомбинантного белка с получением конечного продукта - специфического связывающего агента - или не подвергаться отщеплению.

В частности, в дрожжах специфический связывающий агент может быть рекомбинантно экспрессирован с помощью систем, поступающих в продажу, например с помощью системы экспрессии РюЫа (ΙπУ1!годеп, δап П1едо, СА), в соответствии с инструкциями производителя. Эта система также использует последовательности Про-Про-альфа для прямой секреции, но транскрипция вставки направляется промотором алкогольоксидазы, индуцируемым метанолом.

Секретированный пептид специфического связывающего агента очищают от среды для роста дрожжей, например, с помощью способов, применяемых для очистки пептида из надосадочной жидкости клеток бактерий или млекопитающих.

Кроме того, кДНК, кодирующую пептид специфического связывающего агента, могут клонировать в экспрессионном векторе рУЪ1393 на основе бакуловируса (РйагМшдеп, δап П1едо, СА). Вектор могут использовать в соответствии с инструкциями производителя для инфицирования клеток δрοбοр!е^а £гид1регба в безбелковой среде кР9 для получения рекомбинантного белка. Специфический связывающий агент могут очищать и концентрировать из среды с помощью колонки с гепарин-сефарозой (Рйагтааа).

Кроме того, можно осуществлять экспрессию в системе клеток насекомых. Системы клеток насекомых для экспрессии белков хорошо известны специалистам. В одной из таких систем в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клетках δрοбοр!е^а £гид1регба или Тпсйорйыа 1агуае применяют вирус полиэдроза ядер Аи!одгарйа саШогшса (Ас№У). Последовательность, кодирующая специфический связывающий агент, может быть клонирована в маловажной области вируса, такой как ген полиэдрина, и помещена под контроль промотора гена полиэдрина. Удачная вставка полинуклеотида специфического связывающего агента делает ген полиэдрина неактивным и приводит к образованию рекомбинантного вируса, лишённого белка оболочки. Рекомбинантный вирус можно применять для инфицирования клеток δ.ί^ид^ре^ба или Тпсйорйыа 1агуае, в которых и будет экспрессироваться требуемый полипептид (διιάΐι е! а1., 1. У1го1. 46: 584 (1983); Εηде1йа^б е! а1., Ргос. №11. Асаб. δα. (США), 91: 3224-7 (1994)).

В другом примере последовательность ДНК, кодирующую специфический связывающий агент, могут амплифицировать при помощи ПЦР и клонировать в подходящем векторе, например рСБХ-3Х (Рйагтааа). Этот вектор разработан для получения конъюгированного белка, состоящего из глутатион-δтрансферазы (Οδ^, кодируемой вектором, и специфического связывающего агента, кодируемого фрагментом ДНК, вставленным в участок клонирования в составе вектора. Праймеры для ПЦР могут быть сконструированы так, чтобы содержать подходящий сайт рестрикции. Если фрагмент, конъюгированный со специфическим связывающим агентом, применяют только для облегчения экспрессии или наличие его в качестве дополнительного фрагмента интересующего полипептида нежелательно по каким-либо другим причинам, рекомбинантный специфический связывающий агент могут отщеплять от области ^Т белкового конъюгата. Полипептидной конструкцией рСΕX-3Х/специфический связывающий агент трансформируют клетки Е.сой ХЬ-1 В1ие ^йа1адепе, Ьа Ло11а СА), индивидуальные трансформанты выделяют и выращивают. Плазмидная ДНК из индивидуальных трансформантов может быть очищена и частично секвенирована при помощи автоматического секвенатора для подтверждения присутствия требуемой вставки нуклеотидной последовательности, кодирующей специфический связывающий агент, в правильном положении.

Экспрессия полинуклеотидов, кодирующих антитела к Апд-2 и их фрагменты при помощи рекомбинантных систем, описанных выше, может приводить к выработке антител и их фрагментов, которые следует подвергнуть рефолдингу (чтобы должным образом создать дисульфидные мостики) для достижения биологической активности. Типичные процедуры рефолдинга таких антител изложены в разделе Примеры, а также в нижеследующем разделе.

- 24 011866

Специфические связывающие агенты, полученные в бактериях, могут вырабатываться в виде нерастворимых включений в бактериальной клетке, и их могут очищать следующим образом. Клеткихозяева можно убить центрифугированием, промыть раствором 0,15 М №С1, 10 мМ, Трис, рН 8, 1 мМ ЭДТА и обработать лизоцимом в концентрации 0,1 мг/мл (81дта, 81. Ьошк, МО) в течение 15 мин при комнатной температуре. Лизат можно осветлить обработкой ультразвуком и осадить обрывки клеток центрифугированием в течение 10 мин при 12000 д. Осадок, содержащий специфический связывающий агент, можно ресуспендировать в растворе 50 мМ, Трис, рН 8, 10 мМ ЭДТА, наслоить на 50%-ный глицерин и центрифугировать 30 мин при 6000 д. Осадок далее можно ресуспендировать в стандартном физиологическом фосфатно-буферном растворе (РВ8), свободном от Са++ и Мд++. Затем специфический связывающий агент можно очищать фракционированием ресуспендированного осадка в денатурирующем полиакриламидном геле, содержащем 8Ό8 (8атЬгоок е1 а1., см. выше). Гель можно вымачивать в 0,4 М КС1 для визуализации белка, который можно вырезать и элюировать электрофоретически в электродном буфере без 8Ό8. Если требуемый белок, конъюгированный с С8Т, был получен в бактериях, его далее можно очистить при помощи модуля очистки от 68Т (68Т Рипйсайоп Мойи1е, Рйагташа).

Системы на основе клеток-хозяев из млекопитающих для экспрессии рекомбинантных белков хорошо известны специалистам. Штаммы клеток-хозяев можно отобрать по особой способности к специфическому ограниченному посттрансляционному протеолизу и к формированию посттрансляционных модификаций, которые могут быть полезны для обеспечения активности белка. Такими модификациями, в частности, являются ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидирование, ацилирование и др.

В различных клетках-хозяевах, таких как СНО, НеЬа, МОСК, 293, ^138, а также гибридомные клеточные линии и т.п., протекают различные внутриклеточные процессы и имеются различные характерные механизмы такой посттрансляционной активности, поэтому следует делать правильный выбор для обеспечения требуемых модификаций и требуемого ограниченного протеолиза введённого в них чужеродного белка.

Для выявления клеток, трансформированных для выработки рекомбинантного белка, может быть использовано множество селективных систем. Такими селективными системами, в частности, являются гены тимидинкиназы вируса простого герпеса, гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы и аденинфосфорибозилтрансферазы в клетках !к, йдрг! или арг( соответственно. Антиметаболитная устойчивость также может лежать в основе отбора на дигидрофолатредуктазу (ДГФР), которая сообщает устойчивость к метотрексату; глутамат-пируваттрансаминазу (др!), которая обеспечивает устойчивость к микофеноловой кислоте; пео, который обеспечивает устойчивость к аминогликозиду С418 и хлорсульфурону; и йудго, который сообщает устойчивость к гигромицину. Другими селективными генами, которые могут оказаться полезными, являются !грВ, позволяющий клеткам использовать индол вместо триптофана, или Ы&Э, позволяющий клеткам использовать гистинол вместо гистидина. Маркёры, которые позволяют зрительно выявить наличие трансформации, включают антоцианины, бета-глюкуронидазу и её субстрат (6И8), а также люциферазу и её субстрат люциферин.

Очистка и рефолдинг специфических связывающих агентов.

В некоторых случаях специфический связывающий агент, полученный при помощи вышеописанных процедур, следует подвергнуть рефолдингу и окислить с образованием правильной третичной структуры с образованием дисульфидных связей для достижения биологической активности. Восстановление третичной структуры можно осуществлять при помощи различных процедур, хорошо известных в данной области техники. Среди таких способов, например, - обработка растворённого полипептидного агента хаотропным агентом в среде с рН больше 7. Выбор хаотропа здесь сходен с выбором хаотропа при солюбилизации нерастворимых включений в клетках бактерий, однако здесь хаотроп обычно применяют в меньшей концентрации. К примеру, таким хаотропным агентом является гуанидин. В большинстве случаев раствор для рефолдинга/окисления содержит также восстановитель совместно с его окисленной формой в особом соотношении для создания необходимого окислительно-восстановительного потенциала, позволяющего реаранжировку дисульфидных связей для образования цистеиновых мостиков. Вот некоторые широко применяемые окислительно-восстановительные пары: цистеин/цистамин, глутатион/дитио-бис-глутатион, хлористая медь, дитиотреитол (ДТТ)/дитиан (ДТТ) и 2-меркаптоэтанол (2-МЭ)/дитио-2-МЭ. Во многих случаях для повышения эффективности восстановления третичной структуры используются сорастворители. Среди широко применяемых сорастворителей - глицерин, полиэтиленгликоль различной молекулярной массы и аргинин.

Весьма желательно получить белки специфических связывающих агентов или их варианты, соответствующие настоящему изобретению, в чистом виде. Методики очистки белков хорошо знакомы специалистам. Эти методики состоят, на первом уровне, в грубом фракционировании полипептидных и неполипептидных фракций. После отделения полипепида специфического связывающего агента от других белков интересующий полипептид можно дополнительно очищать при помощи хроматографических или электрофоретических методик для достижения частичной или полной очистки (или очистки до гомогенности). Аналитическими методами, особенно подходящими для получения чистого полипептида сецифического связывающего агента, являются ионообменная хроматография, гель-проникающая хромато

- 25 011866 графия, электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрофокусирование. Особенно эффективным методом очистки пептидов является жидкостная экспресс-хроматография белков или же высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Некоторые аспекты настоящего изобретения касаются очистки, а в некоторых воплощениях и, по существу, полной очистки кодируемого белка или пептида специфического связывающего агента. Термин очищенный белок или пептид специфического связывающего агента, как он употребляется здесь, относится к смеси, которую можно отделить от других составляющих и в которой белок или пептид специфического связывающего агента очищен в любой степени по отношению к тому виду, в котором он доступен в природе. Очищенный специфический связывающий агент, следовательно, имеет также отношение к специфическому связывающему агенту - белку или пептиду, - свободному от окружения, в котором он может встречаться в природе.

Обычно термин очищенный относится к смеси, содержащей специфический связывающий агент, которая была подвергнута фракционированию для удаления различных других составляющих, такая смесь в значительной степени сохраняет исходную биологическую активность. При применении термина по существу, очищенный подразумевают композицию, содержащую специфический связывающий агент, в которой специфический связывающий агент - белок или пептид - представляет собой главную составную часть композиции, например около 50, около 60, около 70, около 80, около 90, около 95% или более по отношению к другим белкам композиции.

Различные способы оценки степени очистки специфического связывающего агента окажутся известными специалистам в свете настоящего раскрытия. Среди них, например, определение специфической связывающей активности активной фракции или определение количества полипептидов специфического связывающего агента в той или иной фракции с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии 8Ό8. Предпочтительным способом определения чистоты фракции, содержащей специфический связывающий агент, является расчёт связывающей активности фракции в сравнении со связывающей активостью первоначального экстракта, и таким образом определяется степень очистки, которая обозначается, как кратный номер очистки. Конкретные единицы, применяемые для представления величины связывающей активности, будут, разумеется, зависеть от конкретной методики анализа, выбранной после очистки, а также от того, проявляет ли экспрессированный полипептид специфического связывающего агента обнаружимую связывающую активность или нет.

Различные процедуры, применимые для очистки полипептида специфического связывающего агента, окажутся известны специалистам. Среди них, например, осаждение сульфатом аммония, полиэтиленгликолем, антителами (иммунопреципитация) и т.п. или же тепловая денатурация с последующим центрифугированием, хроматографические стадии, такие как аффинная хроматография (например, на сефарозе с иммобилизованным белком А), ионообменная, обратно-фазная, хроматография на гидроксиапатите и аффинная хроматография; изоэлектрофокусирование, гель-электрофорез и сочетания этих и других методик. Как хорошо известно в данной области техники, полагают, что порядок проведения различных стадий очистки может быть изменён либо некоторые стадии могут быть опущены и тем не менее способ будет приемлем для приготовления, по существу, очищенного специфического связывающего агента.

Не во всех случаях специфический связывающий агент должен быть представлен в особенно чистом виде. В самом деле, в некоторых случаях могут найти применение специфические связывающие агенты меньшей степени очистки. Частичную очистку можно осуществить меньшим числом стадий очистки или при использовании различных форм той же общей схемы очистки. Например, отметим, что при использовании для катионообменной хроматографии системы ВЭЖХ достигается более высокая степень очистки, чем при хроматографии низкого давления. Способы с более низкой степенью относительной очистки могут иметь преимущества при восстановлении белковой структуры специфического связывающего агента или для поддержания связывающей активности экспрессирующегося белка специфического связывающего агента.

Известно, что подвижность полипептида может варьировать, иногда значительно, при различных условиях электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии 8Ό8 (Сара1б1 е! а1., Вюсйет Вюрйук Яек. Сотт., 76: 425 (1977)). Следовательно, следует обратить внимание на то, что при различных условиях электрофореза определяемая молекулярная масса очищенных или частично очищенных рекомбинантных специфических связывающих агентов может изменяться.

Анализы связывания.

В иммунологических анализах связывания применяют захватывающие агенты для специфического связывания и, зачастую, иммобилизации анализируемого антигена. Захватывающий агент - это вещество, специфически связывающееся с анализируемым антигеном. В одном из воплощений настоящего изобретения захватывающий агент представляет собой антитело или его фрагмент, специфически связывающий Лпд-2. Такие иммунологические анализы связывания хорошо известны специалистам (см. Лкаг еб., МеШобк ш Се11 Вю1оду, νο1. 37, АпбЬобкк ш Се11 Вю1оду, Асабетк Ргекк, 1пс., Νονν Уогк (1993)).

В иммунологическом анализе связывания часто применяют вещества-метки, сигнализирующие о наличии связанного комплекса, образованного из захватывающего агента и антигена. Меченым агентом

- 26 011866 может быть одна из молекул, входящих в связанный комплекс: например, меченым может быть специфический связывающий агент или антитела к специфическому связывающему агенту. Кроме того, веществом-меткой может служить третья молекула, обычно молекула еще одного антитела, связывающегося с иммунным комплексом. Так, меченым агентом могут быть, например, антитела к специфическому связыващему агенту, несущие метку. Вторичное антитело, специфичное к иммунному комплексу, может и не иметь метки, но при этом связываться четвёртой молекулой, специфичной к тому виду антител, к которой принадлежат вторичные антитела. Например, вторичное антитело может быть модифицировано выявляемым фрагментом, таким как биотин, который далее может быть связан четвёртой молекулой, такой как ферментативно-меченый стрептавидин. В качестве меченого агента могут использоваться и другие белки, специфически связывающиеся с константными областями иммуноглобулинов, такие как белок А или белок С. Эти связывающие белки являются нормальными составляющим клеточной стенки стафилококков и проявляют сильную неиммуногенную реактивность по отношению к константным областям иммуноглобулинов различных видов животных (см. Акегз!гот, I. 1ттипо1., 135: 2589-2542 (1985) и СйаиЬеб, Моб. РаШо1., 10: 585-591 (1997)).

Во всех указанных анализах могут потребоваться стадии инкубации и/или промывки после каждого сочетания реагентов. Стадии инкубации могут варьировать от приблизительно 5 с до нескольких часов, предпочтительно от 5 мин до суток. Однако время инкубации будет зависеть от формата анализа, анализируемого вещества, объёма раствора, концентраций и т.п. Обычно подобные анализы проводят при температуре окружающей среды, хотя можно выполнять их в широком диапазоне температур.

A. Неконкурентные анализы связывания.

Иммунологические анализы связывания могут быть неконкурентного типа. В этих анализах количество связываемого анализируемого вещества измеряют напрямую. Например, в одном из предпочтительных анализов (типа Сэндвич) захватывающий агент (антитело) может быть связан прямо с твёрдой подложкой, где он иммобилизуется. Эти иммобилизованные антитела далее захватывают (связывают) антиген, представленный в тестируемом образце. Иммобилизованный таким образом белок связывается затем с веществом-меткой, например с антителами, несущими метку. В другом предпочтительном анализе типа Сэндвич вторичные антитела не несут метки, однако связываются мечеными антителами, специфичными к антителам того вида животных, из которого происходят вторичные антитела. Вторичные антитела также могут быть модифицированы выявляемым фрагментом, таким как биотин, с которым специфически связывается третья меченая молекула, например стрептавидин (см. Наг1оте, Ьапе, АпбЬоб1ез, А ЬаЬога!огу Мапиа1, Сй. 14, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, ΝΥ (1988)), включенный здесь путем ссылки.

Б. Конкурентные анализы связывания.

Иммунологические анализы связывания могут быть и конкурентного типа. При этом количество анализируемого вещества в образце определяют косвенно, посредством измерения количества анализируемого вещества, сместившегося или вытесненного от захватывающего агента анализируемым веществом, присутствующим в пробе. В одном из предпочтительных конкурентных анализов связывания к образцу добавляют известное количество анализируемого вещества, обычно меченого, и затем образец приводят в контакт с антителами (захватывающим агентом). Количество меченого анализируемого вещества, связавшегося с антителами, обратно пропорционально концентрации анализируемого вещества в пробе (см. Наг1оте, Ьапе, АпбЬоб1ез, А ЬаЬога!огу Мапиа1, Сй. 14, р. 579-583, см. выше).

В другом предпочтительном конкурентном анализе связывания антитело иммобилизовано на твёрдой подложке. Количество белка, связавшегося с антителами, может быть выявлено либо путём измерения количества белка, присутствующего в комплексе белок-антитело, либо же посредством измерения количества оставшегося белка, не входящего в комплекс. Количество белка может быть измерено получением меченого белка (см. Наботе, Ьапе, АпбЬоб1ез, А ЬаЬога!огу Мапиа1, Сй 14, см. выше).

Ещё в одном предпочтительном конкурентном тесте на связывание применяется гаптенное ингибирование. В этом случае известное количество анализируемого вещества иммобилизируют на твёрдой подложке. К тестируемому образцу добавляют известное количество антител и образец вводят в контакт с иммобилизованным анализируемым веществом. Количество антител, связавшееся с иммобилизованным антигеном, обратно пропорционально количеству анализируемого вещества, присутствующего в образце. Количество иммобилизованных антител можно выявить либо посредством определения иммобилизованной фракции антител или фракции, оставшейся в растворе. Определение может быть прямым, если антитела меченые, или непрямым, с последующим добавлением меченого вещества, специфически связывающегося с антителами, как описано выше.

B. Применение конкурентных анализов связывания.

Конкурентные анализы связывания можно применять при определении перекрёстной реактивности, что позволит опытному специалисту выявить, является ли белок или ферментный комплекс, распознаваемый специфическим связывающим агентом, соответствующим настоящему изобретению, требуемым белком, а не перекрёстно реагирующей молекулой, либо определить, являются ли антитела специфичными к данному антигену и не связываются ли они с неродственными антигенами. В анализах такого типа антиген может быть иммобилизован на твёрдой подложке и к нему добавляют смесь неизвестных

- 27 011866 белков, конкурирующую с иммобилизованным белком за связывание со специфическим связывающим агентом. Конкурирующая молекула также связывает один или несколько антигенов, неродственных указанному антигену. Способность белков конкурировать с иммобилизованным антигеном за связывание со специфическим связывающим агентом сравнивается с тем же белком, иммобилизованным на твёрдой подложке, для выявления перекрёстной реактивности белковой смеси.

Г. Другие анализы связывания.

Настоящим изобретением предложены также способы вестерн-блоттинга для выявления или для определения количества Апд-2, присутствующего в образце. Методика обычно включает разделение белков образца посредством гель-электрофореза по их молекулярной массе и перенос белков на подходящую твёрдую подложку, такую как нитроцеллюлозный фильтр, нейлоновый фильтр или химически модифицированный нейлоновый фильтр. Образец инкубируют с антителами или их фрагментами, которые специфически связывают Апд-2, после чего выявляют образованный при этом комплекс. Антитела могут быть мечены напрямую или же могут быть обнаружены при помощи меченых антител, специфически связывающихся с вышеуказанными антителами.

Анализы связывания для определения таких агентов, специфически связывающих Апд-2, которые разрывают связь Апд-2 с его рецептором, изложены в разделе Примеры.

Диагностические анализы.

Антитела и их фрагменты, соответствующие настоящему изобретению, применимы для диагностики состояний или заболеваний, для которых характерна экспрессия Апд-2 или его субъединиц, или в анализах для мониторинга пациентов, подвергавшихся лечению индукторами Апд-2, его фрагментами, агонистами или ингибиторами активности Апд-2. Диагностические анализы Апд-2 включают способы с использованием специфического связывающего агента и метки для выявления Апд-2 в жидкостях человеческого организма или в экстрактах клеток или тканей. Специфические связывающие агенты, соответствующие настоящему изобретению, могут быть использованы с модификациями или без таковых. В предпочтительном диагностическом анализе специфические связывающие агенты являются мечеными с помощью присоединения к ним, например, метки или репортерной молекулы. Известно большое разнообразие меток и обнаруживаемых молекул, некоторые из которых уже были здесь описаны. В частности, настоящее изобретение применимо для диагностики заболеваний человека.

Специалистам известны разнообразные протоколы измерения количества Апд-2 при помощи моноклональных или поликлональных антител, специфичных к этому белку. Примеры включают твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А), радиоиммунный анализ (РИА) и цитофлуорометрию. Предпочтительным является двухэпитопный иммунологический анализ на основе моноклональных антител с использованием моноклональных антител, реактивных к двум неперекрывающимся эпитопам; однако может применяться и конкурентный анализ связывания. Эти анализы описаны, например, в статье Маййох е! а1., 1. Ехр. Мей., 158: 1211 (1983).

Для обеспечения базы для диагностики обычно определяют нормальные или стандартные значения экспрессии Апд-2 у человека. Это определение должно осуществляться путём сочетания жидкостей тела или клеточных экстрактов нормальных субъектов, предпочтительно людей, со специфическим связывающим агентом, например антителами к Апд-2, в условиях, приемлемых для образования комплекса, хорошо известных специалистам. Величину стандартного образования комплекса можно количественно оценить путём сравнения величины связывания специфического связывающего агента с известными количествами белка Апд-2 в присутствии образцов, соответствующих норме и патологии. Затем стандартные величины, полученные для нормальных образцов, можно сравнить с величинами, полученными для образцов от пациентов, поражённых заболеванием. Различие между полученными величинами в норме и патологи говорит о роли Апд-2 в болезненном состоянии.

В воплощениях специфический связывающий агент для диагностических нужд может быть мечен выявляемым фрагментом. Выявляемым фрагментом может быть любой, способный прямо или опосредованно подать выявляемый сигнал. Например, выявляемым фрагментом может быть радиоизотоп, такой как ³Н, ¹⁴С, ³²Р, ³⁵δ или ¹²⁵1, флуоресцентное или хемилюминесцентное вещество, такое как флуоресцеинизотиоцианат, родамин или люциферин; или фермент, такой как щелочная фосфатаза, бетагалактозидаза или пероксидаза хрена (Вауег е! а1., Ме111. Епх., 184: 138-163 (1990)).

Заболевания.

Согласно настоящему изобретению предложен специфический связывающий агент, который связывает Апд-2 и пригоден для лечения человеческих заболеваний и патологических состояний. Агенты, модулирующие активность связывания Апд-2 или другую клеточную активность, можно применять в сочетании с другими терапевтическими агентами для повышения их терапевтического эффекта или снижения возможных побочных эффектов.

В одном из аспектов настоящего изобретения предложены реагенты и способы, пригодные для лечения заболеваний и состояний, характеризующихся нежелательным или отклоняющимся уровнем активности Апд-2 в клетке. Среди этих заболеваний - раковые заболевания и другие гиперпролиферативные состояния, такие как гиперплазия, псориаз, контактный дерматит, иммунологические расстройства или бесплодие.

- 28 011866

Согласно настоящему изобретению также предложены способы лечения рака у животных, включая человека, включающие введение животному эффективной дозы специфического связывающего агента, который ингибирует или снижает активность Апд-2. Кроме того, согласно изобретению предложены способы ингибирования роста раковых клеток, включая процессы клеточной пролиферации, инвазивность и метастазирование в биологических системах. Среди этих способов - применение соединения, соответствующего настоящему изобретению, в качестве ингибитора роста раковых клеток. Предпочтительно эти способы применяют для подавления или уменьшения роста раковых клеток, инвазивности, метастазирования или уменьшения опухоли у животных, таких как млекопитающие. Способы, соответствующие настоящему изобретению, можно легко приспособить и для применения в тестовых системах, например, выявляющих рост раковых клеток и его характеристики, а также выявляющих вещества, которые влияют на рост раковых клеток.

Раковые заболевания, которые можно лечить способами по настоящему изобретению, предпочтительно встречаются у млекопитающих. Млекопитающими являются, например, люди и другие приматы, а также домашние животные, такие как собаки и кошки; лабораторные животные, такие как крысы, мыши и кролики; и сельскохозяйственные животные, такие как лошади, свиньи, овцы и крупный рогатый скот.

Опухоли, или неоплазии, представляют собой, в частности, разрастания клеток в тканях, при которых увеличение числа клеток является бесконтрольным и прогрессирующим. Некоторые из таких разрастаний доброкачественны, однако другие, называемые злокачественными, могут привести к смерти организма. Злокачественные неоплазии, или раковые опухоли, отличаются от доброкачественных тем, что, кроме проявления агрессивной клеточной пролиферации, они могут внедряться в окружающие ткани и метастазировать. Кроме того, злокачественные неоплазии отличаются тем, что проявляют меньший уровень дифференциации (большую дедифференциацию) и меньшую степень организации по сравнению с любой из окружающих их тканей. Это свойство также называется анаплазией.

Разновидностями неоплазий, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, являются солидные опухоли, например карциномы и саркомы. Карциномы включают те злокачественные неоплазии, происходящие из эпителиальных клеток, которые инфильтрируют (проникают) в окружающие ткани и приводят к возникновению метастазов. Аденокарциномы - это карциномы, происходящие из железистой ткани или образующие различимые железоподобные структуры. Другая широкая категория раковых заболеваний включает саркомы, представляющие собой опухоли, клетки которых окружены волокнистым или гомогенным межклеточным веществом, подобным эмбриональной соединительной ткани. Настоящее изобретение делает возможным и лечение раковых заболеваний лимфоидной и миелоидной систем, в том числе лейкемий, лимфом и других раковых заболеваний, которые обычно не представлены опухолевой массой, а рассредоточены в сосудистой или лимфатической системах.

Перечень разновидностей раковых заболеваний, поддающихся лечению в соответствии с настоящим изобретением, включает, например, опухоль, вырабатывающую аденокортикотропный гормон; острую лимфоцитарную лейкемию, острую нелимфоцитарную лейкемию, рак коры надпочечников, рак мочевого пузыря, рак мозга, рак груди, рак шейки матки, хроническую лейкоцитарную лейкемию, хроническую миелоцитарную лейкемию, рак толстой и прямой кишки, Т-клеточную лимфому кожи, рак эндометрия, рак пищевода, саркому Эвингса, рак желчного пузыря, лейкемию волосяных клеток, рак головы и шеи, лимфому Ходжкина, саркому Капоши, рак почки, рак печени, рак лёгкого (мелкоклеточный и немелкоклеточный), злокачественный перитонеальный выпот, злокачественный плевральный выпот, меланому, мезотелиому, множественную миелому, нейробластому, глиому, неходжкинову лимфому, саркому кости, рак яичника, рак зародышевых клеток яичника, рак поджелудочной железы, рак полового члена, рак предстательной железы, ретинобластому, рак кожи, саркому мягких тканей, плоскоклеточные карциномы, рак желудка, рак яичка, рак щитовидной железы, трофобластические неоплазии, рак матки, рак влагалища, рак преддверия влагалища и опухоль Вильмса.

Настоящее изобретение частично проиллюстрировано здесь в отношении лечения некоторых типов экспериментальных опухолей. Для такого иллюстративного лечения были использованы стандартные современные модели ш νίΙΐΌ и ш у1уо. Такими методами можно выявить агент, в отношении которого можно ожидать, что он будет эффективен при лечении ш у1уо. Однако следует понимать, что способ по настоящему изобретению не ограничивается лечением указанных типов опухолей, а распространяется на любую солидную опухоль, происходящую из любой ткани. Раковые заболевания, инвазивность или метастазирование которых связано с экспрессией Апд-2 или с его активностью, особенно чувствительны к ингибированию и даже могут быть индуцированы к обратному развитию средствами, предложенными согласно настоящему изобретению.

Настоящее изобретение можно также осуществлять на практике, применяя специфический связывающий агент, соответствующий настоящему изобретению, такой как антитело, в сочетании с другим противоопухолевым химиотерапевтическим агентом, таким как любой из обычных химиотерапевтических агентов. Сочетание специфического связывающего агента с другими агентами такого рода может увеличить эффективность химиотерапевтического протокола. Опытный практикующий врач знает множество химиотерапевтических протоколов, которые могут войти как составная часть в способ, соответ

- 29 011866 ствующий настоящему изобретению. При этом можно применять любые химиотерапевтические агенты, такие как алкилирующие средства, антиметаболиты, гормоны и их антагонисты, радиоизотопы, а также природные продукты. Например, соединение, соответствующее настоящему изобретению, можно назначать с антибиотиками, такими как доксорубицин и другие аналоги антрациклина, азотистые иприты, такие как циклофосфамид, аналоги пиримидина, такие как 5-фторурацил; цисплатин, оксимочевина, таксол и его натуральные и синтетические производные и т.п. Как другой пример, в случае опухолей смешанного типа, таких как аденокарцинома груди, где опухоль состоит из гонадотропинзависимых и гонадотропиннезависимых клеток, соединение можно вводить в сочетании с лейпролидом или гозерелином (синтетическими пептидными аналогами релизинг-фактора лютеинизирующего гормона). Другие антинеопластические протоколы включают, например, применение соединений тетрациклинового ряда вместе с иными методами терапии, например хирургией, радиацией и т.п., которые называются здесь сопряжёнными антинеопластическими методами терапии. Таким образом, способ по настоящему изобретению можно применять совместно с обычными режимами лечения для снижения побочных эффектов и повышения эффективности лечения.

Таким образом, согласно настоящему изобретению предложены фармацевтические композиции и способы, применимые для лечения широкого спектра раковых заболеваний, в том числе солидных опухолей и лейкемий. Типы раковых заболеваний, которые могут подвергаться лечению в соответствии с настоящим изобретением, включают, без ограничения, следующее: аденокарцинома груди, предстательной железы и толстой кишки; все формы бронхогенной карциномы лёгкого, миелоид, меланома, гепатома, нейробластома, папиллома, апудома, хористома, бранхиома, злокачественный карциноидный синдром, карциноидная болезнь сердца, различные карциномы (например, Волкера, базально-клеточная, Брауна-Пирса, карцинома из эпителия протоков, опухоль Эрлиха, Кребса 2, клеток Меркеля, слизеобразующая, немелкоклеточная лёгкого, овсяноклеточная, папиллярная, фиброзная, бронхиол, бронхогенная, плоскоклеточная и переходно-клеточная), гистиоцитарные расстройства, лейкемия, злокачественный гистиоцитоз, болезнь Ходжкина, иммунопролиферативная мелкоклеточная карцинома лёгкого, неходжкинова лимфома, плазмоцитома, ретикулоэндотелиоз, меланома, хондробластома, хондрома, хондросаркома, фиброма, фибросаркома, гигантоклеточные опухоли, гистиоцитома, липома, липосаркома, мезотелиома, миксома, миксосаркома, остеома остеосаркома, хордома, краниофарингиома, дисгерминома, гамартома, мезенхимома, мезонефрома, миосаркома, амелобластома, цементома, одонтома, тератома, тимома, трофобластическая опухоль и др. Кроме того, также можно лечить следующие типы раковых заболеваний: аденома, холангиома, холестеатома, цилиндрома, цистаденокарцинома, цистаденома, аденома граафовых пузырьков, гинандробластома, гепатома, гидраденома, инсулома, опухоль из клеток Лейдига, папиллома, опухоль из сертолиевых клеток, текома, лейомиома, лейомиосаркома, миобластома, миома, миосаркома, рабдомиома, рабдомиосаркома, эпендимома, англионеврома, глиома, медуллобластома, менингиома, нейрилеммома, нейробластома, нейроэпителиома, нейрофиброма, нейрома, параганглиома, нехромаффинная параганглиома, ангиокератома, ангиолимфоидная гиперплазия с эозинофилией, склерозирующая ангиома, ангиоматоз, гломангиома, гемангиоэндотелиома, гемангиома, гемангиоперицитома, гемангиосаркома, лимфангиома, лимфангаомиома, лимфангиосаркома, пинеалома, карциносаркома, хондросаркома, листовидная цистосаркома, фибросаркома, гемангиосаркома, лейомиосаркома, лейкосаркома, липсаркома, лимфангиосаркома, миосаркома, миксосаркома, карцинома яичника, рабдомиосаркома, саркома, новообразования, нейрофиброматоз и цервикальная дисплазия.

Другой аспект настоящего изобретения представляет собой использование материалов и способов, соответствующих настоящему изобретению, для профилактики или лечения любых гиперпролиферативных состояний кожи, в том числе псориаза и контактного дерматита или других гиперпролиферативных заболеваний. Как было обнаружено, у пациентов с псориазом и контактным дерматитом повышен уровень активности Аид-2 в области поражения (0докЫ с1 а1., I. Ιην. Эсгта1о1.. 110: 818-23 (1998)). Предпочтительно специфические связывающие агенты, специфичные к Апд-2, следует применять в сочетании с другими фармацевтическими агентами для лечения людей, у которых выражены эти клинические симптомы. Специфические связывающие агенты могут доставлять при помощи любого из разнообразных носителей с помощью способов введения, описанных здесь, и других, хорошо известных специалистам.

Согласно другим аспектам настоящего изобретения предложено лечение различных ретинопатий (в том числе диабетической ретинопатии и старческой макулодеградации), в патологии которых задействован ангиогенез, а также нарушений/заболеваний женских половых путей, таких как эндометриоз, фиброиды матки и другие подобные состояния, связанные с дисфункцией пролиферации сосудов (в том числе рост капиллярной сети в эндометрии), в ходе репродуктивного цикла у женщин.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к лечению аномального роста сосудов, в том числе артериовенозных аномалий в мозге, повреждений слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и их восстановление, изъязвления слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки у пациентов с язвенной болезнью этих органов в анамнезе, ишемического инсульта, широкого спектра сосудистых нарушений в лёгких, заболеваний печени и портальной гипертензии у пациентов с негепатогенной портальной гипертензией.

- 30 011866

Ещё одним из аспектов настоящего изобретения является профилактика раковых заболеваний фармацевтическими композициями и способами, предусмотренными настоящим изобретением. Такие композиции включают в себя специфические связывающие агенты к Апд-2.

Фармацевтические композиции.

В объем настоящего изобретения входят фармацевтические композиции, содержащие агенты, специфически связывающие Апд-2. Фармацевтические композиции, содержащие антитела, подробно описаны, например, в патенте ИЗ 6171586 (Ьат е! а1.) от 09.01.2001. Такие композиции содержат терапевтически или профилактически эффективное количество специфического связывающего агента, такого как антитело или его фрагмент, вариант, производное или конъюгат, как описано здесь, с примесью фармацевтически приемлемого агента. В предпочтительном воплощении фармацевтические композиции содержат антагонистические специфические связывающие агенты, которые частично или полностью модулируют по меньшей мере одну из биологических активностей Апд-2, в смеси с фармацевтически приемлемым агентом. Обычно специфические связывающие агенты являются достаточно очищеными, чтобы их можно было вводить животному.

Фармацевтическая композиция может содержать компоненты состава, служащие для изменения, поддержания или сохранения, например, рН, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, отношения растворимости или высвобождения, адсорбции или проницаемости состава. Приемлемыми компонентами состава являются, например, аминокислоты, такие как Гли, Глн, Асн, Арг или Лиз, противомикробные агенты, антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфит натрия или бисульфит натрия), буферные агенты (такие как борат, бикарбонат, Трис-НС1, цитраты, фосфаиты, другие органические кислоты), агенты, увеличивающие объём (такие как маннит или глицин), хелатирующие агенты (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)), комплексообразователи (такие как кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или оксипропил-бетациклодекстрин), наполнители, моносахариды. дисахариды и другие углеводы (такие как глюкоза, манноза или декстрины), белки (такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины), красители, отдушки и разбавители, эмульгаторы, гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон), полипептиды низкого молекулярного веса, солеобразующие противоионы (такие как натрий), консерванты (такие как хлористый бензалконий, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенэтиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или перекись водорода), растворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль), сахарные спирты (такие как маннит или сорбит), вещества, стабилизирующие взвеси; сурфактанты или увлажнители (Плюроник, полиэтиленгликоль, сорбитановые эфиры, полисорбаты, такие как полисорбат 20, полисорбат 80, Тритон, трометамин, лецитин, хорестерин, тилоксапал), стабилизаторы (сахароза или сорбит), вещества, повышающие ионную силу (такие как галогениды щелочных металлов, предпочтительно хлористый натрий или калий, маннит, сорбит), основы, растворители, неактивные наполнители и/или адъюванты (Ветшд!оп'к Ркагтасеи!1са1 Заепсек, 18¹¹' Еббюп, А.В. Сеппаго, еб., Маск РиЫкЫпд Сотрапу, 1990).

Оптимальная фармацевтическая композиция будет подбираться специалистом в зависимости, например, от предполагаемого пути введения, формата доставки и желаемой дозировки (например, Веттд!оп'к РЬагтасеи!1са1 Заепсек, см. выше). Такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения ш νί\Ό и скорость выведения ш νί\Ό специфического связывающего агента.

Первичная основа или носитель в фармацевтической композиции может иметь водную или неводную природу. Например, подходящей основой или носителем может быть вода для инъекций, физиологический солевой раствор или искусственная цереброспинальная жидкость, возможно, с добавлением других веществ, обычных для фармацевтических композиций парентерального применения. Другими примерами лекарственных основ могут служить нейтрально-буферный физиологический раствор или физиологический раствор с добавлением сывороточного альбумина. Другие примеры фармацевтических композиций содержат Трис-буфер с рН в области 7,0-8,5 или ацетатный буфер с рН в области 4,0-5,5, который может дополнительно содержать сорбит или приемлемый его заменитель. В одном из воплощений настоящего изобретения фармацевтические композиции, содержащие связывающий агент, могут быть приготовлены для хранения путём смешения выбранного вещества с нужной степенью очистки с дополнительными неактивными наполнителями (Ветшд!оп'к РЬагтасеи!юа1 Заепсек, см. выше) в виде лиофилизированной массы или водного раствора. Кроме того, связывающий агент может быть представлен в лиофилизированном виде при использовании подходящих наполнителей, таких как сахароза.

Могут быть выбраны фармацевтические композиции для парентерального введения. Также могут быть выбраны композиции для ингаляций или для приёма внутрь через рот, ухо, глаз, прямую кишку или влагалище. Приготовление таких фармацевтических композиций находится в компетенции специалистов.

Компоненты фармацевтических композиций берут в концентрациях, приемлемых для выбранного способа введения. Например, буферные вещества используются для поддержания в лекарственном составе физиологического или слегка пониженного рН, обычно в диапазоне от 5 до 8.

- 31 011866

В случае выбора парентерального способа введения фармацевтические композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением могут быть представлены в виде апирогенного парентерально-приемлемого водного раствора, содержащего требуемый специфический связывающий агент и фармацевтически приемлемую основу. Особенно подходящей основой для парентерального введения является стерильная дистиллированная вода, в которой связывающий агент представлен в виде стерильного изотонического раствора, должным образом законсервированного. В другом препарате активный компонент может быть представлен в виде состава, включающего требуемую молекулу и агент, такой как микросферы для инъекций, биоразрушаемые частицы, полимерные соединения (полимолочная кислота, полигликолевая кислота), гранулы, липосомы, в результате чего достигается контролируемое или замедленное высвобождение продукта, который таким образом можно доставлять с помощью инъекции замедленного всасывания. Может использоваться и гиалуроновая кислота, при этом может достигаться эффект длительного пребывания в кровотоке. Другими подходящими средствами для введения требуемой молекулы являются имплантируемые устройства для доставки лекарств.

В другом аспекте фармацевтические композиции, приемлемые для парентерального введения, могут находиться в составе водных растворов, предпочительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенкса, раствор Рингера или физиологический буферный солевой раствор. Суспензии для инъекций на водной основе могут содержать вещества, повышающие вязкость суспензии, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Кроме того, суспензии действующего вещества могут быть приготовлены в виде приемлемых масляных инъекционных суспензий. Приемлемыме липофильные растворители или основы включают жирные масла, такие как кунжутное масло; или синтетические эфиры жирных кислот, такие как этилолеат; триглицериды или липосомы. Для доставки препарата могут использоваться и нелипидные поликатионные аминополимеры. Если желательно, суспензия может содержать также подходящие стабилизаторы или вещества, повышающие растворимость соединений, позволяющие изготавливать высококонцентрированные растворы.

Ещё в одном воплощении фармацевтическая композиция может иметь состав, пригодный для ингаляций. Например, связывающий агент может быть представлен в виде сухого порошка для ингаляций. Растворы полипептидов или молекул нуклеиновых кислот для ингаляций могут быть иметь состав, включающий пропеллент для доставки в виде аэрозоля. Ещё в одном воплощении растворы могут подлежать распылению. Введение через лёгкие рассмотрено также в международной заявке РСТ/И894/001875, которая описывает введение химически модифицированных белков через лёгкие.

Согласно изобретению также предложены фармацевтические композиции, вводимые перорально. В одном из воплощений настоящего изобретения молекулы связывающего агента, вводимые таким путём, могут быть представлены в сочетании с носителями, обычно применяющимися в компаундировании твёрдых дозированных форм, таких как таблетки или капсулы, или без таковых носителей. Например, капсулы могут быть разработаны так, чтобы высвобождать активную часть состава в такой точке пищеварительного тракта, в которой биодоступность максимальна, а пресистемное разрушение минимально. Для облегчения всасывания молекулы связывающего агента могут применяться дополнительные вещества. Могут использоваться также разбавители, вкусовые добавки, легкоплавкие воски, растительные масла, скользящие вещества, суспендирующие агенты; дезинтегрирующие агенты и связующие вещества.

Фармацевтические композиции для перорального введения могут также быть составлены с использованием фармацевтически приемлемых носителей, хорошо известных специалистам, в дозировках, подходящих для перорального применения. Такие носители дают возможность создавать такие лекарственные формы, как таблетки, пилюли, драже, капсулы, жидкости, гели, сиропы, суспензии и т. п., которые могут проглатываться пациентом.

Фармацевтические препараты для перорального применения могут быть получены посредством сочетания действующих веществ с твёрдыми неактивными наполнителями и получения гранул из этой смеси (при необходимости, после измельчения) для получения таблеток или сердцевин драже. При желании, могут быть добавлены подходящие вспомогательные вещества. Приемлемые неактивные наполнители включают углеводные или белковые наполнители, такие как сахара, в том числе лактоза, сахароза, маннит или сорбит; крахмал из кукурузы, пшеницы, сои, риса, картофеля или других растений; целлюлозу, например метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу или натрийкарбоксиметилцеллюлозу; камеди, в том числе гуммиарабик или трагакантовая камедь; и белки, такие как желатин или колаген. При желании, могут быть добавлены дезинтегрирующие или солюбилизирующие агенты, такие как поперечно-сшитый поливинилпирролидон, агар-агар или альгиновая кислота либо её соль, такая как альгинат натрия.

Сердцевина драже может применяться в сочетании с приемлемыми оболочками, такими как концентрированные растворы сахаров, которые могут содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, гель карбопола, полиэтиленгликоль и/или двуокись титана, лаковые растворы и подходящие органические растворители и их смеси. В оболочки драже можно также добавлять красители и пигменты для иденификации продукта или для обозначения количества действующего вещества, т.е. дозировки.

- 32 011866

Фармацевтические препараты для перорального назначения также включают капсулы из желатина с плотной насадкой, а также мягкие герметичные капсулы из желатина и покрытия, такого как глицерин или сорбит. Капсулы с плотной насадкой могут содержать действующее вещество в смеси с наполнителями или связующими веществами, такими как лактоза или крахмалы, скользящие вещества, такие как тальк, стеарат магния, и при необходимости, стабилизаторы. В мягких капсулах действующие вещества могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как растительные масла, жидкость или жидкий полиэтиленгликоль со стабилизаторами или без таковых.

Другие фармацевтические композиции могут содержать эффективное количество связывающего агента в смеси с нетоксичными наполнителями, пригодными для производства таблеток. При растворении таблеток в стерильной воде или другой подходящей основе могут быть получены растворы в виде единицы дозы. Приемлемые неактивные наполнители включают, например, инертные разбавители, такие как углекислый кальций, углекислый или двууглекислый натрий, лактоза или фосфорно-кислый кальций; или связующие вещества, такие как крахмал, желатин или гуммиарабик; либо скользящие вещества, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк.

Прочие фармацевтичекие композиции будут очевидны специалистам, включая композиции, в состав которых молекулы связывающего агента входят вместе с веществами, обеспечивающими замедленное или контролируемое высвобождение. Методики создания различных других средств для замедленного или контролируемого высвобождения действующего вещества, таких как липосомные носители, биоразлагаемые микрочастицы или пористые гранулы и инъекции замедленного всасывания, также известны специалистам (см., например, РСТ/И893/00829, в которой описывается контролируемое высвобожднение пористых полимерных микрочастиц для доставки фармацевтических композиций). Дополнительные примеры препаратов замедленного высвобождения включают полупроницаемые полимерные матрицы, имеющие различную форму, например плёнки или микрокапсулы. Матрицами замедленного высвобождения могут являться, например, полиэфиры, гидрогели, полиактиды (патенты И8 3773919, ЕР 58481), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Ь-глутамата (81йшап е! а1., Вюро1ушег§, 22: 547-556 (1983)), поли(2-оксиэтилметакрилат) (Ьапдег е! а1., 1. Вюшей. Ма!ег Яек, 15: 167-277 (1981) и Ьапдег е! а1., С1еш. Тес1., 12: 98-105(1982)), этилен-винилацетат (Ьапдег е! а1., см. выше) или поли-Э(-)-3оксимасляная кислота (ЕР 133988). Композиции с замедленным высвобождением также могут включать липосомы, которые могут быть приготовлены любым из нескольких методов, известных специалистам (см., например, ЕррЧет е! а1., Ргос. №а!1. Асай. 8сг (США), 82: 3688-3692 (1985); ЕР 36676; ЕР 88046; ЕР 143949).

Фармацевтическая композиция, предназначенная для применения ш νίνΌ, как правило, должна быть стерильной. Это может достигаться благодаря фильтрации через стерильные мембраны. Если композиция является лиофилизованной, то стерилизацию с использованием этого способа можно осуществлять либо до лиофилизации, либо после растворения. Композицию для парентерального введения могут хранить в лиофилизированном виде или в растворе. Кроме того, композиции для парентерального введения обыкновенно помещают в ёмкость со стерильным входным отверстием, например в мешок для внутривенного применения или в пузырёк с пробкой, протыкаемой иглой для подкожных инъекций.

После приготовления фармацевтической композиции ее могут хранить в стерильных аптечных пузырьках в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твёрдого вещества или обезвоженного либо лиофилизированного порошка. Такие составы могут храниться в форме, готовой к употреблению, либо в форме (например, лиофилизованной), требующей растворения перед введением.

В конкретном воплощении настоящее изобретение предусматривает наборы для создания формы для введения единицы дозы. Каждый из таких наборов может включать первую емкость с высушенным белком и вторую емкость с водной основой. В объем изобретения также включены наборы, состоящие из предварительно заполненных одиночных и многокамерных шприцев (например, шприцы с жидкостью или шприцы с лиофилизированным порошком).

Эффективная доза фармацевтической композиции для терапевтического применения будет зависеть, например, от терапевтических обстоятельств и целей. Специалисту понятно, что подходящая дозировка при лечении будет, таким образом, изменяться в зависимости, с одной стороны, от действующего вещества, для которого здесь используется обозначение специфический связывающий агент, способа введения, размеров (масса тела, поверхность тела или размер органа) и состояния (возраст и общее состояние здоровья) пациента. Соответственно, клиницист может изменить дозировку или способ введения для достижения оптимального лечебного эффекта. Обычно дозировки могут варьировать в пределах приблизительно от 0,1 до приблизительно 100 мг/кг, или от 1 до приблизительно 100 мг/кг, или же от 5 до приблизительно 100 мг/кг.

Терапевтически эффективная доза любого соединения может быть изначально оценена либо в анализах на клеточной культуре, либо на модели на животных, таких как мыши, крысы, кролики, собаки или свиньи. Модель на животных может также применяться для определения приемлемого диапазона концентраций и способа введения. Такие сведения могут быть затем использованы для определения приемлемых доз и способов введения для людей.

- 33 011866

Точная дозировка должна быть определена с учетом факторов, связанных с пациентом, подлежащим лечению. Дозы и способ назначения подбирают для достижения достаточных уровней действующего вещества или для поддержания желаемого эффекта. Факторами, которые могут быть приняты во внимание, являются тяжесть заболевания, общие показатели здоровья пациента, возраст, вес и пол пациента, длительность и частота введения, сочетания лекарств, чувствительность к препарату и ответ на лечение. Фармацевтические композиции длительного действия можно вводить каждые 3 или 4 дня, еженедельно или раз в две недели, в зависимости от периода полураспада или полувыведения конкретного состава.

Частота введения будет зависеть от фармакокинетических параметров молекул связывающего агента в данной фармацевтической композиции. Обычно фармацевтическую композицию вводят до тех пор, пока лекарство не возымеет желательного действия. Таким образом, состав можно вводить в виде однократной дозы или в несколько приёмов (в одной и той же или в различных дозировках) в течение некоторого времени либо же в виде непрерывного вливания. Дальнейшая корректировка дозировки является рутинной процедурой. Приемлемые дозировки могут быть определены при использовании подходящих данных типа доза-ответ.

Фармацевтические композиции вводят различными путями в соответствии с известными способами, например перорально, в виде внутривенных инъекций, внутрибрюшинно, внутрь мозга (интрапаренхимально), в мозговые желудочки, внутримышечно, в глаз, внутриартериально, внутрипортально, через поврежденные ткани, интрамедуллярно, интратекально, интравентрикулярно, чрескожно, подкожно, внутрибрюшинно, в нос, местно, под язык, через уретру, влагалище или прямую кишку, в системах длительного высвобождения или через имплантируемые устройства. Если желательно, фармацевтические композиции можно также вводить посредством болюсной инъекции или непрерывно путём вливания или с помощью имлантируемого устройства.

Альтернативно или дополнительно композицию можно вводить локально путём имплантации мембраны, губки или другого подходящего материала, на котором требуемые молекулы сорбированы или инкапсулированы. При применении такого имплантируемого устройства оно может быть имплантировано в любую подходящую ткань или орган, и высвобождение действующего вещества может происходить путём диффузии, болюсов с определенным временем высвобождения или непрерывного введения.

В некоторых случаях может оказаться желательным применение фармацевтических композиций ех у1уо. В таком случае клетки, ткани или органы, которые были удалены у пациента, подвергают воздействию фармацевтических композиций, после чего указанные клетки, ткани и/или органы имлантируют назад в организм пациента.

В других случаях специфический связывающий агент, который является полипептидом, можно вводить пациенту посредством имплантации определенных клеток, которые подверглись генетической инженерии при помощи методов, некоторые из которых описаны здесь, для обеспечения экспрессии и секреции данного полипептида. Такими клетками могут быть клетки животных или человека, и они могут быть аналогичными, гомологичными или чужеродными. При необходимости клетки могут быть иммортализованы. Для снижения вероятности иммунного ответа клетки могут быть инкапсулированы с целью избежания инфильтрации в окружающие ткани. Материалы для инкапсулирования, как правило, являются биосовместимыми полупроницаемыми полимерными чехлами или мембранами, которые позволяют выход белковых продуктов, но предотвращают разрушение клеток иммунной системой пациента или другими разрушающими факторами окружающих тканей.

Комбинированная терапия.

Специфические связывающие агенты, соответствующие настоящему изобретению, можно применять в сочетании с другими терапевтическими средствами при лечении патологий, связанных с Апд-2. Эти другие терапевтические средства включают радиоактивное облучение, химиотерапию и направленное терапевтическое воздействие, как описывается ниже. Другие виды комбинационной терапии, не перечисленные здесь особо, также попадают в объем настоящего изобретения.

Таким образом, настоящим изобретением охватывается введение одного или более специфических связывающих агентов, соответствующих настоящему изобретению, в сочетании с введением тому же самому пациенту одного или более дополнительного подходящего агента, причем каждый назначается согласно соответствующему данному медикаменту режиму. При этом, в частности, подразумевается, по существу, одновременное введение специфического связывающего агента, соответствующего настоящему изобретению, и одного или нескольких других подходящих агентов.

Под неодновременным введением здесь понимается введение одного или нескольких специфических связывающих агентов, соответствующих настоящему изобретению, и одного или нескольких дополнительных подходящих агентов в различное время, в различном порядке, причем их действие может перекрываться или не перекрываться. При этом, без ограничения, включено последовательное лечение (такое как премедикация, постмедикация или перекрывающееся лечение) компонентами комбинации, а также режимы чередования лекарств или же случаи, когда одно средство вводится в течение долгого времени, а другое (другие) - периодически. Компоненты могут входить в одну или в отдельные композиции, и способы их введения могут быть одинаковыми или же разными.

- 34 011866

В некоторых воплощениях комбинированная терапия включает специфический связывающий агент, способный связывать Апд-2, в сочетании по меньшей мере с одним антиангиогенным препаратом. Эти препараты влючают, без ограничения, синтезированные 1п ν 11го химические композиции, анитела, антигенсвязывающие области, радионуклиды, их сочетания и конъюгаты и др. В некоторых воплощениях такой препарат может действовать как агонист, антагонист, аллостерический модулятор или токсин. В некоторых воплощениях действие препарата может заключаться в ингибировании или стимуляции его мишени (например, в активации или ингибировании рецептора или фермента) и в результате этого - в стимуляции клеточной смерти или остановке клеточного роста.

В химиотерапевтическом лечении могут быть задействованы антинеопластические агенты, такие как азотистые иприты, например мехлоретамин, циклофосфамид, ифосфамид, мефалан и хлорамбуцил; производные нитрозомочевины, например кармустин (ВСЫИ), ломустин (ССЫИ) и семустин (метилССЫи); этиленимины/метилмеламид, такие как триэтиленмеламин (ТЕМ), триэтилентиофосфамид (тиотефа) гексаметилмеламин (ГММ, альтретамин); алкилсульфонаты, такие как бусульфан; триазины, такие как дакарбазин (ЭТК'.'); антиметаболиты, включая аналоги фолиевой кислоты, такие как метатрексат и триметрексат; аналоги пиримидиновых оснований, такие как 5-фторурацил, фтордезоксиуридин, гемцитабин, цитозин-арабинозид (АгаС, цитарабин), 5-азацитидин, 2,2'-дифтордезоксицитидин; аналоги пуриновых оснований, такие как 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, азатиоприн, 2'-дезоксикоформицин (пентостатин), эритрогидроксинониладенин (ЭГНА), флударабина фосфат и 2-хлордезоксиаденозин (кладрибин, 2-СбА); природные препараты, включая антимитотические средства, такие как паклитаксел; алкалоиды барвинка, такие как винбластин (УЪВ), винкристин и винорелбин, таксотер, эстрамустин и эстрамустина фосфат; токсины ноголистника, такие как этопозид и тенипозид; антибиотики, такие как актиномицин Ό, дауномицин (рубидомицин), доксорубицин, митоксантрон, идарубицин, блеомицины, пликамицин (митрамицин), митомицин С и актиномицин; ферменты, такие как Ь-аспарагиназа; модуляторы биологического ответа, такие как альфа-интерферон, 1Ь-2, С-С8Е и СМ-С8Е; разные средства, в том числе координированные комплексы платины, такие как цисплатин и карбоплатин; анрацендионы, такие как митоксантрон; замещённые мочевины, такие как гидроксимочевина; производные метилгидразина, в том числе Ν-метилгидразин (Ν-МГ) и прокарбазин; супрессоры коры надпочечников, такие как митотан (о,р'ΌΌΌ) и аминоглутетимид; гормоны и их антагонисты, в том числе адренокортикостероидные антагонисты, такие как преднизон и его эквиваленты, дексаметазон и аминоглутетимид; прогестины, такие как гидроксипрогестерона капроат, медроксипрогестерона ацетат и мегестрола ацетат; эсторгены, такие как диэтилстильбестрол, и эквиваленты этинилэстрадиола; антиэстрогены, такие как тамоксифен; андрогены, в том числе тестостерона пропионат и эквиваленты флуоксиместерона; антиандрогены, такие как флутамид, аналоги гонадолиберина и лейпролид; нестероидные антиандрогены, такие как флутамид.

Противораковая терапия, которая может применяться вместе со специфическим агентом, связывающим Апд-2, также включает, без оганичения, направленную терапию, как описано здесь. Неограничивающим примером направленной терапии является применение терапевтических антител. Неограничивающим примером терапевтических антител могут служить антитела мышиные, химерные мышиночеловеческие, с пересаженными участками, определяющими комплементарность; гуманизированные и полностью человеческие антитела, а также синтетические антитела, в том числе, например, выбранные при скрининге библиотек антител, и др. Неограничивающими примерами антител могут являться антитела, связывающие белки клеточной поверхности Нег2, СЭС20, СЭС33, муциноподобный гликопротеид и рецептор фактора роста эпидермиса (РФРЭ), представленные на поверхности опухолевых клеток, и в ряде случаев оказывающие цитостатический и/или цитотоксичский эффект на опухолевые клетки, несущие эти белки. Примерами антител также могут служить Херцептин™ (трастузумаб), который может применяться при лечении рака груди и других форм рака, и Ритуксан™ (ритуксумаб), Зевалин™ (ибритумомаб, тиуксетан), Гливек™ и Лимфоцид™ (эпратузумаб), применимые при лечении неходжкиновой лимфомы и других форм рака. Некоторые примеры антител также включают Эрбитукс™ (1МС-С225); Иресса™ (эртинолиб); Бексар™ (йод-131-тоситумомаб); ингибиторы рецептора киназного домена (РКД); антитела к фактору роста эндотелия сосудов (ФРЭС) и его антагонисты (например, Авастин™ и УЕСЕТЯАР (Ловушка ФРЭС)); антитела к рецептору ФРЭС и их антигенсвязывающие области; антитела к Апд-1 и их антигенсвязывающие области; антитела к Т1е-2 и другим рецепторам Апд-1 и Апд-2; лиганды Т1е-2; антитела к ингибиторам Т1е-2-киназы; а также Кампат® (алемтузумаб). В некоторых осуществлениях препаратами для лечения рака являются полипептиды, селективно индуцирующие апоптоз в опухолевых клетках, в том числе родственные ФНО полипептиды, такие как ТЯА1Б (Титог Ыесгокк Еасгог Яесер!ог Арор!ок1к-1пбистд Ыдапб - лиганд рецептора ФНО, индуцирующий апоптоз).

В некоторых воплощениях подходящие агенты для лечения рака известны как антиангиогенные агенты. Некоторые такие агенты включают, без ограничения, 1Ь-8 (интерлейкин-8); СатраФ™, В-ФРФ (фактор роста фибробластов В); антагонисты ФРФ; антагонисты Тек (СеггеШ е! а1., публикация И8 2003/0162712; СеггеФ е! а1., патент И8 6413932, СеггеФ е! а1., патент И8 6521424, каждый из этих документов включен здесь в качестве ссылки для любой цели); агенты против ТVЕАΚ (среди которых, например, антитела, антигенсвязывающие области и др.); антагонисты растворимого рецептора ТVЕΛΚ

- 35 011866 (^УПеу, патент И8 6727225); дизинтегрины АОАМ (или их домены-антагонисты связывания интегрина с его лигандами (Рапк1о\у е1 а1. - публикация И8 2002/0042368)); антитела к рецептору ерН и к эфрину, их антигенсвязывающие области (патенты И8 5981245; И8 5728813; И8 5969110; И8 6596852; И8 6232447; и8 6057124 и другие члены этого семейства патентов); агенты против ФРЭС, как описано здесь (например, антитела или антигенсвязывающие области, которые специфически связывают ФРЭС или растворимые рецепторы ФРЭС, или лиганды, связывающие его области), такие как Авастин™ или УЕСРТВАР™, и агенты против рецептора ФРЭС (например, антитела или антигенсвязывающие области, которые специфически связываются с ним), агенты, подавляющие РФРЭ (например, антитела или антигенсвязывающие области, которые специфически связываются с ним), такие как панитумумаб, Иресса™ (гефитиниб), Тарцева™ (эрлотиниб), агенты против Апд-1 и против Апд-2 (например, антитела или антигенсвязывающие области, которые специфически связываются с ними или с их рецепторами, например Т1е-2/ТЕК), и агенты, подавляющие Т1е-2-киназу (например, антитела или антигенсвязывающие области, которые специфически связываются и подавляют активность факторов роста, такие как антагонисты фактора роста гепатоцитов (ФРГ, также известного как фактор Скаттера)), антитела или антигенсвязывающие области, которые специфически связывают его рецептор с-Мет; антагонисты ФРТ-ВВ (фактора роста тромбоцитов-ВВ); антитела или антигенсвязывающие области к лигандам ФРТ-ВВ и ингибиторы киназы рецептора ФРТ.

В некоторых воплощениях подходящие агенты для терапии рака известны как ингибиторы ангиогенеза. Некоторыми из таких ингибиторов являются 80-7784 (РПхег, США); циленгитид (Мегск КСаА, Германия, ЕРО 770622); октанатрия пегаптаниб (СПеай 8с1епсек, США); альфастатин (ВюАс!а, Великобритания); М-РСА (Се1депе, США, И8 5712291); иломастат (Атта, США, И8 5892112); семаксаниб (РПхег, США, и8 5792783); ваталаниб (ШтагОк, Швейцария); 2-метоксиэстрадиол (ЕпйеМей, США); ТЬС ЕЬЬ-12 (Е1ап, Ирландия); анекортава ацетат (А1соп, США); альфа-0148 МаЬ (Атдеп, США); СЕР-7055 (СерНа1оп, США); анти-Уп МаЬ (Сгисе11, Нидерланды); ОАС:апйапдюдешс (СопщСйет, Канада); ангиоцидин (1пКте Рйагтасеийса1, США); КМ-2550 (Куо^а Накко, Япония); 8И-0879 (РПхег, США); ССР-79787 (Ыотагйк, Швейцария, ЕР 970070); технология АРГЕНТ (Апай, США); ΥЮ8В-8ΐеа1Ш, (1ойпкоп&1ойикоп, США); Е-фрагмент фибриногена (ВюАс!а, Великобритания); ингибитор ангиогенеза (Тпдеп, Великобритания); ТВС-1635 (ЕпсукВе Рйагтасеийса1к, США); 8С-236 (РПхег, США); АВТ-567 (АЬЬой, США); метастатин (ЕпйеМей, США); ингибитор ангиогенеза (Тпрер, Швеция); маспин (8оке1, Япония); 2-метоксиэстрадиол (Опсо1оду 8с1епсек Согрогайоп, США); ЕВ-68203-00 (1УАХ, США); бенефин (Йапе ЬаЬк, США); Тх-93 (Ткитига, Япония); ТАЮ 1120 (Такейа, Япония); РВ-111142 (Рицката, Япония, ДР 02233610); фактор роста тромбоцитов 4 (ВерйСеп, США, ЕР 407122); антагонист фактора роста эндотелия сосудов (Вогеап, Дания); сапсег (Негару (средство от рака) ШштегкИу оГ 8ои111 Сагойпа, США); бевацизумаб φΙΝΝ) (Сепеп!есй, США); ингибиторы ангиогенеза (8иСЕЫ, США); ХЬ 784 (Ехе11х1к, США); ХЬ 647 (Ехейх1к, США); моноклональные антитела к альфа5 бета3-интегрину второго поколения (Аррйей Мо1еси1аг Ето1ийоп, США и Мей1ттипе, США); генетическая терапия, ретинопатия (ОхГогй ВюМейюа, Великобритания); энзастаурина гидрохлорид (И8АЦ) (ЬШу, США); СЕР 7055 (СерНа1оп, США и 8апой-8упШе1аЬо, Франция); ВС 1 (Генуэзский институт раковых исследований, Италия); ингибитор ангиогенеза (А1сйеш1а, Австралия); антагонист ФРЭС (Ведепегоп, США); гВР1 21 и ВР1производные антиангиогенные средства (ХОМА, США); Р1 88 (Ргодеп, Австралия); циленгитид φΙΝΝ) (Мегск КСаА; Мюнхенский технический университет, Германия, и Клиника и исследовательский фонд Скриппса, США); цетуксимаб (ΙΝΝ) (Атепйк, Франция); АУЕ 8062 (АрнотоЮ, Япония); А8 1404 (Лаборатория раковых исследований, Новая Зеландия); 8С 292 (Тейок, США); эндостатин (Бостонский детский госпиталь, США); А'ТЫ 161 (Айепиоп, США); ангиостатин (Бостонский детский госпиталь, США); 2-метоксиэстрадиол (Бостонский детский госпиталь, США); ΖΏ 6474 (Акй^епеса, Великобритания); ΖΏ 6126 (Апдюдепе Рйагтасеийса1к, Великобритания); РР1 2458 (Ргаес1к, США); ΑΖ^ 9935 (Акй^епеса Великобритания); ΑΖ^ 2171 (Акй^епеса, Великобритания); ваталаниб φΙΝΝ) (ШтагОк, Швейцария и 8сНеппд АС, Сегтапу); ингибиторы обмена тканевых факторов (ЕпйеМей, США); пегаптаниб (Р1пп) (Сйеай 8с1епсек, США); ксанторризол (Университет Ёнсей, Южная Корея); генетически-основанная вакцина ФРЭС-2 (Клиника и исследовательский фонд Скриппса, США); 8РУ5.2 (8ирга!ек, Канада); 8ОХ 103 (Университет Калифорнии в Сан-Диего, США); РХ 478 (Рго1Х, США); метастатин (ЕпйеМей, США); тропонин I (Гарвардский университет, США); 8и 6668 (8иСЕЫ, США); ОХ1 4503 (ОХЮЕЯЕ, США); о-гуанидины (О1тепкюпа1 Рйагтасеийса1к, США); мотупорамин С (Университет Британской Колумбии, Канада); СОР 791 (СеШесН Сгоир, Великобритания); атипримод φΙΝΝ) (С1аxо8шййК1^ηе, Великобритания); Е 7820, (Е1ка1, Япония); СΥС 381 (Гарвардский университет, США); АЕ 941 (Ае!ета, Канада); тассте, апдюдепеык (вакцина против ангиогенеза) (ЕпйеМей, США); ингибитор активатора плазминогена урокиназы (Оепйгеоп, США); оглуфанид φΙΝΝ) (Ме1тойе, США); ингибиторы Н1Р-1альфа (Хепота, Великобритания); СЕР 5214 (СерНа1оп, США); ВΑΥ ВЕ8 2622 (Вауег, Германия); ангиоцидин (1пКте, США); А6 (Апдкйот, США); КВ 31372 (Корейский исследовательский институт химической технологии, Южная Корея); СXV 2286 (С1ахо8тйНК1те, Великобритания); ЕНТ 0101 (ЕхопНй, Франция); СР 868596 (РПхег, США); СР 564959 (О81, США); СР 547632 (РП/ег США); 786034 (С1ахо8тййК1те,

- 36 011866

Великобритания); ΕΚΉ 633 (Киш Вгетегу, Япония); 2-метоксиэстрадиол и интраокулярная система введения лекарств (ЕпВеМеб, США); ангинекс (Университет Маастрихта, Нидерланды и Университет Миннесоты, США); АВТ 510 (ЛЬЬоН. США); АЛЬ 993 (ШуаПЬ. Швейцария); УЕС1 (Рго1еотТесН. США); ингибиторы фактора некроза опухолей-альфа (Национальный институт старения США); 8и 11248 (РШег, США, и §иСЕ№ США); АВТ 518 (АЬЬой, США); УН16 (УапЕи Вопдсйапд, Китай); 8-3АРС (Бостонский детский госпиталь, США, и ЕпйеМей, США); МАЬ, КДР (киназа рецепторного домена) (1тС1опе 8у51етз, США); МАЬ, альфа5 бета1 (Рго1еш Эезхдп, США); ингибитор киназы КДР (Се1Йесй Сгоир, Великобритания и Зойизоп&Зойизоп, США); СРВ 116 (Университет Южной Флориды, США, и Йельский университет, США); С8 706 (8апкуо, Япония); пролекарство комбретастатин А4р (Университет штата Аризона, США); хондроитиназа АС (1ВЕХ, Канада); ВАУ ВЕ8 2690 (Вауег, Германия); АСМ 1470 (Гарвардский университет, США, Такеба, Япония, и ТАР, США); АС 13925 (Адоигоп, США); тетратиомолибдат (Университет Мичигана, США); СС8 100 (Университет штата Вэйн, США); СУ 247 (1уу Меб1са1, Великобритания); СКЭ 732 (Сйопд Кип Эапд, Южная Корея); моноклональные антитела к фактору роста эндотелия сосудов (Хепоуа, Великобритания); ирсогладин (1№И) (№рроп 8й1пуаки, Япония); ВС 13577 (Ауепйз, Франция); XVX 360 (У11ех, Германия); скваламин (рШЯ) (Сепаега, США); ВР14610 (81гпа, США); сапсег Легару (лекарство от рака) (Маппоуа, Австралия); ингибиторы гепараназы (1п81дй1, Израиль); КЬ 3106 (Ко1оп, Южная Корея); Гонокиол (Университет Эмори, США); 2К СЭК (8сйеппд АС, Германия); 2К Апдю (8сйеппд АС, Германия); 2К 229561 (КоуаЛЬ, Швейцария, и 8сйелпд АС, Германия); ХМР 300 (Х0МА, США); УСА 1102 (Та1зйо, Япония); модуляторы рецептора ФРЭС (Рйагтасоре1а, США); антагонисты УЕ-кадерина-2 (1тС1опе 8у51етз, США); вазостатин (Национальные институты здоровья, США); вакцина Р1к-1 (1тС1опе 8у51ет5, США); Т2 93 (Тзитига, Япония); Тит81айп (Госпиталь Бэйт-Исраэль, США); усечённая растворимая форма РЬТ 1 (рецептора фактора роста сосудистого эндотелия-1) (Мегск&Со., США); лиганды Т1е-2 (Ведепегоп, США); ингибитор тромбоспондина 1 (Фонд образования и исследований А11едйепу Неайй, США); 2-бензолсульфонамид-4-(5-(4-хлорфенил)-3(трифторметил)-1Н-пиразол-1-ил)-; Аглуа и С-Мет. АУЕ 8062 ((28)-2-амино-3-окси-Ы-[2-метокси-5[(12)-2-(3,4,5-триметоксифенил)этенил]фенил]пропанамида моногидрохлорид); метелимумаб (рШЯ) (иммуноглобулин С4 к человеческому трансформирующему фактору роста бета1 (человеческие моноклональные САТ, цепь гамма4), дисульфидный димер с каппа-цепью человеческих моноклональных САТ 192); лиганд Е113; лиганд СЭ40; интерлейкин-2; интерлейкин-12; лиганд 4-1ВВ; антитела к 4-1ВВ; антагонисты ФНО и антагонисты рецептора ФНО, в том числе рецептор ФНО/Рс, антагонисты ТУЕАК и антагонисты ТУЕАК-В, в том числе ТУЕАК-В/Рс; ТВА1Б; антагонисты ФРЭС, в том числе антитела к ФРЭС; антагонисты рецептора ФРЭС (в том числе ФРЭС-В1 и ФРЭС-В2, известные также, как РЙ1 и Р1к1 или КДР); агонисты СЭ 148 (известного нам также как ЭЕР-1, ЕСВТР и РТРВ1, см. Такайазй1 е1 а1., I. Ат. 8ос. №рйго1. 10: 2135-45 (1999), включено здесь путем ссылки); ингибитор тромбоспондина 1, а также ингибиторы одного или обоих лигандов Т1е-2 или Т1е-2 (таких как Апд-2). Специалистам известно множество ингибиторов Апд-2, в том числе некоторые антитела к Апд-2, описанные в опубликованной патентной заявке И8 20030124129 (соответствующей международной заявке У0 03/030833) и в патенте И8 6166185, содержание которых полностью включено в описание путем ссылки. Кроме того, пептидные антитела к Апд-2 также известны специалистам, сведения о них опубликованы, например, в заявке И8 20030229023 (соответствующей международной заявке У0 03/057134) и в заявке И8 20030236193, содержание которых полностью включено здесь путем ссылки.

Некоторыми средствами лечения рака являются, например, талидомид и его аналоги (№(2,6-диоксо-3-пиперидил)фталимид); текогалан-натрий (сульфированный полисахарид пептидогликан); ТАN 1120 (8-ацетил-7,8,9,10-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-1-метокси-10-[[октагидро-5-гидрокси2-(2-5-гидроксипропил)-4,10-диметилпирано[3,4-й]-1,3,6-диоксазоцин-8-ил]окси]-5,12-нафтациндион); сурадиста (7,7'-[карбонил-бис-[имино(1-метил-1Н-пиррол-4,2-диил)карбонилимино(1-метил-1Н-пиррол4,2-диил)карбонилимино]]-бис-1,3-нафталиндисульфоновой кислоты четырёхнариевая соль); 8И 302; 8И 301; 8И 1498 ((Е)-2-циано-3-[4-гидрокси-3,5-бис-(1-метилэтил)фенил]-Ы-(3-фенилпропил)-2пропенамид); 8И 1433 (4-(6,7-диметил-2-хиноксалинил)-1,2-бензолдиол); 8Т 1514; 8В 25989; растворимый Т1е-2; производные селективного модулятора рецептора экстрогена, Фармос; семаксаниб (рШЯ) (3-[(3,5-диметил-1Н-пиррол-2-ил)метилен]-1,3-дигидро-2Н-индол-2-он); 8 836; ВС 8803; рестин; В 440 (3 -(1-метил-1Н-индол-3 -ил)-4-(1 -метил-6-нитро-1Н-индол-3 -ил)-1Н-пиррол-2,5-дион); В 123942 (1-[6-(1,2,4-тиадиазол-5-ил)-3-пиридазинил]-М-[3-(трифторметил)фенил]-4-пиперидинамин); ингибитор пропилгидроксилазы; гены повышенной прогрессии; приномастат (1ИК) ((8)-2,2-диметил-4-[[п-(4пиридилокси)фенил]сульфонил]-3-тиоморфолинкарбогидроксамовая кислота); NУ 1030; ИМ 3 (8-гидрокси-6-метокси-альфа-метил-1-оксо-1Н-2-бензопиран-3-уксусная кислота); № 681; Ж 050; М1С; МЭТ 2; МЭТ 1; манассантин В (альфа-[1-[4-[5-[4-[2-(3,4-диметоксифенил)-2-гидрокси-1-метилэтокси]-3метоксифенил]тетрагидро-3,4-диметил-2-фуранил]-2-метоксифенокси]этил]-1,3-бензодиоксол-5метанол); моноклональные антитела к РДК (рецептору киназного домена); антитела против альфа5бета3интегрина; ЬУ 290293 (2-амино-4-(3-пиридинил)-4Н-нафто[1,2-Ь]пиран-3-карбонитрил); КР 0201448; КМ 2550; интегринспецифические пептиды; INСN 401; СУК1 66475; СУК1 66462; гринстатин (101-354плазминоген (человеческий)); генная терапия ревматоидного артрита, рака предстательной железы, рака

- 37 011866 яичника, глиомы, рака прямой и толстой кишки, эндостатин, АТЕ ВТРк гены против ангиогенеза, ингибитор ангиогенеза; ингибитор желатиназы, ЕВ 111142 (4,5-дигидрокси-2-гексеновой кислоты 5-метокси4-[2-метил-3-(3-метил-2-бутенил)оксиранил]-1-оксаспиро[2.5]окт-6-иловый эфир); форфенимекс (рШЫ) (^)-альфа-амино-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)бензолуксусная кислота); антагонист фибронектина (1-ацетил-Е-пролил-Е-гистидил-Е-серил-Е-цистеинил-Ь-аспартамид); ингибитор рецептора фактора роста фибробластов; антагонист фактора роста фибробластов; ЕСΕ 27164 (7,7'-[карбонил-бис-[имино(1метил-1Н-пиррол-4,2-диил)карбонилимино(1-метил-1Н-пиррол-4,2-диил)карбонилимино]]-бис-1,3,5нафталинтрисульфоновой кислоты шестинатриевая соль); ЕСΕ 26752 (8,8'-[карбонил-бис-[имино(1метил-1Н-пиррол-4,2-(диил)карбонилимино(1-метил-1Н-пиррол-4,2-диил)карбонилимино]]-бис-1,3,6нафталинтрисульфоновая кислота); полипептид, активирующий эндотелиальные моноциты ΙΙ; антисенсолигонуклеотид рецептора ФРЭС; антиангиогенный и трофический факторы; ангиостатический агент АNСН0В; эндостатин; ангиогенный белок Эе1-1; СТ 3577; контортростатин; СМ 101; хондроитиназа АС; СОР 845; Са^1айп; ΒδТ 2002; ΒδТ 2001; ΒΙ.δ 0597; ΒΙΒΕ 1000; аррестин; апомигрен (1304-1388коллаген типа XV (человеческий ген предшественника С0Ь15А1 альфа-1-цепи)); ангиоингибин; ааАТШ; А 36; 9альфа-фтормедроксипрогестерона ацетат ((6-альфа)-17-(ацетилокси)-9-фтор-6-метил-прегн-4-ен3,20-дион); 2-метил-2-фталимидиноглутаровая кислота (2-(1,3-дигидро-1-оксо-2Н-изоиндол-2-ил)-2метилпентандиовая кислота); моноклональные антитела ВС-1, меченые иттрием-90; Семаксаниб (3-(4,5диметилпиррол-2-илметилен)индолин-2-он) (С^Ш/Ц^); РI 88 (фосфоманнопентозы сульфат); альвоцидиб (4Н-1-бензопиран-4-он), 2-(2-хлорфенил)-5,7-дигидрокси-8-(3-гидрокси-1-метил-4-пиперидинил)цис-(-)-)(С₂1Н₂₀СШ0₅); Ε 7820; δυ 11248 (5-[3-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-(32)-илиденметил]-2,4диметил-1Н-пиррол-3-карбоксикислоты (2-диэтиламиноэтил)амид) (С₂₂Н₂₇Е^0₂); скваламин (холестан7,24-диол, 3-[3-[(4-аминобутил)аминопропил]амино]-, 24-(гидросульфат), (3бета,5альфа,7альфа)-) (Сз₄Н₆5Nз05δ); эриохром чёрный Т; АСМ 1470 (карбаминовой кислоты (хлорацетил)-, 5-метокси-4-[2метил-3 -(3-метил-2-бутенил)оксиранил]- 1-оксаспиро[2,5]окт-6-иловый эфир, [3В-[3 альфа,4альфа(2В,

3В),5бета,6бета]]) (С₁₉Н₂₈СШ0₆); ΆΖΌ 9935; ΒΙΒΕ 1000; ΆΖΌ 2171; АВТ 828; К8-интерлейкин-2; утероглобин; А 6; N80 639366 (1-[3-(диэтиламино)-2-гидроксипропиламино]-4-(оксиран-2илметиламино)антрахинона фумарат) (С₂₄Н₂9^0₄-С/|Н₄0₄); Ιδν 616; конъюгированные белки против ΕΌΒ; ΠυΙ 77; тропонин Ι; моноклональные антитела ВС-1; δРV 5.2; ΕΒ 68203; СкО 731 (3-(3,4,5-триметоксифенил)-2(Е)-пропеновой кислоты (3В,4δ,5δ,6В)-4-[2(В)-метил-3(В)-3(В)-(3-метил-2бутенил)оксиран-2-ил]-5-метокси-1-оксаспиро[2.5]окт-6-иловый эфир) (С₂₈Н₃₈0₈); ШСЛСП; ааАТШ; 8с 7; СМ 101; ангиокол; Кгтд1е 5; СКО 732 (3-[4-[2-(диметиламино)этокси]фенил]-2(Е)-пропеновая кислота) (С₂₉Н₄^0₆); υ 995; канстатин; δθ 885; СТ 2584 (1-[1-(додециламино)-10-гидроксиундецил]-3,7диметилксантин) (С₃₀Н₅₅№0₃); сальмостин; ЕМАР ΙΙ; ТХ 1920 (1-(4-метилпиперазино)-2-(2-нитро-1Н-1имидазолил)-1-этанон) (С₁₀Н₁₅№0₃); ингибитор альфа-ν бета-х; СШВ 11509 (№(1-пропинил)глицил-[№ (2-нафтил)]глицил-[№(карбамоилметил)]глицин-бис-(4-метоксифенил)метиламид) (С₃₃Н₃-№0₆);

ΒδТ 2002; ΒδТ 2001; В 0829; ЕВ 111142; 4,5-дигидрокси-2(Е)-гексеновой кислоты (3Β,4δ,5δ,6Β)-4[1(В),2(В)-эпокси-1,5-диметил-4-гексенил]-5-метокси-1-оксаспиро[2.5]октан-6-иловый эфир (С22Н3407) и ингибиторы киназ, в том числе, например, №(4-хлорфенил)-4-(4-пиридинилметил)-1-фталазинамин; 4-[4-[[[[4-хлор-3-(трифторметил)фенил]амино]карбонил]амино]фенокси]-Ы-метил-2-пиридинкарбоксамид; №[2-(диэтиламино)этил]-5-[(5-фтор-1,2-дигидро-2-оксо-3Н-индол-3-илиден)метил]-2,4диметил-1Н-пиррол-3-карбоксамид; 3-[(4-бромо-2,6-дифторфенил)метокси]-5-[[[[4-(1-пирролидинил)бутил]амино]карбонил]амино]-4-изотиазолкарбоксамид; №(4-бром-2-фторфенил)-6-метокси-7-[(1-метил4-пиперидинил)метокси]-4-хиназолинамин; 3-[5,6,7,13-тетрагидро-9-[(1-метилэтокси)метил]-5-оксо-12Ниндено[2,1-а]пирроло[3,4-с]карбазол-12-ил]пропиловый эфир ^№диметилглицина; №[5-[[[5-(1,1диметилэтил)-2-оксазолил]метил]тио]-2-тиазолил]-4-пиперидинкарбоксамид; №[3-хлор-4-[(3фторфенил)метокси]фенил]-6-[5-[[[2-(метилсульфонил)этил]амино]метил]-2-фуранил]-4-хиназолинамин; 4-[(4-метил-1-пиперазинил)метил]-Ы-[4-метил-3-[[4-(3-пиридинил)-2-пиримидинил]амино]фенил]бензамид; №(3-хлор-4-фторфенил)-7-метокси-6-[3-(4-морфолинил)пропокси]-4-хиназолинамин; N-(3этинилфенил)-6,7-бис-(2-метоксиэтокси)-4-хиназолинамин; N-(3 -((((2В)-1 -метил-2-пирролидинил)метил)окси)-5-(трифторметил)фенил)-2-((3 -(1,3-оксазол-5-ил)фенил)амино)-3 -пиридинкарбоксамид; 2-(((4-фторфенил)метил)амино)-И-(3-((((2В)-1-метил-2-пирролидинил)метил)окси)-5-(трифторметил)фенил)-3-пиридинкарбоксамид; №[3-(азетидин-3-илметокси)-5-трифторметилфенил]-2-(4-фторбензиламино)никотинамид; 6-фтор-И-(4-(1-метилэтил)фенил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; 2-((4-5-пиридинилметил)амино)-N-(3-(((2δ)-2-пирролидинилметил)окси)-5-(трифторметил)фенил)-3-пиридинкарбоксамид; N-(3 -(1,1 -диметилэтил)-1Н-пиразол-5-ил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; №(3,3-диметил-2,3-дигидро-1-бензофуран-6-ил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; N-(3-((((2δ)-1-метил-2-пирролидинил)метил)окси)-5-(трифторметил)фенил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; 2-((4-пиридинилметил)амино)-Ы-(3 -((2-(1 пирролидинил)этил)окси)-4-(трифторметил)фенил)-3-пиридинкарбоксамид; №(3,3-диметил-2,3-дигидро1Н-индол-6-ил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; N-(4-(пентафторэтил)-3-(((2δ)-2пирролидинилметил)окси)фенил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; N-(3 -((3 -азетидинилметил)окси)-5-(трифторметил)фенил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид;

- 38 011866 №(3-(4-пиперидинилокси)-5-(трифторметил)фенил)-2-((2-(3-пиридинил)этил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; №(4,4-диметил- 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)-2-(1Н-индазол-6-иламино)никотинамид;

2-(1Н-индазол-6-иламино)-№[3-(1-метилпирролидин-2-илметокси)-5-трифторметилфенил]никотинамид; №[1-(2-диметиламиноацетил)-3,3-диметил-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил]-2-(1Н-индазол-6-иламино)никотинамид; 2-(1Н-индазол-6-иламино)-№[3-(пирролидин-2-илметокси)-5-трифторметилфенил]никотинамид; №(1-ацетил-3,3-диметил-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил)-2-(1Н-индазол-6-иламино)никотинамид;

№(4,4-диметил-1 -оксо-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)-2-(1Н-индазол-6-иламино)никотинамид; №[4-(трет-бутил)-3 -(3 -пиперидилпропил)фенил][2-(1Н-индазол-6-иламино)(3 -пиридил)]карбоксамид; №[5-(трет-бутил)изоксазол-3-ил][2-(1Н-индазол-6-иламино)(3-пиридил)]карбоксамид и №|4-(третбутил)фенил][2-(1Н-индазол-6-иламино)(3-пиридил)]карбоксамид и ингибиторы киназ, описанные в патентах И8 6258812; И8 6235764; И8 6630500; И8 6515004; И8 6713485; И8 5521184; И8 5770599; И8 5747498; И8 5990141 и патентных заявках И8 20030105091, №0 01/37820; №0 01/32651; №0 02/68406; №0 02/66470; №0 02/55501; №0 04/05279; №0 04/07481; №0 04/07458; №0 04/09784; №0 02/59110; №0 99/45009; №0 98/35958; №0 00/59509; №0 99/61422; №0 00/12089 и №0 00/02871, каждая из них включена здесь путем ссылки для любой цели.

В сочетанной терапии с факторами роста могут применяться цитокины, лимфокины, факторы роста или другие факторы гематопоэза, такие как МКСФ (макрофагоколониестимулирующий фактор), ГМКСФ (гранулоцитомакрофагоколониестимулирующий фактор), ФНО, 1Ь-1 (интерлейкин-1), 1Ь-2, Ш-3, Ш-4, Ш-5, 1Ь-6, Ш-7, 1Ь-8, 1Ь-9, 1Ь-10, 1Ь-11, 1Ь-12, 1Ь-13, 1Ь-14, 1Ь-15, 1Ь-16, 1Ь-17, 1Ь-18, интерферон, ФНО0, ФНО1, ФНО2, ГКСФ (гранулоцитоколониестимулирующий фактор), МегКСФ (мегакариоцитоколониестимулирующий фактор), ГМКСФ, тромбопоэтин, фактор стволовых клеток и эритропоэтин. Среди других веществ могут иметь место известные ангиопоэтины, такие как Апд-1, -2, -4, -Υ, и/или человеческий Лпд-подобный полипептид, и/или фактор роста сосудистого эндотелия (ФРЭС). Факторами роста являются ангиогенин, костный морфогенный белок-1, костный морфогенный белок-2, костный морфогенный белок-3, костный морфогенный белок-4, костный морфогенный белок-5, костный морфогенный белок-6, костный морфогенный белок-7, костный морфогенный белок-8, костный морфогенный белок-9, костный морфогенный белок-10, костный морфогенный белок-11, костный морфогенный белок-12, костный морфогенный белок-13, костный морфогенный белок-14, костный морфогенный белок-15, рецептор костного морфогенного белка-1А, рецептор костного морфогенного белка-1В, нейротрофный фактор мозгового происхождения, ресничный нейротрофный фактор, рецептор ресничного нейротрофного фактора, индуцируемый цитокинами фактор хемотаксиса нейтрофилов-1, индуцируемый цитокинами фактор хемотаксиса нейтрофилов-2, фактор роста эндотелиальных клеток, эндотелии-1, фактор роста эпидермиса, аттрактант нейтрофилов эпителиального происхождения, фактор роста фибробластов-4, фактор роста фибробластов-5, фактор роста фибробластов-6, фактор роста фибробластов-7, фактор роста фибробластов-8, фактор роста фибробластов-8Ь, фактор роста фибробластов-8с, фактор роста фибробластов-9, фактор роста фибробластов-10, кислый фактор роста фибробластов, основный фактор роста фибробластов, рецептор нейротрофного фактора из линии глиальных клеток-1, рецептор нейротрофного фактора из линии глиальных клеток-2, белок, связанный с ростом; белок, связанный с ростом-2, белок, связанный с ростом-3; гепаринсвязывающий эпидермальный фактор роста, фактор роста гепатоцитов, рецептор фактора роста гепатоцитов, инсулиноподобный фактор роста-1, рецептор инсулиноподобного фактора роста, инсулиноподобный фактор роста-ΙΙ, белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста; фактор роста кератоцитов, фактор, подавляющий лейкемию; рецептор фактора, подавляющего лейкемию-1; фактор роста нервов и его рецептор, нейротрофин-3, нейротрофин-4, плацентарный фактор роста, плацентарный фактор роста-2, фактор роста эндотелиальных клеток из кровяных пластинок, фактор роста из кровяных пластинок, фактор роста из кровяных пластинок цепь А, фактор роста из кровяных пластинок АА, фактор роста из кровяных пластинок АВ, фактор роста из кровяных пластинок цепь В, фактор роста из кровяных пластинок ВВ, рецептор фактора роста из кровяных пластинок-1, рецептор фактора роста из кровяных пластинок-2, фактор стимуляции роста предшественников В-клеток, фактор стволовых клеток, рецептор фактора стволовых клеток, трансформирующий фактор роста-1, трансформирующий фактор роста-2, трансформирующий фактор роста-3, трансформирующий фактор роста-4, трансформирующий фактор роста-5, латентный трансформирующий фактор роста-1, белок Ι, связывающий трансформирующий фактор роста-1; белок ΙΙ, связывающий трансформирующий фактор роста-1; белок ΙΙΙ, связывающий трансформирующий фактор роста-1; рецептор фактора некроза опухолей 1 типа (ФНО-Р1), рецептор фактора некроза опухолей 2 типа (ФНО-Р2), рецептор активатора плазминогена урокиназного типа, фактор роста эндотелия сосудов, а также химерные белки и биологически или иммунологически активные их фрагменты.

Очевидно, что специфические связывающие агенты, соответствующие настоящему изобретению, можно вводить с одним или несколькими противовоспалительными агентами. Под противовоспалительным агентом здесь понимается любое вещество, которое снижает воспаление или опухание у пациента. Здесь приводится множество примеров противовоспалительных агентов, однако следует понимать, что могут существовать и другие приемлемые противовоспалительные агенты, которые не указаны здесь конкретно, но которые, тем не менее, охватываются настоящим изобретением.

- 39 011866

Противовоспалительным агентом может являться, например, соединение, которое подавляет взаимодействие противовоспалительных цитокинов с их рецепторами. Примерами ингибиторов цитокинов, применимых в сочетании со специфическими связывающими агентами, соответствующими настоящему изобретению, являются, например, антагонисты (такие как антитела) ТРФ-бета, а также антагонисты (такие как антитела), направленные против интерлейкинов, вовлечённых в воспалительный процесс. Такими интерлейкинами, описанными здесь, предпочтительно являются, например, 1Ь-1, 1Ь-2, 1Ь-3, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6, 1Ь-8, 1Ь-9, 1Ь-11, 1Ь-12, 1Ь-13, 1Ь-17, 1Ь-18 и др. (см. Еедбаб, е! а1., Егопбегк ίη ВюксЕ, 2: 12-26 (1997)).

Специфические связывающие агенты по настоящему изобретению можно также вводить в сочетании с ингибиторами протеинкиназы А типа I для усиления пролиферации Т-клеток у ВИЧинфицированных пациентов, получающих антиретровирусную терапию.

Факторы роста нервов (ФРН) также можно комбинировать со специфическими связывающими агентами, соответствующими настоящему изобретению, при лечении определённых состояний. Такими состояниями являются нейродегенеративные заболевания, повреждения спинного мозга и множественный склероз. Другими состояниями, котрые можно лечить такой комбинацией, являются глаукома и диабет.

Предпочтительный вариант комбинированной терапии относится к специфическому связывающему агенту, соответствующему настоящему изобретению, вводящемуся пациенту в сочетании с одним или несколькими приемлемыми ингибиторами 1Ь-1 (интерлейкина-1). Ингибиторами 1Ь-1 являются, например, рецепторсвязывающие пептидные фрагменты 1Ь-1, антитела к 16-1 или 1Ь-1-бета или рецептора 1Ь-1 типа 1 и рекомбинантные белки, содержащие целиком или частично молекулы рецепторов 1Ь-1 или их модифицированные варианты, в том числе генетически модифицированные мутеины, олигомерные формы и составы с замедленным высвобождением. Специфическими антагонистами являются полипептиды 1Ь-1га, ингибиторы 1Ь-1-бета-превращающего фермента, антагонистические антитела κ-рецептора 1Ь-1 типа 1, формы рецепторов 1Ь-1 типа 1 и типа 2, связывающие 1Ь-1; антитела к 1Ь-1, в том числе к 1Ь-1 альфа и Ш-1 бета и другим членам семейства 1Ь-1, а также средство, известное как ловушка Ш-1 (Яедепегоп). Полипептиды 1Ь-1га являются формами 1Ь-1га, описанными в патенте И8 5075222, а также модифицированными формами и вариантами, в том числе описанными в И8 5922573, XVО 91/17184, Χνϋ 92/16221 νθ 96/09323. Ингибиторами 1Ь-1-бета-превращающего фермента (1СЕ - 1Ь-1-Ье!а сопуебШд епхуте) являются пептидильный и низкомолекулярный ингибиторы, в том числе описанные в международных заявках νϋ 91/15577; νϋ 93/05071; νϋ 93/09135; νϋ 93/14777 и νϋ 93/16710, а также в заявке на европейский патент ЕР 0547699. Непептидильные соединения включают описанные в международной заявке νϋ 95/26958, патенте И8 5552400, патенте И8 6121266 и в статье Эо11е е! а1., 1. Меб. С1ет., 39, р. 2438-2440 (1996). Другие ингибиторы 1СЕ описаны в патентах И8 6162790, И8 6204261, И8 6136787, И8 6103711, И8 6025147, И8 6008217, И8 5973111, И8 5874424, И8 5847135, И8 5843904, И8 5756466, И8 5656627, И8 5716929. 1Ь-1-связывающие формы рецепторов 1Ь-1 типов I и II описаны в патентах И8 4968607, И8 4968607, И8 5081228, И8 Яе 35450, И8 5319071 и И8 5350683. Другие подходящие антагонисты ГС-1 включают, без ограничения, пептиды, происходящие из ГС-1, которые способны конкурентно связываться с сигнальным рецептором ГС-1 (ГС-1 Я типа I). Дополнительные сведения по различным антагонистам ГС-1 (и других цитокинов) можно найти в патенте И8 6472179.

Кроме того, подходящими являются ингибиторы ФНО, которые включают, без ограничения, рецепторсвязывающие пептидные фрагменты ФНОа, противосмысловые олигонуклеотиды и рибозимы, подавляющие выработку ФНОа, антитела к ФНОа и рекомбинантные белки, несущие рецепторы ФНОа, целиком или частями, а также их модифицированные формы, в том числе генетически модифицированные мутеины, олигомерные формы и составы с длительным высвобождением. Пригодными являются также ингибиторы ТАСЕ (Титог №сгок18 Еас!ог-а Сопуегбпд Епхуте - ФНОа-превращающий фермент), такие как ТАРI (Титог №сгок18 Еас!ог-а Рго!еаке [пЫЬПог - ингибитор протеазы ФНОа) Цттипех Согр.) и Ον-3333Χ (С1ахо Vе11соте Шс.). Пригодны и молекулы, подавляющие образование комплекса ^А-а^Т, например пептиды, описанные в ЕР 0614464 В, либо антитела к этому комплексу. Другими пригодными молекулами являются, например, ФНОа-ингибирующие дисахариды, сульфатированные производные глюкозамина или другие сходные углеводы, описанные в патенте И8 6020323. Кроме того, пригодными молекулами являются пептидные ингибиторы ФНОа, описанные в патентах И8 5641751 и И8 5519000, а также пептиды, содержащие Ό-аминокислоты, описанные в патенте И8 5753628. Сверх того, пригодны также ингибиторы ФНОа-превращающего фермента. νϋ 01/03719 описывает и другие средства, которые могут найти применение в сочетании, соответствующем настоящему изобретению.

Другими подходящими средствами являются, например, низкомолекулярные вещества, такие как талидомид и его аналоги, пентоксифиллин или ингибиторы матриксной металлопротеазы (ММП), а также другие низкомолекулярные вещества. Подходящими ингибиторами ММП для этих целей являются, например, описанные в патентах И8 5883131, И8 5863949 и И8 5861510, а также меркаптоалкилпептидильные соединения, описанные в патенте И8 5872146. Другими низкомолекулярными веществами, способными снижать продукцию ФНОа, являются, например, описанные в патентах И8 5508300,

- 40 011866 и8 5596013 и и8 5563143. Другими пригодными низкомолекулярными веществами являются, без ограничения, ингибиторы ММП, описанные в патентах И8 5747514 и И8 5691382, и производные гидроксамовой кислоты, такие как описанные в И8 5821262. Прочие подходящие молекулы представляют собой, к примеру, низкомолекулярные соединения, которые ингибируют выработку фосфодиэстеразы Ιν и ФНОа, такие как замещённые производные оксимов (\У0 96/00215), хинолинсульфонамиды (патент и8 5834485), производные арилфурана (\У0 99/18095) и гетероциклические производные (\У0 96/01825; 6Β 2291422 А). Пригодны и производные тиазола, ингибирующие ФНОа и интерферон-γ (\У0 99/15524), а также ксантиновые производные, ингибирующие ФНОа и другие провоспалительные цитокины (см., например, патенты И8 5118500, И8 5096906 и И8 5196430). Дополнительные низкомолекулярные вещества, применимые в лечении описанных здесь состояний, представляют собой соединения, описанные в патенте И8 5547979.

Другими примерами лекарств и типов лекарств, которые можно вводить в рамках комбинированной терапии, включают, без ограничения, антивирусные средства, антибиотики, анальгетики (например, ацетаминофен кодеин, пропоксифен напсилат, оксикодона гидрохлорид, гидрокодона битартрат, трамадол), кортикостероиды, антагонисты провоспалительных цитокинов, противоревматические препараты, модифицирующие заболевание (ΌΜΑΚΌ - ЭЬеахе Μοάίίγίη§ ΛηΙί-ΡΙιοιιιηαΙίο Эгид), нестероидные противовоспалительные средства (Κ8ΑΙΌ - №п-81его10а1 Αηί^-IηΠаттаΐο^у Эгид), антиревматические средства медленного действия (8ΑΑΚΌ -81ο^-Αοΐί^ Αηί^-Кйеитаί^с Эгидх) и др.

Примеры противоревматических препаратов, модифицирующих заболевание, (ΌΜΑΚΌ) включают, без ограничения, Реуматекс™ (метотрексат); Энбрел® (этанерцепт); Ремикад® (инфликсимаб); Химура™ (адалимумаб); Сегард® (афелимомаб); Арава™ (лефлумомид); Кинерет™ (анакинра); Арава™ (лефлуномид); Ό-пеницилламин; Миохризин; Плакенил; Кйбаига™ (ауранофин); солганал; ленерцепт (Ноййтап-Ьа КосЬе); СЭР870 (СеШесЬ); СЭР571 (СеШесЬ), а также антитела, описанные в ЕР 0516785 Β1, и8 5656272, ЕР 0492448 А1; онерцепт (8егопо; СΑ8 гед. по. 199685-57-9); ΜΚΑ (СЬида1); Имуран™ (азатиоприн); ингибиторы ядерного фактора κ-В; Цитоксан™ (циклофосфамид); циклоспорин; оксихлорохина сульфат; миноциклин; сульфасалазин и соединения золота, такие как пероральное золото, золотонатрия тиомалат и ауротиоглюкоза.

Далее, пригодными молекулами являются, например, растворимые рецепторы ФНО, происходящие из внеклеточных доменов молекул рецептора ФНОа, отличных от рецепторов ФНО р55 и р75, такие как, например, рецепторы ФНО, описанные в XV0 99/04001, в том числе слитые белки рецептор ФНО-иммуноглобулин, производные от этого рецептора ФНО. Другие приемлемые ингибиторы ФНОа тоже подходят для применения, как описано здесь. При этом подразумевается использование не только антител к ФНОа или рецептору ФНО, как это описано здесь, но и производного от ФНОа пептида, который может действовать как конкурентный ингибитор ФНОа (И8 5795859 или И8 6107273), конъюгаты рецептор ФНО-иммуноглобулин С, например, содержащие экстрацеллюлярный домен рецептора ФНОа р55, растворимый рецептор фНОа, отличный от конъюгата с Ι§Ο. либо другие молекулы, которые могут понизить эндогенный уровень ФНОа, такие как ингибиторы ФНОа-превращающего фермента (см., например, и8 5594106), либо низкомолекулярные вещества или ингибиторы ФНОа, множество которых было описано здесь.

В отношении антител к ФНО, хотя их доза оптимальным образом будет определяться опытным специалистом в области здравоохранения в соответствии с конкретными нуждами пациента, предпочтительный диапазон дозы антител к ФНОа составляет от 0,1 до 20 мг/кг, более предпочтительно 1-10 мг/кг. Другой предпочтительный интервал доз для антител к ФНОа составляет от 0,75 до 7,5 мг/кг массы тела.

В рамках настоящего изобретения можно применять специфический связывающий агент и одно или несколько нестероидных противовоспалительных средств (НСПВС). Противовоспалительное действие НСПВС обусловлено, по меньшей мере частично, ингибированием синтеза простагландинов (Сообтап, С11тап, ТЬе РЬагтасо1одка1 Βηδίδ ой ТЬегареиЬск, ΜасΜ^11аη 7^4Ь Б^Шоп (1985)). НСПВС можно разделить на 9 групп:

1) производные салициловой кислоты,

2) производные пропионовой кислоты,

3) производные уксусной кислоты,

4) производные фенаминовой кислоты,

5) производные карбокислоты,

6) производные масляной кислоты,

7) оксикамы,

8) пиразолы,

9) пиразолоны.

Неограничивающими примерами НСПВС являются, в частности, Анапрокс™, Анапрокс Όδ™ (напроксен-натрий); Ансаид™ (флурбипрофен); Артротек™ (диклофенак натрия+мизопростил); Катафлам/Вольтарен (диклофенак калия); Клинорил (сулиндак); Дейпро™ (оксапрозин); Дисальцид™ (сальса

- 41 011866 лат); Долобид™ (дифлунизал); ЕС Напросин™ (напроксен-натрий); Фельден™ (пироксикам); Индоцин™, Индоцин 8В™ (индометацин); Лодин™, Лодин ХЬ™ (этодолак); Мотрин™ (ибупрофен); Напрелан™ (напроксен); Напросин™ (напроксен); Орудис™ (кетопрофен); Оруваил™ (кетопрофен); Релафен™ (набуметон); Толектин™, (тольметин-натрий); Трилисат™ (холина-магния трисалицилат); ингибиторы Сох1; ингибиторы Сох-2, такие как Виокс™ (рофекоксиб); Аркоксия™ (эторикоксиб), Целебрекс™ (целекоксиб); Мобик™ (мелоксикам); Бекстра™ (вальдекоксиб), Династал™ (паракоксиб-натрий); Прексиж™ (люмиракоксиб) инамбуметон.

Другие пригодные НСПВП включают, без ограничения, следующее: эпсилон-ацетамидокапроновая кислота, 8-аденозилметионин, 3-амино-4-оксимасляная кислота, амиксетрин, анитразафен, антрафеин, бендазак, бендазак лизинат, бензидамин, бепрозин, броперамол, буколом, буфезолак, ципроквазон, клоксимат, дазидамин, дебоксамет, детомидин, дифенпирамид, дифисаламин, дитазол, эморфазон, фанетизол мезилат, фенфлумизол, флоктафенин, флумизол, флуниксин, флупроквазон, фопиртолин, фосфосал, гваймесал, гвайзолин, изониксирн, лефетамин-НС1, лефлуномид, лофемизол, лотифазол, лизинклониксинат, мезеклазон, набуметон, никтиндол, нимесулид, орготеин, опраноксин, оксацепрольм, оксападол, паранилин, перизоксал, перизоксала цитрат, пифоксим, пипроксен, пиразолак, пирфенидон, проквазон, проксазол, тиелавин В, тифламизол, тимегадин, толектин, тольпадол, триптамид и вещества, обозначенные фирменным кодовым номером, в частности 4801568, АА861, АО1590, АРР802, АРР860, А177В, АР504, АИ8001, ВРРС, В№540С, СНПМОПМ 127, СМ100, ЕВ382, ЕЬ508, Е1044, ЕК-506, СМ3658, 1ТЕ182, КСМТЕ16090, КМЕ4, ЬА2851, МВ714, МВ897, МУ309, ОМО3144, РВ823, РМ102, РМ108, В830, В82131, 8СВ152, 8Н440, 81В133, 8РА8510, 8Р27239, 8Т281, 8Υ6001, ТА60, ТА1-901 (4-бензоил-1индакарбоксикислота), ТМХ2706, И60257, ИВ2301 и νΥ41770. Структурно-родственные НСПВП, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными свойствами, что и НСПВП, также охватываются этой группой.

Пригодные 8ААВЭ или ОМАВЭ включают, без ограничения, аллокупреид натрия, ауранофин, ауротиоглюкоза, ауротиогликанид, азатиоприн, брекинар-натрий, буцилламин, кальция 3-ауротио-2пропанол-1-сульфонат, хлорамбуцил, хлорохин, клобузарит, купроксолин, циклофосфамид, циклоспорин, дапсон, 15-дезоксиспергуалин, диацереин, глюкозамин, соли золота (например, циклохина золотая соль, золота-натрия тиомалат, золота-натрия тиосульфат), гидроксихлорохин, гидроксимочевина, кебузон, левамизол, лобензарит, мелиттин, 6-меркаптопурин, метотрексат, мизорибин, микофенолят мофетил, миорал, азотные аналоги иприта, Ό-пеницилламин, пиридинол, имидазолы, такие как 8ΙΧΝΕ86002 и 8В203580, рапамицин, тиолы, тимопоэтин и винкристин. Подразумевается, что структурно-родственные 8ААВЭ и ОМАВЭ, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными свойствами, также охватываются этой группой.

Ингибиторы киназ в сигнальных каскадах также являются пригодными агентами для комбинирования со специфическими связывающими агентами, соответствующими настоящему изобретению. Среди них, например, вещества, способные ингибировать Р-38 (также известные как ВК или 8АРК-2, Ьее е! а1., Ма!иге, 372: 739 (1994)). Р-38 описан как сериновая/треониновая киназа (см. Нап е! а1., ВюсЫтюа Вюрйукюа Ас!а, 1265: 224-227 (1995)). Было показано, что ингибиторы Р-38 учатвуют в событиях, происходящих между внеклеточной стимуляцией и секрецией клеткой 1Ь-1 и ФНОа, блокируя передачу сигнала посредством ингибирования киназы, участвующей в пути передачи сигнала.

Пригодны также ингибиторы МК2 и !р1-2. Кроме того, пригодными являются также ингибиторы Т-клеток, включающие, например, с!1а-4, 30 СкА, Ек-506, ОХ40, ОХ40В-Ес, антитела к ОХ40, лиганд ОХ40, антитела к лиганду ОХ40, 1ск и ΖΛΓ70. Пригодны также ретиноиды, в том числе для перорального применения, а также антагонисты ТСЕ-бета.

Кроме того, пригодные агенты для комбинирования со специфическими связывающими агентами, соответствующими настоящему изобретению, включают, например, любое производное или несколько производных салициловой кислоты либо их сложные эфиры-пролекарства или же их фармацевтически приемлемые соли. Такие производные салициловой кислоты, пролекарственные сложные эфиры и фармацевтически приемлемые соли салициловой кислоты включают, например, ацетаминосалол, алоксиприн, аспирин, бенорилат, бромосалигенин, ацетилсалицилат кальция, холина-магния трисалицилат, дифлусинал, этерсалат, фендосал, гентизиновая кислота, гликольсалицилат, имидазолсалицилат, лизина ацетилсалицилат, месаламин, морфолинсалицилат, 1-нафтилсалицилат, ольсалазин, парсалмид, фенилацетилсалицилат, фенилсалицилат, салацетамид, салициламид-О-уксусная кислота, сальсалат и сульфасалазин. Подразумевается, что структурно-родственные производные салициловой кислоты, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными свойствами, также охватываются этой группой. Среди прочих пригодных агентов, например, производные пропионовой кислоты, их сложные эфиры-пролекарства и фармацевтически приемлемые соли, которыми, в частности, являются альминопрофен, беноксапрофен, буклоксовая кислота, карпрофен, дексиндопрофен, фенопрофен, флуноксапрофен, флупрофен, флурбипрофен, фурклопрофен, ибупрофен, ибупрофен-алюминий, ибупроксам, индопрофен, иопрофен, кетопрофен, локсопрофен, миропрофен, напроксен, оксапрозин, пикетопрофен, пимепрофен, пирпрофен, пранопрофен, протизиновая кислота, пиридоксипрофен, супрофен, тиапрофеновая кислота и

- 42 011866 тиоксапрофен. Подразумевается, что структурно-родственные производные пропионовой кислоты, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными свойствами, также охватываются этой группой. Пригодными для применения являются также производные уксусной кислоты, их сложные эфиры-пролекарства и фармацевтически приемлемые соли, которыми, в частности, являются ацеметацин, алклофенак, амфенак, буфексамак, цинметацин, клопирак, дельметацин, диклофенак-натрий, этодолак, фельбинак, фенклофенак, фенклорак, фенклозовая кислота, фентиазак, флурофенак, глукаметацин, ибуфенак, индометацин, изофезолак, изоксепак, лоназолак, метиазиновая кислота, оксаметацин, оксипинак, пиметацин, проглуметацин, сулиндак, тальметацин, тиарамид, тиопинак, тольметин, зидометацин и зомепирак. Подразумевается, что структурно-родственные производные уксусной кислоты, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными свойствами, также охватываются этой группой. Пригодными для применения являются также производные фенаминовой кислоты, их сложные эфиры-пролекарства и фармацевтически приемлемые соли, которыми, в частности, являются энфенаминовая кислота, этофенамат, флуфенаминовая кислота, изониксин, меклофенаминовая кислота, меклофенамат натрия, медофенаминовая кислота, мефанаминовая кислота, нифлумовая кислота, тальнифлумат, терофенамат, толфенаминовая кислота и уфенамат. Подразумевается, что структурно-родственные производные фенаминовой кислоты, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными свойсвами, также охватываются этой группой.

Пригодными для применения являются также производные карбокислоты, их сложные эфирыпролекарства и фармацевтически приемлемые соли, которыми, в частности, являются клиданак, дифлунисал, флуфенисал, иноридин, кеторолак и финоридин. Подразумевается, что структурно-родственные производные карбокислоты, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными свойсвами, также охватываются этой группой. Пригодными для применения являются также производные масляной кислоты, их сложные эфиры-пролекарства и фармацевтически приемлемые соли, которыми, в частности, являются бумадизон, бутибуфен, фенбуфен и ксенбуцин. Подразумевается, что структурно-родственные производные масляной кислоты, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными свойсвами, также охватываются этой группой. Оксикамы, их сложные эфирыпролекарства и фармацевтически приемлемые соли также являются пригодными для применения. Среди них: дроксикам, эноликам, изоксикам, пироксикам, судоксикам, теноксикам и 4-гидрокси-1,2бензотиазин-1,1-диоксид 4-(Ы-фенил)карбоксамид. Подразумевается, что структурно-родственные оксикамы, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными свойствами, также охватываются этой группой. Пиразолы, их сложные эфиры-пролекарства и фармацевтически приемлемые соли также являются пригодными для применения. Среди них: дифенамизол и эпиризол. Подразумевается, что структурно-родственные пиразолы, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными свойствами, также охватываются этой группой. Кроме того, пиразолоны, их сложные эфирыпролекарства и фармацевтически приемлемые соли также являются пригодными для применения. Среди них: апазон, азапропазон, бензпиперилон, фепразон, мофебутазон, моразон, оксифенбутазон, фенилбутазон, пипебузон, пропилфеназон, рамифеназон, суксибузон и тиазолинобутазон. Подразумевается, что структурно-родственные пиразолоны, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными свойствами, также охватываются этой группой.

Пригодными для лечения заболеваний, опосредованных ФНО, являются сложные эфирыпролекарства и фармацевтически приемлемые соли. Кортикостероиды, их сложные эфиры-пролекарства и фармацевтически приемлемые соли включают гидрокортизон и производные гидрокортизона, такие как 21-ацетоксипрегненолон, акломеразон, альгестон, амцинонид, беклометазон, бета-метазон, бетаметазона валерат, будесонид, хлорпреднизон, клобетазол, клобетазола пропионат, клобетазон, клобетазона бутират, клокорталон, клопреднол, кортикостерон, кортизон, кортивазол, дефлазакон, десонид, дезоксимеразон, дексаметазон, дифлоразон, дифлукортолон, дифлупреднат, эноксолон, флуазакорт, флуклоронид, флуметазон, флуметазона пивалат, флунизолид, флуцинолона ацетонид, флуоцинонид, флуороцинолона ацетонид, бутилфлуокортин, флуорокортолон, флуорокортолона гексаноат, дифлукортолона валерат, флуорометолон, флуперолона ацетат, флупреднидена ацетат, флупреднизолон, флуранденолид, формокортал, гальцинонид, галометазон, галопредона ацетат, гидрокортамат, гидрокортизон, гидрокортизона ацетат, гидрокортизона бутират, гидрокортизона фосфат, гидрокортизона 21-натрия сукцинат, гидрокортизона тебутат, мазипредон, медризон, мепреднизон, метилпредниколон, мометазона фуроат, параметазон, предникарбат, преднизолон, преднизолон 21-диэдриаминоацетат, преднизолон-натрий фосфат, преднизолон-натрий сукцинат, преднизолон-натрий 21-м-сульфобензоат, преднизолон- натрий 21-стеарогликолят, преднизолона тебутат, преднизолон 21-триметилацетат, преднизон, преднивал, преднилиден, преднилиден 21-диэтиламиноацетат, тиксокортол, триамцинолон, триамцинолона ацетонид, триамцинолона бенетонид и триамцинолона гексацетонид. Подразумевается, что структурнородственные кортикостероиды, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными свойствами, также охватываются этой группой.

Пригодными для комбинированного применения в соответствии с приведёнными описаниями являются также противомикробные средства, их сложные эфиры-пролекарства и фармацевтически приемлемые соли. Пригодные антимикробные средства, в частности, включают ампициллин, амоксициллин,

- 43 011866 ауреомицин, бацитрацин, цефтазидим, цефтриаксон, цефотаксим, цефахлор, цефалексин, цефрадин, ципрофлоксацин, клавулановая кислота, клоксациллин, диклоксациллан, эритромицин, флуклоксациллан, гентамицин, грамицидин, метициллан, неомицин, оксациллан, пенициллин и ванкомицин. Подразумевается, что структурно-родственные противомикробные средства, обладающие сходными обезболивающими и противовоспалительными свойствами, также охватываются этой группой.

Прочие пригодные соединения включают, без ограничения, ВN 50730; тенидап; Е 5531; тиапафант РСА 4248; нимесулид; панавир; ролипрам; РР 73401; пептид Т; МЭБ 201,449А; (1Р,38)-цис-1-[9-(2,6диаминопуринил)]-3-окси-4-15-циклопентена гидрохлорид; (1Р,3Р)-транс-1-[9-(2,6-диамино)пурин]-3ацетоксициклопентан; (1Р,3Р)-транс-1-(9-аденил)-3-азидоциклопентана гидрохлорид и (1Р,3Р)-транс-1(6-гидроксипурин-9-ил)-3-азидоциклопентан.

Было показано, что интерлейкин-4 (1Б-4) может вызывать воспалительный эффект в некоторых случаях, таких как астма, при которой сверхэкспрессия 1Б-4 в лёгких приводит к гипертрофии эпителиальных клеток и скоплению лимфоцитов, эозинофилов и нейтрофилов. Такой ответ является одной из основных особенностей провоспалительного ответа, вызванного другими цитокинами Т112. Следовательно, как отмечено выше, ингибиторы 1Б-4 также применимы в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, следует понимать, что в лечении артритов также могут применяться некоторые иммунодепрессанты, например ингибиторы индуцируемой синтазы оксида азота (ίΝΟδ - тйис!1Ь1е пйпс ох1йе купШаке), ингибиторы 5-липоксигеназы и др.

Было показано, что определёнными противовоспалительными свойствами обладает имбирь, следовательно, и он применим в качестве противовоспалительного агента в соответствии с настоящим изобретением, как и хондроитин.

В некоторых воплощениях агент, специфически связывающий Апд-2, можно вводить перед, одновременно и после лечения агентом для противораковой терапии. Неограничивающими примерами раковых заболеваний являются, в частности, рак груди, рак толстой и прямой кишки, карцинома желудка, глиома, плоскоклеточный рак головы и шеи, наследственная или спорадическая папиллярная карцинома почки, лейкемия, лимфома, синдром Ли-Фраумени, злокачественная плевральная мезотелиома, меланома множественная миелома, немелкоклеточная карцинома лёгкого, остеосаркома, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, мелкоклеточный рак лёгкого, синовиальная саркома, тироидная карцинома и переходно-клеточная карцинома мочевого пузыря.

В некоторых воплощениях агент, специфически связывающий Апд-2, можно применять отдельно или совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим агентом для лечения рака. В некоторых воплощениях агент, специфически связывающий Апд-2, применяют в сочетании с терапевтически эффективной дозой дополнительного терапевтического агента. Неограничивающими примерами терапевтических агентов, которые можно вводить вместе с агентом, специфически связывающим Апд-2, могут служить члены гелданамицинового семейства антибиотиков анизамицинового ряда, Про-НСР; ΝΚ2; с-Мет-пептидный ингибитор, антагонист СгЬ2 8гс гомологии 2; модулятор СаЬ1; доминантнонегативный 8гс; ингибитор фон Гиппеля-Ландау, включая, без ограничения, вортманнин; ингибиторы киназы Р13, другие антирецепторные средства, анти-РФРЭ, ингибитор СОХ-2, Целебрекс™, Виокс™; фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС), модулятор ФРЭС, фактор роста фибробластов (ФРФ), модулятор ФРФ, фактор роста эпидермиса (ФРЭ); модулятор ФРЭ, фактор роста кератиноцитов (ФРК), молекула, родственная ФРК, модулятор ФРК, модулятор металлопротеазы матрикса.

В некоторых воплощениях настоящее изобретение направлено на лекарственные средства, включающие агент, специфически связывающий Апд-2, и по меньшей мере один ингибитор сериновых протеаз, а также способы лечения с использованием таких лекарственных средств. В некоторых осуществлениях средство содержит агент, специфически связывающий Апд-2, и ингибитор сериновых протеаз, а также по меньшей мере одну описанную здесь дополнительную молекулу.

В некоторых случаях нарушение баланса протеаза/ингибитор протеазы может привести к разрушению ткани, опосредованному протеазой, которое, в частности, может привести к инвазии опухоли в нормальную ткань, что приводит к метастазированию.

В некоторых воплощениях агент, специфически связывающий Апд-2, можно применять по меньшей мере с одним провоспалительным терапевтическим агентом. В некоторых воплощениях агент, специфически связывающий Апд-2, можно применять по меньшей мере с одним агентом, нарушающим работу иммунной системы. Неограничивающими примерами провоспалительных агентов и агентов, нарушающих работу иммунной системы, могут служить ингибиторы циклооксигеназы типа 1 (СОХ-1) и типа 2 (СОХ-2), низкомолекулярные модуляторы митогенактивируемой протеинкиназы (МАРК - ту!одеп асйуа!ей рго!ет купаке) с молекулярной массой 38 кДа (р38-МАРК), низкомолекулярные модуляторы внутриклеточных молекул, задействованных в воспалительных путях, которые внутриклеточные молекулы включают, без ограничения, _)пк, ΙΚΚ, ΝΡ-кВ, 2АР70, 1ск и др. Некоторые примеры провоспалительных лекарственных средств описаны, например, в кн.: С.А. О1паге11о, Б.Б. Мо1йа^ег РгошПатта!огу апй АпБ-1пПатта!огу Су!октек т РЪеита!о1й Аг1Нг111к: А Рптег £ог СИпЫапк ТЫгй Еййюп (2001) Атдеп 1пс. Ткоикапй Оакк, С А.

- 44 011866

В некоторых воплощениях настоящего изобретения фармацевтические композиции могут содержать более одного агента, специфически связывающего Апд-2. В некоторых воплощениях фармацевтические композиции могут содержать более одного агента, специфически связывающего Апд-2, при этом агент, специфически связывающий Апд-2, связывает более одного эпитопа.

Иммунотерапевтические средства.

Иммунотерапевтические средства обычно основываются на применении эффекторных клеток и молекул иммунной системы для направленного разрушения раковых клеток. Иммунными эффекторами могут быть, например, антитела, соответствующие настоящему изобретению, распознающие некоторые маркёры на поверхности клетки-мишени. Антитела сами по себе могут служить эффекторами в терапии опухолей или же могут задействовать другие клетки, убивающие клетки-мишени. Антитела могут также быть конъюгированы с лекарством или токсином (химиотерапевтическим средством, радионуклидом, цепью А рицина, токсином холеры, токсином коклюша и т.п.) и, таким образом, служить попросту в качестве направляющего агента.

В соответствии с настоящим изобретением мутантные формы Апд-2 могут служить мишенью для иммунотерапии при помощи антител или конъюгатов антител, соответствующих настоящему изобретению. В частности, предлагается вариант, при котором фармацевтические композиции, содержащие антитела, соответствующие настоящему изобретению, можно применять в комбинированной терапии, сопряжённом с терапией, нацеленной на Апд-2.

Было доказано, что пассивная иммунотерапия чрезвычайно эффективна в отношении ряда раковых заболеваний (см., например, \УО 98/39027).

Нижеследующие примеры приведены только с иллюстративной целью и ни в коей мере не ограничивают объем настоящего изобретения.

Пример 1. Экспрессия Апд-2 в патологической и нормальной ткани.

Экспрессию Апд-2 исследовали в нормальной и патологической ткани при помощи гибридизации ш 8Йи. Фрагменты человеческой (ОепЬапк, номер доступа ΆΕΌ04327, нуклеотиды 1274-1726) и мышиной (ОепЬапк, номер доступа: АЕ004326, нуклеотиды 1135-1588) последовательностей Апд-2 амплифицировали способом ПЦР с обратной транскриптазой на основе человеческой или мышиной кДНК эмрионального лёгкого, клонировали в плазмиде рОЕМ-Т и проверяли секвенированием. Образцы антисмысловой РНК, меченые фосфором-33, были транскрибированы с матриц линеаризованных плазмид с применением 33Р-УТФ и РНК-полимеразы. Блоки тканей, фиксированных формалином и залитых парафином, резали на микротоме с толщиной срезов 5 мкм и собирали на обработанных предметных стёклах. Перед гибридизацией ш δίΐιι ткани пермеабилизовали 0,2 М НС1 с последующей обработкой протеиназой К и ацетилированием триэтаниламином на уксусном ангидриде. Срезы гибридизовали с радиоактивно меченым зондом в течение ночи при 55°С, затем подвергали обработке РНКазой и тщательно отмывали в 0,1Х 88С при 55°С. Срезы обмакивали в эмульсии Койак №ТВ2, выдерживали при 4°С в течение 2-4 недель, проявляли и окрашивали. Такие срезы изучали в тёмном поле и при обычном освещении для одновременной оценки морфологии ткани и сигнала от гибридизации.

Результаты показали, что в нормальном постнатальном человеческом организме экспрессия Апд-2 ограничена немногими тканями, имеющими значительное содержание сосудов, таких как яичник, плацента и матка. Экспрессия Апд-2 не выявлялась в норме в сердце, мозге, почках, печени, лёгких, поджелудочной железе, селезёнке, мышцах, миндалинах, тимусе, аппендиксе, лимфоузлах, желчном пузыре, предстательной железе и семенниках взрослого человека. У мышей в возрасте 5 недель (но не у взрослых обезьян или людей) почки проявляли значительный уровень экспрессии Апд-2 в прямых сосудах. Для выявления, не является ли эта экспрессия остаточной после эмбрионального развития, этот же опыт повторяли на почках мышей различного возраста, вплоть до одного года, с использованием мышиного зонда Апд-2 и условий, описанных выше. Было отмечено, что экспрессия Апд-2 уменьшалась в ходе постнатального развития, однако всё же была выражена в почках годовалых мышей.

Экспрессия Апд-2 была также выявлена практически во всех протестированных типах опухолей, в том числе в первичных опухолях человека, таких как карцинома толстой кишки (5 случаев), карцинома груди (10 случаев), карцинома лёгкого (8 случаев), глиобластома (1 случай), в метастазирующих опухолях человека, таких как карцинома груди (2 случая), карцинома лёгкого (2 случая), карцинома яичника (2 случая), с метастазами в мозг, а также на модели опухолей грызунов, таких как С6 (глиома крысы), НТ29 (карцинома толстой кишки человека), Со1о-205 (карцинома толстой кишки человека), НСТ116 (карцинома толстой кишки человека), А431 (человеческая эпидермоидная карцинома), А673 (рабдомиосаркома человека), НТ1080 (фибросаркома человека), РС-3 (карцинома предстательной железы человека), В16Е10 (меланома мыши), Ме!1А (саркома мыши), и в метастазах лёгочной карциномы Льюиса, кроме того, экспрессия Апд-2 была выявлена в новообразованных сосудах, прорастающих в матригелевую пробку в ответ на ФРЭС, а также в мышиной гипоксической модели ретинопатии и преждевременного созревания.

- 45 011866

Пример 2. Получение рекомбинантного белка тАпд-2 и кроличьей поликлональной антисыворотки к Апд-2.

Молекулу мышиной кДНК Апд-2 полной длины с гистидиновым хвостом получили способом ПЦР (С1оЩеск Айуап!аде РСК Кй, Са!. # К1905-01) из библиотеки кДНК 15-дневного мышиного эмбриона (Ма^а!коπ-Кеайу-с^NА, Са!. # 7459-1, С1опе!еск, 1пс.) с применением праймеров для ПЦР для человеческого Апд-2 полной длины. Продукт ПЦР лигировали с вектором для экспрессии, содержащим промотор СМУ, и полученной плазмидой трансформировали клетки человеческой фибросаркомы НТ1080 (полученные в АТСС) при помощи трансфицирующего агента (Коске, Са!. # 1814443). Стабильные клоны были изолированы селекцией на С418. Для скрининга клонов, экспрессирующих тАпд-2-Гис, использовали твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А) с антителами к гистидиновому хвосту и иммуноблоттинг.

Рекомбинантный полипептид тАпд-2 очищали от среды и от клеточного материала. Кондиционированную среду, содержащую тАпд-2-Гис, очищали двустадийной хроматографией. Вкратце, рН среды подводили до 8,9 добавлением трис-буфера с рН 9,5 до конечной концентрации около 20 мМ. Кроме того, добавляли детергент СНАР8 до конечной концентрации около 5 мМ.

Далее среду напрямую наносили на анионообменную колонку с Ц-сефарозой ££ (Ркагтааа). Затем колонку промывали 10 мМ Трис рН 8,0, содержащим 50 мМ №С1. Рекомбинантный тАпд-2-Гис смывали в одну стадию при помощи 10 мМ трис рН 8,0, содержащего 350 мМ Ν;·ιΟΊ и около 5 мМ СНАР8.

К элюату с колонки Ц-сефарозы добавляли имидазол до конечной концентрации 4 мМ и наносили его на аффинную колонку с иммобилизованным металлом (ΝΪ-ΝΤΆ 5ирегПо\у (Ц1адеп)). Связавшийся белок элюировали при помощи РВ8, содержащего около 5 мМ СНАР8 и около 100 мМ имидазола. Далее элюат концентрировали до конечной концентрации около 1,0 мг/мл с последующим диализом против РВ8. Чистота тАпд-2-Гис была более 90%, как было определено электрофорезом с 8Ό8 с последующим окрашиванием Кумасси.

Для получеия антител кроликов иммунизировали приблизительно тАпд-2 в количестве 0,2 мг на инъекцию. Кроликам вводили около 1 мл Нцп!ег'§ ТйегМах® (81дта) и тАпд-2 в соотношении 1:1. 4 недели спустя кроликам делали повторную инъекцию или подкрепляющую иммунизацию, через 2 недели после этого проводили ещё одну иммунизацию, а на 7-ю неделю забирали сыворотку и оценивали в ней титр антител к тАпд-2. Если титр оказывался достаточно высоким, в течение 6 последующих недель у животных отбирали по 50 мл крови. Однако, если титр оказывался низким, кроликам делали ещё одну покрепляющую иммунизацию и затем у них еженедельно в течение 6 недель отбирали по 50 мл крови начиная с 9-й недели. После осуществления 6 последовательных заборов крови животному давали отдых в течение 6 недель. Если требовалось больше сыворотки, кроликам давали подкрепляющую иммунизацию через месяц после последнего отбора крови.

При помощи анализа ЕЬ18А на нейтрализацию (описан ниже) обнаружили, что поликлональные антисыворотки от двух кроликов, 5254 и 5255, подавляли взаимодействие тАпд-2 с Т1е-2.

Пример 3. Молекулярные анализы для оценки антител к Апд-2.

Были разработаны молекулярные анализы (ЕЫ8А на сродство, ЕЫ8А на нейтрализацию и В1Асоге) для оценки связывания антител с Апд-2 и родственными белками этого семейства, а также воздействия антител на взаимодействие Апд-2 с Т1е-2. Эти анализы, осуществляемые 1п уйго и на клеточном уровне, описываются ниже.

А. Анализ ЕЫ8А на сродство.

Для начального скрининга кандидатов на антитела к Апд-2 применяли очищенный человеческий Апд-2 (К апй Ό Зуйетк, 1пс.; Са!. # 623ΆΝ; Апд-2 поставляется как смесь двух усечённых версий) или мышиный Апд-2 (полученный, как описано выше). Для подтверждающего анализа на связывание человеческий Апд-2 получали из среды человеческих клеток 293Т, трансфицированных человеческой ДНК Апд-2 полной длины и культивированных в бессывороточной среде Дульбекко, модифицированной Иглом (ЭМЕМ - ОЫЬессо тойШей Еад1е'§ тейшт), содержащей около 50 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА).

На планшетах для микротитрования в каждую лунку добавляли по 100 мкл Апд-2 и планшеты выдерживали около 2 ч, после чего четырежды промывали физиологическим фосфатно-буферным раствором (РВ8), содержащим 0,1% Твин-20. Затем лунки блокировали примерно 250 мкл 5%-ного БСА на РВ8 на каждую лунку и планшеты выдерживали при комнатной температуре около 2 ч. После этого избыток блокированного раствора удаляли и в каждую лунку добавляли около 100 мкл кандидатов на антитела к Апд-2, растворённых в РВ8 с добавлением около 1% БСА, в серии четырёхкратных разведений, начиная примерно с 40-нМ концентрации. Планшеты выдерживали в течение ночи при комнатной температуре. По окончании инкубации планшеты четырежды промывали РВ8, содержащим 0,1% Твин-20, затем в лунки добавляли по 100 мкл козьих антител к Бс-фрагменту человеческих 1дС, конъюгированных с пероксидазой хрена (Р1егсе Скетка1 Со., Са!. # 31416), предварительно разведённых 1:5000 на РВ8, содержащем 1% БСА. Планшеты выдерживали около 1 ч при комнатной температуре, после чего пятикратно промывали РВ8, содержащим 0,1% Твина-20. Затем в лунки планшета добавляли по 100 мкл раствора субстрата тетраметилбензидина (ТМБ; 3,3',5,5'-Те!гате!ку1Ьеп71йте Бгдшй 8иЬ§!га!е 8уЧет; 81дта

- 46 011866 с11ст1са1 Сотрапу, 51. Ьошк, М0, са1а1од питЬег Т8665) и планшеты инкубировали 5-15 мин до развития окрашивания синего цвета.

Оптическое поглощение определяли на спектрофотометре при длине волны около 370 нм.

B. Анализ ЕЫ5А на нейтрализацию.

Планшеты для микротитрования с сорбированным на них Апд-2 получали, как описано для теста ЕЫ5А на сродство. Кандидаты на антитела к Апд-2 готовили в серии разведений, как описано выше для анализа ЕЫ5А на аффинность, в РВ5, содержащем около 1% БСА и около 1 нМ Т1е-2 (полученного как молекула Т1е-2-Ес, в которой часть, соответствующая Т1е-2, представляет собой только растворимую внеклеточную часть молекулы; К апй Ό 5ук!етк, Са!. # 313-ΤΙ).

После того как в каждую лунку добавили по 100 мкл смеси антител с Т1е-2, планшеты инкубировали в течение ночи при комнатной температуре, а затем пятикратно промывали в РВ5, содержащем около 0,1% Твин-20. После промывки в лунки планшета добавляли по 100 мкл антител к Т1е-2 (Рйагтшдеп 1пс., Са!. # 557039) в концентрации около 1 мкг/мл и планшеты выдерживали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл козьих антител к 1дС мыши, меченых пероксидазой хрена (Р1егсе СНет1са1 С0., Са1. # 31432) в разведении 1:10,000 в РВ5, содержащем около 1% БСА. Планшеты выдерживали при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего пятикратно промывали РВ5, содержащим 0,1% Твин-20. Затем в лунки добавляли по 100 мкл раствора тетраметилбензидина, как указано выше, и оставляли для развития окрашивания. Оптическое поглощение определяли на спектрофотометре при длине волны около 370 нм.

C. Тест В1Асоге на сродство.

Анализ сродства каждого кандидата на антитела к Апд-2 осуществляли также при помощи системы В1Асоге®2000 (В1Асоге, 1пс., Р1кса!а^ау, N1) с РВ5 и 0,005% сурфактантом Р20 (В1Асоге, 1пс.) в качестве рабочего буфера. Рекомбинантный белок 6 (Керйдеп, НеейНат, МА) иммобилизовали на сенсорном чипе СМ5 для исследовательской работы (В1Асоге, 1пс.) через первичные аминогруппы с помощью набора Атте Соирйпд Κίΐ (В1Асоге, 1пс.) в соответствии с протоколом, рекомендуемым производителем.

Опыт по связыванию осуществляли, прежде всего, посредством связывания около 100 Ки каждого кандидата на антитела к Апд-2 с иммобилизованным белком 6, после чего на поверхность связанных антител впрыскивали различные концентрации (0-100 нМ) человеческого или мышиного Апд-2 со скоростью около 50 мкл/мин в течение около 3 мин.

Кинетические характеристики связывания антител, в том числе к_а (коэффициент связывания), к_й(коэффициент диссоциации) и ΚΌ (равновесный коэффициент диссоциации) определяли при помощи компьютерной программы В1А еνа1иаί^оη 3.1 (В1Асоге, 1пс.). Более низкий равновесный коэффициент диссоциации указывал на большее сродство данных антител к Апд-2.

Пример 4. Получение полностью человеческих антител к Апд-2 путём фаговой экспрессии.

Полностью человеческие антитела к Апд-2 получали при помощи пэннинга генетической библиотеки Тагде! Онек! РНаде И1кр1ау ЕаЬ ЕЬгагу (Тагде! Опеке 1пс.) с помощью человеческого полипептида Апд-2 (К апй Ό 5ук!етк 1пс., Са!. # 623-А№) в соответствии с нижеследующим протоколом.

Человеческий Апд-2 иммобилизировали на поверхности полистирольных магнитных гранул двумя способами:

1) прямое связывание Апд-2 в концентрации 50 мкг/мл при 4°С в течение ночи и

2) непрямой захват Апд-2 козьими антителами к Апд-2 (50 мкг/мл в течение ночи при 4°С).

Поверхность гранул блокировали 2%-ным молоком на РВ5 (МРВ5 - Мйк РВ5). Фаговую библиотеку человеческих ЕаЬ подвергали предварительному отбору для удаления фаговых клонов, реагирующих с магнитными гранулами без покрытия или с козьими антителами к Апд-2. Магнитные гранулы, покрытые Апд-2, инкубировали затем с фаговой библиотекой при комнатной температуре в продолжение

1,5 ч. По окончании стадии связывания фагов поверхность шестикратно промывали МРВ5, содержащим около 0,1% Твин-20, затем шестикратно же РВ5, содержащим около 0,1% Твин-20, затем два раза РВ5. Связанные фаговые частицы элюировали сначала с помощью человеческого Т1е-2-Ес (К апй Ό 5ук!етк, М1ппеаро11к, М№) в концентрации 100 мкг/мл, затем приблизительно 100 мМ триэтаноламина. Элюированные фаги использовали для инфицирования клетки Е.сой Т61, фаги амплифицировали и восстанавливали для следующей стадии отсева. Давление селекции с каждой новой стадией повышали путём применения всё более жёстких отмывок и сокращения количества вводимого фага.

После трёх стадий селекции выявили 18 уникальных ЕаЬ-клонов, связывающих Апд-2, все из которых распознаваали человеческий, мышиный и крысиный Апд-2, как это было показано в тесте ЕЬ15А на аффинность, описанном выше. Приблизительно 10% этих фагов связывали также человеческий Апд-1. Эти клоны были превращены в антитела 1д61, как описано ниже.

Для получения других уникальных фагов проводили новый скрининг той же самой библиотеки, но по несколько изменённому протоколу. По этому протоколу человеческим Апд-2 в буфере NаНС0з при рН 9,6 покрывали иммунные трубки Мшс тах1когр при 4°С в течение ночи. Апд-2 сорбировали в концентрации около 1,5; 0,74 и 0,3 мкг/мл для покрытия кругов 1, 2 и 3 соответственно. Поверхность иммунных трубок блокировали при помощи приблизительно 2%-ного молока на РВ5 (МРВ5), после чего их

- 47 011866 инкубировали с приблизительно двумя триллионами фаговых частиц (около 50 копий каждого уникального фага в библиотеке) из той же самой библиотеки фаговой экспрессии, на которую авторы ссылались выше (Тагде! Оиек!), примерно в 4 мл 2% МРВ8. После окончания инкубации с фагами поверхность промывали 20 раз в РВ8, содержащем около 0,1% Твин-20, затем ещё 20 раз в РВ8.

Связавшиеся фаговые частицы смывали при помощи 1 мкМ человеческого Апд-2 или 1 мкМ человеческого Т1е-2 (К апй Ό 8у5!ет5, описаны выше). Элюированными фагами инфицировали клетки Е.сой ТС1 (поставляемые вместе с фаговой библиотекой), фаги амплифицировали и восстанавливали для следующей стадии скрининга. 16 уникальных РаЬ-клонов, связывающих Апд-2, выявили путём ПЦРамплификации каждого из фагов, с которыми связывались человеческие Апд-2 или Т1е-2, и эти клоны анализировали рестрикцией. ДНК каждого клона секвенировали. Последовательность, кодирующую вариабельный участок каждой тяжёлой цепи в каждом из фагов, амплифицировали при помощи комплементарных праймеров. Праймеры разрабатывали так, чтобы они включали сайты рестрикции Нтй111, ХЬа1, последовательность Козака и сигнальную последовательность (транслируемый пептид представляет собой МПМКУРАОЬЬСЬЬЬЬ^ЪКСАКС; 8ЕО ΙΌ N0: 202) на 5'-конце вариабельной области, тогда как сайт рестрикции ВктВ1 добавляли на 3'-конце продукта ПЦР. В качестве примера клонирования тяжёлых цепей шаблонную ДНК фага для клона 544 (8Е0 ΙΌ N0: 19) амплифицировали с применением праймеров 2248-21 (СТС СТТ САС АСС ТСС САС АТС ТСА СОТ ССА ОСТ СОТ ОСА С; 8 ЕС ΙΌ N0: 203), которые добавляли 7 последних аминокислот к сигнальной последовательности, и 2502-31 (АТТ АСС ТСТ САС АСТ ТСС ТТТ САТ СТС САС; 8ЕС) ΙΌ N0: 204), которые добавляли сайт для В5шВ[ на конце вариабельной области. Полученный продукт амплифицировали с праймерами 214898 (ССС СТС АСС ТСС ТСС ССС ТСС ТСС ТАТ ТСТ ССТ ТСА САС СТС ССА САТ; 8ЕС ΙΌ N0: 205), которые добавляли 9 аминокислот к сигнальному пептиду (АОЬЬСЬЬЬЬ; 8ЕС ΙΌ N0: 206), и 2502-31, а затем 2489-36 (САС САС ААС СТТ СТА САС САС САТ ССА САТ САС ССТ ССС ССС ТСА ССТ ССТ ССС; 8ЕС ΙΌ N0: 207) и 2502-31. Праймеры 2489-36 добавляли от 5'- к 3'-концу, сайт для Нтй111, для ХЬа1, последовательность Козака и 6 первых аминокислот сигнальной последовательности. Продукты ПЦР расщепяли ХЬа1 и ВчпВЕ а затем клонировали в экспрессионном векторе для млекопитающих, содержащем константную область человеческого ^С]. Этот вектор содержит промотор 8У40 и подвергается селекции по дигидрофолатредуктазе (ДГФР).

Лёгкие цепи из каждого фага относились к классу каппа или лямбда. Для каждой лёгкой цепи конструировали комплементарные праймеры, добавляющие в направлении 5'-3' сайт рестрикции Нтй111, сайт рестрикции ХЬа1, последовательность Козака и сигнальную последовательность (как изложено выше). Эти цепи, содержащие участки безошибочного кодирования, клонировали как продукты полной длины. В качестве примера лёгкие цепи из фагов клона 536 (8Е0 ΙΌ N0: 11 и 8Е0 ΙΌ N0: 210) амплифицировали, как кодирующие области полной длины, используя праймеры 2627-69 (СТС СТТ САС АСС ТСС САС АТС ТСА САТ ТСТ САТ САС ТСА СТС ТСС; 8ЕС) ΙΌ N0: 208), которые добавляли последние 7 аминокислот сигнальной последовательности, и праймер 2458-54 (СТТ СТС САС ТТА ТТА АСА СТС ТСС ССТ СТТ С; 8Е0 ΙΌ N0: 209), которые добавляли участок 8а11 после стоп-кодона. Полученный продукт затем амплифицировали, как описано выше, с дополнительными праймерами на 5'-конце: 2148-98 и 2489-36 соответственно, спаренными с праймером 2458-54 для завершения добавления сигнальной последовательности и участков клонирования. Лёгкие цепи полной длины клонировали как фрагменты ХЬа1-8а11 в экспрессионном векторе млекопитающих, как описано выше.

Некоторые клоны лямбда-цепей имели ошибки в константных участках по сравнению с природной последовательностью константных участков человека. Для исправления этих несоответствий осуществляли перекрывающуюся ПЦР с использованием ДНК, кодирующей безошибочную последовательность константной области лямбда и вариабельный участок, происходящий из фага. Эти ДНК также клонировали как фрагменты ХЬа1-8а11, как изложено выше.

Если вариабельные области каппа клонировали отдельно от их константных областей, к 3'-концу продукта ПЦР добавляли сайт, распознаваемый ВктВР После отщепления продукта ПЦР рестриктазами ХЬа1 и Β8тΒI вариабельный участок каппа-цепи клонировали в экспрессионном векторе, содержащем константный участок человеческой каппа-цепи. Конструкции со спаренными лёгкой и тяжёлой цепями из каждого переоборудованного фага котрансфицировали в клетки яичников китайского хомячка (СНО) при помощи набора для трансфекции с фосфорно-кислым кальцием (Са1сшт Рйокрйа!е ТгапкГесйоп Кй, Iпν^ΐ^одеп Согр.) в основном в соответствии с протоколом, рекомендуемым производителем. Среды меняли через 14-16 ч после трансфекции и клетки пересевали на чашки для клеточных культур для селекции примерно через 48 ч в соответствии с рекомендациями производителя. Трансфицированные клетки отделяли путём селекции на гипоксантин-гимидин в течение около 3 недель, после чего колонии трансфицированных клеток СНО обрабатывали трипсином и переводили их в состояние взвеси.

Среды малого объёма собирали через двое суток и испытывали на наличие антител иммуноблоттингом с помощью антител к человеческим Рс, каппа- или лямбда-участкам. Отобранные популяции клеток затем пересевали в селективных условиях при помощи стандартных стерильных процедур для клеточных культур до получения достаточного количества клеток, чтобы засеять четыре бутыли по 850 см², каждая, на 2х10⁷ жизнеспособных клеток и приготовить замороженные маточные линии клеток с исполь- 48 011866 зованием ДМСО. После высевания клетки содержались в цилиндрических бутылях приблизительно с 10%-ной сывороткой, содержащей среду ΌΜΕΜ (С1Ьсо/ВВЬ, 1пс.), дополненную глутамином и заменимыми аминокислотами. Клетки поддерживали в культуре 2-3 дня до достижения степени слияния клеток примерно 80%. На этой стадии среду в бутыли заменяли на бессывороточную (50% ΌΜΕΜ, 50% Р12, С1Ьсо), дополненную глутамином и заменимыми аминокислотами. Кондиционированную среду собирали через 7 дней и заменяли свежей бессывороточной средой для осуществления ещё одного или двух сборов конечного продукта.

Антитела очищали аффинной хроматографией на белке С прямо из собранной среды с применением стандартных процедур. Элюцию с колонки с иммобилизованным белком С осуществляли буфером с низким рН (около 3), после чего смытые с колонки антитела нейтрализовали при помощи 1 М Трис, рН

8,5 и затем концентрировали центрифугированием через ультрафильтр, удерживающий вещества с молекулярной массой более 10 кДа. Концентрированный раствор антител далее переносили в РВЗ с помощью буферного обмена.

Таким образом, получили 31 разновидность антител, каждое из которых состояло из двух тяжёлых цепей и двух лёгких цепей (каппа или лямбда), как указано в табл. 2.

Таблица 2

Тяжёлая цепь (НС) антител	Лёгкая цепь антител*
526 НС*	526 каппа
528 НС*	528 лямбда С1
531 НС*	531 лямбда СЗ
533 НС*	533 -каппа
535 НС*	535 лямбда СЗ
536 НС*	536 каппа
537 НС*	537 лямбда СЗ (О 107АН)
540 НС*	540 лямбда СЗ
543 НС*	543 каппа
544 НС*	544 -лямбда СЗ
545 НС*	545 лямбда С2
546 НС*	546 лямбда С1 (6 107Α8,Ν 112 А, Т1148)
551 НС*	551 каппа
553 НС*	553 каппа
555 НС*	555 каппа
558 НС	558 каппа
559 НС	559 лямбда С1 (Ν 112 А, Т1148)
565 НС*	565 каппа
Р1-С6НС	Р1-С6 лямбда С2
РВ1-А7НС	РВ1-А7 лямбда С2( О 107А8)

- 49 011866

14)-132 НС	Ρ ϋ-Β2 лямбда СЗ ( О 107А 5)
РЕ-В7 НС	Ρ Е-В7 каппа
РД-О11НС	Ρ 1-011 каппа
ЕК-Г.З НС	Ρ К-ЕЗ каппа
ОЮ4НС*	0Ю4 лямбда С2
СС1Е8НС	6С1Е8 лямбда СЗ ( К 149 К)
Н1С12НС	Н1С12 лямбда С2
1А1-1Е7НС	I А1-1Е7 каппа
1Р-1С1ОНС	1Р-1С10 лямбда СЗ (Т212А)
ΙΚ-2Ε2 НС	ΙΚ-2Ε2 лямбда С2 (Т212А)
1Р-2С11 НС	1Р-2С11 каппа

*Испытано на связывание с человеческим Апд-2, мышиным Апд2 и человеческим Апд-1, как здесь описано.

Некоторые константные области лёгких цепей лямбда оказываются химерами, состоящими более чем из одного гена зародышевой линии константной области лямбда. Указан самый близкий ген зародышевой линии константной области вместе с аминокислотами, составляющими отличие от гена этой зародышевой линии, пронумерованными в соответствии с системой КаЬа!.

В следующих четырех таблицах представлены последовательности и идентификационые номера последовательностей тяжёлых и лёгких (каппа и лямбда) цепей 31 антитела к Апд-2, реконструированных из фага в 1дО₁ полной длины. Участки, определяющие комплементарность (СОЯ) моноклональных антител, были предсказаны с помощью базы данных УВА8Е, которая использует методику, описанную Кабатом и др. (КаЬа! е! а1. ш 8едиепсе5 оГ Рго!ет§ оГ 1шшипо1од1са1 1п!егек! (№1Н РиЬйсаЕоп №о. 91-3242; и.8. Эер!. НеаИй апй Нишап 8еМсек, 5'¹' ей.)). Области ЕаЬ были выровнены с последовательностями из базы данных с ближайшей последовательностью зародышевой линии при помощи средств, доступных в Центре белковой инженерии МЯС, Кембридж, Великобритания, а затем зрительно сопоставлены с такими последовательностями. СОЯ каждой вариабельной области (тяжёлой и лёгкой цепей) приведены в табл. 7.

- 50 011866

Вариабельные участки тяжёлых цепей

Таблица 3

Тяжёлая цепь (НС) антител	Последовательность
526 НС (8Е<2 ГО N0: 1)	ЕУ0ЬУЕ8ОООУУрРОК8ЬКЬ8САА8ОРТР88УОМНтеУК9АР ΟΚ.αΕΕΨν8Α18Ο8Ο08ΤΥΥΑΟ8νΚΟΚΓΤΙ8ΚΟΝΑΚΝ8ΕΥΕρ ΜΝδΕΚλΕϋΤΑνΥΥ6ΑΗϋΕΕΟΥΌΙΕΤΟΡΥΑΥ\νθρθΤΕντν88
528 НС (8ЕС> ГО ΝΟ: 3)	ОУОЬУрЗаЛЕУККРСЗЗУКУЯСКАЯСбТЕКЗУЛКШ'КрЛР ΟΟΟΕΕ\νΜ(ί(ίΙΙΓ4Ρ(7ΓΛΝΥΑ()ΚΡ(χίΙ<νΊΊΤΑΕ>Ε8Τ81ΆΥΜΕ1_ 88ЬК8 ΕΟΤΑνΥΥΕΑΓ<θνναθΡϋ%+8ΡΡΟΥ\νθ06ΤΕντν88
531 НС (8Е() ГО ΝΟ: 5)	ЕУСД.Ур8С,ЛЕУККР088УКУ8СКЛ8ООТГ88УАКтеУЕ0АР 0ρ0ΕΕ\νΜ00ΠΡΙΕαΐΑΝΥΑ9ΚΡρ6ΚνΤΙΤΑ0Κ8ΤΝΤΑΥΜΕΕ Τ8ΙΤ8 ηθΤΑνΥΥεΛΚΠΗΕΟΤΑΜνΓΝΥ\νϋΟΟΤΡ.ντν88
533 НС (8Е<> ГО ΝΟ: 7)	Ενζ)Ι.νρ86(ί(ΐνν0Ρ(ΐΚ8Ι.ΚΙ.8(ΑΑ8(:ΡΊΡ88 ΥΟΜΗλννΡίχχΡ 6Κ0ΕΕλνν8ΥΙ88808ΤΙΥΥΑ08νΚ0ΚΡΤ18ΚΟΝΑΚΝ8ΕΥΕ()Μ Κ8ΕΚΑ ΕΟΤΑνΥΥϋΑΚΗΙ.ΙΌΥηίΕΤΟΥαΥΑναρΟΤΡντν^
535 НС (8Е(2 ГОРЮ: 9)	0УрЕУ08СЛЕУКК1Ю88УКУ8СКЛ8СОТР88УА18\УУК.С)АР (ί(χΐΙ + Δ·®Κί(^Ρ1Ρ(.τΤΑΝΥΑ(^ΗΥ0Ρ νΠΤΑΟΚ8Τ8ΤΛΥΜΕΕ 88ЬК8 ΕϋΤΑνΥΥ€ΑΑΡ8ΡΡΤΕΊυΑΡΟΙ\νΌ9Ο3Μντν88
536 НС (8Ер ΙΓ1Ν0: Η)	ЕУОЬУ98С/ОСЛ’УГ)Р6К8ЕК1.8СЛА8С\|ЕТР88У<7МП\УУКС)ЛР 6Καΐ.ΕΑνν8ΥΙ888α8ΤΙΥΥΑΓ)8νΚ(?τΚΡΤΙ8ΚΠΝΑΚΝ8ΕΥΤ.ρΜ Ν8ΕΚΑ Ε^ΤΑνΥΥ€ΑΕΟ[ ΡΠΥΓΛΡΤ6ΥΓίΥ\νθ06ΤΤΛ'Τν88
537 НС (8Е<2 ГО ΝΟ: 13)	ρνρΕνρ8ΟΑΕνΚΚΡΟ88νκν80ΚΑ8ΟΟΤΕ88ΥΑΙ8ψνΚ0ΑΡ СдУЕЕте'МСС11Р1Е61АЛУА0КРдаКУТ1ТАОК8Т8ТАУМЕЬ 86ЬС8 ΡΟΤΑνΥΥ€ΑΚα88ΟΑΑνΑ6Μ\ναρθΤΙ_ντν88
540 НС (8ЕС2 ΙϋΝΟ: 15)	9У0ЕУр8САЕУККРСт88УКУ8СКА8С1С1ТГ88УА18ХУУКрАР 6ρ6ΕΕ\νΜ6ΟΙΙΡΙΕϋΙΑΝΥΑ9ΚΡ9ΟΗνΤΙΤΑΠΚΡΤ8ΤΑΥΜΕΕ 88ЬС8 ЕОТАУУУСАКАУРО ГЕГ)АР1Яте(КХП МУТУ88

- 51 011866

543 НС (8Е(_) ΙϋΝΟ: 17)	0УО1Л'08(1АЕУККРО88УКУ8СКА8ООТР88УА18и^гУ]<С>АР ΟΟσ,ΕΕλνΜΟΚΠΡΠ,αΐΑΝΥΛΟΚΓΟΟΚνΤΙΤΛΟΚΪΤδΤΑΥΜΕΕ 88БЯ8 Ε0Ί ΑνΥΥί:ΑΚΡΥΥ0Γν.Υ6Ρ66Μ0νν.Ό90ΤΤντν88
544 НС (8Ε<3 ГО ΝΟ: 19)	0ν0Εν08ΟΑΕνΚΚΡΟΑ8νκν8ΟΚΑ86ΟΤΡ88ΥΑΙ8ΨνΚ9ΑΡ ΟςΟΕΕλΥΜΟΟΙ 1ΡΙΡΟΤΑΝ УАОКЕОСгКУТ1ТАОЕ8Т8ТЛ ΥΜΕΕ 88ΕΚ.8 ΕΟΤΑνΥΥΟΑΚΓΕ8ΟΥ\νθΌΑΡΠΙ\νθ0ΟΤΜντν88
545 НС (8ЕС? ГО N0:21)	0ν(₂Ε0Ε8ϋϋϋνν0ΡΟΚ8ΕΡΕ8εΑΛ8<51··ΤΓ88ΥΟΜΠνννκρΑΡ ΟΚΟΕΕλΥνΑνΐ8ΥΟΟ8ΝΚΥΥΑΟ8νΚΟΚΕΤΙ8ΚϋΝ8ΚΝΤΕΥΕ9 ΜΝδΕΚΑΕϋΤΑνΥΥΟΑΚΟΡνΟΡΟΥΟΟΥΑΙΠΥΨΟΟΟΤΕνΤνΒ
546 НС (5Е(? ГО N0: 23)	ЕУрЕУО8ООСЕУрРОО8ЕКЕ8САА8СРТР85¥АМ8\УУК9АР ΟΚΟΙ,Ε\νν8Α18Ο8ΟΟ8ΤΥΥΑΙ)8νΚΟΙΗΓΙ5ΚΟΝ8ΚΝΓΕΥΕ0 ΜΝ8ΕΚ. ΑΕΟΤΑνΥΥΟΑΚΕΤΙ8Ε8ΤΓ80ΥΓΤ)Υ\νΑΟΟΤΕντν88
551 НС (8Ер ГО N0: 25)	^V^^V^80ΑΕVΚΚΡ088VΚV8СΚΑ80ΟΤΡ88ΥΑI81VVΚ^ΑΡ 0ρ(τΙ.Ε\νΜ(ί(ίίΙΡΙΕ(ίΊΑΝ ΥΑ0ΚΙ·Ο(τΚνΤΠΑΟΕ8Ι8ΙΑ ΥΜΕΕ 58ЕВ.8ЕОТАУУУСАВ.СУОР)У80¥8ЕОАР013УСрОТМУТУ88
553 НС (5ЕС2 ГО ΝΟ: 27)	ρν01.ν08ΟΑΕνΚΚΡΟΑ8νκν8€Κ./\8ΟΥΤΓΤ8ΥΛΜΠ\ννΚ0Λ ΡΟ9ΚΕΕ\νΜΟΨΙΝΑΟΝΟΝΤΚΥ59ΚΡ9ΟΕ.νΤΙΤΚΟΤ8Α8ΤΑΥ Μ ΕΙ ,8(31 ,Ι<8ΕΙ)ΊΛ V Υ УСЛГЙЗ V Ι)Γ) Υ(30 ΝΥ\¥ ΑΡΙ) 1 Υ'ΟΟΟΓΜ V ТУ88
555 НС <8ЕС\| ГО ΝΟ: 29)	<3ν(}Ε(2Ε86<36νν()Ρ6Κ8ΕΚΕ8€ΑΑ8σΡΤΡ88ΥΑΜΗ3ννΐ<(2ΑΡ 0Κ0ΕΕΥ⁷νΛνΐ8ΥΟΟ8ΝΚΥΥΛΟ8νΚ6ΚΕΤ18ΚΌΝ8ΚΝΤΕΥΕ0 ΜΝ8ΕΚΑΕΟΤΑνΥΥ0ΑΚ8Α8ϋΗΥΥΟ88ΟΥΥ8ΟΑΡΟΙλνθ0ΟΜ УТУ88
558 НС (8Е<2 ГО N0: 31)	9ν()Ε90\νθΑΟΕΕΚ.Ρ8Ε1Ε8Ε1ΕΆν Υ008Ρ80ΥΥ\νδ\νΐΚ08Ρ ΟΚ6ΕΕν.··ΙΟΕΙΝΗ808ΦΗΟΝΡ8Ι.Κ$ΚΙΤ[8νΗΤ8ΝΝ0Γ8ΕΚΕ88 νΤΑΑϋ ΤΑΑΥΥΟΑΚΟΗΟΧνΟΜΟΙΟΟΑΑΥϋΠΥΟρσΤΜνΤνδδ
559 НС (8Е0 Ю N0: 33)	0У0ЕУ08ОАЕУККРОА8\'КУ8СКУ8ОУ1ЕТЕ88МН\У\Т<<2А ΡαΚΟΕΕ3ΥΜθσΡΟΡΕΗ6ΕΤΙΥΑ(}ΚΕ0σΚΕΤΜΤΕΟΤ8ΤΟΤΑΥ ΜΕΕ88ΕΚ8ΕΟΤΑνΥΡεΑ1ϊ<3ν9νΤ80ΥΗΥΡηΗ\νθ<26ΤΕνΤν8
565 НС (8Е() ΙΏΝ0: 35)	^V^^V^8СΑΕVΚΚΡΟ88VΚV8СΚΑ8СΟΤΡ88ΥΑI8¾^,VΚ^ΑΡ ΟΟΟΕΕΆ’ΜΟΟΙ1ΡΙΡΟΤΑΝ Υ АОКЕрСКУПТ ΑΟΕ8Τ8ΤΑΥΜΓΕ 88Ι.Κ8 ΕΙΠ ΑνΥΥ0ΛΚ8ΡΙΥΥΌΙΕΊ('ι1ΟΑΡυΐΥΌ()ΟΤΜντν88

- 52 011866

Р1-С6НС (8Еф ГО N0: 37)	0У0ЕУ08ОАЕУККРС88УКУ8СКА8ООТР88УА18!¥УК0АР ΟΟΟΕΕΜνΜΟΚΠΡΙΕΟΙΑΝΥΑΟΚΡφΟΚνΤΙΤΑΟΚδΤδΤΑΥΜΕΕ 8 8БК8 ЮТАУΥУСАК 0Р!Р8С.А^;ΥΡϋΙ ΑΥΟΕΟΤΕνΤУ88
РВ1-А7НС (8Εζ) ГО ΝΟ: 39)	0У0ЬУЕ8ОООЕУКРОВ8ЬВЕ8САА8ОРТР88УОМН\УУК0АР 0Κ0ΕΕν/νΑνΐΧνΥ008ΝΚΥΥΑϋ8νΚ0ΚΓΤΙ8ΚΟΝ8ΚΝΤΕΥΕΡ ΜΝ8ΕΙΑΑΕΟΤΑνΥΥ0Α№νθΝΥΥΟ886ΥΟΥ\ν00ΟΊτνΤν88
Ρϋ-Β2 НС (8Εζ> ГО N0: 41)	0У0Е005ОРОЕУКР80ТЬ8ЬТСА186ОТУ88№АААЪ^г\У1К08 Ρ8ΡΓιΙ.ΕΑΊ.ΟΚΤΥΥΚ8Κν.^τΥ8ΟΥΑν8Τ.Ε0Κ1ΤΓΝΤ,ΟΤΟΤ8ΚΝ0Ρ 8Е0Ь ΝδνΤΡΕϋΤΑνΥΥΟΑΚΌΚΟΟΥΙΟδλνΟφΟΤΕντνδδ
РЕ-В7 НС (8ΕφΙϋΝ0: 43)	ЕУОЕУЕБОООЫЗОРООЗЕКЬЗСЛЛТОРЗЕООУЕМХА'УВОАР ΟΚΟΕΕ\Υν8ΥΙΙΟ8ΟΚΤΙΡΥΑΟ8νΚΟΚΓΤΙ8ΚϋΝΟΚΝ8νΥΕ9Μ И8ьк лЕотл1УУСлкосс8лууькт8О1 ψοςοτΜντνεδ
ΕΙ-6Ι1 НС (ΞΕφΙϋΝΟ: 45)	0ν0Ενφ8ΟΑΕνΚΚΡΟΑ8νκν80ΚΑ8σΥΤΡΤ8ΥΟΙ8ΑννΚ0ΑΡ ΟφΟΕΕλνΜΟλνΚΑΥΝΟΝΤΝΥΑΟΚΕΟΟΚ,νΤΜΤΤΟΤδΤδΤΑΥ ΜΕΕΚ8ΕΚ.8ϋΟΤΑνΥΥΟΑΚΟΚ.(3ΙΑΑΚ.8ΑΥΥΥΟΜθν\νθΟΟΤΤ УТУ88
РК-ЕЗ НС (8Е0 ГО N0: 47)	0У0ЕУ08ОАЕУККРОА8УКУ8СКА8ОУТРТ8УОЕН1¥УВрА 8Ο0ΟΕΕΨΜΟΨΜΝΡΤ8ΟΝΤ0ΥΑ0ΚΡΡΟΚΙΤΜΤΒΝΤ8Ι8ΤΑΥ ΜΕΕΡ8ΕΓ<80ΟΤΛνΥΥΕΛΚΟΡΡ86θν.'ΕΓΟΥ’λΌ00ΤΙ.ντν88
С1Э4НС (8Е0 ГО N0: 49)	0У0ЕУ086АЕУККРО88УКУ8СКА86ОТР88НА185УУВфАР ΟφΟΕΕλνΜΟΚΙΙΡΙΕΟ 1 ΑΝ ΥΛ0ΚΡ0ΟΚ.νΤΙΤΑΟΕ8Τ8ΤΛΥΜΕΤ, 88ΕΚ.8 ΕΟΊΑνγΥ€Α18ΚΕΕΑΈΕΥΕΟΥ\νθ061ΕνΊ ν88
0С1Е8НС (8Е() ГО N0: 51)	0ν0Εν08ΟΑΕνΚΚΡΟΑ8νκν8ΟΚΑ8ΟΥΤΡΤ8ΥΟΙ8\¥νΚ0ΑΡ Ο9ΟΕΕλνΜΟλνΐ8ΑΥΝΟΝΤΝΥΑ0ΚΕ0ΟΚνΤΜΤΤΟΤ8Τ8ΤΑΥ ΜΕνΚ8ΕΓ<8ϋϋΤΛνΥΥ€ΑΚ608ΡΥΟΟΥΑΥΡΡϋΥ\νθΟΟΤΕνΤ У88
Н1С12НС (8Е0 ГО N0: 53)	Εν0ΕνΕ8ΟΟθνν0ΡΟΚ8ΕΚΕ80ΑΑ8ΟΡΤΡ88ΥΟΜΗ3¥νΚ0ΑΡ ΟΚϋΕΕ\νν8ΥΙ88808ΤΙΥΥΑΟ8νΚΟΚΡΤΙ8ΚΟΝΑΚΝ8ΕΥΕ0Μ ΝδίΚΛ ΕΟΤΛνΥΥ€ΛΚΟΕΕΟΥΟΙΕΤ(3ΥΟΥΑΌΟΟΊΊ.ντν88
1А1-1Е7НС (8Еф ГО ΝΟ: 55)	0ν0Ι.0()\ν(Μ6ΑΕΚΡ8ΕΤΕ8ΕΤ0ΑνΥ«;8Ρ8ΟΥΥ\ν8\νΐΚ08Ρ ΟΚΟΕΕλνΐΟΕΙΝΗ8Ο8ΦΗΟΝΡ8ΕΚ8ΚΙΤΙ8νθΤ8ΝΝφΡ8ΕΚΕ88 νΤΑΑϋΤΑν УУСАКОНО\УОМОЮОААУО1\УО9ОТМУТУ88
1Г-1С10НС (8Е0 ΙΟΝΟ: 57)	0ν0ΕνΕ8ΟΟΟΕνςΡ6Ο8ΕΚΕ80ΑΑ8ΟΡΤΡΡ8ΤΥΑΜΤ\ννΚ0Α ΡΟΚΟΕΕ\νν8νΐΚ8ΝΟΟΤϋΥΑΟΡνΚΟΚΡΤΙ8ΚΕ>Ν8ΚΝΤΕΥΕρ μνοε κΑΕϋΤΑνγγοΜΤϋΥ γχνοοοτΕντν88
1К-2Е2 НС (8Е0 ГО N0: 59)	Εν0ΕΕΕ8ΟΟΟΕν0ΡΟΟ8ΕΒΕ80ΑΑ8ΟΡΤΡ88ΥΑΜ8ΨνΚ0ΑΡ ΟΚΟΕΕ\ννδΑ18Ο8αθ8ΤΥΥΑΟ8νΚ<3ΚΓΤΙ8ΚΟΝ8ΚΝΤΕΥΕΕ) ΜΝ8ΕΚ ΛΕ0ΤΑνΥΥΰΑΚΕΤΚΕ8ΊΕ80ΥΓΟΥ\ν60ΟΤΕντν88
1Р-2С11НС (8Е<2 ГО N0: 61)	0νςΕν08ΟΑΕνΚΚ.Ρ6Α8νκν80ΚΑ8ΟΥΤΡΤ8ΥΟΙΝ\ννΚ0ΑΤ ΟΟΟί.ΕΧνΜΓΑνΜΝΡΝδαΝΓΰΥΑΟΚΡΟΟκνΤΜΓΚΚΤδΙδΤΛΥ ΜΕΕ88ΕΒ.8ΕΟΤΑνΥΥΟΑΚΕΙΑνΑΟΤΚΥΟΜθνΨΟΟ(3ΤΤνΤ88

- 53 011866

Вариабельные участки каппа-цепей

Таблица 4

Лёгкая цепь (ЬС) антител	Последовательность
526 каппа (8Е9 ГО N0:2)	ΟΐνΜΊΟ8ΡΕ8Ι_ΡνΤΡ(1ΕΡΑ8Ι8ΕΕ8808ΕΕΗ8Ν(1 УМУШ\¥ ΥΕ0ΚΡΟ98Ρ0ΕΕΙΥΕΟ8ΝΚΑ8θνΡΟΚΓ8Ο8Ο8ΟΤΟΕΤΕΚ18 КУЕАЕОУОУ ΥΥΟΜΟΑΙ.ΟΤΡΡΤΕΟΟΟΤΚνΕΙΚ
533 каппа (8Ε()ΙΟΝΟ:8)	ΟΐνΜΤ<.)8ΡΕ8ΕΡνΤΡΟΕΡΑ8Ι8ΟΙ<88Ο8ΕΕΗ8ΝΕίΥΝΥΕΝΆ' УЬ9КРОр8Р01ЫУЕ08МКА8ОУРОКГ8О8О8ОТОГТЬК18 КУЕАЕОУОУ ΥΥΟΜΟΟΕΟΤΡΡΊΕΌΟΟΤΚΕΕΙΚ
536 каппа (ТНЗУ) (8Е0ГОКО: 12)	ΟΐνΜΤ08ΡΕ8ΕΡνΤΡΟΕΡΑ8Ι80Κ5808ΙΧΗ8ΝΟΥΝΥΕΟΧν УЕ0КРОр8РрЕЕ1 УЕО8¥1{А8ОУТ’ОИР868О8ОТОРТЬКТ8 КУЕАЕОУОУ ΥΥΕΜΟ<ίΊΉ\νΡΡ ΓΕΟΟΟΊΚΕΕ1К
536 каппа (Ь()Т) (8Ер ГО N0:210)	О1УМТ08РЕ8ЬРУТРОЕРА818ΓΚ8808ΕΕΗ8ΝΟΥΝ УЬО\У ΥΈΟΚΡ 6р8Р0ШУШ8МКА86УРОКГ8С8О8СТОР ТЕК18РЛ'ЕАЕ0У0УУ ΥΕΜΟΟΕΟΤΡΡΤΕΟΟΟΤΚΕΕΙΚ
543 каппа (8Ε<)1ΟΝΟ: 18)	О1УМТ08РЬ8ЕРУТРОЕРА818СК8808ЬЬН8К0УМУ1.О1У УЕ0КР6<38Р0ШУЬ68МКА8СУРОКЕ8О8686ТПЕТЕК18 КУЕАЕОУОУ ΥΥΟΜΟΑΕΟΊΓΕ ΓΚΧΚ, Ι κνΕΙ К
551 каппа (8Е0 ГО ΝΟ: 26) 553 каппа (8Е0 Ιϋ N0: 28) 555 каппа (8ЕЦ ГО N0: 30) 558 каппа (8Е(} ГО N0: 32) 565 каппа (8ЕС) ΙΟΝΟ: 36) 565 каппа (2) (8Е0 ГО ΝΟ: 211)	ΟΐνΜΤ08ΡΕ8ΕΡνΤΡΟΕΡΑ8Ι80Κ8808ΕΕΗ8ΝΟΥΝΥΕΟ ΨΥΕρΚΡθς8Ρ0ΕΕΙΥΕΟ8ΝΚΑ8θνΡΟΚΡ8Ο8Ο8ΟΤΟΡΤΕ К18КУЕАЕ0У0У ΥΥΕΜΟΑΙ.Ο'Ι'ΡΙΜΊ'ΟΟΟΊ ΚνΕΙΚ ΟΐνΜΤ08ΡΕ8ΕΡνΤΡΟΕΡΑ8Ι80Κ.88φ8ΕΕΗ8ΝΟΥΝΥΕΟ \УУЕ0КРО08Р0ЬЫУЕ68МКА8ОУРОкРТО8О8АТОРТЬ К18КУЕАЕ0У0У УУСМ()АЕОТРЕТГ060ТКУЕ1К ΟΐνΜΤ08ΡΕ8ΕΡνΤΡΟΕΡΑ8Ι80Κ8808ΕΕΗ8ΝΟΥΝΥΕΟ \νΥΕ0ΚΡ608Ρ0ΕΕΙΥΕΛ8ΝΕΛ8θνΡΟΗΡ8Ο8<38ΟΤΠΓΤΕ ΚΙ 8ΚνΕΑΕϋναν ΥΥΟΜφΤΙ.01Р1ТГСРОТКУ1Ж Е1УЕТ(}8Р6ТЕ8Е8РОЕКАТЕ8СКА8ф8У5888ЕА\УУ(3<ЗК РО0АРКЬЕУУАА88КАТО1РОКР8С8О8ОТОРТЕТ18КЕЕ РЕОГАУУУС0 ΗΥΟ88ΡΚΤΕΟ0ΟΤΚνΕ1Κ Е1УЕТ08РОТЕ8Е8РСЕКАТЕ8СКА808У8888ЕАХУУ00К РО9АРКЕЕУУАА88КАТО1РОКР8О8О8ОТОРТЕТ18КЕЕ РЕОРАУУУСО НУС88РКТГС;СЮТКУЕ1К ΟΐνΜτς8ΡΕ8ΕΡνΤΡΟΕΡΑ8Ι8ΟΚ8808ΕΕΗ8ΝΟΥΝΥΕΟ \νΥΕ0ΚΡΟ08Ρ0ΕΕΙΡΕα88ΚΑ8θνΡΟΚΡ8Ο8Ο8ΟΤΟΡΤΕ К18КУЕА00У61У УСМ0ЛЬОТРРТРС.РСТКУЕ1К
РЕ-В7 каппа (8Ер ΙΌΝΟ: 44)	1)1 УМТ08РЕ8 ЬРУТРОЕР А81 δΟΚδδφΒΕΕΗδΚΟΟΝΥΕΟ \УУЕ0КРСг08Р0ЕЕ1УЕО8Е[[<А8аУРОКР8О8С8СП’ОГТ1. К18КУЕАЕОУОУ УУСМ0ЛЕ0ТР1.ТгаСК!ТКУЕ1К
Ю-О11 каппа (8Е<2 ГО N0: 46)	ΟΙ\^ΓΜΓ0ΤΡΕ8ΕΡνΓΡϋΕΡΑ8[8ΕΤ<8808ΕΕϋ8ΟϋΕίΚΤΥΊ.ί) 1УУЬ0кРО08Р0ЬЬМУТТ88КА8ОУРОКР8О8О8ОТЦРТ ЬК18КУЕЛЕ0У0 VУΥΟΜΟΛΤΟΕΙ’ΥΤΡΟΟΟΤΚΙ ΕΙΚ
ГК-ЕЗ каппа (8Е0 ГО ΝΟ: 48)	О1УМТ0ТРЕ88ТУТЕО0РА818СК8808ЬУНЕ0ОНТУЬЙ %ТН0КР<30РРКШУК.18ККР8ОУРОКР8О8<ЗАОТОРТЕ К18КУЕРЕОУОУУ УСМ08ТКГРКТРО0СТКЕЕ1К
ΙΑ1-1Ε7 каппа (8Е<3 ГО N0: 56)	Е1УЬТ08РАТЬ8Е8РОЕКАТЬ8СКА808У888РЬАЗ¥У00К АОО ΑΡΚΕΙ, 1 Υ0Τ8ΤΚΑΤ61АОКГ8О8О8ОТОРТЬТ18КЕЕ АЕОКАУУУСОО ΥϋΡδΡΕΤΡΟΟΟΤΚνΕΙΚ
1Р-2С11 каппа (8Е0 ГО N0:62)	Е1УЬТ08РОТЬ8Е8Р<ЗЕКАТЕ8СКА80818ТРЕАХ¥У0С)КР 0рАРКШУ0А8НКАТС1РОКР8О8О80ТОРТЕТ18НЬЕР ЕОРАУУУС0НК1 ΝλνΡΕΤΡΟΟΟΤΚΥΕΙΚ

- 54 011866

Вариабельные участки лямбда-цепей

Таблица 5

Лёгкая цепь (ЬС) антител	Последовательность
528 лямбда (5Е<2 ГО ΝΟ: 4)	ЗУЕЕТОРРЗУВУЗРООТАЗИСЗООКЬОУТУТБХУГООКРООЗРУЕ νίΓρΟΓΚΚΡδΟΙΡΕΚΓδΟδΝδΟΝΤΑΤΕΤΙδΟΤρΑΜΟΕΑΟΥΥΟΙ^Α XV ϋδΤΤΑννΡΟΤΟΤΚντνΕ
531 лямбда (δΕ<3 [ΟΝΟ: 6)	ρδνΕΤΟΡΡδνδΑΑΡΟΟΚντνδίΑΟδδδΝΙΟΝΝΥνδΧνΥΟΟΕΡΟΤΑ ΡΚΕΕΙΥΟΝΝΚΚΡδΟΙΡΟΚΡδΟδΚδΟΤδΑΤΕΟΙΤΟΕρΤΟΟΕΑΟΥΥΟ ΟΤννϋδδΕδΛΕΑ'νίΟΟΟΊ КЬГ\'Ь
535 лямбда (8Εζ)ΙΟΝΟ: 10)	ΡδνΕΤΟΡΡδνδΑΑΡΟΟΚνΤΙδΟδΟδΝδΝΙΟΝΝΓνδΨΥΟΟΕΡΟΤΑΡ ΚΕΕνΥΟΝΝΚΒΡδΟΙΡΟΚΡδΟδΚδΟΤδΑΤΕΟΙΤΟΕΟΤΟΟΕΑΟΥΥε σπνϋδ δίδ ААЕУ УЕ66ОТКЕТУЕ
537 лямбда (8Εζ) ΙϋΝΟ: 14)	ΟδνΕΤΟΡΡδνδΑΑΡΟΟΟνΤΙδΟδΟΝΝδΝΙΟΝΝΥνδΑνΥΟΟνΡΟΤΑ ΡΚΕΕνΥΟΝΗΚΚΡδΟΙδΟΚΕδΟδΚδΟΤίΛΤΕΟ 1 ΤΟΕρΡΟΟΕΛΟΥΥ С ΟΤ\ΧΌΤ8Ε8ΑΝ\ννΗΧΚΠΚΕΤνΕ
540 лямбда (8Е0 ГО ΝΟ: 16)	ΟδνΕΤΟΡΡδνδΑΑΡΟΟΚνΤΙδΟδΟδδδΝΙΟΑΝΥνδλνΥΟΟΕΡΟΤΑ ΡΚΕΕΙΥΝΝΝΚϋΡδΟΙΡΟΚΓδΟδΚδΟΤδΑΤΕΟΙΤΟΕΌΤΟΟΕΑΟΥΥε 0 ΑΨΟδδΕδΑδΨνΡΟΟΟΤΚΕΤνΕ
544 лямбда (ΝΕΟ ГО N0: 20)	8ΥΕΕΓΕ)ΡΡ8ν8ν8Ρ09ΤΛΚ1Τ08(10ΑΕΡΚΟΥΛΥ\νΥΟζ)ΚΡ(.ϊΟΛΡ νΕνίΥΚϋδΕΚΡδΟΙΡΕΒΡδΟδδδΟΤΤνΤΕΤΙδΟνςΑΕΟΕΑΟΥΥΟρδ Α ΟδδΗννΡΟΟΟΤΚΕΤνΕ
545 лямбда (8ЕС) ГО N0: 22)	Ό8νΕΤρΡ88νδΟΑΡΟ(2ΐυ/ΤΙ80Τ(3(288ΝΙ(3Α6ΥθνΗΧνΥρ(2ΕΡ(3Κ. ΑΡΚΕΕΙΥΟΝδΝΡΡδΟνΡΟΚΡδΟδΚδΟΤδΑδΕΑΙΤΟΕΟΡΕΟΕΑΟΥΥ ΓΟδΥΟδΚΕδΰδνΐΌΟΟΤΚΕΤνΕ
546 лямбда (8Еф ГО N0: 24)	ΟδνΕΤΟΡδδνδΕΑΡΚρκνΤΙδΟδΟδΑδΝΙΟΑΝΟνδν/ΥΗΟνΡΟΚΑ РВЕЕЕ8НООЕУТ8ОУРОКЕ8У8К8 ΟΤ8 Α8 ΕΛΙδΟΕΗδΟΟΕΟϋΥΥΟ АУХУСЮЗЕКАУУРОСОТКЕТУЕ
559 лямбда (8Εζ) ГО N0: 34)	Ό8ΑΕΤφΡΡδΑ808Ρ(}Ό5ΙΤΙ80ΤΟΤΝ80Ι0δΥΡΡν8ν/Υ9ΚΗΡ0ΚΑΡ ΚΕΕΙΥΟνδΝΚΡδΟνδΟΚΡδΟδΚδΟΝΤΑδΕΤΙδΟΕΟΑΕΟΕΟΟΥΥΟδ δΡΤΜΝδΕνίΡΟΟΟΤΚΕΤΥΕ

- 55 011866

Р1-С6 лямбда (8Е0 ГО N0: 38)	08УЕТ0РР8У8ЕАРК0РУТ18С86888МСАМАУтА00ЕРОКАР КЬЬ1Υ УООЬЬРЙб У8ОВР8О8К8ОТ8А8ЕА18ОЬК.8ЕОЕАО Υ УСА Ί\νθΟ8Ε8ΟΑ'νκαααΤΚΕΤνΐ.
РВ1-А7 лямбда (5Е<2 ГО N0: 40)	ΝΡΜΕΤς)ΡΗ8ν8Ε8ΡΟΚΤνΊΊ8σΠ18000Ι088ΡνΗΨΡ(}()ΚΡ(388Ρ ΤΤνΐΡΟΟΝ0ΚΡΤ6νΡΟΚΡ8ΑΑΙΟΤ8888Α8Ι.ΤΙ86Ι.ΤΛΕΟΕΑΟΥΥ€ 088Н8ТАУУРСООТКЕТУЕ
ПЗ-В2 лямбда (8Е<2 ГО N0: 42)	ΝΡΜΕΤΟΡΗδνδΕδΡΟΚΤνΤΙδΟΤΚδδΟδΙΑΤΝΥνΟΑΎΟΟΒΡΟδδΡ ΑΤνΐΥΕΟΝ0ΚΡ8&νΡΟΚΡ868ΙΟΤ88Ν8Α8ΕΤΙ8ΟΕΤΤΕΟΕΑϋΥΡ0 08ΥΟϋΝΝ\ννΡααθΤΚΕΤνΕ
0ГО4 лямбда (8Е0 ГО N0: 50)	ΝΡΜΕΤ0ΡΗ8ν8Ε8ΡΟΚΤνΠΡ0ΤΚ88Ο8ΙΑ8ΝΥν03¥Υ0ΚΚΡΟ8ΑΡ 81ΥΙ ΥΕϋΚρΓ<Ρ80νΡ(3«Ρ868ΙΌ888Ν8Α8[.Γ18СЬК1Е0ЕА0УУС 08ΥΝ8ΒθνΜΡΟΟΟΤΚΕΤνΕ
0С1Е8 лямбда (8Е0 ΙΟ ΝΟ: 52)	ΝΡΜΕΤ0ΡΗ8νΕΕ8ΑΟΚΤνΤΙ8ΟΤί<3568ΙΑ8ΝΥν0ΨΥ00ΒΡ<3Τ8Ρ ΤΝνΐΡΕϋΝρΚΡ8θνΡΟΚΡ8Ο8Ι0888Ν8Α8ΕΤΙ8ΟΕΚΤΕ0ΕΑΟΥΡ0 08 ΥϋδΝ ι ν/νραοοτκΕτνί
Н1С12 лямбда (8Е0 ГО N0: 54)	08νΕΤ0ΡΡ8ν8ΑΑΡΟ0ΚνΤΙ8Ο8Ο888ΝΙΟΝΝΥν8ΨΥ0ΗΕΡΟΤΑΡ ΚΕΕΙΥΟΝΤΝΚΡ86νΡΟΚΡ8Ο8Κ8ΟΤ8Α8ΕΑ1ΑΟΕ0ΑΕΟΕΑϋΥΥ0 08УЕ)88Е8О81ЛТ<эаатКЕТУЕ
1Р-1С10 лямбда (8Е0 ГО N0: 58)	ΝΡΜΕΤ0ΡΗ8νδΕ8ΡΟΚΤνΤ180ΤΟ8ΟΟ8ΙΑ8ΝΥν0\νΥ00ΒΡΟ8Α ΡΤΤνΐΥΕΟΝ0ΚΡ8θνΡΟΚΡ8Ο8ΙΟ888Ν8Α8ΕΤΙ8ΟΕΚΤΕΟΕΑΟΥΥ СОЗУОЗЗТХУУРСгООТКЬТУЬ
ΙΚ-2Ε2 лямбда (8Е0 ГО N0: 60)	08ΑΕΤ0ΡΑ8ν8Ο8Ρα08ΙΤΙ8ΟΤΟΤ88θνθΟΥΝΥν8ΨΡ00ΗΡΚ ΑΡΚΕΜΙΥΚνΝΝΚΡ8ΟΕ8ΝΚΡ8Ο808ΟΝΤΑ8ΕΤ18ΟΕ0ΑΕΟΕΑ ΟΥ ¥С88УТ888ТЬОРСССТКЬТУЕ

- 56 011866

Человеческие константные участки (СЯ)

Таблица 6

Константные области (СК) антител	Последовательность
Человеческая	Ο0ΡΚΑΝΡΤνΤΡΓΡΡ88ΕΕΐΧ)ΑΝΚΛΊΊ.νίΧΙ8υΡΥ'Ρ6ΑνΤνΑ\νΐ<
константная	ΑΟΟ8ΡνΚΑθνΕΤΤΚΡ8Κ08ΝΝΚΥΑΑ88ΥΕ8ΕΤΡΕ0λνΚ8ΗΚ8Υ
область лямбда 1 (С1) (5Е0 ГО N0: 63)	8С0УТНЕС8ТУЕК1УАРТЕС8
Человеческая	Ο^ΡΚΑΑΡ8VΤ^ΓΡΡ88ΕΕ^^ΑNΚΑΤ^VС^I8^ΡΥΡΟΑVΤVΑ¾'Κ
константная	ΑΟ88ΡνΚΑσνΕΤΤΤΡ8Κ08ΝΝΚΥΑΑ88ΥΕ8ΕΤΡΕ0ΨΚ8ΗΚ8Υ8
область лямбда 2 (С2) (8Ер ГО ΝΟ: 64)	С(?УТНЕО81УЕКТУАРТЕС8
Человеческая	6ОРКААР8УТ1.ЕРР88ЕЕ1ХЛА^КА!1Л'С1.181)КУР(лА\'1Л'А\УК
константная	ΑΟ88ΡνΚΑθνΕΤΤΤΡ8Κρ8ΝΝΚΥΑΑ88ΥΕ8ΕΤΡΕρ\νΚ8ΗΚ8Υ8
область лямбда 3 (СЗ) (ΒΕζΗϋΝΟ: 65)	С<?УТНЕО8ТУЕКТУАРТЕС8
Человеческая	0ρΡΚΛΑΡ8νΤΕΕΡΡ$8ΕΕΕ9ΑΝΚΛΤΙ_ν€Ι.ν80ΡΥΡ6ΛντνΛ\ν
константная	ΚΑΟΟ8ΡνκνονΕΤΤΚΡ8Κ<)8ΝΝΚΥΑΑ88ΥΕ8ΕΤΡΕ9\νΚ8ΗΚ8
область лямбда 7 (С7) (8Е() ГО ΝΟ: 66)	У8СКУТНЕО8ТУЕКТУАРЛЕС$
Человеческая	ΚΤνΑΑΡ8νΓΙΕΡΡ8ΟΕ9ΕΚ8ΟΤΑ8νν0ΕΕΝΝΡΥΡΚΕΑΚ.ν<)λνκν
константная	ΟΝΑΕ08ΟΝ80Ε8νΤΕρθ8ΚΟ8ΤΥ8Ε88ΤΕΤί8ΚΑΟΥΕΚΗΚνΥ
область каппа (8Εζ> ГО N0: 67)	АСЕУТНС<31.88РУТК8РЖСЕС
Человеческая	А8ТКС\|Р8УГР1.АР88К8Т8ССТААЕС\|С1_УК.ОУТРЕРУТУ8\УЫ8
константная	бАЕТ8СУНТЕРАУЕС>88ОЕУ8Е88УУТУР888Еет9ТУ1СМУМ
область кС1	Η
(8Εζ)Π}ΝΟ:	КР8КТК.УОККУЕРК8СОКТНТСРРСРАРЕЕЬООР8УРЬЕРРКРК
68)	ΟΤΕΜΙδΚΤΡΕνΤΟνννονδΗΕϋΡΕνΚΓΝλνΥνΏΟνΕνΗΝΑΚΤ ΚΡΚΈΕρΥΝδΤΥΚννδνΕΤνΕΗΟΟΧνΕΝΟΚΕΥΚΟΚνδΝΚΑΕΡΑ ΡΙΕΚΤΙδΚΑΚαΟΡΒΕΡρνΥΤΕΡΡΒΚϋΕΕΤΚΝΟνδΕΤεΕνΚΟΓΥΡ 8ΌΙΑνΕ\νΕ8ΝΟ9ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡνΕΟ8θσ8ΕΓΕΥ8ΚΕΤνθΚ8Κλν СраКУР5С8УМНЕАЕНХНУТрК5Ь5Е8РОК

- 57 011866

Таблица 7

Участки, определяющие комплементарность (СОК) тяжёлых цепей (НС) и лёгких цепей (ЬС) антител (АЬ) к Апд-2

	СОК1
Антитела	Остатки
АЬ526 НС	5ΥΟΜΗ (ЗЕО Ю N0: 69)
АЬ526 КС	Κ85ρ81Λ.Η8Ν6ΥΝΥίΟ (ЗЕО ТО ΝΟ: 70)

АЬ528 НС	3ΥΑ18 (ЗЕО ТО N0:71)
АЬ528 ЬС	ЗбОКЬСУТУТЗ (ЗЕО ΙϋΝΟ: 72)
АЬ531 НС	8ΥΑΙ5 (ЗЕО ГО N0:71)
А0531 ЬС	3Ο888ΝΙ6ΝΝΥν8 (ЗЕО ГО ΝΟ: 73)
АЬ533 НС	8Υ6ΜΗ (ЗЕО ГО ΝΟ: 69)
АЬ533 КС	ΚΒδΟδίίΗΒΝΟΥΝΥΕΝ (ЗЕО Ιθ ΝΟ: 74)
АЬ535 НС	8ΥΑΙ3 (ЗЕО ТО N0:71)
АЬ535 ЬС	8Ο8Ν8ΝΙ0ΝΝΓν3 (8Е0 ГО ΝΟ: 75)
АЬ536 НС	8ΥΟΜΗ (ЗЕО ГО N0: 69)
АЬ536 (ТЭТУ) КС	КЗЗОЗЬЬНЗНбУИУЬО (ЗЕО ГО N0:70)
АЬ53б (Ь<5Т) КС	Κ3308ΕΕΗ5ΝΟΥΝΥίΟ (8Е0 ГО ΝΟ: 70)

СОК2	СРКЗ
Остатки	Остатки
А130 860 8ΤΥΥАОЗУКО (8Е0 ГО ΝΟ: 105)	ОЬЫЗУОИТСРУЛУ (8Ε0 1ΟΝΟ: 144)
ЬСКМКАЗ (ЗЕО ГО N0: 106)	МОАЬОТРРТ (ЗЕО ГО ΝΟ: 145)
ΟΠΡΙΓΟΤΑΝΥΑΟΚΓΟΟ (8Е0 ΙϋΝΟ: 107)	бУУООЕОУУЬЗГГОУ (ЗЕО 10 N0: 146)
0ОЕККР8 (ΪΕΟ ГО ΝΟ: 108)	ОАХУОЗТТАУУ (8Е0 ΙΟΝΟ: 147)
ΟΙΙΡΙίΟΙΑΝΥΑΟΚΡΟΟ (8Ε0 ΓΟΝΟ: 109)	ΟΚΈΟΤΑΜνΡΝΎ (8ЕО ΙΟΝΟ: 148)
0ΝΝΚΚΡ8 (8Ε0 ТО ΝΟ: 110)	СТиТЗЗЗЬЗАЕЗУУ (ЗЕО ГО ΝΟ: 149)
Υ183868ΤΙΥΥΑΟ8νΚΟ (ЗЕО ГО ΝΟ: 111)	ОЬЬОУОИТСУОУ (ЗЕО ΙΟ ΝΟ. 150)
1.68ΝΚΑ8 (ЗЕО ГО ΝΟ: 106)	мосьотррт (8ΕΟΙΡΝΟ: 151)
ΟΙΙΡΙΡΟΤΑΝ ΥΑΟΚΡ'ΟΟ (ΒΕΟΙϋΝΟ: 107)	Ь'ЗРЕТЕТОАЕО! (ЗЕО ГО ΝΟ: 152)
ΟΝΝΚΚΡ8 (8Ε0 ГО ΝΟ: 110)	СТУГОЗЗЬЗААЕУУ (ЗЕО ΙΟΝΟ: 153)
ΥΙ885Ο8ΤΙΥΥΑΟ8νΚ6 (8Ε0 10 ΝΟ: 111)	0ЬЬ0У01ЬТ6У6У (8Ε0ΙΟΝΟ: 150)
ίΟ8ΝΚΑ3 (3Ε01ΟΝΟ: 106)	МОСТН'ЛТРТ (8Ε0ΙΟΝΟ: 154)
1Ό5ΝΚΑ5 (8Ер ΙΟ ΝΟ: 106)	МОСЬОТРРТ (ЗЕО ГО N0:212)

- 58 011866

АЬ537 НС	8ΥΑΙ8(5Εζ> ГО N0:71)	ΟΠΡΙΙΑΠΑΝΥΑΟΚΕΟα (8Ε0 ГО ΝΟ: 109)	СЗЗОААУАСМ (ЗЕЦГОЖ): 155)
АЬ537 ЬС	8ΟΝΝ8ΝΙ0ΝΝ УУ8 (8ЕЦ ГО ΝΟ: 76)	ϋΝΗΚΚΡ8 (5Ер Ю N0:112)	<.1Τν/ΟΤ8Ι.8ΑΝ\νν (8Ε0 II) ΝΟ: 156)
АЬ540 НС	8ΥΑΙ5>(8Ε<? ГО N0:71)	αιΐΡίΕοίΑΝΥΑΟΚΡοα (8Ε0 ΙϋΝΟ: 109)	ΑνΡΟΤΕΟΑΡΟΙ: (ΒΕΟΙϋΝΟ: 157)
АЬ540 ьс	80855Ν!6ΑΝΥν5 (5Ер Ю N0: 77)	ΝΝΝΚΚΡ8 (8Ε0 ΙΟ N0:113)	САТО88Ь8А8)УУ (8ΕΟΙΟΝΟ: 158)
АЬ543 НС	8ΥΑ18 (8Ер 10 ΝΟ: 71)	ΚΙΙΡΙΕΟΙΑΝΥΑΟΚΡΟΟ (δΕΟΙϋΝΟ: 114)	ΡΥΥΟΡ\ν80ΡΟΟΜϋν (8Ε0ΙϋΝΟ: 159)
АЬ543 КС	Κ8808ίίΗ8ΝΟΥΝΥίϋ (8Е0 ГОЖ): 70)	ЬСБИКАЗ (8Ε0 ГО N0: 106)	МОАЬОТРЬТ (8Ε0 ГО ΝΟ: 160)
АЬ544 нс	8ΥΑΙ8(8Ε<) 1ΟΝΟ71)	01ΙΡΙΕ6ΤΑΝΥΑΟΚΕ96 (3Ε0 ΙΟΝΟ: 107)	ΡΕ8ΟΥ\ν0ϋΑΕΟ1 (8Ε9ΙΟΝΟ: 161)
АЬ544
ьс	ЗООАЬРКОУАУ (8Е0 ГО ΝΟ:: 78)	ΚΟ8ΕΚΡ8 (8Ες> Ю ΝΟ: 115)	ΟδΑϋδδΗνν (ΒΕΟΙϋΝΟ: 162)
АЬ545 НС	8Υ6ΜΗ(8Ε0 ΙϋΝΟ; 69}	νΐ8ΥΟ08ΝΚΥΥΑΟ8νΚ0 (8Ε0 Ιϋ ΝΟ: 116)	ΟΡνΟΕΟΥΟΟΥΑΙΟΥ (ΪΕΟΙϋΝΟ: 163)
АЬ545 ЬС	Τ0088ΝΙ6Α0ΥθνΗ (8Е<3 ГО ΝΟ: 79)	ΟΝ8ΝΚΡ8 (8Ε0 ГО ΝΟ: 117)	08УО8КЬ808У (δΕΟΙΏΝΟ: 164)
АЬ546 НС	8ΥΑΜ8 (8Ε9ΙϋΝΟ:80)	А18С8ОО8ТУ Υ ΑϋδνΚΟ (8Е0ГО N0: 105)	ΕΤΙ8Ρ8ΤΡ8ΟΥΡϋΥ (8Ε0 10 ΝΟ: 165)

- 59 011866

АЬ546 ЬС	805Α5ΝΙΟΑΝ6ν$ (5Е<2 ΪΟΝΟ:; 81)	НОСБУТЗ (8Ε01ϋΝΟ: 118)	ΑνΨΟϋδΕΝΑνν (ЗЕр ΓΟΝΟ: 166)
АЬ551 НС	8ΥΑΙ8 (8ЕО ΙΟΝΟ::71)	ΟΙΙΡΙΕΟΤΑΝΥΑΟΚΓϊ^α (δΕρίϋΝΟ: 107)	суогхузсузбоар ΟΙ (ВЕС? ΙΟΝΟ: 167)
АЬ551 КС	ΚδδΡδίΕΗδΝΟΥΝΥΕΟ (8Ε<3 ΙΟ ΝΟ: 70)	ΕΟ5ΝΚΑ8 (ЗЕр Ю ΝΟ: 106)	МРАБрТРБТ (ЗЕр ΤΟΝΟ: 160)
АЬ553 НС	8ΥΑΜΗ (8Е<3 Ю ΝΟ: 82)	\νΐΝΑ6ΝΟΝΤΚΥ8 рКГрО (3ΕΟ Ю ΝΟ: 119)	0ν0ϋΥ06Ν8\ν ΑΕϋΙ (δΕζΗϋΝΟ: 168)
АЬ553 КС	Κ53Ο3ΕΕΗ5ΝΟΥΝΥΕΟ (8Ες ΙϋΝΟ: 70)	ΕΟ8ΝΚΑ3 (8ΕΟ ΙϋΝΟ: 106)	МрАБОТРБТ (ЗЕрЮИО: 160)
АЬ555 НС	5ΥΑΜΗ (8ΕΟ ΙϋΝΟ: 82)	νΐ5ΥΟ68ΝΚΥΥΑΟ3νΚ0 (8Ε0 ΙϋΝΟ: 116)	3Α5ΟΗΥΥ0836Υ Υ8ΌΑΕϋΙ (ЗЕрЮИО: 169)
АЪ555 КС	Κ58<25ΕΕΗ8ΝΟΥΝΥΕΟ	ΕΑ5ΝΚΑ5	Μρτίςιριτ
	(8Ε<3 ΙΟ ΝΟ: 70)	(8Εζ! ΙΟ N0:120)	(8ΕΡ Ю N0:170)
АЬ558 НС	ΟΥΥλνδ(8Ε(? ΙϋΝΟ: 83)	ΕΓΝΗ8Ο3ΓΝΟΝΡ8ΕΚ8 (8Ε ΙΟΝΟ: 121)	ΟΗβΧνΟΜαίΟΟΑΑΥΟ (8Ε<?ΙΟΝΟ: 171)
АЬ558 КС	КАЗОЗУЗЗЗЗБА (8Е(? ΙΟΝΟ:: 84)	ΑΑ33ΚΑΤ (8ΕΟ ΙϋΝΟ: 122)	РНГС83РКТ (8Ε(}ΙΟΝΟ: 172)
АЬ559 НС	Ε83ΜΗ (ЗЕО Ю ΝΟ; 85)	ΟΕΡΡΕΗΟΕΤΙΥΑΡΚΡΡΟ (δΕρίϋΝΟ: 123)	6ν(?νΤ86ΥΗΥΓΟΗ (8Ε9ΙΟΝΟ: 173)
АЬ559 БС	ΤΟΤΝ5Ο1Ο3ΥΡΓν8 (8ΕΟ ΙΟ ΝΟ; 86)	ϋν3ΝΚΡ5 (ΒΕςίϋΝΟ; 124)	38ΡΤΜΝ3Ενΐ (5Ε<31ΟΝΟ: 174)
АЬ565 НС	8ΥΑΙ8(8Ε9 ΙϋΝΟ:71)	(ΠΙΡΙΡΟΤΑΝΥΑςΚΡίχί (3Εφ ΙΟΝΟ: 107)	δΡΙΥΥϋΙΕΤΟΙΟΑΕϋΙ (3ΕΟΙΟΝΟ: 175)
АЬ565 КС	КА898У5888ЕА (5ΕΟ ΙΟ N0:213)	ΑΑ88ΚΑΤ (3ΕΡ ΙΌ N0:214)	ΡΗΥΟ83ΡΚΤ (8ЕрЮ N0:215)
АЕ565 (2)КС	Κ880$ΕΕΗ8Ν<3ΥΝΥΕΟ (8Ε<2 Ю ΝΟ: 70)	БСЗЗКАЗ (8Ες ΙϋΝΟ: 125)	МрАБОТРРТ (8ΕΡ ίϋ ΝΟ: 176)

- 60 011866

АЬ Я- Се НС	8ΥΑ13 (ЗЕ<? 1ΟΝ0;71)	ΚΙΙΡΙΕΟΙΑΝΥΑΟΚΡΟΟ (5Ε0ΙΟΝΟ: 114)	ΟΡΙΡ8Ο\νΥΓΟΕ (5Ε0 Ю N0: 177)
АЬ Я- Се ЬС	86888ΝΙΰΝΝΑνΝ (КЕО ΙΟ ΝΟ:: 87)	УООЬЬРЗ (КЕО ΙΟΝΟ: 126)	ΑΤΨΟϋΚΕδϋλνν (3Ε0 ΙΟΝΟ: 178)
АЬРВ1- А7НС	ЗУСМН (ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 69)	νΐ\νΥΟΟ3ΝΚΥΥΑΟ8 νκο (ΒΕΟΙΡΝΟ; 127)	Εν0ΝΥΥϋ38(3Υ6Υ (8Ε0 ΙΟΝΟ: 179)
АЬРВ1-
А7ЬС	тязаооюззгун (ЗЕО ΙΟΝΟ : 88)	ϋΟΝΟΚΡΤ (ЗЕО Ю N0: 128)	0$8Η3ΤΑνν (8Ε0 ΙΟΝΟ: 180)
льго- тно	5Ν$ΑΑΑλΛΝ (ЗЕО Ю ΝΟ: 89)	КТУУКЗКАУЗОУАУЗЬК (8Ε0 ΙΟΝΟ: 129)	ϋκοογιοε (8Ε0 ΙΟΝΟ: 181)
АЬРО’ В2ЬС	ΤΚ5308ΙΑΤΝΥνθ (ЗЕО Ιθ ΝΟ:: 90)	ΕΟΝ0ΚΡ3 (ЗЕО ΙΟΝΟ: 130)	ΟΚΥΟΟΝΝΨ/ν (8ΕΟΙΟΝΟ; 182)
АЪРЕ- В7НС	ϋΥΕΜΝ(3Ε0 ΙΟ N0:91)	ΥΙΙΟΚΟΚΤΙΡΥΑϋΒνΚΟ (8Ε0 ΙΟΝΟ: 131)	οαοδΑΥΥΕΝΤΒυι (8Ε0ΙΟΝΟ: 183)
АЬГЕ- В7К.С	ΚδδΟΚΕΕΗδΚΟϋΝΥίϋ (5Ε0ΙΟΝΟ: 92)	Ш8НКА8 (ЗЕО Ю N0:132)	МОАЕрТРЬТ (ΚΕΟΙϋΝΟ: 160)
АЬР1- <311 НС	8Υ6Ι8 (3Ε0 ΙΟ N0; 93)	λνίδΑΥΝΟΝΤΝΥΑΟ кьос (8Ε01ΟΝΟ; 133)	ϋΚΟΙΛΑΚΚΑΥΥΥΟΜΟ (8Ε0ΙΟΝΟ: 184)
АЬГГ О11КС	КЗЗОЗЕЕОЗООСКТУЬО (8Ε0 ΙΟΝΟ: 94)	ТТ85ЙА8 (8Ε0 ΙΟΝΟ: 134)	μοατορρυτ (8Ε0ΙΟΝΟ: 185)
АЬГК- ЕЗНС	5ΥΠΕΝ (8Ε0 ΙΟ N0: 95)	\νΜΝΡΤ30ΝΤ6ΥΑ0 ΚΡΟΟ (5Ε0ΙΡΝΟ: 135)	ΟΡΡδΟΟν/ΕΓΟΥ (8Ε0 ΙΟΝΟ: 186)
АЬГК- ЕЗКС	ΚδΚΟΚΕνΗΕΟΟΝΤΥίΝ (8Ε0 10 N0; 96)	ΚΙ8ΚΚΓ8(3Ε0 ΙΟΝΟ; 136	Μ08ΤΚΗΡΚΤ (8Ε0ΙΟΝΟ: 187)

- 61 011866

АЬ СЮ4 НС	3ΗΑΙ8 (ЗЕО Ю ΝΟ: 97)	КПР1ЬО1А1ЧУАОКЕОС (ЗЕО ЮНО: 44)	ЗКЬЕ^ЬЬУЬОУ (ЗЕО ГОРЮ: 188)
АЬ 0Ю4	ΤΡ58Ο8ΙΑ3ΝΥν0	ΕϋΚΟΚΡΒ (ЗЕО ГО N0:	08ΥΝ8ΚθνΜ
ЬС	(ЗЕО ГО ΝΟ: : 98)	137)	(ЗЕО Ю ΝΟ: 189)
АЬ СС1Е8 НС	8Υ6Ι8 (8Ь0 ГОРЮ: 93)	νίΚΑΥΝΟΝΤΝΥΑΟΚί ОС (81.0 ΙΟ ΝΟ: 133)	ΟΟΚΡΥΟΟΥΑΥΡΡΟΥ (ЗЕО II) ΝΟ: 190)
АЬ 0С1Е8 ЬС	ΤΚ8805ΙΑ8ΝΥνθ (ЗЕО ГО ΝΟ:: 98)	ΕϋΝΟΚΡδ (ЗЕО ГО N0:130)	ΟδΥϋδΝΐινν (ЗЕО ГО РЮ: 191)
АЬ Н1С12 НС	8Υ0ΜΗ (ЗЕО ГО ΝΟ: 69)	ΥΙ383Ο8ΤΙΥΥΑΟ5νΚΟ (ЗЕО ГО N0: 111)	ΟίΕΟΥΟΙίΤΟΥΟΥ (ЗЕО ГО РЮ: 150)
АЬ Н1С12 ЬС	8Ο588Ν1ΟΝΝΥν8 (ЗЕО ГО РГО: 73)	ΟΝΤΝΚΡ8 (ЗЕО 10 N0:138)	08УО83Ь8С8ЕУ (8Ε0ΙΟΝΟ: 192)
АЫА1- 1Е7НС	0ΥΥΨ8 (ЗЕО ГО N0: 8)	ΕΓΝΗ808ΤΝΡΝΡ3ίΚ8 (8Ε0ΙΟΝΟ: : 121)	ΟΗΟΆ'ΟΜΟΙ οοαλυοι (ЗЕО ΠΟΝΟ: 171)
АЬ ΙΑ1- 1Е7КС	КАЗОЗУЗЗЗРЬА (ЗЕО ГО ΝΟ: : 99)	ϋΤΞΤΚΆΤ (ЗЕО 10 ΝΟ: 139)	ΟΟΥϋΡδΡίτ (ЗЕО ГО N0:193)
АЫГ- 1С10 НС	8ΤΥΑΜΤ (ЗЕр ГО N0: ЮО)	νίΚδΝΟΟΤΟΥΑϋΡνΚΟ (ЗЕО ГО N0: 140)	Γ1ΥΥ (8Е0 ГО N0: 194)
АЫР- 1СЮЬС	Τ05068ΙΑ3ΝΥνθ	ΕΟΝ0ΚΡ3	Ο8ΥΟ88Τ\νν
	(ЗЕО Ю ΝΟ:: 101)	(ЗЕО Ю ΝΟ: 130)	(ЗЕр 10 ΝΟ: 195)
АЫК- 2Е2НС	8ΥΑΜ8 (8Е0 ГО ΝΟ: 80)	А15С8С68ТУУАО8УК6 (8Е0ГОРЮ: 105)	ΕΤ18Ρ5ΤΡ5ΟΥΡΟΥ (8Е9 ΙΟ ΝΟ: 165)
АЫК- 2Е2ЬС	ΤαΤ83ϋν00ΥΝΥν8	ΚνΝΝΚΡδ	88ΥΤ858ΤΕΟ
	(ЗЕО III ΝΟ: К»)	(ЗЕО ГОРЮ: 141)	(ЗЕО ΙϋΝΟ: 196)
АЫР- 2С11 НС	5ΥϋΙΝ(8Ε0 ГОРЮ: 103)	ΧΥΜΝΡΝδΟΝΤΟΥΑ ОКРОС (ЗЕО ГОРЮ: 142)	ΕΙΑνΑΟΤΡΥΟΜΏν (ЗЕО Ю N0: 197)
АЫР- 2С11 КС	КА5р81£ТРЬА (ЖЗ ΙΟΝΟ::104)	ΟΑ5ΝΚΑΤ (5Е(? ΙΟ ΝΟ: 143)	ОНЩРЛУРЬТ (8Е0 ГО ΝΟ: 198)

- 62 011866 антител и негативный контроль 1дС1 протестировали при помощи анализов ЕЫ8А на сродство и нейтрализацию (как изложено выше в примере 3), а также анализа В1Асоге на нейтрализацию для определения их сродства, способности к нейтрализации и специфичности. Результаты, рассчитанные стандартными процедурами, приведены в табл. 8.

Таблица 8

Антитела к Апд-2 ЕС50з и 1С50з

	Ь Ап 2-2	мышиный Ап2-2	человеческий Ап£-1
Антитела (АЬ)	1С50 (пМ)	ЕС50 (пМ)	1С50 (пМ)	ЕС50 (пМ)	1С50 (пМ)	ЕС50 (пМ)
АЬ536 (ТНЗУ/ЬО Т смесь)	0.08	0.005	0.05	0.01	114.65	30
АЬ565	0.26		0.26		Нет ингибирования
АЬ546	0.37		1.09		Нет ингибирования
АЬ 543	0.51		0.24		Нет ингибирования
АЬ533	0.3		0.08		Нет ингибирования
АЬ537	0.56		0.62		Нет ингибирования
АЬ540	0.70		1.53		Нет ингибирования
АЬ544	0.97		1.82		23.32
АЬ545	1.04	0.02	1.30	0.05	8.31	2
АЬ528	1.37		0.73		Нет ингибирования
АЬСЮ4	1.39		0.60		69.48
АЬ551	1.41		2.88		Нет ингибирования
АЬ553	1.47		1.41		Нет ингибирования
АЬ526	1.83		0.27		243.15
АЬ531	2.15		1.67		Нет ингибирования
А5555	2.21		1.76		Нет ингибирования
АЬ535	2.81		2.45		Нет ингибирования
КОВ1	Нет ингибиров ан ия	Нет связыва НИЯ	Нет ингибирова ния	Нет связыва ния¹	Нет ингибирования	Нет связывания

Два антитела, клон 536 и клон 545, охарактеризовали при помощи анализа В1Асоге, описанного выше. Связывание антител определяли, как изложено выше для анализа В1Асоге, причём более низкое значение К_С8 указывало на большее сродство. Результаты изложены в табл. 9.

- 63 011866

Таблица 9

Сродство антител к человеческому и мышиному Апд-2

человеческий Ап§-2	мышиный Ап§-2
АЬ	К„ (пМ)	к_а(1/М5)	к>(1/5)	К„(пМ)	к„(1/Мз)	М1/з)
АЬ536 (ΤΗ\ν/ΕΟ Т смесь)	0.12	3.2 хЮ¹	3.8 хЮ*	0.15	6.2 хЮ⁵	9.5 χΙΟ*
АЬ545	1.2	3.3 хЮ’	3.9 х1О’⁴	0.9	5.9 хЮ¹	5.3 х 10’’

Клон 536, анализ которого приведен выше, представлял собой смесь двух вариантов антител, которые приведены в табл. 4 как 8Еф ΙΌ ЮО: 12 (536 каппа ΊΉν) и 8Еф ΙΌ ЮО: 210 (536 каппа ЬфТ). Эти два варианта 536 были разделены и их активность анализировали раздельно с помощью анализов ЕЫ8А и гомогенной флуоресценции с временным разрешением (НТВР - Нотодепоик йте геко1тей Г1иогексепсе). Для анализа ЕЫ8А 96-луночные планшеты для микротитрования покрывали рекомбинантными ангиопоэтинами в составе культуральной среды, собранной с клеток 293 Т ЩМЕМ/50 мкг/мл В8А) при 37°С в течение 1 ч. Среды, собранные с культур рекомбинантных клеток, использовали при концентрациях ангиопоэтинов, обеспечивающих степень связывания 80% от максимально возможной с 1 нМ НТ|е-2-Рс (В&Э 8ук!етк, Са!. # 313-Ή). Планшеты промывали при помощи РВ8/0,1% Твин-20 и затем блокировали в продолжение 2 ч при комнатной температуре с помощью РВ8/5% БСА. Ангиопоэтин-нейтрализующие агенты в серии разведений от 100 нМ до 0,4 пМ раствором РВ8/1% БСА/1 нМ Т1е-2 добавляли в планшеты с сорбированными на них ангиопоэтинами, выдерживали в течение ночи при комнатной температуре и промывали РВ8/0,1% Твин-20. Мышиные антитела к Т1е-2 (ВО РНатипдеп Шс., Са!. # 557039) добавляли затем в каждый планшет в концентрации 1 мкг/мл и выдерживали 1 ч при комнатной температуре. Далее планшеты промывали в РВ8/0,1% Твин-20 и добавляли в них козьи антитела к мышиным фС, меченые пероксидазой хрена (Р1егсе, Са!. # 31432) в разведении 1:10000 на РВ8/1% БСА с последующей инкубацией в течение 1 ч при комнатной температуре. Планшеты затем промывали несколько раз РВ8/0,1% Твин-20 и добавляли раствор субстрата - тетраметилбензидина (81дта, Са!. # Т8665). После развития окрашивания измеряли оптическое поглощение при длине волны 370 нм и определяли степень нейтрализации ангиопоэтина: Т1е-2 сравнением со стандартной кривой Т1е-2.

Для анализа НТВР подготавливали 96-луночный планшет для микротитрования, добавляя в каждую лунку буфера НТВР (50 мМ Трис-НС1 рН 7,5, 100 мМ ЮаС1, 0,.05% Твин-20, 0,1% БСА), содержащего 0,8 нМ стрептавидина, конъюгированного с европием (РЕВКЕИ ЕЬМЕВ ЫРЕ 8СШМСЕ8 ГИС., Са!. # АЭ0062) и 4,0 нМ биотинилированного человеческого ангиопоэтина 1 (Β&Ό 8ук!етк) либо ангиопоэтина 2 (Атдеп Шс.). В отдельном планшете для микротитрования готовили серию разведений ангиопоэтин-нейтрализующих агентов от 400 нМ до 20 пМ в буфере для НТВР и по 50 мкл полученных разведений переносили в лунки планшета с иммобилизованным комплексом стрептавидин-Еи-ангиопоэтин. Планшет встряхивали затем на шейкере при комнатной температуре в продолжение 1 ч. После этого по 20 мкл из каждой лунки этого планшета переносили в лунки другого планшета, содержащие по 20 мкл 10 нМ человеческого Т1е-2-Рс, конъюгированного с человеческим аллофикоцианином на буфере для НТВР. Этот планшет встряхивали 2 ч при комнатной температуре. Конечные концентрации веществ в последнем планшете были таковы: 1,0 нМ ангиопоэтин, 5,0 нМ человеческий Т1е-2-Рс и от 100 нМ до 5,0 пМ серийно-разведённых ангиопоэтин-нейтрализующих агентов. Планшеты анализировали при помощи спектрофотометра для планшетов ВиЬук!аг (ВМС ЬаЬ!есйпо1од1ек, ОГГепЬегд, Сегтапу). Уровень нейтрализации ангиопоэтин/Т1е-2 определяли, рассчитывая процент ингибирования в каждом разведении ангиопоэтин-нейтрализующего агента относительно контроля, не содержащего такого агента (нулевое ингибирование), и контроля, не содержащего ангиопоэтина (полное ингибирование). Далее на основе анализа процента ингибирования рассчитывали значения Ιί.'₅₀ при помощи программы СВАРЮ 5.0 (ЕпШасик 8о£Шаге Ь!й.).

Полученные результаты представляли как кривые Ιθ5₀, рассчитанные для проб, каждая из которых тестировалась дважды, при помощи нижеприведённой формулы. Значения ΙΟ₅₀, отражающие данные ингибирования в двухпараметрическом уравнении, варьировали от 0 (с учётом коррекции фона) до 100 (по ранжированной шкале).

100% ^У~(-Ϋ

В этом уравнении к представляет собой фактор наклона. Уравнение подразумевает, что у снижается при возрастании х. Это уравнение используется в программном обеспечении СВАРЮ 5.0 (ЕпШасик 8оГ1

- 64 011866 теаге Ытйеб).

Результаты приведены в табл. 10 и 11.

Таблица 10

Значения Ι050 при анализе для варианта антител АЬ536

Образец	Человеческий Ап§1 1С50 (нМ)	Человеческий Ап§2 1С50 (нМ)	Мышиный Ап§2 1С50 (нМ)
АЬ53б 1ОТ	>100	0.35	0.10
АЬ536 ΤΗνν	>100	0.31	0.088

Таблица 11

Значения Ι0₅₀ при анализе НТВЕ для варианта антител АЬ536

Образец	Человеческий Ап§11С50 (нМ)	Человеческий Апд2 1С50 (нМ)
АЬ536 ЬОТ	>100	0.072
АЬ536 ΤΗ\ν	>100	0.071

Пример 5. Исследование терапевтической эффективности при использовании антител к Апд-2.

Фармакокинетику поликлональных кроличьих антител к Апд-2, очищенных на иммобилизованном белке С, изучали на мышах. 24 мышам вводили кроличьи поликлональные антитела к Апд-2 (1 мг на мышь). По четыре мыши, получавших антитела, убивали в каждый из указанных сроков после введения антител: 1 ч, 6 ч, 1 день, 3 дня, 7 дней и 14 дней.

Полученные результаты показали, что для общего кроличьего ЦС характерен период полужизни в сыворотке приблизительно 19 дней, тогда как составляющая общего ЦС. специфичная к Апд-2, обладала периодом полужизни около 8 дней.

Для оценки терапевтической эффективности мышам (по 10 животных на группу) с пересаженной им опухолью А431 вводили внутрибрюшинно по 10 доз (одна доза составляла около 10 мг ЦС на мышь) поликлональных кроличьих антител к мышиному Апд-2, очищенных на иммобилизованном белке С, на 1, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 14, 15 и 18-й день после пересадки опухоли. Размеры опухоли измеряли на 7, 12, 15, 19 и 21-й день. Массу тела измеряли на 0, 7, 15 и 21-й день и, как оказалось, лечение на неё не влияло. Результаты показали, что поликлональные антитела к Апд-2 подавляли рост пересаженной опухоли А431 приблизительно на 50% с р=0,008 по сравнению с контролем, представлявшим собой очищенную неиммунную поликлональную сыворотку (единичная доза также составляла 10 мг ЦС на мышь), и плацебо (ΤΒδ), как это было определено дисперсионным анализом каждого измерения.

Для оценки эффективности ΐπ νί\Ό полностью человеческих моноклональных антител к Апд-2 мышам (по 10 животных на группу) с пересаженной им опухолью А431 вводили внутрибрюшинно либо клоны 533, 537 или 544 антител к Апд-2, либо отрицательные контроли в виде РΒδ или человеческого ЦЦ-каппа. Дозировка составляла около 420 мкг белка на одну мышь в качестве первой дозы, около 140 мкг белка на мышь в качестве каждой из трёх последующих доз и около 55 мкг белка на мышь в качестве каждой последующей дозы, всего одной мыши вводили 8 доз антител. Объём опухоли и массу тела измеряли дважды в неделю. По окончании исследования животных забивали и собирали у них сыворотку крови для измерения уровня антител с помощью анализа ΕΡΙδ® Опухоли и ряд нормальных тканей собирали у каждой группы.

Были обнаружены значительные различия в росте опухолей у группы, получавшей антитела к Апд-2, и контрольными группами, как показано на фиг. 1. Все три клона антител подавляли рост опухолей по сравнению с контролями (р<0,005 по сравнению с контролем на основе человеческих ЦЦ для всех клонов антител, по данным дисперсионного анализа каждого измерения для всех 3 антител). Напротив, опухоли в контрольных группах продолжали расти с гораздо большей скоростью.

Пример 6. Картирование эпитопов.

Человеческий белок Апд-2 полной длины (аминокислоты 1-495), его №концевой фрагмент (аминокислоты 1-254) и С-концевой фрагмент (аминокислоты 255-495) клонировали в экспрессионном векторе млекопитающих на основе цитомегаловируса с С-концевыми хвостами 6хН1к. Три полученные конструкции и контрольный вектор были в течение недолгого периода экспрессированы в клетках 293Т. Культивационные среды затем собирали с трансфицированных клеток и способом или иммуноблоттингом при помощи антител к гистидиновым хвостам оценивали уровень экспрессии Апд-2 в среде.

Эпитопы связывания антител к Апд-2 и их фрагментов определяли по их способности связывать три варианта человеческого йАпд-2 при помощи теста ВБ^А в соответствии со следующим протоколом. В 96-луночных планшетах с высокой связывающей способностью сорбировали среду, собранную с кле

- 65 011866 точных культур, добавляя последнюю по 100 мкл на лунку с последующей инкубацией при 37°С в течение 1 ч. Среду отсасывали и планшет блокировали 5%-ным БСА на РВ8 в количестве 200 мкл на лунку при комнатной температуре в течение 1 ч. Блокирующий раствор отсасывали, в лунки добавляли по 100 мкл антител, их фагментов или Т1е-2-Рс в концентрации 1 мкг/мл в 1% БСА на РВ8 и планшеты выдерживали 1 ч при комнатной температуре. Далее лунки промывали 4 раза 200 мкл 0,1% Твин-20 на РВ8 и добавляли в них по 100 мкл козьих антител к 1дС человека или к 1дС мыши, меченых пероксидазой хрена, и выдерживали 45 мин при комнатной температуре. Затем лунки четырежды промывали 200 мкл 0,1% Твин-20 на РВ8 и добавляли по 100 мкл на лунку раствора субстрата тетраметилбензидина. Оптическое поглощение измеряли при длине волны 370 нм. Резуьтаты представлены на фиг. 2а-2в.

Claims

1. Выделенный полипептид, специфически связывающий ангиопоэтин-2, где полипептид включает по меньшей мере один участок, определяющий комплементарность (СОК.), причём СЭР представляет собой:

а) участок СЭРЕ включающий аминокислотную последовательность формулы

Х^,Х²Х³Х⁴Х⁵Х⁶Х⁷Х⁸Х⁹Х¹⁰Х^,1Х¹²Х¹³Х¹⁴Х^|5Х¹⁶Х¹⁷ (ЗЕр Ю N0: 199), где X¹ представляет собой К, δ, Т, С, Е, Э;

X² представляет собой δ, С, А, К, Ν, Т, Υ, Н;

X³ представляет собой δ, Э, Ν, р, Т, Υ, А, С, Е;

X⁴ представляет собой р, К, δ, Ν, А, С, I, М, V, Ь;

X⁵ представляет собой δ, Ь, С, А, М, Н, Ν;

X⁶ представляет собой Ь, С, Ν, Р, V, Ω, V, δ, Т, I или отсутствует;

X⁷ представляет собой Ь, Υ, I, К, δ, Ν, V или отсутствует;

X⁸ представляет собой Н, Т, С, Ρ, δ, А, Э или отсутствует;

X⁹ представляет собой δ, Υ, Ν, А, Т, Е, С, Р или отсутствует;

X¹⁰ представляет собой Ν, Т, А, С, δ, Υ, К, Ω, Р, Ь или отсутствует;

X¹¹ представляет собой С, δ, Υ, Р, Ь, Р, А, Ρ, Ω, Ν или отсутствует;

X¹² представляет собой Υ, V, Э, А, Р, С, Ν или отсутствует;

X¹³ представляет собой Ν, δ, V, Н, р, К, Т или отсутствует;

X¹⁴ представляет собой Υ, Н, δ, Т или отсутствует;

X¹⁵ представляет собой Ь, Υ или отсутствует;

X¹⁶ представляет собой Ω, Ν, Ь или отсутствует;

X¹⁷ представляет собой Э или отсутствует;

б) участок (.ΌΕΣ, включающий аминокислотную последовательность формулы

Х¹Х²Х³Х⁴Х⁵Х⁶Х⁷Х⁸Х⁹Х¹⁰Х^|1Х¹²Х^|3Х^,4Х^|5Х^|6Х¹⁷Х¹⁸ (8ЕР ΙΟΝΟ: 200), где X¹ представляет собой Ь, ρ, Ω, Ν, К, С, Н, А, Υ, Е, Т, К, V, V;

X² представляет собой С, Э, Ν, А, V, Т, I, Р, М;

X³ представляет собой δ, Р, Ν, Н, С, Э, К, Т, I, V, Υ, К;

X⁴ представляет собой Ν, К, Е, Ь, δ, Р, Н, Т, С, Р, Υ, А;

X⁵ представляет собой К, V, Ь, δ, I, Э, С, Е, Υ, Т, Ν;

X⁶ представляет собой А, Р, Т, Р, С, Ь, Ν, Н, δ;

X⁷ представляет собой δ, Т, С, К;

X⁸ представляет собой δ, Т, I, Ν, Е, V или отсутствует;

X⁹ представляет собой Т, А, I, К, Ν, Υ, Э или отсутствует;

X¹⁰ представляет собой Υ, Ν, К, Р, I, δ, С или отсутствует;

X¹¹ представляет собой Υ, Ν, Э, А или отсутствует;

X¹² представляет собой А, δ, Р, Υ, ϋ или отсутствует;

X¹³ представляет собой Ω, ρ, δ, А, Р или отсутствует;

X¹⁴ представляет собой δ, К, Ь, V или отсутствует;

X¹⁵ представляет собой V, Р, К, δ, Ь или отсутствует;

X¹⁶ представляет собой К, ρ, δ, Ь, Р, С или отсутствует;

X¹⁷ представляет собой С, К или отсутствует;

X¹⁸ представляет собой С или отсутствует; или

в) участок 00^3, включающий аминокислотную последовательность формулы

Х^|Х²Х³Х⁴Х⁵Х⁶Х⁷Х⁸Х⁹Х^,0Х¹¹Х^|2Х¹³Х¹⁴Х¹⁵Х^|6Х^,7Х¹⁸Х¹⁹ (ЗЕр ГО ΝΟ; 201), где X¹ представляет собой Э, М, С, Р, Р, А, Р, Е, δ;

X² представляет собой Ь, ρ, V, А, К, Т, δ, Υ, Е, Р, Н, С, I;

X³ представляет собой Ь, А, V, V, Е, Р, С, δ, Υ, I, Э, Т, р, Р, К;

X⁴ представляет собой Э, Ь, С, Р, Т, δ, V, V, Υ, Р, Ν, Н, I, Е;

X⁵ представляет собой Υ, р, Ω, δ, Т, Н, А, Р, V, С, М, К, Ν;

X⁶ представляет собой Э, Т, Р, А, δ, Е, V, К, С, Υ, I, М, Ν, Ь;

- 66 011866

X⁷ представляет собой I, Р, Ό, Т, М, Ь, 8, V, 6, Н, Υ, №, А, Ν, Я;

X⁸ представляет собой Ь, Р, №, А, V, 8, Ό, 6, Е, Ν, Υ, I, Я, Е, Т;

X⁹ представляет собой Т, Ь, V, Е, А, 6, Р, Ό, 8, Н, Ν, М, Υ или отсутствует;

X¹⁰ представляет собой 6, 8, V, Ν, Е, А, М, Ό, Υ, Ь, №, I, Т или отсутствует;

X¹¹ представляет собой Р, Е, Υ, №, Ό, Ε, I, 6, А, V, Ь, 8, М или отсутствует;

X¹² представляет собой Υ, Е, V, 6, I, V, М, А, Ό или отсутствует;

X¹³ представляет собой А, Ό, Υ, V, Е, Н, I, 6 или отсутствует;

X¹⁴ представляет собой Υ, V, Ό, I, 8, Е, М или отсутствует;

X¹⁵ представляет собой I, Ό или отсутствует;

X¹⁶ представляет собой А, I, V или отсутствует;

X¹⁷ представляет собой Е или отсутствует;

X¹⁸ представляет собой Ό или отсутствует, и

X¹⁹ представляет собой I или отсутствует.

2. Полипептид по п.1, включающий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из 8ΕΕ) II) Ν0: 69-104 и 8ΕΟ II) Ν0: 213.

3. Полипептид по п.1, включающий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из 8ΕΕ) ГО Ν0: 105-143 и 8ΕΕ) ГО Ν0: 214.

4. Полипептид по п.1, включающий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из 8ΕΕ) ГО Ν0: 144-198, 8ΕΕ) ГО Ν0: 212 и 8ΕΕ) ГО Ν0: 215.

5. Выделенный полипептид по п.1, представляющий собой антитело.

6. Антитело по п.5, представляющее собой поликлональное, моноклональное, химерное, гуманизированное или полностью человеческое антитело.

7. Антитело по п.6, представляющее собой одноцепочечное антитело.

8. Гибридома, продуцирующая моноклональное антитело по п.6.

9. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид по п.1.

10. Вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п.9.

11. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.10.

12. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по пп.5, 6 или 7.

13. Вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п.12.

14. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.13.

15. Способ получения антител, включающий:

(а) трансформацию клетки-хозяина по меньшей мере одной молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело по пп.5, 6 или 7;

(б) экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты в указанной клетке-хозяине и (в) выделение указанного специфического связывающего агента.

16. Способ ингибирования нежелательного ангиогенеза у млекопитающего, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенного полипептида по п.1.

17. Способ лечения рака у млекопитающего, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенного полипептида по п.1.

18. Способ ингибирования нежелательного ангиогенеза у млекопитающего, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела по пп.5, 6 или 7.

19. Способ лечения рака у млекопитающего, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела по пп.5, 6 или 7.

20. Фармацевтическая композиция, включающая выделенный полипептид по п.1 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

21. Фармацевтическая композиция, включающая антитело по пп.5, 6 или 7 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

22. Способ модуляции или ингибирования активности ангиопоэтина-2, включающий введение пациенту выделенного полипептида по п.1.

23. Способ модуляции или ингибирования активности ангиопоэтина-2, включающий введение пациенту антитела по пп.5, 6 или 7.

24. Способ модуляции сосудистой проницаемости или протекания плазмы или того и другого у млекопитающего, включающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества выделенного полипептида по п.1.

25. Способ лечения по меньшей мере одного из следующих состояний: неоваскуляризация глаза, тучность, гемангиобластома, гемангиома, артериосклероз, воспалительное заболевание, воспалительные нарушения, атеросклероз, эндометриоз, неопластическое заболевание, заболевание, связанное с костью, или псориаз у млекопитающего, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенного полипептида по п.1.

26. Способ модуляции сосудистой проницаемости или протекания плазмы или того и другого у млекопитающего, включающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества антитела по пп.5, 6 или 7.

- 67 011866

27. Способ лечения по меньшей мере одного из следующих состояний: неоваскуляризация глаза, тучность, гемангиобластома, гемангиома, артериосклероз, воспалительное заболевание, воспалительные нарушения, атеросклероз, эндометриоз, неопластическое заболевание, заболевание, связанное с костью, или псориаз у млекопитающего, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела по пп.5, 6 или 7.

28. Способ лечения рака у млекопитающего, включающий введение терапевтически эффективного количества выделенного полипептида по п.1 и химиотерапевтического агента.

29. Способ по п.28, при котором выделенный полипептид и химиотерапевтический агент вводят одновременно.

30. Способ по п.28, при котором выделенный полипептид и химиотерапевтический агент не вводят одновременно.

31. Способ лечения рака у млекопитающего, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела по пп.5, 6 или 7 и химиотерапевтического агента.

32. Выделенное антитело, связывающее ангиопоэтин-2, включающее СОВ1, который включает аминокислотную последовательность, указанную в любом из 8ЕЦ ΙΌ N0: 69-104 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 213.

33. Выделенное антитело, связывающее ангиопоэтин-2, включающее СОВ2, который включает аминокислотную последовательность, указанную в любом из 8ЕЦ ΙΌ N0: 105-143 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 214.

34. Выделенное антитело, связывающее ангиопоэтин-2, включающее СОВ3, который включает аминокислотную последовательность, указанную в любом из 8ЕЦ ΙΌ N0: 144-198, 8ЕЦ ΙΌ N0: 212 или 8ЕО ΙΌ N0: 215.

35. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по пп.32, 33 или 34.

36. Вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п.35.

37. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.36.

38. Способ определения уровня ангиопоэтина-2 в биологическом образце, включающий:

(а) приведение выделенного полипептида по п.1 в контакт с указанным образцом и (б) определение степени связывания специфического связывающего агента с указанным образцом.

39. Способ определения уровня ангиопоэтина-2 в биологическом образце, включающий:

(а) приведение антитела по пп.32, 33 или 34 в контакт с указанным образцом и (б) определение степени связывания антитела с указанным образцом.

40. Антитело, включающее тяжёлую цепь и лёгкую цепь, где указанная тяжёлая цепь включает вариабельный участок тяжёлой цепи, выбранный из:

8ЕО ΙΌ N0: 1; 8ЕО ΙΌ N0: 3; 8ЕО ΙΌ N0: 5; 8ЕО ΙΌ N0: 7; 8ЕО ΙΌ N0: 9; 8ЕО ΙΌ N0: 11; 8ЕО ΙΌ N0: 13; 8ЕО ΙΌ N0: 15; 8ЕО ΙΌ N0: 17; 8ЕО ΙΌ N0: 19; 8ЕО ΙΌ N0: 21; 8ЕО ΙΌ N0: 23; 8ЕО ΙΌ N0: 25; 8ЕО ΙΌ N0: 27; 8ЕО ΙΌ N0: 29; 8ЕО ΙΌ N0: 31; 8ЕО ΙΌ N0: 33; 8ЕО ΙΌ N0: 35; 8ЕО ΙΌ N0: 37; 8ЕО ΙΌ N0: 39; 8ЕО ΙΌ N0: 41; 8ЕО ΙΌ N0: 43; 8ЕО ΙΌ N0: 45; 8ЕО ΙΌ N0: 47; 8ЕО ΙΌ N0: 49; 8ЕО ΙΌ N0: 51; 8ЕО ΙΌ N0: 53; 8ЕО ΙΌ N0: 55; 8ЕО ΙΌ N0: 57; 8ЕО ΙΌ N0: 59; 8ЕО ΙΌ N0: 61, и их антигенсвязывающих фрагментов;

а указанная лёгкая цепь включает вариабельный участок лёгкой цепи, включающий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 12, 8ЕЦ ΙΌ N0: 210 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 211, или ее антигенсвязывающий фрагмент.

41. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по п.40.

42. Вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п.41.

43. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.42.

44. Антитело, специфически связывающее ангиопоэтин-2, включающее тяжёлую цепь и лёгкую цепь, где лёгкая цепь включает вариабельный участок лёгкой цепи, включающий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 12, 8ЕЦ ΙΌ N0: 210 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 211, или ее антигенсвязывающий фрагмент.

45. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело по п.44.

46. Вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п.45.

47. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.46.

48. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающее ангиопоэтин-2, включающее тяжёлую цепь и лёгкую цепь, где тяжёлая цепь включает каркасные области тяжёлой цепи и вариабельную область тяжёлой цепи, где вариабельная область тяжёлой цепи включает СЭВ1 (81 (С) ΙΌ N0: 69), СЭВ2 (8ЕО ΙΌ N0: 111) и СЭВ3 (8ЕО ΙΌ N0: 150) и лёгкая цепь включает каркасные области лёгкой цепи и вариабельную область лёгкой цепи, где вариабельная область лёгкой цепи включает СЭВ1 (8ЕО ΙΌ N0: 70), СЭВ2 (8ЕО ΙΌ N0: 106) и СЭВ3 (8ЕО ΙΌ N0: 212).

49. Выделенное антитело, специфически связывающее ангиопоэтин-2, включающее тяжёлую цепь и лёгкую цепь, где лёгкая цепь включает вариабельную область лёгкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 210, или ее антигенсвязывающий фрагмент.

50. Выделенное антитело, включающее тяжёлую цепь и лёгкую цепь, где указанная тяжёлая цепь включает вариабельную область тяжёлой цепи последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 11 или ее антигенсвязывающий фрагмент, а указанная лёгкая цепь включает вариабельную область лёгкой цепи, содержащую

- 68 011866 аминокислотную последовательность 8Ε0 ΙΌ N0: 210, или ее антигенсвязывающий фрагмент.

51. Антигенсвязывающий фрагмент антитела по п.7, содержащий одноцепочечное Εν антитело.

52. Антигенсвязывающий фрагмент антитела по любому из пп.48-50, содержащий ЕаЬ антитело.

53. Антигенсвязывающий фрагмент антитела по любому из пп.48-50, содержащий Е(аЬ')₂ антитело.

54. Антитело по любому из пп.48-50, которое представляет собой ЦС1 антитело.