TWI487712B - 多重特異性抗體 - Google Patents

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Description

多重特異性抗體
本發明係關於多重特異性抗體，及製造與使用該等抗體之方法。
抗體係由脊椎動物免疫系統回應於外源蛋白、醣蛋白、細胞或其他抗原性外源物質之攻毒而產生之特異性免疫球蛋白多肽。此過程之一重要部分為產生與特定外源物質特異性結合之抗體。該等多肽與特定抗原之結合特異性已經高度改進，且能夠由個別脊椎動物產生之多重特異性就其複雜性與可變性而言為顯著的。數以千計之抗原能夠引發反應，各反應幾乎僅僅針對引發其之特定抗原。
特異性抗原識別對於抗體在適應性免疫反應中發揮作用而言係必需的。在所有脊椎動物中，重鏈(HC)與輕鏈(LC)之組合結合在抗體譜系之產生中係保守的。然而，在兩條鏈中存在多樣性之不對稱性。HC之可變域(VH )比LC之可變域(VL )含有顯著較高之序列多樣性，且更常供應抗原識別之決定子。LC在確定抗原特異性中之作用係由稱作受體編輯之過程所表明。為編輯B細胞受體而正在進行之VL 基因重組係校正自反應性抗體前驅體之主要機制，其中該等抗體前驅體似乎構成初始譜系之一大部分(約75%)。已證實輕鏈之改變可消除不需要之結合特異性或多重特異性。
抗體及抗體片段對特定抗原之特異性可使得抗體成為理想之治療劑。抗體及抗體片段可用於靶向特定組織(例如腫瘤)，且藉此使得非特異性靶向之潛在副作用最小化。因此，當前且持續需要識別及表徵適用於治療癌症及其他增殖性病症之治療性抗體，尤其為抗體、片段及其衍生物。
本發明提供一種含有高變區(HVR)L1序列之經分離抗體，其中該HVR L1序列含有序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)，且其中該抗體特異性地結合人類表皮生長因子受體2(HER2)及血管內皮生長因子(VEGF)。在一項實施例中，該抗體另外包含：含有序列WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2及/或含有序列HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3。在另一項實施例中，該抗體另外含有一個、兩個或三個HVR序列，其係選自(i)含有序列NIKDTY(SEQ ID NO:4)之HVR-H1；(ii)含有序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)之HVR-H2；及(iii)含有序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)之HVR-H3。在另一項實施例中，該抗體另外含有一個、兩個或三個HVR序列，其係選自(i)含有序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1；(ii)含有序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2；及(iii)含有序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3。
在另一態樣中，本發明提供一種含有HVR-L1序列之經分離抗體，其中該HVR-L1序列含有序列X1 IX3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 Y(SEQ ID NO:83)，其中X1 為除天冬胺酸以外之任何胺基酸，X3 為除脯胺酸以外之任何胺基酸，X4 為除精胺酸以外之任何胺基酸且X5 為除絲胺酸以外之任何胺基酸，且其中該抗體特異性地結合HER2及VEGF。在一項實施例中，含有序列X1 IX3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 Y(SEQ ID NO:83)之抗體於X1 處具有天冬醯胺，於X3 處具有丙胺酸，於X4 處具有離胺酸，於X5 處具有蘇胺酸，於X7 處具有絲胺酸，及/或於X8 處具有甘胺酸，或其任何組合。在本發明之此態樣之各種實施例中，圖57中所示之任何具有大於1、5或10之F值的HVR-L1殘基均為較佳保持為與在bH1-44或bH1-81之HVR-L1之相同位置(SEQ ID NO:1)處發現之殘基相同的殘基。在其他實施例中，表14中所示之任何具有大於1之ΔΔG值的HVR-L1殘基均為較佳保持為與在bH1-44或bH1-81之HVR-L1之相同位置(SEQ ID NO:1)處發現之殘基相同的殘基。在一項實施例中，該抗體包含HVR-H2序列，其包含序列RX2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 R(SEQ ID NO:84)。在一項實施例中，該抗體另外包含：含有序列WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2及/或含有序列HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3。在另一項實施例中，該抗體另外含有一個、兩個或三個HVR序列，其係選自(i)含有序列NIKDTY(SEQ ID NO:4)之HVR-H1；(ii)含有序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)之HVR-H2；及(iii)含有序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)之HVR-H3。在另一項實施例中，該抗體另外含有一個、兩個或三個HVR序列，其係選自(i)含有序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1；(ii)含有序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2；及(iii)含有序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3。
在另一態樣中，本發明提供一種含有HVR-H2序列之經分離抗體，其中該HVR-H2序列含有序列RX2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 R(SEQ ID NO:85)，其中X5 為除蘇胺酸以外之任何胺基酸且X6 為除天冬醯胺以外之任何胺基酸，且其中該抗體特異性地結合HER2及VEGF。在另一項實施例中，含有序列RX2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 R(SEQ ID NO:84)之抗體於X8 處具有酪胺酸。在一項實施例中，含有序列RX2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 R(SEQ ID NO:84)之抗體於X5 處具有絲胺酸及/或於X6 處具有麩胺酸。在該態樣之另一項實施例中，該等抗體另外含有一個、兩個或三個HVR序列，其係選自以下之群：含有序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1、含有序列WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2及/或含有序列HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3。在本文所述之任何實施例中，該等抗體另外含有一或兩個HVR序列，其係選自(i)含有序列NIKDTY(SEQ ID NO:4)之HVR-H1及(ii)含有序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)之HVR-H3。在另一項實施例中，該等抗體另外含有一或兩個HVR序列，其係選自(i)含有序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1及(ii)含有序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3。
在本發明之此態樣之各種實施例中，圖57中所示之任何具有大於1、5或10之F值的HVR-H2殘基均為較佳保持為與在bH1-44或bH1-81之HVR-H2之相同位置(分別為SEQ ID NO:8及5)處發現之殘基相同的殘基。在其他實施例中，表14中所示之任何具有大於1之ΔΔG值的HVR-H2殘基均為較佳保持為與在bH1-44或bH1-81之HVR-H2之相同位置(分別為SEQ ID NO:8及5)處發現之殘基相同的殘基。
在特定實施例中，抗體包含：含有NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列；含有WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列；含有HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列；含有NIKDTY(SEQ ID NO:4)之HVR-H1序列；含有RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)之HVR-H2序列；及含有WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)之HVR-H3序列，或包含：含有NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列；含有WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列；含有HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列；含有NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1序列；含有RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2序列；及/或含有WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3序列。
在另一項特定實施例中，經分離抗體含有HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其中各自依序含有序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)；WGSFLY(SEQ ID NO:2)；HYSSPP(SEQ ID NO:3)；NIKDTY(SEQ ID NO:4)；RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)；及WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)，且該抗體特異性地結合HER2及VEGF。在另一項特定實施例中，抗體含有HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3，其中各自依序含有序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)；WGSFLY(SEQ ID NO:2)；HYSSPP(SEQ ID NO:3)；NISGTY(SEQ ID NO:7)；RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)；及WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)，且該抗體特異性地結合HER2及VEGF。
在本文所述之任何態樣之各種實施例中，抗體以150nM或更強之Kd結合人類及鼠類VEGF且以7nM或更強之Kd結合HER2。在其他實施例中，該抗體相對於對照物抑制VEGF誘發之細胞增殖及表現HER2之細胞的增殖。在一項特定實施例中，抗體以36nM或更強之Kd結合人類及鼠類VEGF且以1nM或更強之Kd結合HER2。在另一項實施例中，該抗體抑制VEGF與VEGFR2結合。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離抗體，其以150nM或更強之Kd結合人類及鼠類VEGF且以7nM或更強之Kd結合HER2，且其中該抗體相對於對照物抑制VEGF誘發之細胞增殖及表現HER2之細胞的增殖。在一項實施例中，該抗體以36nM或更強之Kd結合人類及鼠類VEGF且以1nM或更強之Kd結合HER2。
在又一態樣中，本發明提供一種經分離抗體片段，其以58nM或更強之Kd結合人類VEGF且以6nM或更強之Kd結合HER2，且/或相對於對照物抑制VEGF誘發之細胞增殖及表現HER2之細胞的增殖。在一項特定實施例中，該抗體片段以33nM或更強之Kd結合人類及鼠類VEGF且以0.7nM或更強之Kd結合HER2。在另一項特定實施例中，該片段為Fab片段或單鏈可變片段(scFv)。
在任何上述態樣中，抗體可為單株抗體。在所有上述態樣之另一項實施例中，抗體可為IgG抗體。在所有上述態樣之其他實施例中，抗體之構架序列的至少一部分可為人類共同構架序列。
在另一態樣中，本發明提供一種抗體(本文所述之任何抗體)片段。抗體片段之一項實施例為特異性地結合HER2及VEGF且含有含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列的片段。在另一項實施例中，該抗體片段另外含有一或兩個HVR序列，其係選自(i)含有序列WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2；及(ii)含有序列HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3。在另一項實施例中，該抗體片段另外含有一個、兩個或三個HVR序列，其係選自(i)含有序列NIKDTY(SEQ ID NO:4)之HVR-H1；(ii)含有序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)之HVR-H2；及(iii)含有序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)之HVR-H3。在另一項實施例中，該抗體片段另外含有一個、兩個或三個HVR序列，其係選自(i)含有序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1；(ii)含有序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2；及(iii)含有序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3。在特定實施例中，該抗體片段包含：含有NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列；含有WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列；含有HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列；含有NIKDTY(SEQ ID NO:4)之HVR-H1序列；含有RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)之HVR-H2序列；及含有WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)之HVR-H3序列，或包含：含有NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列；含有WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列；含有HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列；含有NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1序列；含有RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2序列；及含有WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3序列。在一項實施例中，該片段為Fab片段或單鏈可變片段(scFv)。在所有上述態樣之其他實施例中，抗體之構架序列的至少一部分可為人類共同構架序列。
在其他態樣中，本發明提供編碼本文所述之任何抗體或抗體片段的聚核苷酸，以及一種含有該類聚核苷酸之或體。在特定實施例中，所編碼之抗體含有含NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列。視情況而定或另外而言，該聚核苷酸編碼亦含有含WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列及/或含HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列或其任何組合的抗體。在另一態樣中，該聚核苷酸可另外編碼含有以下序列中之一者、兩者或三者的抗體：含有NIKDTY(SEQ ID NO:4)之HVR-H1序列；含有RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)之HVR-H2序列；及含有WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)之HVR-H3序列；或編碼含有以下序列中之一者、兩者或三者的抗體：含有NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1；含有RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2；及/或含有WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3序列。
在本發明之其他態樣中，聚核苷酸編碼含有序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1序列、具有RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2序列或具有WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3序列或其任何組合。
在其他態樣中，本發明提供一種編碼含有序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列的經分離聚核苷酸，且視情況而定，該聚核苷酸另外編碼一個、兩個或三個HVR序列，其係選自(i)含有序列NIKDTY(SEQ ID NO:4)之HVR-H1；(ii)含有序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)之HVR-H2；及(iii)含有序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)之HVR-H3。在其他態樣中，本發明提供一種編碼以下序列之經分離聚核苷酸：含有序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列及(i)含有序列WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列或(ii)含有序列HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列或其兩者，且視情況而定地，該聚核苷酸另外編碼一個、兩個或三個HVR序列，其係選自(i)含有序列NIKDTY(SEQ ID NO:4)之HVR-H1；(ii)含有序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)之HVR-H2；及(iii)含有序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)之HVR-H3。
在另一態樣中，本發明提供一種編碼以下序列之經分離聚核苷酸：含有序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列；含有序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1；含有序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2；及含有序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3。在又一態樣中，本發明提供一種編碼以下序列之經分離聚核苷酸：含有序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列；含有序列WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列；含有序列HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列；含有序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1；含有序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2；及含有序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3。
在其他態樣中，本發明提供一種編碼含有序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1序列的經分離聚核苷酸、一種編碼含有序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2序列的經分離聚核苷酸及一種編碼含有序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3序列的經分離聚核苷酸。在另一態樣中，本發明提供一種編碼某一多肽之經分離聚核苷酸，該多肽包含：含有序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1序列；含有序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2序列；及含有序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3序列。
在本發明之另一項實施例中，經分離聚核苷酸編碼含有序列X1 IX3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 Y(SEQ ID NO:83)之HVR-L1序列，其中X1 為除天冬胺酸以外之任何胺基酸，X3 為除脯胺酸以外之任何胺基酸，X4 為除精胺酸以外之任何胺基酸且X5 為除絲胺酸以外之任何胺基酸。在本發明之另一項實施例中，聚核苷酸編碼含有序列X1 IX3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 Y(SEQ ID NO:83)之HVR-L1序列(其中X1 為除Asp以外之任何胺基酸，X3 為除脯胺酸以外之任何胺基酸，X4 為除精胺酸以外之任何胺基酸且X5 為除絲胺酸以外之任何胺基酸)及含有序列WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列及/或含有序列HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列。在本發明之此態樣之其他實施例中，聚核苷酸編碼含有序列X1 IX3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 Y(SEQ ID NO:83)之抗體，該抗體於X1 處具有天冬醯胺，於X3 處具有丙胺酸，於X4 處具有離胺酸，於X5 處具有蘇胺酸，於X7 處具有絲胺酸，及/或於X8 處具有甘胺酸，或其任何組合。在本發明之此態樣之各種實施例中，圖57中所示之任何具有大於1、5或10之F值的HVR-L1殘基均為較佳保持為與在bH1-44或bH1-81之HVR-L1之相同位置(SEQ ID NO:1)處發現之殘基相同的殘基。在其他實施例中，表14中所示之任何具有大於1之ΔΔG值的HVR-L1殘基均為較佳保持為與在bH1-44或bH1-81之HVR-L1之相同位置(SEQ ID NO:1)處發現之殘基相同的殘基。
在本發明之另一項實施例中，聚核苷酸編碼含有序列RX2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 R(SEQ ID NO:85)之HVR-H2序列，其中X5 為除蘇胺酸以外之任何胺基酸且X6 為除天冬醯胺以外之任何胺基酸。在另一態樣中，本發明提供一種編碼以下序列之聚核苷酸：含有序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1序列；含有序列RX2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 R(SEQ ID NO:85)之HVR-H2序列，其中X5 為除蘇胺酸以外之任何胺基酸且X6 為除天冬醯胺以外之任何胺基酸；及含有序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3序列。在本發明之另一項實施例中，聚核苷酸編碼含有序列RX2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 R(SEQ ID NO:84)之HVR-H2序列，其於X5 處具有絲胺酸，於X6 處具有麩胺酸，及/或於X8 處具有酪胺酸，或其任何組合。在本發明之此態樣之各種實施例中，圖57中所示之任何具有大於1、5或10之F值的HVR-H2殘基均為較佳保持為與在bH1-44或bH1-81之HVR-H2之相同位置(分別為SEQ ID NO:8及5)處發現之殘基相同的殘基。在其他實施例中，表14中所示之任何具有大於1之ΔΔG值的HVR-H2殘基均為較佳保持為與在bH1-44或bH1-81之HVR-H2之相同位置(分別為SEQ ID NO:8及5)處發現之殘基相同的殘基。
在其他態樣中，本發明提供一種含有含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列的經分離多肽，或一種含有含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列、含序列WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列及/或含序列HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列的經分離多肽。在另一態樣中，本發明提供一種多肽，其包含：含有序列X1 IX3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 Y(SEQ ID NO:83)之HVR-L1序列，其中X1 為除天冬胺酸以外之任何胺基酸，X3 為除脯胺酸以外之任何胺基酸，X4 為除精胺酸以外之任何胺基酸且X5 為除絲胺酸以外之任何胺基酸。在該態樣之另一項實施例中，該多肽含有HVR-L1序列X1 IX3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 Y(SEQ ID NO:83)，其中X1 為除天冬胺酸以外之任何胺基酸，X3 為除脯胺酸以外之任何胺基酸，X4 為除精胺酸以外之任何胺基酸且X5 為除絲胺酸以外之任何胺基酸。視情況而定，該多肽另外包括含有序列WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列及/或含有序列HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列。在包括含有序列X1 IX3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 Y(SEQ ID NO:83)之多肽的任何上述態樣之特定實施例中，於X1 處存在有天冬醯胺，於X3 處存在有丙胺酸，於X4 處存在有離胺酸，於X5 處存在有蘇胺酸，於X7 處存在有絲胺酸，及/或於X8 處存在有甘胺酸，或其任何組合。在本發明之此態樣之各種實施例中，圖57中所示之任何具有大於1、5或10之F值的HVR-L1殘基均為較佳保持為與在bH1-44或bH1-81之HVR-L1之相同位置(SEQ ID NO:1)處發現之殘基相同的殘基。在其他實施例中，表14中所示之任何具有大於1之ΔΔG值的HVR-L1殘基均為較佳保持為與在bH1-44或bH1-81之HVR-L1之相同位置(SEQ ID NO:1)處發現之殘基相同的殘基。
本發明亦提供一種多肽，其包含：含有序列RX2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 R(SEQ ID NO:85)之HVR-H2序列，其中X5 為除蘇胺酸以外之任何胺基酸且X6 為除天冬醯胺以外之任何胺基酸。在本發明之另一態樣中，該多肽含有HVR-H2序列RX2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 R(SEQ ID NO:85)(其中X5 為除蘇胺酸以外之任何胺基酸且X6 為除天冬醯胺以外之任何胺基酸)、含有序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1序列及含有序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3序列。在上述態樣之不同實施例中，含有含序列RX2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 R(SEQ ID NO:84)之HVR-H2序列的多肽於X5 處具有絲胺酸，於X6 處具有麩胺酸，及/或於X8 處具有酪胺酸，或其任何組合。在本發明之此態樣之各種實施例中，圖57中所示之任何具有大於1、5或10之F值的HVR-H2殘基均為較佳保持為與在bH1-44或bH1-81之HVR-H2之相同位置(分別為SEQ ID NO:8及5)處發現之殘基相同的殘基。在其他實施例中，表14中所示之任何具有大於1之ΔΔG值的HVR-H2殘基均為較佳保持為與在bH1-44或bH1-81之HVR-H2之相同位置(分別為SEQ ID NO:8及5)處發現之殘基相同的殘基。
本發明亦提供一種含有以下序列中之一者、兩者或三者的多肽：含有序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1序列、含有序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2序列及/或含有序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3序列或其任何組合。
在任何上述態樣中，經分離多肽可另外含有以下序列中之一者、兩者或三者：含有序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列；含有序列NIKDTY(SEQ ID NO:4)之HVR-H1；含有序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)之HVR-H2；及/或含有序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)之HVR-H3，或其任何組合。
在任何上述態樣中，經分離多肽可另外含有以下序列中之一者、兩者或三者：含有序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列；含有序列WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列；含有序列HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列。
在任何上述態樣中，經分離多肽可另外包含：含有序列NIKDTY(SEQ ID NO:4)之HVR-H1；含有序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)之HVR-H2；及/或含有序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)之HVR-H3，或其任何組合。
在任何上述態樣中，經分離多肽可另外含有一個、兩個或三個HVR序列，其係選自：含有序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1；含有序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2序列；及/或含有序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3，或其任何組合。
在其他態樣中，本發明提供一種經分離多肽，其包含：含有序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列及(i)含有序列WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列或(ii)含有序列HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列或其兩者；及一個、兩個或三個HVR序列，其係選自(i)含有序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1；(ii)含有序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2；及(iii)含有序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3。
在其他態樣中，本發明提供一種經分離多肽，其包含：含有序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列及(i)含有序列WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列或(ii)含有序列HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列或其兩者；及一個、兩個或三個HVR序列，其係選自：(i)含有序列NIKDTY(SEQ ID NO:4)之HVR-H1；(ii)含有序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)之HVR-H2；及/或(iii)含有序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)之HVR-H3或其任何組合。
在其他態樣中，本發明提供一種含有含序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1序列的經分離多肽、一種包含含有序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2序列的經分離多肽及一種含有含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3序列的經分離多肽。在又一態樣中，本發明提供一種經分離多肽，其包含：含有序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1序列；含有序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2序列；及含有序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3序列。
在一項實施例中，本發明提供一種含有本發明之任何上述聚核苷酸之載體。在另一態樣中，本發明提供一種含有本發明之任何載體之宿主細胞。在一項實施例中，該宿主細胞為原核的。在另一項實施例中，該宿主細胞為真核的，例如哺乳動物細胞。
在另一態樣中，本發明提供一種產生上述任何抗體或抗體片段之方法。該方法包括培養包含含有編碼該抗體之聚核苷酸之載體的宿主細胞且回收該抗體。在特定實施例中，該聚核苷酸編碼含有序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列，且視情況而定，該聚核苷酸另外編碼含有序列NIKDTY(SEQ ID NO:4)之HVR-H1、含有序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)之HVR-H2及含有序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)之HVR-H3。在其他實施例中，該聚核苷酸編碼含有序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列、含有序列WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列及含有序列HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列，且視情況而定，該聚核苷酸另外編碼含有序列NIKDTY(SEQ ID NO:4)之HVR-H1、含有序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)之HVR-H2及含有序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)之HVR-H3。在另一項實施例中，該聚核苷酸編碼含有序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列、含有序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1、含有序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2及含有序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3。在又一項實施例中，該聚核苷酸編碼含有序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列、含有序列WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列、含有序列HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列、含有序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1、含有序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2及含有序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3。
在其他實施例中，該聚核苷酸編碼含有序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1序列、含有序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2序列或含有序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3序列。在又一項實施例中，該聚核苷酸編碼一種多肽，其含有：包含序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1序列；含有序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2序列；及含有序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3序列。
在一項實施例中，該宿主細胞為原核的，且在另一項實施例中，該宿主細胞為真核的，諸如哺乳動物細胞。
在另一態樣中，本發明提供一種治療個體之腫瘤的方法。該方法包括向該個體投與本文所述之抗體或抗體片段，其中該投與所持續之時間以及投與量足以治療或預防該個體之該腫瘤。在一項實施例中，該腫瘤為結腸直腸腫瘤、乳癌、肺癌、腎細胞癌、神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤或卵巢癌。在另一項實施例中，該抗體含有含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列且特異性地結合HER2及VEGF。根據一項實施例，該抗體另外含有一或兩個HVR序列，其係選自(i)含有序列WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2；及(ii)含有序列HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3。在另一項實施例中，該抗體含有一個、兩個或三個HVR序列，其係選自(i)含有序列NIKDTY(SEQ ID NO:4)之HVR-H1；(ii)含有序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)之HVR-H2；及(iii)含有序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)之HVR-H3。在另一項實施例中，該抗體含有一個、兩個或三個HVR序列，其係選自(i)含有序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1；(ii)含有序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2；及(iii)含有序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3。在特定實施例中，該抗體包含：含有NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列、含有WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列、含有HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列、含有NIKDTY(SEQ ID NO:4)之HVR-H1序列、含有RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)之HVR-H2序列及含有WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)之HVR-H3序列，且特異性地結合HER2及VEGF。在另一項實施例中，該抗體包含:含有NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列、含有WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列、含有HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列、含有NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1序列、含有RIYPSFGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2序列及含有WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3序列，且特異性地結合HER2及VEGF。
在一項實施例中，該方法另外包括向該個體投與另一抗癌療法。在另一項實施例中，該另一抗癌療法包括另一抗體、化療劑、細胞毒性劑、抗血管生成劑、免疫抑制劑、前藥、細胞激素、細胞激素拮抗劑、細胞毒性放射線療法、皮質類固醇、止吐劑、癌症疫苗、止痛劑或生長抑制劑。
在另一項實施例中，該另一抗癌療法係在投與抗體之前或之後投與。在另一項實施例中，該另一抗癌療法係與抗體同時投與。
在另一態樣中，本發明提供一種治療個體之自體免疫疾病的方法。該方法包括向該個體投與本文所述之抗體或抗體片段，其中該投與所持續之時間以及投與量足以治療或預防該個體之該自體免疫疾病。在一項實施例中，該抗體含有含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列，且特異性地結合HER2及VEGF。根據一項實施例，該抗體含有一或兩個HVR序列，其係選自(i)含有序列WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2；及(ii)含有序列HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3。在另一項實施例中，該抗體含有一個、兩個或三個HVR序列，其係選自(i)含有序列NIKDTY(SEQ ID NO:4)之HVR-H1；(ii)含有序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)之HVR-H2；及(iii)含有序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)之HVR-H3。在另一項實施例中，該抗體含有一個、兩個或三個HVR序列，其係選自(i)含有序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1；(ii)含有序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2；及(iii)含有序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3。在特定實施例中，該抗體包含:含有NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列、含有WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列、含有HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列、含有NIKDTY(SEQ ID NO:4)之HVR-H1序列、含有RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)之HVR-H2序列及含有WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)之HVR-H3序列，且特異性地結合HER2及VEGF，或該抗體含有:包含NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列、含有WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列、含有HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列、含有NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1序列、含有RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2序列及含有WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3序列，且特異性地結合HER2及VEGF。
在又一態樣中，本發明提供一種治療個體之涉及HER2異常活化的非惡性疾病之方法。該方法包括向該個體投與本文所述之抗體或抗體片段，其中該投與所持續之時間以及投與量足以治療或預防該個體之該非惡性疾病。在一項實施例中，該抗體含有含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列，且特異性地結合HER2及VEGF。根據一項實施例，該抗體包含一或兩個HVR序列，其係選自(i)含有序列WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2；及(ii)含有序列HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3。在另一項實施例中，該抗體另外含有一個、兩個或三個HVR序列，其係選自(i)含有序列NIKDTY(SEQ ID NO:4)之HVR-H1；(ii)含有序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)之HVR-H2；及(iii)含有序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)之HVR-H3。在另一項實施例中，該抗體含有一個、兩個或三個HVR序列，其係選自(i)含有序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1；(ii)含有序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2；及(iii)含有序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3。在特定實施例中，該抗體包含：含有NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列、含有WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列、含有HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列、含有NIKDTY(SEQ ID NO:4)之HVR-H1序列、含有RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)之HVR-H2序列及含有WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)之HVR-H3序列，且特異性地結合HER2及VEGF，或該抗體含有:包含NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列、含有WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列、含有HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列、含有NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1序列、含有RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2序列及含有WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3序列，且特異性地結合HER2及VEGF。
本發明之其他態樣提供本文所述之抗體及抗體片段用於治療個體之涉及HER2異常活化的腫瘤、自體免疫疾病或非惡性疾病之用途，以及用於製造用以治療個體之涉及HER2異常活化的腫瘤、自體免疫疾病或非惡性疾病之藥物之用途。在該等用途之一項實施例中，該抗體含有含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列，且特異性地結合HER2及VEGF。根據一項實施例，該抗體另外含有一或兩個HVR序列，其係選自(i)含有序列WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2；及(ii)含有序列HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3。在另一項實施例中，該抗體含有一個、兩個或三個HVR序列，其係選自(i)含有序列NIKDTY(SEQ ID NO:4)之HVR-H1；(ii)含有序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)之HVR-H2；及(iii)含有序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)之HVR-H3。在另一項實施例中，該抗體含有一個、兩個或三個HVR序列，其係選自(i)含有序列NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1；(ii)含有序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2；及(iii)含有序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3。在特定實施例中，該抗體包含：含有NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列、含有WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列、含有HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列、含有NIKDTY(SEQ ID NO:4)之HVR-H1序列、含有RIYPTNGYTR(SEQ ID NO:5)之HVR-H2序列及含有WGGDGFYAMD(SEQ ID NO:6)之HVR-H3序列，且特異性地結合HER2及VEGF，或該抗體包含：含有NIAKTISGY(SEQ ID NO:1)之HVR-L1序列、含有WGSFLY(SEQ ID NO:2)之HVR-L2序列、含有HYSSPP(SEQ ID NO:3)之HVR-L3序列、含有NISGTY(SEQ ID NO:7)之HVR-H1序列、含有RIYPSEGYTR(SEQ ID NO:8)之HVR-H2序列及含有WVGVGFYAMD(SEQ ID NO:9)之HVR-H3序列，且特異性地結合HER2及VEGF。
在本文所述之治療涉及HER2異常活化之腫瘤、自體免疫疾病或非惡性疾病的方法之一項實施例中，該個體為人類。
此外，涵蓋包含本文所述之抗體及抗體片段的套組、組合物及製造物品。
本發明提供製造多重特異性抗體及抗體片段之方法，以及使用該等方法識別之抗體及其用途。一般而言，本發明之方法包含使抗體之輕鏈可變域或重鏈可變域多樣化以產生可於文庫中穩定表現之變異體。隨後自此文庫中選出能夠特異性地結合兩個抗原決定基之多樣化抗體且作進一步表徵。
使用本發明之方法識別之例示性抗體包括結合HER2(人類表皮生長因子受體2)與VEGF(血管內皮生長因子)兩者之抗體。特定言之，本文所述之資料(例如在下文實例中)展示HER2抗體之輕鏈互補決定區(CDR)之突變可賦予對無關蛋白抗原以及HER2之雙重結合能力。一種雙特異性高親和性HER2/VEGF抗體已經廣泛表徵。此外，展示與HER2及VEGF複合之該雙特異性Fab的晶體結構且評估突變誘發對Fab殘基之能量貢獻。兩個抗原之結合位點廣泛重疊；接觸HER2之大多數CDR殘基亦咬合VEGF。然而，在能量上，重鏈之殘基支配HER2特異性，而輕鏈支配VEGF特異性。
HER2/VEGF雙特異性抗體於活體外及活體內抑制HER2及VEGF介導之細胞增殖。該等結果表明改變抗體之輕鏈可變域的序列可產生具有雙特異性及功能之抗體。例如，bH1-44及bH1-81具有靶向兩種腫瘤進程機制之潛力：由HER2介導之腫瘤細胞增殖及由VEGF介導之腫瘤血管生成。以單一抗體共靶向兩個抗原為組合療法之一種替代選擇。
I.定義
術語「多重特異性抗體」係以最廣泛意義使用且具體涵蓋包含重鏈可變域(VH )及輕鏈可變域(VL )之抗體，其中VH VL 單元具有多抗原決定基特異性(亦即，能夠結合至一個生物分子上之兩個不同抗原決定基或不同生物分子上之每一抗原決定基)。該等多重特異性抗體包括(但不限於)全長抗體、具有兩個或兩個以上VL 及VH 域之抗體、諸如Fab、Fv、dsFv、ScFv、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體及三功能抗體之抗體片段、經共價或非共價連接之抗體片段。「多抗原決定基特異性」係指特異性地結合至相同或不同標靶上之兩個或兩個以上不同抗原決定基的能力。「單特異性」係指僅結合一個抗原決定基之能力。根據一項實施例，多重特異性抗體為以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM之親和性結合至每一抗原決定基的IgG1形式。
基本4鏈抗體單元為由兩個相同輕(L)鏈及兩個相同重(H)鏈構成之異源四聚醣蛋白(IgM抗體由5個基本異源四聚體單元以及另一稱作J鏈之多肽組成，且因此含有10個抗原結合位點，而所分泌之IgA抗體可聚合以形成包含2至5個基本4鏈單元以及J鏈之多價集合體)。在IgG之情況下，4鏈單元一般為約150,000道爾頓(dalton)。每一L鏈均由一個共價雙硫鍵連接至H鏈，而兩個H鏈視H鏈同型而定經由一或多個雙硫鍵彼此連接。每一H鏈及L鏈亦具有規律間隔之鏈內雙硫橋。每一H鏈於N末端具有可變域(VH )，其後對於α及γ鏈之各者而言為三個恆定域(CH )且對於μ及ε同型而言為四個CH 域。每一L鏈於N末端具有可變域(VL )，其後在其另一末端為恆定域(CL )。VL 係與VH 對準且CL 係與重鏈之第一恆定域(CH 1)對準。咸信特定胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成一界面。VH 與VL 之配對一起形成單一抗原結合位點。關於不同類別的抗體之結構及特性，參見例如Basic and Clinical Immunolog y，第8版，Daniel P. Stites,Abba I. Terr及Tristram G. Parslow(編)，Appleton & Lange,Norwalk,CT,1994，第71頁及第6章。
任何脊椎動物物種之L鏈基於其恆定域之胺基酸序列均可歸屬於兩種明顯不同的類型(稱作κ及λ)中之一種。免疫球蛋白視其重鏈之恆定域(CH )的胺基酸序列而定可歸屬於不同類別或同型。存在五類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其分別具有命名為α、δ、γ、ε及μ之重鏈。γ及α類別基於CH 序列及功能之相對微小的差異而被進一步分成亞類，例如人類表現以下亞類：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。
術語「可變」係指可變域之某些區段的序列在抗體之間廣泛不同的事實。V域介導抗原結合且確定特定抗體對其特定抗原之特異性。然而，可變性在可變域之110個胺基酸跨度上並非均勻分布。實情為，V區由具有15至30個胺基酸且稱作構架區(FR)之相對不變的一段序列構成，該等構架區被長度各為9至12個胺基酸之稱作「高變區」的具極端可變性之較短區所分隔開。天然重鏈及輕鏈之可變域各自包含四個主要採用β摺疊構型、藉由三個高變區連接之FR，該等高變區形成連接β摺疊結構之環，且在一些情況下形成β摺疊結構之部分。每一鏈中之高變區經由FR極接近地固持在一起，且與另一鏈之高變區一起促使抗體之抗原結合位點形成(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恆定域並不直接涉及使抗體與抗原結合，但展現各種效應功能，諸如使抗體參與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
術語「高變區」在本文中使用時係指抗體之負責抗原結合的胺基酸殘基。高變區通常包含「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基(例如，於VL 中在約殘基24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)周圍，且於VH 中在約殘基26-35(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)周圍(在一項實施例中，H1係在約殘基31-35周圍)；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))及/或「高變環」之彼等殘基(例如，於VL 中為殘基26-32(L1)、50-52(L2)及91-96(L3)，且於VH 中為26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)；Chothia及Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))。
「構架區」(FR)為除CDR殘基以外之彼等可變域殘基。每一可變域一般具有四個標識為FR1、FR2、FR3及FR4之FR。若根據Kabat來定義CDR，則輕鏈FR殘基係位於約殘基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)及98-107(LCFR4)處，且重鏈FR殘基係位於重鏈殘基中之約殘基1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)及103-113(HCFR4)處。若CDR包含高變環之胺基酸殘基，則輕鏈FR殘基係位於輕鏈中之約殘基1-25(LCFR1)、33-49(LCFR2)、53-90(LCFR3)及97-107(LCFR4)處，且重鏈FR殘基係位於重鏈殘基中之約殘基1-25(HCFRI)、33-52(HCFR2)、56-95(HCFR3)及102-113(HCFR4)處。在某些情況下，當CDR包含如Kabat所定義之CDR之胺基酸及高變環之胺基酸兩者時，FR殘基將相應地經調整。例如，當CDRH1包括胺基酸H26-H35時，重鏈FR1殘基係位於1-25位且FR2殘基係位於36-49位。
「人類共同構架」為表示在人類免疫球蛋白VL或VH構架序列之選擇中最常出現之胺基酸殘基的構架。通常，人類免疫球蛋白VL或VH序列之選擇係來自可變域序列之亞群。通常，序列之亞群為如Kabat中之亞群。在一項實施例中，對於VL而言，亞群為如Kabat中之亞群κI。在一項實施例中，對於VH而言，亞群為如Kabat中之亞群III。
如本文中所用之術語「單株抗體」係指來自一群大體上均質之抗體的抗體，亦即，構成該群之個別抗體除可能在單株抗體產生期間產生且一般以微量存在之可能變異體以外實質上為相同的且結合相同抗原決定基。該單株抗體一般包括包含結合標靶之可變區的抗體，其中該抗體係藉由自複數個抗體中選擇抗體之方法而獲得。例如，選擇方法可為自複數個純系(諸如融合瘤純系、噬菌體純系或重組DNA純系之集合)中選擇出獨特純系。應瞭解，所選抗體可經進一步修改(例如)以改良對標靶之親和性，人類化抗體，改良其在細胞培養物中之產生，減少其活體內免疫原性，產生多重特異性抗體等，且應瞭解包含經修改可變區序列之抗體亦為本發明之單株抗體。除其特異性以外，單株抗體製劑之有利之處在於其一般未受其他免疫球蛋白污染。修飾語「單株」表示如自大體上同源之抗體群體所獲得之抗體的特徵，且不欲解釋為需要藉由任何特定方法來產生抗體。例如，根據本發明欲使用之單株抗體可由各種技術來製造，包括融合瘤方法(例如，Kohler等人，Nature,256:495(1975)；Harlow等人，Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等人，於Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)中)、重組DNA方法(參見，例如美國專利第4,816,567號)、噬菌體呈現技術(參見，例如Clackson等人，Nature,352:624-628(1991)；Marks等人，J. Mol. Biol.,222:581-597(1991)；Sidhu等人，J. Mol. Biol. 338(2):299-310(2004)；Lee等人，J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472(2004)；及Lee等人J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132(2004))及用於產生人類抗體或來自具有編碼人類免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因座或基因之部分或全部的動物之人類樣抗體的技術(參見，例如WO98/24893、WO/9634096、 WO/9633735及WO/91 10741,Jakobovits等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:2551(1993)；Jakobovits等人，Nature,362:255-258(1993)；Bruggemann等人，Year in Immuno.,7:33(1993)；美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、第5,591,669號(GenPharm之所有)、第5,545,807號、WO 97/17852、美國專利第5,545,807號、第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號及第5,661,016號及Marks等人，Bio/Technology,10:779-783(1992)；Lonberg等人，Nature,368:856-859(1994)；Morrison,Nature,368:812-813(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology,14:845-851(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology,14:826(1996)；及Lonberg及Huszar,Intern. Rev. Immunol.,13:65-93(1995))。
「完整」抗體為包含抗原結合位點以及CL 及至少重鏈恆定域(CH 1、CH 2及CH 3)之抗體。恆定域可為天然序列恆定域(例如，人類天然序列恆定域)或其胺基酸序列變異體。較佳地，完整抗體具有一或多種效應功能。
「抗體片段」包含完整抗體之一部分，較佳為完整抗體之抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2 及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體(參見美國專利第5,641,870號，實例2；Zapata等人，Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995))；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成之多重特異性抗體。
表述「線性抗體」通常係指Zapata等人，Protein Eng.,8(10):1057-1062(1995)中所述之抗體。簡言之，該等抗體包含一對串聯Fd區段(VH -CH 1-VH -CH 1)，其與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區。線性抗體可具雙特異性或單特異性。
木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個相同之抗原結合片段，稱為「Fab」片段及殘餘「Fc」片段，此命名反映易於結晶之能力。Fab片段由整個L鏈以及H鏈之可變區域(VH )及一個重鏈之第一恆定域(CH 1)組成。胃蛋白酶處理抗體產生單一大的F(ab')2 片段，其粗略地對應於具有二價抗原結合活性之經兩個雙硫鍵連接之Fab片段且仍能夠交聯抗原。Fab'片段與Fab片段之區別在於在CH 1域之羧基末端具有額外少量殘基，包括來自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸。Fab'-SH在本文中為對於恆定域之半胱胺酸殘基帶有自由硫醇基之Fab'的命名。F(ab')2 抗體片段初始係產生為在片段之間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab'片段對。抗體片段之其他化學偶合亦係已知的。
Fc片段包含由雙硫鍵固持在一起之兩個H鏈的羧基末端部分。抗體之效應功能係由Fc區中之序列來確定；該區亦為由在特定類型細胞上所發現之Fc受體(FcR)所識別之部分。
「Fv」係由緊密非共價締合之一個重鏈可變區域與一個輕鏈可變區域的二聚體組成。自該兩個域之摺疊發散出六個高變環(3個環各自來自H及L鏈)，其有助於胺基酸殘基之抗原結合且賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使單一可變域(或僅包含三個對抗原具特異性之CDR的Fv之一半)具有識別及結合抗原之能力，但親和性常低於整個結合位點。
亦縮寫為「sFv」或「scFv」之「單鏈Fv」為包含連接成單一多肽鏈之VH 及VL 抗體域的抗體片段。較佳地，sFv多肽另外包含位於VH 與VL 域之間使得sFv能夠形成用以抗原結合之所要結構的多肽連接子。關於sFv之綜述，參見Pluckthun於The Pharmacology of Monoclonal Antibodies ，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)；Borrebaeck 1995中。
術語「雙功能抗體」係指藉由建構sFv片段(參見前段)製備之小抗體片段，其於VH 及VL 域之間具有短連接子(約5至10個殘基)以使得達成V域之鏈間配對而非鏈內配對，產生二價片段，亦即具有兩個抗原結合位點之片段。雙特異性雙功能抗體為兩個「交叉」sFv片段之異源二聚體，其中不同多肽鏈上存在兩種抗體之VH 及VL 域。雙功能抗體更全面描述於(例如)EP 404,097、WO 93/11161及Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:6444-6448(1993)中。
非人類(例如，齧齒動物)抗體之「人類化」形式為含有源自非人類抗體之最小序列的嵌合抗體。在極大程度上，人類化抗體為其中受體高變區之殘基經具有所要抗體特異性、親和性及能力之非人類物種(諸如小鼠，大鼠，兔或非人類靈長類動物)(供體抗體)的高變區之殘基置換之人類免疫球蛋白(受體抗體)。在某些情況下，人類免疫球蛋白之構架區(FR)殘基經相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中未發現之殘基。進行該等修飾以進一步改進抗體效能。一般而言，人類化抗體將包含大體上至少一個(且一般為兩個)可變域之全部，其中所有或大體上所有之高變環對應於非人類免疫球蛋白之高變環且所有或大體上所有之FR為人類免疫球蛋白序列之FR。人類化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，一般為人類免疫球蛋白之至少一部分。關於進一步詳情，參見Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；及Presta,Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)。
如本文中所用，「密碼子組」係指一組用於編碼所要變異體胺基酸之不同核苷酸三聯體序列。例如，可藉由固相合成來合成一組寡核苷酸，包括表示由密碼子組所提供之核苷酸三聯體的所有可能組合且將編碼所要胺基酸群之序列。密碼子命名之標準形式為IUB碼之標準形式，其在此項技術中係已知的且描述於本文中。密碼子組一般由3個大寫字母以斜體表示，例如NNK、NNS、XYZ、DVK及其類似物(例如，NNK密碼子係指在密碼子之1及2位處，N=A/T/G/C且在等莫耳比下於3位處K=G/T以編碼所有20種天然胺基酸)。因此，如本文中所用之「非隨機密碼子組」係指編碼部分(較佳完全)滿足如本文所述之胺基酸選擇標準的所選胺基酸之密碼子組。於特定位置處具有所選核苷酸「簡併」之寡核苷酸的合成於彼項技術中係熟知的，例如TRIM方法(Knappek等人，J. Mol. Biol. 296:57-86,1999)；Garrard及Henner,Gene 128:103,1993。該等具有特定密碼子組之寡核苷酸組可使用市售核酸合成器(例如，可購自Applied Biosystems,Foster City,CA)來合成或可由商業獲得(例如，獲自Life Technologies,Rockville,MD)。因此，所合成之具有特定密碼子組之一組寡核苷酸一般將包括複數個具有不同序列之寡核苷酸，該等差異係由總序列內之密碼子組所建立。如根據本發明所用之寡核苷酸具有允許與可變域核酸模板雜交之序列且亦可(但非必須)包括適用於(例如)選殖目的之限制酶位點。
本發明之「結合」所關注抗原之抗體為以足夠親和性結合抗原以使得抗體在靶向蛋白或表現抗原之細胞或組織時適用作診斷劑及/或治療劑且不與其他蛋白顯著交叉反應之抗體。在該等實施例中，如由螢光活化細胞揀選(FACS)分析或放射免疫沈澱(RIA)或ELISA所測定，抗體與「非標靶」蛋白結合之程度將小於抗體與其特定標靶蛋白結合之約10%。關於抗體與標靶分子之結合，術語「特異性結合」或」特異性地結合至特定多肽或特定多肽標靶上之抗原決定基」或「對特定多肽或特定多肽標靶上之抗原決定基具特異性」意謂經量測與非特異性相互作用不同之結合(例如，對於bH1-44或bH1-81而言，非特異性相互作用為結合至牛血清白蛋白、酪蛋白、胎牛血清或中性鏈親和素(neuravidin))。例如，特異性結合可藉由與對照分子之結合相比測定分子之結合來量測。例如，特異性結合可藉由與類似於標靶之對照分子(例如，過量之未經標記標靶)競爭來測定特異性結合。在此情況下，若經標記標靶與探針之結合受到過量未經標記標靶之競爭性抑制，則指示特異性結合。如本文所用之術語「特異性結合特定多肽或特定多肽標靶上之抗原決定基」或「特異性地結合至特定多肽或特定多肽標靶上之抗原決定基」或「對特定多肽或特定多肽標靶上之抗原決定基具特異性」可例如由對標靶具有至少約200nM、或者至少約150nM、或者至少約100nM、或者至少約60nM、或者至少約50nM、或者至少約40nM、或者至少約30nM、或者至少約20nM、或者至少約10nM、或者至少約8nM、或者至少約6nM、或者至少約4nM、或者至少約2nM、或者至少約1nM或更大之Kd的分子來展示。在一項實施例中，術語「特異性結合」係指分子在大體上不結合至任何其他多肽或多肽抗原決定基之情況下結合至特定多肽或特定多肽上之抗原決定基的結合。
「結合親和性」通常係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)間之非共價相互作用的總強度。除非另作說明，否則如本文所用之「結合親和性」係指反映結合對成員(例如抗體與抗原)之間1:1相互作用之固有結合親和性。分子X對其搭配物Y之親和性通常可由解離常數(Kd)來表示。理想的是，Kd為約200nM、150nM、100nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、1nM或更強。親和性可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所述之彼等方法)來量測。低親和性抗體通常緩慢地結合抗原且傾向於易於解離，而高親和性抗體通常較快地結合抗原且傾向於保持較長時間結合。此項技術中已知多種量測結合親和性之方法，該等方法中之任一者均可用於達成本發明之目的。
在一項實施例中，使用BIAcoreTM -2000或BIAcoreTM -3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，藉由使用表面電漿共振檢定，於25℃下以約10個反應單位(RU)之固定抗原CM5晶片來量測根據本發明之「Kd」或「Kd值」。簡言之，根據供應商之說明書用N-乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)使羧甲基化葡聚糖生物感應器晶片(CM5,BIAcore Inc.)活化。用10mM乙酸鈉(pH 4.8)稀釋抗原至5μg/ml(約0.2μM)，之後以5微升/分鐘之流動速率注射以獲得約10個反應單位(RU)之偶合蛋白。注射抗原後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應之基團。關於動力學量測，於25℃下以約25μl/min之流動速率於具有0.05% Tween 20之PBS(PBST)中注射Fab之兩倍連續稀釋液(例如，0.78nM至500nM)。使用簡單之一比一朗繆爾結合模型(Langmuir binding model)(BIAcore評估軟體3.2版)，藉由同時擬合締合與解離感應器圖譜來計算締合速率(kon )及解離速率(koff )。根據比率koff /kon 來計算平衡解離常數(Kd)。參見例如Chen,Y.等人，(1999)J. Mol. Biol. 293:865-881。若由上述表面電漿共振檢定獲得之締合速率超過106 M-1 S-1 ，則可在如光譜儀(諸如裝備停流裝置之分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌紅色光析管之8000系列SLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic))所量測濃度遞增之抗原存在下，藉由使用於25℃下量測PBS(pH 7.2)中之20nM抗抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度之增加或降低(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)的螢光淬滅技術來測定締合速率。
根據本發明，「締合速率」或「kon 」亦可在25℃下，使用BIAcoreTM -2000或BIAcoreTM -3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，以約10個反應單位(RU)之固定抗原CM5晶片，利用上述相同之表面電漿共振技術來測定。簡言之，根據供應商之說明書用N-乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)使羧甲基化葡聚糖生物感應器晶片(CM5,BIAcore Inc.)活化。用10mM乙酸鈉(pH 4.8)稀釋抗原至5μg/ml(約0.2μM)，之後以5微升/分鐘之流動速率注射以獲得約10個反應單位(RU)之偶合蛋白。注射抗原後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應之基團。關於動力學量測，於25℃下以約25μl/min之流動速率於具有0.05% Tween 20之PBS(PBST)中注射Fab之兩倍連續稀釋液(例如，0.78nM至500nM)。使用簡單之一對一朗繆爾結合模型(BIAcore評估軟體3.2版)，藉由同時擬合締合與解離感應器圖譜來計算締合速率(kon )及解離速率(koff )。根據比率koff /kon 來計算平衡解離常數(Kd)。參見例如Chen，Y.等人，(1999)J. Mol. Biol. 293:865-881。然而，若由上述表面電漿共振檢定獲得之締合速率超過106 M-1 S-1 ，則較佳可在如光譜儀(諸如裝備停流裝置之分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌光析管之8000系列SLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic))所量測濃度遞增之抗原存在下，藉由使用於25℃下量測PBS(pH 7.2)中之20nM抗抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度之增加或降低(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)的螢光淬滅技術來測定締合速率。
關於本發明之多肽而言之「生物活性」及「生物特徵」意謂除另外說明外具有結合至生物分子之能力。
「生物分子」係指核酸、蛋白、碳水化合物、脂質及其組合。在一項實施例中，生物分子天然存在。
「經分離」當用於描述本文所揭示之各種抗體時意謂已經識別且自表現其之細胞或細胞培養物分離及/或回收之抗體。對於多肽而言，其天然環境之污染組分為一般將干擾診斷或治療用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中，抗體將經純化至(1)足以藉由使用旋轉杯定序儀來獲得N末端或內部胺基酸序列的至少15個殘基之程度；或(2)使用庫馬斯(Coomassie)藍或(較佳地)銀染色在非還原或還原條件下藉由SDS-PAGE獲得同源性。由於多肽天然環境之至少一種組分將不存在，因此經分離之抗體包括重組細胞內之原位抗體。然而，通常經分離之多肽將由至少一個純化步驟來製備。
術語「對照序列」係指為特定宿主生物體內之可操作地連接編碼序列之表現所必需的DNA序列。適於原核生物之對照序列(例如)包括啟動子、視情況存在之操縱序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號及增強子。
當使核酸與另一核酸序列功能相關時，該核酸被「可操作地連接」。舉例而言，前序列(presequence)或分泌性前導序列之DNA若其被表現為參與多肽之分泌的前體蛋白質則被可操作地連接於該多肽之DNA；啟動子或增強子若其影響編碼序列之轉錄則被可操作地連接於該編碼序列；或核糖體結合位點若其經定位而有助於轉譯則被可操作地連接於編碼序列。一般而言，「可操作地連接」意謂所連接之DNA序列為鄰接的，且在分泌性前導序列之情況下為鄰接的且處於閱讀階段。然而，增強子不必為鄰接的。藉由接合於適宜限制性位點處來實現連接。若該等位點不存在，則根據習知作法使用合成寡核苷酸接頭或連接子。
關於本文中所識別之多肽序列的「胺基酸序列一致性百分數(%)」經定義為在比對序列且引入缺口(若必要)以達成最大序列一致性百分數之後，且不將任何保守性取代視為序列一致性之部分時，胺基酸殘基在與所比較序列中之胺基酸殘基相同之候選序列中的百分數。為測定胺基酸序列一致性百分比目的而進行之比對可以此項技術中熟知之各種方式來實現，例如使用公開可用之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於量測比對之適當參數，包括實現所比較之全長序列上最大比對所需之任何演算法。然而，為達成本文之目的，胺基酸序列一致性%值係使用序列比較電腦程式ALIGN-2而產生。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech,Inc.創作且原始碼已以使用者文件備案於美國版權辦公室(U.S. Copyright Office,Washington D.C.,20559)，其中其係以美國版權註冊第TXU510087號註冊。ALIGN-2程式經Genentech,Inc.(South San Francisco,California)公開可用。ALIGN-2程式應經編譯以用於UNIX操作系統，較佳為數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式來設定且不改變。
除非另外指出，否則本文所述之胺基酸序列為鄰近之胺基酸序列。
根據本發明，「結構上不相似」之生物分子係指不屬於相同類別之生物分子(蛋白、核酸、脂質、碳水化合物等)，或例如當提及蛋白時，與彼此相比具有小於60%之胺基酸一致性、小於50%之胺基酸一致性、小於40%之胺基酸一致性、小於30%之胺基酸一致性、小於20%之胺基酸一致性或小於10%之胺基酸一致性。
一般熟習此項技術者可易於測定雜交反應之「嚴格性」且其通常為根據探針長度、洗滌溫度及鹽濃度之經驗計算值。一般而言，較長探針要求較高溫度以適當黏接，而較短探針需要較低溫度。雜交通常視當互補鏈存在於低於其熔融溫度之環境中時已變性DNA再黏接之能力而定。探針與可雜交序列之間所要之同源性程度愈高，可使用之相對溫度則愈高。因此，由此得出結論，較高相對溫度將傾向於使反應條件更嚴格，而因此較低相對溫度則傾向於使反應條件較不嚴格。關於雜交反應嚴格性之額外詳情及解釋，參見Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers,(1995)。
如本文所定義，「嚴格條件」或「高嚴格性條件」可由以下要求來識別：(1)採用低離子強度及高溫以供洗滌，例如0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉，於50℃下；(2)在雜交期間採用變性劑(諸如甲醯胺)，例如具有0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯啶酮之50%(v/v)甲醯胺/具有750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉之50mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.5)，於42℃下；或(3)在42℃下，於採用50%甲醯胺、5×SSC(0.75M NaCl、0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5×唐納氏溶液(Denhardt's solution)、經超音波處理之鮭魚精DNA(50μg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖之溶液中隔夜雜交，在42℃下於0.2×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中洗滌10分鐘，繼而在55℃下於由含有EDTA之0.1×SSC組成之高嚴格性洗滌液中洗滌10分鐘。
「適度嚴格條件」可如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, New York:Cold Spring Harbor Press,1989所述來識別，且包括使用與如上文所述者相比較不嚴格之洗滌溶液及雜交條件(例如，溫度、離子強度及%SDS)。適度嚴格條件之實例為在37℃下於包含以下各物之溶液中隔夜培育：20%甲醯胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6),5×唐納氏溶液、10%硫酸葡聚糖及20mg/ml變性經剪切鮭魚精DNA；繼而在約37至50℃下於1×SSC中洗滌過濾器。熟習此項技術者將識別如何視需要調整溫度、離子強度等以適應諾如探針長度之因素及其類似因素。
抗體「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變異體Fc區)之彼等生物活性，且隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：Clq結合及互補依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調及B細胞活化。
「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指一種細胞毒性形式，其中與存在於特定細胞毒性細胞(例如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)上之Fc受體(FcR)結合的分泌型Ig使得該等細胞毒性效應細胞能夠與帶有抗原之標靶細胞特異性地結合且隨後以細胞毒素殺傷標靶細胞。抗體「配備」細胞毒性細胞且完全為此殺傷所需。用於介導ADCC之初級細胞(NK細胞)僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血細胞上之表現係總結於Ravetch及Kinet,Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991)之第464頁上的表3中。為評估所關注分子之ADCC活性，可進行活體外ADCC檢定，諸如美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中所述之檢定。用於該等檢定之有用效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺傷(NK)細胞。其他或另外，所關注分子之ADCC活性可於活體內評估，例如在如Clynes等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)95:652-656(1998)中所揭示之動物模型中評估。
「Fc受體」或「FcR」描述與抗體之Fc區結合之受體。較佳FcR為天然序列人類FcR。此外，較佳FcR為結合IgG抗體之FcR(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體，包括該等受體之對偶基因變異體及另外之剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」)，其具有主要其細胞質域不同之類似胺基酸序列。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化基元(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制基元(ITIM)(參見M.於,Annu. Rev. Immunol. 15:203-234(1997)中之評述)。FcR係評述於Ravetch及Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9:457-492(1991)；Capel等人，Immunomethods 4:25-34(1994)；及de Haas等人，J. Lab. Clin. Med. 126:330-41(1995)中。本文之術語「FcR」涵蓋包括有待於將來識別之其他FcR。該術語亦包括新生受體FcRn，其負責將母系IgG轉移至胎兒(Guyer等人，J. Immunol. 117:587(1976)及Kim等人，J. Immunol. 24:249(1994))。
「人類效應細胞」係表現一或多個FcR且執行效應功能之白血球。該等細胞較佳至少表現FcγRIII且執行ADCC效應功能。介導ADCC之人類白血球的實例包括周圍血液單核細胞(PBMC)、自然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞及嗜中性白血球；其中PBMC及NK細胞為較佳的。效應細胞可自例如血液之天然來源分離。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指標靶細胞在補體存在下之溶解。藉由使補體系統之第一組分(Clq)結合至與其同源抗原結合之抗體(屬於適當子類)，引發典型補體路徑之活化。為評估補體活化，可執行(例如)如Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods,202:163(1996)中所述之CDC檢定。
術語「治療有效量」係指治療個體疾病或病症之抗體或抗體片段的量。在腫瘤(例如癌性腫瘤)之情況下，抗體或抗體片段(例如，特異性地結合HER2及VEGF之多重特異性抗體或抗體片段)之治療有效量可減少癌細胞數目；降低原發腫瘤尺寸；抑制(亦即在某種程度上減緩且較佳終止)癌細胞浸潤至周邊器官中；抑制(亦即在某種程度上減緩且較佳終止)腫瘤轉移；在某種程度上抑制腫瘤生長；及/或在某種程度上減輕與病症相關聯之一或多種症狀。就抗體或抗體片段可阻止現有癌細胞生長及/或將其殺死而言，其可具細胞抑制性及/或細胞毒性。關於癌症治療，可例如藉由評估存活持續時間、疾病進展時間(TTP)、反應速率(RR)、反應持續時間及/或生活品質來量測活體內功效。
「減少或抑制」意謂引起較佳20%或更大，更佳50%或更大且最佳75%、85%、90%、95%或更大之總體減少的能力。減少或抑制可係指所治療病症之症狀、癌轉移之存在或尺寸、原發腫瘤之尺寸或血管生成病症中血管之尺寸或數目。
術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物中一般以不受調節之細胞生長/增殖為特徵之生理學病況。此定義包括良性及惡性癌症。癌症之實例包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病。該等癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺之腺癌、肺之鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞癌、包括胃腸癌之胃癌、胰腺癌、神經膠母細胞瘤、神經膠質瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(例如腎細胞癌)、肝癌、***癌、陰門癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、黑素瘤及各種類型之頭頸部癌。
「早期癌症」意謂非侵襲性或轉移性或分類為0、I或II期癌症之癌症。
術語「癌前」係指一般在癌症之前或發展成癌症之病況或生長。
「非轉移性」意謂癌症為良性的或保留在原發位點處且並未滲透至淋巴或血管系統中或除原發位點以外之組織中。非轉移性癌症通常為任何癌症，其為0、I或II期癌症且有時為III期癌症。
「涉及HER2之異常活化的非惡性疾病或病症」為不包含在患有或預先傾向於患疾病或病症之個體的細胞或組織中發生HER2之異常活化的癌症之病況。該等疾病或病症之實例包括自體免疫疾病(例如牛皮癬)，參見下文之定義；子宮內膜異位；硬皮病；再狹窄；息肉，諸如結腸息肉、鼻息肉或胃腸息肉；纖維腺瘤；呼吸道疾病(例如慢性支氣管炎、哮喘(包括急性哮喘及過敏性哮喘)、囊腫性纖維化、支氣管擴張、過敏性或其他鼻炎或竇炎、α1-抗胰蛋白酶缺陷、咳嗽、肺氣腫、肺纖維化或氣管過度反應、慢性阻塞性肺病及慢性阻塞性肺病)；膽囊炎；多發性神經纖維瘤；多囊性腎病；炎性疾病；皮膚病症，包括牛皮癬及皮炎；血管疾病；涉及血管上皮細胞之異常增殖的病況；胃腸潰瘍；Menetrier氏疾病、分泌腺瘤或蛋白流失症候群；腎病；血管生成病症；眼科疾病，諸如年齡相關之黃斑退化、假定眼科組織漿菌病症候群、源自增殖性糖尿病性視網膜病之視網膜新生血管、視網膜血管生成、糖尿病性視網膜病或年齡相關之黃斑退化；骨相關病變，諸如骨關節炎、佝僂病及骨質疏鬆症；大腦缺血事件後之損害；纖維變性或水腫疾病，諸如肝硬化症、肺纖維化、類肉瘤病、甲狀腺炎、全身性黏性過大症候群、Osler Weber-Rendu病、慢性阻塞性肺病或燒傷、外傷、輻射、撞擊、低氧或缺血後之水腫；皮膚之過敏性反應；糖尿病性視網膜病及糖尿病性腎病變；格林巴厘氏症候群(Guillain-Barre syndrome)；移植物抗宿主疾病或移植排斥反應；佩吉特氏病(Paget's disease)；骨或關節炎症；光老化(例如由UV輻射人類皮膚而引起)；良性***肥大；特定微生物感染，包括選自腺病毒、汗塔病毒(hantavirus)、伯氏疏螺旋菌(Borrelia burgdorferi)、耶爾森菌屬(Yersinia spp.)及百日咳桿菌(Bordetella pertussis)之微生物病原體；血小板凝集引起之血栓；生殖病況，諸如子宮內膜異位、卵巢過度刺激症候群、初期子巔、功能障礙性子宮出血或月經過多；滑膜炎；動脈粥樣化變；急性及慢性腎病變(包括增殖性絲球體腎炎及糖尿病誘發之腎疾病)；濕疹；肥厚性疤痕形成；內毒素休克及真菌感染；家族性腺瘤病息肉病；神經退化性疾病(例如阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、AIDS相關之癡呆、帕金森氏病(Parkinson's disease)、肌肉萎縮性側索硬化、色素性視網膜炎、脊髓性肌肉萎縮及小腦退化)；骨髓發育不良症候群；再生障礙性貧血；缺血損傷；肺、腎或肝之纖維化；T細胞介導之過敏性疾病；嬰兒肥厚性幽門狹窄；泌尿系統阻塞性症候群；牛皮癬性關節炎及橋本氏甲狀腺炎(Hasimoto's thyroiditis)。
在本文中，「自體免疫疾病」為由個體自身組織產生及針對個體自身組織之疾病或病症，或其共分離(co-segregate)或表現症狀或由此產生之病狀。自體免疫疾病或病症之實例包括(但不限於)關節炎(類風濕性關節炎，諸如急性關節炎、慢性類風濕性關節炎、痛風性關節炎、急性痛風性關節炎、慢性炎性關節炎、退化性關節炎、感染性關節炎、萊姆關節炎(Lyme arthritis)、增殖性關節炎、牛皮癬性關節炎、椎骨關節炎及青少年型類風濕性關節炎、骨關節炎、慢性漸進性關節炎、畸形性關節炎、慢性原發性多關節炎、反應性關節炎及強直性脊椎炎)、炎性過度增殖性皮膚病、牛皮癬(諸如斑塊狀牛皮癬、點狀牛皮癬、膿皰性牛皮癬及指甲之牛皮癬)、皮炎(包括接觸性皮炎、慢性接觸性皮炎、過敏性皮炎、過敏性接觸性皮炎、疱疹樣皮炎及異位性皮炎)、x性聯高IgM症候群(x-linked hyper IgM syndrome)、蕁痲疹(諸如慢性過敏性蕁痲疹及慢性特發性蕁痲疹，包括慢性自體免疫性蕁痲疹)、多肌炎/皮肌炎、青少年皮肌炎、中毒性表皮壞死松解症、硬皮病(包括全身性硬皮病)、硬化症(諸如全身性硬化症、多發性硬化症(MS)，諸如視神經脊髓炎型MS(spino-optical MS)、原發性進行性MS(PPMS)及復發緩解型MS(RRMS)、進行性全身性硬化症、動脈粥樣硬化、動脈硬化、播散性硬化症及共濟失調性硬化症)、炎性腸道疾病(IBD)(例如，克羅恩氏病(Crohn's disease)、自體免疫介導性腸胃疾病、結腸炎(諸如潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)、潰瘍性結腸炎(colitis ulcerosa)、顯微鏡下結腸炎、膠原性結腸炎、息肉狀結腸炎、壞死性小腸結腸炎及透壁性結腸炎)及自體免疫炎性腸道疾病)、壞疽性膿皮病、結節性紅斑、原發性硬化性膽管炎、上鞏膜炎)、呼吸窘迫症候群(包括成人或急性呼吸窘迫症候群(ARDS))、腦脊膜炎、葡萄膜之全部或部分之炎症、虹膜炎、脈絡膜炎、自體免疫血液病、類風濕性脊椎炎、突發性聽力喪失、IgE介導性疾病(諸如重度過敏及過敏性與異位性鼻炎)、腦炎(諸如拉斯馬森腦炎(Rasmussen's encephalitis)及邊緣葉腦炎及/或腦幹腦炎、葡萄膜炎(諸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽腫性葡萄膜炎、非肉芽腫性葡萄膜炎、晶狀體抗原性葡萄膜炎、後葡萄膜炎或自體免疫葡萄膜炎)、伴有及不伴有腎病症候群之絲球體腎炎(GN)(諸如慢性或急性絲球體腎炎，諸如原發性GN、免疫介導性GN、膜性GN(膜性腎病變)、特發性膜性GN或特發性膜性腎病變、膜增殖性GN或膜性增殖性GN(MPGN)(包括I型及II型)及快速進行性GN)、過敏性病況、過敏性反應、濕疹(包括過敏性或異位性濕疹)、哮喘(諸如支氣管哮喘(asthma bronchiale)、支氣管哮喘(bronchial asthma)及自體免疫哮喘)、涉及T細胞浸潤之病狀及慢性炎性反應、慢性肺部炎性疾病、自體免疫心肌炎、白血球黏附缺陷病、全身性紅斑性狼瘡症(SLE)或全身性紅斑狼瘡(諸如皮膚性SLE、亞急性皮膚性紅斑性狼瘡症、新生兒狼瘡症候群(NLE)、播散性紅斑性狼瘡症、狼瘡症(包括腎炎、大腦炎、兒童、非腎、腎外、盤狀、禿頭症)、青少年型(I型)糖尿病(包括兒童胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、成人型糖尿病(II型糖尿病)、自體免疫糖尿病、特發性尿崩症、與由細胞激素及T淋巴細胞介導之急性及遲發超敏反應相關之免疫反應、結核病、肉狀瘤病、肉芽腫(包括淋巴瘤樣肉芽腫、韋格納肉芽腫(Wegener's granulomatosis))、顆粒性球缺乏症、血管炎(包括脈管炎(包括大血管脈管炎(包括風濕性多肌痛及巨細胞(高安氏(Takayasu's))動脈炎)、中等血管脈管炎(包括川崎氏病(Kawasaki's disease)及結節性多動脈炎)、顯微鏡下多動脈炎、CNS脈管炎、壞死性脈管炎、皮膚性脈管炎或超敏性脈管炎、全身性壞死性脈管炎及ANCA相關脈管炎(諸如徹奇-斯全司(Churg-Strauss)脈管炎或症候群(CSS)))、顳動脈炎、再生障礙性貧血、自體免疫再生障礙性貧血、庫姆陽性貧血(Coombs positive anemia)、戴-布二氏貧血(Diamond Blackfan anemia)、溶血性貧血或免疫性溶血性貧血(包括自體免疫溶血性貧血(AIHA)、惡性貧血、艾迪生氏病(Addison's disease)、純紅細胞貧血或發育不全(PRCA))、因子VIII缺乏症(Factor VIII deficiency)、A型血友病、自體免疫嗜中性球減少症、全血球減少症、白血球減少症、涉及白血球滲出之疾病、CNS炎性病症、多器官損傷症候群(諸如繼發於敗血症、外傷或出血之多發性器官損傷症候群)、抗原抗體複合介導性疾病、抗腎小球基底膜疾病、抗磷脂抗體症候群、過敏性神經炎、貝西氏病(Bechet's或Behcet's disease)、卡索曼氏症候群(Castleman's syndrome)、古德帕斯徹氏症候群(Goodpasture's syndrome)、雷諾氏症候群(Reynaud's syndrome)、休格連氏症候群(Sjogren's syndrome)、史蒂芬-瓊森症候群(Stevens-Johnson syndrome)、類天疱瘡(諸如大皰性類天疱瘡及皮膚類天疱瘡)、天疱瘡(包括尋常天疱瘡、落葉型天疱瘡、天疱瘡性黏膜性類天疱瘡及紅斑性天疱瘡)、自體免疫性多內分泌病、萊特氏病或症候群(Reiter's disease or syndrome)、免疫複合物性腎炎、抗體介導性腎炎、視神經脊髓炎、多發性神經病、慢性神經病(諸如IgM多發性神經病或IgM介導性神經病)、血小板減少症(例如，由如心肌梗塞患者逐步顯現)(包括栓塞性血小板減少性紫癜病(TTP)及自體免疫或免疫介導性血小板減少症，諸如特發性血小板減少性紫癜病(ITP)(包括慢性或急性ITP))、睾丸及卵巢之自體免疫疾病(包括自體免疫睪丸炎及***)、原發性甲狀腺功能低下、副甲狀腺低能症、自體免疫內分泌疾病(包括甲狀腺炎，諸如自體免疫甲狀腺炎、橋本氏病(Hashimoto's disease)、慢性甲狀腺炎(橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis))或亞急性甲狀腺炎)、自體免疫甲狀腺疾病、特發性甲狀腺功能低下、格雷氏病(Grave's disease)、多腺性症候群(諸如自體免疫多腺性症候群(或多腺性內分泌病症候群))、副腫瘤症候群(包括神經性副腫瘤症候群，諸如蘭伯特-伊頓肌無力症候群(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)或伊頓-蘭伯特症候群(Eaton-Lambert syndrome))、僵人症候群(stiff-man或stiff-person syndrome)、腦脊髓炎(諸如過敏性腦脊髓炎及實驗性過敏性腦脊髓炎(EAE))、重症肌無力(諸如胸腺瘤相關重症肌無力)、小腦變性、神經性肌強直、視性眼陣攣或視性眼陣攣肌陣攣症候群(OMS)及感官神經病、多灶性運動神經病、席漢氏症候群(sheehan's syndrome)、自體免疫肝炎、慢性肝炎、類狼瘡肝炎、巨細胞肝炎、慢性活動性肝炎或自體免疫慢性活動性肝炎、淋巴細胞間質性肺炎、阻塞性細支氣管炎(非移植)伴NSIP、古立安-白瑞症候群(Guillain-syndrome)、伯格氏病(Berger's disease)(IgA腎病變)、特發性IgA腎病變、線性IgA皮膚病、原發性膽汁性肝硬化、肺硬變、自體免疫腸病症候群、腹腔疾病(Celiac disease、Coeliac disease)、乳糜瀉(celiac sprue)(麩質腸病)、難治性口炎性腹瀉、特發性脂肪瀉、冷球蛋白血症、肌肉萎縮性側索硬化(ALS；盧伽雷氏病(Lou Gehrig's disease))、冠狀動脈疾病、自體免疫耳病(諸如自體免疫內耳疾病(AIED))、自體免疫聽力喪失、視性眼陣攣肌陣攣症候群(OMS)、多軟骨炎(諸如難治性或復發性多軟骨炎)、肺泡蛋白質沈積症、澱粉樣變性病、鞏膜炎、非癌性淋巴球增多症、原發性淋巴球增多症(包括單株B細胞淋巴球增多症(例如良性單株γ球蛋白症及意義未明之單株γ球蛋白症(MGUS)))、周邊神經病、副腫瘤症候群、離子通道病(諸如癲癇症、偏頭痛、心律不整、肌肉病、耳聾、失明、週期性麻痹及CNS之離子通道病)、自閉症、炎性肌病、局灶性節段性腎小球硬化(FSGS)、內分泌眼病、葡萄膜視網膜炎、脈絡膜網膜炎、自體免疫肝病、肌肉纖維疼痛、多發性內分泌衰竭、施密特氏症候群(Schmidt's syndrome)、腎上腺炎、胃萎縮、早老性癡呆、脫髓鞘病(諸如自體免疫脫髓鞘病)、糖尿病性腎病變、德雷斯勒氏症候群(Dressler's syndrome)、斑禿、CREST症候群(鈣沈著病、雷諾氏現象(Raynaud's phenomenon)、食道功能異常、指端硬皮病及毛細管擴張症)、男女自體免疫***症、混合型結締組織疾病、卡格氏病(Chagas' disease)、風濕熱、習慣性流產、農民肺、多形性紅斑、心切開術後症候群、柯興氏症候群(Cushing's syndrome)、飼鳥者肺(bird-fancier's lung)、過敏性肉芽腫性血管炎、良性淋巴細胞性血管炎、阿爾波特氏症候群(Alport's syndrome)、肺泡炎(諸如過敏性肺泡炎及纖維化肺泡炎)、間質性肺疾病、輸血反應、麻風病、瘧疾、利什曼體病(leishmaniasis)、錐蟲病(kypanosomiasis)、血吸蟲病、蛔蟲病、麴菌病、薩姆特氏(Sampter's)症候群、卡普蘭氏症候群(Caplan's syndrome)、登革病(dengue)、心內膜炎、內心肌纖維化、彌漫性間質性肺纖維化、間質性肺纖維化、特發性肺纖維化、囊腫性纖維化、眼內炎、持久性***性紅斑、胎兒紅血球母細胞增多症、嗜伊紅血球性筋膜炎、舒曼氏症候群(Shulman's syndrome)、費爾蒂氏症候群(Felty's syndrome)、絲蟲病、睫狀體炎(諸如慢性睫狀體炎、異色性睫狀體炎、虹膜睫狀體炎或富克氏斯睫狀體炎(Fuch's cyclitis))、亨諾-許蘭二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、人類免疫缺陷病毒(HIV)感染、埃可病毒感染(echovirus infection)、心肌病、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、細小病毒感染、風疹病毒感染、疫苗接種後症候群、先天性風疹感染、埃-巴二氏病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、流行性腮腺炎、伊氏症候群(Evan's syndrome)、自體免疫性腺衰竭、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham's chorea)、鏈球菌感染後腎炎、血栓閉塞性脈管炎、甲狀腺毒症、脊髓癆、絨膜炎、巨細胞多肌痛、內分泌眼病、慢性過敏性肺炎、乾躁性角膜結膜炎、流行性角膜結膜炎、特發性腎病症候群、最小變化腎病變、良性家族性及缺血-再灌注損傷、視網膜自體免疫性、關節炎症、支氣管炎、慢性阻塞性氣管疾病、矽肺病、口瘡、口瘡性口炎、動脈硬化性病症、不形成***症(aspermiogenese)、自體免疫溶血、伯克氏疾病(Boeck's disease)、冷凝球蛋白血症、杜普特氏攣縮(Dupuytren's contracture)、晶狀體過敏性眼內膜炎、過敏性腸炎、麻瘋結節性紅斑、特發性面癱、慢性疲勞症候群、風濕性發燒(febris rheumatica)、哈-里二氏疾病(Hamman-Rich's disease)、感音神經性聽力喪失、陣發性血紅素尿、性腺低能症、局部性迴腸炎、白血球減少症、感染性單核血球病、橫貫性脊髓炎、原發性特發性黏液水腫、腎病、交感神經性眼炎(ophthalmia symphatica)、肉芽腫性睪丸炎、胰炎、急性多神經根炎、壞疽性膿皮病、奎萬氏甲狀腺炎(Quervain's thyreoiditis)、後天性脾臟萎縮、由於抗***抗體引起之***症、非惡性胸腺瘤、白斑病、SCID及艾伯斯坦-巴爾病毒相關聯之疾病(Epstein-Barr virus-associated disease)、後天性免疫缺乏症候群(AIDS)、寄生蟲疾病(諸如亞曼利什曼(Leishmania))、毒性休克症候群、食物中毒、涉及T細胞浸潤之病況、白血球黏附缺陷、與細胞激素及T-淋巴細胞介導之急性及延遲性過敏相關聯之免疫系統反應、涉及白血球滲出之疾病、多器官損傷症候群、抗原抗體複合介導之疾病、抗腎小球基底膜疾病、過敏性神經炎、自體免疫多內分泌病、***、原發性黏液水腫、自體免疫萎縮性胃炎、交感神經性眼炎、風濕性疾病、混合型結締組織疾病、腎病症候群、胰島炎、多內分泌衰竭、周邊神經病、I型自體免疫多腺症候群、成人型特發性副甲狀腺低能症(AOIH)、全禿、擴張型心肌病、獲得性大皰性表皮鬆懈(epidermolisis bullosa acquisita，EBA)、血色素沈著症、心肌炎、腎病症候群、原發性硬化性膽管炎、化膿性或非化膿性竇炎、急性或慢性竇炎、篩骨、前葉、頷骨或蝶骨竇炎、嗜伊紅血球相關病症(諸如嗜伊紅血球增多、肺浸潤性嗜伊紅血球增多、嗜伊紅血球增多肌痛症候群、呂弗勒氏症候群(Loffler's syndrome)、慢性嗜伊紅血球增多肺炎、熱帶肺嗜伊紅血球增多、支氣管肺炎性麴菌症、曲黴菌病或含有嗜伊紅血球之肉芽腫)、重度過敏、血清陰性脊椎關節炎、多內分泌自體免疫疾病、硬化性膽管炎、鞏膜、上鞏膜、慢性皮膚黏膜念珠菌病、布魯頓氏症候群(Bruton's syndrome)；嬰兒暫時性低γ球蛋白血症；維-奧二氏症候群(Wiskott-Aldrich syndrome)、共濟失調毛細管擴張症、與膠原蛋白疾病相關聯之自體免疫病症、風濕、神經病、缺血再灌注病症、血壓反應降低、血管功能障礙、血管擴張、組織損傷、心血管缺血、痛覺過敏、大腦缺血及伴發血管生成之疾病、過敏症、絲球體腎炎、再灌注損傷、心肌或其他組織之再灌注損傷、伴有急性炎性成分之皮膚病、急性化膿性腦脊膜炎或其他中樞神經系統發炎性病症、眼睛及眼眶發炎性病症、顆粒球輸注相關症候群、細胞激素誘發性毒性、急性嚴重炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肝硬變、糖尿病性視網膜病、糖尿病性大動脈病症、動脈內增生、消化性潰瘍、心瓣炎及子宮內膜異位。
「抗血管生成劑」或「血管生成抑制劑」係指直接地或間接地抑制血管生成、血管發生或非所要之血管通透性的小分子量物質、聚核苷酸、多肽、分離蛋白、重組蛋白、抗體或其結合蛋白或融合蛋白。舉例而言，抗血管生成劑為如上文所定義之抗體或抗血管生成劑之其他拮抗劑，例如抗VEGF之抗體(例如貝伐單抗(bevacizumab)(AVASTIN7)、bH1、bH1-44、bH1-81)、抗VEGF受體之抗體、阻斷VEGF受體信號傳導之小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT/SU11248(舒尼替尼蘋果酸鹽(sunitinib malate))、AMG706)。抗血管生成劑亦包括天然血管生成抑制劑，例如血管抑制素、內皮抑制素等。參見例如Klagsbrun及D'Amore,Annu .Rev .Physiol .,53:217-39(1991)；Streit及Detmar,Oncogene ,22:3172-3179(2003)(例如，表3列出惡性黑色素瘤之抗血管生成療法)；Ferrara及Alitalo,Nature Medicine 5(12):1359-1364(1999)；Tonini等人，Oncogene ,22:6549-6556(2003)(例如，表2列出抗血管生成因子)；及SatoInt .J .Clin .Oncol .,8:200-206(2003)(例如表1列出臨床試驗中所用之抗血管生成劑)。血管生成失調可引起許多可由本發明之組合物及方法治療之病症。該等病症包括非贅生性與贅生性病況兩者。
如本文中所用之術語「細胞毒性劑」係指能抑制或阻止細胞之功能及/或引起細胞破壞之物質。該術語意欲包括放射性同位素(例如，At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、Ra223 、P32 及Lu之放射性同位素)；化療劑，例如甲胺喋呤(methotrexate)、阿黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(vinca alkaloid)(長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、阿黴素(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他***劑、酶及其片段(諸如核酸分解酶)、抗生素及毒素(諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段及/或變異體)，以及本文所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。其他細胞毒性劑描述於本文中。殺腫瘤劑引起腫瘤細胞之破壞。
「化療劑」為適用於治療癌症之化合物。化療劑之實例包括：烷化劑，諸如硫替派(thiotepa)及CYTOXAN環磷醯胺；烷基磺酸酯類，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡巴醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙基亞胺類及甲基密胺類，包括六甲密胺(altretamine)、三伸乙基密胺(triethylenemelamine)、三伸乙基磷醯胺(trietylenephosphoramide)、三伸乙基硫代磷醯胺(triethiylenethiophosphoramide)及三羥甲密胺(trimethylolomelamine)；多聚乙醯類(acetogenins)(尤其為布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氫***酚(delta-9-tetrahydrocannabinol)(屈***酚(dronabinol,MARINOL))；β-拉帕酮(beta-lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙鹼(colchicine)；樺木酸(betulinic acid)；喜樹鹼(camptothecin)(包括合成類似物拓朴替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊諾替康(irinotecan；CAMPTOSAR)、乙醯基喜樹鹼、莨菪亭(scopolectin)及9-胺基喜樹鹼)；苔蘚蟲素(bryostatin)；卡利斯塔汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；足葉草毒素(podophyllotoxin)；足葉草酸(podophyllinic acid)；替尼泊甙(teniposide)；念珠藻環肽(cryptophycin)(尤其念珠藻環肽1及念珠藻環肽8)；海兔毒素(dolastatin)；多卡米辛(duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；沙考的汀(sarcodictyin)；海綿他汀(spongistatin)；氮芥類，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、環磷醯胺、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸氮芥氧化物、美法侖、新恩比興(novembichin)、膽甾醇對苯乙酸氮芥(phenesterine)、松龍
苯芥(prednimustine)、氯乙環磷醯胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲類，諸如亞硝脲氮芥(carmustine)、氯脲黴素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素類，諸如烯二炔抗生素(例如，卡奇黴素(calicheamicin)，尤其刺孢黴素γ1(參見，例如Agnew,Chem Intl. Ed. Engl.,33:183-186(1994))；達內黴素(dynemicin)，包括達內黴素A；埃斯培拉黴素(esperamicin)；以及新製癌菌素(neocarzinostatin)發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、蒽黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博萊黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、放線菌素D(dactinomycin)、道諾黴素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、ADRIAMYCIN阿黴素(包括嗎啉幷阿黴素、氰基嗎啉幷阿黴素、2-吡咯幷阿黴素及去氧阿黴素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycins)(諸如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物類，諸如甲胺喋呤及5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)；葉酸類似物，諸如新喋呤(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、噻咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如環胞苷(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，諸如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯(testolactone)；抗腎上腺劑，諸如胺基格魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸(frolinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺醣苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(ehiluracil)；胺苯吖啶(amsacrine)；倍思塔布(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達曲卡(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗尼辛(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃坡黴素(epothilone)；乙環氧啶(etoglucid)；硝酸鎵(gallium nitrate)；羥基脲(hydroxyurea)；香菇糖(lentinan)；羅尼代寧(lonidainine)；類美登素(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)及胺沙托辛(ansamitocins)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫比旦莫耳(mopidanmol)；硝爾靈(nitraerine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基醯肼(2-ethylhydrazide)；普魯苄肼(procarbazine)；PSK多醣複合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；丙亞胺(razoxane)；根黴菌素(rhizoxin)；西佐糖(sizofiran)；螺鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙基胺；單端孢黴烯族毒素(trichothecenes)(尤其為T-2毒素、韋拉庫林A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及安奎定(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)(ELDISINE，FILDESIN)；氮烯咪胺(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；雙溴丙基哌嗪(pipobroman)；伽托辛(gacytosine)；***糖苷(arabinoside)(「Ara-C」)；硫替派(thiotepa)；紫杉醇(taxoids)，例如TAxOL太平洋紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)；ABRAXANETM (不含克列莫佛(Cremophor))(亦即，太平洋紫杉醇之白蛋白工程化奈米粒子調配物)(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)及TAXOTERE多西他賽(doxetaxel)(Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR)；6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)；巰基嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春花鹼(vinblastine)(VELBAN)；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(ONCOVIN)；奧沙利鉑(oxaliplatin)；甲醯四氫葉酸(leucovovin)；長春瑞賓(vinorelbine)(NAVELBINE)；諾凡特龍(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；胺基喋呤；伊班膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(difluorometlhylornithine)(DMFO)；類視色素類，諸如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)(XELODA)；以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及以上兩種或兩種以上之組合，諸如CHOP(環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼與潑尼松龍(prednisolone)之組合療法的縮寫)及FOLFOX(奧沙利鉑(oxaliplatin)(ELOXATINTM)與5-FU及甲醯四氫葉酸組合之治療方案的縮寫)。
此定義中亦包括抗激素劑，其用於調節、降低、阻斷或抑制可促進癌症生長之激素的作用且其常為全身性或整體治療之形式。其本身可為激素。實例包括抗***及選擇性***受體調節劑(SERM)，包括(例如)他莫西芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫西芬)、EVISTA雷洛西芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及FARESTON托瑞米芬(toremifene)；抗黃體酮；***受體下調劑(ERD)；起抑止或制止卵巢之作用之藥劑，例如黃體素釋放激素(LHRH)促效劑，諸如LUPRON及ELIGARD乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、乙酸布舍瑞林(buserelin acetate)及曲特瑞林(tripterelin)；其他抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)及必卡他胺(bicalutamide)；及抑制調控腎上腺中***產生之酶芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如4(5)-咪唑、胺基格魯米特、MEGASE乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、福美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR伏氯唑(vorozole)、FEMARA來曲唑(letrozole)及ARIMIDEX阿那曲唑(anastrozole)。此外，化療劑之該定義包括：雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽(clodronate)(例如，BONEFOS或OSTAC)、DIDROCAL依替膦酸鹽(etidronate)、NE-58095、ZOMETA唑來膦酸/唑來膦酸鹽、FOSAMAX阿侖膦酸鹽(alendronate)、AREDIA帕米膦酸鹽(pamidronate)、SKELID替魯膦酸鹽(tiludronate)或ACTONEL利塞膦酸鹽(risedronate)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，尤其抑制基因在牽涉於異常細胞增殖中之信號傳導路徑中之表現的反義寡核苷酸，諸如PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生長因子受體(EGF-R)；疫苗，諸如THERATOPE疫苗及基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗及VAXID疫苗；LURTOTECAN拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIXrmRH；二對甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinib ditosylate)(ErbB-2與EGFR雙重酪胺酸激酶小分子抑制劑，亦稱為GW572016)；及以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。
「生長抑制劑」當在本文中使用時係指活體外或活體內抑制細胞生長之化合物或組合物。因此，生長抑制劑可為顯著減少S期中之細胞百分比者。生長抑制劑之實例包括阻斷細胞週期進程(處於S期以外之位置)之藥劑，諸如誘發G1停滯及M期停滯之藥劑。典型M期阻斷劑包括長春花屬(例如，長春新鹼及長春鹼)、紫杉烷(taxane)及拓撲異構酶II型抑制劑，諸如阿黴素、表柔比星、道諾黴素、依託泊苷及博萊黴素。使G1停滯之藥劑亦外溢引起S期停滯，例如DNA烷化劑，諸如他莫西芬、潑尼松(prednisone)、氮烯咪胺、氮芥、順鉑、甲胺喋呤、5-氟尿啶及ara-C。其他資訊可見於The Molecular Basis of Cancer ,Mendelsohn及Israel編，第1章，Murakami等人之標題為[Cell cycle regulation,oncogenes,and antineoplastic drugs](WB Saunders:Philadelphia,1995)，尤其第13頁中。紫杉烷(太平洋紫杉醇及多烯紫杉醇)均為源自紫杉之抗癌藥物。源自歐洲紫杉之歐洲紫杉醇(TAXOTERE,Rhone-Poulenc Rorer)為太平洋紫杉醇(TAXOL,Bristol-Myers Squibb)之半合成類似物。太平洋紫杉醇及多烯紫杉醇促進由微管蛋白二聚體組裝微管且藉由防止解聚合來穩定微管，此導致細胞中之有絲***受到抑制。
如本文所用之「抗癌療法」係指減少或抑制個體之癌症的治療。抗癌療法之實例包括細胞毒性放射線療法以及向個體投與治療有效量之細胞毒性劑、化療劑、生長抑制劑、癌症疫苗、血管生成抑制劑、前藥、細胞激素、細胞激素拮抗劑、皮質類固醇、免疫抑制劑、止吐劑、抗體或抗體片段或止痛劑。
如本申請案中所用之術語「前藥」係指醫藥學活性物質之前驅體或衍生物形式，其與母體藥物相比對腫瘤細胞之細胞毒性較低，且能夠經酶促活化或轉化為活性較高之母體形式。參見例如，Wilman,[Prodrugs in Cancer Chemotherapy]Biochemical Society Transactions,14，第375-382頁，615th Meeting Belfast(1986)及Stella等人，[Prodrugs:A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery]Directed Drug Delivery,Borchardt等人(編)，第247-267頁，Humana Press(1985)。前藥包括(但不限於)：含有磷酸鹽之前藥、含有硫代磷酸鹽之前藥、含有硫酸鹽之前藥、含有肽之前藥、經D-胺基酸修飾之前藥、糖基化前藥、含有β-內醯胺之前藥、含有視情況經取代之苯氧基乙醯胺之前藥或含有視情況經取代之苯乙醯胺之前藥、可轉化成活性更強之細胞毒性游離藥物之5-氟胞嘧啶及其他5-氟尿苷前藥。可衍生成適用於本發明之前藥形式之細胞毒性藥物的實例包括(但不限於)上文所述之彼等化療劑。
術語「細胞激素」為由一個細胞群體釋放之作為細胞內介體作用於另一細胞的蛋白之通用術語。該等細胞激素之實例為淋巴因子、單核球激素及傳統多肽激素。細胞激素包括生長激素，諸如人類生長激素(HGH)、N-甲硫胺醯基人類生長激素及牛生長激素；副甲狀腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；鬆弛素；鬆弛素原；醣蛋白激素，諸如促濾泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)及促黃體激素(LH)；表皮生長因子(EGF)；肝生長因子；纖維母細胞生長因子(FGF)；促乳素；胎盤生乳素；腫瘤壞死因子-α及腫瘤壞死因子-β；苗勒氏抑制物質(mullerian-inhibiting substance)；小鼠***相關肽；抑制素；活化素；血管內皮生長因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神經生長因子，諸如NGF-α；血小板生長因子；轉化生長因子(TGF)，諸如TGF-α及TGF-β；類胰島素生長因子-I及類胰島素生長因子-II；紅細胞生成素(EPO)；骨誘導因子；干擾素，諸如干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ；群落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；及粒細胞-CSF(G-CSF)；介白素(IL)，諸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β；及其它包括LIF及套組配位體(KL)之多肽因子。如本文中所用之術語細胞激素包括來自天然來源或來自重組細胞培養物之蛋白及天然序列細胞激素之生物活性等效物。
「細胞激素拮抗劑」意謂部分或完全阻斷、抑制或中和至少一個細胞激素之生物活性的分子。例如，細胞激素拮抗劑可藉由抑制細胞激素表現及/或分泌或藉由結合至細胞激素或細胞激素受體來抑制細胞激素活性。細胞激素拮抗劑包括結合至細胞激素或細胞激素受體之抗體、合成或天然序列肽、免疫黏附素及小分子拮抗劑。細胞激素拮抗劑視情況與細胞毒性劑結合或稠合。例示性TNF拮抗劑為依那西普(etanercept)(ENBREL)、英利昔單抗(infliximab)(REMICADE)及阿達木單抗(adalimumab)(HUMIRATM )。
如本文所用之術語「免疫抑制劑」係指起抑止或掩蔽經治療個體之免疫系統之作用的物質。此可包括抑止細胞因子產生，下調或抑止自體抗原表現或掩蔽MHC抗原之物質。免疫抑制劑之實例包括2-胺基-6-芳基-5-經取代之嘧啶(參見美國專利第4,665,077號)；黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil)，諸如CELLCEPT；硫唑嘌呤(azathioprine)(IMURAN，AZASAN/6-巰基嘌呤；溴隱亭(bromocryptine)；達那唑(danazol)；胺苯碸(dapsone)；戊二醛(其遮蔽MHC抗原，如美國專利第4,120,649號中所述)；針對MHC抗原及MHC片段之抗遺傳型抗體；環孢素A(cyclosporin A)；類固醇，諸如皮質類固醇及糖皮質類固醇，例如潑尼松、潑尼松龍(prednisolone)諸如PEDIAPRED(潑尼松龍磷酸鈉)或ORAPRED(潑尼松龍磷酸鈉口服溶液)、甲基潑尼松龍及***(dexamethasone)；甲胺喋呤(經口或經皮下)(RHEUMATREX，TREXALLTM )；羥基氯奎(hydroxycloroquine)/氯奎(chloroquine)；柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)；來氟米特(leflunomide)；細胞激素或細胞激素受體拮抗劑包括抗干擾素-γ、抗干擾素-β或抗干擾素-α抗體、抗腫瘤壞死因子-α抗體(英利昔單抗或阿達木單抗)、抗TNFα免疫黏附素(ENBREL，依那西普)、抗腫瘤壞死因子-β抗體、抗介白素-2抗體及抗IL-2受體抗體；抗LFA-1抗體，包括抗CD11a及抗CD18抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細胞球蛋白；多株或pan-T抗體或單株抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；含有LFA-3結合域之可溶性肽(WO 1990/08187，於1990年7月26日公開)；鏈球菌激酶；TGF-β；鏈球菌去氧核糖核酸酶；來自宿主之RNA或DNA；FK506；RS-61443；去氧斯匹胍素(deoxyspergualin)；雷帕黴素(rapamycin)；T-細胞受體(Cohen等人，美國專利第5,114,721號)；T-細胞受體片段(Offner等人Science,251:430-432(1991)；WO 1990/11294；Ianeway,Nature,341:482(1989)；及WO 1991/01133)；T細胞受體抗體(EP 340,109)，諸如T10B9；環磷醯胺(CYTOXAN)；胺苯碸；青黴胺(CUPRIMINE)；漿細胞交換；或靜脈內免疫球蛋白(IVIG)。該等免疫抑制劑可單獨使用或彼此組合使用，尤其為類固醇與另一免疫抑制劑之組合或該等組合之後接維持劑量之非類固醇藥劑以減少對類固醇之需要。
「止痛劑」係指用以抑制或抑止個體之疼痛的藥物。例示性止痛劑包括非類固醇消炎藥物(NSAID)，包括布洛芬(ibuprofen，MOTRIN)、萘普生(naproxen，NAPROSYN)、乙醯基水楊酸、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)及托美汀(tolmetin)包括其鹽及衍生物、以及各種其他藥物用於減少可能發生之穿刺疼痛包括抗驚厥藥(加巴噴丁(gabapentin)、苯妥英(phenyloin)、卡馬西平(carbamazepine))或三環抗抑鬱劑。特異性實例包括乙醯胺苯酚(acetaminophen)、阿司匹靈(aspirin)、阿米曲替林(amitriptyline，ELAVIL)、卡馬西平(TEGRETOL)、苯妥英鈉(phenyltoin，DILANTIN)、加巴噴丁(NEURONTIN)、(E)-N-香草基-8-甲基-6-神經醯胺(CAPSAICIN)或神經阻斷劑。
「皮質類固醇」係指模擬或增大天然存在之皮質類固醇之作用的具有類固醇之一般化學結構之若干合成或天然存在之物質中的任一者。合成皮質類固醇之實例包括潑尼松、潑尼松龍(包括甲潑尼龍(methylprednisolone))、***、曲安西龍(triamcinolone)及倍他米松(betamethasone)。
如本文所用之「癌症疫苗」為刺激個體體內針對癌症之免疫反應的組合物。癌症疫苗一般由可與個體同體(來自自身)或同種異體(來自其他)之癌症相關物質或細胞(抗原)之來源以及其他組分(例如佐劑)組成以進一步刺激及增強針對抗原之免疫反應。癌症疫苗理想地導致刺激個體之免疫系統以產生針對一種或若干種特異性抗原之抗體，及/或以產生殺傷T細胞以攻擊具有彼等抗原之癌細胞。
如本文所用之「細胞毒性放射線療法」係指抑制或防止細胞功能及/或引起細胞破壞之輻射療法。輻射療法可包括(例如)外部束照射或具有放射性標記之藥劑(諸如抗體)的療法。該術語意欲包括使用放射性同位素(例如，At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、Ra223 、P32 及Lu之放射性同位素)。
「止吐劑」為減少或防止個體噁心之化合物。止吐劑化合物包括(例如)神經激肽-1受體拮抗劑、5HT3受體拮抗劑(諸如昂丹司瓊(ondansetron)、格拉司瓊(granisetron)、托烷司瓊(tropisetron)及紮替司瓊(zatisetron))、GABAB受體促效劑(諸如氯苯胺丁酸(baclofen))、皮質類固醇(諸如***、KENALOG、ARISTOCORT或NASALIDE)、抗多巴胺能藥、啡噻嗪(例如普魯氯嗪(prochlorperazine)、氟奮乃靜(fluphenazine)、硫利達嗪(thioridazine)及美索達嗪(mesoridazine))、屈***酚(dronabinol)、甲氧氯普胺(metroclopramide)、多潘立酮(domperidone)、氟哌啶醇(haloperidol)、賽克利嗪(cyclizine)、勞拉西泮(lorazepam)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)及左美丙嗪(levomepromazine)。
「個體」為脊椎動物，較佳為哺乳動物，更佳為人類。哺乳動物包括(但不限於)農畜動物(諸如奶牛)、運動型動物、寵物(諸如貓、狗及馬)、靈長類動物、小鼠及大鼠。
除非另有說明，否則實例中所提及之市售試劑係根據製造者說明來使用。在以下實例中及整個說明書中由ATCC寄存編號識別之彼等細胞的來源為the American Type Culture Collection,Manassas,VA。除非另外說明，否則本發明使用重組DNA技術之標準程序，諸如上文及以下課本中所述之彼等程序；Sambrook等人，上文；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates及Wiley Interscience,N.Y.,1989)；Innis等人，PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications (Academic Press,Inc.:N.Y.,1990)；Harlow等人，Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press:Cold Spring Harbor,1988)；Gait,Oligonucleotide Synthesis (IRL Press:Oxford,1984)；Freshney,Animal Cell Culture ,1987；Coligan等人，Current Protocols in Immunology ,1991。
貫穿本說明書及申請專利範圍，詞語「包含」應理解為暗示包括所列整數或整數群，但不排除任何其他整數或整數群。
II.載體、宿主細胞及重組方法
為重組產生本發明之抗體，分離編碼該抗體之核酸且將其***可複製之載體中以用於進一步選殖(DNA之擴增)或表現。編碼抗體之DNA經容易地分離且使用習知程序(例如藉由使用能夠與編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)定序。許多載體為可用的。載體之選擇部分地視待使用之宿主細胞而定。較佳宿主細胞通常具有原核生物或真核生物(通常為哺乳動物)來源。應瞭解，為達成此目的可使用任何同型之恆定區，包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恆定區，且該等恆定區可自任何人類或動物物種獲得。
a.　使用原核宿主細胞產生抗體
i.　載體建構
可使用標準重組技術獲得編碼本發明抗體之多肽組分的聚核苷酸序列。可自產生抗體之細胞(諸如融合瘤細胞)中分離所需聚核苷酸序列且進行定序。或者，可使用核苷酸合成儀或PCR技術合成聚核苷酸。在獲得編碼多肽之序列後，將其***能夠在原核宿主中複製且表現異源聚核苷酸之重組載體中。可獲得且為此項技術中所知之多種載體可用於達成本發明之目的。適當載體之選擇將主要視待***載體中之核酸的大小及待經載體轉型之特定宿主細胞而定。視載體功能(擴增或表現異源聚核苷酸或兩者)及載體與其居住之特定宿主細胞的相容性而定，各載體含有各種組分。載體組分通常包括(但不限於)：複製起點、選擇標記基因、啟動子、核糖體結合位點(RBS)、信號序列、異源核酸***及轉錄終止序列。
一般而言，含有源自與宿主細胞相容之物種之複製子及控制序列的質體載體與該等宿主結合使用。載體一般攜帶複製位點以及能夠在轉型細胞中提供表型選擇之標記序列。舉例而言，一般使用pBR322(一種源自大腸桿菌(E. coli )物種之質體)使大腸桿菌轉型。pBR322含有編碼胺苄西林(ampicillin，Amp)及四環素(tetracycline，Tet)抗性之基因且因此提供用於識別轉型細胞之容易方式。pBR322、其衍生物或其他微生物質體或噬菌體亦可含有或經修飾而含有可由微生物生物體用於表現內源蛋白之啟動子。Carter等人之美國專利第5,648,237號中詳細描述用於表現特定抗體之pBR322衍生物的實例。
此外，含有與宿主微生物相容之複製子及控制序列的噬菌體載體可與該等宿主結合用作轉型載體。舉例而言，可利用諸如λGEM.TM.-11之噬菌體製備可用於轉型諸如大腸桿菌LE392之易感宿主細胞的重組載體。
本發明之表現載體可包含兩種或兩種以上編碼各多肽組分之啟動子-順反子對。啟動子為位於調節其表現之順反子上游(5')的未經轉譯之調控序列。原核啟動子一般分為兩類：誘導型及組成型。誘導型啟動子為在其對培養條件之改變(例如養分存在與否或溫度改變)作出回應之控制下起始增加量之順反子轉錄的啟動子。
熟知由多種潛在宿主細胞識別之大量啟動子。可藉由經限制酶消化將所選啟動子自源DNA移除且將所分離之啟動子序列***本發明之載體中而使該啟動子以可操作方式連接至編碼輕鏈或重鏈之順反子DNA。天然啟動子序列與多種異源啟動子均可用以指導標靶基因之擴增及/或表現。在一些實施例中，利用異源啟動子，此係因為如與天然標靶多肽啟動子相比，異源啟動子通常允許經表現之標靶基因較高轉錄且產率較高。
適用於原核宿主之啟動子包括PhoA啟動子、β-半乳糖酶及乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統及雜交啟動子(諸如tac或trc啟動子)。然而，在細菌中具有功能性之其他啟動子(諸如其他已知之細菌或噬菌體啟動子)亦為合適的。其核苷酸序列已公開，藉此使得熟習此項技術者能夠使用連接子或接頭將其與編碼標靶輕鏈及重鏈之順反子接合(Siebenlist等人，(1980)Cell 20:269)以提供任何所需之限制位點。
在本發明之一態樣中，重組載體內之每一順反子均包含引導經表現之多肽跨膜移位的分泌信號序列組分。一般而言，信號序列可為載體之組分，或其可為***載體中之標靶多肽DNA的一部分。出於本發明之目的所選擇之信號序列應為由宿主細胞識別且加工(亦即，由信號肽酶裂解)之信號序列。對於不識別且加工異源多肽之天然信號序列的原核宿主細胞而言，使信號序列經(例如)選自由以下各序列組成之群之原核信號序列取代：鹼性磷酸酶、青黴素酶、Ipp或熱穩定性腸毒素II(STII)前導序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA及MBP。在本發明之一項實施例中，用於表現系統之兩種順反子中之信號序列為STII信號序列或其變異體。
在另一態樣中，本發明之免疫球蛋白的產生可發生在宿主細胞之細胞質中，且因此無需各順反子內均存在分泌信號序列。就此而言，免疫球蛋白之輕鏈及重鏈均在細胞質內表現、摺疊且組裝形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如大腸桿菌trxB-菌株)提供有利於雙硫鍵形成之細胞質條件，藉此允許適當摺疊及組裝經表現之蛋白次單元(Proba及Pluckthun,Gene,159:203(1995))。
適合於表現本發明抗體之原核宿主細胞包括古細菌(Archaebacteria)及真細菌(Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性(Gram-negative)或革蘭氏陽性生物體。適用細菌之實例包括埃希氏菌(Escherichia)(例如大腸桿菌)、芽孢桿菌(Bacilli)(例如枯草芽孢桿菌(B. subtilis ))、腸桿菌(Enterobacteria)、假單胞菌(Pseudomonas)物種(例如綠膿桿菌(P. aeruginosa ))、鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium )、黏質沙雷菌(Serratia marcescans )、克雷伯氏菌(Klebsiella)、變形菌(Proteus)、志賀菌(Shigella)、根瘤菌(Rhizobia)、透明顫菌(Vitreoscilla)或副球菌(Paracoccus)。在一項實施例中，使用革蘭氏陰性細胞。在一項實施例中，大腸桿菌細胞用作本發明之宿主。大腸桿菌菌株之實例包括菌株W3110(Bachmann,Cellular and Molecular Biology，第2卷(Washington,D.C.:American Society for Microbiology,1987)，第1190-1219頁；ATCC寄存編號27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR之菌株33D3(美國專利第5,639,635號)。其他菌株及其衍生物(諸如大腸桿菌294(ATCC 31,446)、大腸桿菌B、大腸桿菌λ1776(ATCC 31,537)及大腸桿菌RV308(ATCC 31,608))亦為合適的。該等實例係出於說明而非限制之目的。構築具有限定基因型之任何以上提及之細菌的衍生物之方法在此項技術中已知且描述於(例如)Bass等人，Proteins,8:309-314(1990)中。一般需要考慮複製子在細菌細胞中之可複製性來選擇適當細菌。舉例而言，當使用熟知之質體(諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410)提供複製子時，大腸桿菌、沙雷氏菌或沙門氏菌物種可適當地用作宿主。宿主細胞一般應分泌最小量之蛋白水解酶，且可視需要將額外之蛋白酶抑制劑併入細胞培養物中。
ii.　抗體產生
用上述表現載體使宿主細胞轉型，且將其培養於適當時經修飾之習知培養基中以誘導啟動子、選擇轉型物或擴增編碼所需序列之基因。
轉型意謂將DNA引入原核宿主中，以便DNA可作為染色體外要素或由染色體成份複製。視所用宿主細胞而定，使用適合於該等細胞之標準技術進行轉型。採用氯化鈣進行鈣處理通常用於含有實質性細胞壁障壁之細菌細胞。另一種轉型方法採用聚乙二醇/DMSO。所使用之另一技術為電穿孔法。
用以產生本發明之多肽的原核細胞生長於此項技術中已知且適合於培養所選宿主細胞之培養基中。合適培養基之實例包括盧氏培養液(Luria broth,LB)加必需養份補充物。在一些實施例中，培養基亦含有基於表現載體之構築而選擇之選擇劑，以選擇性地允許含有表現載體之原核細胞生長。舉例而言，將胺苄西林添加至培養基中以使表現胺苄西林抗性基因之細胞生長。
亦可包括適當濃度之單獨或以與另一種補充物或培養基(諸如複合氮源)之混合物形式引入的除碳、氮及無機磷酸鹽源以外之任何必需補充物。培養基視情況可含有一或多種選自由以下各物組成之群的還原劑：麩胱甘肽、半胱胺酸、胱胺、巰基乙酸鹽、二硫赤蘚糖醇及二硫蘇糖醇。
在合適溫度下培養原核宿主細胞。對於大腸桿菌生長而言，例如，較佳溫度在約20℃至約39℃、更佳約25℃至約37℃之範圍內，甚至更佳在約30℃下。培養基之pH值主要視宿主生物體而定可為約5至約9範圍內之任何pH值。對於大腸桿菌而言，pH值較佳為約6.8至約7.4，且更佳為約7.0。
若本發明之表現載體中使用誘導型啟動子，則在適合於活化啟動子之條件下誘導蛋白表現。在本發明之一態樣中，PhoA啟動子用於控制多肽轉錄。因此，將經轉型之宿主細胞培養於磷酸鹽限制性培養基中以進行誘導。磷酸鹽限制性培養基較佳為C.R.A.P培養基(參見例如Simmons等人，J. Immunol. Methods(2002),263:133-147)。如此項技術中已知，可根據所採用之載體構築體來使用多種其他誘導劑。
在一項實施例中，本發明之經表現多肽經分泌至宿主細胞之周質中且自其回收。蛋白回收一般包含通常藉由諸如滲壓衝擊、超音波處理或溶解之方式使微生物碎裂。一旦細胞碎裂，則可藉由離心或過濾來移除細胞碎片或全細胞。例如，可藉由親和樹脂層析法來進一步純化蛋白。或者，可將蛋白轉移至培養基中且在其中進行分離。可自培養物中移除細胞，且將培養物上清液過濾且濃縮以進一步純化所產生之蛋白。可使用諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)及西方墨點檢定(Western blot檢定)之常用已知方法來進一步分離及識別經表現之多肽。
在本發明之一態樣中，藉由醱酵方法大批量地進行抗體生產。可利用多種大規模饋料分批醱酵程序來產生重組蛋白。大規模醱酵具有至少1000公升之容量，較佳約1,000至100,000公升之容量。該等醱酵器使用葉輪攪拌器來分配氧及養份，尤其葡萄糖(較佳之碳/能量來源)。小規模醱酵通常係指在體積容量不大於約100公升且可在約1公升至約100公升範圍內之醱酵罐中進行的醱酵。
在醱酵方法中，一般在細胞已於合適條件下生長至所需密度(例如OD550為約180-220，在該階段細胞處於穩定期早期)後開始誘導蛋白表現。如此項技術中已知且如上文所述，可根據所採用之載體構築體使用多種誘導劑。可在誘導之前使細胞生長較短時間。通常誘導細胞約12至50小時，但可使用較長或較短之誘導時間。
為改良本發明之多肽的產率及品質，可改變多種醱酵條件。舉例而言，為改良所分泌抗體多肽之適當組裝及摺疊，可使用過度表現伴隨蛋白(諸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD及/或DsbG)或FkpA(具有伴隨蛋白活性之肽基脯胺醯基順，反-異構酶))之額外載體來共轉型宿主原核細胞。已證實伴隨蛋白有利於細菌宿主細胞中所產生之異源蛋白的適當摺疊及溶解性。Chen等人(1999)J. Bio. Chem. 274:19601-19605；Georgiou等人，美國專利第6,083,715號；Georgiou等人，美國專利第6,027,888號；Bothmann及Pluckthun(2000)J. Biol. Chem. 275:17100-17105；Ramm及Pluckthun(2000)J. Biol. Chem. 275:17106-17113；Arie等人(2001)Mol. Microbiol. 39:199-210。
為使所表現之異源蛋白(尤其對蛋白水解敏感之蛋白)之蛋白水解降至最低，某些缺乏蛋白水解酶之宿主菌株可用於本發明。舉例而言，宿主細胞菌株可經修飾以實現編碼諸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合之已知細菌蛋白酶之基因的基因突變。一些大腸桿菌蛋白酶缺陷性菌株可予以利用且描述於(例如)Joly等人，(1998)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2773-2777；Georgiou等人，美國專利第5,264,365號；Georgiou等人，美國專利第5,508,192號；Hara等人，Microbial Drug Resistance,2:63-72(1996)中。
在一項實施例中，缺乏蛋白水解酶且經過度表現一或多種伴隨蛋白之質體轉型的大腸桿菌菌株用作本發明之表現系統中的宿主細胞。
iii.抗體純化
可採用此項技術中已知之標準蛋白純化方法。以下程序為例示性合適純化程序：免疫親和管柱或離子交換管柱之分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽或陽離子交換樹脂(諸如DEAE)層析、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沈澱及使用(例如)Sephadex G-75之凝膠過濾。
在一態樣中，將固定於固相上之蛋白A用於本發明之全長抗體產物的免疫親和純化。蛋白A為來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureas )之41 kD細胞壁蛋白，其以高親和力與抗體之Fc區結合。Lindmark等人(1983)J. Immunol. Meth. 62:1-13。固定蛋白A之固相較佳為包含玻璃或二氧化矽表面之管柱，更佳為可控多孔玻璃管柱或矽酸管柱。在一些應用中，管柱已經諸如甘油之試劑塗覆以試圖防止污染物之非特異性黏附。
作為純化之第一步驟，將如上所述之源自細胞培養物之製劑塗覆至固定有蛋白A之固相上以使得所關注抗體與蛋白A特異性結合。隨後洗滌固相以移除與固相非特異性結合之污染物。最後藉由溶離自固相回收所關注之抗體。
b.使用真核宿主細胞產生抗體：
載體組分通常包括(但不限於)以下各物中之一或多者：信號序列、複製起點、一或多個標記物基因、增強子要素、啟動子及轉錄終止序列。
(i)信號序列組分
用於真核宿主細胞中之載體亦可含有信號序列或在所關注之成熟蛋白或多肽之N末端具有特異性***位點的其他多肽。所選擇之異源信號序列較佳為經宿主細胞識別且加工(亦即，由信號肽酶裂解)之信號序列。在哺乳動物細胞表現中，哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列(例如，單純性疱疹gD信號序列)係可用的。
該前驅區之DNA在閱讀框架中與編碼抗體之DNA接合。
(ii)複製起點
一般而言，哺乳動物表現載體無需複製起點組分。舉例而言，一般可使用SV40起點，僅係因為其含有早期啟動子。
(iii)選擇基因組分
表現及選殖載體可含有選擇基因，亦稱為可選擇標記物。典型選擇基因編碼具有下列作用之蛋白：(a)賦予對抗生素或其他毒素(例如胺苄西林、新黴素、甲胺喋呤或四環素)之抗性；(b)補充營養缺陷型不足(相關聯時)；或(c)供應自複合培養基不可得之關鍵養份。
選擇方案之一實例利用藥物來阻滯宿主細胞之生長。經異源基因成功轉型之彼等細胞產生賦予藥物抗性之蛋白且因此在經歷選擇方案之後存活。此顯性選擇之實例使用藥物新黴素、黴酚酸及潮黴素(hygromycin)。
哺乳動物細胞之合適可選擇標記物的另一實例為使得可識別能夠吸收抗體核酸之細胞組分的彼等標記物，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I及-II(較佳為靈長類動物金屬硫蛋白基因)、腺苷脫胺酶、鳥胺酸脫羧酶等。
舉例而言，首先藉由在含有甲胺喋呤(Mtx)(DHFR之競爭性拮抗劑)之培養基中培養所有轉型物來識別經DHFR選擇基因轉型之細胞。當採用野生型DHFR時，適當之宿主細胞為缺乏DHFR活性之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株(例如ATCC CRL-9096)。
或者，可藉由在含有可選擇標記物(諸如胺基糖苷抗生素，例如卡那黴素、新黴素或G418)之選擇劑的培養基中進行細胞生長來選擇經編碼抗體之DNA序列、野生型DHFR蛋白及另一可選擇標記物(諸如胺基糖苷3'-磷酸轉移酶(APH))轉型或共轉型之宿主細胞(尤其為含有內源性DHFR之野生型宿主)。參見美國專利第4,965,199號。
(iv)啟動子組分
表現及選殖載體通常含有由宿主生物體識別且可操作地連接至抗體多肽核酸之啟動子。已知真核生物之啟動子序列。實際上所有真核基因均具有位於轉錄起始位點上游約25至30個鹼基處之AT富集區。在許多基因轉錄起始處上游70至80個鹼基處發現之另一序列為CNCAAT區，其中N可為任何核苷酸。在大部分真核基因之3'末端處為AATAAA序列，其可為用於將聚腺苷酸尾(poly A tail)添加至編碼序列之3'末端的信號。所有該等序列均適於***真核表現載體中。
哺乳動物宿主細胞中自載體之抗體多肽轉錄(例如)受自病毒(諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、細胞巨大病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及猿病毒40(SV40))基因組，自異源哺乳動物啟動子(例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)，自熱休克啟動子獲得之啟動子來控制，其限制條件為該等啟動子與宿主細胞系統相容。
SV40病毒之早期及晚期啟動子係作為亦含有SV40病毒複製起點之SV40限制性片段而便利地獲得。人類細胞巨大病毒之即刻早期啟動子係作為HindIII E限制性片段而便利地獲得。美國專利第4,419,446號中揭示在哺乳動物宿主中使用牛乳頭狀瘤病毒作為載體來表現DNA之系統。美國專利第4,601,978號中描述對於該系統之修改。或者，勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)長末端重複序列可用作啟動子。
(v)增強子要素組分
由高級真核細胞轉錄編碼本發明之抗體多肽的DNA通常係藉由將增強子序列***載體中來增強。目前已知來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)之許多增強子序列。然而，一般將使用來自真核細胞病毒之增強子。實例包括位於複製起點最近側之SV40增強子(bp 100-270)、細胞巨大病毒早期啟動子增強子、位於複製起點最近側之多瘤增強子及腺病毒增強子。關於活化真核啟動子之增強要素，亦參見Yaniv,Nature 297:17-18(1982)。雖然可將增強子在編碼抗體多肽之序列的位置5'或3'處剪接至載體中，但較佳定位於啟動子之位點5'處。
(vi)轉錄終止組分
用於真核宿主細胞中之表現載體一般亦將含有終止轉錄及穩定mRNA所必需之序列。該等序列通常可自真核或病毒DNA或cDNA之5'且偶爾自3'之未經轉譯區獲得。該等區含有在編碼抗體之mRNA之未經轉譯部分中轉錄為聚腺苷酸化片段的核苷酸區段。一種適用之轉錄終止組分為牛生長激素聚腺苷酸化區。參見WO94/11026及其中所揭示之表現載體。
(vii)選擇及轉型宿主細胞
用於選殖或表現本文載體中之DNA的合適宿主細胞包括本文所述之高級真核生物細胞，包括脊椎動物宿主細胞。脊椎動物細胞在培養物(組織培養物)中之繁殖已成為一種常規程序。適用哺乳動物宿主細胞株之實例為經SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)轉型之猴腎CV1株；人類胚腎株(293或為在懸浮培養物中生長而經次選殖之293細胞，Graham等人，J. Gen. Virol. 36:59(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK,ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980))；小鼠塞利特氏細胞(mouse sertoli cell)(TM4,Mather,Biol. Reprod. 23:243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(African green monkey kidney cell)(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人類宮頸癌細胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK,ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138,ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝癌株(Hep G2)。
用上述用於產生抗體之表現或選殖載體使宿主細胞轉型，且將其培養於適當時經修飾之習知培養基中以誘導啟動子、選擇轉型物或擴增編碼所需序列之基因。
(viii)培養宿主細胞
用於產生本發明抗體之宿主細胞可培養於各種培養基中。市售培養基(諸如漢姆氏(Ham's F10，Sigma)、最低必需培養基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及杜氏改良依格氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)(Sigma))均適合於培養宿主細胞。此外，Ham等人，Meth. Enz. 58:44(1979),Barnes等人，Anal. Biochem. 102:255(1980)，美國專利第4,767,704號、第4,657,866號、第4,927,762號、第4,560,655號或第5,122,469號、WO 90/03430、WO 87/00195或美國專利第30,985號中所述之任何培養基均可用作宿主細胞之培養基。該等培養基中之任一者可視需要補充激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣鹽、鎂鹽及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM 藥物)、微量元素(定義為通常以微莫耳濃度範圍內之最終濃度存在的無機化合物)及葡萄糖或等效能源。亦可包括將為熟習此項技術者已知之適當濃度的任何其他必需補充物。培養條件(諸如溫度、pH值及其類似條件)為先前用於為表現所選擇之宿主細胞的彼等條件，且將為一般熟習此項技術者所顯而易見。
(ix)純化抗體
當使用重組技術時，可在細胞內產生抗體或將其直接分泌至培養基中。若抗體在細胞內產生，則作為第一步驟，例如藉由離心或超濾來移除宿主細胞或溶胞片段之微粒碎片。在抗體經分泌至培養基中之情況下，通常首先使用市售蛋白濃縮過濾器(例如，Amicon或Millipore Pellicon超濾裝置)來濃縮來自該等表現系統之上清液。在任何先前步驟中均可包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外來污染物生長。
自細胞製備之抗體組合物可使用(例如)羥磷灰石層析法、凝膠電泳法、透析及親和力層析法來純化，其中親和力層析法為較佳之純化技術。蛋白A作為親和配位體之適宜性視存在於抗體中之任何免疫球蛋白Fc域的種類及同型而定。蛋白A可用於純化基於人類γ1、γ2或γ4重鏈之抗體(Lindmark等人，J. Immunol. Meth. 62:1-13(1983))。對於所有小鼠同型及人類γ3而言，均推薦蛋白G(Guss等人，EMBO J. 5:15671575(1986))。親和配位體所附著之基質最通常為瓊脂糖，但其他基質為可用的。與使用瓊脂糖可達成之流動速率及處理時間相比，諸如受控微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯之機械穩定性基質允許更快之流動速率及更短之處理時間。在抗體包含CH3域之情況下，Bakerbond ABXTM 樹脂(J. T. Baker,Phillipsburg,NJ)適用於純化。視待回收之抗體而定，亦可利用其他用於蛋白純化之技術，諸如離子交換管柱分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽層析、肝素SEPHAROSETM 層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。
在任何初步純化步驟之後，可使包含所關注抗體及污染物之混合物經受使用pH值在約2.5至4.5之間的溶離緩衝劑較佳在低鹽濃度(例如，約0至0.25M鹽)下進行的低pH值疏水性相互作用層析。
免疫結合物
本發明亦提供免疫結合物(互換地稱為「抗體-藥物結合物」或「ADC」)，其包含本文所述之結合至細胞毒性劑(諸如化療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物源之酶活性毒素或其片段))之任何抗Notchl NRR抗體或放射性同位素(亦即放射性結合物)。
使用抗體-藥物結合物進行細胞毒素或細胞生長抑制劑之局部傳遞，亦即在治療癌症中使用藥物來殺死或抑制腫瘤細胞(Syrigos及Epenetos(1999)Anticancer Research 19:605-614；Niculescu-Duvaz及Springer(1997)Adv. Drg. Del. Rev. 26:151-172；美國專利第4,975,278號)使得藥物部分可經靶向傳遞至腫瘤及其中之細胞內積聚，其中該等未結合0藥劑之全身性投與可導致對於正常細胞以及待尋求消除之腫瘤細胞而言不可接受之程度的毒性(Baldwin等人，(1986)Lancet pp.(1986年3月15日):603-05；Thorpe,(1985)[Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review]於Monoclonal Antibodies '84:Biological And Clinical Applications,A. Pinchera等人(編)，第475-506頁中)。因此尋求具有最小毒性之最大功效。已報導，多株抗體與單株抗體均適用於該等策略(Rowland等人，(1986)Cancer Immunol. Immunother.,21:183-87)。該等方法中使用之藥物包括道諾黴素、阿黴素、甲胺喋呤及長春地辛(Rowland等人，(1986)上文)。抗體-毒素結合物中所使用之毒素包括細菌毒素，諸如白喉毒素(diphtheria toxin)；植物毒素，諸如蓖麻毒素；小分子毒素，諸如格爾德黴素(geldanamycin)(Mandler等人(2000)Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandler等人，(2000)Bioorganic ＆ Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandler等人，(2002)Bioconjugate Chem. 13:786-791)、類美登素(EP 1391213；Liu等人，(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)及刺孢黴素(Lode等人，(1998)Cancer Res. 58:2928；Hinman等人，(1993)Cancer Res. 53:3336-3342)。該等毒素可藉由包括微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制之機制來實現其細胞毒性及細胞生長抑制效應。一些細胞毒性藥物當與大型抗體或蛋白受體配位體結合時傾向於無活性或具有較小活性。
ZEVALIN(替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan),Biogen/Idec)為抗體-放射性同位素結合物，其係由藉由硫脲連接子-螯合劑所結合之針對CD20抗原(發現於正常及惡性B淋巴細胞之表面上)之鼠類IgG1κ單株抗體與111 In或90 Y放射性同位素組成(Wiseman等人，(2000)Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wiseman等人，(2002)Blood 99(12):4336-42；Witzig等人，(2002)J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzig等人，(2002)J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。雖然ZEVALIN對B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's Lymphoma，NHL)具有活性，但投藥導致大部分患者罹患嚴重且長期之血球減少症。MYLOTARGTM (吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin)，Wyeth Pharmaceuticals)，一種由連接至刺孢黴素的hu CD33抗體組成之抗體藥物結合物，於2000年獲准用於注射治療急性骨髓性白血病(Drugs of the Future(2000)25(7):686；美國專利第4,970,198號、第5,079,233號、第5,585,089號、第5,606,040號、第5,6937,62號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,773,001號)。卡妥珠單抗莫坦辛(Cantuzumab mertansine，Immunogen,Inc.)，一種由經由雙硫鍵連接子SPP與類美登素藥物部分(DM1)連接之huC242抗體組成的抗體藥物結合物，正發展至II期試驗以用於治療表現CanAg之癌症，諸如結腸癌、胰腺癌、胃癌及其他癌症。MLN-2704(Millennium Pharm.,BZL Biologics,Immunogen Inc.)，一種由與類美登素藥物部分(DM1)連接之抗***特異性膜抗原(PSMA)單株抗體組成的抗體藥物結合物，正處於研發中以用於潛在治療***腫瘤。奧利斯汀(auristatin)肽、奧利斯汀E(AE)及單甲基奧利斯汀(monomethylauristatin；MMAE)(海兔毒素之合成類似物)係與嵌合單株抗體cBR96(對癌瘤上之Lewis Y具特異性)及cAC10(對血液科惡性疾病上之CD30具特異性)結合(Doronina等人(2003)Nature Biotechnology 21(7):778-784)且正處於治療研發中。
適用於產生免疫結合物之化療劑描述於本文中(例如上述)。可使用之酶促活性毒素及其片段包括：白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa ))、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素(abrin)A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-帚麴菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii )蛋白、康乃馨蛋白、洋商陸(Phytolaca americana )蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻楓樹蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、天堂果蛋白(gelonin)、有絲***素(mitogellin)、侷限麯黴素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(enomycin)及黴菌毒素(tricothecene)。參見例如1993年10月28日公開之WO 93/21232。各種放射性核種可用於產生放射性結合抗體。實例包括212 Bi、131 I、131 In、90 Y及186 Re。使用多種雙官能蛋白偶合劑來製備抗體與細胞毒性劑之結合物，該等雙官能蛋白偶合劑諸如：N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如己二醯亞胺酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(諸如雙-(對疊氮基苄醯基)己二胺)、雙-重氮鹽衍生物(諸如雙-(對重氮苄醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯類(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，可如Vitetta等人，Science,238:1098(1987)中所述來製備蓖麻毒素免疫毒素。經碳14標記之1-異硫氰氧基苄基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)為用於使放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參見WO94/11026。
抗體與一或多種小分子毒素(諸如刺孢黴素、類美登素、海兔毒素、奧利斯汀、單端孢黴烯族毒素及CC1065)及該等毒素之具有毒素活性之衍生物的結合物亦涵蓋於本文中。i.美登素及類美登素
在一些實施例中，免疫結合物包含與一或多個類美登素分子結合之本發明抗體(全長或片段)。
類美登素為有絲***抑制劑，其藉由抑制微管蛋白聚合而起作用。美登素最先係自東非灌木齒葉美登木(east African shrub Maytenus serrata)分離得到(美國專利第3,896,111號)。之後，發現某些微生物亦產生類美登素，諸如美登醇(maytansinol)及C-3美登醇酯(美國專利第4,151,042號)。例如，美國專利第4,137,230號、第4,248,870號、第4,256,746號、第4,260,608號、第4,265,814號、第4,294,757號、第4,307,016號、第4,308,268號、第4,308,269號、第4,309,428號、第4,313,946號、第4,315,929號、第4,317,821號、第4,322,348號、第4,331,598號、第4,361,650號、第4,364,866號、第4,424,219號、第4,450,254號、第4,362,663號及第4,371,533號中揭示合成美登醇及其衍生物及類似物。
類美登素藥物部分為抗體藥物結合物中具吸引力之藥物部分，此係因為其：(i)相對容易藉由醱酵或化學修飾或醱酵產物之衍生作用來製備，(ii)適於以適合經由非雙硫鍵連接子與抗體結合之官能基衍生化，(iii)在血漿中穩定，及(iv)對多種腫瘤細胞株有效。
含有類美登素之免疫結合物、製造其之方法及其治療用途係揭示於(例如)美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235 B1中，其揭示內容以引用的方式明確併入本文中。Liu等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623(1996)描述包含與針對人類結腸直腸癌之單株抗體C242連接之類美登素(命名為DM1)的免疫結合物。發現該結合物對所培養之結腸癌細胞具有高度細胞毒性，且在活體內腫瘤生長檢定中展示抗腫瘤活性。Chari等人，Cancer Research 52:127-131(1992)描述其中類美登素經由雙硫鍵連接子與結合人類結腸癌細胞株上之抗原的鼠類抗體A7結合或與結合HER-2/neu致癌基因之另一鼠類單株抗體TA.1結合的免疫結合物。在活體外測試TA.1-類美登素結合物對人類乳癌細胞株SK-BR-3(其每個細胞表現3×105 個HER-2表面抗原)之細胞毒性。藥物結合物達成與游離類美登素藥物類似程度之細胞毒性，此程度可藉由增加每個抗體分子之類美登素分子的數目而增加。A7-類美登素結合物在小鼠體內展示低全身性細胞毒性。
抗體-類美登素結合物係藉由以化學方法使抗體與類美登素分子連接但不顯著降低抗體或類美登素分子之生物學活性來製備。參見例如美國專利第5,208,020號(其揭示內容以引用的方式明確併入本文中)。每個抗體分子結合平均3至4個類美登素分子已展示增強對標靶細胞之細胞毒性的功效而對抗體之功能或溶解性無負面影響，但預期甚至一個分子之毒素/抗體即可增強細胞毒性，優於使用裸抗體。類美登素在此項技術中係熟知的，且可藉由已知技術合成或自天然來源分離。合適類美登素揭示於(例如)美國專利第5,208,020號及上文提及之其他專利及非專利公開案中。較佳類美登素為美登醇及在美登醇分子之芳族環或其他位置處經修飾之美登醇類似物，諸如各種美登醇酯。
此項技術中已知多種用於製造抗體-類美登素結合物之連接基團，包括例如美國專利第5,208,020號或歐洲專利0 425 235 B1及Chari等人，Cancer Research 52:127-131(1992)及2004年10月8日申請之美國專利申請案第10/960,602號(其揭示內容以引用的方式明確併入本文中)中所揭示之彼等連接基團。可如2004年10月8日申請之美國專利申請案第10/960,602號中所揭示來製備包含連接子組分SMCC之抗體-類美登素結合物。連接基團包括如以上指出之專利中所揭示之雙硫基、硫醚基、酸不穩定性基團、光不穩定性基團、肽酶不穩定性基團或酯酶不穩定性基團，其中雙硫基及硫醚基係較佳的。本文中描述且例示其他連接基團。
抗體與類美登素之結合物可使用多種雙官能蛋白偶合劑來製造，該等雙官能蛋白偶合劑諸如為N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如己二醯亞胺酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苄醯基)己二胺)、雙-重氮鹽衍生物(諸如雙(對重氮鹽苄醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。尤其較佳之偶合劑包括N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等人，Biochem. J. 173:723-737(1978))及N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)以提供雙硫鍵。
視連接類型而定，可使連接子於各個位置處與類美登素分子連接。舉例而言，可使用習知偶合技術藉由與羥基反應而形成酯鍵。反應可發生在具有羥基之C-3位置、經羥甲基修飾之C-14位置、經羥基修飾之C-15位置及具有羥基之C-20位置上。在一較佳實施例中，在美登醇或美登醇類似物之C-3位置處形成鍵聯。
ii.奧利斯汀及海兔毒素
在某些實施例中，免疫結合物包含與海兔毒素或海兔毒素肽類似物及衍生物奧利斯汀結合之本發明抗體(美國專利第5,635,483號及第5,780,588號)。已展示海兔毒素及奧利斯汀干擾微管動力學、GTP水解及核與細胞分離(Woyke等人(2001)Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584)及具有抗癌(美國專利第5,663,149號)及抗真菌活性(Pettit等人，(1998)Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)。海兔毒素或奧利斯汀藥物部分可經肽藥物部分之N(胺基)末端或C(羧基)末端連接至抗體(WO 02/088172)。
例示性奧利斯汀實施例包括2004年11月5日申請之美國專利連續案第10/983,340號[Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands]中所揭示之N末端連接之單甲基奧利斯汀藥物部分DE及DF，其揭示內容以全文引用的方式明確併入本文中。
肽基藥物部分一般可藉由在兩個或兩個以上胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵來製備。該等肽鍵例如可根據肽化學領域中熟知之液相合成方法(參見E.及K.,[The Peptides]第1卷，第76-136頁，1965,Academic Press)來製備。奧利斯汀/海兔毒素藥物部分可根據美國專利第5,635,483號及第5,780,588號；Pettit等人，(1989)J. Am. Chem. Soc. 111:5463-5465；Pettit等人，(1998)Anti-Cancer Drug Design 13:243-277；Pettit,G.R.等人，Synthesis,1996,719-725及Pettit等人，(1996)J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863之方法來製備。亦參見2005年10月27日公開之Doronina(2003)Nat. Biotechnol. 21(7):778-784；[Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands]US20050238649，其以全文引用的方式併入本文中(例如揭示連接子及製備與連接子結合之單甲基纈胺酸化合物(諸如MMAE及MMAF)的方法)。
iii.刺孢黴素
在其他實施例中，免疫結合物包含與一或多個刺孢黴素分子結合之本發明抗體。抗生素之刺孢黴素家族能夠產生亞皮莫耳濃度之雙股DNA斷裂。關於刺孢黴素家族結合物之製備，參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號(所有專利均屬於American Cyanamid Company)。可使用之刺孢黴素結構類似物包括(但不限於)γ1 I 、α2 I 、α3 I 、N-乙醯基-γ1 I 、PSAG及θI 1 (Hinman等人，Cancer Research 53:3336-3342(1993),Lode等人，Cancer Research 58:2925-2928(1998)及上文提及之屬於American Cyanamid之美國專利)。抗體可結合之另一抗腫瘤藥物為QFA，其係抗葉酸劑。刺孢黴素與QFA兩者均具有細胞內作用位點且不易於穿過質膜。因此，經抗體介導之內化作用細胞吸收該等藥劑大幅增強其細胞毒素效應。
iv.其他細胞毒性劑
可結合本發明抗體之其他抗腫瘤劑包括BCNU、鏈佐黴素(streptozoicin)、長春新鹼及5-氟尿嘧啶、美國專利第5,053,394號及第5,770,710號中所述之已知總稱為LL-E33288複合物之藥劑家族以及埃斯培拉黴素(美國專利第5,877,296號)。
可使用之酶促活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌)、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、莫迪素A鏈、α-帚麴菌素、油桐蛋白、康乃馨蛋白、洋商陸蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻楓樹蛋白、巴豆毒素、鼠尾草抑制劑、白樹素、有絲***素、侷限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素及黴菌毒素。參見例如1993年10月28日公開之WO 93/21232。
本發明另外涵蓋一種在抗體與具有核分解活性之化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸內切酶，諸如脫氧核糖核酸酶(DNase))之間形成的免疫結合物。
為選擇性地破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。多種放射性同位素可用於產生放射性結合之抗體。實例包括At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 及Lu之放射性同位素。當結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍攝影術研究之放射性原子(例如tc99m 或I123 )或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，mri)之自旋標記，諸如碘-123(再次)、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
可以已知方式將放射性標記或其他標記併入結合物中。舉例而言，可經生物方式合成肽，或可藉由使用合適胺基酸前驅體(例如包含以氟-19代替氫)進行化學胺基酸合成來合成肽。諸如Tc99m 或I123 、Re186 、Re188 及In111 之標記可經由肽中之半胱胺酸殘基連接。釔-90可經由離胺酸殘基連接。可使用IODOGEN方法(Fraker等人(1978)Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57)來併入碘-123。[Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy](Chatal,CRC Press 1989)詳細描述其他方法。
抗體與細胞毒性劑之結合物可使用多種雙官能蛋白偶合劑來製造，該等雙官能蛋白偶合劑諸如為N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如己二醯亞胺酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(諸如雙-(對疊氮基苄醯基)己二胺)、雙-重氮鹽衍生物(諸如雙-(對重氮鹽苄醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science 238:1098(1987)中所述來製備。經碳14標記之1-異硫氰氧基苄基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)為用於使放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參見WO94/11026。連接子可為有助於細胞中細胞毒素藥物釋放之「可***連接子」。舉例而言，可使用酸不穩定性連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定性連接子、二甲基連接子或含二硫化物之連接子(Chari等人，Cancer Research 52:127-131(1992)；美國專利第5,208,020號)。
本發明之化合物明確涵蓋(但不限於)用以下市售(例如購自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)之交聯試劑製備的ADC：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB及SVSB(琥珀醯亞胺基-(4-乙烯碸)苯甲酸酯)。參見第467-498頁，2003-2004 Applications Handbook and Catalog。
v.　製備抗體藥物結合物
在本發明之抗體藥物結合物(ADC)中，抗體(Ab)經由連接子(L)與一或多個藥物部分(D)結合，例如每個抗體結合約1至約20個藥物部分。式I之ADC可藉由若干途徑採用熟習此項技術者已知之有機化學反應、條件及試劑來製備，包括：(1)抗體之親核性基團與二價連接子試劑經由共價鍵反應以形成Ab-L，繼而與藥物部分D反應；及(2)藥物部分之親核性基團與二價連接子試劑經由共價鍵反應以形成D-L，繼而與抗體之親核性基團反應。本文中描述製備ADC之其他方法。
Ab-(L-D)p 　I
連接子可由一或多種連接子組分組成。例示性連接子組分包括6-順丁烯二醯亞胺基己醯基(「MC」)、順丁烯二醯亞胺基丙醯基(「MP」)、纈胺酸-瓜胺酸(「val-cit」)、丙胺酸-***酸(「ala-phe」)、對胺基苄氧羰基(「PAB」)、4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-琥珀醯亞胺酯(「SPP」)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸N-琥珀醯亞胺酯(「SMCC」)及(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯(「SIAB」)。額外之連接子組分已為此項技術中所知且一些描述於本文中。亦參見2004年11月5日申請之[Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands]美國專利連續案第10/983,340號，其內容以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，連接子可包含胺基酸殘基。例示性胺基酸連接子組分包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性二肽包括：纈胺酸-瓜胺酸(vc或val-cit)、丙胺酸-***酸(af或ala-phe)。例示性三肽包括：甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(gly-gly-gly)。包含胺基酸連接子組分之胺基酸殘基包括天然產生之胺基酸以及次要胺基酸及非天然產生之胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。可對胺基酸連接子組分進行設計且優化其對特定酶(例如腫瘤相關蛋白酶、組織蛋白酶B、C及D或纖溶酶蛋白酶)之酶促裂解的選擇性。
抗體上之親核性基團包括(但不限於)：(i)N末端胺基；(ii)側鏈胺基，例如離胺酸；(iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸；及(iv)糖羥基或胺基，在該等糖羥基或胺基處抗體經糖基化。胺、硫醇及羥基係親核性的且能夠與連接子部分及包括以下各物之連接子試劑上的親電子基團反應以形成共價鍵：(i)活性酯類，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苄基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；(iii)醛類、酮類、羧基及順丁烯二醯亞胺基團。某些抗體具有可還原之鏈間雙硫鍵，亦即半胱胺酸橋。可藉由用諸如DTT(二硫蘇糖醇)之還原劑處理而使抗體具有與連接子試劑結合之反應性。因此，理論上各半胱胺酸橋將形成兩個反應性硫醇親核體。可經由使離胺酸與2-亞胺基硫雜環戊烷(Traut試劑)反應而使胺轉化為硫醇，從而將額外之親核性基團引入抗體中。可藉由引入一個、兩個、三個、四個或四個以上半胱胺酸殘基將反應性硫醇基團引入抗體(或其片段)中(例如製備包含一或多個非天然半胱胺酸胺基酸殘基之突變抗體)。
本發明之抗體藥物結合物亦可藉由修飾抗體以引入可與連接子試劑或藥物上之親核性取代基反應之親電子部分而產生。可將糖基化抗體之糖以(例如)過碘酸鹽氧化試劑氧化以形成可與連接子試劑或藥物部分之胺基反應的醛基或酮基。所得亞胺希夫鹼(Schiff base)基團可形成穩定鍵，或可(例如)經硼氫化物試劑還原以形成穩定胺鍵。在一項實施例中，糖基化抗體之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏過碘酸鈉之反應可在蛋白中產生可與藥物上之適當基團反應的羰基(醛基及酮基)(Hermanson,Bioconjugate Techniques)。在另一項實施例中，含有N末端絲胺酸或蘇胺酸殘基之蛋白可與偏過碘酸鈉反應，從而產生醛而非第一胺基酸(Geoghegan ＆ Stroh,(1992)Bioconjugate Chem. 3:138-146；美國專利第5,362,852號)。該醛可與藥物部分或連接子親核體反應。
同樣，藥物部分上之親核性基團包括(但不限於)：胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、硫半卡巴腙、肼羧酸酯基及芳基醯肼基團，其能夠與連接子部分及包括以下各物之連接子試劑上的親電子基團反應以形成共價鍵：(i)活性酯類，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苄基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；(iii)醛類、酮類、羧基及順丁烯二醯亞胺基團。
或者，包含抗體及細胞毒性劑之融合蛋白可例如藉由重組技術或肽合成來製造。DNA長度可包含編碼彼此相鄰或由編碼連接子肽之區隔開(其不會破壞所需結合物特性)之結合物的兩部分之各別區。
在又一項實施例中，抗體可與「受體」(諸如抗生蛋白鏈菌素)結合以用於腫瘤預靶向，其中向個體投與抗體-受體結合物，繼而使用清除劑自循環中移除未結合之結合物且隨後投與與細胞毒性劑(例如放射性核苷酸)結合之「配位體」(例如抗生物素蛋白(avidin))。
醫藥調配物
藉由將具有所需純度之抗體與生理學上可接受之可選載劑、賦形劑或穩定劑混合(Remington:The Science and Practice of Pharmacy 第20版(2000))而以水溶液、凍乾調配物或其他乾燥調配物之形式來製備包含本發明抗體之治療性調配物以供儲存。在所採用之劑量及濃度下，可接受之載劑、賦形劑或穩定劑對接受者無毒，且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苄基銨；氯化六烴季銨(hexamethonium chloride)；氯化苯甲烴銨(benzalkonium chloride)；苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽平衡離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白錯合物)；及/或非離子性界面活性劑，諸如TWEENTM 、PLURONICSTM 或聚乙二醇(PEG)。
如所治療之特定適應症所需，本文之調配物亦可含有一種以上活性化合物，較佳為具有不會不利地彼此影響之互補活性的活性化合物。該等分子合適地以有效達成預期目的之量組合存在。
亦可將活性成份包埋於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合而製備之微膠囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中，包埋於膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或包埋於***液中。該等技術揭示於Remington:The Science and Practice of Pharmacy 第20版(2000)中。
待用於活體內投藥之調配物必須無菌。此易於藉由經無菌濾膜過濾而實現。
可製備持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之合適實例包括含有本發明之免疫球蛋白的固體疏水性聚合物之半滲透性基質，該等基質為成形物品之形式，例如薄膜或微膠囊。持續釋放型基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與γ-乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOTTM ，由乳酸-乙醇酸共聚物與乙酸亮丙瑞林組成之可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。儘管諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物能釋放分子歷時超過100天，但某些水凝膠釋放蛋白歷時較短時段。當經囊封之免疫球蛋白在體內長時間保持時，由於在37℃下暴露於水份，故其可能變性或聚集，從而導致生物活性之損失及免疫原性可能之改變。視所涉及之機制而定，可設計合理之穩定策略。舉例而言，若發現聚集機制係經由硫基-二硫化物互換之分子間S-S鍵形成，則可藉由修飾巰基殘基、自酸性溶液凍乾、控制水份含量、使用適當添加劑及研製特定聚合物基質組合物來達成穩定化作用。
III.治療性用途
本文所述之結合HER2及VEGF兩者之抗體及抗體片段(例如，bH1-44或bH1-88或其片段)可用於治療腫瘤(包括癌前、非轉移性及癌性腫瘤(例如，早期癌症))、用於治療自體免疫疾病、用於治療血管生成病症、用於治療涉及HER2之異常活化之疾病或用於治療具有發展癌症(例如，乳癌、結腸直腸癌、肺癌、腎細胞癌、神經膠質瘤或卵巢癌)、血管生成病症、自體免疫疾病或涉及HER2之異常活化之疾病的風險之個體。
術語癌症涵蓋增殖性病症之集合，包括(但不限於)癌前生長、良性腫瘤及惡性腫瘤。良性腫瘤保持位於初始位點處且不具有浸潤、侵襲或轉移至遠端位點的能力。惡性腫瘤將侵襲且損壞其周圍之其他組織。其亦可獲得離開起始位點且通常經由血流或經由淋巴結所定位之淋巴系統擴散至身體之其他部分(轉移)的能力。藉由產生原發腫瘤之組織的類型對原發腫瘤分類；藉由引起癌細胞之組織類型對轉移性腫瘤分類。惡性腫瘤細胞隨時間變得更加異常且似乎更不像正常細胞。癌細胞外觀之此變化稱作腫瘤等級，且癌細胞係描述為充分分化、中度分化、不良分化或未分化。充分分化細胞之外觀相當正常且類似於產生其之正常細胞。未分化細胞為已變得異常以致不再有可能確定細胞起源之細胞。
腫瘤可為實體腫瘤或非實體腫瘤或軟組織腫瘤。軟組織腫瘤之實例包括白血病(例如慢性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病、成年急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、成熟B細胞急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴球性白血病、前淋巴球性白血病或毛細胞白血病)或淋巴瘤(例如非霍奇金氏淋巴瘤、皮膚T-細胞淋巴瘤或霍奇金氏病(Hodgkin's disease))。實體腫瘤包括除血液、骨髓或淋巴系統以外的任何身體組織之癌症。實體腫瘤可進一步分成上皮細胞起源之實體腫瘤及非上皮細胞起源之實體腫瘤。上皮細胞實體腫瘤之實例包括胃腸道、結腸、***、***、肺、腎臟、肝臟、胰腺、卵巢、頭及頸部、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、肛門、膽囊、唇、鼻咽、皮膚、子宮、雄性生殖器、泌尿器、膀胱及皮膚之腫瘤。非上皮起源之實體腫瘤包括肉瘤、腦腫瘤及骨腫瘤。
上皮癌症通常自良性腫瘤發展至侵襲前階段(例如，原位癌瘤)、惡性癌症，其已滲透基膜且侵襲上皮細胞下基質。
結合VEGF及HER2兩者之多重特異性抗體(例如，bH1-44或bH1-88或其片段)理想地用於治療乳癌、結腸直腸癌、肺癌、腎細胞癌、神經膠質瘤或卵巢癌。
現已充分確定多種病症之發病機理中均牽涉血管生成。該等病症包括實體腫瘤及轉移、動脈粥樣硬化、晶狀體後纖維組織增生、血管瘤、慢性炎症、眼內新生血管疾病(諸如增殖性視網膜病(例如糖尿病性視網膜病)、年齡相關之黃斑退化(AMD)、新生血管性青光眼)、移植角膜組織及其他組織之免疫排斥反應、類風濕性關節炎及牛皮癬。Folkman等人，J. Biol. Chem.,267:10931-10934(1992)；Klagsbrun等人，Annu. Rev. Physiol. 53:217-239(1991)；及Garner A.,[Vascular diseases]於Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach,Garner A.,Klintworth GK編，第2版(Marcel Dekker,NY,1994)，第1625-1710頁中。
異常血管生成發生在新血管過度、不足或不當(例如就醫學觀點而言，血管生成之位置、時序或發作不當)生長時，其係以患病狀態或使得其引起患病狀態。過度、不當或不受控之血管生成發生在促進患病狀態之惡化或引起患病狀態之新血管生長時，諸如在癌症(尤其為血管化實體腫瘤及轉移性腫瘤(包括結腸、肺癌(尤其為小細胞肺癌)或***癌))、眼科新生血管引起之疾病(尤其為糖尿病性失明、視網膜病、早期糖尿病性視網膜病或年齡相關之黃斑退化(AMD))、糖尿病性黃斑水腫、大腦水腫(例如，與急性中風/閉鎖性頭部損傷/外傷)、滑膜炎、類風濕性關節炎中之血管翳形成、骨化性肌炎、肥厚性骨形成、難治性腹水症、多囊性卵巢疾病、流體疾病之第三空間(胰炎、腔室症候群、燒傷、腸疾病)、子宮肌瘤、早產兒、眼角新生血管(虹膜紅變)、惡性肺積水、血管再狹窄、血管母細胞瘤(諸如血管瘤)；炎性腎疾病(諸如絲球體腎炎，尤其為系膜增殖性絲球體腎炎)、溶血性尿毒癥候群、糖尿病性腎病變或高血壓性腎硬化症、各種炎性疾病(諸如關節炎(尤其為類風濕性關節炎)、炎性腸疾病、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、斑塊牛皮癬、肉狀瘤病、動脈硬化及移植後發生之疾病)、腎同種異體移植排斥反應、子宮內膜異位或慢性哮喘及70種以上之其他病況中。新血管可供養患病組織、損壞正常組織且在癌症之情況下，新血管可使腫瘤細胞逃離至循環中且留存於其他器官中(腫瘤轉移)。不足之血管生成發生在存在促進患病狀態之惡化的不當血管生長時，例如在諸如冠狀動脈疾病、中風及延遲性傷口癒合之疾病中。此外，潰瘍、中風及心臟病發作可因不存在自然恢復正常所需之血管生成所致。本發明涵蓋使用特異性地結合VEGF及HER2兩者之抗體(例如，bH1-81或bH1-44抗體)治療患有上文所提及疾病或具有患該等疾病之風險的彼等患者。
作為接受本發明組合物之候選者的其他患者患有以下疾病或具有患以下疾病之風險：纖維小管組織之異常增殖、痤瘡、後天性免疫缺乏症候群、動脈阻塞、異位性角膜炎、細菌性潰瘍、***、血源性腫瘤、頸動脈阻塞性疾病、脈絡膜新生血管、慢性炎症、慢性視網膜脫離、慢性葡萄膜炎、慢性玻璃體炎、隱形眼鏡超戴症、角膜移植排斥反應、角膜新生血管、角膜移植新生血管、克羅恩氏病、伊爾斯病(Eales disease)、流行性角膜結膜炎、真菌潰瘍、單純疱疹感染、帶狀疱疹感染、黏性過大症候群、卡堡氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、白血病、脂質退化、萊姆氏病(Lyme's disease)、邊緣角質層分離、穆雷氏潰瘍(Mooren ulcer)、除麻風以外之分枝桿菌(Mycobacteria)感染、近視、眼科新生血管疾病、視盤小凹、Osler-Weber症候群(Osler-Weber-Rendu)、骨關節炎、佩吉特氏病、平坦部炎、類天疱瘡、皰性角結膜病、多動脈炎、雷射後併發症、原生蟲感染、彈性假黃瘤、翼狀胬肉乾性角膜炎、放射狀角膜切開術、視網膜新生血管、早產兒視網膜病、晶狀體後纖維組織增生、肉狀瘤、鞏膜炎、鐮狀細胞貧血、修格連氏症候群(Sogren's syndrome)、實體腫瘤、斯特格氏病(Stargart's disease)、史蒂芬-約翰遜病(Steven's Johnson disease)、上輪部角膜炎、梅毒、全身性狼瘡症、特利恩氏角膜邊緣退化(Terrien's marginal degeneration)、弓蟲症、尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)之腫瘤、神經母細胞瘤之腫瘤、骨肉瘤之腫瘤、視網膜母細胞瘤之腫瘤、橫紋肌肉瘤之腫瘤、潰瘍性結腸炎、靜脈阻塞、維生素A缺乏(Vitamin A deficiency)、韋格內氏類肉瘤病(Wegener's sarcoidosis)、與糖尿病相關聯之非所要血管生成、寄生性疾病、異常傷口癒合、手術、損傷或外傷後肥大(例如，急性肺損傷/ARDS)、抑制毛髮生長、抑制***及黃體形成、抑制植入及抑制子宮中之胚胎發育。
抗血管生成療法適用於以下疾病之一般性治療：移植排斥反應、肺炎、原發性肺高血壓、腎病症候群、初期子巔及胸腔積水、具有不利血管滲透性特徵之疾病及病症(例如，與腦部腫瘤相關聯之水腫、與惡性疾病相關聯之腹水症、梅格氏症候群(Meigs' syndrome)、肺炎、腎病症候群、心包膜積水(諸如與心包炎相關聯)、與心血管疾病相關聯之滲透性(諸如，心肌梗塞及中風後之病況)及其類似疾病)及敗血症。
本發明之其他血管生成依賴性疾病包括血管纖維瘤(易於出血之血管的異常血液)、新生血管性青光眼(眼睛腫血管之生長)、動靜脈畸形(AVM；動脈與靜脈之間的異常連通)、不癒合性骨折(不癒合之骨折)、動脈粥樣硬化斑(動脈之硬化)、化膿性肉芽腫(由血管組成之普通皮膚病變)、硬皮病(一種結締組織疾病形式)、血管瘤(由血管組成之腫瘤)、腦膜瘤、甲狀腺增生(包括格雷氏病(Grave's disease))、沙眼(第三世界中失明之主要原因)、血友病性關節、滑膜炎、皮炎、血管黏附及肥厚性疤痕(異常疤痕形成)。
IV.劑量及調配物
抗體(例如，bH1-44或bH1-81)或抗體片段組合物將以與良好醫藥實踐一致之方式經調配、給藥及投與。本文所考慮之因素包括經治療之特定病症、經治療之特定哺乳動物、個別個體之臨床病況、病症之原因、藥劑傳遞之位點、投藥方法、投藥時程及醫師已知之其他因素。待投與之抗體或抗體片段之「治療有效量」將由該等考慮因素來決定且為預防、改善或治療癌症或自體免疫病症所需之最小量。抗體或抗體片段無需(但視情況地)與一或多種藥劑一起調配目前用於預防或治療癌症或自體免疫病症或發展癌症或自體免疫病症之風險。該等其他藥劑之有效量視調配物中存在之抗體或抗體片段之量、病症或治療之類型及上文論述之其他因素而定。該等藥劑通常以如上文所使用之相同劑量及投藥途徑使用或以迄今所使用之劑量之約1%至99%使用。減輕或治療癌症通常包含減少與癌症相關聯之一或多種症狀或醫學問題。治療有效量之藥物可實現以下作用中之一者或其組合：減少(至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或100%以上)癌細胞之數目；減少或抑制腫瘤尺寸或腫瘤負荷；抑制(亦即，某種程度上減少及/或停止)癌細胞浸潤至周邊器官；在腺瘤之情況下減少激素分泌；減少血管密度；抑制腫瘤轉移；減少或抑制腫瘤生長；及/或某種程度上緩解與癌症相關聯之一或多種症狀。在一些實施例中，抗體或抗體片段係用於預防個體之癌症或自體免疫病症發生或復發。
在一項實施例中，本發明可用於增加易患癌症或自體免疫病症或經診斷患有癌症或自體免疫病症之人類患者的存活持續時間。存活持續時間係定義為第一次投與藥物至死亡之時間。存活持續時間亦可藉由治療組與對照組之分層風險比(HR)來量測，其表示患者在治療期間之死亡風險。
在又一項實施例中，本發明之治療顯著增加經各種抗癌療法治療之易患癌症或經診斷患有癌症之人類患者群的反應率。反應率係定義為對治療有反應之經治療患者的百分比。在一態樣中，本發明之使用抗體或抗體片段及手術、輻射療法或一或多種化療劑之組合治療與僅經手術、輻射療法或化療單獨治療之組相比，顯著增加經治療患者組之反應率，該增加具有小於0.005之卡方p值(Chi-Square p-value)。
對於癌症治療中之治療功效的額外量測係描述於美國專利申請公開案第20050186208號中。
使用此項技術中已知之標準方法，藉由混合具有所需純度之活性成份與可選之生理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences(第20版)，A. Gennaro編，2000,Lippincott,Williams & Wilkins,Philadelphia,PA)來製備治療性調配物。可接受之載劑包括生理食鹽水或緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽平衡離子，諸如鈉；及/或非離子性界面活性劑，諸如TWEENTM 、PLURONICSTM 或PEG。
視情況但較佳地，調配物含有醫藥學上可接受之鹽，較佳為氯化鈉且其較佳處於約生理學濃度下。視情況而定，本發明之調配物可含有醫藥學上可接受之防腐劑。在一些實施例中，防腐劑濃度介於0.1%至2.0%(一般為v/v)之範圍內。合適防腐劑包括醫藥技術中已知者。苄醇、苯酚、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯為較佳防腐劑。視情況而定，本發明之調配物可包括濃度為0.005%至0.02%之醫藥學上可接受之界面活性劑。
如所治療之特定適應症所需，本文之調配物亦可含有一種以上活性化合物，較佳為具有不會不利地彼此影響之互補活性的活性化合物。該等分子合適地以有效達成預期目的之量組合存在。
亦可將活性成份包埋於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合作用而製備之微膠囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中，包埋於膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或包埋於***液中。前述Remington's Pharmaceutical Sciences中揭示該等技術。
可製備持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之合適實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物的半滲透性基質，該等基質為成形物品之形式，例如薄膜或微膠囊。持續釋放型基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物(諸如，LUPRON DEPOTTM ，由乳酸-乙醇酸共聚物與乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)組成之可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。儘管諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸之聚合物能釋放分子歷時超過100天，但某些水凝膠釋放蛋白歷時較短時段。當經囊封之抗體在體內長時間保持時，由於在37℃下暴露於水份，故其可變性或聚集，從而導致生物活性之損失及免疫原性可能之變化。視所涉及之機制而定，可設計合理之穩定策略。舉例而言，若發現聚集機制係經由硫基-二硫化物互換之分子間S-S鍵形成，則可藉由修飾巰基殘基、自酸性溶液凍乾、控制水份含量、使用適當添加劑且研製特定聚合物基質組合物來達成穩定化作用。
根據已知方法，諸如以大丸劑形式經靜脈內投與，或藉由經一段時間連續輸注，藉由肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、經口、局部或吸入途徑，將本文所述之抗體及抗體片段(例如，bH1-44或bH1-81或其片段)投與人類個體。若廣泛之副作用或毒性與VEGF及/或HER2拮抗作用相關聯，則特定需要局部投藥。亦可將離體策略用於治療應用。離體策略包含以編碼抗體或抗體片段之聚核苷酸轉染或轉導自個體獲得之細胞。隨後使經轉染或轉導之細胞返回至個體。該等細胞可為多種類型中之任一者，包括(但不限於)造血細胞(例如骨髓細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞、T細胞或B細胞)、纖維母細胞、上皮細胞、內皮細胞、角質細胞或肌細胞。
在一實例中，當腫瘤病症或位置允許時，局部(例如藉由直接注射)投與抗體(例如，bH1-44或bH1-81)或抗體片段，且可定期重複注射。亦可將抗體或抗體片段全身性地傳遞至個體或直接傳遞至腫瘤細胞，例如傳遞到腫瘤或在手術切除腫瘤後傳遞至腫瘤床，以預防或減少局部復發或轉移。
V.　製造物品及套組
本發明之另一項實施例為一種含有適用於治療自體免疫疾病及癌症之物質的製造物品。該製造物品包含一容器及一在該容器上或與該容器相聯之標籤或包裝插頁。合適之容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器等。該等容器可由諸如玻璃或塑膠之各種材料形成。該容器容納對治療病況有效之組合物且可具有一無菌進入孔(例如，容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈輸液袋或小瓶)。該組合物中之至少一種活性劑為本發明之多重特異性抗體或抗體片段抗體。標籤或包裝插頁指示該組合物係用於治療特定病況。標籤或包裝插頁將另外包含關於向患者投與抗體組合物之說明書。亦涵蓋包含本文所述之組合療法的製造物品及套組。
包裝插頁係指通常包括在治療性產品之商業包裝中之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投藥、禁忌及/或關於使用該等治療性產品之注意事項的資訊。在其他實施例中，包裝插頁指示該組合物係用於治療乳癌、結腸直腸癌、肺癌、腎細胞癌、神經膠質瘤或卵巢癌。
此外，製造物品可另外包含一第二容器，該容器包含醫藥學上可接受之緩衝劑，諸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可另外包括就商業及使用者觀點而言所需之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
亦提供適用於各種目的之套組，例如適用於使VEGF或HER2自細胞純化或免疫沈澱。對於分離及純化VEGF或HER2而言，該套組可含有與珠粒(例如，瓊脂糖珠粒)偶合之VEGF/HER2抗體(例如，bH1-44或bH1-81)。可提供含有用於活體外(例如以ELISA或西方墨點法)偵測及定量VEGF或HER2之抗體的套組。如同製造物品，套組包含一容器及一在該容器上或與該容器相聯之標籤或包裝插頁。該容器容納包含至少一種本發明之多重特異性抗體或抗體片段的組合物。可包括含有(例如)稀釋劑及緩衝劑或對照抗體之額外容器。標籤或包裝插頁可提供關於組合物之描述以及關於預期活體外或診斷用途之說明。
應認為，上述書面描述足以使熟習此項技術者能夠實施本發明。以下實例僅出於說明目的而提供，且不意欲以任何方式限制本發明之範疇。實際上，根據上述說明，除本文中所示及所述外對本發明之各種修改將為熟習此項技術者所顯而易見且屬於隨附申請專利範圍之範疇內。
實例 實例1.文庫設計及建構
抗體之抗原結合位點係藉由使各自含有三個用於抗原識別之CDR環的重鏈(HC)與輕鏈(LC)之可變域(VH 、VL )締合而形成。在許多情況下，兩個可變域中之一者(常為VH )決定著抗原特異性。除完整LC譜系以外具有轉殖基因HC之小鼠產生中和抗體力價(Senn等人，Eur. J. Immunol. 33:950-961,2003)。吾人著手研究抗體之雙特異性可如何出現及VH 與VL 域之不同使用能否實現雙重抗原結合特異性。
採用半經驗方法來尋求用於多樣化抗體輕鏈之胺基酸組成與CDR長度及文庫模板的設計，其中該文庫模板使得可產生功能性噬菌體呈現抗體庫且可自該抗體庫中選擇出特異性地結合至蛋白抗原之抗體。如Kabat資料庫中所示具有大約1500個人類κ輕鏈序列之CDR區的序列及長度多樣性用於引導文庫設計方法。靶向經溶劑暴露之殘基以供隨機化之用。隨機化位置之子集經定製以表示位於該等位點處之作為天然譜系之一部分的胺基酸，而剩餘位點則經隨機化以包括所有20個天然產生之胺基酸。
詳言之，如本文所述修飾下文列舉之輕鏈模板(可變域)(加下劃線之殘基已經隨機化)(SEQ ID NO:10)。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQD 28 VNTA VAWYQQKPGKAPKLLIYS 50 A SF LYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQH 91 YTT PPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
基於3個人類Fab及scFv模板產生四組文庫，其中靶向不同組之位置以供隨機化之用(圖1 )。
在所有文庫中，重鏈與其由文庫模板所確定之序列保持恆定。重鏈模板(可變域)序列列於下文中(SEQ ID NO:11)。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPINGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH
文庫設計概括於圖1 及圖2 中。所有文庫模板均含有嵌埋於CDR L1中之終止密碼子(Sidhu等人，2004)以防止在噬菌體呈現抗體庫成員之間存在模板輕鏈。模板CDR序列概括於圖3 中。
在一實例中，吾人於HER2特異性抗體之LC可變域中引入突變以識別可在保持初始結合特異性之同時結合不同蛋白抗原的變異體。吾人採取保守方法來隨機化LC CDR以便產生可穩定表現之變異體。選擇12個經溶劑暴露之LC CDR位置用於隨機化：CDR1中五個(28、29、30、31、32)、CDR2中三個(50、51、53)及CDR3中四個(91、92、93、94)。此外，為引導選定位點處之胺基酸多樣性的設計，藉由分析大約1500個人類κLC CDR序列來檢驗該等位置之天然多樣性(Johnson及Wu,Nucleic Acids Res. 28:214,2000；Chothia及Lesk,J. Mol. Biol. 196:901,1987)(圖4 )。使具有相對較高之天然多樣性之一些位置(30、31、50、92、93)完全隨機化，而其他位置則限於少至兩種胺基酸類型以模擬天然抗體。天然LC CDR1及CDR3之長度變化亦反映於文庫中(圖4 )。在圖4 中，X表示如所示以低頻率設計之胺基酸類型。藉由在殘基30與31之間及在殘基93與94之間***1至5個殘基來建構長度多樣性。
LC庫為生產性原初譜系(表1 )。所列者為在四輪選擇結束時篩檢95個隨機純系的結果。詳言之，如所述針對固定標靶(VEGF、DR5及人類Fc)進行對新結合特異性之選擇(Sidhu等人，J.Mol. Biol. 338:299,2004)。在四輪選擇之後，使用ELISA檢定95個噬菌體純系與標靶HER2及非標靶蛋白(BSA)之結合以確保特異性結合。為富集保持HER2結合之標靶結合純系，對HER2進行最後一輪選擇。對陽性純系定序。為識別最高親和性結合物，藉由競爭性ELISA測定抗原結合之IC50 (Sidhu等人，J. Mol. Biol. 338:299,2004)。展示如藉由序列分析所測定之獨特純系的數目及保持HER2結合之獨特純系(雙特異性純系)的數目。該等純系對於不相關抗原(諸如BSA)展示最低背景結合信號。
表1.輕鏈庫選擇概要
針對以下三種蛋白抗原之選擇：人類血管內皮生長因子(hVEGF)、死亡受體5(DR5)及IgG之補體結合片段(Fc)，產生多個結合純系(圖5A) 。一些純系喪失對HER2之結合親和性，而其他純系保持HER2結合且因此具雙特異性。與Herceptin抗體相比，對具有新結合特異性之131個獨特Herceptin抗體變異體的序列分析識別胺基酸取代及***(圖5B) 。
突變數目在3至17之範圍內。保持HER2結合之純系(雙特異性純系)與喪失HER2結合能力之純系相比平均含有較少之突變。保持Herceptin抗體CDR-L3序列係較佳的，但不足以保留HER2結合。此與以下報導一致：Herceptin抗體CDR-L3為對於HER2結合而言最重要之LC CDR(Kelley 及O'Connell,Biochemistry 32:6828. 1993)。代表性VEGF結合純系被表現為Fab及IgG蛋白(表2 )。
表2. 　自Herceptin抗體之輕鏈庫分離出之代表性抗體
為證明該等抗體特異性地結合至其同源抗原且不與其他蛋白質非特異性地相互作用，吾人展示對於一組哺乳動物細胞溶胞物及非抗原蛋白無可偵測之結合。該檢定證實經純化IgG或Fab之單特異性及雙特異性(圖6 )。
源自LC庫之單特異性抗體的平衡結合親和力(KD )在15至150nM之範圍內。雙特異性抗體以高nM至低μM之親和力結合新抗原(亦即，VEGF)且以低nM親和力結合HER2(表2 )。在表2中所示之抗體中，抗體bH1對兩種不同蛋白抗原VEGF(KD =300nM)及HER2(KD =26nM)展示最高雙特異性親和力。
材料
酶及M13-KO7輔助噬菌體係來自New England Biolabs。大腸桿菌XLl-Blue係來自Stratagene。牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白及Tween 20係來自Sigma。中性鏈親和素、酪蛋白及Superblock係來自Pierce。固定化蛋白G及抗M13結合之辣根過氧化酶(HRP)係來自GE Healthcare(Piscataway,NJ)。Maxisorp免疫培養盤係來自NUNC(Roskilde,Denmark)。四甲基聯苯胺(TMB)受質係來自Kirkegaard及Perry Laboratories(Gaithersburg,MD)。所有蛋白抗原係由Genentech,Inc之研究組產生。使用IUB碼表示DNA簡併，且除非另有指示，否則表示等莫耳混合物：N=A/C/G/T、D=A/G/T、V=A/C/G、B=C/G/T、H=A/C/T、K=G/T、M=A/C、R=A/G、S=G/C、W=A/T、Y=C/T。
例如，在某些隨機化位置處，由編碼所有20種天然胺基酸之簡併NNK密碼子(N=A/T/G/C，K=G/T，等莫耳比)置換野生型密碼子。XYZ密碼子係指在密碼子三聯體之每一位置處具有不等核苷酸比之密碼子。X含有38% G、19%A、26% T及17% C；Y含有31% G、34% A、17% T及18% C；且Z含有24% G及76% C。
用於文庫建構之噬菌粒載體
使用標準分子生物學技術進行載體建構。建構三個模板用於庫產生。所有模板均為基於經修飾人類化4D5(第8型)之重鏈庫中所用之質體pV0354的衍生物(Lee等人，2004a)。
藉由將2C4重鏈可變域選殖至含有鹼性磷酸酶啟動子(Lowman等人，1991)及Fab之輕鏈與重鏈兩者之stII分泌信號的pV0354-Fab-C載體中來建構2C4 Fab-C模板噬菌粒pJB0290。其被工程改造而於重鏈可變域1之C-末端含有單一半胱胺酸以允許如前所述的2C4 Fab之二價M13噬菌體呈現(Lee等人，2004b)。使用Kunkel等人之方法(Kunkel等人，1987)，藉由定點突變誘發將2C4輕鏈CDR引入Fab-C載體中。於輕鏈之C-末端添加抗原決定基標籤(gD標籤)(Lasky及Dowbenko，1984)以便如(Sidhu等人，2004)所述實現對呈現程度之測定。藉由將經高度呈現之重鏈可變域選殖至pV0354-Fab-C中而產生Fab12-G庫模板pV1283，且修飾輕鏈可變域以含有Fab-12(人類化A4.6.1，一種抗VEGF抗體)之CDR-L3。經高度呈現之VH 係選自Fab庫，該文庫使用CDR-L3轉化成Fab-12(Y91 STVPW96 ；SEQ ID NO:24)之獵槍丙胺酸掃描突變誘發(Liang等人，2006；Vajdos等人，2002)，經由針對固定抗gD抗體進行淘選來隨機化G6 Fab之重鏈CDR殘基。於M13噬菌體粒子表面上呈現二價4d5(LC-R66G)scFv之噬菌粒pV1384的設計及建構係自先前所述之模板pS2018修改而來(Sidhu等人，2004)。scFv片段在輕鏈與重鏈之間的連接子區中含有gD抗原決定基標籤。LC構架殘基Arg66經突變為Gly66，其為在95%以上天然κ輕鏈中於此位置普遍存在之殘基。如Kelley及Connell(Biochemistry 32:6828,1993)中所述，突變R66G僅使Herceptin抗體對HER2之結合親和力略微減少(<2倍)。文庫模板之CDR序列概括於圖3 中。
文庫建構
使用如(Sidhu等人，2004)所述之寡核苷酸定向突變誘發產生噬菌體呈現庫。文庫模板載體含有嵌埋於CDR-L1中之終止密碼子(TAA)，其在突變誘發反應期間使用黏接於編碼CDR-L1、CDR-L3(所有庫)、CDR-L2(L1/L2/L3-A、-B、-C、+L4-D)及輕鏈構架3(L1/L4及L1/L2/L3+L4-D)之序列上的簡併寡核苷酸來修復。根據Kunkel等人之方法(Kunkel等人，1987)進行文庫突變誘發反應。關於文庫之輕鏈CDR設計展示於圖1 中，其概括在不同文庫之每一位置處所用之簡併密碼子。對於每一CDR而言，以特定比率混合三個或四個寡核苷酸以編碼為隨機化而靶向之每一位置處的所需頻率之胺基酸類型(圖4 )。將寡核苷酸以不同比率組合以微調多樣性，從而反映天然輕鏈κ序列中所選位置處之胺基酸頻率。對於CDR1而言，以1:3:1之比率混合在位置91至94處含有密碼子之三個寡核苷酸：CAT NNK NNK RST(SEQ ID NO:25)、KMT XYZ XYZ RST(SEQ ID NO:26)或DGG XYZ XYZ RST(SEQ ID NO:27)。XYZ為NNK之變體，其在每一位點具有相等比例之A/G/T/C以減少脂族疏水性胺基酸之覆蓋範圍(Lee等人，J. Mol. Biol. 340:1073,2004)。對於CDR2而言，以1:1:2:10之比率混合在位置50至53處含有密碼子之四個寡核苷酸：NNK GST TCC NNK(SEQ ID NO:28)、TGG GST TCC NNK(SEQ ID NO:29)、KGG GST TCC TMT(SEQ ID NO:30)或NNK GST TCC TMT(SEQ ID NO:31)。對於CDR3而言，每一長度為在位置28至33處含有密碼子之三個寡核苷酸的1:1:2比率之混合物：G70 A70 C70 RTT NNK NNK TAC STA(SEQ ID NO:32)、G70 A70 C70 RTT NNK NNK DGG STA(SEQ ID NO:33)或G70 A70 C70 RTT NNK NNK NMT STA(SEQ ID NO:34)。G70 A70 C70 為允許70%的指定核苷酸及各10%的其他三種核苷酸編碼約50%之Glu及約50%之其他胺基酸的「軟」密碼子。
對大量具有κLC之代表性抗體的結構分析顯示CDR1具有最寬的構形範圍，此可能為環長度(位置24與34之間的11至17個殘基)變化之結果。不同之CDR-L1長度(長度：11至16)因此包括於文庫中。天然CDR-L3之長度亦有變化(長度：位置89至96之間的7至10個殘基)，其係由文庫設計來反映(長度：8至10；圖4) 。
圖1展示輕鏈天然多樣性與實際文庫設計之比較。將每個文庫之突變誘發產物合併於一個反應中且被電穿孔至補充有KO7輔助噬菌體之大腸桿菌SS320細胞中，且於30℃下生長隔夜(Lee等人，J. Mol. Biol. 340:1073,2004)。在每一電穿孔反應中使用約1011 個細胞及約5至10μg DNA。將文庫噬菌體純化(Sidhu等人，J. Mol. Biol. 338:299,2004)。轉型體之數目介於109 至1010 之範圍內。以ELISA結合檢定測定完整Fab或scFv於噬菌體表面上之呈現程度，其中測試96個自各文庫隨機選擇出之純系結合抗gD抗體的能力。呈現程度在5%至25%之範圍內(圖2 )。呈現抗體之純系的25%保持HER2結合。對大約150個呈現純系進行定序以便與設計多樣性相比檢驗實際文庫多樣性。由於不完全突變誘發(CDR-1中之模板終止密碼子確保所表現之scFv中此CDR 100%突變)，一部分(約30%)經功能性呈現之文庫成員保留Herceptin抗體CDR-L2及/或 CDR-L3序列。將此等者自實際文庫多樣性之序列分析中排除。在大部分隨機化位置處，呈現純系之噬菌體呈現庫的多樣性並未顯著偏離設計多樣性(p>0.05，優勢比測試(odds ratio test))。例外為CDR-L1之位置29(其中發現Val與Ile相比略微被過度表示(p=0.005))及CDR-L2之位置51與53(其中Gly及Ser分別比Ala及Tyr更普遍(p<0.01))。
實例2.評估文庫效能 文庫揀選及篩檢
當在4至5輪揀選後可分離出與各種蛋白抗原特異性結合之抗體時，則認為某一文庫係功能性的。已知多種蛋白標靶允許功能性固定以供文庫淘選之用且已自經確認噬菌體呈現庫產生特異性抗體(Fellouse等人，2005)(Lee等人，2004a)。為評估各組文庫，吾人選擇該等標靶之子集用於選擇(圖2 )。使該等文庫經受初輪結合選擇，其中抗gD抗體或蛋白L作為捕捉標靶以去除已刪除Fab/scFv基因之純系，繼而經受4至5輪抗原選擇。或者，在未經抗gD或蛋白L預先選擇之情況下使其直接經受標靶結合選擇。以抗原(5μg/ml)塗覆NUNC 96孔Maxisorp培養盤隔夜，且以交替阻斷劑阻斷1小時(圖7)。在第一選擇週期中，將1013 個噬菌體/毫升之噬菌體溶液添加至經塗覆之免疫培養盤中。在各輪選擇中，減低噬菌體濃度。在免疫培養盤上培育噬菌體溶液以允許結合至固定化抗原之後，將培養盤以PBS、0.5% Tween 20重複洗滌。為增加嚴格性，在各輪選擇中減少培育時間(第1輪4小時，第2輪3小時，第3輪3小時，第4輪2小時，第5輪1.75小時)且增加洗滌次數(圖7 )。將所結合之噬菌體以0.1M HCl溶離30分鐘且以1.0M Tris鹼中和溶離物。計算每一經抗原塗覆之免疫培養盤孔之噬菌體回收率且與未塗覆抗原之經阻斷孔的噬菌體回收率相比較以研究呈現特異性地結合標靶抗原之Fab或scFv之噬菌體純系的富集(圖7 )。使經溶離之噬菌體在大腸桿菌中擴增且用於其他輪之選擇。選擇來自第4輪及第5輪之隨機純系以供篩檢且使用噬菌體ELISA進行檢定，其中將與標靶及抗gD之結合與非相關蛋白(BSA)之結合相比較以檢驗非特異性結合。認為結合抗gD抗體及標靶但不結合非特異性蛋白之純系為特異性陽性的。庫L1/L3、L1/L4、L1/L2/L3-A、L1/L2/L3-B_1及L1/L2/L3-B_2不產生任何特異性陽性純系，而庫L1/L2/L3-C及L1/L2/L3+L4-D使分離針對標靶抗原之特異性抗體成為可能。
例如，使用噬菌體ELISA檢定第四輪之隨機純系，其中將經個別擴增之純系與標靶及HER2之結合與非標靶蛋白(BSA)之結合相比較以測試結合特異性。為富集維持HER2結合之噬菌體純系，使來自第三輪及第四輪VEGF或DR5選擇之經溶離噬菌體擴增且於經HER2塗覆之孔上經受另一輪選擇。藉由PCR擴增陽性純系之VL 及VH 區且進行定序。
hFC、hVEGF及hDR5-lf之命中率分別為63%、77%及85%。如(Sidhu等人，2004)所述藉由PCR擴增陽性純系之VL 區且進行定序。陽性特異性結合物之DNA序列分析揭示獨特純系之百分比為51%(hFC)、55%(hVEGF)及6.1%(hDR5-lf)。獨特hVEGF結合純系之序列概括於圖8 中。
hVEGF結合純系之組合培養盤及溶液選擇
觀察到繼四輪揀選後hVEGF結合純系之高多樣性。為識別高親和性hVEGF結合純系，在第四次基於培養盤之揀選後採用基於溶液之選擇方法。將50nM經生物素標記之hVEGF與自第4輪於固定化抗原上選擇而繁殖之噬菌體一起培育。於室溫下在震盪下培育2小時之後，於經中性鏈親和素塗覆且經阻斷之免疫培養盤上捕捉結合hVEGF之噬菌體，繼而重複洗滌。如前所述將噬菌體純系溶離、篩檢且定序。來自最後溶液選擇步驟之hVEGF結合純系的序列見於圖9 中。
自庫L1/L2/L3-C及L1/L2/L3+L4-D分離雙特異性純系
用於庫L1/L2/L3-C及L1/L2/L3+L4-D之文庫模板為自hu4D5抗體修改而來之scFv片段，其以高親和性結合Her2。藉由CDR區之丙胺酸掃描突變誘發定位hu4D5-5之用於Her2結合的功能性互補位，其顯示出重鏈殘基供應大部分之結合自由能，而個別輕鏈殘基之供應程度則較小(Kelley及O'Connell，1993)。對於與人類Her2-ECD複合之Herceptin抗體Fab的原子結構之分析表明，儘管輕鏈涉及產生抗原接觸，但重鏈提供大部分與抗原之結構界面(Cho等人，Nature 421:756,2003)。吾人觀察到，構建於Herceptin抗體模板上之功能性輕鏈庫的一些成員保持Her2結合能力。在嘗試自功能性庫L1/L2/L3-C及L1/L2/L3+L4-D分離能夠結合Her2以及第二抗原之雙特異性scFv片段時，使用兩種策略。在一種方法中，藉由ELISA自來自先前所述之標靶抗原選擇的陽性純系中篩檢出保持Her2結合之陽性純系。能夠結合Her2之特異性陽性純系的百分比視第二抗原特異性而變化。僅1/61之獨特hFc特異性陽性純系仍結合Her2(1.6%)，30/41之獨特hVEGF結合純系仍結合Her2(73%)，且2/5之獨特hDR5結合物仍結合Her2(40%)。此外，採用基於選擇之方法藉由自hVEGF及hDR5結合抗體池中選擇Her2結合物來分離雙特異性抗體。藉由在經Her2塗覆(5μg/ml)且經BSA阻斷之Maxisorp免疫培養盤上培育2×1013 個噬菌體/毫升1小時來使來自第4輪標靶抗原揀選之溶離物經受另一輪選擇。將培養盤以PBS、0.5% Tween 20洗滌15次，且如前所述溶離所結合之噬菌體。選擇隨機純系且檢定Her2、抗gD及標靶結合，並與非相關蛋白(BSA)之非特異性結合相比較。確認所有192種經測試之純系為特異性陽性，且如前所述進行定序。定序揭示94種獨特序列。總而言之，該方法在94種所測試之獨特純系中產生94種Her2/hVEGF雙特異性純系(100%)(圖8 )。來自兩種分離策略之所有經分離獨特hVEGF/Her2雙特異性抗體的序列概括於圖10A 及10B 中。喪失所有與Her2之可偵測結合的經分離純系之序列展示於圖11 中。在具有雙重特異性之純系中，幾乎所有純系均保留Herceptin抗體CDR-L3，此使得維持CDR-L3對於維持HER2結合至關重要成為可能。在hDR5之情況下，2/7之獨特Her2結合純系具雙特異性(29%,12個經定序純系)。雙重特異性純系之一的CDR-L3具有一些同源變化。
高產量表徵hVEGF結合純系
使用96孔格式之高產量單點競爭性ELISA(Sidhu等人，2004)來篩檢對hVEGF具高親和性之純系及研究VEGFR1阻斷概況。簡言之，於4℃下以2μg/ml hVEGF109 塗覆Maxisorp免疫培養盤隔夜，且以1%(w/v)BSA阻斷1小時。使大腸桿菌XL1-Blue中之噬菌粒純系生長於150μl補充有卡苯尼西林(carbenicillin)及M13-KO7輔助噬菌體之2YT培養液中；使培養物在震盪下於37℃下以96孔格式生長隔夜。將含有噬菌體之培養物上清液於添加或未添加用於親和性篩檢之100nM hVEGF109 的PBST(具有0.05% Tween 20及0.5%(w/v)BSA之PBS)中作五倍稀釋。對於受體阻斷篩檢而言，在VEGFR1域1-3(D1-3)及VEGFR1域2(D2)存在或不存在下培育經hVEGF塗覆之孔，然後添加經五倍稀釋之噬菌體上清液(Liang等人，2006；Wiesmann等人，1997)。在室溫(RT)下培育1小時之後，將混合物轉移至經hVEGF109 塗覆之培養盤中且培育10分鐘。將培養盤以PBT(具有0.05% Tween 20之PBS)洗滌且與於PBST中按5000倍稀釋至1nM之抗M13抗體辣根過氧化酶結合物一起培育30分鐘。洗滌培養盤，以TMB受質顯影大約五分鐘，以1.0M H3 PO4 淬滅，且在450nm下以分光光度法讀數。在單點親和性檢定中，將在溶液相hVEGF109 存在時之吸光度與在溶液相hVEGF109 不存在時之吸光度的比率用作親和性之指標。低比率將指示大部分Fab噬菌體在初始培育階段時結合至溶液相hVEGF109 ，且因此不能為固定化hVEGF109 所捕捉。頭41個獨特純系之高產量親和性檢定結果概括於圖12 中。類似地，對於阻斷檢定而言，低比率指示純系與hVEGF109 之結合由hVEGF109 -VEGFR1相互作用所阻斷，此表明某些純系在VEGF上與各自之VEGF受體片段具有重疊之結合位點(抗原決定基)(圖13A 及13B )，且該等純系可能呈現阻斷抗體。
高產量表徵雙特異性hVEGF/Her2純系
應用如前一部分中所述之相同原理來實現分離對hVEGF及Her2具有高親和性之純系以供進一步表徵之用(圖14A )。使用高產量單點競爭性ELISA，藉由以2μg/ml hVEGF109 及Her2-ECD於4℃下塗覆Maxisorp免疫培養盤隔夜，繼而以1%(w/v)BSA阻斷1小時來篩檢出對hVEGF及Her2具高親和性之純系。如前所述使在先前之單點ELISA篩檢中識別為雙特異性之噬菌體純系生長且在添加及不添加20nM Her2-ECD及50nM hVEGF之情況下培育。於室溫下培育1小時之後，將溶液施加至經塗覆之免疫培養盤且如前一部分中所述記錄及分析結合信號。選擇對hVEGF及Her2兩者具有低比率之純系以用於進一步表徵。選擇在單點競爭性ELISA中產生最低信號比之hVEGF特異性及hVEGF/Her2雙特異性噬菌體純系以及來自初始單點ELISA篩檢之DR5結合及DR5/Her2雙特異性噬菌體純系及來自組合培養盤及溶液選擇之VEGF結合純系以便藉由競爭性ELISA作親和性量測。藉由在25ml補充有卡苯尼西林及KO7輔助噬菌體之2YT培養物中於30℃下生長隔夜而自單一群落繁殖噬菌體純系。首先於PBST中連續稀釋藉由在PEG/NaCl中沈澱而純化之噬菌體且測試其與經抗原塗覆之培養盤的結合。在溶液結合檢定中使用產生50%至70%飽和信號之稀釋液，其中首先將噬菌體與增加濃度之抗原一起培育一至兩個小時，且隨後轉移至經抗原塗覆之培養盤歷時10至15分鐘以捕捉未結合之噬菌體。IC50 係以在溶液結合階段時抑制50%之噬菌體與固定化抗原結合之抗原的濃度來計算(Lee等人，2004a)。圖14B 展示可用於計算來自培養盤揀選策略之經分析hVEGF結合純系之IC50 的曲線。IC50 值在22nM至大於1μM之範圍內(圖14B )。利用組合培養盤及基於溶液之選擇而分離之hVEGF結合物的IC50 值在41nM至226nM之範圍內(圖9 )。DR5結合純系之IC50 值在20nM至大於1μM之範圍內。hVEGF/Her2雙特異性純系之IC50 值概括於圖15 中。
實例3.來自輕鏈庫之抗體之表徵 scFvs轉化為Fabs
為測試噬菌體上所呈現之scFvs'2轉化為Fabs是否影響該庫中結合純系之親和性，選擇2種純系(3-7抗hVEGF及4-1抗hDR5)用於轉化為Fab且呈現於噬菌體上。用限制酶消化所選hVEGF及DR5 scFv片段之噬菌粒DNA的VL 區，該等酶裂解編碼CDR-L1之區的DNA上游(EcoRV )及編碼CDR-L3之區的下游(Kpn I)。經消化之DNA片段藉由與M13基因-3次要外鞘蛋白之C端域融合而接合至經設計用於噬菌體呈現Fab hu4D5的經類似消化之載體(pAP2009)中(Lee等人，2004b)。所得雙順反子噬菌粒含有C端與抗原決定基(gD)標籤融合之輕鏈及C端與M13次要外鞘蛋白(p3)之基因融合之重鏈(VH 及CH 1)在鹼性磷酸酯酶啟動子控制下。第一開放閱讀框架編碼一種由stII分泌信號接著Fab4D5輕鏈(其中CDRs由3-7抗hVEGF及4-1抗hDR5 scFv'2之CDRs置換)接著gD-標籤抗原決定基組成之多肽。第二開放閱讀框架編碼一種由以下組成之融合多肽：stII分泌信號、Fab4D5重鏈、琥珀(TAG)終止密碼子、Gly/Ser連接子序列及g3蛋白之c端域(cP3)。於經M13-KO7共感染之大腸桿菌XL-1 Blue中表現導致產生呈現3-7及4-1 scFv'2之Fab變體的M13噬菌體。使用競爭性噬菌體ELISAs來估算噬菌體呈現之scFvs及Fabs對hVEGF及hDR5之親和力之IC50 值。來自兩種不同格式之資料相當一致(資料未顯示)。
為於M13噬菌體表面上呈現bH1 Fab，修飾質體pAP 2009以編碼bH1 Fab。使用bH1 Fab之變體作為庫模板，其分別在LC及HC庫之三個LC CDRs或三個HC CDRs中含有終止密碼子(TAA)。如前所述建構各別重鏈及輕鏈丙胺酸及同系物掃描庫(Vajdos等人，J. Mol. Biol. 320:415,2002)。簡併性範圍由1×105 至1×108 ，實際庫大小由6×109 至4×1010 。如上所述建構各庫。針對固定化標靶(VEGF、HER2-ECD、蛋白L或抗gD mIgG)進行兩至三輪選擇(Vajdos等人，J. Mol. Biol. 320:415,2002)。對於標靶結合，藉由噬菌體ELISA篩檢標靶結合純系，繼而進行DNA定序及序列比對以計算各位置之野生型/突變型比率。對於呈現及蛋白質摺疊效應，將VEGF及HER2結合純系之大約100個獨特序列之序列分析的比率藉由除以100個以上抗gD結合純系之序列計算之比率校正以得到F野生型/突變型 值。當僅Fab重鏈融合至噬菌體外殼時，噬菌體呈現融合至輕鏈之gD標籤指示輕鏈與重鏈適當摺疊與締合。與此一致地，與Fab輕鏈上之非線性抗原決定基結合之蛋白L亦導致與gD標籤選擇相類似之野生型/突變型比率。使用如Vajdos等人(J. Mol. Biol. 320:415,2002)中所述之式ΔΔG=RTln (Ka,野生型 /Ka,突變型 )=RTln (F野生型/突變型 )將F野生型/突變型 值轉化為ΔΔG。
使文庫結合物表現為游離人類Fab及IgG
為準確地測定抗體之親和性、特異性及其他特性，選擇在競爭ELISA實驗中展現最高親和性之各特異性組的代表性純系以用於表現為游離Fab及hIgG(圖16 )。將輕鏈及重鏈之可變域選殖至先前經設計用於大腸桿菌中之Fab表現或哺乳動物細胞中之短暫人類IgG表現的載體中(Lee等人，2004a)。藉由如(Presta等人，1997)所述使經轉型之34B8大腸桿菌細胞於完整C.R.A.P.培養基中在30℃下生長26小時而產生Fab蛋白。藉由短暫轉染293細胞來表現hIgG，且藉由蛋白A親和性層析法(Fuh等人，J. Biol. Chem. 273:11197,1998)來純化hIgG。藉由蛋白G親和性層析法純化1L大腸桿菌培養物。以PBS洗滌管柱，並以100mM乙酸溶離Fab蛋白且針對PBS透析。如前所述於蛋白A親和性管柱上，繼而藉由陽離子交換層析法純化4L大腸桿菌培養物(Muller等人，1998)。以分光光度法測定蛋白質濃度。自小規模震盪燒瓶生長物純化而得之Fab的最終產量一般為0.8至15mg/l。在小規模培養物中IgG產量為中等至高等產量，其為6.7至60mg/l(圖17 )。首先使用尺寸排阻層析法及光散射法表徵經純化之蛋白質以確保蛋白質不展現顯著的蛋白質聚集程度(<5%)。
簡言之，藉由ELISA針對結合各自之抗原篩檢所表現之Fab及hIgG。發現除一種變異體以外之所有變異體均結合其同源抗原。純系4-6在經轉化為Fab及hIgG時喪失hDR5結合能力。使用標準ELISA(H3、H4_N、H4_D hIgG)及競爭性ELISA(bH1、3-1、3-6、3-7 hIgG)測試針對較短形式之hVEGF109 而產生的所選抗VEGF純系與hVEGF165 之結合。使用G6 hIgG(Fuh等人，2006)作為陽性對照(圖18A 及18B )。如所預期，所有純系均結合hVEGF165 。
為研究蛋白質聚集程度，如同經純化之Fab及IgG，藉由尺寸排阻層析法(SEC)繼而藉由光散射(LS)分析來分析所選純系。於PBS中檢定濃度為0.5mg/ml(hIgG)及1mg/ml(Fab)之樣品。對於所有樣品而言，在既定濃度下觀察到最多5%之聚集程度(圖17 )，此係在吾人先前對於其他噬菌體呈現源性抗體所觀測到之範圍內。純系3-6及3-7在預期時間點未出現，此表明該等經重新格式化之IgG及Fab展現聚集及/或與樹脂非特異性相互作用(資料未顯示)。將該等純系自經歷進一步分析之純系集合中除去。
為排除交叉反應性及非特異性結合，吾人以標準ELISA檢定研究高濃度(100nM)之所選hIgG與一組包括全細胞溶胞物、同源抗原及同系物之固定化蛋白標靶的結合。除抗原以外，吾人固定化hVEGF之鼠類變體以測試抗hVEGF純系之交叉物種反應性。詳言之，將該組蛋白固定於Maxisorp培養盤上且以PBS中之1% BSA阻斷1小時。將hIgG(或Fab)於PBST中稀釋至100或500nM之濃度且轉移至經塗覆之培養盤。在培育1小時之後，洗滌培養盤且與結合HRP之蛋白A一起培育。藉由添加TMB受質使結合信號顯影歷時大約5分鐘，以1M H3 PO4 淬滅且於A450 下以分光光度法讀數。所測試之hIgG特異性地結合至其抗原。純系bH1及3-1展示與鼠類VEGF(mVEGF)之交叉反應性(圖19 )。
為測試雙特異性抗體bH1、H3(抗hVEGF/Her2)及D1(抗hDR5/Her2)是否能同時結合其同源抗原或該等抗原是否競爭抗體結合，以2μg/ml之濃度固定hVEGF及hDR5。將固定濃度之hIgG與Her2-ECD之連續稀釋液一起培育，繼而捕捉hIgG於固定化抗原上。在每一情況下均發現Her2-ECD結合與結合至其他抗原相競爭(圖20 )。
為準確測定IgG及Fab(亦即，自文庫分離之抗hVEGF及抗hVEGF/Her2 Fab及IgG)之親和性及研究即時結合概況，吾人使用於BIAcoreTM -3000(BIAcore,Uppsala,Sweden)機器上視所研究之分析物而定以40至300反應單位(RU)之固定化hVEGF、mVEGF、DR5及Her2-ECD CM5感應晶片進行的表面電漿共振(SPR)檢定。如(Chen等人，1999)所述進行固定化。為使二價IgG分析物之親和力效應最小化，在該等情況下使較低密度之配位體靶向於感應晶片上。以22至30μl/分鐘之速度注射大約低於預估KD (基於競爭ELISA實驗)之10倍至高於預估KD 之10倍濃度範圍內的漸增濃度之樣品，且藉由減去參考流式細胞之RU來校正結合反應。此外，對反應作雙重參考以藉由減去與樣品緩衝液(具有0.05% Tween 20之PBS)一起注射之結合配位體之流式細胞的RU來校正儀器偏差。對於Fab之動力學分析，使用1:1朗繆爾結合模型來計算k on 及k off 。在必要(高分析物濃度)時，應用具有質量轉移限制之1:1朗繆爾結合模型。對於IgG分析物，使用具有或不具有質量轉移限制之二價分析物結合模型(BIAcore評估軟體3.2)。在H3 hIgG、H4_N Fab及H4_D hIgG之情況下，對動力學結合模型之反應的擬合不令人滿意。因此，應用穩態結合分析，其中將平衡反應針對分析物濃度作圖。根據EC50 估算KD 。BIAcore結合分析之概要可見於圖21 中。發現hVEGF結合抗體3-1、3-6及3-7之親和性在奈莫耳範圍內。所分析之雙特異性抗體(bH1、H3、H4_N、H4_D)對於hVEGF顯示低微莫耳級至微莫耳級之親和性。與此對比，對於Her2之親和性在8至59nM(Fab)之範圍內。
為確定抗hVEGF結合物bH1、H3及H4_N之輕鏈是否能結合hVEGF，而與相關重鏈之序列無關，藉由將輕鏈可變域選殖至2C4 Fab表現載體pJB0524中而將輕鏈可變域移植至抗Her2 2C4 Fab上，由此置換2C4輕鏈可變域。如前所述表現Fab。bH1/2C4及H3/2C4嵌合Fab未以可偵測之量表現。分離出H4_N/2C4嵌合Fab蛋白且測試其與hVEGF(bH1初始特異性)及Her2(bH1、2C4初始特異性)之結合。藉由標準ELISA結合檢定未偵測到與hVEGF及Her2之結合(圖22 )。結果指示，bH1之重鏈為抗原結合所需。
抗hVEGF抗原決定基之比較
為了粗略地定位出hVEGF上抗hVEGF抗體之抗原決定基，吾人研究該等新分離之抗VEGF抗體與其他hVEGF結合抗體競爭及VEGF受體與已知結合位點競爭之能力(Fuh等人，2006；Muller等人，1998；Wiesmann等人，1997)。以競爭性ELISA格式進行檢定，其中以2μg/ml於Maxisorp免疫培養盤上固定VEGFR1(Flt)域1-3及抗hVEGF抗體Avastin(IgG)、B20-4.1(IgG)、G6(Fab)及KDR域1-7Fc融合蛋白。溶液競爭結合檢定使用以經純化IgG蛋白之連續稀釋液平衡之生物素標記VEGF，並以塗覆於Maxisorb培養盤上之固定化Fab或IgG捕捉未結合之生物素-VEGF且以結合抗生蛋白鏈菌素之HRP偵測(Lee等人，J. Mol. Biol. 340:1073,2004)。阻斷hVEGF與其他hVEGF結合抗體或hVEGF受體結合之抗體可能共用重疊抗原決定基。高濃度(μM)之雙特異性hVEGF/Her2結合抗體(bH1)可實現完全阻斷hVEGF與其受體(VEGFR1及VEGFR2)之結合，此表明bH1抗原決定基與VEGFR1(圖23 )及VEGFR2(圖23 )充分重疊。此外，bH1阻斷hVEGF與B20-4.1結合(圖24 )。H3、H4_N及H4_D亦阻斷hVEGF與兩種受體結合，此說明其抗原決定基與bH1類似(圖23 )。不完全的阻斷概況可能為其對於hVEGF相對較低之親和性的結果(圖21 )。與此對比，3-1即使在最高濃度(0.5μM)下亦不阻斷hVEGF與VEGFR1結合(圖23 )。此外，吾人無法偵測Avastin抗體之3-1 hIgG阻斷(圖25 )。然而，3-1 hIgG阻斷hVEGF與VEGFR2(KDR)(圖23 )以及B20-4.1(圖24 )之結合。該等結果指示，3-1與其他抗體相比具有獨特之抗原決定基。
實例4.bH1、抗hVEGF/Her2雙特異性抗體之結構-功能研究
為解釋bH1與其兩個抗原(VEGF及HER2)相互作用之性質，進行結構與功能研究。Herceptin抗體及bH1之不同之處在於CDR-L1(V29 NTA32 相對於I29 PRSISGY32 ；SEQ ID NO:35及36)及CDR-L2(S50 ASF53 相對於W50 GSY53 ；SEQ ID NO:37及38)。bH1抗VEGF/Her2基於其雙重特異性性質及其對於VEGF及Her2相對較高之親和性而被選作典型以供結構表徵。為研究VEGF及Her2上之功能性及結構性抗原決定基，吾人使與VEGF109 及hHer2胞外域複合之bH1 Fab結晶且藉由X光結晶術解析兩種複合物之結構。此外，吾人使用如(Vajdos等人，2002)所述之組合噬菌體呈現庫進行丙胺酸及同系物獵槍掃描分析。
bH1 Fab表現、純化、結晶及資料收集
如先前(Christinger等人，1996)所述表現、再摺疊及純化人類VEGF之由殘基8-109組成的受體結合部分。如先前(Franklin等人，2004；Hudziak及Ullrich，1991)所述表現及純化Her2之胞外域的殘基1-624。
對於大規模bH1 Fab製備而言，自10公升大腸桿菌醱酵獲得全細胞小球。將220公克細胞糊狀物解凍至1 L PBS、25mM EDTA、1mM PMSF中。將混合物均質化且隨後兩次通過微流化裝置(microfluidizer)。隨後將懸浮液於12k下以250ml等分試樣離心90分鐘。隨後將蛋白質以5毫升/分鐘之速度裝載至以PBS平衡之蛋白G管柱(25ml)上。將管柱以平衡緩衝液洗滌且隨後以0.58%乙酸溶離。藉由SDS PAGE檢定溶離份(資料未顯示)。將含有bH1 Fab之溶離份合併且隨後裝載至以20mM MES(pH 5.5)平衡之50ml陽離子交換SP瓊脂糖管柱(Pharmacia)上。將Fab以於平衡緩衝液中之氯化鈉梯度溶離。梯度為線性至0.5M NaCl、20mM MES(pH 5.5)。藉由SDS-PAGE識別含有Fab之溶離份(資料未顯示)且將其合併。以大約0.5M之NaCl濃度溶離出bH1 Fab。藉由量測A280 測定Fab濃度。bH1 Fab之最終產量為67mg/l醱酵物生長。
藉由以2:1莫耳比混合經純化之bH1 Fab與VEGF或Her2 ECD而獲得複合物，且對於VEGF-Fab複合物而言於25mM Tris-HCl(pH 7.5)及0.3M氯化鈉中藉由尺寸排阻層析法(SP-200,Pharmacia)純化且對於Her2 ECD-Fab複合物而言以25mM Tris-HCl(pH 8)及0.15M氯化鈉純化。藉由SDS PAGE檢驗所得複合物之組成(資料未顯示)。將蛋白質複合物濃縮且用於結晶試驗中。在bH1-VEGF複合物之情況下，於19℃下使用蒸氣擴散方法之初始懸滴實驗於1週內自14種不同條件產生小同型晶體。於一週內在4種條件下出現bH1-Her2複合物之晶體。在每種情況下選擇來自一種條件之晶體用於進一步最優化。
對於bH1 Fab-VEGF(8-109)之結晶而言，將等體積之蛋白質複合物溶液(10.6mg/ml蛋白質、300mM NaCl、25mM Tris-HCl(pH 7.5))與含有0.15M D,L-蘋果酸(pH 7.0)、20% PEG3350 之結晶緩衝液混合，且於19℃下平衡。在24小時後出現屬於具有a=100.6、b=198.0、c=77.7之晶胞尺寸的空間群C2221 之大晶體。晶體形式於不對稱單元中含有1個Fab及1個VEGF單體。在資料收集之前，藉由在於人造母液中含有5%、10%及15%甘油的液滴之間轉移，繼而於液氮中急驟冷凍來冷凍保護晶體。以高級光源(Advanced Light Source)(Berkeley)之光束線5.0.1針對2.6收集資料。
藉由將蛋白質溶液(11mg/ml、25mM Tris(pH 8)及150mM氯化鈉)與含有25% w/v PEG2000 、0.1M MES(pH 6.5)之結晶緩衝液混合而獲得bH1 Fab-Her2(1-624)之晶體。在12小時後出現屬於具有a=62.3、b=115.1、c=208.2之晶胞尺寸的空間群P21 21 21 之晶體。晶體於不對稱單元中含有一種Her2-Fab複合物。在資料收集之前，將晶體以20%乙二醇作為冷凍保護劑於液氮中急驟冷凍。以高級光源(Berkeley)之光束線5.0.1針對2.9收集資料。
資料處理、結構確定及改進
使用Denzo及Scalepack(Otwinowski，1997)處理資料。藉由Phaser(L. C. Storoni，2004；Read，2001)解析bH1 Fab複合物之結構。使用VEGF之座標自先前所述之VEGF-Fab複合物(2FJG)及含有Herceptin抗體Fab-Her2複合物(1N8Z)之可變域VL /VH 或恆定域CH1 /CL 的Fab片段解析bH1-Fab-VEGF(8-109)複合物。當解析bH1-Her2結構時，使用Her2之片段及來自Her2-Fab複合物1N8Z之Herceptin抗體Fab的可變域作為搜尋模型。使用Herceptin抗體Fab恆定部分作為搜尋模型(1N8Z)不能發現bH1 Fab之恆定域，且必須藉由Herceptin抗體Fab-Her2複合物結構引導來手動對接。分別使用程式Refmac(Collaborative Computational Project，1994)及Coot(Emsley及Cowtan，2004)進行模型建立及改進。使用MolProbity(Lovell等人，Proteins 50:437(2003))分析立體化學參數。對於Fab-VEGF複合物而言將結構改進為R值 =0.22及R自由 =0.27，且對於Fab-Her2複合物而言將結構改進為R值 =0.25及R自由 =0.31。對與VEGF以及Her2-ECD複合之bH1 Fab的晶體結構建模。某些bH1 Fab殘基在抗原之4.5、4.0及3.5以內。相同抗體上兩個抗原之兩個互補位(抗體上與抗原產生接觸之區域)明顯重疊且來自輕鏈及重鏈兩者之殘基涉及與兩抗原之結合。bH1結合VEGF上與Avastin抗體類似之抗原決定基，且bH1結合與Herceptin抗體基本相同之抗原決定基上的Her2。
分別以2.9及2.6之解析度測定與HER2胞外域(ECD)(殘基1-624)及VEGF受體結合域(殘基8-109)結合之bH1 Fab的晶體結構(圖26及表3 )。圖26 顯示與Herceptin抗體/HER2複合物疊加之bH1 Fab/HER2晶體結構及bH1 Fab/VEGF複合物之晶體結構。
表3. 結晶學研究
在bH1/HER2複合物中，Fab以類似於Herceptin抗體之方式結合至HER2之域IV(Cho等人，Nature 421:756,2003)；該兩種複合物以2.3之Cα位置的均方根偏差(r.m.s.d.)疊加。在VEGF複合物中，bH1識別與VEGF受體(VEGFR1及VEGFR2)之結合位點及其他VEGF抗體之結合位點重疊的抗原決定基(Wiesmann等人，Cell 91:695,1997；Muller等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:7192,1997)。與此相一致的是，觀察到bH1阻斷VEGF與其受體結合(圖27 )。對於圖27 中所示之資料而言，以漸增濃度之IgG(x軸)平衡經生物素標記之人類VEGF165 。於固定化VEGFR2-ECD Fc融合蛋白上捕捉未結合之hVEGF165 且以分光光度法偵測(於450nm下之光密度，y軸)。
如圖28 中所示，bH1上VEGF及HER2之結合位點廣泛重疊。十四個咬合HER2之殘基中之十二個亦接觸VEGF。兩個結合位點包括來自HC以及LC之CDR殘基。在HER2複合物中，LC及HCCDR供應大致相等之抗原接觸區域(分別為53%及47%)，而在VEGF複合物中，LCCDR構成接近70%之包埋表面(圖29 )。Herceptin抗體及bH1上之HER2結合位點類似，且不同之處僅為CDR-L1及-L2區，其中在bH1中Herceptin抗體序列不保守(圖28 )。在圖28 中，根據由VEGF或HER2包埋之程度遮蔽bH1或Herceptin抗體Fab表面上之殘基(深色陰影及白色文字>75%包埋，中度陰影及白色文字50-75%包埋，淺色陰影及黑色文字25-49%包埋)。加下劃線之殘基在bH1與Herceptin抗體之間有所不同。白色虛線展示輕鏈與重鏈之分隔。
與HER2複合之bH1 Fab的構形明顯類似於結合VEGF之Fab的構形(r.m.s.d.=0.7,Cα)。兩種bH1 Fab結構之CDR彼此良好疊加，且與母體Herceptin抗體Fv及bH1Fv(HER2)r.m.s.d.=0.6、Herceptin抗體Fv及bH1Fv(VEGF)r.m.s.d.=1.2良好疊加。CDR-L1為一例外且兩種複合物結構顯著不同；偏差為4.6(殘基27-32之Cα)。圖30 顯示與VEGF結合之bH1 Fab的CDR構形與結合HER2之bH1及Herceptin抗體明顯類似，例外之處為CDR-L1。圖30 為作為結合VEGF之bH1(深色陰影)、結合HER2之bH1(白色)及結合HER2之Herceptin抗體(淺色陰影)之管的CDR環之疊加。CDR-L1環展現兩種bH1結構之顯著不同的構形(對於bH1殘基27-32而言，r.m.s.d.Cα =4.6)(圖31 )。在HER2複合物中，CDR-L1最小程度地涉及於抗原相互作用中且環之一部分(殘基28-30b)顯現具可撓性。對於VEGF結合而言，整個環係充分結構化的且佔由VEGF包埋之表面積的26%。
CDR-L1中之兩個殘基(Ile30c及Tyr32)具有不同構形且在bH1與HER2或VEGF之結合中具有不同作用。在HER2複合物中，Ile30c之側鏈包埋於由CDR-L1及CDR-L3殘基形成之疏水性核心中。在VEGF複合物中，該側鏈與VEGF形成疏水性接觸。Tyr32之Cα在兩種結構中位於相同位置，但其側鏈旋轉了約130度。在HER2複合物中，Tyr32與受體疊靠，而在VEGF複合物中，側鏈與Ile29一起形成疏水性核心且支撐CDR-L1及CDR-L3之構形。CDR-L1構形藉由Tyr32與LC構架殘基G1y72之間的氫鍵而進一步穩定化。結構分析證實Tyr32對於VEGF結合而言係重要的，此係因為不允許突變為丙胺酸或***酸。與VEGF結合相反,Tyr32突變為丙胺酸(恢復為Herceptin抗體殘基)對於HER2結合而言為較佳的。兩種複合物之疊加表明VEGF在其HER2結合態時將會與CDR-L1之Tyr32碰撞(clash)(圖31 )。在圖31 中，殘基Tyr32、Ile30c、Ile29及G1y72之側鏈顯示為棒狀。具有高於平均值之溫度因數的殘基係以較深陰影顯示(殘基28-30b)。Tyr32與G1y72之間的氫鍵鍵結係以虛線來顯示。
以上結果指示，重排CDR-L1之能力對於bH1之雙特異性而言係必需的。已顯示CDR-L1之類似構形靈活性在天然抗體之抗原識別中具有作用(Jimenez等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:92,2003；Mylvaganam等人，J. Mol. Biol. 281:301,1998)。圖26、28、30、31及32 係使用PYMOL(DeLano Scientfic,San Carlos,CA)由晶體結構座標而產生(PDB碼，3BDY、3BE1、1N8Z)。
bH1獵槍掃描
為研究bH1Fab之抗原結合位點，使用噬菌體呈現Fab庫進行獵槍掃描組合突變誘發(Vajdos等人，J. Mol. Biol. 320:415,2002；Weiss等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:8950,2000)。針對抗原(hVEGF及Her2-ECD)作結合選擇以分離功能性純系，繼而進行DNA定序使得可計算每一變化位置處之野生型/突變型比率(Vajdos等人，2002)。隨後使用該等比率來確定每一經掃描側鏈對VEGF及Her2結合之貢獻。該等結果使得可定位用於結合VEGF及Her2之功能性互補位。
bH1獵槍庫設計
使用噬菌體呈現庫掃描CDR中經溶劑暴露之殘基，其中可允許野生型殘基變為丙胺酸或野生型(丙胺酸掃描)或變為同系物殘基或野生型(同系物掃描)。遺傳密碼之性質需要在文庫中除Wt/丙胺酸或Wt/同系物殘基以外包括一些其他取代(圖33 )。建構獨立之重鏈及輕鏈丙胺酸及同系物掃描文庫。該等文庫顯示於圖34中。簡併係在1.3×105 至1.3×108 之範圍內且實際文庫尺寸係在6×109 至4×1010 之範圍內。
建構獵槍掃描庫
如上所述，為使得可於M13噬菌體表面上呈現bH1 Fab，使用標準分子生物學技術修飾先前所述之經設計於與M13基因-3次要外鞘蛋白之C-末端域融合之噬菌體上呈現hu4D5Fab的質體AP2009以編碼bH1Fab。輕鏈之C-末端含有抗原決定基(gD)標籤。使用bH1 Fab之「終止模板」變型作為文庫模板(Sidhu等人，2004)。輕鏈丙胺酸及同系物掃描庫於CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中具有終止密碼子，且重鏈丙胺酸及同系物庫於每一重鏈CDR中含有終止密碼子。藉由先前所述之方法(Sidhu等人，2004)使用Kunkel突變誘發(Kunkel等人，1987)於各自之終止模板上建構文庫。
文庫選擇
向NUNC 96孔Maxisorp免疫培養盤塗覆5μg/ml捕捉標靶(hVEGF109 、Her2-ECD或抗gD mIgG)且以於PBS中之1%BSA(w/v)阻斷。如(Lee等人，2004a)所述以KO7輔助噬菌體(NEB)繁殖上述文庫之噬菌體。將文庫噬菌體溶液以每毫升1013 個噬菌體粒子之濃度添加至經塗覆之培養盤且於室溫下培育1至2小時。將培養盤以PBST洗滌8次且繼而以0.1M HCl溶離所結合之噬菌體歷時30分鐘。如前所述測定每一輪選擇之後的富集。在2輪標靶選擇之後，對於所有文庫均觀測到50至1000倍之富集，而除在hVEGF上揀選之LC-Ala及LC-Hom以外，後兩者顯示5至10倍之富集。如(Sidhu等人，2004)所述選擇每一文庫中展現50至1000倍富集之大量隨機純系用於定序。以噬菌體ELISA(Sidhu等人，2000)就hVEGF結合而言篩檢庫LC-Ala。選擇展現超出經BSA塗覆之對照培養盤上之信號至少兩倍的hVEGF ELISA信號之純系用於定序。使LC-Hom庫針對hVEGF經受另外1輪選擇，繼而進行噬菌體ELISA篩檢及VEGF結合純系之定序。
DNA序列分析
將來自不同標靶選擇之每一文庫的高品質序列轉譯且加以比對(資料未顯示)。每一文庫中經受分析之序列數目概括於下文表4 中。
表4. 所分析之序列數目
計算每一變化位置處之野生型/突變型比率(圖35 及圖36 )，因此可允許計算出所列之F野生型/突變型 值(圖35 及圖36 )，其係藉由如(Vajdos等人，2002)所述將來自標靶選擇之比率除以來自呈現選擇之比率而經校正以用於呈現。大於1之F野生型/突變型 值指示在此位置處Wt較佳，且小於1之F野生型/突變型 指示突變較佳。F野生型/突變型 >5指示其在抗原結合中之重要作用。每一經掃描CDR殘基之重要性展示於圖37A-37D 中。結果表明，來自重鏈及輕鏈兩者之殘基積極地有助於兩種抗原(Her2及hVEGF)結合之結合。將bH1輕鏈及重鏈殘基對Her2結合之影響與其母體抗體hu4D5之影響相比較(Kelley及O'Connell，1993)(圖38 )。
圖39A 及圖39B 顯示就與VEGF及HER2結合而言對bH1 Fab之獵槍丙胺酸掃描及同系物掃描結果。丙胺酸突變(m1)或額外突變(m2、m3；由於獵槍-丙胺酸密碼子之限制)或同源胺基酸突變(m4)之效應係以野生型與突變體(wt/mut)在結合至人類VEGF(圖39A )或HER2(圖39B )之純系中的出現比率來計算。在僅出現野生型殘基之情況下，比率係顯示為大於「>」野生型計數。胺基酸取代(m1-m4)之識別碼係顯示為F值上之上標。當野生型殘基為丙胺酸時，其經甘胺酸取代(m1)。「*」指示在VEGF或HER2複合物形成後bH1殘基被包埋的程度(*25-49%之可及面積被包埋，**50-75%之可及面積被包埋，***大於或等於75%之可及面積被包埋)。
顯著有助於能量相互作用之殘基組成功能性互補位，其構成結構結合位點之子集。與抗原接觸位點之間的廣泛重疊相反，該兩個功能性互補位顯示有限重疊(圖32及40 )。詳言之，基於獵槍掃描突變誘發，對於VEGF(圖40A )或HER2(圖40B )結合而言針對丙胺酸(黑條)或同源胺基酸(白條)之各突變對ΔΔG值(y軸，kcal/mol)作圖。「」表示下限，因此在此位置處未觀測到突變。「*」指示在VEGF或HER2複合物形成後bH1殘基表面積被包埋的程度(*25-49%包埋，**50-75%，***>75%)。VEGF結合相互作用係以CDR-L1之Tyr32及CDR-L3之His91作為核心熱點主要由LCCDR來介導(ΔΔGwt/ala >1.5kcal/mol)。HER2結合主要由HCCDR供應。圖32 顯示bH1及Herceptin抗體殘基基於其功能重要性而以陰影顯示於Fab表面上時之晶體結構(對於丙胺酸突變而言，深色陰影及白色文字，；中度陰影及黑色文字，；淺色陰影及黑色文字，。如圖28 中，黑色虛線勾勒出接觸區域之輪廓。白色虛線展示輕鏈與重鏈之分隔。
對於VEGF結合及HER2結合而言，功能性互補位殘基分布在HC與LC之間，此表示兩條鏈之協同性。CDR-H3之Trp95為該兩種相互作用之唯一共同的熱點殘基(ΔΔGwt/ala >1.5kcal/mol)。如上所述，VEGF結合相互作用主要係由LCCDR介導，而HER2結合係由HCCDR所支配。與Herceptin抗體相比，具有較弱HER2結合親和性(300倍)之bH1保持與HER2結合相同之核心熱點殘基(Arg50、Trp95及Tyr100a)，而周邊殘基之重要性得以重新分配(圖32 )。總之，重鏈中供應hu4D5/Her2結合之大部分重要側鏈對於bH1/Her2結合仍為重要的(ΔΔG>1.5kcal/mol)。該等為一些改變。輕鏈殘基在供應中具有更多改組-一些殘基變得較不重要且一些變得更為重要。總之，功能性位點為bH1-VEGF及bH1-Her2複合物之晶體結構的結構界面之一部分。
簡而言之，藉由使能量相互作用中之獨特的一組bH1殘基與每一抗原咬合來表徵bH1與兩個結構上無關的大蛋白質之相互作用。儘管兩種不同抗原之兩個廣泛重疊結合位點之大部分展現單一構形，但一個CDR環(L1)之可撓性有利於容納HER2及VEGF兩者。其機制使人聯想到在結合無關小半抗原或肽之多重特異性抗體中觀測到之分子多樣性。先前研究描述由小配位體在單一抗體構形之空間獨特區之差分定位(Sethi等人，Immunity 24:429,2006)或由抗原結合位點之多重預存在構形(James等人，Science 299:1362,2003)所介導的多重特異性。藉由有限LC突變可如何產生結合兩種無關蛋白抗原之抗體的方式進一步突顯出抗體分子在抗原識別中之多樣性。
bH1親和性成熟
為了研究在結構及功能結果成為可用之前是否可藉由最優化輕鏈序列來增加bH1之VEGF結合親和性，建構一文庫，其中使基於h4D542 Fab(假定其極類似bH1 Fab)之晶體結構(Eigenbrot等人，2001)位於溶劑高度可及位置處之CDR殘基多樣化。允許所靶向殘基變為野生型或少數同源殘基(圖34 )。如「建構獵槍掃描庫」部分中所述建構文庫。如所述，使用基於溶液之選擇方法來選擇較高親和性之VEGF-結合物。進行兩輪基於溶液之選擇。在每輪選擇中藉由使經生物素標記之VEGF的濃度自第一輪中之50nM減少至第二輪中之20nM來增加嚴格性。對來自最後一輪選擇之138個純系進行定序。發現大部分純系係獨特的。使用利用固定化VEGF(8-109)、抗gD抗體及Her2-ECD之高產量ELISA檢定來識別與VEGF、Her2-ECD及抗gD mIgG結合但不與BSA結合之純系。以抗gD ELISA信號校正VEGF-ELISA結合信號以估算VEGF結合純系之相對親和性。選擇具有高VEGF/抗gD比率之純系用於進一步表徵。如前所述，如同噬菌體呈現之Fab，藉由競爭ELISA估算所選純系對VEGF及Her2之親和性。與母體bH1純系相比，bH1變異體顯示改良之VEGF結合親和性。有趣的是，即使不對Her2進行基於親和性之選擇，某些純系對於Her2結合仍具有略微改良之IC50 值。此表明有可能就VEGF結合而言在不顯著影響Her2結合能力之情況下使bH1純系親和性成熟。存在一些與母體bH1純系相比顯示降低之Her2結合親和性的VEGF親和性改良純系。此結果指示，儘管根據bH1-Her2複合物結構及獵槍丙胺酸掃描分析，存在以下事實：重鏈為結合能之主要貢獻者，但輕鏈仍積極地有助於bH1對Her2之結合能力。經表徵純系之序列及IC50 值概括於圖41 中。大部分序列為獨特的發現表明，該等變異體之輕鏈序列尚未針對VEGF結合而被完全優化，且有可能藉由其他輪之選擇來進一步親和性改良bH1純系。
如表5 中所示，單一Fab對於兩個抗原之親和性顯著改良係可達成的且通常係能實現的。舉例而言，人類VEGF之KD 自250(bH1；IgG)增加至41(bH1-81；IgG)或16nM(bH1-44；IgG)，且HER2之KD 自21(bH1；IgG)增加至7(bH1-81；IgG)或1nM(bH1-44；IgG)。
藉由在bH1之HC及LC CDR中引入突變來改良親和性。根據關於本文所述之VEGF及HER2之功能性互補位的資訊來選擇位置。如本文所述，藉由選擇及篩檢噬菌體呈現庫以兩步驟分離bH1變異體。藉由基於親和性選擇所述輕鏈同系物獵槍掃描庫來分離經改良之純系bh1-81。在第二步驟中，藉由隨機化bH1-81之殘基自文庫中分離最高親和性純系(bH1-44)。詳言之，寡核苷酸係設計成使bH1-81之HC及LC中之各位點(表5)隨機化以於每一位置處編碼約50%野生型及50%所有其他19種胺基酸(Gallop等人，Journal of Medicinal Chimistry 37:1233,1994)。
對於Fab片段及IgG抗體量測bH1親和性改良變異體之KD (表5 )。Fab片段及IgG抗體分別表現於大腸桿菌及293細胞中，且如本文所述加以純化。如Lee等人(J. Mol. Biol. 340:1073,2004)中所述，使用利用BIAcore3000之表面電漿共振(SPR)量測來測定Fab片段及IgG抗體之結合親和力。為研究單價Fab片段形式之抗體的親和性，將抗原(hVEGF109 、鼠類VEGF102 及HER2 ECD)以低密度固定於BIAcore CM5晶片上。使Fab片段之連續稀釋液與固定化抗原接觸且藉由SPR量測結合反應。使用1:1朗繆爾結合模型來計算k on 、k off 及KD 。為測定IgG抗體之KD ，藉由固定化之抗Fc抗體於BIAcore CM5晶片上捕捉IgG，且暴露於hVEGF109 、鼠類VEGF102 及HER2-ECD之連續稀釋液中。對於HER2而言，使用簡單的1:1朗繆爾結合模型來測定KD ，而VEGF需要二價分析物模型。所有實驗均在30℃下進行。
表5 以粗體顯示隨機化位置且概述bH1、bH1-81及bH1-44之CDR序列(SEQ ID NO:1-9及39-41)及其親和性(如藉由表面電漿共振所測定)。
表5. 具有經改良雙重親和性之bH1的變異體
藉由BIAcore量測抗體對人類VEGF109 、鼠類VEGF102 及HER2 ECD之單價親和性。表5顯示各結合相互作用之代表性解離常數(Kd )。在BIAcore實驗中使用VEGF(VEGF109 )之受體結合片段，此係因為bH1變異體在溶液競爭實驗中以類似親和性結合全長蛋白(VEGF165 )及VEGF109 (資料未顯示)。使用不同檢定格式及評估模型來計算如本文所述之Fab片段/IgG抗體之Kd 。不同檢定/評估格式對於個別相互作用產生一致之解離常數。
實例5.以細胞檢定分析IgG活性
為確定bH1及3-1抗體是否能抑制hVEGF165 誘發之人類臍靜脈內皮(HUVEC)細胞之增殖，以增殖檢定對其進行測試。如(Fuh等人，J. Biol. Chem. 273:11197,1998)所述使人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)(Cambrex,East Rutherford,NJ)生長且加以檢定。在96孔細胞培養盤之每一孔中塗覆大約4000個HUVEC且於補充有1.0%(v/v)胎牛血清之杜氏改良依格氏/F-12培養基(1:1)(檢定培養基)中培育18小時。首先以可刺激次大DNA合成之VEGF量滴定具有固定量VEGF(0.2nM最終濃度)之新鮮檢定培養基，且隨後將增加濃度之抗VEGF抗體(例如，bH1)添加至細胞中。在37℃下培育18小時之後，對細胞以每孔0.5μCi[3 H]胸苷作脈衝處理24小時，且加以收集以便以TopCount微定量盤式閃爍計數器(TopCount Microplate Scintillation counter)計數。結果表明3-1及bH1兩者均可藉由防止hVEGF誘發之信號傳導及隨後之增殖來抑制VEGF誘發之HUVEC細胞生長。使用Avastin抗體(抗VEGF)作為陽性對照且使用Herceptin抗體作為陰性對照(圖42 )。
為研究雙特異性抗Her2/VEGF抗體與表現於哺乳動物細胞上之Her2的結合，藉由流動式細胞測量術研究bH1及bH3抗體與過度表現Her2之NR6纖維母細胞(NR6-Her2)之結合。將一百萬個NR6-Her2細胞與100μg/ml Fab及IgG一起培育1小時，繼而與結合Alexa488之鼠類抗人類IgG抗體一起培育1小時。作為陰性對照，研究Fab及IgG與非表現性NR6細胞之結合。如圖43 中所表明，如同Fab及IgG，bH1及bH3特異性地結合至NR6細胞上之Her2。
圖44 顯示bH1與VEGF或HER2之競爭性結合實驗的結果。bH1雖然由於其親和性降低因此與Herceptin抗體相比效率較低，但在培育5天後其以200nM之IC50 (此與其300nM之親和性相一致)抑制VEGF誘發之人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的增殖，且抑制表現HER2之乳癌細胞株BT474的增殖，(圖45 )。HerceptinIgG抗體及貝伐單抗(抗VEGF)用作對照物。如圖45 中所示，bH1-81及bH1-44抗體以與bH1相比較大之程度抑制VEGF誘發之HUVEC細胞的增殖及BT474細胞之生長。bH1變異體之效能增加與其相對親和性相關。最高親和性變異體(bH1-44)分別以類似於貝伐單抗或Herceptin抗體之效能抑制HUVEC及BT474細胞之生長。
為進行該等實驗，以增加濃度之人類IgG處理經VEGF刺激之HUVECs，在培育兩天後如Liang等人(J. Biol. Chem. 281:951,2006)中所述測量增殖抑制作用。將乳癌細胞BT474培養於補充10% FBS之RPMI培養基中。對於檢定，於96孔培養盤之每個孔中塗覆104 個細胞，且於37℃下培育隔夜(18小時)。向細胞中添加增加濃度之人類IgG。隨後細胞於37℃下培育五天，繼而根據製造商說明書添加10% AlamarBlue(Biosource International,Camarillo,CA)。在6小時之後藉由測量螢光信號來測定對HER2表現細胞增殖的抗體依賴性抑制作用。
實例6.結合特異性之分析
測定源自LC庫之抗體的結合特異性。藉由ELISA檢定與各種固定化純化蛋白質或細胞溶胞物(包括同源抗原)結合之IgGs。將抗原固定且與15μg/mL濃度之hIgG一起培育一小時。以分光光度法偵測所結合之IgG(450nm下之光密度；y軸；圖46 )。檢定中所包括之蛋白質為(圖46 中自左至右)：血管內皮生長因子A(VEGF)、鼠類血管內皮生長因子(鼠類VEGF)、血管內皮生長因子C(hVEGF-C)、血管內皮生長因子D(hVEGF-D)、HER2胞外域(HER2 ECD)、表皮生長因子受體胞外域(hEGFR)、ErbB3/HER3胞外域(HER3 ECD)、人類死亡受體5(hDR5)、牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、胎牛血清(FBS)、中性鏈親和素、5%牛奶、小鼠纖維母細胞溶胞物、及添加有hVEGF-A或HER2 ECD之小鼠纖維母細胞溶胞物。在圖46 中，誤差條表示兩次重複之標準誤差平均值(SEM)。未測抗體bH3、3-1、bD1、bD2、4-1及4-5與鼠類VEGF、HER3 ECD、中性鏈親和素、5%牛奶、添加有hVEGF-A之細胞溶胞物、及添加有HER2 ECD之細胞溶胞物的結合。
亦測定各種抗體(Avastin抗體、Herceptin抗體、bH1、bH3、bH4、bH1-81及bH1-44)阻斷VEGF與VEGF受體結合之能力(圖47 )。以增加濃度之IgG(x軸)平衡生物素化之人類VEGF165 (圖47A )或鼠類VEGF164 (圖47B )。未結合之VEGF捕捉於固定化人類VEGFR2-ECD Fc融合蛋白上且以分光光度法偵測(於450nm下之光密度，y軸)。亦觀測VEGFR1之類似抑制作用。抗VEGF抗體阻斷VEGF與VEGF受體結合。
顯示抗原VEGF及HER2在溶液中競爭結合至bH1-44雙特異性IgG抗體(圖48 )。將濃度為0.1nM之人類bH1-44 IgG抗體與0.1nM經生物素標記之人類VEGF165 一起在增加濃度之HER2 ECD存在下培育。藉由以抗生蛋白鏈菌素-HRP偵測之固定化抗人類Fc及bH1-44結合之生物素-VEGF來捕捉bH1-44。使用結合HER2上之非重疊抗原決定基之鼠類抗HER2抗體，繼而使用結合HRP之山羊抗小鼠IgG來偵測與經捕捉之bH1-44結合之HER2 ECD(圖48A )。將濃度為0.2nM之人類bH1-44 IgG與0.6nM經生物素標記之HER2一起在增加濃度之人類VEGF165 存在下培育。藉由以抗生蛋白鏈菌素-HRP偵測之固定化抗人類Fc及bH1-44結合之生物素-HER2來捕捉bH1-44(圖48B )。
亦藉由使用FACS(螢光活化細胞揀選(Fluorescence Activated Cell Sorting)；圖49 )來偵測bH1及bH1-44與細胞之特異性結合。雙特異性抗體(bH1及bH1-44)結合至表現HER2之小鼠纖維母細胞(NR6)細胞(圖49B )，但不結合至HER2陰性NR6細胞(圖49A )。將50萬至100萬之細胞與15μg/mL hIgG一起於冰上培育一小時。使用二次螢光PE結合之山羊抗人類IgG偵測與細胞結合之一次抗體。使用FACS Calibur流式細胞儀分析細胞。bH1及bH1-44不與HER2之大鼠直系同源物交叉反應，此係因為未偵測到與經大鼠neu轉染之小鼠纖維母細胞(HER2之大鼠直系同源物)的結合。
為進一步表徵bH1抗體變異體bH1-81及bH1-44之特異性，進行免疫沈澱實驗且顯示bH1抗體變異體特異性地使VEGF或HER2而非其他蛋白質自小鼠纖維母細胞(NR6)溶胞物中免疫沈澱出來(圖50 )。對NR6細胞作非特異性生物素標記，作溶胞處理且經細胞膜蛋白清潔劑溶解。將對應於每毫升5百萬至一千萬個細胞的NR6細胞、添加有0.1μg/mL經生物素標記之VEGF165 之NR6細胞或過度表現HER2之NR6細胞的細胞溶胞物與15μg/mL抗體一起培育。使用經蛋白A塗覆之瓊脂糖珠粒捕捉抗體且溶離所結合之蛋白。藉由SDS-PAGE分離所溶離之蛋白質。將對應於大約25至50,000個細胞之細胞溶胞物及來自大約12萬至25萬個細胞之免疫沈澱物裝載至凝膠上。藉由西方墨點法(Western blotting)使用抗生蛋白鏈菌素-HRP偵測所捕捉之經生物素標記之蛋白質。
實例7.以活體內檢定分析IgG活性
為評估該等抗體之活體外雙重活性是否可轉化為相應之活體內活性，吾人採用已知對抗VEGF抗體(Colo205，一種結腸直腸癌細胞株)或Herceptin抗體(BT474M1，乳癌細胞株)處理具反應性之小鼠異種移植腫瘤模型。詳言之，在nu/nu小鼠中使用Colo205異種移植物且在米色裸XID小鼠中使用BT474M1異種移植物。所有動物研究均符合美國實驗動物照護評鑒協會(American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care)及Genentech之實驗動物管理與使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)之準則。
詳言之，將BT474M1(內部)及Colo205(ATCC,Manassas,VA)細胞培養於RPMI培養基/10%胎牛血清中。將懸浮於漢克氏緩衝鹽溶液(Hank's Buffered Salt Solution，HBSS)及基底膠(matrigel)(1:1)混合物中之5×106 個BT474M1細胞注射至經皮下植入***小球之Harlan米色裸XID小鼠(Indianapolis,IN)的***脂墊中。對於Colo205異種移植物而言，將於HBSS中之5×106 個Colo205細胞經皮下注射至Charles River nu/nu小鼠(Hollister,CA)中。當平均腫瘤尺寸達到約200mm3 時，將小鼠隨機分為7組，每組8隻小鼠(BT474M1)或10隻小鼠(Colo205)。每週一次經腹膜內投與抗體。每週兩次量測腫瘤尺寸。根據V= 0.5ab2 計算體積(a為腫瘤之最長尺寸且b垂直於a)。統計學評估使用單因子分析，繼而使用雙尾學生t 測試(two-tailed studentt test)。由於多重比較而引起的對α量之調整(Bonferroni)並未改變吾人結論之意義。部分反應(PR)係定義為與V0相比腫瘤體積減少50%至99%之反應。在第一次及第三次處理後7天收集血清樣品。使用ELISA測定人類抗體之濃度。將驢抗人類IgG Fc固定於免疫培養盤上。將血清及抗體標準物之稀釋液於培養盤上培育2小時。藉由結合辣根過氧化酶之山羊抗人類IgG Fc，繼而藉由TMB受質/1M磷酸偵測所結合之抗體。於450/620nm下讀取培養盤。使用4參數演算法確定樣品濃度。
將bH1-44處理組與經抗VEGF(B20-4.1)(Liang等人，J. Biol. Chem. 281:951,2006)、Herceptin抗體或組合(Herceptin抗體+抗VEGF)處理之組相比較以進一步確定bH1-44抗體能夠抑制VEGF及HER2介導之腫瘤生長。在所有組中，在開始處理後7天，抗體以高含量(藉由ELISA評估)存在於來自Colo205異種移植物之血清中，此指示正常藥物動力學(表6 )。
表6. 抗體血清含量
每週以10mg/kg投與之bH1-44與對照抗體相比抑制Colo205腫瘤生長(p<0.0001,n=10)，其功效與抗VEGF(每週10mg/kg)類似，而Herceptin抗體對Colo205生長無影響(p=0.12,n=10)。如所預期，組合治療顯示與單獨抗VEGF類似之功效。以每週10及20mg/kg投與之bH1-44抗體產生劑量依賴性反應。在BT474M1模型中，在經bH1-44抗體(每週10mg/kg，p=0.0005,n=8及每週20mg/kg，p=0.0001,n=7)處理之小鼠組中觀測到顯著腫瘤生長抑制作用。如同以Herceptin抗體或Herceptin/抗VEGF組合給藥之組，一半以上的經bH1-44抗體處理之腫瘤顯示自初始體積消退50%以上(亦即，部分反應，圖51 )。另一方面，單獨抗VEGF與對照組相比對於BT474M1僅展現適度生長抑制作用(p=0.06,n=7)，且展現無部分反應。因此證明雙特異性bH1-44抗體抑制對於活體內腫瘤生長而言重要之兩種不同機制。
以上結果指示bH1抗體之親和性改良型變異體(例如，bH1-44及bH1-81)抑制對於活體內腫瘤生長而言重要之兩種機制的潛力。
實例8.表徵VEGF及HER2與bH1及bH1-44之結合界面
為進一步比較bH1及bH1-44之結構特徵，識別VEGF及HER2與該等抗體之結合界面。根據晶體結構座標3BDY(bH1/VEGF)及3BE1(bH1/HER2)識別表7 中所列舉之結構性接觸。使用程式XSAE計算結合界面。該程式定義界面為極性的、疏水性的且為混合型的。表7 列舉在HER2或VEGF結合後>25%之總表面積被包埋之bH1殘基。表7 亦列舉bH1殘基之4.5以內的VEGF及HER2殘基。基於晶體結構座標3BDY、3BE1及1N8Z(PDB)，使用IMOL計算在複合物形成後被包埋之每一殘基的表面積。表11 中報導之極性及疏水性界面區域反映極性界面區域及混合型之一半。所報導之疏水性界面區域由疏水性區域與混合型之一半組成。
晶體結構及丙胺酸掃描顯示bH1在HER2上保留與Herceptin抗體相同之結合抗原決定基(Bostrom等人，2009)。與HER2複合之HerceptinFab的晶體結構良好疊加至bH1/HER2複合物上(0.8之r.m.s.d)(Bostrom等人，2009；Cho等人，2003)。此外，保留根據丙胺酸掃描突變誘發貢獻總結合能的10%以上之Herceptin抗體殘基，且其中許多亦為bH1及bH1-44之結合熱點之一部分(Bostrom等人，2009；Kelley及O'Connell，1993)(表14 ，圖62 )。bH1/VEGF與bH1/HER2之間的界面分別包埋1506及1579，且主要為疏水性的(分別為60%及63%)。Herceptin/HER2 結合界面具有與bH1/HER2界面類似之尺寸及組成(1524，60%疏水性，表11 )，且亦以高形狀互補性來表徵(表8 )(Bostrom等人，2009)。
表7. bH1 Fab/HER2 ECD與bH1/Fab/VEGF109 之複合物之結構接觸列表。該表列舉在HER2或VEGF結合後>25%之總表面積被包埋之殘基。列舉bH1殘基之4.5以內的VEGF及HER2殘基。基於晶體結構座標3BDY、3BE1及1N8Z(PDB)，使用IMOL計算在複合物形成後被包埋之每一殘基的表面積。
如(Lawrence等人，1993)所述測定抗體與抗原之間的形狀互補性(如表8中以Sc所表示)。類似於Herceptin抗體與HER2之間的互補性，bH1/VEGF與bH1/HER2複合物之高形狀互補性係在所報導之抗體-抗原複合物之範圍內(Sc為約0.64至0.68；Lawrence等人，1993)。HER2與bH1在其VEGF結合構形中之疊加或VEGF與bH1在其HER2結合形式中之疊加揭示當使抗體與無關抗原並置時所觀測之形狀互補性很小(Sc為約0.35；Lawrence等人，1993)。該等結果表明bH1重排以容納兩種不同抗原之程度。
表8. bH1之結合HER2及VEGF的不同表面構形。
藉由自bH1之噬菌體呈現抗體庫選擇高親和性變異體bH1-44來改良bH1之親和性。獵槍丙胺酸掃描突變誘發表明bH1-44保留bH1之抗原結合的熱點(表9A-B、10及14 )。使用上文關於bH1之獵槍丙胺酸掃描突變誘發所述的技術來進行bH1-44之獵槍丙胺酸掃描突變誘發。
在表9A-B 中，丙胺酸突變(m1)或額外突變(m2，m3；由於獵槍密碼子之限制)或同源胺基酸突變(m4)之效應係以VEGF(表9A )或HER2(表9B )結合純系中野生型(wt)之出現率或VEGF(表9A )或HER2(表9B )結合純系之野生型/突變型來計算。當wt為丙胺酸時，其經甘胺酸取代(m1)。對於蛋白質摺疊/表現效應而言，藉由除以來自呈現選擇之野生型/突變型比率來校正野生型/突變型比率，以獲得F值。獨立地藉由選擇結合至蛋白L之純系進行呈現選擇，其中該蛋白L結合抗體輕鏈之非線性抗原決定基。當僅Fab重鏈與噬菌體外鞘蛋白(p3)融合時，蛋白L結合指示輕鏈與重鏈之適當摺疊及締合。
在表10 中，列舉在晶體結構中接觸VEGF及/或HER2之bH1及bH1-44的抗體殘基。結合之能量熱點係由產生大於總相互作用結合能之大約10%的ΔΔGwt/ala 之抗體殘基所界定。
表11 中之資料指示結合界面之極性及尺寸在bH1/VEGF、bH1/HER2與Herceptin/HER2複合物之間係類似的。使用XSAE分析每一界面之極性。除非另外指示，否則表11 中所示之所有數字表示以計之面積。
表9A. 就結合至VEGF而言對bH1-44 Fab之獵槍丙胺酸掃描及同系物掃描結果。
表9B.就結合至HER2而言對bH1-44 Fab之獵槍丙胺酸掃描及同系物掃描結果。
表10. VEGF及HER2之結構性及功能性互補位。
表11. bH1/VEGF、bH1/HER2及Herceptin/HER2複合物之結合界面的極性及尺寸。
HER2/VEGF雙重特異性bH1-44抗體維持Herceptin 抗體之HER2結合動力學
進行表面電漿共振分析以研究bH1及其Fab變異體與固定化VEGF或HER2之結合動力學(表12) 。使用BIAcore 3000進行基於SPR之檢定。以允許50-150RU範圍內之Rmax的密度將VEGF109 及HER2胞外域固定於CM5晶片上。以30μl/min注射Fab於具有0.05% Tween 20之PBS中的連續稀釋液。藉由減去空白流式細胞之反應且藉由針對緩衝效應作校正來校正結合反應。使用1:1朗繆爾擬合模型來估算ka (締合速率)及kd (解離速率)。由ka 與kd 之比率求出KD 值。
bH1 Fab/VEGF相互作用之特徵在於相對較高之締合速率(kon =3.7×104 )及快速的解離速率(koff =0.013)，此產生300nM之中等KD 。bH1/HER2相互作用之親和性(KD =26nM，kon =9.6×104 ，koff =2.4×10-3 )比具有較慢締合速率及較快解離速率之Herceptin/HER2相互作用(KD =0.5nM，kon =7.1×105 ，koff =3.5×10-4 )低52倍。親和性改良型bH1變異體(bH1-81及bH1-44)展示VEGF及HER2相互作用之締合速率及解離速率有所改良。高親和性純系bH1-44以類似於Herceptin之親和性結合HER2(KD =0.2nM，表12) 。
表12 展示使用BIAcore於30℃下經由表面電漿共振量測所測定的bH1變異體及Herceptin抗體之動力學概況。在該等實驗中，使Fab結合至固定化VEGF或HER2，且使用1:1朗繆爾結合擬合模型測定締合速率(ka )、解離速率(kd )及解離常數(KD )。bH1-44抗體具有與Herceptin抗體類似之動力學概況及對HER2之親和性。喪失與VEGF或HER2結合之兩種雙重突變體(bH1-44 I29A+Y32A及bH1-44 R50A+R58A)保持動力學概況及對其他抗原之親和性。
表12. bH1變異體及Herceptin抗體之動力學概況。
雙重特異性抗體以類似熱力學特性與HER2及VEGF相互作用
亦使用等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry，ITC)測定bH1 Fab變異體與兩個抗原VEGF(VEGF之受體結合域，VEGF8-109 )及HER2胞外域(ECD)之間的相互作用之焓(ΔH)及熵(ΔS)變化(圖59A-F，圖60，表13 )。
如(Starovasnik等人，1999)所述，用VP-ITC滴定量熱計(Microcal Inc.)進行對Fab與人類VEGF109 及HER2胞外域之間的相互作用之微量熱法量測。使蛋白質溶液廣泛透析至磷酸鹽緩衝鹽水中。在同一容器中透析抗原及Fab以最小化由於緩衝液組成差異而引起之混合熱效應。將濃度為100-220μM之Fab以10-22μM之濃度滴定至抗原溶液(HER2-ECD或VEGF109 )中。此濃度之抗原為精確的焓量測所需，但排除在結合親和性高之情況下對KD 之測定。進行15或20次注射以獲得2倍過量之抗體。測定反應熱，減去Fab稀釋熱，且計算ΔH。
根據下式使用藉由表面電漿共振所測定之解離常數(KD )(表12 )來計算結合自由能(ΔG)：
ΔG=RTln (KD )
根據下式計算締合後之熵變化(ΔS)：
ΔS=(ΔH-ΔG)/T，其中T為溫度(K)。
為測定ΔCp，如上文所述在20至37℃範圍內之不同溫度下進行微量熱法量測。藉由經由將ΔH作為溫度之函數作圖進行線性回歸而測出ΔCp(圖62 )。
首先表徵雙重特異性抗體(bH1)與其兩個抗原(VEGF及HER2)中之任一者的相互作用。bH1與VEGF及HER2之結合展現類似之熱力學特性(表13 )。於30℃下在PBS(pH 7.4)中所量測之兩種相互作用係放熱的(對於VEGF及HER2而言分別為ΔH=-2.4及-2.4kcal/mol，表13 ，圖60 )，伴隨高度有利的有助於結合能之熵變化(對於VEGF及HER2而言分別為-TΔS=-6.6及-7.9kcal/mol，表13 ，圖60 )。
表13 展示以kcal/mol計之ΔG(結合自由能)、ΔS(熵變化)及ΔH(焓變化)。所示親和性係於至少兩個獨立的實驗中藉由BIAcore於30℃下使用動力學分析來量測。ΔH係使用ITC來量測，且其表示兩次或三次獨立量測之平均值後接標準偏差。如上所述計算ΔG及ΔS。
高親和性變異體bH1-81及bH1-44展示與bH1類似之熱力學概況。其與VEGF及HER2之相互作用的特徵亦在於有利之焓及熵(表13 ，圖60 )。對於VEGF相互作用而言，親和性改良係與明顯更為有利之焓變化(在30℃下，對於bH1-44而言ΔH=-7.1kcal/mol，相對地，bH1為-2.4kcal/mol)及略微較不具正性之熵變化(在30℃下，對於bH1-44而言-TΔS=-6.6，相對地，bH1為-4.7，表13 ，圖60 )相關聯。改良的對HER2之親和性亦與更為有利之焓變化(在30℃下，ΔH=-5.3相對於-2.4kcal/mol，表13 ，圖60 )相關聯。
表13. bH1變異體及Herceptin抗體之抗原結合親和性及熱力學。
bH1-44及Herceptin 以獨特熱力學與HER2相互作用
與雙重特異性抗體相反，HER2/Herceptin相互作用之特徵在於大的有利之焓變化(ΔH=-13.6kcal/mol)，而無任何顯著的熵變化(-TΔS=-0.3kcal/mol，圖60 ，表13 )(Kelley等人，1992)。儘管bH1-44以與Herceptin類似之親和性與HER2相互作用，但結合自由能係由較大之熵分量(-TΔS=-8.1kcal/mol，30℃)及較小之焓分量(ΔH=-5.3kcal/mol，30℃)組成。獨特之熱力學特性同Herceptin與bH1-44之間的HER2結合特徵之諸多類似性形成對比，該等類似性包括親和性、動力學及能量熱點之諸多殘基。儘管對於HER2貢獻總結合能之10%以上的Herceptin之熱點殘基類似於bH1及bH1-44之彼等殘基，但仍存在一些明顯差異。
表14 顯示藉由丙胺酸掃描突變誘發就HER2結合而言所測定之bH1、bH1-44及Herceptin抗體熱點。如Kelley等人，1993中所述進行突變誘發。表14 中之數字表示當殘基突變為丙胺酸時結合自由能之變化(ΔΔG野生型-突變型 )。表14 中之熱點殘基加有陰影且係定義為大於或等於總結合自由能(ΔG)之10%的ΔΔG。
在bH1之序列中，殘基LC-Thr94、HC-Tyr33、HC-Asp98係保守的，但在HER2結合中具有不同功能(表14 ，圖61 )。因此，募集VEGF結合之Herceptin的抗原結合位點之突變似乎使影響與HER2之相互作用的抗原結合位點產生一些根本性變化。雙重特異性抗體藉由利用對HER2產生與Herceptin等高之親和性的不同HER2識別策略來適應引入之突變。有趣的是，注意到除bH1-44之LC-Ser94以外，使對HER2之親和性與bH1相比改良100倍以上之突變並非結合熱點之部分，而似乎使現有之相互作用最優化。
雙重特異性相互作用中之大的負熱容量
為進一步理解促進雙重特異性相互作用之共同能量學及其如何有別於單特異性母體Herceptin之能量學，進行一系列實驗以研究以下三種Fab/抗原相互作用：bH1-44與VEGF或HER2及Herceptin與HER2。藉由在20℃至37℃範圍內之多個溫度下測定結合焓(ΔH)來量測雙重特異性相互作用之熱容量(ΔT=17℃，圖62，表15 )。熱容量(ΔCp)係ΔH及溫度(T)之函數且係以以下等式來說明：
ΔCp=δ(ΔH)/δT。
藉由線性回歸根據ΔH之溫度依賴性斜率來估算ΔCp(圖62，表15 )。對於與VEGF之相互作用而言，bH1-44之ΔCp經測定為-400cal/molK，且對於與HER2之相互作用而言為-440cal/molK。如先前(Kauzmann，1959)所述，大的負熱容量指示疏水性效應之重要性，此與兩種複合物中之結構界面的疏水性質相一致(表11 )。Herceptin/HER2之ΔCp(先前以類似溫度間隔經測定為-370cal/molK(Kelley等人，1992))小於bH1-44/HER2之ΔCp，但仍指示疏水性效應在HER2結合中之重要作用。
結合自由能之總熵變化(ΔS)為以下三種來源之熵變化的總和(Murphy等人，1994)：與結合表面之去溶劑化相關聯之熵變化(ΔSSOLV )、來自轉動及平動自由度損失之熵變化(ΔSRT )及由於相互作用分子之構型及構形動力學變化引起之熵變化(ΔSCONF )。
(1)ΔSTOT =ΔSSOLV +ΔSRT +ΔSCONF
一般地，僅ΔSSOLv 為正的，而ΔSRT 及ΔSCONF 二者均為負的。對於兩個分子之締合而言，專有性(cratic)熵術語ΔSRT 可如(Murphy等人，1994)所述經估算為-8cal/Kmol。由於非極性表面區域之包埋，因此，可假定ΔSSOLV 為疏水性效應所支配，且可以ΔCp之函數來說明：
(2) ΔSSOLV =ΔCp 1n(T/T*)，T*=385K
ΔSCONF 因此可如下估算：
(3) ΔSCONF =ΔSTOT -ΔSRT -ΔSSOLV
根據等式(3)，對於bH1-44/VEGF而言ΔSSOLV 經估算為96calmol-1 K-1 ，對於bH1-44/HER2而言為105calmol-1 K-1 ，且對於Herceptin/HER2而言為89calmo1-1 K-1 (表15 )。此轉換成ΔSCONF ，對於bH1-44/VEGF而言為-72calmol-1 K-1 ，對於bH1-44/HER2而言為-70calmol-1 K-1 ，且對於Herceptin/HER2而言為-80calmol-1 K-1 (表15 )。
為檢驗雙重特異性Fab與其母體Herceptin相比之總體結構穩定性，使用差示掃描熱量測定(DSC)進行熱變性實驗。於來自Microcal Inc之差示掃描量熱計上進行熱變性實驗。針對10mM乙酸鈉(pH 5)、150mM氯化鈉透析Fab。將溶液調整至0.5mg/ml之濃度且以1℃/min之速率加熱至95℃。對熔融曲線作基線校準且作校正。使用由製造商提供之軟體測定熔融溫度(TM )。如所預期，無Fab展示可逆之熱變性概況(Kelley等人，1992)(資料未顯示)。雙重特異性變異體之TM (對於bH1、bH1-81及bH1-44而言分別為77.2℃、75.6℃、74.3℃，表16 )略微低於Herceptin之TM (82.5℃)，但係高的且在對於其他治療性抗體所報導之TM 範圍內(Garber及Demarest，2007)。
對單獨VEGF或HER2具高親和性之bH1變異體的結合動力學及熱力學有趣的是，雙重特異性抗體自共用VEGF/HER2結合位點之完全獨特的區域得到其大部分之結合能。該等資料顯示可在不影響剩餘結合特異性的情況下選擇性地破壞雙重特異性抗體之VEGF或HER2結合功能。結構研究指示，對於VEGF及HER2而言bH1上之結構互補位顯著重疊，但bH1及bH1-44之獵槍丙胺酸突變誘發表明VEGF及HER2相互作用係由具有很少重疊之兩組獨特CDR殘基所介導(圖54 及57 ，表9A 、9B 及10 )。bH1及bH1-44之獵槍丙胺酸掃描指示，一些CDR殘基僅對於結合VEGF或HER2而言係重要的(圖54 及57 ，表9A 、9B 及10 )，包括LC-I1e29、LC-Tyr32(其對於VEGF結合係重要的)及HC-Arg50、HC-Arg58(對於HER2結合而言)(圖54 及57 ，表9 及10 )。為證實該等殘基之側鏈在每一相互作用中之獨特重要性，在bH1-44(LC-I1e29、LC-Tyr32、HC-Arg50、HC-Arg58)或Herceptin(HC-Arg50、HC-Arg58)架構中，使每一殘基個別地或組合地突變為丙胺酸且使突變體表現為Fab及IgG。
使用編碼經由重鏈融合至基因IIIN末端之bH1-44或HerceptinFab的載體作為Kunkel突變誘發之模板(Kunkel等人，1987)。設計寡核苷酸以於所選位置處引入所要丙胺酸突變。如同噬菌體表現Fab丙胺酸突變體，且藉由競爭ELISA證實結合(圖58 )。隨後將重鏈及輕鏈可變域選殖至Fab及IgG表現載體中，且如(Bostrom等人，2009)所述表現及純化Fab及IgG。SDS-PAGE證實正確的蛋白質尺寸(圖65)。尺寸排阻層析顯示小於5%之聚集程度。
藉由競爭ELISA及/或BIAcore檢驗與兩種抗原之結合。bH1-44架構中之所有單一丙胺酸突變在不同程度上削弱結合(資料未顯示)。大部分顯著的單一突變為LC-Y32A，其在維持HER2結合親和性及動力學之同時顯著破壞VEGF結合(表12 ，圖58 及圖63 )。雙重突變I29A+Y32A(LC)或R50A+R58A(HC)分別幾乎完全破壞與VEGF或HER2之結合，同時維持對另一抗原之結合親和性及動力學(表12，圖58 及圖63 )。Herceptin架構中之丙胺酸突變HC-R50A、HC-R58A亦在不同程度上破壞與HER2之結合，而雙重突變體HC R50A+R58A顯示無可偵測之HER2結合(表12 )。
接著分析雙重突變體之熱力學參數且與bH1-44之值相比較。bH1-44突變體LC-I29A+Y32A及HC-R50A+R58A與HER2或VEGF之結合自由能分別係由焓及熵之有利貢獻(對於VEGF而言，ΔH=-7.7且-TΔS=-3.9，對於HER2而言，ΔH=-6.4且-TΔS=-7.6，表13 ，圖60 )產生，其大致等於在30℃下所量測之bH1-44(表13 ，圖60 )。因此，雙重突變體展示與bH1-44相同之熱力學及動力學概況。
表14. 對藉由丙胺酸掃描突變誘發就HER2結合而言所測定之bH1、bH1-44及Herceptin熱點的比較
表15. VEGF及HER2相互作用之熱力學參數。
表16. 雙重特異性Fab及Herceptin抗體之熔融溫度(TM )
特異性改變之殘基之功能的結構基礎
接著，分析與VEGF或HER2複合之bH1的晶體結構(Bostrom等人，2009)以揭示結合決定子在各抗原複合物中之特異性相互作用(圖64 )。所得分析解釋兩個特異性決定殘基之突變如何在不影響對一種抗原之親和性、動力學及結合熱力學之情況下破壞對另一抗原之結合能力。bH1之CDR-L1含有Herceptin之序列的大部分變化且對於VEGF結合而言係重要的。bH1之CDR-L1構形在兩種複合物結構中顯著不同；平均偏差為4.6(殘基27-32之Cα )。與此相反，與VEGF複合之bH1 Fab的總體構形明顯類似於結合HER2之Fab的構形(r.m.s.d.=0.7，對於398個骨架原子而言，Cα )。在CDR-L1環位於HER2互補位之周邊且最小程度地涉及HER2接觸時，該環佔由VEGF包埋之表面積的26%。
兩種複合物之疊加指示，VEGF將會與Tyr32及CDR-L1在其結合HER2之構形中之相鄰殘基相衝突。Tyr32之主鏈Cα 原子在兩種結構中位於相同位置，但其側鏈旋轉了約130°。在VEGF複合物中，Tyr32及Ile29在使得為VEGF結合所需之CDR-L1構形成為可能方面似乎起著結構性作用。Tyr32突變為Ala或Phe對於VEGF結合而言係不可容許的(Bostrom等人，2009)。儘管Tyr32之側鏈朝向HER2，但其似乎並未涉及生產性抗原接觸。Ile29遠離HER2，其側鏈暴露於溶劑且Ile29及Tyr32突變為Ala對於HER2結合而言係完全可容許的。
亦檢驗bH1/HER2複合物中就HER2結合而言具獨特重要性之殘基的結構。在bH1-HER2結構中Arg50及Arg58之側鏈與HER2上之酸性殘基(Glu558及Asp560)疊靠(圖64 )。相互作用似乎具高度側鏈特異性，此係因為突變為Lys以及Ala係破壞性的(Bostrom等人，2009)。然而，在VEGF結構中，Arg50及Arg58暴露於溶劑且遠離VEGF，且突變為A1a或Lys係完全可容許的(Bostrom等人，2009)。
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本說明書中所引用或參考之所有專利、專利申請案、專利申請公開案及其他公開案均以引用的方式併入本文中，該引用程度就如同特定地及個別地指示將各獨立專利、專利申請案、專利申請公開案或公開案以引用的方式併入一般。
圖1展示各種LC庫之設計多樣性；圖2展示用於改變抗VEGF抗體或抗Her2抗體以結合至另一標靶之四個輕鏈庫的概要。斜體之NNK及XYZ係指密碼子組。Ys、Ds、Ts及Ss係指分別使酪胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸及絲胺酸之出現幾率為50%且使20種胺基酸中之任一者之出現幾率為另外之50%的軟隨機化。D/Ds及T/Ts係指分別使D或T之出現幾率為75%且使20種胺基酸中之任一者之出現幾率為另外之25%的軟隨機化；圖3展示輕鏈模板之HC、LC CDR殘基的序列；圖4展示輕鏈CDR之天然及設計多樣性。各位置處之Herceptin抗體序列係展示於括弧中。「*」表示Herceptin抗體中不存在之***；圖5A及圖5B1-5B2展示自輕鏈(LC)庫分離出之特異性抗原結合純系的序列。圖5A展示與VEGF、DR5及Fc結合之單特異性噬菌體純系的LC CDR序列，且圖5B展示與VEGF/HER2、DR5/HER2及Fc/HER2結合之雙特異性Fab。除了LC構架取代R66G以外，輕鏈構架及重鏈序列與Herceptin抗體一致；圖6為展示源自LC庫之抗體之結合特異性的圖。圖上展示關於抗體bH1、bH3、3-1、bD1、bD2、4-1及4-5之結果。以分光光度法偵測所結合之IgG抗體(於450nm下之光密度，y軸)。檢定中所包括之蛋白質為(對於各抗體而言自左至右)：人類血管內皮生長因子A(hVEGF-A)、hVEGF-C、hVEGF-D、hHER2胞外域(ECD)、表皮生長因子受體胞外域(hEGFR)、人類死亡受體5(hDR5)、牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、胎牛血清(FBS)、WIL2細胞溶胞物及NR6細胞溶胞物；圖7展示文庫C及D之揀選條件及富集；圖8展示VEGF結合物。殘基28、30、30a、31、92、93及93a完全不同。殘基32、50、53、91及94受到限定。殘基29、33及51受到限制(<3)；圖9展示人類VEGF結合物、組合培養盤及溶液選擇；圖10A及圖10B展示結合VEGF及HER2兩者之純系；圖11展示僅結合VEGF且喪失與HER2之結合活性的純系；圖12基於高產量單點競爭性ELISA展示與VEGF(100nM)結合之純系；圖13A及圖13B展示阻斷VEGF與VEGFR1-D2(圖13A)或D1-3(圖13B)結合之純系；圖14A及圖14B展示hVEGF結合物(圖14A)及來自文庫L1/L2/L3-C,D之VEGF結合物的親和性(輕鏈(LC)結合至hVEGF之IC50值；圖14B)；圖15展示可結合hVEGF及HER2兩者之純系，如經培養盤揀選直接在HER2上之hVEGF結合物所示；圖16展示用於scFv'2形成且呈現於噬菌體上之LC庫結合物；圖17展示呈Fab或hIgG形式之各種純系的表現；圖18A及圖18B展示與hVEGF165結合之hIgG型純系的ELISA；圖18A展示競爭ELISA之結果，圖18B展示標準ELISA之結果；圖19展示與固定化蛋白標靶結合之hIgG型純系的ELISA；圖20展示hIgG型純系在Her2及VEGF或DR5存在下之競爭性ELISA；圖21展示對與VEGF或HER2之結合的Biacore分析；圖22展示具有獲自不同結合純系之輕鏈的IgG或Fab與固定HER2-ECD(圖22A)或固定hVEGF(圖22B)之結合ELISA分 析結果；圖23A及圖23B展示阻斷VEGF與VEGFR1 D 1-3及KDR D1-7之相互作用的抗VEGF抗體；圖24展示阻斷B20-4.1與hVEGF結合之抗體；圖25展示阻斷Avastin®抗體與hVEGF結合之抗體；圖26展示結合至HER2或VEGF之雙特異性bH1 Fab的晶體結構；圖27為展示抗VEGF抗體阻斷hVEGF與VEGF受體2(VEGFR2)結合之圖；圖28展示結合至HER2或VEGF之雙特異性bH1 Fab的晶體結構；圖29為展示對bH1之結構互補位之個別CDR貢獻的一系列圓餅圖。VEGF之互補位尺寸為730Å2 且HER2之互補位尺寸為690Å2 。重鏈CDR係以灰色指示且輕鏈CDR係以白色指示；圖30展示結合VEGF/HER2之bH1或結合HER2之Herceptin®抗體的CDR環在與圖28相同之方向上的疊加；圖31展示結合至HER2或VEGF之雙特異性bH1 Fab的晶體結構。兩種bH1複合物之CDR-L1係以相同方向展示；圖32展示就VEGF及HER2結合而言bH1在能量上重要之結合位點；圖33展示經獵槍掃描之bH1的密碼子；圖34展示文庫組合(library consortium)；圖35展示具有根據與VEGF結合而篩檢出之獵槍掃描突變的抗體純系；圖36展示具有根據與HER2結合而篩檢出之獵槍掃描突變的抗體純系；圖37A-37D展示丙胺酸掃描結果。圖37A及圖37B展示就VEGF結合或HER2結合而言對bH1之丙胺酸掃描的結果(分別為圖37A、圖37B)及就VEGF結合或HER2結合而言對bH1之同系物掃描的結果(分別為圖37C、圖37D)；圖38展示bH1或Herceptin抗體突變體之丙胺酸掃描結果；圖39A1-39A3及圖39B1-39B3展示就與VEGF及HER2結合而言對bH1 Fab之獵槍丙胺酸掃描及同系物掃描結果；圖40展示就VEGF及HER2結合而言bH1在能量上重要之結合位點；圖41展示bH1 VEGF親和性成熟純系序列及對於VEGF或HER2之結合親和性；圖42展示抗VEGF抗體對VEGF誘發之HUVEC細胞增殖的抑制作用；圖43展示雙特異性抗體與表現於NR6細胞上之HER2的結合；圖44展示bH1與VEGF或HER2之競爭性結合實驗的結果；圖45展示bH1及親和性改良型變異體bH1-44及bH1-81 IgG活體外抑制HER2及VEGF介導之細胞增殖； 圖46展示源自LC庫之雙特異性抗體的結合特異性；圖47展示抗VEGF抗體阻斷VEGF與VEGFR2受體結合。圖47A展示人類VEGF結合且圖47B展示鼠類VEGF結合；圖48A及圖48B展示VEGF及HER2在溶液中競爭結合至bH1-44雙特異性IgG上；圖49A及圖49B展示雙特異性抗體bH1及bH1-44結合至HER2表現小鼠纖維母細胞(NR6；圖49B)，但並未結合至HER2陰性NR6細胞(圖49A)；圖50展示雙特異性bH1抗體特異性地使VEGF或HER2而非其他蛋白質自小鼠纖維母細胞(NR6)溶胞物中免疫沈澱出來；左：NR6細胞(無VEGF或HER2)；中：添加有VEGF165 之NR6細胞；右：表現HER2之NR6細胞圖51展示bH1-44對於免疫受損小鼠體內之Colo205及BT474M1異種移植物的腫瘤抑制作用；圖52A、52B及53展示用於實施本發明且具有如下序列識別符之例示性受體人類共同構架序列：可變重鏈(VH)共同構架(圖52A及圖52B) 缺少Kabat CDR之人類VH亞群I共同構架區FR1、FR2、FR3及FR4(IA：分別為SEQ ID NO：42-45)缺少擴展高變區之人類VH亞群I共同構架區FR1、FR2、FR3及FR4(IB：分別為SEQ ID NO：46、47、44及45；IC：分別為SEQ ID NO：46-48及45；ID：分別為SEQ ID NO：42、47、49及45)缺少Kabat CDR之人類VH亞群II共同構架區FR1、FR2、FR3及FR4(IIA：分別為SEQ ID NO：50-52及45)缺少擴展高變區之人類VH亞群II共同構架區FR1、FR2、FR3及FR4(IIB：分別為SEQ ID NO：53、54、52及45；IIC：分別為SEQ ID NO：53-55及45；IID：分別為SEQ ID NO：53、54、56及45)缺少Kabat CDR之人類VH亞群III共同構架區FR1、FR2、FR3及FR4(IIIA：分別為SEQ ID NO:57-59及45)缺少擴展高變區之人類VH亞群III共同構架區FR1、FR2、FR3及FR4(IIIB：分別為SEQ ID NO:60、61、59及45；IIIC：分別為SEQ ID NO:60-62及45；IIID：分別為SEQ ID NO:60、61、63及45)缺少Kabat CDR之人類VH受體構架區FR1、FR2、FR3及FR4(受體A：分別為SEQ ID NO:64、58、65及45)缺少擴展高變區之人類VH受體構架區FR1、FR2、FR3及FR4(受體B：分別為SEQ ID NO:60、61、65及45；受體C：分別為SEQ ID NO:60、61、66及45)缺少Kabat CDR之人類VH受體2構架區FR1、FR2、FR3及FR4(第二受體A：分別為SEQ ID NO:64、58、67及45)缺少擴展高變區之人類VH受體2構架區FR1、FR2、FR3及FR4(第二受體B：分別為SEQ ID NO:60、61、67及45；第二受體C：分別為SEQ ID NO:60、61、68及45；第二受體D：分別為SEQ ID NO:60、61、69及45)可變輕鏈(VL)共同構架(圖53) 人類VL κ亞群I共同構架區FR1、FR2、FR3及FR4(kv1：分別為SEQ ID NO:70-73)人類VL κ亞群II共同構架區FR1、FR2、FR3及FR4(kv2：分別為SEQ ID NO:74-76及73)人類VL κ亞群III共同構架區FR1、FR2及FR3(kv3：分別為SEQ ID NO:77-79及73)人類VL κ亞群IV共同構架區FR1、FR2及FR3(kv4：分別為SEQ ID NO:80-82及73)；圖54展示與HER2、VEGF或兩者產生結構性接觸或能量相互作用之殘基。將與HER2(淺灰色)、VEGF(灰色)或兩者(共用，黑色)產生結構性接觸(>25%包埋)或能量相互作用(ΔΔG>10%總結合能)之殘基定位於結合HER2之bH1的表面上；圖55展示bH1/VEGF及bH1/HER2結合界面。bH1/VEGF(A)及bH1/HER2(B)結合界面之特寫圖說明抗體結合區中VEGF與HER2之間的結構性差異。VEGF(C)及HER2-ECD(D)之表面表示係以相對於bH1 Fab之相同方向展示。突顯出與bH1 Fab接觸之殘基(近於4.5)。就化學組成或拓撲學而言，在bH1之兩個抗原決定基之間無明顯類似性；圖56展示bH1及bH1-44抗體阻斷人類VEGF與VEGFR1結合。將經生物素標記之人類VEGF165 與漸增濃度(x軸)之IgG一起培育，隨後捕捉於固定化人類VEGFR1-Fc上，且在添加受質下以結合辣根過氧化酶之抗生蛋白鏈菌素進行偵測(經校正之% OD450 ，y軸)；圖57展示bH1及bH1-44突變體之丙胺酸掃描結果。丙胺酸掃描突變誘發識別對VEGF及/或HER2結合而言在功能上具重要性之殘基。F值表示每一經掃描殘基對抗原結合之相對貢獻。針對bH1-44與VEGF及HER2之結合測定F值(黑條)，且與bH1之F值(白條)相比較。括弧中之胺基酸表示不同於bH1之bH1-44殘基。該圖係自圖56修改而來；圖58展示bH1-44 I29A Y32A bH1-44及R50A R58A bH1-44抗體與VEGF(圖58A)及HER2(圖58B)之結合。ELISA結合檢定展示bH1-44 IgG及兩個雙重突變體分別結合至經生物素標記之VEGF109 (左)或HER2-ECD(右)及與固定化抗VEGF抗體或Herceptin競爭的能力。I29A/Y32A LC突變體雖然對於HER2維持與bH1-44類似之親和性，但已喪失VEGF結合能力。R50A/R58A HC突變體已失去對HER2之親和性，但保持VEGF結合；圖59展示對與抗原結合相關之焓變化的量熱量測。圖59A-F分別展示關於bH1與VEGF之結合、bH1與HER2之結合、bH1-44與VEGF之結合、bH1-44與HER2之結合、bH1-44 HC-R50A+R58A與VEGF之結合、bH1-44 LC-I29A+Y32A與HER2之結合的資料。該等圖展示個別熱脈衝(上圖)及反應熱(下圖)，後者係藉由對已作為在注射結束時抗體與抗原之比率之函數作圖的每一脈衝求積分而計算得出。小量值之焓變化需要相對較高之蛋白質濃度，其當親和性高時排除對KD 之準確估計；圖59A-D ：藉由15次注射濃度為100至200μM之bH1或bH1-44 Fab來滴定濃度在10至20μM範圍內之VEGF109 或HER2-ECD溶液。圖59E-F ：藉由20次注射濃度為150及250μM之bH1-44 LC-I29A+Y32A Fab或bH1-44 HC-R50A+R58A Fab來滴定濃度為10至20μM之VEGF109 或HER2-ECD溶液。由於儀器雜訊，自分析中排除(圖59E )中之1號及13號滴定；圖60展示bH1變異體及Herceptin抗體之熱力學概況。每一雙重特異性變異體(bH1、bH1-81及bH1-44)具有特徵在於有利於VEGF及HER2結合之焓及熵的熱力學概況。分別對HER2或VEGF已喪失親和性之變異體HC-R50A+R58A及LC-129A+Y32A展示與bH1-44類似之熱力學概況。bH1-44/HER2相互作用之熱力學概況不同於Herceptin/HER2；圖61展示基於丙胺酸掃描突變誘發資料就HER2結合而言對bH1、bH1-44及Herceptin抗體熱點之比較。熱點殘基係以定位於Herceptin(赫賽汀)結構或bH1 Fab結構(bH1、bH1-44)上之灰色突顯出。熱點係定義為大於或等於總結合自由能(ΔG)之10%的ΔΔG。結構接觸位點(在結構中之抗原的4.5以內)係以淺色虛線勾勒出。HC及LC為黑色虛線所隔開。加下劃線之殘基的序列不同於Herceptin；圖62展示與bH1-44 Fab與VEGF或HER2之結合相關的估計熱容量變化。ΔCp係根據在20℃與37℃之間ΔH之溫度依賴性的斜率而求出。基於ΔH與T之間的線性關係，在此範圍內，ΔCp似乎與T無關(對於bH1-44/HER2而言R=0.991，對於bH1-44/VEGF而言R=0.9989)。Herceptin/HER2之ΔCp先前已由Kelley等人(Biochemistry，1992)測出；圖63A-B展示藉由BIAcore量測之bH1-44變異體的結合動力學。該等圖展示就固定化(A)VEGF109 或(B)HER2-ECD與bH1-44 Fab(紅色)、bH1-44-LC-Y32(綠色)、bH1-44-LC-I29A+Y32A(洋紅色)及bH1-44-HC-R50A+R58A(灰色)之0.5μM溶液之間的結合相互作用而言代表性反應相對於時間之曲線的重疊。跡線表示與相同之固定化CM5晶片的結合，其在每次Fab操作後再生。在0.5μM下，未偵測到bH1-44-LC-I29A+Y32A與VEGF或bH1-44-HC-R50A+R58A與HER2之結合。變異體bH1-44-Y32A展示與野生型bH1-44相比與VEGF之結合顯著變弱； 圖64A-D展示bH1-44之特異性決定殘基於bH1之晶體結構上的定位。對於VEGF結合而言重要之殘基(LC-I29及LC-Y32；A及B)及對於HER結合而言重要之殘基(HC-R50及HC-R58；C及D)係以深灰色展示為bH1/VEGF(A及C，2.6解析度)或bH1/HER2(B及D，2.9解析度)晶體結構上之棒狀物。殘基I29及Y32似乎涉及於用以維持為VEGF結合必需之CDR-L1環構形的鏈內相互作用中。I29經溶劑暴露於HER2結構中。Y32與HER2疊靠，但未參與生產性抗原接觸。R50及R58與HER2上之D560及E558疊靠且似乎參與電荷-電荷相互作用。R50及R58經溶劑暴露於VEGF溶劑結構中；及圖65展示Herceptin突變體Fab(R50A、R58A及R50A/R58A)之表現。
(無元件符號說明)

Claims (28)

  1. 一種分離之抗體，其包含下列六個高變區(HVR)序列，該等序列包含：(i)包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)之HVR L1；(ii)包含序列WGSFLY(SEQ ID NO：2)之HVR-L2；及(iii)包含序列HYSSPP(SEQ ID NO：3)之HVR-L3；及(a)另外包含含有以下之HVR序列：(iv)包含序列NIKDTY(SEQ ID NO：4)之HVR-H1；(v)包含序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO：5)之HVR-H2；及(vi)包含序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)之HVR-H3；或(b)另外包含含有以下之HVR序列：(iv)包含序列NISGTY(SEQ ID NO：7)之HVR-H1；(v)包含序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)之HVR-H2；及(vi)包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)之HVR-H3；其中該抗體特異性地結合人類表皮生長因子受體2(HER2)及血管內皮生長因子(VEGF)。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗體：以150nM或更強之Kd結合人類及鼠類VEGF且以7nM或更強之Kd結合HER2；相對於對照物，抑制VEGF誘發之細胞增殖及HER2表現細胞的增殖；或 抑制VEGF與VEGF受體2(VEGFR2)結合。
  3. 如請求項1之抗體，其中該抗體以150nM或更強之Kd結合人類及鼠類VEGF且以7nM或更強之Kd結合HER2，且其中該抗體相對於對照物，抑制VEGF誘發之細胞增殖及HER2表現細胞的增殖。
  4. 如請求項3之抗體，其中該抗體以36nM或更強之Kd結合人類及鼠類VEGF且以1nM或更強之Kd結合HER2。
  5. 如請求項1之抗體，其中該抗體以3nM或更強之Kd結合人類及鼠類VEGF且以0.2nM或更強之Kd結合HER2。
  6. 如請求項5之抗體，其中該抗體相對於對照物，抑制VEGF誘發之細胞增殖及HER2表現細胞的增殖。
  7. 一種如請求項1之抗體之分離之抗體片段，其中該抗體片段以58nM或更強之Kd結合人類VEGF且以6nM或更強之Kd結合HER2，且其中該抗體片段相對於對照物，抑制VEGF誘發之細胞增殖及HER2表現細胞的增殖。
  8. 如請求項7之抗體片段，其中該抗體片段以33nM或更強之Kd結合人類及鼠類VEGF且以0.7nM或更強之Kd結合HER2。
  9. 如請求項7或8之抗體片段，其中該片段為Fab片段。
  10. 如請求項1至6中任一項之抗體，其中該抗體為單株抗體，或其中該抗體為IgG抗體。
  11. 如請求項1至6中任一項之抗體，其中該抗體以奈莫耳濃度(nanomolar)之親和性結合人類及鼠類VEGF。
  12. 一種如請求項1至6中任一項之抗體的片段，其中該片段 特異性地結合HER2及VEGF。
  13. 如請求項1至8及12中任一項之抗體或抗體片段，其中該構架序列之至少一部分為人類一致構架序列。
  14. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1至13中任一項之抗體或抗體片段。
  15. 一種多肽，其包含6個HVR序列，該等序列包含：(i)包含序列NIAKTISGY(SEQ ID NO：1)之HVR L1；(ii)包含序列WGSFLY(SEQ ID NO：2)之HVR-L2；及(iii)包含序列HYSSPP(SEQ ID NO：3)之HVR-L3；及(a)另外包含含有以下之HVR序列：(iv)包含序列NIKDTY(SEQ ID NO：4)之HVR-H1；(v)包含序列RIYPTNGYTR(SEQ ID NO：5)之HVR-H2；及(vi)包含序列WGGDGFYAMD(SEQ ID NO：6)之HVR-H3；或(b)另外包含含有以下之HVR序列：(iv)包含序列NISGTY(SEQ ID NO：7)之HVR-H1序列；(v)包含序列RIYPSEGYTR(SEQ ID NO：8)之HVR-H2序列；及(vi)包含序列WVGVGFYAMD(SEQ ID NO：9)之HVR-H3序列。
  16. 一種載體，其包含如請求項14之聚核苷酸。
  17. 如請求項16之載體，其中該載體為表現載體。
  18. 一種宿主細胞，其包含如請求項16或17之載體。
  19. 如請求項18之宿主細胞，其為原核細胞、真核細胞或哺乳動物細胞。
  20. 一種產生如請求項1至13中任一項之抗體或抗體片段的方法，該方法包含培養包含一種包括如請求項14之聚核苷酸之載體的宿主細胞及回收該抗體。
  21. 如請求項20之方法，其中該宿主細胞為原核細胞、真核細胞或哺乳動物細胞。
  22. 一種如請求項1至13中任一項之抗體或抗體片段的用途，其係用於製造用以治療人類個體之下列疾病的藥物：(a)腫瘤；(b)自體免疫疾病；或(c)涉及HER2異常活化之非惡性疾病；其中以足以治療或預防該個體之該腫瘤、該自體免疫疾病或該非惡性疾病之時間及量投與該抗體或抗體片段。
  23. 如請求項22之用途，其中該腫瘤為結腸直腸腫瘤、乳癌、肺癌、腎細胞癌、神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤或卵巢癌。
  24. 如請求項23之用途，其中該藥物係與另一抗癌療法一起施用。
  25. 如請求項24之用途，其中該另一抗癌療法包含另一抗體或抗體片段、化療劑、細胞毒性劑、抗血管生成劑、免疫抑制劑、前藥、細胞激素(cytokine)、細胞激素拮抗 劑、細胞毒性放射線療法、皮質類固醇、止吐劑、癌症疫苗、止痛劑或生長抑制劑。
  26. 如請求項25之用途，其中係在施用如請求項1至13中任一項之抗體或抗體片段之前或之後施用該另一抗癌療法，或其中該另一抗癌療法係與如請求項1至13中任一項之抗體或抗體片段同時施用。
  27. 如請求項1至8及12中任一項之抗體或抗體片段，其係用於治療人類個體之下列疾病：(a)腫瘤；(b)自體免疫疾病；或(c)涉及HER2異常活化之非惡性疾病；其中以足以治療或預防該個體之該腫瘤、該自體免疫疾病或該非惡性疾病之時間及量投與該抗體或抗體片段。
  28. 如請求項1至8及12中任一項之抗體或抗體片段，其係作為用於治療人類個體之下列疾病之組合物中之活性成分：(a)腫瘤；(b)自體免疫疾病；或(c)涉及HER2異常活化之非惡性疾病；其中以足以治療或預防該個體之該腫瘤、該自體免疫疾病或該非惡性疾病之時間及量投與該抗體或抗體片段。
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