JP5796831B2 - 多重特異性抗体 - Google Patents

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Description

（発明の分野）
本発明は、多重特異性抗体と、該抗体の製造方法及び使用方法に関する。
抗体は、外来タンパク質、糖タンパク質、細胞又は他の抗原性外来物質による抗原刺激に応答して脊椎動物の免疫系によって生産される特定の免疫グロブリンポリペプチドである。この過程の重要なところは、特定の外来物質に特異的に結合する抗体の生成である。特定の抗原に対するこのようなポリペプチドの結合特異性は非常に正確であり、個々の脊椎動物によって生成されることが可能な特異性の多くはその複雑性および多様性が著しい。何千もの抗原は応答を誘発することが可能であり、各々は誘発した特定の抗原に対してほぼ排他的に偏向している。
特異的な抗原認識は、適応性の免疫応答の機能に対する抗体に必須である。重鎖(ＨＣ)および軽鎖(ＬＣ)のコンビナトリアルな会合は、抗体レパートリの生成においてすべての脊椎動物に保存されている。しかしながら、２つの鎖には非対称の多様性がある。ＨＣ(ＶＨ)の可変ドメインは、非常に高い配列多様性を含有し、ＬＣ(ＶＬ)の可変ドメインよりも多くの抗原認識の決定基に寄与することが多い。抗原特異性を決定する際のＬＣの役割は、レセプター編集と呼ばれる過程によって示される。Ｂ細胞レセプターを編集するためのＶＬ遺伝子の継続的な組換えは、自己反応性の抗体前駆体を修正するための主要なメカニズムであり、最初のレパートリの有意な部分(７５％程度)を構成するようである。軽鎖の変更により、不必要な結合特異性又は多重特異性が無効になることが示されている。
一又は複数の特定の抗原に対する抗体および抗体断片の特異性は、抗体を所望の治療薬にする。抗体および抗体断片を用いて、特定の組織、例えば腫瘍を標的化し、それによって非特異的標的の起こりうる副作用を最小限にすることができる。このように、癌および他の増殖性疾患の治療において有用な、治療的抗体、特に抗体、断片およびその誘導体を識別し、特徴化するために現在及び継続的な必要性がある。
本発明は、配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含む高頻度可変領域(ＨＶＲ) Ｌ１配列を含む単離された抗体であって、ヒト上皮性増殖因子レセプター２(ＨＥＲ２)および血管内皮性増殖因子(ＶＥＧＦ)を特異的に結合する抗体を提供する。一実施態様では、抗体は、配列WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２および／または配列HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３をさらに含んでなる。他の実施態様では、抗体は、(i) 配列NIKDTY(配列番号：４)を含むＨＶＲ-Ｈ１、(ii) 配列RIYPTNGYTR(配列番号：５)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び、(iii) 配列WGGDGFYAMD(配列番号：６)を含むＨＶＲ-Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲ配列を含む。他の実施態様では、抗体は、(i) 配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１、(ii) 配列RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び(iii) 配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲ配列を更に含む。
他の態様では、本発明は、配列Ｘ１ＩＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｙ(配列番号：８３)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列を含む単離された抗体であって、Ｘ１がアスパラギン酸以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ３がプロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ４がアルギニン以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ５がセリン以外の任意のアミノ酸であり、ＨＥＲ２およびＶＥＧＦを特異的に結合する抗体を特色とする。一実施態様では、配列Ｘ１ＩＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｙ(配列番号：８３)を含む抗体は、Ｘ１にアスパラギン、Ｘ３にアラニン、Ｘ４にリジン、Ｘ５にスレオニン、Ｘ７にセリンおよび／またはＸ８にグリシン、又はこれら何れかの組合せを有する。本発明のこの態様の様々な実施態様では、１、５又は１０を超えるＦ値を有することが図５７に示されるＨＶＲ-Ｌ１の何れかの残基は、ｂＨ１-４４又はｂＨ１-８１のＨＶＲ-Ｌ１(配列番号：１)の同じ位置に見られるのと同じ残基として維持されるのが好ましい残基である。更なる実施態様では、１より大きいΔΔＧ値を有することが表１４に示されるＨＶＲ-Ｌ１の何れかの残基は、ｂＨ１-４４又はｂＨ１-８１のＨＶＲ-Ｌ１(配列番号：１)の同じ位置に見られるのと同じ残基として維持されるのが好ましい残基である。一実施態様では、抗体は、配列ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｒ(配列番号：８４)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列を含む。一実施態様では、抗体は、配列WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２および／または配列HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３を更に含む。他の実施態様では、抗体は、(i) 配列NIKDTY(配列番号：４)を含むＨＶＲ-Ｈ１、(ii) 配列RIYPTNGYTR(配列番号：５)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び(iii) 配列WGGDGFYAMD(配列番号：６)を含むＨＶＲ-Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲ配列を更に含む。他の実施態様では、抗体は、(i) 配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１、(ii) 配列RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び(iii) 配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲ配列を更に含む。
他の態様では、本発明は、配列ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｒ(配列番号：８５)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列を含む単離された抗体であって、Ｘ５がスレオニン以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ６がアスパラギン以外の任意のアミノ酸であり、ＨＥＲ２およびＶＥＧＦを特異的に結合する抗体を特色とする。他の実施態様では、配列ＲＸ２Ｘ３ Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｒ(配列番号：８４)を含む抗体は、Ｘ８にチロシンを有する。一実施態様では、配列ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｒ(配列番号：８４)を含む抗体は、Ｘ５にセリンおよび／またはＸ６にグルタミン酸を有する。この態様の他の実施態様では、抗体は、配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１、配列WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２、および／または配列HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３の群から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲ配列を更に含む。本明細書に記述される何れかの実施態様では、抗体は、(i) 配列NIKDTY(配列番号：４)を含むＨＶＲ-Ｈ１、及び(ii) 配列WGGDGFYAMD(配列番号：６)を含むＨＶＲ-Ｈ３から選択される１つ又は２つのＨＶＲ配列を更に含む。更なる実施態様では、抗体は、(i) 配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１、及び(ii) 配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３から選択される１つ又は２つのＨＶＲ配列を更に含む。
本発明のこの態様の様々な実施態様では、１、５又は１０を超えるＦ値を有することが図５７に示されるＨＶＲ-Ｈ２の何れかの残基は、ｂＨ１-４４又はｂＨ１-８１のＨＶＲ-Ｈ２(それぞれ配列番号：８および５)の同じ位置に見られるのと同じ残基として維持されるのが好ましい残基である。更なる実施態様では、１より大きいΔΔＧ値を有することが表１４に示されるＨＶＲ-Ｈ２の何れかの残基は、ｂＨ１-４４又はｂＨ１-８１のＨＶＲ-Ｈ２(それぞれ配列番号：８および５)の同じ位置に見られるのと同じ残基として維持されるのが好ましい残基である。
特定の実施態様では、抗体は、NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列、HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列、NIKDTY(配列番号：４)を含むＨＶＲ-Ｈ１配列、RIYPTNGYTR(配列番号：５)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列、及びWGGDGFYAMD(配列番号：６)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列を含むか、あるいは、NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列、HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列、NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１配列、RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列、および／またはWVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列を含む。
さらに具体的な実施態様では、単離された抗体は、ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を含み、それぞれ順に、配列NIAKTISGY(配列番号：１)、WGSFLY(配列番号：２)、HYSSPP(配列番号：３)、NIKDTY(配列番号：４)、RIYPTNGYTR(配列番号：５)、及びWGGDGFYAMD(配列番号：６)を含み、ＨＥＲ２およびＶＥＧＦを特異的に結合する。他の特定の実施態様では、抗体は、ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２およびＨＶＲ-Ｈ３を含み、それぞれ順に、配列NIAKTISGY(配列番号：１)、WGSFLY(配列番号：２)、HYSSPP(配列番号：３)、NISGTY(配列番号：７)、RIYPSEGYTR(配列番号：８)、及びWVGVGFYAMD(配列番号：９)を含み、ＨＥＲ２およびＶＥＧＦを特異的に結合する。
ここに記載の何れかの態様の様々な実施態様では、抗体は、１５０ｎＭ以上の強さのＫｄでヒト及びマウスのＶＥＧＦを、そして７ｎＭ以上の強さのＫｄでＨＥＲ２を結合する。更なる実施態様では、抗体は、コントロールと比較して、ＶＥＧＦが誘導する細胞増殖およびＨＥＲ２発現細胞の増殖を阻害する。特定の実施態様では、抗体は、３６ｎＭ以上の強さのＫｄでヒト及びマウスのＶＥＧＦを、そして１ｎＭ以上の強さのＫｄでＨＥＲ２を結合する。更なる実施態様では、抗体は、ＶＥＧＦＲ２へのＶＥＧＦ結合を阻害する。
他の態様では、本発明は、１５０ｎＭ以上の強さのＫｄでヒト及びマウスのＶＥＧＦを、そして７ｎＭ以上の強さのＫｄでＨＥＲ２を結合する単離された抗体であって、コントロールと比較して、ＶＥＧＦが誘導する細胞増殖およびＨＥＲ２発現細胞の増殖を阻害する抗体を特色とする。一実施態様では、抗体は、３６ｎＭ以上の強さのＫｄでヒト及びマウスのＶＥＧＦを、そして１ｎＭ以上の強さのＫｄでＨＥＲ２を結合する。
さらに他の態様では、本発明は、５８ｎＭ以上の強さのＫｄでヒトＶＥＧＦを、そして６ｎＭ以上の強さのＫｄでＨＥＲ２を結合し、及び／又は、コントロールと比較して、ＶＥＧＦが誘導する細胞増殖およびＨＥＲ２発現細胞の増殖を阻害する単離された抗体断片を提供する。特定の実施態様では、抗体断片は、３３ｎＭ以上の強さのＫｄでヒト及びマウスのＶＥＧＦを、そして０．７ｎＭ以上の強さのＫｄでＨＥＲ２を結合する。他の具体的な実施態様では、断片は、Ｆａｂ断片又は単鎖可変断片(ｓｃＦｖ)である。
上記何れかの態様では、抗体はモノクローナル抗体であってよい。上記すべての態様の他の実施態様では、抗体はＩｇＧ抗体であってよい。上記すべての態様の更なる実施態様では、抗体のフレームワーク配列の少なくとも一部は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列であってよい。
他の態様では、本発明は、ここに記載の何れかの抗体の断片を特色とする。抗体断片の一実施態様は、ＨＥＲ２及びＶＥＧＦを特異的に結合する、配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列を含む断片である。他の実施態様では、抗体断片は、(i) 配列WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２、及び(ii) 配列HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３から選択される１つ又は２つのＨＶＲ配列を更に含む。他の実施態様では、抗体断片は、(i) 配列NIKDTY(配列番号：４)を含むＨＶＲ-Ｈ１、(ii) 配列RIYPTNGYTR(配列番号：５)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び(iii) 配列WGGDGFYAMD(配列番号：６)を含むＨＶＲ-Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲ配列を更に含む。更なる実施態様では、抗体断片は、(i) 配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１、(ii) 配列RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び(iii) 配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲ配列を更に含む。具体的な実施態様では、抗体断片は、NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列、HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列、NIKDTY(配列番号：４)を含むＨＶＲ-Ｈ１配列、RIYPTNGYTR(配列番号：５)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列、及びWGGDGFYAMD(配列番号：６)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列を含むか、又は、NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列、HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列、NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１配列、RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列、及びWVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列を含む。一実施態様では、断片は、Ｆａｂ断片又は単鎖可変断片(ｓｃＦｖ)である。上記すべての態様の更なる実施態様では、抗体のフレームワーク配列の少なくとも一部は、ヒトコンセンサスフレームワーク配列であってよい。
更なる態様では、本発明は、ここに記載の何れかの抗体又は抗体断片をコードするポリヌクレオチド、並びに該ポリヌクレオチドを含むベクターを特色とする。具体的な実施態様では、コードされた抗体は、NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列を含む。場合によって又はさらに、ポリヌクレオチドは、WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列、および／またはHYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列、又はこれら何れかの組合せも含む抗体をコードする。更なる態様では、ポリヌクレオチドは、NIKDTY(配列番号：４)を含むＨＶＲ-Ｈ１配列、RIYPTNGYTR(配列番号：５)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列、及びWGGDGFYAMD(配列番号：６)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列のうちの１つ、２つ又は３つを含む抗体、または、NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１、RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２、および／またはWVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列のうちの１つ、２つ又は３つを含む抗体を更にコードしてよい。
本発明の更なる態様では、ポリヌクレオチドは、NISGTY(配列番号：７)の配列を含むＨＶＲ-Ｈ１配列、RIYPSEGYTR(配列番号：８)の配列を含むＨＶＲ-Ｈ２、又はWVGVGFYAMD(配列番号：９)の配列を含むＨＶＲ-Ｈ３、又はこれら何れかの組合せをコードする。
他の態様では、本発明は、配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列をコードする単離されたポリヌクレオチドを特色とし、場合によって、ポリヌクレオチドは、(i) 配列NIKDTY(配列番号：４)を含むＨＶＲ-Ｈ１、(ii) 配列RIYPTNGYTR(配列番号：５)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び(iii) 配列WGGDGFYAMD(配列番号：６)を含むＨＶＲ-Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲ配列を更にコードする。更なる態様では、本発明は、配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、及び(i) 配列WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列、又は(ii) 配列HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列、又はこの両方をコードする単離されたポリヌクレオチドを特色とし、場合によって、該ポリヌクレオチドは、(i)配列NIKDTY(配列番号：４)を含むＨＶＲ-Ｈ１、(ii) 配列RIYPTNGYTR(配列番号：５)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び(iii) 配列WGGDGFYAMD(配列番号：６)を含むＨＶＲ-Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲ配列を更にコードする。
更なる態様では、本発明は、配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１、配列RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３をコードする単離されたポリヌクレオチドを特色とする。さらに他の態様では、本発明は、配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、配列WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列、配列HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列、配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１、配列RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３をコードする単離されたポリヌクレオチドを特色とする。
他の態様では、本発明は、配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１配列をコードする単離されたポリヌクレオチド、配列RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列をコードする単離されたポリヌクレオチド、及び、配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列をコードする単離されたポリヌクレオチドを特色とする。他の態様では、本発明は、配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１配列、配列RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列、及び配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを特色とする。
本発明の更なる実施態様では、単離されたポリヌクレオチドは、配列Ｘ１ＩＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｙ(配列番号：８３)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列をコードし、このとき、Ｘ１はアスパラギン酸以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ３はプロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ４はアルギニン以外の任意のアミノ酸であり、そしてＸ５はセリン以外の任意のアミノ酸である。本発明の他の実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列Ｘ１ＩＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｙ(配列番号：８３)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列であって、このとき、Ｘ１はＡｓｐ以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ３はプロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ４はアルギニン以外の任意のアミノ酸であり、そしてＸ５はセリン以外の任意のアミノ酸であるＨＶＲ-Ｌ１配列、及び配列WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列および／または配列HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列をコードする。本発明のこの態様の更なる実施態様では、ポリヌクレオチドは、Ｘ１にアスパラギン、Ｘ３にアラニン、Ｘ４にリジン、Ｘ５にスレオニン、Ｘ７にセリンおよび／またはＸ８にグリシン、又はこの何れかの組合せを有する配列Ｘ１ＩＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｙ(配列番号：８３)を含む抗体をコードする。本発明のこの態様の様々な実施態様では、１、５又は１０を超えるＦ値を有することが図５７に示されるＨＶＲ-Ｌ１の何れかの残基が、ｂＨ１-４４又はｂＨ１-８１のＨＶＲ-Ｌ１(配列番号：１)の同じ位置に見られるのと同じ残基として維持されることが好ましい残基である。更なる実施態様では、１より大きなΔΔＧ値を有することが表１４に示されるＨＶＲ-Ｌ１の何れかの残基が、ｂＨ１-４４又はｂＨ１-８１のＨＶＲ-Ｌ１(配列番号：１)の同じ位置に見られるのと同じ残基として維持されるのが好ましい残基である。
本発明の更なる実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｒ(配列番号：８５)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列をコードし、このときＸ５はスレオニン以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ６はアスパラギン以外の任意のアミノ酸である。他の態様では、本発明は、配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１配列；Ｘ５がスレオニン以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ６がアスパラギン以外の任意のアミノ酸である、配列ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｒ(配列番号：８５)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列；及び配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明の更なる実施態様では、ポリヌクレオチドは、Ｘ５にセリン、Ｘ６にグルタミン酸および／またはＸ８にチロシン、又はこれら何れかの組合せを有する配列ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｒ(配列番号：８４)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列をコードする。本発明のこの態様の様々な実施態様では、１、５又は１０を超えるＦ値を有することが図５７に示されるＨＶＲ-Ｈ２の何れかの残基が、ｂＨ１-４４又はｂＨ１-８１のＨＶＲ-Ｈ２(それぞれ配列番号：８および５)の同じ位置に見られるのと同じ残基として維持されるのが好ましい残基である。更なる実施態様では、１より大きなΔΔＧ値を有することが表１４に示されるＨＶＲ-Ｈ２の何れかの残基が、ｂＨ１-４４又はｂＨ１-８１のＨＶＲ-Ｈ２(それぞれ配列番号：８および５)の同じ位置に見られるのと同じ残基として維持されるのが好ましい残基である。
更なる態様では、本発明は、配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列を含む単離されたポリペプチド又は配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列を含む単離されたポリペプチド；配列WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列；および／または配列HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列を含む単離されたポリペプチドを特色とする。他の態様では、本発明は、配列Ｘ１ＩＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｙ(配列番号：８３)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列を含むポリペプチドであって、このときＸ１はアスパラギン酸以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ３はプロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ４はアルギニン以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ５はセリン以外の任意のアミノ酸である、ポリペプチドを提供する。この態様の他の実施態様では、ポリペプチドは、ＨＶＲ-Ｌ１配列Ｘ１ＩＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｙ(配列番号：８３)を含み、このときＸ１はアスパラギン酸以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ３はプロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ４はアルギニン以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ５はセリン以外の任意のアミノ酸である。場合によって、ポリペプチドは、配列WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列および／または配列HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列を更に含む。配列Ｘ１ＩＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｙ(配列番号：８３)を含むポリペプチドを含む上記何れかの態様の特定の実施態様では、Ｘ１にアスパラギン、Ｘ３にアラニン、Ｘ４にリジン、Ｘ５にスレオニン、Ｘ７にセリンおよび／またはＸ８にグリシン、又はこの何れかの組合せがある。本発明のこの態様の様々な実施態様では、１、５又は１０を超えるＦ値を有することが図５７に示されるＨＶＲ-Ｌ１の何れかの残基は、ｂＨ１-４４又はｂＨ１-８１のＨＶＲ-Ｌ１(配列番号：１)の同じ位置に見られるのと同じ残基として維持されるのが好ましい残基である。更なる実施態様では、１より大きなΔΔＧ値を有することが表１４に示されるＨＶＲ-Ｌ１の何れかの残基は、ｂＨ１-４４又はｂＨ１-８１のＨＶＲ-Ｌ１(配列番号：１)の同じ位置に見られるのと同じ残基として維持されるのが好ましい残基である。
また、本発明は、配列ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｒ(配列番号：８５)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列を含むポリペプチドであって、このときＸ５がスレオニン以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ６がアスパラギン以外の任意のアミノ酸である、ポリペプチドを提供する。本発明の他の態様では、ポリペプチドは、Ｘ５がスレオニン以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ６がアスパラギン以外の任意のアミノ酸であるＨＶＲ-Ｈ２配列ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｒ(配列番号：８５)と、配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１配列と、配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列とを含む。上記の態様の異なる実施態様では、配列ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｒ(配列番号：８４)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列を含むポリペプチドは、Ｘ５にセリン、Ｘ６にグルタミン酸および／またはＸ８にチロシン、又はこれら何れかの組合せを有する。本発明の本態様の様々な実施態様では、１、５又は１０を超えるＦ値を有することが図５７に示されるＨＶＲ-Ｈ２の何れかの残基は、ｂＨ１-４４又はｂＨ１-８１のＨＶＲ-Ｈ２(それぞれ配列番号：８および５)の同じ位置に見られるのと同じ残基として維持されるのが好ましい残基である。更なる実施態様では、１より大きなΔΔＧ値を有することが表１４に示されるＨＶＲ-Ｈ２の何れかの残基は、ｂＨ１-４４又はｂＨ１-８１のＨＶＲ-Ｈ２(それぞれ配列番号：８および５)の同じ位置に見られるのと同じ残基として維持されるのが好ましい残基である。
また、本発明は、配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１配列、配列RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列、および／または配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列、又はこれらの何れかの組合せの１つ、２つまたは３つを含むポリペプチドを提供する。
上記何れかの態様では、単離されたポリペプチドは、配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、配列NIKDTY(配列番号：４)を含むＨＶＲ-Ｈ１、配列RIYPTNGYTR(配列番号：５)を含むＨＶＲ-Ｈ２、および／または配列WGGDGFYAMD(配列番号：６)を含むＨＶＲ-Ｈ３、又はこれら何れかの組合せの１つ、２つまたは３つを更に含んでよい。
上記何れかの態様では、単離されたポリペプチドは、配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、配列WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列、および／または配列HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列、又はこれら何れかの組合せの１つ、２つまたは３つを更に含んでよい。
上記何れかの態様では、単離されたポリペプチドは、配列NIKDTY(配列番号：４)を含むＨＶＲ-Ｈ１、配列RIYPTNGYTR(配列番号：５)を含むＨＶＲ-Ｈ２、および／または配列WGGDGFYAMD(配列番号：６)を含むＨＶＲ-Ｈ３、又はこれら何れかの組合せを更に含んでよい。
上記何れかの態様では、単離されたポリペプチドは、配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１、配列RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列、および／または配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３、又はこれら何れかの組合せから選択される１つ、２つまたは３つのＨＶＲ配列を更に含んでよい。
更なる態様では、本発明は、配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、及び(i)配列WGSFLYを含む(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列又は(ii)配列HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列、又はこの両方；及び、(i)配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１、(ii)配列RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２、および／または、(iii)配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３、又はこれら何れかの組合せの１つ、２つまたは３つ、を含む単離されたポリペプチドを特色とする。
更なる態様では、本発明は、配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、及び(i)配列WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列又は(ii)配列HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列、又はこの両方；及び、(i)配列NIKDTY(配列番号：４)を含むＨＶＲ-Ｈ１、(ii)配列RIYPTNGYTR(配列番号：５)を含むＨＶＲ-Ｈ２、および／または、(iii)配列WGGDGFYAMD(配列番号：６)を含むＨＶＲ-Ｈ３、又はこれら何れかの組合せを含む単離されたポリペプチドを特色とする。
更なる態様では、本発明は、配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１配列を含む単離されたポリペプチド、配列RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列を含む単離されたポリペプチド、そして、配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列を含む単離されたポリペプチドを特色とする。より更なる態様では、本発明は、配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１配列、配列RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列、そして、配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列を含む単離されたポリペプチドを特色とする。
一実施態様では、本発明は、本発明の上記何れかのポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。他の態様では、本発明は、本発明の何れかのベクターを含む宿主細胞を特色とする。一実施態様では、宿主細胞は原核生物のものである。他の実施態様では、宿主細胞は、真核生物の、例えば哺乳類の細胞である。
他の態様では、本発明は、上記何れかの抗体又は抗体断片の製造方法を特色とする。この方法は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞を培養し、抗体を回収することを含む。ある実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列をコードし、場合によって、ポリヌクレオチドは、さらに、配列NIKDTY(配列番号：４)を含むＨＶＲ-Ｈ１、配列RIYPTNGYTR(配列番号：５)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び配列WGGDGFYAMD(配列番号：６)を含むＨＶＲ-Ｈ３をコードする。他の実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、配列WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列、及び配列HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列をコードし、場合によって、ポリヌクレオチドは、さらに、配列NIKDTY(配列番号：４)を含むＨＶＲ-Ｈ１、配列RIYPTNGYTR(配列番号：５)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び配列WGGDGFYAMD(配列番号：６)を含むＨＶＲ-Ｈ３をコードする。他の実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１、配列RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３をコードする。さらに他の実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、配列WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列、配列HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列、配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１、配列RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３をコードする。
更なる実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１配列、配列RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列、又は配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列をコードする。まだ更なる実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１配列、配列RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列、及び配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列を含むポリペプチドをコードする。
一実施態様では、宿主細胞は原核生物のものであり、他の実施態様では、宿主細胞は哺乳類の細胞といった真核生物のものである。
更なる態様では、本発明は、被検体の腫瘍の治療方法を特色とする。この方法は、本明細書中に記載の抗体ないし抗体断片を被検体に投与することを含み、この投与は被検体の腫瘍を治療又は予防するために十分な量と時間である。一実施態様では、腫瘍は、結腸直腸腫瘍、乳癌、肺癌、腎臓細胞癌腫、膠腫、神経膠芽腫又は卵巣癌である。他の実施態様では、抗体は、配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列を含み、ＨＥＲ２およびＶＥＧＦを特異的に結合する。一実施態様によると、抗体は、(i) 配列WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２、及び(ii) 配列HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３から選択される１つ又は２つのＨＶＲを更に含む。他の実施態様では、抗体は、(i) 配列NIKDTY(配列番号：４)を含むＨＶＲ-Ｈ１、(ii) 配列RIYPTNGYTR(配列番号：５)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び(iii) 配列WGGDGFYAMD(配列番号：６)を含むＨＶＲ-Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲ配列を含む。更なる実施態様では、抗体は、(i) 配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１、(ii) 配列RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び(iii) 配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲ配列を含む。具体的な実施態様では、抗体は、NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列、HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列、NIKDTY(配列番号：４)を含むＨＶＲ-Ｈ１配列、RIYPTNGYTR(配列番号：５)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列、及びWGGDGFYAMD(配列番号：６)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列を含み、ＨＥＲ２およびＶＥＧＦを特異的に結合する。他の実施態様では、抗体は、NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列、HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列、NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１配列、RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列、及びWVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列を含み、ＨＥＲ２およびＶＥＧＦを特異的に結合する。
実施態様では、前記方法は、被検体に他の抗癌療法を投与することを更に含む。他の実施態様では、他の抗癌療法は、他の抗体、化学療法剤、細胞障害性剤、抗血管形成剤、免疫抑制剤、プロドラッグ、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、細胞障害性放射線療法、副腎皮質ステロイド、制吐剤、癌ワクチン、鎮痛剤又は増殖阻害性剤を含む。
更なる実施態様では、他の抗癌療法は、抗体の投与の前又は後に投与される。更なる実施態様では、他の抗癌療法は、抗体と同時に投与される。
更なる態様では、本発明は、被検体の自己免疫性疾患の治療方法を特色とする。この方法は、本明細書中に記載の抗体ないし抗体断片を被検体に投与することを含み、この投与は被検体の自己免疫性疾患を治療又は予防するために十分な量と時間である。一実施態様では、抗体は、配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列を含み、ＨＥＲ２およびＶＥＧＦを特異的に結合する。一実施態様によると、抗体は、(i) 配列WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２、及び(ii) 配列HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３から選択される１つ又は２つのＨＶＲ配列を含む。他の実施態様では、抗体は、(i) 配列NIKDTY(配列番号：４)を含むＨＶＲ-Ｈ１、(ii) 配列RIYPTNGYTR(配列番号：５)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び(iii) 配列WGGDGFYAMD(配列番号：６)を含むＨＶＲ-Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲ配列を含む。更なる実施態様では、抗体が、(i) 配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１、(ii) 配列RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び(iii) 配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲ配列を含む。特定の実施態様では、抗体は、NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列、HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列、NIKDTY(配列番号：４)を含むＨＶＲ-Ｈ１配列、RIYPTNGYTR(配列番号：５)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列、及びWGGDGFYAMD(配列番号：６)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列を含み、ＨＥＲ２及びＶＥＧＦを特異的に結合し、又は、この抗体は、NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列、HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列、NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１配列、RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列、及びWVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列を含み、ＨＥＲ２およびＶＥＧＦを特異的に結合する。
さらに他の態様では、本発明は、被検体のＨＥＲ２の異常な活性化を伴う非悪性疾患の治療方法を特色とする。この方法は、本明細書中に記載の抗体ないし抗体断片を被検体に投与することを含み、この投与は被検体の非悪性疾患を治療又は予防するために十分な量と時間である。一実施態様では、抗体は、配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列を含み、ＨＥＲ２およびＶＥＧＦを特異的に結合する。一実施態様によると、抗体は、(i) 配列WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２、及び配列HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３から選択される１つ又は２つのＨＶＲ配列を含む。他の実施態様では、抗体は、(i) 配列NIKDTY(配列番号：４)を含むＨＶＲ-Ｈ１、(ii) 配列RIYPTNGYTR(配列番号：５)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び(iii) 配列WGGDGFYAMD(配列番号：６)を含むＨＶＲ-Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲ配列を含む。更なる実施態様では、抗体は、(i) 配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１、(ii) 配列RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び(iii) 配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲ配列を含む。特定の実施態様では、抗体は、NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列、HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列、NIKDTY(配列番号：４)を含むＨＶＲ-Ｈ１配列、RIYPTNGYTR(配列番号：５)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列、及びWGGDGFYAMD(配列番号：６)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列を含み、ＨＥＲ２及びＶＥＧＦを特異的に結合するか、又はこの抗体は、NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列、HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列、NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１配列、RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列、及びWVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列を含み、ＨＥＲ２およびＶＥＧＦを特異的に結合する。
本発明の他の態様は、被検体においてＨＥＲ２の異常活性化を伴う腫瘍、自己免疫性疾患又は非悪性疾患の治療における抗体ないし抗体断片の使用、並びに被検体においてＨＥＲ２の異常活性化を伴う腫瘍、自己免疫性疾患又は非悪性疾患の治療のための医薬の製造における使用を特色とする。これらの使用の一実施態様では、抗体は、配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列を含み、ＨＥＲ２およびＶＥＧＦを特異的に結合する。一実施態様によると、抗体は、(i) 配列WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２、及び(ii) 配列HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３から選択される１つ又は２つのＨＶＲ配列を更に含む。他の実施態様では、抗体は、(i) 配列NIKDTY(配列番号：４)を含むＨＶＲ-Ｈ１、(ii) 配列RIYPTNGYTR(配列番号：５)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び(iii) 配列WGGDGFYAMD(配列番号：６)を含むＨＶＲ-Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲ配列を含む。更なる実施態様では、抗体は、(i) 配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１、(ii) 配列RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び(iii) 配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３から選択される１つ、２つ又は３つのＨＶＲ配列を含む。特定の実施態様では、抗体は、NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列、HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列、NIKDTY(配列番号：４)を含むＨＶＲ-Ｈ１配列、RIYPTNGYTR(配列番号：５)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列、及びWGGDGFYAMD(配列番号：６)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列を含み、ＨＥＲ２及びＶＥＧＦを特異的に結合するか、又はこの抗体は、NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２配列、HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３配列、NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１配列、RInYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２配列、及びWVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３配列を含み、ＨＥＲ２およびＶＥＧＦを特異的に結合する。
本明細書中に記載のＨＥＲ２の異常な活性化を伴う腫瘍、自己免疫性疾患又は非悪性疾患の治療方法の実施態様では、被検体はヒトである。
また、本明細書中に記載の抗体及び抗体断片を含む、キット、組成物および製造品も考慮する。
様々なＬＣライブラリの設計された多様性を示す。 他の標的と結合するように抗ＶＥＧＦ抗体又は抗Ｈｅｒ２抗体を変更するために用いた４つの軽鎖ライブラリの概要を示す。イタリック体のＮＮＫおよびＸＹＺはコドンセットを指す。Ｙｓ、Ｄｓ、ＴｓおよびＳｓはそれぞれ、チロシン、アスパラギン酸、スレオニンおよびセリンをほぼ５０％の確率で、そして２０アミノ酸のうちのいずれか一つを５０％の確率で有することによる穏やかな(ソフト)ランダム化を指す。Ｄ／ＤおよびＴ／Ｔｓはそれぞれ、Ｄ又はＴを７５％の確率で、そして２０アミノ酸のうちのいずれか一つを２５％の確率で有する穏やかな(ソフト)ランダム化を指す。 軽鎖鋳型のＨＣ、ＬＣ ＣＤＲ残基の配列を示す。 軽鎖ＣＤＲの天然及び設計された多様性を示す。各々の位置の、ハーセプチン(登録商標)抗体配列を括弧で示す。「＊」は、ハーセプチン(登録商標)抗体に存在しない挿入を意味する。 軽鎖(ＬＣ)ライブラリから単離した特定の抗原結合性クローンの配列を示す。図５Ａは、ＶＥＧＦ、ＤＲ５およびＦｃに結合する単一特異性ファージクローンのＬＣ ＣＤＲ配列を示す。図５Ｂは、ＶＥＧＦ／ＨＥＲ２、ＤＲ５／ＨＥＲ２およびＦｃ／ＨＥＲ２に結合する二重特異性Ｆａｂを示す。軽鎖フレームワークおよび重鎖配列は、ＬＣフレームワーク置換Ｒ６６Ｇを除いてハーセプチン(登録商標)抗体のものに対応する。 ＬＣライブラリ由来の抗体の結合特異性を示すグラフである。抗体ｂＨ１、ｂＨ３、３-１、ｂＤ１、ｂＤ２、４-１および４-５の結果を示す。結合したＩｇＧ抗体は分光光度法で検出した(４５０ｎｍの光学濃度、ｙ軸)。アッセイに含まれるタンパク質は、(各抗体について左から右の順に)ヒト血管内皮性増殖因子Ａ(ｈＶＥＧＦ−Ａ)、ｈＶＥＧＦ-Ｃ、ｈＶＥＧＦ-Ｄ、ｈＨＥＲ２細胞外ドメイン(ＥＣＤ)、上皮性増殖因子レセプター細胞外ドメイン(ｈＥＧＦＲ)、ヒトデスレセプター５(ｈＤＲ５)、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、カゼイン、ウシ胎児血清(ＦＢＳ)、ＷＩＬ２細胞溶解物およびＮＲ６細胞溶解物とした。 ライブラリＣおよびＤの分類条件および濃縮を示す。 ＶＥＧＦ結合体を示す。残基２８、３０、３０ａ、３１、９２、９３および９３ａは十分に多様であった。残基３２、５０、５３、９１および９４は限定的であった。残基２９、３３および５１は制限された(＜３)。 ヒトＶＥＧＦ結合体、併用プレートおよび溶液選別を示す。 ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２の両方を結合するクローンを示す。 ＶＥＧＦのみを結合し、ＨＥＲ２との結合活性を失っているクローンを示す。 ＶＥＧＦに結合するクローンを示す。 ＶＥＧＦＲ１-Ｄ２又はＤ１へのＶＥＧＦ結合を遮断するクローンを示す。 ライブラリＬ１／Ｌ２／Ｌ３-Ｃ,ＤからのＶＥＧＦ結合体とＶＥＧＦ結合体の親和性を示す。 ｈＶＥＧＦおよびＨＥＲ２を結合しうるクローンを示す。 ｓｃＦｖ'２形成に使用し、ファージ上に表出されたＬＣライブラリ結合体を示す。 Ｆａｂ又はｈＩｇＧ型での様々なクローンの発現を示す。 ｈＶＥＧＦ１６５に結合するｈＩｇＧ型のクローンのＥＬＩＳＡを示す。 固定されたタンパク質標的に結合するｈＩｇＧ型のクローンのＥＬＩＳＡを示す。 Ｈｅｒ２およびＶＥＧＦ又はＤＲ５の存在下における、ｈＩｇＧ型のクローンの競合的ＥＬＩＳＡを示す。 ＶＥＧＦ又はＨＥＲ２への結合のＢｉａｃｏｒｅ分析を示す。 異なる結合クローンから得られた軽鎖を有するＩｇＧ又はＦａｂを有するＨＥＲ２-ＥＣＤ又はｈＶＥＧＦへの結合を示す。 ＶＥＧＦＲ１ Ｄ１−３およびＫＤＲ Ｄ１−７とのＶＥＧＦ相互作用を遮断する抗ＶＥＧＦ抗体を示す。 Ｂ２０-４．１およびＶＥＧＦ結合を遮断する抗体を示す。 アバスチン(登録商標)抗体とＶＥＧＦ結合を遮断する抗体を示す。 ＨＥＲ２又はＶＥＧＦに結合した二重特異性ｂＨ１ Ｆａｂの結晶構造を示す。 抗ＶＥＧＦ抗体がＶＥＧＦレセプター２(ＶＥＧＦＲ２)へのｈＶＥＧＦ結合を遮断することを示しすグラフである。 ＨＥＲ２又はＶＥＧＦに結合した二重特異性ｂＨ１ Ｆａｂの結晶構造を示す。 ｂＨ１の構造的パラトープに対する個々のＣＤＲ貢献を示す一連の円グラフである。ＶＥＧＦのパラトープサイズは７３０Å２であり、ＨＥＲ２は６９０Å２である。重鎖ＣＤＲを灰色で示し、軽鎖ＣＤＲを白色で示す。 図２８と同じ方向の、ＶＥＧＦ／ＨＥＲ２結合ｂＨ１又はＨＥＲ２結合ハーセプチン(登録商標)抗体のＣＤＲループの重ね合わせを示す。 ＨＥＲ２又はＶＥＧＦに結合した二重特異性ｂＨ１ Ｆａｂの結晶構造を示す。２つのｂＨ１複合体のＣＤＲ-Ｌ１は同じ方向で示す。 ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２結合のためのｂＨ１のエネルギー的に重要な結合部位を示す。 ショットガンスキャンを行ったｂＨ１のコドンを示す。 ライブラリ構築を示す。 ＶＥＧＦへの結合によりスクリーニングされたショットガンスキャン突然変異を有する抗体クローンを示す。 ＨＥＲ２への結合によりスクリーニングされたショットガンスキャン突然変異を有する抗体クローンを示す。 アラニンスキャニング結果を示す。図３７Ａ−Ｂは、ＶＥＧＦ結合(図３７Ａ)又はＨＥＲ２結合(図３７Ｂ)についてのｂＨ１のアラニンスキャンの結果と、ＶＥＧＦ結合(図３７Ｃ)又はＨＥＲ２結合(図３７Ｄ)についてのｂＨ１のホモログスキャンの結果を示す。 ｂＨ１又はハーセプチン(登録商標)抗体変異体のアラニンスキャニング結果を示す。 ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２への結合についてのｂＨ１ Ｆａｂのショットガンアラニン−およびホモログスキャニングを示す。 ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２結合についてのｂＨ１のエネルギー的に重要な結合部位を示す。 ｂＨ１ ＶＥＧＦ-親和性成熟したクローン配列と、ＶＥＧＦ又はＨＥＲ２に対する結合親和性を示す。 抗ＶＥＧＦ抗体によるＶＥＧＦ誘導性ＨＵＶＥＣ細胞増殖の阻害を示す。 ＮＲ６細胞に発現されるＨＥＲ２への二重特異性抗体の結合を示す。 ＶＥＧＦ又はＨＥＲ２へのｂＨ１についての競合的結合実験の結果を示す。 ｂＨ１及び親和性改善した変異体ｂＨ１-４４およびｂＨ１-８１のＩｇＧがインビトロでＨＥＲ２およびＶＥＧＦが媒介する細胞増殖を阻害することを示す。 ＬＣライブラリ由来の二重特異性抗体の結合特異性を示す。 抗ＶＥＧＦ抗体がＶＥＧＦＲ２レセプターへのＶＥＧＦ結合を遮断することを示す。図４７ＡはヒトＶＥＧＦ結合を示し、図４７ＢはマウスＶＥＧＦ結合を示す。 ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２が溶液中のｂＨ１-４４二重特異性ＩｇＧへの結合について競合することを示す。 二重特異性抗体ｂＨ１およびｂＨ１-４４が、ＨＥＲ２発現マウス線維芽細胞(ＮＲ６；図４９Ｂ)に結合するが、ＨＥＲ２陰性ＮＲ６細胞(図４９Ａ)には結合しないことを示す。 二重特異性ｂＨ１抗体が、マウス線維芽細胞(ＮＲ６)溶解物からＶＥＧＦ又はＨＥＲ２を特異的に免疫沈降するが、他のタンパク質は免疫沈降しないことを示す。 免疫欠損マウスのＣｏｌｏ２０５及びＢＴ４７４Ｍ１異種移植片におけるｂＨ１-４４の腫瘍阻害を示す。 以下のように配列識別子を有する本発明を実施するために使用される、例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を示す。可変重鎖(ＶＨ)コンセンサスフレームワーク(図５２ＡおよびＢ)。ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からカバットＣＤＲを除く(ＩＡ：それぞれ配列番号：４２−４５)。ヒトＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４から伸展した高頻度可変領域を除く(ＩＢ：それぞれ配列番号：４６、４７、４４および４５；ＩＣ：それぞれ配列番号：４６−４８および４５；ＩＤ：それぞれ配列番号：４２、４７、４９および４５)。ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からカバットＣＤＲを除く(ＩＩＡ：それぞれ配列番号：５０−５２および４５)。ヒトＶＨサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４から伸展した高頻度可変領域を除く(ＩＩＢ：それぞれ配列番号：５３、５４、５２および４５；ＩＩＣ：それぞれ配列番号：５３−５５および４５；ＩＩＤ：それぞれ配列番号：５３、５４、５６および４５)。ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からカバットＣＤＲを除く(ＩＩＩＡ：それぞれ配列番号：５７−５９および４５)。ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４から伸展した高頻度可変領域を除く(ＩＩＩＢ：それぞれ配列番号：６０、６１、５９および４５；ＩＩＩＣ：それぞれ配列番号：６０−６２および４５；ＩＩＩＤ：それぞれ配列番号：６０、６１、６３および４５)。ヒトＶＨアクセプターフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からカバットＣＤＲを除く(アクセプターＡ：それぞれ配列番号：６４、５８、６５及び４５)。ヒトＶＨアクセプターフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４から伸展した高頻度可変領域を除く(アクセプターＢ：それぞれ配列番号：６０、６１、６５および４５；アクセプターＣ：それぞれ配列番号：６０、６１、６６および４５)。ヒトＶＨアクセプター２フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からカバットＣＤＲを除く(第二アクセプターＡ：それぞれ配列番号：６４、５８、６７および４５)。ヒトＶＨアクセプター２フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４から伸展した高頻度可変領域を除く(第二アクセプターＢ：それぞれ配列番号：６０、６１、６７および４５；第二アクセプターＣ：それぞれ配列番号：６０、６１、６８および４５；第二アクセプターＤ：それぞれ配列番号：６０、６１、６９および４５)。 以下のように配列識別子を有する本発明を実施するために使用される、例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を示す。可変軽鎖(ＶＬ)コンセンサスフレームワーク(図５３)。ヒトＶＬκサブグループＩコンセンサスフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４(ｋｖ１：それぞれ配列番号：７０−７３)。ヒトＶＬκサブグループＩＩコンセンサスフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４(ｋｖ２：それぞれ配列番号：７４−７６および７３)。ヒトＶＬκサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３(ｋｖ３：それぞれ配列番号：７７−７９および７３)。ヒトＶＬκサブグループＩＶコンセンサスフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３(ｋｖ４：それぞれ配列番号：８０−８２および７３)。 ＨＥＲ２、ＶＥＧＦ又はその両方と構造的に接触するか又はエネルギー的に相互作用する残基を示す。構造的に接触するか(＞２５％埋没)、又はＨＥＲ２(淡い灰色)、ＶＥＧＦ(灰色)又はその両方(共通、黒色)とエネルギー的に相互作用する(ΔΔＧ＞１０％総結合エネルギー)残基を、ＨＥＲ２結合ｂＨ１の表面にマップする。 ｂＨ１／ＶＥＧＦおよびｂＨ１／ＨＥＲ２結合界面を示す。ｂＨ１／ＶＥＧＦ(Ａ)およびｂＨ１／ＨＥＲ２(Ｂ)結合界面の拡大図は、抗体結合の領域におけるＶＥＧＦとＨＥＲ２との間の構造的相違を示す。ＶＥＧＦ(Ｃ)およびＨＥＲ２-ＥＣＤ(Ｄ)の境界の表示はｂＨ１ Ｆａｂと比較して同じ方向で示す。ｂＨ１ Ｆａｂ(４．５Åより近い)と接触する残基を強調して示す。化学組成又は位相幾何学に関して、ｂＨ１の２つのエピトープ間で見かけの類似点はない。 ｂＨ１およびｂＨ１-４４抗体がＶＥＧＦＲ１へのヒトＶＥＧＦ結合を遮断することを示す。ビオチン化ヒトＶＥＧＦ１６５は、漸増濃度のＩｇＧ(ｘ軸)とインキュベートし、次いで固定したヒトＶＥＧＦＲ１-Ｆｃに捕捉させ、基質を加えた西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンにて検出した(基準化した％ＯＤ４５０、ｙ軸)。 ｂＨ１およびｂＨ１-４４変異体のアラニンスキャニング結果を示す。アラニンスキャニング突然変異誘発は、ＶＥＧＦおよび／またはＨＥＲ２結合のために機能的に重要な残基を同定した。Ｆ値は、各々スキャンした残基の抗原結合に対する相対的な寄与を表す。Ｆ値は、ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２へのｂＨ１-４４結合について決定し(黒色バー)、ｂＨ１のＦ値(白色バー)と比較した。括弧のアミノ酸は、ｂＨ１と異なるｂＨ１-４４残基を意味する。このグラフは図５６から応用した。 ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２に対するｂＨ１-４４ Ｉ２９Ａ Ｙ３２Ａ ｂＨ１-４４およびＲ５０Ａ Ｒ５８Ａ ｂＨ１-４４の抗体の結合を示す。ＥＬＩＳＡ結合アッセイは、ｂＨ１-４４ ＩｇＧおよび２つの二重突然変異体の、ビオチン化ＶＥＧＦ１０９(左)又はＨＥＲ２-ＥＣＤ(右)へ結合し、固定した抗ＶＥＧＦ抗体又はハーセプチンとそれぞれ競争する能力を示す。Ｉ２９Ａ／Ｙ３２Ａ ＬＣ変異体はＶＥＧＦの結合を失っていたのに対して、ＨＥＲ２に対する親和性の維持はｂＨ１-４４と同程度であった。Ｒ５０Ａ／Ｒ５８Ａ ＨＣ変異体は、ＨＥＲ２に対する親和性を失っていたが、ＶＥＧＦ結合を保持する。 抗原結合と関係しているエンタルピー変化の熱量測定値を示す。図５９Ａ−Ｆはそれぞれ、ＶＥＧＦへのｂＨ１結合、ＨＥＲ２へのｂＨ１結合、ＶＥＧＦへのｂＨ１-４４結合、ＨＥＲ２へのｂＨ１-４４結合、ＶＥＧＦへのｂＨ１-４４ ＨＣ-Ｒ５０Ａ＋Ｒ５８Ａ結合、ＨＥＲ２へのｂＨ１-４４ ＬＣ−Ｉ２９Ａ＋Ｙ３２Ａ結合についてのデータを示す。図は、個々の熱パルス(上図)と反応の熱(下図)を示す。これらは、注入終了時の抗原に対する抗体比の関数としてプロットした各パルスの座標により算出した。エンタルピー変化の小さいものは相対的に高いタンパク質濃度を必要とした。これは、親和性が高い場合のＫＤの正確な評価を除く。図５９Ａ−Ｄは、１０−２０μＭの濃度のＨＥＲ２-ＥＣＤのＶＥＧＦ１０９の溶液は、１００から２００μＭの濃度のｂＨ１又はｂＨ１-４４ Ｆａｂを１５回注入して滴定した。図５９Ｅ−Ｆは、１０〜２０μＭの濃度のＶＥＧＦ１０９又はＨＥＲ２-ＥＣＤの溶液は、１５０および２５０μＭの濃度のｂＨ１-４４ ＬＣ−Ｉ２９Ａ＋Ｙ３２Ａ Ｆａｂ又はｂＨ１-４４ ＨＣ-Ｒ５０Ａ＋Ｒ５８Ａ Ｆａｂを２０回注入して滴定した。図５９Ｅの滴定ナンバー１および１３は、計測器ノイズのため分析から除いた。 ｂＨ１変異体およびハーセプチン(登録商標)抗体の熱力学の性質を示す。各々の二重特異性変異体(ｂＨ１、ｂＨ１-８１およびｂＨ１-４４)は、ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２結合について好適なエンタルピーおよびエントロピーによって特徴付けされる熱力学の性質を有する。それぞれＨＥＲ２又はＶＥＧＦに対する親和性を失っていた変異体ＨＣ-Ｒ５０Ａ＋Ｒ５８ＡおよびＬＣ−１２９Ａ＋Ｙ３２Ａは、ｂＨ１-４４と同様な熱力学の性質を表す。ｂＨ１-４４／ＨＥＲ２相互作用の熱力学の性質は、ハーセプチン／ＨＥＲ２と異なっている。 アラニンスキャニング突然変異誘発データに基づいた、ＨＥＲ２結合についてのｂＨ１、ｂＨ１-４４およびハーセプチン(登録商標)抗体ホットスポットの比較を示す。ホットスポット残基は、ハーセプチン(登録商標)(ハーセプチン)構造又はｂＨ１ Ｆａｂ構造(ｂＨ１、ｂＨ１-４４)にマップし、灰色で強調した。ホットスポットは、全結合自由エネルギー（ΔＧ）の１０％以上のΔΔＧとして定義する。構造上の接触部位(構造において抗原の４．５Å内)は、明るい点線で外形を表す。ＨＣおよびＬＣは、黒色の点線で分かれる。下線を付した残基は、配列がハーセプチン(登録商標)と異なる。 ＶＥＧＦ又はＨＥＲ２と結合するｂＨ１-４４ Ｆａｂ結合と関係する推定の熱容量変化を示す。ΔＣｐは、２０から３７℃の間のΔＨの温度依存の傾斜から決定した。この範囲を超えると、ΔＣｐは、ΔＨとＴの直線関係に基づくと、Ｔから独立しているように見える(ｂＨ１-４４／ＨＥＲ２についてはＲ＝０．９９１、ｂＨ１-４４／ＶＥＧＦのためのＲ＝０．９９８９)。ハーセプチン(登録商標)／ＨＥＲ２のΔＣｐは、Kelley et al. (Biochemistry, 1992)によって予め決定した。 ＢＩＡｃｏｒｅによって測定したｂＨ１-４４変異体の結合動態を示す。図は、固定した(Ａ) ＶＥＧＦ１０９又は(Ｂ) ＨＥＲ２-ＥＣＤと、０．５μＭ溶液のｂＨ１-４４ Ｆａｂ(ＡおよびＢ：上)、ｂＨ１−４４−ＬＣ−Ｙ３２(Ａ：下から２番目；Ｂ：上から２番目)、ｂＨ１−４４−ＬＣ−Ｉ２９Ａ＋Ｙ３２Ａ(Ａ：下；Ｂ：下から２番目)、およびｂＨ１−４４−ＨＣ−Ｒ５０Ａ＋Ｒ５８Ａ(Ａ：上から２番目；Ｂ：下)との間の結合相互作用についての代表的な時間に対する反応のプロットのオーバーレイを示す。トレースは、同じ固定したＣＭ５チップへの結合を表す。このチップは各Ｆａｂ実行の後に再生した。ＶＥＧＦへのｂＨ１−４４−ＬＣ−Ｉ２９Ａ＋Ｙ３２Ａについて、または、０．５μＭのＨＥＲ２へのｂＨ１−４４−ＨＣ−Ｒ５０Ａ＋Ｒ５８Ａについて、結合は検出されなかった。変異体ｂＨ１−４４−Ｙ３２Ａは、野生型ｂＨ１-４４と比較してＶＥＧＦへの結合の有意な減弱を表した。 ｂＨ１の結晶構造上のｂＨ１-４４の特異性を決定している残基のマッピングを示す。ＶＥＧＦ結合に重要な残基(ＬＣ-Ｉ２９およびＬＣ-Ｙ３２：ＡおよびＢ)、及びＨＥＲ結合に重要な残基(ＨＣ-Ｒ５０およびＨＣ-Ｒ５８；ＣおよびＤ)を、ｂＨ１／ＶＥＧＦ(ＡおよびＣ、２．６Å分解能)又はｂＨ１／ＨＥＲ２(ＢおよびＤ、２．９Å分解能)結晶構造上に棒状の濃い灰色で示す。残基Ｉ２９およびＹ３２は、ＶＥＧＦ-結合に必要なＣＤＲ-Ｌ１ループ立体構造を維持するように働く鎖内相互作用に伴うようである。Ｉ２９は、ＨＥＲ２構造において溶媒に露出される。Ｙ３２は、ＨＥＲ２に対してパックするが、生産的な抗原接触には係わらない。Ｒ５０およびＲ５８は、ＨＥＲ２上のＤ５６０およびＥ５５８に対してパックし、電荷-電荷相互作用に係わるようである。Ｒ５０およびＲ５８は、ＶＥＧＦ溶媒構造において溶媒に露出する溶媒である。 ハーセプチン(登録商標)変異体Ｆａｂ(Ｒ５０Ａ、Ｒ５８ＡおよびＲ５０Ａ／Ｒ５８Ａ)の発現を示す。
（本発明の詳細な説明）
本発明は、多重特異性抗体および抗体断片の製造方法、並びにこれら方法を用いて同定した抗体及びその方法を提供する。通常、本発明の方法は、ライブラリにおいて安定して発現されうる変異体を生成するために、抗体の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインを多様化することを伴う。次いで、２つのエピトープを特異的に結合することができる多様化された抗体をこのライブラリから選択し、さらに特徴付けする。
本発明の方法を用いて同定された例示的な抗体には、ＨＥＲ２(ヒト上皮性増殖因子レセプター２)及びＶＥＧＦ(血管内皮性増殖因子)の両方を結合する抗体が含まれる。特に、本明細書中、例えば以下の実施例に記載のデータは、ＨＥＲ２抗体の軽鎖相補性決定領域(ＣＤＲ)内の突然変異がＨＥＲ２だけでなく関係のないタンパク質抗原についての二重結合能を与えることを示す。ある二重特異性高親和性ＨＥＲ２／ＶＥＧＦ抗体は、広く特徴付けされる。更に、ＨＥＲ２及びＶＥＧＦと複合体化したこの二重特異性Ｆａｂの結晶構造を示し、突然変異誘発によるＦａｂ残基のエネルギー的な貢献を評価する。２つの抗原のための結合部位は広く重なっており、ＨＥＲ２と接触するＣＤＲ残基の大部分はＶＥＧＦを係合する。しかしながら、エネルギー的に、重鎖の残基はＨＥＲ２特性に影響するのに対して、軽鎖はＶＥＧＦ特異性に影響する。
ＨＥＲ２／ＶＥＧＦ二重特異性抗体は、インビトロ及びインビボで、ＨＥＲ２およびＶＥＧＦの両方が媒介する細胞増殖を阻害する。これらの結果は、抗体の軽鎖可変ドメインの配列を変更することにより、二重特異性及び機能を有する抗体を生成することができることを示す。例えば、ｂＨ１-４４およびｂＨ１-８１は、ＨＥＲ２が媒介する腫瘍細胞増殖とＶＥＧＦが媒介する腫瘍血管形成といった、腫瘍発達の２つのメカニズムをターゲットとする可能性がある。単一の抗体によって２つの抗原を同時に標的とすることは、併用療法の変形例である。
Ｉ．定義
「多重特異性抗体」なる用語は最も広義に用いられ、重鎖可変ドメイン(ＶＨ)および軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)を含む抗体を特別に包含する。このＶＨＶＬユニットはポリエピトープ性特異性を有する(すなわち、１つの生体分子上の２つの異なるエピトープ又は異なる生体分子上の各エピトープに結合することが可能である)。このような多重特異性抗体には、完全長抗体、２以上のＶＬおよびＶＨドメインを有する抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディおよびトリアボディのような抗体断片、共有結合又は非共有結合して連結されている抗体断片を含むが、これらに限定されない。「ポリエピトープ性特異性」は、同じ又は異なる標的(一又は複数)上の２以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。「単一特異性」は、１つのエピトープにのみ結合する能力を指す。ある実施態様によると、多重特異性抗体は、５μＭから０．００１ｐＭ、３μＭから０．００１ｐＭ、１μＭから０．００１ｐＭ、０．５μＭから０．００１ｐＭ、又は０．１μＭから０．００１ｐＭの親和性で、各々のエピトープに結合するＩｇＧ１型である。
基本的な４-鎖抗体ユニットは２つの同一の軽(Ｌ)鎖と２つの同一の重(Ｈ)鎖から構成されるヘテロ四量体の糖タンパクである(ＩｇＭ抗体は、基本的なヘテロ四量体ユニットとそれに付随するＪ鎖と称される付加的なポリペプチドの５つからなり、よって１０の抗原結合部位を有するが、分泌されたＩｇＡ抗体は重合して、基本的４-鎖ユニットとそれ付随するＪ鎖のうち２-５つを含む多価集合を形成可能である)。ＩｇＧの場合、４-鎖ユニットは一般的に約１５００００ダルトンである。それぞれのＬ鎖は１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に結合するが、２つのＨ鎖はＨ鎖のアイソタイプに応じて一又は複数のジスルフィド結合により互いに結合している。それぞれのＨ及びＬ鎖はまた規則的な間隔を持った鎖内ジスルフィド結合を持つ。それぞれのＨ鎖は、α及びγ鎖の各々に対しては３つの定常ドメイン(ＣＨ)が、μ及びεアイソタイプに対しては４つのＣＨドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)をＮ末端に有する。それぞれのＬ鎖は、その他端に定常ドメイン(ＣＬ)が続く可変ドメイン(ＶＬ)をＮ末端に有する。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)と整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。ＶＬとＶＨは共同して対になって、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性は、例えばBasic and Clinical Immunology, ８版, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow(編), Appleton ＆ Lange, Norwalk, CT, 1994, ７１頁及び６章を参照のこと。
任意の脊椎動物種からのＬ鎖には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明確に区別される型の一つを割り当てることができる。また、その重鎖の定常ドメイン(ＣＨ)のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンには異なったクラス又はアイソタイプを割り当てることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという免疫グロブリンの５つの主要なクラスがあり、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる重鎖を有する。さらにγ及びαのクラスは、ＣＨ配列及び機能等の比較的小さな差異に基づいてサブクラスに分割され、例えば、ヒトにおいては次のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が発現する。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が抗体の間で配列が広範囲に異なることを意味する。Ｖドメインは抗原結合性を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定める。しかし、可変性は可変ドメインの１１０-アミノ酸スパンを通して均等には分布されていない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９−１２アミノ酸長である「高頻度可変領域」と称される極度の可変性を有するより短い領域によって分離された１５−３０アミノ酸のフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる比較的不変の伸展からなる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメイン各々は、大きなβ-シート配置をとり、３つの高頻度可変領域により接続された４つのＦＲ領域を含み、それはループ状の接続を形成し、β-シート構造の一部を形成することもある。各鎖の高頻度可変領域はＦＲにより他の鎖からの高頻度可変領域とともに極近傍に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ED. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接は関係ないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)における抗体の寄与を示す。
ここで使用される「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。高頻度可変領域は、一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、ＶＬの、概ね残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）周辺と、ＶＨの概ね３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）；Kabatら、Sequences of Protein of Immunological Interest, 第５版、Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）、及び／又は「高頻度可変ループ」由来のそれらの残基（例えば、ＶＬの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５１（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）と、ＶＨの２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）；Chothia及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）とを含む。
「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、一般的にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と同定される４つのＦＲを持つ。ＣＤＲがカバットの定義に従うならば、軽鎖ＦＲ残基は残基およそ１−２３（ＬＣＦＲ１）、３５−４９（ＬＣＦＲ２）、５７−８８（ＬＣＦＲ３）および９８−１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、重鎖ＦＲ残基は重鎖残基の残基１−３０（ＨＣＦＲ１）、３６−４９（ＨＣＦＲ２）、６６−９４（ＨＣＦＲ３）および１０３−１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。ＣＤＲが高頻度可変ループからのアミノ酸残基を含むならば、軽鎖ＦＲ残基は軽鎖の残基１−２５（ＬＣＦＲ１）、３３−４９（ＬＣＦＲ２）、５３−９０（ＬＣＦＲ３）および９７−１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、重鎖ＦＲ残基は重鎖残基の残基１−２５（ＨＣＦＲ１）、３３−５２（ＨＣＦＲ２）、５６−９５（ＨＣＦＲ３）および１０２−１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。場合によって、ＣＤＲがカバットの定義によるＣＤＲと高頻度可変ループのものの両方からのアミノ酸を含む場合、ＦＲ残基はそれに応じて調節されるであろう。例えば、ＣＤＲＨ１がアミノ酸Ｈ２６−Ｈ３５を含む場合、重鎖ＦＲ１残基は位置１−２５にあり、ＦＲ２残基は位置３６−４９にある。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選別において最も共通して生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選別は、可変ドメイン配列のサブグループから行う。一般に、配列のサブグループはカバットによるサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、サブグループはカバットによるサブグループκIである。一実施態様では、ＶＨについて、サブグループはカバットによるサブグループＩＩＩである。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、一般に少量で存在する突然変異等の、モノクローナル抗体の産生の間に生じる可能性のある突然変異を除いて、実質的に同一であり、同じエピトープ(一又は複数)に結合する。このようなモノクローナル抗体は、一般に、標的を結合する可変領域を含む抗体を包含しており、この抗体は、複数の抗体からの抗体の選択を含むプロセスによって得られたものである。例えば、この選択プロセスは、複数のクローン、例えばハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールからの、特定のクローンの選択であり得る。選択された抗体を更に変更することにより、例えば標的に対する親和性を向上させる、抗体をヒト化する、細胞培養液中でのその産生を向上させる、インビボでのその免疫原性を低減する、多重特異性抗体を作製する等が可能であること、並びに、変更した可変領域配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、通常他の免疫グロブリンと混同していない点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、ほぼ均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作ることができ、それらの技術には例えばハイブリドーマ法（例えば、Kohler等、Nature, 256:495 (1975); Harlow等、Antibodies: A loboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第２版 1988); Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)）、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第4816567号参照）、ファージディスプレイ法（例えば、Clarkson等、Nature, 352:624-628 (1991); Marks等、J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Sidhu等、J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee等、J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); 及びLee等、J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)参照）、及びヒト免疫グロブリン座位又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する動物からのヒト又はヒト様抗体を産生する技術（例えば、WO1998/24893; WO1996/34096; WO1996/33735; WO1991/10741; Jackobovits等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits等、Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann等、Year in Immuno., 7:33 (1993); 米国特許第5545806号；同第5569825号；同第5591669号（全てGenPharm）；同第5545807号；WO1997/17852; 米国特許第5545807号；同第5545806号；同第5569825号；同第5625126号；同第5633425号；及び同第5661016号；及びMarks等、Bio/Technology, 10:779-783 (1992); Longerg等、Nature, 368:856-859 (1994); Morrison, Nature, 368:812-813 (1994); Fishwild等、Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996); 及びLongerg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)）が含まれる。
「インタクト」の抗体は、抗原-結合部位、並びにＣＬ及び少なくとも重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)又はそれらのアミノ酸配列変異体であってよい。好ましくは、無傷の抗体は一又は複数のエフェクター機能を有する。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体（米国特許第５６４１８７０号、実施例２；Zapata等, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
「線形抗体」という表現は、Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)に記載された抗体を意味する。簡単に言えば、これら抗体は、相補的な軽鎖ポリペプチドと共に抗原結合領域の対を形成する一対の直列のＦｄセグメント（ＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１）を含む。直鎖状抗体は二重特異性であっても単一特異性であってもよい。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片と、容易に結晶化する能力を反映して命名された残りの「Ｆｃ」断片を産生する。Ｆａｂ断片は全長Ｌ鎖とＨ鎖の可変領域ドメイン(ＶＨ)、及び一つの重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)からなる。抗体のペプシン処理により、単一の大きなＦ(ａｂ')２断片が生じ、これは２価の抗原結合部位を持つ２つのジスルフィド結合されたＦａｂ断片にほぼ対応し、抗原を交差結合させることができるものである。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨは、ここでは定常ドメインのシステイン残基(類)が遊離のチオール基を持つＦａｂ'を表す。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、通常はＦａｂ'断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
Ｆｃ断片はジスルフィドにより一緒に保持されている双方のＨ鎖のカルボキシ末端部位を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列により決定され、その領域は、所定の型の細胞に見出されるＦｃレセプター(ＦｃＲ)によって認識される部位である。
「Ｆｖ」は、完全な抗原-認識及び-結合部位を含む最小の抗体断片である。この断片は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの高頻度可変ループ(Ｈ及びＬ鎖から、それぞれ３つのループ)が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略称される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖内に結合したＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)；Borrebaeck 1995, 以下を参照のこと。
「ダイアボディ(diabodies)」という用語は、鎖間ではなく鎖内でＶドメインを対形成させ、結果として二価の断片、すなわち２つの抗原-結合部位を有する断片が得られるように、ＶＨとＶＬドメインとの間に、短いリンカー(約５-１０残基)を持つｓＦｖ断片（前の段落を参照）を構築することにより調製される小型の抗体断片を意味する。二重特異性ダイアボディは２つの「交差」ｓＦｖ断片のヘテロダイマーであり、そこでは２つの抗体のＶＨ及びＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開９３／１１１６１号；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により十分に記載されている。
非ヒト(例えば齧歯類)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト抗体から得られた最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の抗体特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、状況に応じて免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。
本明細書で使われるように、「コドンセット」は所望の変異体アミノ酸をコードするのに用いられる、一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列を指す。一組のオリゴヌクレオチドは、コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの可能な組合せのすべてを表す配列であって所望のアミノ酸群をコードする配列を含み、例えば固相法によって合成することができる。標準的なコドン指定形式はＩＵＢコードのものであり、このコードは当技術分野で公知であり本明細書で記載されている。コドンセットは、一般的に、イタリック体の３文字、例えばＮＮＫ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＤＶＫなどで表される(例えば、ＮＮＫコドンは、コドンの位置１及び位置２ではＮ＝Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃであり、位置３ではＫ＝Ｇ／Ｔ(等モル比)であることを示し、２０すべての天然のアミノ酸をコードする)。ゆえに、本明細書中で用いられる「非ランダムコドンセット」とは、ここに記載のアミノ酸選別の基準を部分的、好ましくは完全に満たす選択アミノ酸をコードするコドンセットを指す。ある位置の選択されたヌクレオチド「縮重」によるオリゴヌクレオチドの合成は当技術分野で公知であり、例えば、ＴＲＩＭ手法が知られている(Knappek et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 1999)；Garrard and Henner, Gene 128:103, 1993)。そのようなある種のコドンセットを有するオリゴヌクレオチドのセットは、市販の核酸シンセサイザー（Applied Biosystems, Foster City, CAなどから入手可能）を使って合成することができ、または市販品を入手することができる（例えば、Life Technologies, Rockville, MDから）。したがって、特定のコドンセットを有する合成オリゴヌクレオチドセットは、一般的に異なる配列の複数のオリゴヌクレオチドを含み、この相違は配列全体の中のコドンセットによるものである。本発明で使用されるように、オリゴヌクレオチドは可変ドメイン核酸テンプレートへのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、そうするとは限らないが、例えばクローニングに役立つ制限酵素部位を含むこともできる。
対象の抗原を「結合する」本発明の抗体は、抗体が抗原を発現するタンパク質、細胞ないし組織を標的とした治療薬及び／又は診断剤として有用となるように十分な親和性を有して抗原を結合するものである。このような実施態様では、「非標的」タンパク質に対する抗体の結合範囲は、蛍光活性化細胞分類(ＦＡＣＳ)分析又は放射性免疫沈降法(ＲＩＡ)又はＥＬＩＳＡにより決定した場合、その特定の標的タンパク質に対する抗体の結合の約１０％未満である。標的分子への抗体の結合に関して、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープに対する「特異的結合」又は「に特異的に結合する」又は「に特異的な」といった用語は、非特異的な相互作用とは測定可能な差異を有する結合を意味する(例えば、ｂＨ１-４４又はｂＨ１-８１では、非特異的な相互作用は、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ウシ胎児血清又はニューロアビジンへの結合である)。特異的結合は、例えば、コントロール分子の結合と比較して分子の結合を決定することにより測定することができる。例えば、特異的結合は、標的、例えば標識していない過剰な量の標的に類似したコントロール分子との競合により決定することができる。この場合、プローブに対する標識した標的の結合が、標識していない過剰な量の標的により競合的に阻害された場合、特異的結合が示される。ここで用いる特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープに対する「特異的結合」又は「に特異的に結合する」又は「に特異的である」といった用語は、例えば、少なくともおよそ２００ｎＭ、あるいは少なくともおよそ１５０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ１００ｎＭ、あるいは少なくともおよそ６０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ５０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ４０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ３０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ２０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ１０ｎＭ、あるいは少なくともおよそ８ｎＭ、あるいは少なくともおよそ６ｎＭ、あるいは少なくともおよそ４ｎＭ、あるいは少なくともおよそ２ｎＭ、あるいは少なくともおよそ１ｎＭ又はそれ以上の対標的Ｋｄを有する分子によって提示されうる。一実施態様では、「特異的な結合」なる用語は、分子が他のいかなるポリペプチド又はポリペプチドエピトープに実質的に結合しないで特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合する結合を指す。
一般的に「結合親和性」は、分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強度を意味する。特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば抗体と抗原)間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を意味する。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数(Ｋｄ)として表される。望ましくは、Ｋｄは、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、６ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ又はそれ以上の強さである。およそ親和性は、本明細書中に記載のものを含む当業者に公知の共通した方法によって測定することができる。低親和性抗体は抗原にゆっくり結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は抗原により密接により長く結合したままとなる。結合親和性の様々な測定方法が当分野で公知であり、それらの何れかを本発明のために用いることができる。
一実施態様では、本発明の「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、およそ１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のBIAcoreTM-2000又はBIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)にて表面プラズモン共鳴アッセイを行ってＫｄ又はＫｄ値を測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(Ｋｏｎ)と解離速度(Ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,ら, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
また、本発明の「結合速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」は、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のBIAcoreTM-2000又はBIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いた前述と同じ表面プラズモン共鳴アッセイにて測定される。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(およそ０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。その後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(Ｋｏｎ)と解離速度(Ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,ら, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。しかし、上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定するのが好ましい。
本発明のポリペプチドに関して「生物学的に活性な」および「生物学的活性」および「生物学的特徴」は、特段の記載がない限り、生物各的な分子に結合する能力を有することを意味する。
「生物学的分子」は、核酸、タンパク質、糖質、脂質およびこれらの組合せを指す。一実施態様では、生物学的分子は天然に存在する。
「単離された」とは、ここで開示された種々の抗体を記述するために使用するときは、発現した細胞又は細胞培養物から同定され分離され及び／又は回収された抗体を意味する。その自然環境の混入成分とは、ポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように十分なほど精製される。ポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
「コントロール配列」なる用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列或いは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合しているか、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合しているか、又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター或いはリンカーが使用される。
ここで同定されるポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、比較するポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ-２又はＭｅｇａｌｉｇｎ(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能である。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ(登録商標) Ｖ４.０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
ここに記載するアミノ酸配列は、特に明記しない限り隣接するアミノ酸配列である。
本発明による「構造的に非類似の」生物学的分子は、同じクラス内にない生物学的分子(タンパク質、核酸、脂質、糖質など)を指すか、例えば、タンパク質を指す場合、互いに比較して６０％未満のアミノ酸同一性、５０％未満のアミノ酸同一性、４０％未満のアミノ酸同一性、３０％未満のアミノ酸同一性、２０％未満のアミノ酸同一性又は１０％未満のアミノ酸同一性を有する。
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プローブが短くなるとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション配列の間で所望される同一性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにすることになり、低い温度はストリンジェントを低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology(Wiley Interscience Publishers, 2003)を参照のこと。
ここで定義される「ストリンジェントな条件」又は「高度なストリンジェンシー条件」は、(１)洗浄に低イオン強度及び高温度を用いる、例えば、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム；(２)ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる、例えば、４２℃で、５０％(ｖ／ｖ)ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム；又は(３)４２℃で、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム)、５０ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ６．８)、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波処理サケ***ＤＮＡ(５０μｇ／ｍｌ)、０．１％ＳＤＳ、及び１０％の硫酸デキストラン溶液を用いた溶液中で終夜ハイブリダイズさせ、４２℃の０．２×ＳＳＣ(塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム)にて１０回洗浄し、ついで５５℃で、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を１０回行うものによって同定される。
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989)に記載されているように同定され、上記のものよりも低いストリンジェントの洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件を使用する。中程度のストリンジェント条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム)、５０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７．６)、５×デンハード液、１０％硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ***ＤＮＡを含む溶液中にて３７℃で終夜インキュベーションし、次いで１×ＳＳＣ中にて約３７−５０℃でフィルターを洗浄することを含む。当業者であれば、プローブ長などの因子に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかは理解されるであろう。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球及びマクロファージ)上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲｓ)と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。抗体は細胞障害細胞を「備えて」おり、これはこのような死滅には絶対に必要なものである。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, PNAS (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。好適なＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性型レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ)を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ＩＴＩＭ)を含んでいる(Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲsに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994); 及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲsはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。また、該用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送を担い(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim等, J. Immunol.24:249 (1994))、免疫グロブリンのホメオスタシスを調節する新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。エフェクター細胞は天然源、例えば血液から単離してもよい。
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
「治療的有効量」なる用語は、対象の疾患又は疾病を治療するための抗体または抗体断片の量を指す。腫瘍(例えば癌性腫瘍)の場合は、治療的有効量の抗体ないし抗体断片(例えばＨＥＲ２及びＶＥＧＦを特異的に結合する多重特異性抗体ないし抗体断片)は、癌細胞の数を減少させる、腫瘍の大きさを小さくする、癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害する(すなわち、ある程度に遅く、好ましくは止める)、腫瘍の転移を阻害する(すなわち、ある程度遅く、好ましくは止める)、腫瘍の成長をある程度阻害する、及び／又は疾患に関連する一又は複数の症状をある程度和らげうる。ある程度、抗体ないし抗体断片は、成長を妨げ及び／又は現存の癌細胞を殺し得、細胞***停止性及び／又は細胞障害性である。癌治療に対しては、インビボにおける効力は、例えば生存期間、病状の進行時間(ＴＴＰ)、応答速度(ＲＲ)、応答期間、及び／又は生活の質の測定により測定される。
「低減する又は阻害する」とは、概して好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の減少を引き起こす能力を指す。低減する又は阻害するとは、治療する疾患の症状、転移の存在又は大きさ、原発腫瘍のサイズ、又は血管形成性疾患の血管の大きさ又は数を指しうる。
「癌」及び「癌性」なる用語は、典型的には調節されない細胞の成長／増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。良性及び悪性の癌は、この定義に含まれる。癌の例には、これらに限定するものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が含まれる。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌を含む胃(gastric及びstomach)癌、膵癌、神経膠芽腫、膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌(例えば、腎臓細胞癌腫)、肝癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門部の癌腫、陰茎癌腫、メラノーマ、及び様々な種類の頭頸部癌が含まれる。
「初期段階の癌」は、浸潤性でも転移性でもなく、又はステージ０、Ｉ又はＩＩの癌として分類される癌を意味する。
「前癌性」なる用語は、典型的に癌に進行する又は癌に発達する症状ないし成長を指す。
「非転移性」とは、良性である癌、又は原発部位に止まり、リンパ管や血管系ないしは原発部位以外の組織に浸透しない癌を意味する。一般的に、非転移性癌は、ステージ０、Ｉ又はＩＩの癌、場合によってステージＩＩＩの癌のいずれかの癌である。
「ＨＥＲ２の異常な活性化を伴う非悪性疾患又は障害」は、疾患ないし障害を有するか又はその素因がある被検体の細胞又は組織においてＨＥＲ２の異常な活性化が生じている癌を伴っていない症状である。このような疾患又は障害の例には、自己免疫性疾患(例えば乾癬)(下記の定義を参照)；子宮内膜症；強皮症；再狭窄；大腸ポリープ、鼻ポリープ又は胃腸ポリープといったポリープ；線維腺腫；呼吸器疾患(例として、慢性気管支炎、急性の喘息およびアレルギー性喘息を含む喘息、嚢胞性線維症、気管支拡張症、アレルギー性又は他の鼻炎又は副鼻腔炎、α１-抗トリプシン欠乏症、咳、肺気腫、肺線維症又は過剰反応性の気道、慢性閉塞性肺性疾患、及び慢性閉塞性肺疾患)；胆嚢炎；神経線維腫症；多発性嚢胞腎；炎症性疾患；乾癬および皮膚炎を含む皮膚疾患；血管系疾患；血管性上皮細胞の異常な増殖を伴う状態；胃腸潰瘍；メネトリエ病、分泌腺腫又はタンパク質喪失症候群；腎臓疾患；血管形成性疾患；眼性疾患、例えば加齢性黄斑変性症、推定眼ヒストプラスマ症候群、増殖性糖尿病性網膜症由来の網膜血管新生、網膜脈管形成、糖尿病性網膜症又は加齢性黄斑変性；骨関連症、例えば骨関節炎、くる病および骨粗鬆症；大脳虚血発症後の損傷；線維性又は浮腫性疾患、例えば熱傷、外傷、放射線、脳卒中、低酸素又は乏血後の肝硬変、肺線維症、サルコイドーシス、甲状腺炎、全身過粘稠度症候群、 オスラー・ランデュ・ウェーバー病、慢性閉塞性肺疾患又は浮腫；皮膚の過敏性反応；糖尿病性網膜症および糖尿病性ネフロパシ；ギラン‐バレー症候群；移植片対宿主病又は移植拒絶反応；パジェット病；骨又は関節の炎症；光老化(例えば、ヒトの皮膚のＵＶ照射によって生じる)；良性前立腺肥大；アデノウイルス、ハンタウイルス、ボレリア・ブルグドルフェリ、エルシニア菌種およびボルデテラペルツッシスから選択される微生物病原体を含む特定の微生物感染；血小板凝集によって生じる血栓；生殖系状態、例えば子宮内膜症、卵巣の過刺激症候群、子癇前症、機能障害性子宮出血又は機能性子宮出血；関節滑膜炎；アテローム；急性及び慢性のネフロパシ(増殖性糸球体腎炎および糖尿病性腎疾患を含む)；湿疹；肥大性瘢痕形成；エンドトキシンショックおよび真菌感染；家族性腺腫性ポリープ症；神経変性疾患(例えばアルツハイマー病、ＡＩＤＳ関連痴呆、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、脊髄筋萎縮および小脳変性)；骨髄形成異常症候群；無形成性貧血；虚血性傷害；肺、腎臓又は肝臓の線維形成；Ｔ細胞が媒介する過敏性症候群；乳幼児肥大性先天性幽門閉塞；泌尿器閉塞性症候群；乾癬の関節炎；及び橋本甲状腺炎が含まれる。
本明細書中の「自己免疫疾患」は、個体の自己組織又は同時分離又はその徴候又は結果として生じるその症状に対する及びそれらから生じる疾患又は症状である。自己免疫疾患又は症状の例として、限定するものではないが、関節炎(関節リウマチ(例えば急性の関節炎、慢性の関節リウマチ、痛風性関節炎、急性の痛風性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節症、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬の関節炎、椎骨関節炎及び若年性発症関節リウマチ、骨関節炎、関節炎慢性化、関節炎変形、関節炎慢性原発、反応性関節炎、及び強直性脊椎炎)、炎症性過剰増殖性皮膚病、乾癬、例えばプラーク乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬及び爪乾癬)、皮膚炎、例として接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、ヘルペス状の皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、一次刺激物接触皮膚炎及び過敏性皮膚炎、Ｘ連鎖性過剰ＩｇＭ症候群、蕁麻疹、例えば慢性アレルギー性蕁麻疹及び慢性特発性蕁麻疹、例として慢性自己免疫蕁麻疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性上皮性表皮壊死症、強皮症(全身強皮症を含む)、硬化症、例えば全身性硬化症、多発性硬化症(ＭＳ)、例えば脊椎-眼(spino-optical) ＭＳ)、一次進行性ＭＳ(ＰＰＭＳ)及び再発性寛解ＭＳ(ＲＲＭＳ)、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、硬化症汎発、失調性硬化症、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)(例えばクローン病、自己免疫性胃腸疾患、大腸炎、例えば潰瘍性大腸炎、大腸性潰瘍、微細な大腸炎、膠原性大腸炎、大腸ポリープ、壊死性全腸炎及び経壁の大腸炎、及び自己免疫炎症性腸疾患)、膿皮症壊疽、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、上強膜炎、呼吸窮迫症候群、例として成人性又は急性の呼吸窮迫症候群(ＡＲＤＳ)、髄膜炎、葡萄膜の全部又は一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫血液疾患、リウマチ様脊椎炎、リウマチ様関節滑膜炎、突発性聴力障害、ＩｇＥ媒介性疾患、例えばアナフィラキシー及びアレルギー性鼻炎及びアトピー性鼻炎、脳炎、例えばラスマッセンの脳炎及び辺縁及び／又は脳幹脳炎、ブドウ膜炎、例として、前部ブドウ膜炎、急性前ブドウ膜炎、肉芽腫ブドウ膜炎、非顆粒性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎又は自己免疫ブドウ膜炎、ネフローゼ症候群を有する又は有さない糸球体腎炎(ＧＮ)、例として、慢性又は急性の糸球体腎炎、例として原発性ＧＮ、免疫性ＧＮ、膜性ＧＮ(膜性ネフロパシ)、特発性膜性ＧＮ又は特発性膜性ネフロパシ、膜又は膜性増殖性ＧＮ(ＭＰＧＮ)(タイプＩ及びタイプＩＩを含む)、急速進行性ＧＮ、アレルギー性症状、アレルギー性反応、湿疹、例としてアレルギー性又はアトピー性湿疹、喘息、例えば喘息気管支炎、気管支喘息及び自己免疫喘息、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状及び慢性炎症反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫心筋炎、白血球粘着力欠損、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)又は全身性ループスエリテマトーデス、例えば皮膚ＳＬＥ、亜急性の皮膚ＳＬＥ、新生児期ループス症候群(ＮＬＥ)、紅班性狼瘡汎発、ループス(例としてループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、円板状ループス、脱毛症ループス)、若年性開始型(Ｉ型)真正糖尿病、例として小児インシュリン依存性真正糖尿病(ＩＤＤＭ)、成人発症型真正糖尿病(ＩＩ型糖尿病)、自己免疫性糖尿病、特発性の尿崩症、サイトカイン及びＴリンパ球によって媒介される急性及び遅発性過敏症と関係する免疫応答、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、例としてリンパ腫肉芽腫症、ヴェゲナーの肉芽腫症、無顆粒球症、脈管炎、例として血管炎、大血管性血管炎(例えば大脈管脈管炎(リウマチ性多発性筋痛及び巨細胞(高安)動脈炎を含む)、中脈管脈管炎(川崎病及び結節性多発動脈炎を含む)、微小多発動脈炎、ＣＮＳ脈管炎、壊死性血管炎、皮膚性血管炎又は過敏性血管炎、全身性壊死性血管炎、及びＡＮＣＡ関連の脈管炎、例としてチャーグ-ストラウス脈管炎又は症候群(ＣＳＳ))、側頭動脈炎、無形成性貧血、自己免疫無形成性貧血、クームズ陽性貧血症、ダイアモンドブラックファン貧血症、溶血性貧血又は免疫溶血性貧血、例として自己免疫溶血性貧血(ＡＩＨＡ)、悪性貧血(貧血症悪性熱)、アジソン病、純粋な赤血球貧血症又は形成不全(ＰＲＣＡ)、第VIII因子欠損症、血友病Ａ、自己免疫好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外遊出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性疾患、多器官損傷症候群、例えば敗血症、外傷又は出血の二次症状、抗原-抗体複合体関連疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット又はベーチェット病、カールスマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンスジョンソン症候群、類天疱瘡、例えば水疱性類天ぽうそう及び類天疱瘡皮膚、天疱瘡(尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、ペンフィグス粘液膜類天疱瘡及び天疱瘡エリテマトーデスを含む)、自己免疫多腺性内分泌障害、ライター病又は症候群、免疫複合体腎炎、抗体媒介性腎炎、視神経脊髄炎、多発性神経炎、慢性神経障害、例えばＩｇＭ多発性神経炎又はＩｇＭ媒介性神経障害、血小板減少(例えば心筋梗塞患者によるもの)、例えば血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、及び自己免疫性又は免疫媒介性血小板減少、例えば慢性及び急性のＩＴＰを含む特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、自己免疫性精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫性疾患、一次甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫内分泌性疾患、例えば甲状腺炎、例えば自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎(橋本甲状腺炎)又は亜急性の甲状腺炎、自己免疫甲状腺性疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブ病、自己免疫多腺性症候群、例として多腺性症候群(又は、多腺性内分泌障害症候群)、腫瘍随伴症候群、例として神経系新生物関連症候群、例えばランバート-イートン筋無力症症候群又はイートン―ランバート症候群、スティッフマン又はスティッフマン症候群、脳脊髄炎、例として、アレルギー性脳脊髄炎又は脳脊髄炎性アレルギー及び実験的アレルギー性脳脊髄炎(ＥＡＥ)、重症筋無力症、例えば胸腺腫関連の重症筋無力症、小脳性退化、神経ミオトニ、眼球クローヌス又は眼球クローヌス筋硬直症候群(ＯＭＳ)及び感覚系神経障害、多病巣性運動神経障害、シーハン症候群、自己免疫肝炎、慢性肝炎、類狼瘡肝炎、巨細胞肝炎、慢性活動性肝炎又は自己免疫慢性活動性肝炎、リンパ系間隙間質性肺炎(ＬＩＰ)、閉塞性細気管支炎(非移植)対ＮＳＩＰ、ギラン‐バレー症候群、ベルガー病(ＩｇＡネフロパシ)、特発性ＩｇＡネフロパシ、線状ＩｇＡ皮膚病、原発性胆管萎縮症、肺線維症、自己免疫腸疾患症候群、セリアック病、コエリアック病、脂肪便症(グルテン腸疾患)、抵抗性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、アミロトロフィック側索硬化症(ＡＬＳ；筋萎縮性側索硬化症(Lou Gehrig's disease))、冠状動脈疾患、自己免疫性耳疾患、例として、自己免疫内耳疾患(ＡＩＥＤ)、自己免疫聴力障害、眼球クローヌス筋硬直徴候(ＯＭＳ)、多発性軟骨炎、例として、抵抗性又は再発性多発性軟骨炎、肺胞状蛋白症、アミロイドーシス、強膜炎、非癌性リンパ球増多症、一次リンパ球増多症、これにはモノクローナルＢ細胞リンパ球増多症(例えば良性モノクローナル免疫グロブリン症及び未同定の有意なモノクローナル免疫グロブリン血症(monoclonal gammopathy of undetermined significance)、ＭＧＵＳ)が含まれる、末梢性神経障害、腫瘍随伴症候群、チャネル病、例として、癲癇、片頭痛、不整脈、筋疾患、難聴、盲目、周期性麻痺及びＣＮＳのチャネル病、自閉症、炎症性ミオパシ、局所性分節性糸球体硬化症(ＦＳＧＳ)、内分泌性眼障害、ブドウ膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓病、線維症、多内分泌性不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老期痴呆、脱髄性疾患、例として自己免疫脱髄性病、糖尿病性ネフロパシ、ドレスラー症候群、円形脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群(石灰沈着、レイノー現象、食道運動障害、強指症及び毛細管拡張症)、雌雄自己免疫性不妊性、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、再発性中絶、農夫肺、多形性紅斑、心切開術後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性脈管炎、良性リンパ球血管炎、アルポート症候群、肺胞炎、例えばアレルギー性肺胞炎及び繊維化肺胞炎、間隙肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、リーシュマニア症、キパノソミアシス(kypanosomiasis)、住血吸虫症、蛔虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維形成、広汎性間質性肺線維形成、間質性肺線維形成、特発性の肺線維形成、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性***性紅斑、胎児赤芽球症、好酸性筋膜炎(eosinophilic faciitis)、シャルマン症候群、フェルティー症候群、フィラリア(flariasis)、毛様体炎、例えば慢性毛様体炎、ヘテロ慢性毛様体炎、虹彩毛様体炎、又はＦｕｃｈの毛様体炎)、ヘーノホ-シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)感染、エコーウィルス感染、心筋症、アルツハイマー病、パルボウィルス感染、風疹ウィルス感染、種痘後症候群、先天性風疹感染、エプスタインバーウイルス感染、耳下腺炎、エヴァンの症候群、自己免疫性腺機能不全、シドナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎(thromboangitis ubiterans)、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞多発性筋痛、内分泌性眼障害、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎臓症候群、微小変化ネフロパシ、良性家族性及び乏血-再灌流障害、網膜自己免疫、関節炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化症疾患、アスペルミオジェネース(aspermiogenese)、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、腸炎アレルギー、結節性紅斑、leprosum、特発性顔麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱、ハンマンリッチ病、感覚器性(sensoneural)聴力障害、血色素尿症発作(haemoglobinuria paroxysmatica)、性機能低下、回腸炎領域、白血球減少症、単核細胞増加症感染、横移動脊髄炎、一次特発性の粘液水腫、ネフローゼ、眼炎symphatica、精巣炎肉芽腫症、膵炎、多発性神経根炎急性、膿皮症壊疽、Ｑｕｅｒｖａｉｎ甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、抗***抗体による不妊性、非悪性胸腺腫、白斑、ＳＣＩＤ及びエプスタインバーウイルス関連疾患、後天性免疫不全症候群(エイズ)、寄生虫病、例えばLesihmania、毒性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状、白血球-粘着力欠損、サイトカイン及びＴリンパ球に媒介される急性及び遅発性過敏症関連免疫応答、白血球血管外遊出を伴う疾患、多器官損傷症候群、抗原-抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌性不全、末梢性神経障害、自己免疫多腺性症候群Ｉ型、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症(ＡＯＩＨ)、完全脱毛症、拡張型心筋症、後天性表皮水疱症(ＥＢＡ)、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性又は非化膿性副鼻腔炎、急性又は慢性副鼻腔炎、篩骨、正面、上顎骨又は蝶形骨副鼻腔炎、好酸球性関連疾患、例えば好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加症-筋肉痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸性肺炎、熱帯肺好酸球増加症、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギローム又は好酸球性を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、血清陰性脊椎関節炎疹、多内分泌性自己免疫性疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ブラットン症候群、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット‐アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、膠原病と関係する自己免疫疾患、リウマチ、神経病学的疾患、虚血性再灌流障害、血圧応答の減退、血管機能不全、antgiectasis、組織損傷、心血管乏血、痛覚過敏、脳虚血、及び脈管化を伴う疾患、アレルギー性過敏症疾患、糸球体腎炎、再灌流障害、心
筋又は他の組織の再灌流損傷、急性炎症性成分を有する皮膚病、急性化膿性髄膜炎又は他の中枢神経系炎症性疾患、眼性及び眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘発性毒性、急性重症炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、肺線維症、糖尿病性網膜症、糖尿病性大動脈疾患、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、及び子宮内膜症などがある。
「抗血管新生剤」又は「血管新生(血管形成)インヒビター」は、直接的又は間接的に、血管新生、脈管形成又は望ましくない血管透過を阻害する、小分子量の物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離したタンパク質、組換えタンパク質、抗体、又はそれらのコンジュゲートないしは融合タンパク質を指す。例えば、抗血管新生剤は、上記に定義したように血管新生剤に対する抗体又は他のアンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦに対する抗体(例えば、ベバシズマブ(アバスチン(登録商標))、ｂＨ１、ｂＨ１-４４、ｂＨ１-８１)、ＶＥＧＦレセプターに対する抗体、ＶＥＧＦレセプターシグナル伝達を遮断する小分子(例えば、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２８４、ＳＵ６６６８、ＳＵＴＥＮＴ／ＳＵ１１２４８ (スニチニブマレート)、ＡＭＧ７０６)である。また、抗血管新生剤には、天然の血管新生インヒビター、例えばアンジオスタチン、エンドスタチンなどが含まれる。例として、Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)；Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)(例えば表３は悪性メラノーマにおける抗血管形成療法を列挙している)；Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999)；Tonini et al., Oncogene, 22:6549-6556 (2003)(例えば、表２は抗血管形成因子を列挙している)；及び、Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)(例えば、表１は臨床試験に使用される抗血管形成剤を列挙している)を参照のこと。脈管形成の調節不全は、本発明の組成物および方法によって治療されうる多くの疾患を引き起こしうる。これらの疾患は非腫瘍性及び腫瘍性の両方の状態を含む。
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｒａ２２３、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学治療薬、例としてメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そしてここに開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞障害性薬が下記に記載されている。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロスホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethiylenethiophosphoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins）(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone)）；δ-９-テトラヒドロカンナビノール(ドロナビノール、MARINOL(登録商標))；β-ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン(合成類似体トポテカン(topotecan)(HYCAMTIN(登録商標))、ＣＰＴ-１１(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン(acetylcamptothecin)、スコポレクチン(scopolectin)、及び９-アミノカンプトテシン(9-aminocamptothecin)を含む）；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin）；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む)；ポドフィリン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン(cryptophycin)(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン(dolastatin）；デュオカルマイシン(duocarmycin ）（合成類似体、KW-2189及びCB1-TM1を含む）；エレトロビン(eleutherobin）；パンクラチスタチン(pancratistatin）；サルコディクチン(sarcodictyin）；スポンジスタチン(spongistatin）；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ、例えば、Agnew Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ）を含むダイネミシン(dynemicin）；エスペラマイシン(esperamicin）；同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団）、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin）、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin）、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン (モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin）、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin）、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins）、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）などの抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン(lonidainine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダンモール(mopidanmol)；ニトラエリン(nitraerine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantrone)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine)）；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；チオテパ；タキソイド、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル、（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、ABRAXANETM クレモフォール(Cremophor)を含まない、アルブミン設計のナノ粒子形状のパクリタキセル(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)及びタキソテア(登録商標）ドキセタキセル、（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；GEMZAR(登録商標)ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン(VELBAN(登録商標))；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標))；オキサリプラチン；ロイコボリン；NAVELBINE(登録商標)ビノレルビン；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン(capecitabine)(XELODA(登録商標))；上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体；並びに、上記のうちの２以上の組合せ、例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニソロンの併用治療の略記号であるCHOP、及び５-ＦＵとロイコボリン(leucovovin)と組み合わされるオキサリプラチン(ELOXATINTM)による治療投薬計画の略記号であるFOLFOXが含まれる。
また、癌の成長を促進しうるホルモンの影響を調節、低減、阻止(ブロック)又は阻害するように作用し、たびたび全身性、又は全身治療の形態にある抗ホルモン剤もこの定義に含まれる。これらはホルモン類自体でもよい。例として、抗卵胞ホルモン類及び、選択的なエストロゲンレセプターモジュレータ類(ＳＥＲＭ)、例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェン)、EVISTA(登録商標)ラロキシフェン、ドロロキシフェン(droloxifene)、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、LY117018、オナプリストン及びFARESTON(登録商標)トレミフェン、抗プロゲステロン類、エストロゲンレセプター下方制御因子(ＥＲＤ)、卵巣を抑制するか又は一時停止させるように機能する薬剤、例えば、黄体形成ホルモン放出ホルモン(ＬＨＲＨ)アゴニスト、例えば、LUPRON(登録商標)及びELIGARD(登録商標)酢酸ロイプロリド、ゴセレリンアセテート、ブセレリンアセテート及びトリプトレリン(tripterelin)、他の抗アンドロゲン類、例えばフルタミド、ニルタミド及びビカルタミド、及び、副腎のエストロゲン産生を制御する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害薬、例として、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)メゲストロールアセテート、AROMASIN(登録商標) エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標) ボロゾール、FEMARA(登録商標) レトロゾール及びARIMIDEX(登録商標) アナストロゾールなどがある。加えて、化学療法剤のこのような定義には、ビスホスホネート、例えばクロドロン酸(例えば、BONEFOS(登録商標)又はOSTAC(登録商標))、DIDROCAL(登録商標)エチドロン酸、NE-58095、ZOMETA(登録商標) ゾレドロン酸／ゾレドロネート、FOSAMAX(登録商標)アレンドロネート、AREDIA(登録商標)パミドロン酸、SKELID(登録商標) チルドロン酸又はACTONEL(登録商標)、リセドロン酸、並びにトロキサチタビン(troxacitabine)(1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を阻害するもの、例として、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、Ｈ-Ｒａｓ及び上皮性成長因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)、ワクチン、例えばTHERATOPE(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン及びVAXID(登録商標)ワクチン、LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ１インヒビター、ABARELIX(登録商標) ｒｍＲＨ、ラパチニブジトシラート(ＥｒｂＢ-２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子インヒビター、GW572016とも称される)、及び、上記の何れかの薬学的に受容可能な塩類、酸又は誘導体が含まれる。
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞の増殖をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期でＨｉｐ発現細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、ローン・プーラン ローラー）は、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、ブリストル-マイヤー スクウィブ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸***を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
「ここで用いる「抗癌療法」は、被検体の癌を低減するか又は阻害する処置を指す。抗癌療法の例には、細胞障害性放射線療法、並びに細胞障害性剤、化学療法剤、増殖阻害性剤、癌ワクチン、脈管形成インヒビター、プロドラッグ、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、副腎皮質ステロイド、免疫抑制因子、制吐剤、抗体ないし抗体断片又は鎮痛剤の治療上の有効量の被検体への投与が含まれる。
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」なる用語は、親薬剤と比較して腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換されうる薬学的に活性な物質の前駆体又は誘導体の形態を指す。例として、Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986)およびStella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)を参照のこと。プロドラッグには、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害性剤の例には、前記の化学療法剤が含まれる。
「サイトカイン」なる用語は、一つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；上皮性増殖因子（ＥＧＦ）；肝臓成長因子；線維芽成長因子（ＦＧＦ）；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ-β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦｓ）；インシュリン様成長因子-Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘発因子；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）；及び顆粒球-ＣＳＦ（Ｇ-ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１０、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α及びＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイトカインには、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
「サイトカインアンタゴニスト」とは、少なくとも一のサイトカインの生物学的活性を一部又は完全に遮断、阻害、又は中和する分子を意味する。例えば、サイトカインアンタゴニストは、サイトカイン発現および／または分泌を阻害することによって、または、サイトカイン又はサイトカインレセプターに結合することによってサイトカイン活性を阻害してよい。サイトカインアンタゴニストには、抗体、合成又は天然の配列ペプチド、イムノアドヘシン、及びサイトカイン又はサイトカインレセプターに結合する小分子アンタゴニストが含まれる。サイトカインアンタゴニストは場合によって、細胞障害性剤とコンジュゲートされるか又は融合される。例示的なＴＮＦアンタゴニストは、エタネルセプト(ＥＮＢＲＥＬ(登録商標))、インフリキシマブ(ＲＥＭＩＣＡＤＥ(登録商標))およびアダリムマブ(ＨＵＭＩＲＡＴＭ)である。
本明細書中で用いる「免疫抑制剤」なる用語は、治療される被検体の免疫系を抑制するか又は隠すために作用する物質を指す。これには、サイトカイン産生を抑制する物質、自己抗原発現を下方制御は又は抑制する物質、又は、ＭＨＣ抗原をマスキングする物質が含まれる。免疫抑制剤の例には、２-アミノ-６-アリル-５-置換ピリミジン(米国特許第４６６５０７７号を参照)；ミコフェノール酸モフェチル、例えばＣＥＬＬＣＥＰＴ(登録商標)；アザチオプリン(ＩＭＵＲＡＮ(登録商標)、ＡＺＡＳＡＮ(登録商標)／６‐メルカプトプリン；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタールアルデヒド(米国特許第４１２０６４９号に記載のように、ＭＨＣ抗原をマスキングするもの)；ＭＨＣ抗原およびＭＨＣ断片のための抗イディオタイプ抗体；サイクロスポリンＡ；副腎皮質ステロイドおよび糖質コルチコイドといったステロイド、例えばプレドニゾン、プレドニソロン、例えばＰＥＤＩＡＰＲＥＤ(登録商標)(プレドニソロンリン酸ナトリウム)又はＯＲＡＰＲＥＤ(登録商標)(プレドニソロンリン酸ナトリウム経口溶液)、メチルプレドニゾロンおよびデキサメサゾン；メトトレキセート(経口又は皮下)(ＲＨＥＵＭＡＴＲＥＸ(登録商標)、ＴＲＥＸＡＬＬＴＭ)；ヒドロキシクロロキン／クロロキン；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカイン又はサイトカインレセプターアンタゴニスト、例として抗インターフェロン-γ、-β、又は-α抗体、抗腫瘍壊死因子-α抗体(インフリキシマブ又はアダリムマブ)、抗ＴＮＦαイムノアドヘシン(ＥＮＢＲＥＬ(登録商標)、エタネルセプト)、抗腫瘍壊死因子-β抗体、抗インターロイキン２抗体、及び抗ＩＬ−２レセプター抗体；抗ＣＤ１１ａおよび抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ-１抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種性抗リンパ球グロブリン；ポリクローナル又はパンＴ抗体、又はモノクローナル抗ＣＤ3又は抗ＣＤ４／ＣＤ4ａ抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを含む可溶性ペプチド(１９９０年７月２６日公開の国際公開１９９０／０８１８７)；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ-β；ストレプトドルナーゼ；宿主のＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；デオキシスペルグアリン；ラパマイシン；Ｔ細胞レセプター(Cohen et al.、米国特許第５１１４７２１号)；Ｔ細胞レセプター断片(Offner et al. Science, 251: 430-432 (1991)；国際公開１９９０／１１２９４；Ianeway, Nature, 341: 482 (1989)；及び国際公開１９９１／０１１３３)；Ｔ１０Ｂ９といったＴ細胞レセプター抗体(欧州特許第３４０１０９号)；シクロホスファミド(ＣＹＴＯＸＡＮ(登録商標))；ダプソン；ペニシラミン(ＣＵＰＲＩＭＩＮＥ(登録商標))；血漿交換；または、静脈免疫グロブリン(ＩＶＩＧ)が含まれる。これらは単独で用いられても、互いに、特にステロイド及び他の免疫抑制剤との組合せ、又はこの組合せの後にステロイドの必要性を低減するために維持用量の非ステロイド剤を組み合わせて用いられてもよい。
「鎮痛剤」は、被検体の痛みを阻害するかまたは抑制するために作用する薬剤を指す。例示的な鎮痛剤には、非ステロイド系抗炎症薬(ＮＳＡＩＤ)、例えばイブプロフェン(ＭＯＴＲＩＮ(登録商標))、ナプロキセン(ＮＡＰＲＯＳＹＮ(登録商標))、アセチルサリチル酸、インドメタシン、スリンダクおよびトルメチン、これらの塩類及び誘導体、並びに、生じうる鋭い痛みを低減するために用いられる様々な他の医薬、例えば抗痙攣剤(ガバペンチン、ｐｈｅｎｙｌｏｉｎ、カルバマゼピン)又は三環系抗鬱薬が含まれる。具体例には、アセトアミノフェン、アスピリン、アミトリプチリン(ＥＬＡＶＩＬ(登録商標))、カルバマゼピン(ＴＥＧＲＥＴＯＬ(登録商標))、ｐｈｅｎｙｌｔｏｉｎ(ＤＩＬＡＮＴＩＮ(登録商標))、ガバペンチン(ＮＥＵＲＯＮＴＩＮ(登録商標))、(Ｅ)-Ｎ−バニリル−８−メチル−６−ノネアミド(ＣＡＰＳＡＩＣＩＮ(登録商標))又は神経遮断薬が含まれる。
「副腎皮質ステロイド」は、天然に生じる副腎皮質ステロイドの効果を模倣するかあるいは増大するステロイドの一般的な化学構造を有するいくつかの合成又は天然に生じる物質の何れか一つを指す。合成副腎皮質ステロイドの例として、プレドニゾン、プレドニゾロン(メチルプレドニゾロンを含む)、デキサメサゾン、トリアムシノロン及びベタメサゾンが含まれる。
ここで用いる「癌ワクチン」は、癌に対して被検体において免疫応答を刺激する組成物である。癌ワクチンは典型的に、抗原に対して免疫応答を更に刺激してブーストする他の構成成分(例えばアジュバント)とともに、被検体に対して自己由来性(自己から)又は同種異系性(他から)である癌関連の物質又は細胞(抗原)の供与源からなる。癌ワクチンにより望ましくは、被検体の免疫系が刺激され、１又はいくつかの特異的抗原に対して抗体が産生され、および／またはそれらの抗原を有する癌細胞を攻撃するためにキラーＴ細胞が産生される。
ここで用いる「細胞障害性放射線療法」は、細胞の機能を阻害又は予防し、および／または細胞の破壊を引き起こす放射線療法を指す。放射線療法には、例えば、外的光線照射又は抗体などの放射性標識した薬剤による療法が含まれうる。この用語は、放射性同位体(例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｒａ２２３、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体)の使用を含むことを目的とする。
「制吐剤」は、被検体における嘔気を軽減又は予防する化合物である。制吐化合物には、例えば、ニューロキニン-１レセプターアンタゴニスト、５ＨＴ３レセプターアンタゴニスト(例えばオンダンセトロン、グラニセトロン、トロピセトロンおよびザチセトロン)、ＧＡＢＡＢレセプターアゴニスト、例としてバクロフェン、デキサメサゾン、ＫＥＮＡＬＯＧ(登録商標)、ＡＲＩＳＴＯＣＯＲＴ(登録商標)又はＮＡＳＡＬＩＤＥ(登録商標)のような副腎皮質ステロイド、抗ドーパミン作動剤、フェノサイアジン(例えばプロクロルペラジン、フルフェナジン、チオリダジンおよびメソリダジン)、ドロナビノール、ｍｅｔｒｏｃｌｏｐｒａｍｉｄｅ、ドンペリドン、ハロペリドール、シクリジン、ロラゼパム、プロクロルペラジンおよびレボメプロマジンが含まれる。
「被検体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、家畜(例えばウシ)、スポーツ用動物、愛玩動物(例えばネコ、イヌおよびウマ)、霊長類、マウスおよびラットが含まれるが、これらに限定されない。
実施例において示す市販の試薬は、特に明記しない限り製造業者の指示に従って使用した。以下の実施例及び明細書全体にわたってＡＴＣＣ受託番号によって識別される細胞の供与源は、American Type Culture Collection, Manassas, VAである。特に明記しない限り、本発明は、組換えＤＮＡ技術の標準的な手順を用いる。これらは本明細書中及び以下のテキストに記載される。上掲のSambrook et al.；Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989)；Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: N.Y., 1990)；Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988)；Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984)；Freshney, Animal Cell Culture, 1987；Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991。
本明細書及び特許請求の範囲全体を通して、「含む」なる語彙、又は「含む」ないし「含んでいる」の変形型は、定めた完全体又は完全体の群を包含するもので、任意の他の完全体又は完全体の群を除外するものではない。
ＩＩ．ベクター、宿主細胞及び組換え方法
本発明の抗体の組み換え生成のために、コードする核酸を単離して、更なるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製ベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは従来の手順で簡単に単離し、配列決定される(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)。多くのベクターが利用可能である。用いる宿主細胞にある程度依存してベクターを選択する。一般的に、好適な宿主細胞は原核生物又は真核生物(一般的に哺乳動物)由来の細胞である。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域を含め、任意のアイソタイプの定常領域がこの目的のために使われてもよく、このような定常領域はヒト又は動物種の何れかから得られうることは理解されるであろう。
a. 原核生物の宿主細胞を用いた抗体生成
i. ベクターの構築
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードしているポリヌクレオチド配列は標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列はハイブリドーマ細胞のような抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機又はＰＣＲ法を使用して合成することができる。ひとたび得られると、ポリペプチドをコードしている配列は原核生物宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現することが可能な組換えベクター中に挿入される。当該分野において入手でき知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主として、ベクターに挿入される核酸のサイズとベクターで形質転換される特定の宿主に依存する。各ベクターは、機能(異種性ポリヌクレオチドの増幅又は発現ないしその両方)及び属する特定の宿主細胞への適合性に応じて、様々な成分を含む。一般的に、限定するものではないが、ベクター成分には複製起源、選択マーカー遺伝子、プロモータ、リボゾーム結合部位(ＲＢＳ)、シグナル配列、異種性核酸挿入及び転写終末配列が含まれる。
一般には、レプリコン及び宿主細胞と適合性のある種に由来するコントロール配列を含んでいるプラスミドベクターが、宿主細胞と関連して使用される。そのベクターは、通常、複製開始点並びに形質転換細胞において表現型の選択を提供可能なマーキング配列を有する。例えば、一般的に大腸菌は、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換する。ｐＢＲ３２２はアンピシリン(Ａｍｐ)及びテトラサイクリン(Ｔｅｔ)耐性のコード遺伝子を含んでいるため、形質転換細胞を容易に同定することができる。ｐＢＲ３２２、その誘導体又は他の微生物プラスミド又はバクテリオファージも外来性タンパク質を発現する微生物によって使用可能なプロモータを含むか、含むように変更される。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例はCarter等の米国特許第５６４８２３７号に詳細に記載されている。
また、レプリコン及び宿主微生物と適合性のあるコントロール配列を含んでいるファージベクターを、これらの宿主との関連でトランスフォーミングベクターとして使用することができる。例えば、λＧＥＭ.ＴＭ.-１１のようなバクテリオファージを、大腸菌ＬＥ３９２のような感受性の宿主細胞を形質転換するために使用できる組換えベクターを作製する際に利用することができる。
本発明の発現ベクターは各ポリペプチド成分をコードする２又はそれ以上のプロモータ−シストロン(翻訳単位)対を含みうる。プロモーターはその発現を調節するシストロンの上流(５')に位置している非翻訳配列である。原核生物のプロモーターは典型的には誘導性と構成的との二つのクラスのものがある。誘導性プロモーターは、例えば栄養分の有無又は温度の変化のような、培養条件の変化に応答してその調節下でシストロンの転写レベルを増大させるように誘導するプロモーターである。
様々な潜在的宿主細胞によって認識されるプロモータが非常にたくさん公知となっている。選択したプロモーターを、制限酵素消化によって供給源ＤＮＡからプロモータを除去し、本発明のベクター内に単離したプロモータを挿入することによって軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作用可能に連結することができる。天然プロモーター配列と多くの異種プロモーターの双方を、標的遺伝子の増幅及び／又は発現を生じさせるために使用することができる。ある実施態様では、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、一般的に発現する標的遺伝子をより多く転写させ、効率をよくするので、異種プロモーターが有用である。
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、βガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃ又はｔｒｃプロモーターが含まれる。しかし、細菌中で機能性である他のプロモーター(例えば他の既知の細菌又はファージプロモーター)も好適である。そのヌクレオチド配列は発表されており、よって当業者は、任意の必要とされる制限部位を供給するリンカー又はアダプターを使用して標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンにそれらを結合させることができる(Siebenlist等 (1980) Cell 20:269)。
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜を貫通して発現されるポリペプチドの転写を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分でありうるか、ベクター中に挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部でありうる。この発明の目的のために選択されるシグナル配列は宿主細胞によって認識されプロセシングされる(つまりシグナルペプチダーゼにより切断される)ものでなければならない。異種ポリペプチドに天然のシグナル配列を認識せずプロセシングする原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩ(ＳＴＩＩ)リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。一実施態様では、発現系の双方のシストロンに使用されるシグナル配列はＳＴＩＩシグナル配列又はその変異体である。
他の態様では、本発明による免疫グロブリンは宿主細胞の細胞質内で産生されるので、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在は必要でない。この点において、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖は発現され、折り畳まれ、集合して細胞質内に機能的免疫グロブリンを形成する。ジスルフィド結合形成に好適な細胞質条件を示し、発現したタンパク質サブユニットを好適に折り畳み、集合することができる宿主系が存在する(例として大腸菌ｔｒｘＢ−系)。Proba及びPluckthun Gene, 159:203 (1995)。
本発明の抗体を発現するのに適した原核生物宿主細胞には、古細菌及び真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物が含まれる。有用な細菌の例には、エシェリキア属(例えば大腸菌)、バシラス属(例えば枯草菌)、エンテロバクター属、シュードモナス種(例えば緑膿菌)、ネズミチフス菌、霊菌(Serratia marcescans)、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ(Vitreoscilla)又はパラコッカス(Paracoccus)が含まれる。一実施態様では、グラム陰性菌が使用される。一実施態様では、大腸菌細胞が本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例として、遺伝子型W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR を有する３３Ｄ３株(米国特許第5,639,635号)を含むW3110株 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), 1190-1219頁；ATCC寄託番号27,325)及びその誘導体が含まれる。また、大腸菌294 (ATCC 31,446), 大腸菌B, 大腸菌λ 1776 (ATCC 31,537)及び大腸菌RV308(ATCC 31,608) など、他の株及びその誘導体も好適である。この例は限定的なものでなく例示的なものである。定義した遺伝子型を有する上記の何れかの細菌の誘導体の構築方法は当業者に公知であり、例として, Bass等, Proteins, 8:309-314 (1990)に記載されている。一般的に、細菌細胞中でのレプリコンの複製能を考慮して適した細菌を選択することが必要である。ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、又はｐＫＮ４１０のようなよく知られたプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、例えば、大腸菌、セラシア属、又はサルモネラ種を宿主として好適に用いることができる。典型的に、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しなければならず、望ましくは更なるプロテアーゼインヒビターを細胞培養中に導入することができる。
ii. 抗体産生
上述した発現ベクターで宿主細胞を形質転換又は形質移入し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された通常の栄養培地中で培養する。
形質転換とは、ＤＮＡを原核生物宿主中に導入し、そのＤＮＡを染色体外要素として、又は染色体組込みによって複製可能にすることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用してなされる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための他の方法はポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。さらに別の方法はエレクトロポレーションである。
本発明のポリペプチドを生産するために使用される原核生物細胞は当該分野で知られ、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖させられる。好適な培地の例には、ルリア培地(ＬＢ)プラス必須栄養分サプリメントが含まれる。ある実施態様では、培地は発現ベクターを含む原核生物細胞の増殖を選択的に可能にするために、発現ベクターの構成に基づいて選択される選択剤をまた含む。例えば、アンピシリンがアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用培地に加えられる。
炭素、窒素及び無機リン酸源の他に任意の必要なサプリメントを、単独で、又は複合窒素源のような他のサプリメント又は培地との混合物として導入される適切な濃度で含有させられうる。場合によっては、培養培地はグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール及びジチオトレイトールからなる群から選択される一又は複数の還元剤を含みうる。
原核生物宿主細胞は適切な温度で培養される。例えば、大腸菌の増殖に対しては、好適な温度は約２０℃から約３９℃、より好ましくは約２５℃から約３７℃の範囲、更により好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主として宿主生物に応じて、約５から約９の範囲の任意のｐＨでありうる。大腸菌に対しては、ｐＨは好ましくは約６．８から約７．４、より好ましくは約７．０である。
本発明の発現ベクターに誘導性プロモータが用いられる場合、プロモータの活性に適する条件下でタンパク質発現を誘導する。本発明の一態様では、ポリペプチドの転写制御のためにＰｈｏＡプロモータが用いられる。したがって、形質転換した宿主細胞を誘導のためにリン酸限定培地で培養する。好ましくは、リン酸限定培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である(例として、Simmons等, J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147を参照)。様々な他の誘導因子は用いるベクターコンストラクトに応じて当業者に知りうるように用いてよい。
一実施態様では、発現された本発明のポリペプチドは宿主細胞の細胞膜周辺中に分泌され、そこから回収される。タンパク質の回収は、一般的には浸透圧ショック、超音波処理又は溶解のような手段によって典型的には微生物を破壊することを含む。ひとたび細胞が破壊されると、細胞片又は全細胞を遠心分離又は濾過によって除去することができる。タンパク質は、例えばアフィニティー樹脂クロマトグラフィーによって更に精製することができる。あるいは、タンパク質は培養培地に輸送しそこで分離することができる。細胞を培養物から除去することができ、培養上清は濾過され、生成したタンパク質の更なる精製のために濃縮される。発現されたポリペプチドを更に単離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(ＰＡＧＥ)及びウェスタンブロットアッセイ法のような一般的に知られている方法を使用して同定することができる。
本発明の一側面では、抗体産生は発酵法によって多量に受け継がれる。組換えタンパク質の生産には様々な大規模流加発酵法を利用することができる。大規模発酵は少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１０００から１０００００リットルの容量である。これらの発酵槽は、酸素と栄養分、特にグルコース(好ましい炭素／エネルギー源)を分散させる撹拌翼を使用する。小規模発酵とは一般におよそ１００リットル以下の容積で、約１リットルから約１００リットルの範囲でありうる発酵槽での発酵を意味する。
発酵法では、タンパク質の発現の誘導は、典型的には、細胞が適切な条件下にて、初期定常期に細胞があるステージで、所望の密度、例えば約１８０−２２０のＯＤ５５０まで増殖したところで開始される。当該分野で知られ上述されているように、用いられるベクターコンストラクトに応じて、様々なインデューサーを用いることができる。細胞を誘導前の短い時間の間、増殖させてもよい。細胞は通常約１２−５０時間の間、誘導されるが、更に長い又は短い誘導時間としてもよい。
本発明のポリペプチドの生産収量と品質を改善するために、様々な発酵条件を変更することができる。例えば、分泌される抗体ポリペプチドの正しい組み立てとフォールディングを改善するために、例えばＤｓｂタンパク質(ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及び／又はＤｓｂＧ)又はＦｋｐＡ(シャペロン活性を持つペプチジルプロピルシス、トランス-イソメラーゼ)のようなシャペロンタンパク質を過剰発現する更なるベクターを用いて宿主原核細胞を同時形質転換させることができる。シャペロンタンパク質は細菌宿主細胞中で生産される異種性タンパク質の適切な折り畳みと溶解性を容易にすることが実証されている。Chen等 (1999) J Bio Chem 274:19601-19605；Georgiou等, 米国特許第６０８３７１５号；Georgiou等, 米国特許第６０２７８８８号；Bothmann及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105；Ramm及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113；Arie等 (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。
発現された異種タンパク質(特にタンパク分解を受けやすいもの)のタンパク質分解を最小にするために、タンパク質分解酵素を欠くある種の宿主株を本発明に用いることができる。例えば、原核生物宿主細胞株を改変して、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ及びその組合せのような既知の細菌プロテアーゼをコードしている遺伝子に遺伝子突然変異を生じさせることができる。幾つかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用でき、例えば、上掲のJoly等 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2773-2777；Georgiou等, 米国特許第５２６４３６５号；Georgiou等, 米国特許第５５０８１９２号；Hara等 (1996) Microbial Drug Resistance 2:63-72に記載されている。
ある実施態様では、タンパク質溶解性酵素を欠損した、一以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を本発明の発現系の宿主細胞として用いる。
iii. 抗体精製
当分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は好適な精製手順の例である：免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画化、エタノール沈降法、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥなどの陽***換樹脂によるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降法及び、例えばSephadex G-75を用いたゲル濾過法。
一態様では、固形層に固定したプロテインＡを本発明の完全長抗体産物の免疫親和性精製法に用いる。プロテインＡは抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する黄色ブドウ球菌から単離した４１ｋＤの細胞壁タンパク質である。Lindmark等 (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。プロテインＡを固定した固形層は、ガラス又はシリカ表面、より好ましくは孔を調節したガラスカラム又はケイ酸カラムを含むカラムが好ましい。ある方法では、カラムは非特異的な混入物の接着を防ぐためにグリセロールなどの試薬でコートされている。
精製の初めの工程では、上記に記載のように細胞培養物からの調製物をプロテインＡ固定固形層に適応し、プロテインＡに対象とする抗体を特異的に結合させる。ついで、固形層を洗浄して、固形層に非特異的に結合した混入物を除去する。最後に、対象とする抗体を溶出により固形層から除去する。
b. 真核生物の宿主細胞を用いた抗体の生成
一般的に、ベクターは、限定するものではないが、以下の一以上を含む：シグナル配列、複製起点、一以上のマーカ遺伝子、エンハンサー因子、プロモータ及び転写終末因子。
(i) シグナル配列成分
真核生物の宿主細胞に用いるベクターは、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいは対象とするポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドを含んでいてもよい。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のＤＮＡは、多価抗体をコードするＤＮＡに読み取り枠を一致させて結合される。
(ii) 複製開始点
一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である。例えば、ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる。
(iii) 選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)必要があれば栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である(例として、ATCC CRL-9096)。
あるいは、抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
(iv) プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され抗体ポリペプチド核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。真核生物のプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第4419446号に開示されている。この系の変形例は米国特許第4601978号に開示されている。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
(v) エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明の抗体ポリペプチドをコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
(vi) 転写終末成分
また、真核生物宿主細胞に用いられる発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
(vii) 宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、脊椎動物の宿主細胞を含む本明細書中に記載の高等真核生物細胞を含む。培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)；ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０); アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス***腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞;ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
(viii) 宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCINTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
(ix) 抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内で生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABXＴＭ樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体及び混入物を含む混合液をｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度(例として、約０−０．２５Ｍ塩)の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィを行う。
イムノコンジュゲート
また、本発明は、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素(例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの細胞毒性剤にコンジュゲートした本明細書中に記載の何れかの抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を含む、イムノコンジュゲート(「抗体−薬剤コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」と交換可能に称される)を提供する。
細胞障害性又は細胞***停止性の薬剤、すなわち癌治療における腫瘍細胞を殺す又は阻害するための薬剤の局部運搬に抗体−薬剤コンジュゲートを用いると(Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172；米国特許第4,975,278号)、腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となるものであり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwin等, (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pincheraら. (ed.s), pp. 475-506)。これによって、最小限の毒性で最大限の効果を求める。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であるとして報告されている(Rowland等, (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowland等, (1986)、上掲)。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、ゲルダナマイシン(Mandlerら(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandlerら(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandlerら(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(EP 1391213；Liu等, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lode等, (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinman等, (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などのリシン、小分子毒素などの植物毒が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞障害性及び細胞***停止性の効果に影響しうる。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
ゼバリン(ZEVALIN)(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン(ibritumomab tiuxetan), Biogen/Idec)は正常及び悪性のＢリンパ球の細胞表面上にみられるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体と111In又は90Y放射性同位体とがチオウレアリンカーキレート剤にて結合した抗体−放射性同位体コンジュゲートである(Wiseman等, (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wiseman等, (2002) Blood 99(12):4336-42；Witzig等, (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzig等, (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。ゼバリンはＢ細胞非ホジキン性リンパ球(ＮＨＬ)に対して活性を有するが、投与によってほとんどの患者に重症で長期の血球減少を引き起こす。カリケアマイシンに連結したｈｕＣＤ３３抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるマイロターグ(MYLOTARG)(登録商標)(ゲムツズマブオゾガミシン(gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals)は、急性骨髄性白血病の治療用注射剤として2000年に認可された(Drugs of the Future (2000) 25(7):686；米国特許第4970198号；同第5079233号；同第5585089号；同第5606040号；同第5693762号；同第5739116号；同第5767285号；同第5773001号)。ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結しているｈｕＣ２４２抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるカンツズマブメルタンシン(Cantuzumab mertansine)(Immunogen, Inc.)は、ＣａｎＡｇを発現する癌、例として大腸、膵臓、胃などの治療用に第ＩＩ相試験へと進んでいる。メイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結している抗前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)モノクローナル抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＬＮ−２７０４(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)は、前立腺癌の潜在的治療の開発段階にある。アウリスタチン(auristatin)ペプチド、アウリスタチンＥ(ＡＥ)及びモノメチルアウリスタチン(ＭＭＡＥ)、ドラスタチン(dolastatin)の合成類似体は、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６(癌細胞上のルイスＹに特異的)及びｃＡＣ１０(血液系悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的)(Doronina等, (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784)にコンジュゲートしており、治療的開発段階にある。
免疫複合体(イムノコンジュゲート)の生成に有用な化学治療薬を本明細書中(例えば、上記)に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。例として1993年10月28日に公開の国際公開公報93/21232を参照のこと。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣＬ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン２，６-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開94/11026参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
i. メイタンシン及びメイタンシノイド
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している本発明の抗体(完全長又は断片)を含んでなる。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する***阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第4,137,230号；同4,248,870号；同4,256,746号；同4,260,608号；同4,265,814号；同4,294,757号；同4,307,016号；同4,308,268号；同4,308,269号；同4,309,428号；同4,313,946号；同4,315,929号；同4,317,821号；同4,322,348号；同4,331,598号；同4,361,650号；同4,364,866号；同4,424,219号；同4,450,254号；同4,362,663号；及び同4,371,533号に開示されている。
メイタンシノイド薬剤成分は、(i) 発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために相対的に利用可能である(ii) 抗体に対する非ジスルフィドリンカーによる共役に好適な官能基による誘導体化に従う、(iii) 血漿中で安定、そして(iv) 様々な腫瘍細胞株に対して有効であるため、抗体薬剤コンジュゲートの魅力的な薬剤成分である。
メイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲート、その作製方法及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第5,208,020号、同5,416,064号、欧州特許第0425235 B1号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合しているイムノコンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験され、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ-２表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。例えば、米国特許第5,208,020号(この開示内容は出典明記により特別に組み込まれる)を参照。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第5,208,020号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第5,208,020号又は欧州特許第0425235 B1号、Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)、及び2004年10月8日に出願の米国特許出願番号10/960,602(これらの開示内容は出典明記により特別に組み込まれる)に開示されているもの等を含め、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。リンカー成分ＳＭＣＣを含んでなる抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、2004年10月8日に出願の米国特許出願番号10/960,602に開示されるように調製されうる。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。更なる結合基を本願明細書中に記載し、例示する。
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施形態において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
ii. アウリスタチン類及びドラスタチン類
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチジル類似体及び誘導体、アウリスタチン(auristatin) (米国特許第5635483号；同第5780588号)にコンジュゲートした本発明の抗体を含んでなる。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解及び核と細胞の分割を妨げ(Woyke 等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584)、抗癌活性(米国特許第5663149号)及び抗真菌性活性(Pettit 等 (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のＮ(アミノ)末端又はＣ(カルボキシル)末端により抗体に接着しうる(国際公開公報02/088172)。
例示的なアウリスタチンの実施態様は、Ｎ末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤成分ＤＥ及びＤＦを含み、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", US Ser. No. 10/983,340, filed Nov. 5, 2004に開示される。この開示内容は出典明記によってその全体が特別に組み込まれる。
一般的に、ペプチドベースの薬剤成分は、２以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片間でペプチド結合を形成することによって調製されうる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知の液相合成方法に従って調製することができる(E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Pressを参照)。アウリスタチン／ドラスタチン薬剤成分は、米国特許第5635483号；同第5780588号；Pettit 等 (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465；Pettit 等 (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277；Pettit, G.R., 等 Synthesis, 1996, 719-725；及びPettit 等 (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863の方法に従って調製されうる。また、Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7): 778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、２００５年１０月２７日に公開の米国公開特許２００５０２３８６４９も参照のこと。これらは出典明記によってその全体が本願明細書中に組み込まれる(例えば、リンカー及びモノメチルバリン化合物、例えばＭＭＡＥ及びリンカーにコンジュゲートしたＭＭＡＦの調整方法を開示している)。
iii. カリケアマイシン
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した本発明の抗体を含んでなる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5712374号、同5714586号、同5739116号、同5767285号、同5770701号、同5770710号、同5773001号、同5877296号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１ Ｉ、α２ Ｉ、α３ Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１ Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ １(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
iv. 他の細胞障害剤
本発明の抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第5053394号、同5770710号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第5877296号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP-S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、1993年10月28日公開の国際公開第93/21232号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成されるイムノコンジュゲートをさらに考察する。
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第94/11026号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第5208020号)。
本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤：市販されている(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、及びスルホ-SMPB、及びSVSB (succinimidyl-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)にて調製したＡＤＣが特に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの467-498頁を参照。
v. 抗体薬剤コンジュゲートの調製
本発明の抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)において、抗体(Ａｂ)を、リンカー(Ｌ)を介して、一つ以上の薬剤部分(Ｄ)、例えば抗体につき約１〜約２０の薬剤部分にコンジュゲートする。式ＩのＡＤＣはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態及び試薬を用いて調製されうる：(1) 共有結合の後に薬剤部分Ｄと反応してＡｂ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応；及び(2) 共有結合の後に抗体の求核基と反応してＤ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。ＡＤＣを調製するための更なる方法は本願明細書中に記載される。
Ａｂ−(Ｌ−Ｄ)ｐ Ｉ
リンカーは、一つ以上のリンカー成分から成ってもよい。例示的なリンカー成分は、６-マレイミドカプロイル(「ＭＣ」)、マレイミドプロパノイル(「ＭＰ」)、バリン-シトルリン(「val-cit」)、アラニン-フェニルアラニン(「ala-phe」)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボンイル(「ＰＡＢ」)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(「ＳＰＰ」)、Ｎ-スクシンイミジル４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１カルボキシレート(「ＳＭＣＣ」)、及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(「ＳＩＡＢ」)を含む。更なるリンカー成分は当分野で公知であり、そのいくつかは本願明細書において、記述される。また、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、2004年11月5日に出願した米出願番号10/983,340を参照。その内容は出典明記により本願明細書に組み込まれる。
いくつかの実施態様では、リンカーはアミノ酸残基を含みうる。例示的なアミノ酸リンカー成分には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドなどがある。例示的なジペプチドは、バリン-シトルリン(vc又はval-cit)、アラニン-フェニルアラニン(af又はala-phe)を含む。例示的なトリペプチドは、グリシン-バリン-シトルリン(gly-val-cit)及びグリシン-グリシン-グリシン(gly-gly-gly)を含む。アミノ酸リンカー成分を含んでなるアミノ酸残基は、天然に生じるもの、並びに微量のアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸類似体、例えばシトルリンを含む。アミノ酸リンカー成分は設定され、特に酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断の選択性に最適化できる。
抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む：(i) Ｎ末端アミン基、(ii) 側鎖アミン基、例えばリシン、(iii) 側鎖チオール基、例えばシステイン、及び(iv) 抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオール及び水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群及びリンカー試薬により共有結合を形成することができる：(i) 活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物；(ii) アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；(iii) アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ(ジチオトレイトール)による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、２の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる２-イミノチオラン(トラウトの試薬)を用いてリシンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。反応性のチオール基は、１、２、３、４又はそれ以上のシステイン残基を導入する(例えば、一又は複数の非天然のシステインアミノ酸残基を含んでなる変異体抗体を調製する)ことによって抗体(又は、その断片)に導入されてもよい。
また、本発明の抗体薬剤コンジュゲートは、抗体を修飾して求電子性の部分を導入する(リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基と反応させることができる)ことによって生成してもよい。グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応するアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤(Hermanson, Bioconjugate Techniques)上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル(アルデヒド及びケトン)基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；米国特許第5362852号)。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。
同様に、薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、以下のものを含む：反応して、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステル及びアリールヒドラジド基：(i) 活性エステル(例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物)；(ii) アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；(iii) アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基、が含まれる。
別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを個体に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
薬剤的製剤
本発明の抗体を含んでなる治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより(Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000))、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体)；及び／又はTWEENTM、PLURONICSTM又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
ここでの製剤は、治療される特定の徴候のために必要ならば一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を持つものも含んでよい。そのような分子は、好適には、意図する目的のために有効な量で組み合わされて存在する。
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、本発明の免疫グロブリンを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3773919号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOTTM(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日以上かけて放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短い時間で放出する。カプセル化された抗体が体内に長時間残ると、３７℃の水分に暴露された結果として変性又は凝集し、生物活性を喪失させ免疫原性を変化させるおそれがある。合理的な戦略を、関与するメカニズムに応じて安定化のために案出することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間Ｓ-Ｓ結合の形成であることが見いだされた場合、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適当な添加剤を使用し、また特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成されうる。
ＩＩＩ．治療上の使用
ＨＥＲ２及びＶＥＧＦの両方を結合する抗体および抗体断片(例えばｂＨ１-４４又はｂＨ１−８８又はその断片)は、前癌性、非転移性及び癌性の腫瘍(例えば初期の癌)を含む腫瘍の治療のため、自己免疫性疾患の治療のため、脈管形成性疾患の治療のため、ＨＥＲ２の異常な活性化を伴う疾患の治療のため、または、癌(例えば乳癌、結腸直腸癌、肺癌、腎臓細胞癌腫、膠腫又は卵巣癌)、脈管形成性疾患、自己免疫性疾患又はＨＥＲ２の異常な活性化を伴う疾患を発症するリスクにある被検体の治療のために用いられうる。
癌なる用語は、前癌性の増殖、良性腫瘍及び悪性腫瘍を含むがこれに限らず、一まとまりの増殖性疾患を包含する。良性腫瘍は、起源の部位に限局化されたままであり、遠位部位に浸潤、侵入又は転移する能力を有していない。悪性腫瘍は、周辺の他の組織に侵入して、障害を与える。また、それらは、起源の部位から切り離れる能力を獲得し、通常はリンパ節が配置されるリンパ系や血流を介して身体の他の部位に拡がりうる(転移する)。 原発性腫瘍は、それらが生じる組織の種類によって分類され、転移性腫瘍は、癌細胞が由来する組織の種類によって分類される。時間とともに、悪性腫瘍の細胞は、より異常になり、正常細胞のようではなくなる。癌細胞にみられるこの変化は、腫瘍グレードと呼ばれており、癌細胞は、十分に分化されている、中程度に分化されている、ほとんど分化されていない、又は、未分化であると表される。十分に分化した細胞はで全く正常な見かけであり、起源の正常細胞のようである。未分化な細胞は、細胞の起源を決定することがもはや不可能であるほど異常となっている細胞である。
腫瘍は固形腫瘍であるか、或いは非固形腫瘍又は軟組織腫瘍でありうる。軟組織腫瘍の例には、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、成熟Ｂ細胞急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、前リンパ球性白血病、又はヘアリーセル白血病）、或いはリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、又はホジキン病）が含まれる。固形腫瘍には、血液、骨髄、又はリンパ系以外の身体組織のあらゆる癌が含まれる。固形腫瘍は更に、上皮細胞を起源とするものと、非上皮細胞を起源とするものとに分けられる。上皮細胞固形腫瘍の例には、胃腸管、結腸、胸部、前立腺、肺、腎臓、肝臓、膵臓、卵巣、頭頸部、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、肛門、胆嚢、下唇、鼻いん頭、皮膚、子宮、***、泌尿器、膀胱、及び皮膚の腫瘍が含まれる。非上皮起源の固形腫瘍には、肉腫、脳腫瘍、及び骨腫瘍が含まれる。
上皮性癌は一般に、良性腫瘍から侵襲前段階(例えばインサイツでの癌腫)、基底膜を透過して、上皮下間質に侵入した悪性癌に発達する。
ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２の両方を結合する多重特異性抗体(例えば、ｂＨ１-４４又はｂＨ１-８８又はこれらの断片)は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、腎臓細胞癌腫、膠腫又は卵巣癌を治療するために用いられるのが望ましい。
脈管形成が様々な疾患の発病に関係することは、現在明らかとなっている。これらには、固形腫瘍および転移、アテローム性動脈硬化、水晶体後繊維増殖、血管腫、慢性炎症、増殖性網膜症のような眼内新生血管疾患、例えば糖尿病性網膜症、年齢関連性黄斑変性(ＡＭＤ)、血管新生緑内障、移植された角膜組織および他の組織の免疫拒絶反応、関節リウマチおよび乾癬が含まれる。Folkman et al., J. Biol. Chem., 267:10931-10934 (1992)；Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991)；及び、Garner A., "Vascular diseases", In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710。
ある罹患した状態において新しい血管が過度に、不十分に又は不適当に成長したとき、異常な血管形成が生じるか(例えば医学的観点から位置、時期又は発生が望ましくない血管形成)、又はそれによって罹患した状態となる。癌、特に血管化の固形腫瘍および転移性腫瘍(大腸、肺癌(特に小細胞肺癌)又は前立腺癌を含む)、眼血管新生、特に糖尿病性盲目、網膜症、主に糖尿病性網膜症又は年齢関連性黄斑変性(ＡＭＤ)、糖尿病性黄斑浮腫、大脳浮腫(例えば、急性の脳卒中／非開放性頭部損傷／外傷と関係する)、滑液炎症、関節リウマチのパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大性骨形成、抵抗性腹水、多嚢胞性卵巣の疾患、第３区画の体液疾患(膵炎、区画症候群、熱傷、腸疾患)、子宮類線維腫、早産、アングル（ルベオーシスの血管新生、悪性の肺滲出、血管性再狭窄、血管腫といった血管芽細胞腫；炎症性腎疾患、例として糸球体腎炎、特にメサンギウム増殖性糸球体腎炎、溶血性***候群、糖尿病性ネフロパシ又は高血圧患者腎硬化症、様々な炎症性疾患、例として関節炎、特に関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬、乾癬の関節炎、乾癬のプラーク、サルコイドーシス、動脈性動脈硬化症および移植後に生じる疾患、腎臓同種異系移植片拒絶反応、子宮内膜症又は慢性喘息、および７０以上の他の状態によって生じる疾患においてなど、罹患した状態を悪化させるかまたは罹患した状態の原因となる新たな血管の発達がある場合に、過剰な、不適切な又は制御できない血管形成が起こる。新しい血管は疾患組織に養分を与え、正常な組織を破壊する。癌の場合、新しい血管によって腫瘍細胞は他の器官の窪み(lodge)及び循環に逃げ得る(腫瘍転移)。病的状態、例えば、冠状動脈疾患、脳卒中および遅発性創傷治癒などの病気で悪化に関与する不適切な血管成長がある場合、不十分な血管新生が生じる。さらに、潰瘍、脳卒中および心臓発作は、天然の治癒に通常必要な血管新生が欠損することから生じうる。本発明は、ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２を特異的に結合する抗体(例えばｂＨ１-８１又はｂＨ１-４４抗体)使用して、上記の疾病を有するか又は発症するリスクにある患者を治療することを考慮する。
本発明の組成物が投与される候補にある他の患者は、血管結合組織の異常増殖、赤瘡、後天性免疫不全症候群、動脈閉塞、アトピー性角膜炎、細菌性潰瘍、ベーチェット疾患、血液が媒介する腫瘍、頸動脈閉塞性疾患、脈絡叢血管新生、慢性炎症、慢性網膜剥離、慢性ブドウ膜炎、慢性 硝子体炎、コンタクトレンズ疲労、角膜移植片拒絶、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、クローン病、イールズ病、流行性角結膜炎、真菌潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状ヘルペス感染、過粘稠度症候群、カポシ肉腫、白血病、脂質変性、ライム病、周縁表皮剥離、モーレン潰瘍、ハンセン病以外のマイコバクテリア感染、近視、眼性新生血管疾患、視神経窩、オスラー-ウェーバー症候群(オスラー-ウェーバー-ランデュ)、骨関節炎、パジェット病、毛様体扁平部炎、類天疱瘡、phylectenulosis、多発動脈炎、レーザー後合併症、原生動物の感染、弾性線維性偽性黄色腫、翼状片角膜炎乾燥、放射状角膜切開、網膜血管新生、未熟児の網膜症、水晶体後繊維増殖、類肉腫、強膜炎、鎌状赤血球貧血、シェーグレン症候群、固形腫瘍、シュタルガルト病、スティーブンジョンソン病、上辺縁角膜炎、梅毒、全身狼瘡、テリアン周縁変性、トキソプラズマ症、ユーイング肉腫の腫瘍、神経芽細胞腫の腫瘍、骨肉腫の腫瘍、網膜芽細胞腫の腫瘍、横紋筋肉腫の腫瘍、潰瘍性大腸炎、静脈閉塞、ビタミンＡ欠乏、ヴェゲナー肉芽腫、糖尿病と関係している望ましくない脈管形成、寄生虫病、異常な創傷治癒、手術、損傷又は外傷後の肥大(例えば急性の肺損傷／ＡＲＤＳ)、体毛成長の阻害、***および黄体形成の阻害、移植の阻害および子宮における胚発達の阻害を有するか、又は発症するリスクにある。
抗血管新生治療は、移植片拒絶、肺炎症、原発性肺高血圧、ネフローゼ症候群、子癇前症、及び胸水貯留、望ましくない血管透過によって特徴づけられる疾患及び疾患、例えば、脳腫瘍と関連している浮腫、悪性腫瘍と関連している腹水、メイグス症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心嚢液貯留(心膜炎と関係するもの)、心血管疾患と関連している透過性、例えば心筋梗塞および脳卒中などの後の症状、及び敗血症の一般的な処置に有用である。
本発明の他の血管新生依存性疾患には、血管線維腫(出血傾向がある異常な血管)、血管新生緑内障(目の血管成長)、動静脈奇形(ＡＶＭ；動脈および静脈間の異常な連通)、結合しない骨折(治癒しない骨折)、アテローム動脈硬化性斑(動脈の硬化)、化膿肉芽腫(血管から成る一般的な皮膚病変)、強皮症(結合織病の形)、血管腫(血管から成る腫瘍)、髄膜種、甲状腺過形成(グレーブス病)、トラコーマ(発展途上国の盲目の主要な原因)、血友病関節、滑膜炎、皮膚炎、血管接着、および肥大した瘢痕(異常な瘢痕形成)が含まれる。
ＩＶ．用量および製剤
抗体(例えばｂＨ１-４４ ｂＨ１-８１)又は抗体断片の組成物は、良好な医療行為に一致した形で処方され、投与量が決められ、投与される。この場合に考慮される因子には、治療されている特定の疾患、治療されている特定の哺乳動物、個々の被検体の臨床症状、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医師に知られている他のファクターが含まれる。投与される抗体又は抗体断片の「治療上有効量」は、このような考慮によって調整され、癌又は自己免疫性疾患を予防するか、改善するかまたは治療するために必要な最小限量である。抗体又は抗体断片は、必ずしもそうする必要はないが、場合によっては、癌又は自己免疫性疾患あるいは癌又は自己免疫性疾患のリスクの予防又は治療のために現在使用されている一又は複数の薬剤と共に処方される。かかる他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体又は抗体断片の量、疾患又は治療のタイプ、及び上で検討した他の因子に依存する。これらは、一般に、これまで使用されたものと同じ用量及び投与経路で、あるいはこれまで用いられた投薬量の約１から９９％で使用される。一般に、癌の寛解又は治療は、癌と関係する一又は複数の症状又は医学的な問題を少なくすることを伴う。治療上有効な量の薬剤によって、以下の何れか又はいくつかが達成される。癌細胞数の(少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％以上の)減少；腫瘍サイズ又は腫瘍負担の低減又は阻害；周辺臓器への癌細胞の浸潤の阻害(すなわちある程度の減少及び／又は停止)；腺腫の場合のホルモン分泌の低減；血管密度の低減；腫瘍転移の阻害；腫瘍増殖の低減又は阻害；及び／又は、癌関連の一又は複数の症状のある程度の軽減。ある実施態様では、抗体又は抗体断片を用いて、被検体の癌又は自己免疫性疾患の発症又は再発を防ぐ。
一実施態様では、本発明は、癌又は自己免疫性疾患に罹りやすいか又はそうと診断されたヒト患者の生存期間を増すために用いられうる。生存期間は、薬剤の最初の投与から死亡の時と定める。また、生存期間は治療中の患者の死亡のリスクを表す、コントロール群に対する治療群の危険率(ＨＲ)を層別化することによって測定することもできる。
更に他の実施態様では、本発明の治療法は、様々な抗癌療法にて治療される癌であると疑われるか診断された一群のヒト患者において奏効率を有意に増加させる。奏効率は治療に反応した治療された患者の割合と定義される。一態様では、抗体ないし抗体断片と、手術、放射線療法又は一又は複数の化学療法剤を使用する本発明の併用治療法は、手術、放射線療法又は化学療法単独で治療された群と比較して治療患者群において奏効率を有意に増大させ、該奏効率は０．００５未満のχ二乗ｐ値を有する。
癌の治療の治療的有効性の更なる測定値は、米国特許出願公開番号２００５０１８６２０８において記述される。
治療用製剤は、所望の純度を有する活性成分を、任意の生理的に許容される担体、賦形剤又は安定剤と混合することによって、当分野で公知の標準的な方法を用いて調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences (20th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)。許容可能な担体には、生理食塩水、又はリン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などのバッファ；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量(およそ１０未満の残基)のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、アミノ酸、例として、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；単糖、二糖および他の炭水化物、例としてグルコース、マンノース又はデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；および／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はＰＥＧが含まれる。
場合によって、しかし、好ましくは、製剤は、薬学的に許容可能な塩、好ましくは塩化ナトリウムを、好ましくは生理的濃度で含有する。場合によって、本発明の製剤は、薬学的に許容可能な防腐剤を含有してもよい。いくつかの実施態様では、保存の濃度は、０．１から２．０％、一般的にｖ／ｖの範囲である。好適な防腐剤には製薬の分野で知られているものが含まれる。ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベンおよびプロピルパラベンは、好適な防腐剤である。場合によって、本発明の製剤は、０．００５〜０．０２％の濃度で、薬学的に許容可能な界面活性剤を含んでもよい。
また、本明細書中の製剤は、治療される特定の徴候の必要に応じて、一よりも多い活性な化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を有するものを含有してもよい。このような分子は、意図する目的のために有効である量で組み合わされて適切に存在する。
活性成分はまた、コロイド性薬物デリバリーシステム(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロカプセル、ミクロエマルション、ナノ−粒子、およびナノカプセルなど)又はマクロエマルション中、例えば、それぞれ、コアセルベーション法又は界面重合法によって製造された、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−(メチルメタシラート)(poly-(methylmethacylate) マイクロカプセルに取込むことができる。このような技術は、上掲のRemington's Pharmaceutical Sciencesにおいて開示される。
徐放性製剤も調製できる。徐放性製剤の適切な例には、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスはフィルムやマイクロカプセル等の成形品の形である。徐放性マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２−ヒドロキシエチルメタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタマートの共重合体、非−分解性エチレン−ビニルアセテート、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ(乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリド(leuprolide acetate)から構成される注射用ミクロスフェア)のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−Ｄ−(−)−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グルコール酸のようなポリマーは分子を１００日間にわたって放出することができるが、ある種のヒドロゲルはタンパクをより短時間の間放出する。被包された抗体が体内に長時間維持された場合、３７℃で水分に暴露されて変性するか凝集し、結果として生物学的活性を失い免疫原性が変化するかもしれない。関与する機構に応じて安定化のための合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を介する分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが分かれば、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含量のコントロール、適当な添加物の使用、および特異的なポリマーマトリックス組成物の使用によって達成することができる。
ここに記載の抗体ないし抗体断片(例えばｂＨ１−４４又はｂＨ１−８４又はこれらの断片)は、ボーラスとして又はある期間の連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、包膜内、経口、局所などの投与経路又は吸入経路などの既知の方法でヒト患者に投与される。広範囲な副作用又は毒性がＶＥＧＦ及び／又はＨＥＲ２拮抗作用と関係している場合、局所投与が特に望ましい。また、エクスビボ方策が医療適用のために用いられてもよい。エクスビボ方策は、抗体ないし抗体断片をコードするポリヌクレオチドを被検体から得られる細胞に形質移入させるか又は形質導入させることを伴う。形質移入させるか又は形質導入させた細胞は、次いで被検体に戻される。細胞は、造血性細胞(例えば骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞又はＢ細胞)、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチン合成細胞又は筋細胞を含むが、これらに限定されるものではない様々な範囲のいずれかでありうる。
一例では、抗体(例えばｂＨ１−４４又はｂＨ１−８１)あるいは抗体断片は、疾患又は腫瘍の位置が許す限り、例えば直接注射によって局所的に投与され、この注射は周期的に繰り返されうる。また、抗体ないし抗体断片は、局所の再発又は転移を予防するかまたは低減するために、被検体に全身的に、又は腫瘍細胞、例えば腫瘍の外科的切除後の腫瘍又は腫瘍巣に直接、送達されてよい。
Ｖ．製造品及びキット
本発明の他の実施態様は、自己免疫性疾患及び癌の治療に有用な材料を具備する製造品である。製造品は、容器と容器上ないしは容器に付随するラベルないしはパッケージ挿入物を具備する。適切な容器には、例えば瓶、バイアル、注射器などが含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックのような様々な材料から形成されてよい。容器は、症状の治療に有効である組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも一つの活性薬剤は本発明の多重特異性抗体ないしその抗体断片である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の疾患の治療に用いられることを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は更に、抗体組成物を患者に投与するための指示を含む。また、本明細書中に記載の併用用治療を含む製造品及びキットも考慮される。
パッケージ挿入物は、慣習的に治療用製品の市販パッケージに含まれる指示書を指し、効能、使用、用量、投与、禁忌及び／又はこのような治療用製品の使用に関する警告についての情報を含むものである。他の実施態様では、パッケージ挿入物は、組成物が、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、腎臓細胞癌腫、膠腫又は卵巣癌の治療のために用いられることを示す。
さらに、製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
また、様々な目的、例えばＶＥＧＦ又はＨＥＲ２を細胞から精製する又は免疫沈降するために有用なキットが提供される。ＶＥＧＦ又はＨＥＲ２の単離又は精製のために、キットは、ビーズ(例えばセファロースビーズ)に結合したＶＥＧＦ／ＨＥＲ２抗体(例えばｂＨ１−４４又はｂＨ１−８１)を含みうる。例えば、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットにおいて、ＶＥＧＦ又はＨＥＲ２をインビトロで検出及び定量するための抗体を具備するキットが提供されうる。製造品と同様に、キットは、容器と容器上ないしは容器に付随するラベルないしはパッケージ挿入物を具備する。容器は、本発明の少なくとも一の多重特異性抗体ないし抗体断片を含む組成物を収容する。例えば希釈剤及びバッファ又はコントロール抗体を具備する他の容器が具備されてよい。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物の説明並びにインビトロでの使用又は診断上の使用についての指示を提供してよい。
前述の記載は当業者が本発明を実施するために十分であるとみなされる。以下の実施例は、事例のためだけであって、本発明の権利範囲が制限されるものでは決してない。事実、本明細書に示したもの及び記載内容に本発明の様々な変更が加わることは、前述の記載から当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲内のものである。
実施例１．ライブラリーの設計および構築
抗体の抗原結合部位は、抗原を認識するための３つのＣＤＲループをそれぞれ含有する重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の可変ドメイン（ＶＨ、ＶＬ）を結合させることによって形成される。多くの場合、これら２つの可変ドメインのうちの１つ、しばしばＶＨが、抗原の特異性を決定する。トランスジェニックなＨＣを有するが、未変化のＬＣレパートリーも有するマウスから、中和抗体価が生じる（Ｓｅｎｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：９５０〜９６１、２００３）。本発明者らは、抗体の二重特異性が発生し得る機序、ならびにＶＨドメインおよびＶＬドメインの異なる活用によって、二重の抗原結合特異性が可能となり得るかどうかの調査に着手した。
半経験的アプローチをとり、アミノ酸組成および抗体軽鎖のＣＤＲの長さを多様化するための設計、ならびにタンパク質抗原に特異的に結合する抗体を選択することができる、機能性ファージ表出抗体ライブラリーの生成を可能にするライブラリー鋳型を見出した。Ｋａｂａｔデータベースに示されているおよそ１５００個のヒトカッパ軽鎖配列のＣＤＲ領域の配列および長さの多様性は、ライブラリーの設計プロセスを導くのに役立った。溶媒に露出する残基を標的にして、ランダム化を行った。サブセットのランダム化した位置は、これらの部位における天然レパートリーの一部をなすアミノ酸となるように合わせ、一方、残りの部位は、２０種の天然に存在するアミノ酸すべてを含むようにランダム化した。
特に、以下に記載する軽鎖鋳型（可変ドメイン）を、本明細書の記載に従って改変した（下線を引いた残基がランダム化した残基である）（配列番号１０）。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQD 28 VNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYS 50 ASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQH 91 YTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
４つのセットのライブラリーを、３つのヒトＦａｂおよびｓｃＦｖの鋳型に基づいて生成し、明確に異なるセットの位置を標的にして、ランダム化を行った（図１）。
ライブラリーのすべてにおいて、重鎖は一定に保ち、その配列はライブラリー鋳型によって定義された。重鎖鋳型（可変ドメイン）の配列を、以下に記載する（配列番号１１）。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH
ライブラリーの設計を、図１および図２に要約する。すべてのライブラリー鋳型が、ＣＤＲ Ｌ１中に組み込まれた終止コドン（Ｓｉｄｈｕら、２００４）を含有して、ファージ表出抗体ライブラリーのメンバーの間に鋳型軽鎖が存在するのを阻止した。鋳型のＣＤＲ配列を、図３に要約する。
一例では、本発明者らは、元々の結合特異性を保持する一方で、異なるタンパク質抗原に結合することができる変異体を同定するために、ＨＥＲ２に特異的な抗体のＬＣ可変ドメイン中に突然変異を導入した。本発明者らは、安定に発現することができる変異体を生成するために、保存的アプローチをとって、ＬＣ ＣＤＲをランダム化した。溶媒に露出する１２箇所のＬＣ ＣＤＲ位置、すなわち、ＣＤＲ１中の５箇所（２８、２９、３０、３１、３２）、ＣＤＲ２中の３箇所（５０、５１、５３）、およびＣＤＲ３中の４箇所（９１、９２、９３、９４）を選択して、ランダム化を行った。さらに、選ばれた部位におけるアミノ酸の多様性の設計を導くために、およそ１５００のヒトカッパＬＣ ＣＤＲ配列を解析することによって、これらの位置の天然の多様性も調べた（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＷｕ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２１４、２０００；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１、１９８７）（図４）。比較的大きな天然の多様性を有するいくつかの位置（３０、３１、５０、９２、９３）は完全にランダム化し、一方、その他の位置では、わずか２つのアミノ酸の種類に限定して天然の抗体を模倣した。また、天然のＬＣのＣＤＲ１およびＣＤＲ３の長さの変化も、ライブラリーに反映させた（図４）。図４中、Ｘは、表示した低い頻度で設計したアミノ酸の種類を意味する。長さの多様性は、１〜５つの残基を、残基３０と残基３１との間および残基９３と残基９４との間に挿入することによって構築する。
このＬＣライブラリーは、生産的なナイーブレパートリーである（表１）。９５個のランダムクローンをスクリーニングした、４回の選別の終了時の結果を列挙する。特に、新たな結合特異性についての選別を、記載に従って、固定化した標的（ＶＥＧＦ、ＤＲ５およびヒトＦｃ）に対して実施した（Ｓｉｄｈｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８：２９９、２００４）。４回の選別後、標的ＨＥＲ２および非標的タンパク質ＢＳＡに対する結合性についてＥＬＩＳＡを使用して、９５個のファージクローンをアッセイして、特異的結合性を確かめた。ＨＥＲ２結合性を維持する、標的に結合するクローンを濃縮するために、ＨＥＲ２に対する最終回の選別を実施した。陽性クローンについて配列決定した。最も高い親和性の結合体を同定するために、抗原結合性についてのＩＣ５０を、競合ＥＬＩＳＡによって決定した（Ｓｉｄｈｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８：２９９、２００４）。特有のクローンの数を、配列解析により決定し、ＨＥＲ２結合性を維持する特有のクローンの数（二重特異性クローン）を示す。これらのクローンは、ＢＳＡ等の不適切な抗原に対しては最小のバックグラウンド結合シグナルを示す。
Figure 0005796831
３つのタンパク質抗原、すなわち、ヒト血管内皮増殖因子（ｈＶＥＧＦ）、デスレセプター５（ＤＲ５）、およびＩｇＧの補体結合断片（Ｆｃ）に対する選別によって、多くの結合性クローンを生成した（図５Ａ）。クローンの中には、ＨＥＲ２に対する結合親和性を喪失したものもあれば、ＨＥＲ２結合性を維持し、したがって、二重特異性であったものもあった。新たな結合特異性を有する１３１個の特有のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体変異体の配列解析によって、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体（図５Ｂ）と比較したアミノ酸の置換および挿入が同定された。
突然変異の数は、３〜１７個の範囲に及んだ。ＨＥＲ２結合性を保持したクローン（二重特異性クローン）は平均して、ＨＥＲ２結合性を喪失したクローンよりも少ない突然変異を含有した。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体のＣＤＲ−Ｌ３配列を保持することが好まれたが、それだけではＨＥＲ２結合性を保存するのには十分ではなかった。このことは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体のＣＤＲ−Ｌ３が、ＨＥＲ２結合性についての最も重要なＬＣ ＣＤＲであるという報告と一致する（ＫｅｌｌｅｙおよびＯ’Ｃｏｎｎｅｌｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：６８２８．１９９３）。代表的なＶＥＧＦ結合性クローンを、Ｆａｂタンパク質およびＩｇＧタンパク質として発現させた（表２）。
Figure 0005796831
本発明者らは、これらの抗体が、それらの同族抗原（ｃｏｇｎａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）に特異的に結合し、その他のタンパク質とは非特異的に相互作用しないことを実証するために、１パネルの哺乳動物細胞溶解物および非抗原性タンパク質に対しては、検出可能な結合性がないことを示した。このアッセイにより、精製したＩｇＧまたはＦａｂの単一特異性および二重特異性が確認された（図６）。
ＬＣライブラリー由来の単一特異性抗体の平衡結合親和性（ＫＤ）は、１５〜１５０ｎＭの範囲に及んだ。二重特異性抗体は、新たな抗原（すなわち、ＶＥＧＦ）には、高ｎＭから低μＭまでの親和性で結合し、ＨＥＲ２には、低ｎＭの親和性で結合した（表２）。表２に示す抗体のうち、抗体ｂＨ１が、２つの異なるタンパク質抗原、すなわち、ＶＥＧＦ（ＫＤ＝３００ｎＭ）およびＨＥＲ２（ＫＤ＝２６ｎＭ）に対して最も高い二重特異性の親和性を表出した。
材料
酵素およびＭ１３−ＫＯ７ヘルパーファージは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミンおよびツイーン２０は、Ｓｉｇｍａから入手した。ニュートラアビジン、カゼインおよびＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋは、Ｐｉｅｒｃｅから入手した。固定化されているプロテインＧおよび抗Ｍ１３コンジュゲート化西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から入手した。Ｍａｘｉｓｏｒｐイムノプレートは、ＮＵＮＣ（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）から入手した。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質は、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）から入手した。すべてのタンパク質抗原は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の研究グループが生成した。ＤＮＡの縮重は、ＩＵＢコードを使用して示し、別段の記載がない限り、等モルの混合物を示す：Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｄ＝Ａ／Ｇ／Ｔ、Ｖ＝Ａ／Ｃ／Ｇ、Ｂ＝Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｈ＝Ａ／Ｃ／Ｔ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｙ＝Ｃ／Ｔ。
例えば、特定のランダム化した位置において、野生型のコドンを、全２０種の天然アミノ酸をコードする縮重ＮＮＫコドン（等モル比のＮ＝Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ）で置き換えた。ＸＹＺコドンは、コドンのトリプレットのそれぞれの位置のヌクレオチドの比が等しくないコドンを指す。Ｘは、３８％のＧ、１９％のＡ、２６％のＴおよび１７％のＣを含有し；Ｙは、３１％のＧ、３４％のＡ、１７％のＴおよび１８％Ｃを含有し；Ｚは、２４％のＧおよび７６％Ｃを含有した。
ライブラリー構築のためのファージミドベクター
標準的な分子生物学の技法を使用して、ベクターを構築した。３つの鋳型を、ライブラリーを生成するために構築した。すべての鋳型は、改変ヒト化４Ｄ５（８版）（Ｌｅｅら、２００４ａ）に基づいた重鎖ライブラリーにおいて使用したプラスミドｐＶ０３５４の誘導体である。
Ｆａｂの軽鎖および重鎖の両方について、アルカリホスファターゼプロモーター（Ｌｏｗｍａｎら、１９９１）およびｓｔＩＩ分泌シグナルを含有するｐＶ０３５４−Ｆａｂ−Ｃベクターに２Ｃ４重鎖可変ドメインをクローニングすることによって、２Ｃ４Ｆａｂ−Ｃ鋳型ファージミドｐＪＢ０２９０を構築した。これを、以前の記載（Ｌｅｅら、２００４ｂ）に従って、単一のシステインを重鎖可変ドメイン１のＣ末端において含有するように工学的に操作して、２Ｃ４Ｆａｂの二価のＭ１３ファージ表出を可能にした。２Ｃ４軽鎖ＣＤＲを、Ｆａｂ−Ｃベクターに、Ｋｕｎｋｅｌらの方法（Ｋｕｎｋｅｌら、１９８７）を使用する部位特異的変異誘発によって組み込んだ。記載（Ｓｉｄｈｕら、２００４）に従って、エピトープタグ（ｇＤタグ）（ＬａｓｋｙおよびＤｏｗｂｅｎｋｏ、１９８４）を、軽鎖のＣ末端に付加して、表出レベルの決定を可能にした。高表出の重鎖可変ドメインをｐＶ０３５４−Ｆａｂ−Ｃにクローニングすることによって、Ｆａｂ１２−Ｇライブラリー鋳型ｐＶ１２８３を創出し、軽鎖可変ドメインをＦａｂ−１２（ヒト化Ａ４．６．１、抗ＶＥＧＦ抗体）のＣＤＲ−Ｌ３を含有するように改変した。高表出のＶＨは、Ｇ６Ｆａｂの重鎖ＣＤＲ残基をショットガンアラニンスキャニング変異誘発（Ｌｉａｎｇら、２００６；Ｖａｊｄｏｓら、２００２）を使用してランダム化し、ＣＤＲ−Ｌ３がＦａｂ−１２に転換している（Ｙ９１ＳＴＶＰＷ９６；配列番号２４）Ｆａｂライブラリーから、固定化抗ｇＤ抗体上でのパニングによって選択した。Ｍ１３ファージ粒子の表面上で４ｄ５（ＬＣ−Ｒ６６Ｇ）ｓｃＦｖを二価性に表出するファージミドｐＶ１３８４の設計および構築を、以前に記載されている（Ｓｉｄｈｕら、２００４）鋳型ｐＳ２０１８から改変した。ｓｃＦｖ断片は、軽鎖と重鎖との間のリンカー領域中にｇＤエピトープタグを含有した。ＬＣフレームワークの残基Ａｒｇ６６を、９５％超の天然のカッパ軽鎖中のこの位置の優勢な残基であるＧｌｙ６６に突然変異させた。ＫｅｌｌｅｙおよびＣｏｎｎｅｌｌの記載（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：６８２８、１９９３）によれば、このＲ６６Ｇの突然変異によって、ＨＥＲ２に対するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体の結合親和性はわずかに低下するに過ぎない（＜２倍）。ライブラリー鋳型のＣＤＲ配列を、図３に要約する。
ライブラリーの構築
ファージ表出ライブラリーを、記載（Ｓｉｄｈｕら、２００４）に従って、オリゴヌクレオチド指定変異誘発を使用して創出した。このライブラリー鋳型ベクターは、ＣＤＲ−Ｌ１中に組み込まれた終止コドン（ＴＡＡ）を含有し、これは、変異誘発反応の間に、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ３（すべてのライブラリー）、ＣＤＲ−Ｌ２（Ｌ１／Ｌ２／Ｌ３−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、＋Ｌ４−Ｄ）、ならびに軽鎖フレームワーク３（Ｌ１／Ｌ４およびＬ１／Ｌ２／Ｌ３＋Ｌ４−Ｄ）をコードする配列上にアニールする縮重オリゴヌクレオチドを使用して修復された。ライブラリーの変異誘発反応は、Ｋｕｎｋｅｌらの方法（Ｋｕｎｋｅｌら、１９８７）に従って実施した。ライブラリーのための軽鎖ＣＤＲの設計を、図１に記載する。図１には、異なるライブラリーのために各位置で使用した縮重コドンが要約されている。ランダム化の標的となる各位置において所望の頻度のアミノ酸の種類をコードするように、各ＣＤＲについて、３つまたは４つのオリゴヌクレオチドを特定の比でミックスした（図４）。オリゴヌクレオチドを異なる比で組み合わせて、選択した位置においては、天然の軽鎖カッパ配列中のアミノ酸頻度を反映するように多様性を微調整した。ＣＤＲ１の場合、９１〜９４位のコドンを含有する３つのオリゴヌクレオチド、すなわち、ＣＡＴ ＮＮＫ ＮＮＫ ＲＳＴ（配列番号２５）、ＫＭＴ ＸＹＺ ＸＹＺ ＲＳＴ（配列番号２６）またはＤＧＧ ＸＹＺ ＸＹＺ ＲＳＴ（配列番号２７）を、１：３：１の比でミックスした。ＸＹＺは、脂肪族の疎水性アミノ酸の範囲を低下させるために、各部位について等しい比率のＡ／Ｇ／Ｔ／Ｃを有するＮＮＫの変化形態である（Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０：１０７３、２００４）。ＣＤＲ２の場合、５０〜５３位のコドンを含有する４つのオリゴヌクレオチド、すなわち、ＮＮＫ ＧＳＴ ＴＣＣ ＮＮＫ（配列番号２８）、ＴＧＧ ＧＳＴ ＴＣＣ ＮＮＫ（配列番号２９）、ＫＧＧ ＧＳＴ ＴＣＣ ＴＭＴ（配列番号３０）またはＮＮＫ ＧＳＴ ＴＣＣ ＴＭＴ（配列番号３１）を、１：１：２：１０の比でミックスした。ＣＤＲ３の場合、それぞれの長さは、２８〜３３位のコドンを含有する３つのオリゴヌクレオチド、すなわち、Ｇ７０Ａ７０Ｃ７０ ＲＴＴ ＮＮＫ ＮＮＫ ＴＡＣ ＳＴＡ（配列番号３２）、Ｇ７０Ａ７０Ｃ７０ ＲＴＴ ＮＮＫ ＮＮＫ ＤＧＧ ＳＴＡ（配列番号３３）またはＧ７０Ａ７０Ｃ７０ ＲＴＴ ＮＮＫ ＮＮＫ ＮＭＴ ＳＴＡ（配列番号３４）の１：１：２の比の混合物であった。Ｇ７０Ａ７０Ｃ７０は、「ソフト」コドンであり、指定したヌクレオチドを７０％有し、その他の３つヌクレオチドをそれぞれ１０％有し、約５０％のＧｌｕおよび約５０％のその他のアミノ酸をコードする。
カッパＬＣを有するいくつかの代表的な抗体の構造解析から、ＣＤＲ１が最も広い範囲の立体構造を有し、このことは、ループの長さが変動すること（２４位と３４位との間で１１〜１７残基）の結果である可能性が高いことが示されている。したがって、異なるＣＤＲ−Ｌ１の長さ（１１〜１６残基長）を、ライブラリーに含めた。また、天然のＣＤＲ−Ｌ３も長さが変動し（８９位と９６位との間で７〜１０残基長）、これも、ライブラリーの設計によって反映されている（８〜１０残基長；図４）。
図１に、軽鎖の天然の多様性と実際のライブラリーの設計との比較を示す。変異誘発産物を、１つのライブラリー当たり１つの反応にプールし、ＫＯ７ヘルパーファージを補った大腸菌ＳＳ３２０細胞中に電気穿孔し、３０℃で一晩増殖した（Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０：１０７３、２００４）。約１０１１個の細胞および約５〜１０μｇのＤＮＡを、各エレクトロポレーション反応において使用した。ライブラリーファージを精製した（Ｓｉｄｈｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８：２９９、２００４）。形質転換体の数は、１０９〜１０１０個の範囲に及んだ。ファージ表面上の未変化のＦａｂまたはｓｃＦｖの表出レベルを、ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて決定し、この場合、各ライブラリーから無作為に選択した９６個のクローンを、抗ｇＤ抗体と結合するそれらの能力について試験した。この表出レベルは、５〜２５％の範囲に及んだ（図２）。抗体を表出するクローンのうちの２５％が、ＨＥＲ２結合性を保持した。およそ１５０個の表出クローンを配列決定して、設計の多様性と比較した実際のライブラリーの多様性を調べた。機能を表出したライブラリーメンバーのうちの一部（約３０％）が、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体のＣＤＲ−Ｌ２配列および／またはＣＤＲ−Ｌ３配列を保持し、これは、不完全な変異誘発に起因した（ｓｃＦｖの発現においては、ＣＤＲ−１中の鋳型の終止コドンによって、このＣＤＲの１００％の突然変異が保証された）。これらは、実際のライブラリーの多様性の配列解析から除外した。大半のランダム化した位置において、ファージ表出ライブラリーの表出クローンの多様性は、設計した多様性から有意には逸脱しなかった（ｐ＞０．０５、オッズ比検定）。例外は、Ｉｌｅと比較して若干過剰出現する（ｐ＝０．００５）ことが見出されたＣＤＲ−Ｌ１の２９位、ならびにＧｌｙおよびＳｅｒがそれぞれ、ＡｌａおよびＴｙｒよりも優勢である（ｐ＜０．０１）ＣＤＲ−Ｌ２の５１位および５３位であった。
実施例２．ライブラリーの性能の評価
ライブラリーの分類およびスクリーニング
種々のタンパク質抗原に特異的に結合する抗体を、４〜５回の分類後に単離することができる場合に、ライブラリーが機能を有するとみなした。多くのタンパク質標的は、機能性に固定化してライブラリーのパニングを行うことが可能であることが知られており、妥当性が確認されたファージ表出ライブラリーから特異的な抗体が生成されている（Ｆｅｌｌｏｕｓｅら、２００５）（Ｌｅｅら、２００４ａ）。本発明者らは、各セットのライブラリーを評価するために、これらの標的のサブセットを選んで、選別を行った（図２）。これらのライブラリーに対して、抗ｇＤ抗体またはプロテインＬを捕捉標的として用いて結合性の選別の初回を行って、Ｆａｂ／ｓｃＦｖ遺伝子が欠失しているクローンを排除し、それに続いて、４〜５回の抗原の選別を行った。あるいは、それらのライブラリーに対して、抗ｇＤまたはプロテインＬを用いる前選別なしで、標的結合性の直接的な選別も行った。ＮＵＮＣ製９６ウエルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを、抗原（５μｇ／ｍｌ）を用いて一晩コートし、遮断剤を交互に用いて１時間遮断した（図７）。最初の選別サイクルでは、１０１３ファージ／ｍｌのファージ溶液を、コートしたイムノプレートに添加した。ファージ濃度は、選別の回が進むにつれて減少させた。イムノプレート上のファージ溶液をインキュベートして、固定化抗原に結合させた後、プレートを、ＰＢＳ、０．５％ツイーン２０を用いて繰り返し洗浄した。ストリンジェンシーを増加させるために、選別の回が進むにつれて、インキュベーション時間を短縮し（１回目４時間、２回目３時間、３回目３時間、４回目２時間、５回目１．７５時間）、洗浄回数を増加させた（図７）。結合しているファージを、０．１Ｍ ＨＣｌを用いて３０分間溶出し、溶出液を、１．０Ｍ Ｔｒｉｓ塩基を用いて中和した。抗原でコートしたイムノプレートウエル１つ当たりのファージの回収率を計算し、抗原でコートされていないが遮断されているウエルの回収率と比較して、標的抗原に特異的に結合する、ＦａｂまたはｓｃＦｖを表出するファージクローンの濃縮を調べた（図７）。溶出したファージを、大腸菌中で増幅し、その後の選別のために使用した。ランダムクローンを４回目および５回目から選択して、ファージＥＬＩＳＡを使用してスクリーニングおよびアッセイを行い、ここでは、標的および抗ｇＤに対する結合性を関連のないタンパク質（ＢＳＡ）に対する結合性と比較して、非特異的な結合を調べた。抗ｇＤ抗体および標的に結合するが、非特異的タンパク質には結合しないクローンを、特異的陽性とみなした。ライブラリーＬ１／Ｌ３、Ｌ１／Ｌ４、Ｌ１／Ｌ２／Ｌ３−Ａ、Ｌ１／Ｌ２／Ｌ３−Ｂ＿１およびＬ１／Ｌ２／Ｌ３−Ｂ＿２は、いずれの特異的陽性のクローンも産生しなかったが、ライブラリーＬ１／Ｌ２／Ｌ３−ＣおよびＬ１／Ｌ２／Ｌ３＋Ｌ４−Ｄからは、標的抗原に対して特異的な抗体を単離することができた。
例えば、４回目から得られたランダムクローンを、ファージＥＬＩＳＡを使用してアッセイし、ここでは、個々に増幅したクローンの、標的およびＨＥＲ２に対する結合性を、非標的タンパク質（ＢＳＡ）に対する結合性と比較して、結合特異性を試験した。ＨＥＲ２結合性を維持するファージクローンを濃縮するために、ＶＥＧＦまたはＤＲ５による選別の３回目および４回目から溶出したファージを増殖し、それに対して、ＨＥＲ２でコートしたウエル上でさらに１回選別を行った。陽性クローンのＶＬ領域およびＶＨ領域を、ＰＣＲにより増幅し、配列決定した。
ｈＦＣ、ｈＶＥＧＦおよびｈＤＲ５−ｌｆのヒット率はそれぞれ、６３％、７７％および８５％であった。陽性クローンのＶＬ領域を、記載（Ｓｉｄｈｕら、２００４）に従ってＰＣＲにより増幅し、配列決定した。陽性の特異的な結合体のＤＮＡ配列解析から、特有のクローンのパーセントが、５１％（ｈＦＣ）、５５％（ｈＶＥＧＦ）および６．１％（ｈＤＲ５−ｌｆ）であることが明らかになった。特有のｈＶＥＧＦ結合性クローンの配列を、図８に要約する。
ｈＶＥＧＦ結合性クローンのプレート選別と溶液選別との組合せ
４回の分類の後のｈＶＥＧＦ結合性クローンに大きな多様性が観察された。高い親和性のｈＶＥＧＦ結合性クローンを同定するために、４回目のプレートに基づいた分類に続いて、溶液に基づいた選別のアプローチをとった。５０ｎＭビオチン化ｈＶＥＧＦを、固定化抗原上での４回目の選別から得て繁殖させたファージと共にインキュベートした。攪拌しながら室温で２時間インキュベートした後、ｈＶＥＧＦに結合しているファージを、ニュートラアビジンでコートし遮断したイムノプレート上に捕捉し、それに続いて、繰り返し洗浄した。ファージクローンを、先の記載に従って、溶出、スクリーニングおよび配列決定した。この最後の溶液選別ステップから得られたｈＶＥＧＦ結合性クローンの配列を、図９に示す。
ライブラリーＬ１／Ｌ２／Ｌ３−ＣおよびライブラリーＬ１／Ｌ２／Ｌ３＋Ｌ４−Ｄからの二重特異性クローンの単離
ライブラリーＬ１／Ｌ２／Ｌ３−ＣおよびライブラリーＬ１／Ｌ２／Ｌ３＋Ｌ４−Ｄのライブラリー鋳型は、Ｈｅｒ２に高い親和性で結合する、ｈｕ４Ｄ５抗体から改変したｓｃＦｖ断片であった。ｈｕ４Ｄ５−５のＨｅｒ２結合性についての機能性パラトープを、ＣＤＲ領域のアラニンスキャニング変異誘発によって位置付けると、重鎖の残基が、大半の結合の自由エネルギーに寄与し、一方、個々の軽鎖の残基が寄与する程度はそれより少ないことが示された（ＫｅｌｌｅｙおよびＯ’Ｃｏｎｎｅｌｌ、１９９３）。ヒトＨｅｒ２−ＥＣＤと複合したＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体のＦａｂの原子構造の解析から、軽鎖は、抗原との接触を起こすことに関与し、一方、重鎖は、抗原との構造的な界面の大部分をもたらすことが実証されている（Ｃｈｏら、Ｎａｔｕｒｅ ４２１：７５６、２００３）。本発明者らは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体の鋳型上に構築した機能性の軽鎖ライブラリーのいくつかのメンバーが、Ｈｅｒ２への結合能を保持することを観察した。Ｈｅｒ２にも第２の抗原にも結合することができる機能性ライブラリーであるＬ１／Ｌ２／Ｌ３−ＣおよびＬ１／Ｌ２／Ｌ３＋Ｌ４−Ｄから、二重特異性ｓｃＦｖ断片を単離する試みにおいて、２つの戦略を適用した。１つのアプローチでは、先に記載した標的抗原の選別から得られた陽性のクローンを、ＥＬＩＳＡにより、Ｈｅｒ２結合性を保持するものについてスクリーニングした。Ｈｅｒ２に結合することができる特異的陽性のクローンのパーセントは、第２の抗原の特異性に依存して変化した。６１個の特有のｈＦｃに特異的陽性のクローンのうちわずか１個のクローンが依然としてＨｅｒ２に結合するに過ぎず（１．６％）、４１個の特有のｈＶＥＧＦ結合性クローンのうち３０個が依然としてＨｅｒ２に結合し（７３％）、５つの特有のｈＤＲ５結合体のうち２つが依然としてＨｅｒ２に結合した（４０％）。さらに、選別に基づくアプローチもとって、二重特異性抗体を、ｈＶＥＧＦ結合性抗体およびｈＤＲ５結合性抗体のプールからＨｅｒ２結合体を選択することによって単離した。標的抗原の分類の４回目から得られた溶出液に対して、２×１０１３個のファージ／ｍｌを、Ｈｅｒ２（５μｇ／ｍｌ）でコートしＢＳＡで遮断したＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレート上で１時間インキュベートすることによってさらに１回選別を行った。これらのプレートを、先の記載に従って、ＰＢＳ、０．５％ツイーン２０を用いて１５回洗浄し、結合しているファージを溶出した。ランダムクローンを、Ｈｅｒ２、抗ｇＤおよび標的に対する結合性について選択およびアッセイし、非関連のタンパク質（ＢＳＡ）への非特異的な結合と比較した。試験した１９２個のクローンすべてが特異的陽性であると同定され、これらを先の記載に従って配列決定した。配列決定から、９４個の特有の配列が明らかになった。要約すると、この方法により、試験した９４個の特有のクローンから、９４個のＨｅｒ２／ｈＶＥＧＦ二重特異性クローンを生成した（１００％）（図８）。両方の単離戦略から単離した特有のｈＶＥＧＦ／Ｈｅｒ２二重特異性抗体すべての配列を、図１０Ａおよび１０Ｂに要約する。Ｈｅｒ２に対する検出可能な結合性すべてを喪失した単離クローンの配列を、図１１に示す。二重の特異性を有するクローンのうち、ほとんどすべてがＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体のＣＤＲ−Ｌ３を保持し、このことは、ＣＤＲ−Ｌ３の維持がＨＥＲ２結合性を維持するために重要である可能性を高めている。ｈＤＲ５の場合には、７個の特有のＨｅｒ２結合性クローンのうち２個が、二重特異性であった（２９％、１２個のクローンを配列決定した）。これらの二重特異性のクローンのうちの１個が、ＣＤＲ−Ｌ３中にいくつかの相同的な変化を有した。
ｈＶＥＧＦ結合性クローンの高スループットによる特徴付け
９６ウエルフォーマット中での高スループットのシングルスポット競合ＥＬＩＳＡ（Ｓｉｄｈｕら、２００４）を使用して、ｈＶＥＧＦに対する高い親和性のクローンについてスクリーニングし、ＶＥＧＦＲ１遮断プロファイルを研究した。手短に述べると、Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅを、２μｇ／ｍｌｈＶＥＧＦ１０９を用いて４℃で一晩コートし、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを用いて１時間遮断した。大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ中のファージミドクローンを、カルベニシリンおよびＭ１３−ＫＯ７ヘルパーファージを補った１５０μｌの２ＹＴブロス中で増殖した。９６ウエルフォーマット中で、培養物を攪拌しながら３７℃で一晩増殖した。親和性スクリーニングのために、ファージを含有する培養上清を、ＰＢＳＴ（０．０５％ツイーン２０および０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを有するＰＢＳ）中で１００ｎＭ ｈＶＥＧＦ１０９を添加した状態または添加しない状態で５倍に希釈した。レセプター遮断スクリーニングのためには、ｈＶＥＧＦでコートしたウエルをＶＥＧＦＲ１ドメイン１〜３（Ｄ１〜３）およびＶＥＧＦＲ１ドメイン２（Ｄ２）がある状態またはない状態でインキュベートしてから、５倍に希釈したファージ上清を添加した（Ｌｉａｎｇら、２００６；Ｗｉｅｓｍａｎｎら、１９９７）。室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした後、混合物を、ｈＶＥＧＦ１０９を用いてコートしたプレートに移し、１０分間インキュベートした。プレートを、ＰＢＴ（０．０５％ツイーン２０を有するＰＢＳ）を用いて洗浄し、ＰＢＳＴ中で５０００倍に希釈して１ｎＭとなした抗Ｍ１３抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートと共に３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＴＭＢ基質を加えておよそ５分間展開し、１．０Ｍ Ｈ３ＰＯ４を用いて消光し、４５０ｎｍにおける分光光度を読んだ。シングルスポット親和性アッセイでは、溶液相ｈＶＥＧＦ１０９の存在下における吸光度の、溶液相ｈＶＥＧＦ１０９の非存在下における吸光度に対する比を、親和性の指標として使用した。低い比は、最初のインキュベーションの段階で大部分のＦａｂ−ファージが溶液相ｈＶＥＧＦ１０９に結合し、したがって、固定化ｈＶＥＧＦ１０９により捕捉されるものがなかったことを示すことになる。最初の４１個の特有のクローンの高スループット親和性アッセイの結果を、図１２に要約する。同様に、遮断アッセイの場合も、低い比は、クローンのｈＶＥＧＦ１０９に対する結合がｈＶＥＧＦ１０９とＶＥＧＦＲ１との相互作用によって遮断されることを示し、このことは、いくつかのクローンが、ＶＥＧＦ上に、それぞれのＶＥＧＦレセプター断片と重複する結合部位（エピトープ）を有し（図１３Ａおよび１３Ｂ）、これらのクローンは、遮断性の抗体を表出している可能性が高いことを示した。
二重特異性ｈＶＥＧＦ／Ｈｅｒ２クローンの高スループットによる特徴付け
先のセクションで記載したのと同じ原理を適用して、さらなる特徴付けのために、ｈＶＥＧＦおよびＨｅｒ２に対して高い親和性を有するクローンを単離することができた（図１４Ａ）。高スループットのシングルスポット競合ＥＬＩＳＡを使用して、ｈＶＥＧＦおよびＨｅｒ２に対する高い親和性クローンについて、Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅを２μｇ／ｍｌのｈＶＥＧＦ１０９およびＨｅｒ２−ＥＣＤを用いて４℃で一晩コートし、それに続いて、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを用いて１時間遮断することによってスクリーニングした。先のシングルスポットＥＬＩＳＡスクリーニングにおいて二重特異性であると同定されたファージクローンを、先の記載に従って増殖し、２０ｎＭ Ｈｅｒ２−ＥＣＤおよび５０ｎＭ ｈＶＥＧＦを添加した状態ならびに添加しない状態でインキュベートした。室温で１時間インキュベートした後、溶液を、先のセクションの記載に従って、コートしたイムノプレートに適用し、結合シグナルを記録および解析した。ｈＶＥＧＦおよびＨｅｒ２の両方について低い比を有するクローンを選択して、さらなる特徴付けを行った。シングルスポット競合ＥＬＩＳＡにおいて最も低いシグナル比を発生させたｈＶＥＧＦ特異的ファージクローンおよびｈＶＥＧＦ／Ｈｅｒ２二重特異性ファージクローンを選択して、競合ＥＬＩＳＡによる親和性の測定を行った。同様に、最初のシングルスポットＥＬＩＳＡスクリーニングから得られたＤＲ５結合性ファージクローンおよびＤＲ５／Ｈｅｒ２二重特異性ファージクローン、ならびにプレート選別と溶液選別との組合せから得られたＶＥＧＦ結合性クローンについても測定を行った。単一コロニーから得られたファージクローンを、カルベニシリンおよびＫＯ７ヘルパーファージを補った２５ｍｌの２ＹＴ培地中、３０℃で一晩増殖することによって繁殖させた。ＰＥＧ／ＮａＣｌ中で沈殿させることによって精製したファージを最初に、ＰＢＳＴ中で段階的に希釈し、抗原でコートしたプレートに対する結合について試験した。５０〜７０％の飽和シグナルを発生させる希釈度を、溶液結合アッセイにおいて使用し、この場合、ファージを、最初に、漸増濃度の抗原と共に１〜２時間インキュベートし、次いで、抗原でコートしたプレートに移し、１０〜１５分かけて未結合のファージを捕捉した。ＩＣ５０を、５０％のファージが固定化抗原に結合するのを阻害する溶液−結合段階の抗原濃度として計算した（Ｌｅｅら、２００４ａ）。図１４Ｂは、プレートによる分類戦略から得て、解析したｈＶＥＧＦ結合性クローンについてＩＣ５０を計算した曲線を示す。このＩＣ５０値は、２２ｎＭ〜＞１μＭの範囲に及んだ（図１４Ｂ）。プレートに基づいた選別と溶液に基づいた選別との組合せによって単離したｈＶＥＧＦ結合体についてのＩＣ５０値は、４１ｎＭ〜２２６ｎＭの範囲に及んだ（図９）。ＤＲ５結合性クローンのＩＣ５０値は、２０ｎＭ〜＞１μＭの範囲に及んだ。ｈＶＥＧＦ／Ｈｅｒ２二重特異性クローンについてのＩＣ５０値を、図１５に要約する。
実施例３．軽鎖ライブラリーから得られた抗体の特徴付け
ｓｃＦｖのＦａｂへの変換
ファージ上に表出したＦｖ’２のＦａｂへの変換が、ライブラリーから得られた結合性クローンの親和性に影響を及ぼすかどうかを試験するために、２つのクローン（３−７抗ｈＶＥＧＦおよび４−１抗ｈＤＲ５）を、Ｆａｂへの変換のために選び、ファージ上に表出させた。選択したｈＶＥＧＦのｓｃＦｖ断片およびＤＲ５のｓｃＦｖ断片についてのファージミドＤＮＡのＶＬ領域を、制限酵素を用いて消化し、これらの酵素によって、ＣＤＲ−Ｌ１をコードする領域のＤＮＡの上流（ＥｃｏＲＶ）、およびＣＤＲ−Ｌ３をコードする領域の下流（ＫｐｎＩ）が切断された。この消化したＤＮＡ断片を、同様に消化した、Ｆａｂ ｈｕ４Ｄ５のファージ表出のために設計されているベクター（ｐＡＰ２００９）に、Ｍ１３遺伝子−３マイナーコートタンパク質のＣ末端ドメインに融合することによってライゲーションした（Ｌｅｅら、２００４ｂ）。得られたバイシストロニックなファージミドは、アルカリホスファターゼプロモーターの制御下にある、Ｃ末端においてエピトープ（ｇＤ）タグに融合した軽鎖と、Ｃ末端においてＭ１３マイナーコートタンパク質（ｐ３）遺伝子に融合した重鎖（ＶＨおよびＣＨ１）とを含有する。第１のオープンリーディングフレームは、ｓｔＩＩ分泌シグナル、それに続く、ＣＤＲが３−７抗ｈＶＥＧＦのｓｃＦｖ’２および４−１抗ｈＤＲ５のｓｃＦｖ’２のＣＤＲで置換されているＦａｂ４Ｄ５軽鎖、ならびにそれに続く、ｇＤ−タグエピトープからなるポリペプチドをコードした。第２のオープンリーディングフレームは、以下からなる融合ポリペプチドをコードした：ｓｔＩＩ分泌シグナル、Ｆａｂ４Ｄ５重鎖、アンバー（ＴＡＧ）終止コドン、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー配列、およびｇ３タンパク質のｃ末端ドメイン（ｃＰ３）。Ｍ１３−ＫＯ７を同時感染させた大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ中における発現により、３−７ｓｃＦｖ’２および４−１ｓｃＦｖ’２のＦａｂ変異形を表出するＭ１３バクテリオファージを産生した。ファージ競合ＥＬＩＳＡを使用して、ｈＶＥＧＦおよびｈＤＲ５に対する、ファージが表出したｓｃＦｖおよびＦａｂの親和性を、ＩＣ５０値として推定した。これら２つの異なるフォーマットから得られたデータは十分に一致した（データ示さず）。
Ｍ１３バクテリオファージ表面上におけるｂＨ１ Ｆａｂの表出を可能にするために、プラスミドｐＡＰ２００９を、ｂＨ１ Ｆａｂをコードするように改変した。ｂＨ１ Ｆａｂの変異形を、ＬＣライブラリーおよびＨＣライブラリーのそれぞれのために、３つのＬＣ ＣＤＲまたは３つのＨＣ ＣＤＲの中に終止コドン（ＴＡＡ）を含有するライブラリー鋳型として使用した。別個の重鎖および軽鎖のアラニンスキャニングライブラリーおよびホモログスキャニングライブラリーを、以前の記載（Ｖａｊｄｏｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２０：４１５、２００２）に従って構築した。縮重度は、１×１０５〜１×１０８の範囲に及び、実際のライブラリーのサイズは、６×１０９〜４×１０１０の範囲に及んだ。ライブラリーは、上記に従って構築した。２〜３回の選別を、固定化標的（ＶＥＧＦ、ＨＥＲ２−ＥＣＤ、プロテインＬまたは抗ｇＤ ｍＩｇＧ）上で実施した（Ｖａｊｄｏｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２０：４１５、２００２）。標的結合性クローンを、ファージＥＬＩＳＡによって標的への結合についてスクリーニングし、それに続いて、ＤＮＡ配列決定および配列アライメントを行って、各位置における野生型／突然変異の比を計算した。Ｆｗｔ／ｍｕｔ値を求めるために、ＶＥＧＦ結合性クローンおよびＨＥＲ２結合性クローンのおよそ１００個の特有の配列の配列解析から得られた比を、表出およびタンパク質の折畳みの作用について、１００個超の抗ｇＤ結合性クローンの配列から計算した比で割ることによって補正した。Ｆａｂ重鎖のみが、ファージのコートに融合することから、軽鎖に融合するｇＤタグのファージ表出が、適切な折畳みおよび軽鎖と重鎖との結合の指標となる。また、一貫して、Ｆａｂの軽鎖上の非直鎖状エピトープに結合するプロテインＬからも、ｇＤタグにより選別した場合、類似の野生型／突然変異の比が得られた。Ｆｗｔ／ｍｕｔ値を、Ｖａｊｄｏｓらの記載（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２０：４１５、２００２）に従って、式ΔΔＧ＝ＲＴｌｎ（Ｋａ，ｗｔ／Ｋａ，ｍｕｔ）＝ＲＴｌｎ（Ｆｗｔ／ｍｕｔ）を使用してΔΔＧに変換した。
ライブラリー結合体の、遊離のヒトのＦａｂおよびＩｇＧとしての発現
これらの抗体の親和性、特異性およびその他の特性を正確に決定するために、競合ＥＬＩＳＡ実験において最も高い親和性を示す、それぞれの特異性の群から得られた代表的なクローンを選択して、遊離のＦａｂおよびｈＩｇＧとして発現させた（図１６）。軽鎖および重鎖の可変ドメインを、大腸菌中でのＦａｂの発現または哺乳動物細胞中での一過性のヒトＩｇＧ発現のために以前に設計されているベクター（Ｌｅｅら、２００４ａ）にクローニングした。Ｆａｂタンパク質を、記載（Ｐｒｅｓｔａら、１９９７）に従って、形質転換３４Ｂ８大腸菌細胞を完全Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．培地中、３０℃で２６時間増殖することによって生成した。ｈＩｇＧｓを、２９３細胞の一過性のトランスフェクションによって発現させ、それを、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いて精製した（Ｆｕｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１１１９７、１９９８）。１Ｌの大腸菌培養物を、プロテインＧ親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。カラムを、ＰＢＳを用いて洗浄し、Ｆａｂタンパク質を、１００ｍＭ酢酸を用いて溶出し、ＰＢＳに対して透析した。４Ｌの大腸菌培養物を、以前の記載（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８）に従って、プロテインＡ親和性カラム上で精製し、それに続いて、カチオン交換クロマトグラフィーを行った。タンパク質濃度を、分光光学的に決定した。Ｆａｂの最終的な収率は典型的には、小規模な振とうフラスコによる増殖物から精製した場合、０．８〜１５ｍｇ／ｌであった。ＩｇＧ産物の収率は、小規模な培養の場合、６．７〜６０ｍｇ／ｌの中〜高の程度であった（図１７）。精製したタンパク質を最初に、分子ふるいクロマトグラフィーおよび光散乱を使用して特徴付けて、これらのタンパク質が顕著なレベルのタンパク質凝集を示さない（＜５％）ことを保証した。
手短に述べると、発現させたＦａｂおよびｈＩｇＧを、ＥＬＩＳＡにより、それらのそれぞれの抗原（複数可）への結合についてスクリーニングした。１つの変異体を除きすべてが、それらの同族抗原（複数可）に結合することが見出された。クローン４−６は、ＦａｂおよびｈＩｇＧへ転換した場合、ｈＤＲ５への結合能を喪失した。より短い形態であるｈＶＥＧＦ１０９に対して産生させ、選択した抗ＶＥＧＦクローンを、ｈＶＥＧＦ１６５に対する結合性について、標準的なＥＬＩＳＡ（Ｈ３ ｈＩｇＧ、Ｈ４＿Ｎ ｈＩｇＧ、Ｈ４＿Ｄ ｈＩｇＧ）および競合ＥＬＩＳＡ（ｂＨ１ ｈＩｇＧ、３−１ ｈＩｇＧ、３−６ ｈＩｇＧ、３−７ ｈＩｇＧ）を使用して試験した。Ｇ６ ｈＩｇＧ（Ｆｕｈら、２００６）を、陽性コントロールとして使用した（図１８Ａおよび１８Ｂ）。予想したように、すべてのクローンがｈＶＥＧＦ１６５に結合した。
タンパク質凝集の程度を研究するために、選択したクローンを、精製したＦａｂおよびＩｇＧとして、分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）により解析し、それに続いて、光散乱（ＬＳ）解析を行った。これらの試料を、ＰＢＳ中で、０．５ｍｇ／ｍｌ（ｈＩｇＧ）および１ｍｇ／ｍｌ（Ｆａｂ）の濃度でアッセイした。最大５％の凝集が、これらの指定した濃度で、すべての試料について観察され（図１７）、この値は、本発明者らが、その他のファージ表出由来抗体について以前に観察したことがある値の範囲に属する。クローン３−６および３−７は、予想した時点では出現せず、このことから、これらの再フォーマットしたＩｇＧおよびＦａｂは、凝集および／または樹脂との非特異的な相互作用を示すことが示唆された（データ示さず）。これらのクローンは、その後の解析を行うクローンのセットから外した。
本発明者らは、交差反応性および非特異的結合を排除するために、標準的なＥＬＩＳＡアッセイにおいて、全細胞溶解物、同族抗原および相同体を含めた、１パネルの固定化タンパク質標的に対する、高い濃度（１００ｎＭ）の選択したｈＩｇＧの結合性を研究した。本発明者らは、抗原に加えて、ｈＶＥＧＦのマウス変異形も固定化して、抗ｈＶＥＧＦクローンの異種間の反応性を試験した。具体的には、この１パネルのタンパク質を、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上に固定化し、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡを用いて１時間遮断した。ｈＩｇＧ（またはＦａｂ）を、ＰＢＳＴ中で１００ｎＭまたは５００ｎＭの濃度に希釈し、コートしたプレートに移した。１時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート化プロテインＡと共にインキュベートした。結合シグナルを、ＴＭＢ基質の添加によりおよそ５分間発色させ、１Ｍ Ｈ３ＰＯ４を用いて消光し、Ａ４５０における分光光度を読んだ。試験したｈＩｇＧは、それらの抗原（複数可）に特異的に結合した。クローンｂＨ１およびクローン３−１は、マウスＶＥＧＦ（ｍＶＥＧＦ）に対して交差反応性を示した（図１９）。
二重特異性抗体であるｂＨ１、Ｈ３（抗ｈＶＥＧＦ／Ｈｅｒ２）、およびＤ１（抗ｈＤＲ５／Ｈｅｒ２）が、それらの同族抗原に同時に結合することができるかどうか、またはこれらの抗原が、抗体の結合について競合するかどうかを試験するために、ｈＶＥＧＦおよびｈＤＲ５を、２μｇ／ｍｌの濃度で固定化した。一定の濃度のｈＩｇＧを、段階希釈したＨｅｒ２−ＥＣＤと共にインキュベートし、それに続いて、これらの固定化抗原上のｈＩｇＧの捕捉を行った。いずれの場合も、Ｈｅｒ２−ＥＣＤに対する結合が、その他の抗原に対する結合と競合することが見出された（図２０）。
本発明者らは、ＩｇＧおよびＦａｂ（すなわち、ライブラリーから単離した抗ｈＶＥＧＦ Ｆａｂおよび抗ｈＶＥＧＦ／Ｈｅｒ２ Ｆａｂ、ならびにＩｇＧ）の親和性を正確に決定するため、さらに、結合プロファイルをリアルタイムで研究するために、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）装置上での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用し、研究する分析対象に応じて４０〜３００の応答単位（ＲＵ）でｈＶＥＧＦ、ｍＶＥＧＦ、ＤＲ５およびＨｅｒ２−ＥＣＤを固定化したＣＭ５センサーチップを用いた。固定化は記載（Ｃｈｅｎら、１９９９）に従って実施した。二価のＩｇＧ分析対象のアビディティー作用を最小限に留めるために、これらの場合には、センサーチップ上のより低い密度のリガンドを標的とした。（競合ＥＬＩＳＡ実験に基づいて）推定されたＫＤのおよそ１０倍未満から１０倍超までの濃度の範囲に及ぶ漸増濃度の試料を、２２〜３０μｌ／分で注入し、結合応答を、参照フローセルからのＲＵを減じることによって補正した。さらに、これらの応答を、二重参照して、装置のドリフトについて、サンプルバッファー（０．０５％ツイーン２０を有するＰＢＳ）を注入した、リガンドをコンジュゲートさせたフローセルからのＲＵを減じることによっても正規化した。Ｆａｂの動態解析のために、１：１のラングミュア結合モデルを使用して、ｋｏｎおよびｋｏｆｆを計算した。（高い分析対象濃度においては）必要に応じて、物質移動限界がある１：１のラングミュア結合モデルを適用した。ＩｇＧ分析対象の場合、物質移動限界があるまたはない二価の分析対象の結合モデルを使用した（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ３．２）。Ｈ３ ｈＩｇＧ、Ｈ４＿Ｎ Ｆａｂ、およびＨ４＿Ｄ ｈＩｇＧの場合、動態結合モデルへの応答の適合は、満足なものではなかった。したがって、平衡応答を分析対象濃度に対してプロットする定常状態の結合解析を適用した。ＫＤを、ＥＣ５０として推定した。ＢＩＡｃｏｒｅ結合解析の概要を、図２１に見出すことができる。ｈＶＥＧＦ結合性抗体の３−１、３−６および３−７の親和性が、ナノモルの範囲にあることが見出された。解析した二重特異性抗体（ｂＨ１、Ｈ３、Ｈ４＿Ｎ、Ｈ４＿Ｄ）は、ｈＶＥＧＦに対して、低マイクロモルからマイクロモルの親和性を示した。対照的に、Ｈｅｒ２に対する親和性は、８〜５９ｎＭの範囲に及んだ（Ｆａｂ）。
抗ｈＶＥＧＦ結合体であるｂＨ１、Ｈ３およびＨ４＿Ｎの軽鎖が、関連の重鎖の配列に依存せずに、ｈＶＥＧＦに結合することができるかどうかを決定するために、軽鎖可変ドメインを２Ｃ４ Ｆａｂ発現ベクターｐＪＢ０５２４にクローニングし、したがって、２Ｃ４軽鎖可変ドメインを置換することによって、軽鎖可変ドメインを抗Ｈｅｒ２ ２Ｃ４ Ｆａｂ上にグラフトした。これらのＦａｂを、先の記載に従って発現させた。ｂＨ１／２Ｃ４キメラＦａｂおよびＨ３／２Ｃ４キメラＦａｂは、検出可能なレベルでは発現しなかった。Ｈ４＿Ｎ／２Ｃ４キメラＦａｂタンパク質を、単離し、ｈＶＥＧＦ（ｂＨ１の元々の特異性）およびＨｅｒ２（ｂＨ１、２Ｃ４の元々の特異性）に対する結合性について試験した。ｈＶＥＧＦおよびＨｅｒ２に対する結合性は、標準的なＥＬＩＳＡ結合アッセイによっては検出されなかった（図２２）。これらの結果から、ｂＨ１の重鎖は、抗原結合性に必要であることが示唆される。
抗ｈＶＥＧＦエピトープの比較
ｈＶＥＧＦ上の、抗ｈＶＥＧＦ抗体のエピトープを大まかに位置付ける試みとして、本発明者らは、これらの新たに単離した抗ＶＥＧＦ抗体が、その他のｈＶＥＧＦ結合性抗体および既知の結合部位を有するＶＥＧＦレセプターと競合する能力を研究した（Ｆｕｈら、２００６；Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８；Ｗｉｅｓｍａｎｎら、１９９７）。これらのアッセイは、競合ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて行い、この場合、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ）ドメイン１〜３、および抗ｈＶＥＧＦである抗体Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ＩｇＧ）、Ｂ２０−４．１（ＩｇＧ）、Ｇ６（Ｆａｂ）、およびＫＤＲドメイン１〜７のＦｃ融合タンパク質を、Ｍａｘｉｓｏｒｐイムノプレート上に、２μｇ／ｍｌで固定化した。この溶液競合結合アッセイは、段階希釈した精製ＩｇＧタンパク質を用いて平衡化したビオチン化ＶＥＧＦを使用し、未結合のビオチン−ＶＥＧＦを、Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート上にコートした固定化されているＦａｂまたはＩｇＧを用いて捕捉し、ストレプトアビジンコンジュゲート化ＨＲＰを用いて検出した（Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０：１０７３、２００４）。ｈＶＥＧＦが、その他のｈＶＥＧＦ結合性抗体またはｈＶＥＧＦレセプターに結合するのを遮断する抗体は、重複するエピトープを共有する可能性が高い。高濃度（μＭ）の二重特異性ｈＶＥＧＦ／Ｈｅｒ２結合性抗体であるｂＨ１によって、ｈＶＥＧＦの、そのレセプターであるＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２に対する結合を完全に遮断することができ、このことから、ｂＨ１のエピトープは、ＶＥＧＦＲ１（図２３）およびＶＥＧＦＲ２（図２３）と十分に重複することが示唆される。さらに、ｂＨ１は、ｈＶＥＧＦのＢ２０−４．１に対する結合も遮断する（図２４）。また、Ｈ３、Ｈ４＿ＮおよびＨ４＿Ｄも、両方のレセプターに対するｈＶＥＧＦの結合を遮断し、このことは、ｂＨ１と類似するエピトープがあることを指している（図２３）。不完全な遮断プロファイルは、ｈＶＥＧＦに対するそれらの親和性が比較的低いことの結果である可能性が高い（図２１）。対照的に、３−１は、ｈＶＥＧＦがＶＥＧＦＲ１に結合するのを最も高い濃度（０．５μＭ）においてさえ遮断しない（図２３）。さらに、本発明者らは、３−１ ｈＩｇＧがＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）抗体を遮断するのを検出することができなかった（図２５）。しかし、３−１ ｈＩｇＧは、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）（図２３）およびＢ２０−４．１（図２４）に対するｈＶＥＧＦの結合を遮断する。これらの結果から、３−１は、その他の抗体と比較して、特有のエピトープを有することが示されている。
実施例４．ｂＨ１、抗ｈＶＥＧＦ／Ｈｅｒ２二重特異性抗体の構造−機能研究
ｂＨ１とその２つの抗原、ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２との相互作用の性質を解明するために、構造的および機能的研究を行った。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体とｂＨ１とは、ＣＤＲ−Ｌ１（Ｖ２９ＮＴＡ３２対Ｉ２９ＰＲＳＩＳＧＹ３２、配列番号３５および３６）ならびにＣＤＲ−Ｌ２（Ｓ５０ＡＳＦ５３対Ｗ５０ＧＳＹ５３、配列番号３７および３８）が異なる。ｂＨ１抗ＶＥＧＦ／Ｈｅｒ２を、ＶＥＧＦおよびＨｅｒ２に対するその二重特異性性質およびその比較的高い親和性に基づく構造的特徴付けの代表的として選択した。ＶＥＧＦおよびＨｅｒ２上の機能的および構造的エピトープを研究するために、ＶＥＧＦ１０９と複合体形成したｂＨ１ ＦａｂおよびｈＨｅｒ２の細胞外ドメインを結晶化し、２つの複合体の構造をＸ線結晶構造解析によって解析した。さらに、記載のようにコンビナトリアルファージ表出ライブラリーを用いたアラニンおよびホモログのショットガンスキャニング分析を行った（Ｖａｊｄｏｓら、２００２）。
ｂＨ１ Ｆａｂの発現、精製、結晶化およびデータ収集
以前に記載のように、残基８〜１０９からなるヒトＶＥＧＦのレセプター結合部分を発現させ、再折畳みを行い、精製した（Ｃｈｒｉｓｔｉｎｇｅｒら、１９９６）。以前に記載のようにＨｅｒ２の細胞外ドメインの残基１〜６２４を発現させ、精製した（Ｆｒａｎｋｌｉｎら、２００４、ＨｕｄｚｉａｋおよびＵｌｌｒｉｃｈ、１９９１）。
大スケールのｂＨ１ Ｆａｂの調製には、全細胞ペレットを１０リットルの大腸菌発酵から得た。２２０グラムの細胞ペーストを１ＬのＰＢＳ、２５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ中で解凍した。混合物をホモジナイズし、その後、マイクロ流動化装置に２回通した。その後、懸濁液を２５０ｍｌのアリコートで９０分間、１２ｋで遠心分離した。その後、タンパク質をＰＢＳで平衡化したプロテインＧカラム（２５ｍｌ）上に５ｍｌ／分間で載せた。カラムを平衡化バッファーで洗浄し、その後、０．５８％の酢酸で溶出させた。画分をＳＤＳ ＰＡＧＥによってアッセイした（データ示さず）。ｂＨ１ Ｆａｂを含有する画分をプールし、その後、２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．５で平衡化した５０ｍｌの陽イオン交換ＳＰセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に載せた。Ｆａｂを平衡化バッファー中の塩化ナトリウムの勾配で溶出させた。勾配は０．５ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．５まで直線的であった。Ｆａｂを含有する画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定し（データ示さず）、プールした。ｂＨ１ Ｆａｂは約０．５ＭのＮａＣｌ濃度で溶出させた。Ｆａｂ濃度はＡ２８０を測定することによって決定した。ｂＨ１ Ｆａｂの最終収率は、１ｌの発酵槽増殖物あたり６７ｍｇであった。
複合体は、精製したｂＨ１ ＦａｂおよびＶＥＧＦまたはＨｅｒ２ ＥＣＤを２：１のモル比で混合し、ＶＥＧＦ−Ｆａｂ複合体には２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および０．３Ｍの塩化ナトリウム、Ｈｅｒ２ ＥＣＤ−Ｆａｂ複合体には２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８および０．１５Ｍの塩化ナトリウム中でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＰ−２００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって精製することによって得た。生じた複合体の組成はＳＤＳ ＰＡＧＥによって検証した（データ示さず）。タンパク質複合体を濃縮し、結晶化の試行で使用した。１９℃の蒸気拡散方法を用いた初期の懸滴実験の結果、ｂＨ１−ＶＥＧＦ複合体の場合では１週間以内に１４通りの異なる条件から小さな同形結晶が生じた。ｂＨ１−Ｈｅｒ２複合体の結晶は４つの条件で１週間以内に出現した。それぞれの場合について、１つの条件からの結晶をさらなる最適化のために選択した。
ｂＨ１ Ｆａｂ−ＶＥＧＦ（８〜１０９）の結晶化には、等体積のタンパク質複合体溶液（１０．６ｍｇ／ｍｌのタンパク質、３００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）および０．１５ＭのＤ，Ｌリンゴ酸、ｐＨ７．０、２０％のＰＥＧ３３５０を含有する結晶化バッファーを１９℃で混合し、平衡化した。２４時間後に、ａ＝１００．６、ｂ＝１９８．０、ｃ＝７７．７のセル寸法を有する空間群Ｃ２２２１に属する大きな結晶が出現した。結晶形は不斉ユニット中に１個のＦａｂおよび１個のＶＥＧＦ単量体を含有していた。人工母液中に５％、１０％、および１５％のグリセロールを含有する液滴間を移送させ、続いて液体窒素中でフラッシュ凍結することによって、データ収集前に結晶を凍結保護した。データはＡｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）のビームライン５．０．１で２．６Åまで収集した。
ｂＨ１ Ｆａｂ−Ｈｅｒ２（１〜６２４）の結晶は、タンパク質溶液（１１ｍｇ／ｍｌ、２５ｍＭのトリス、ｐＨ８および１５０ｍＭの塩化ナトリウム）を、２５％ｗ／ｖのＰＥＧ２０００、０．１ＭのＭＥＳ、ｐＨ６．５を含有する結晶化バッファーと混合することによって得た。１２時間後に、ａ＝６２．３、ｂ＝１１５．１、ｃ＝２０８．２のセル寸法を有する空間群Ｐ２１２１２１に属する結晶が出現した。不斉ユニット中に１個のＨｅｒ２−Ｆａｂ複合体が含有されていた。データ収集の前に、２０％のエチレングリコールを凍結保護剤として用いて結晶を液体窒素中でフラッシュ凍結した。データはＡｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）のビームライン５．０．１で２．９Åまで収集した。
データ処理、構造決定、および洗練
データはＤｅｎｚｏおよびＳｃａｌｅｐａｃｋを用いて処理した（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ、１９９７）。ｂＨ１ Ｆａｂ複合体の構造はＰｈａｓｅｒによって解析した（Ｌ．Ｃ．Ｓｔｏｒｏｎｉ、２００４、Ｒｅａｄ、２００１）。ｂＨ１−Ｆａｂ−ＶＥＧＦ（８〜１０９）複合体は、以前に記載されているＶＥＧＦ−Ｆａｂ複合体（２ＦＪＧ）からのＶＥＧＦおよびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体Ｆａｂ−Ｈｅｒ２複合体（１Ｎ８Ｚ）の可変ドメインＶＬ／ＶＨまたは定常ドメインＣＨ１／ＣＬのいずれかを含有するＦａｂ断片の座標を用いて解析した。Ｈｅｒ２の断片およびＨｅｒ２−Ｆａｂ複合体１Ｎ８ＺからのＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体Ｆａｂの可変ドメインを、ｂＨ１−Ｈｅｒ２構造を解析する際の検索モデルとして使用した。ｂＨ１ Ｆａｂの定常ドメインは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体Ｆａｂ定常部分を検索モデルとして使用した場合に見つけることができず（１Ｎ８Ｚ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体Ｆａｂ−Ｈｅｒ２複合体構造によって導いて手動でドッキングしなければならなかった。モデルの構築および洗練は、それぞれプログラムＲｅｆｍａｃ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ、１９９４）およびＣｏｏｔ（ＥｍｓｌｅｙおよびＣｏｗｔａｎ、２００４）を用いて行った。立体化学的なパラメータはＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙを用いて分析した（Ｌｏｖｅｌｌら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、５０：４３７（２００３））。構造は、Ｆａｂ−ＶＥＧＦ−複合体にはＲｖａｌｕｅ＝０．２２およびＲｆｒｅｅ＝０．２７まで、Ｆａｂ−Ｈｅｒ２−複合体にはＲｖａｌｕｅ＝０．２５およびＲｆｒｅｅ＝０．３１まで洗練させた。ＶＥＧＦおよびＨｅｒ２−ＥＣＤとの複合体中のｂＨ１ Ｆａｂの結晶構造をモデリングした。一部のｂＨ１ Ｆａｂ残基は抗原の４．５、４．０、および３．５Å以内にあった。同じ抗体上の２つの抗原の２つのパラトープ（抗原との接触を行う抗体上の領域）は顕著に重複し、軽鎖および重鎖の両方からの残基が、両方の抗原との結合に関与している。ｂＨ１は、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）抗体と同様のＶＥＧＦ上のエピトープと結合し、また、ｂＨ１は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体と本質的に同一のエピトープ上のＨｅｒ２と結合する。
ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（残基１〜６２４）およびＶＥＧＦレセプター結合ドメイン（残基８〜１０９）と結合したｂＨ１ Ｆａｂの結晶構造を、それぞれ２．９Åおよび２．６Åの分解能で決定した（図２６および表３）。図２６は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体／ＨＥＲ２複合体と重ね合わせたｂＨ１ Ｆａｂ／ＨＥＲ２の結晶構造、およびｂＨ１ Ｆａｂ／ＶＥＧＦ複合体の結晶構造を示す。
ｂＨ１／ＨＥＲ２複合体では、ＦａｂはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体と同様の様式でＨＥＲ２のドメインＩＶと結合する（Ｃｈｏら、Ｎａｔｕｒｅ、４２１：７５６、２００３）。２つの複合体は２．３ÅのＣα位置の標準偏差（ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．）と重なる。ＶＥＧＦ複合体中では、ｂＨ１は、ＶＥＧＦレセプターＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２ならびに他のＶＥＧＦ抗体の結合部位と重複するエピトープを認識する（Ｗｉｅｓｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ、９１：６９５、１９９７、Ｍｕｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：７１９２、１９９７）。一貫して、ＶＥＧＦとそのレセプターとの結合のｂＨ１遮断が観察された（図２７）。図２７に示すデータでは、ビオチン標識したヒトＶＥＧＦ１６５を漸増濃度のＩｇＧ（ｘ軸）で平衡化した。結合していないｈＶＥＧＦ１６５を固定化したＶＥＧＦＲ２−ＥＣＤ Ｆｃ融合体上に捕捉し、分光光度によって検出した（４５０ｎｍの光学密度、ｙ軸）。
図２８に示すように、ｂＨ１上のＶＥＧＦおよびＨＥＲ２の結合部位は広範に重複する。ＨＥＲ２と結合する１４個の残基のうちの１２個はＶＥＧＦとも接触する。どちらの結合部位にもＨＣおよびＬＣからのＣＤＲ残基が含まれる。ＨＥＲ２複合体中では、ＬＣおよびＨＣ ＣＤＲは、ほぼ等しい抗原接触面積に貢献する（それぞれ５３％および４７％）一方で、ＶＥＧＦ複合体中では、ＬＣ ＣＤＲは埋没した表面のほぼ７０％を構成する（図２９）。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体およびｂＨ１上のＨＥＲ２結合部位は類似しており、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体配列がｂＨ１中で保存されていないＣＤＲ−Ｌ１および−Ｌ２領域中のみが異なる（図２８）。図２８では、ｂＨ１またはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体のＦａｂ表面上の残基は、ＶＥＧＦまたはＨＥＲ２によって埋没された程度に従って陰影をつけた（濃い色および白文字、＞７５％埋没した、中間の色および白文字、５０〜７５％埋没した、薄い色および黒文字、２５〜４９％埋没した）。下線を引いた残基はｂＨ１およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体の間で異なる。白い点線は軽鎖および重鎖の境界線を示す。
Figure 0005796831
ＨＥＲ２との複合体中のｂＨ１ Ｆａｂのコンホメーションは、ＶＥＧＦと結合したＦａｂ（標準偏差＝０．７Å、Ｃα）のそれと顕著に類似している。両方のｂＨ１ Ｆａｂ構造のＣＤＲは互いに良好に重なり合い、親Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体ＦｖおよびｂＨ１ Ｆｖ（ＨＥＲ２）は標準偏差＝０．６Åであり、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体ＦｖおよびｂＨ１ Ｆｖ（ＶＥＧＦ）は標準偏差＝１．２Åである。ＣＤＲ−Ｌ１は例外であり、２つの複合体の構造が顕著に異なり、偏差は４．６Åである（残基２７〜３２のＣα）。図３０は、ＣＤＲ−Ｌ１を例外として、ＶＥＧＦと結合したｂＨ１ ＦａｂのＣＤＲコンホメーションが、ＨＥＲ２と結合したｂＨ１およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体と顕著に類似していることを示す。図３０は、ＶＥＧＦと結合したｂＨ１（濃い色）、ＨＥＲ２と結合したｂＨ１（白）およびＨＥＲ２と結合したＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体（薄い色）のチューブとしてのＣＤＲループの重ね合わせである。ＣＤＲ−Ｌ１ループは、２つのｂＨ１構造において顕著に異なるコンホメーションを示す（ｂＨ１残基２７〜３２の標準偏差Ｃα＝４．６）（図３１）。ＨＥＲ２複合体中では、ＣＤＲ−Ｌ１は抗原相互作用に最小限しか関与しておらず、ループの一部（残基２８〜３０ｂ）は柔軟に見える。ＶＥＧＦ結合には、ループ全体が良好に構成されており、ＶＥＧＦによって埋没された表面積の２６％に貢献する。
ＣＤＲ−Ｌ１中の２個の残基、Ｉｌｅ３０ｃおよびＴｙｒ３２は異なるコンホメーションを有し、ｂＨ１とＨＥＲ２またはＶＥＧＦとの結合において異なる役割を果たす。ＨＥＲ２複合体中では、Ｉｌｅ３０ｃの側鎖は、ＣＤＲ−Ｌ１およびＣＤＲ−Ｌ３残基によって形成される疎水性コア中に埋没している。ＶＥＧＦ複合体中では、この側鎖はＶＥＧＦと疎水性接触を形成する。Ｔｙｒ３２のＣαは２つの構造中で同じ位置にあるが、その側鎖は約１３０度回転している。ＨＥＲ２複合体中では、Ｔｙｒ３２はレセプターに対してパッキングしているが、ＶＥＧＦ複合体中では、側鎖はＩｌｅ２９と一緒になって疎水性コアを形成し、ＣＤＲ−Ｌ１およびＣＤＲ−Ｌ３のコンホメーションを支持する。ＣＤＲ−Ｌ１コンホメーションは、Ｔｙｒ３２とＬＣフレームワーク残基Ｇｌｙ７２との間の水素結合によってさらに安定化される。構造解析により、アラニンまたはフェニルアラニンのどちらへの突然変異も許容されないため、Ｔｙｒ３２がＶＥＧＦ結合に重要であることが確認される。ＶＥＧＦ結合とは反対に、Ｔｙｒ３２からアラニンへの突然変異（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体の残基に戻る）はＨＥＲ２結合に好ましい。２つの複合体の重ね合わせにより、ＶＥＧＦは、そのＨＥＲ２と結合した状態のＣＤＲ−Ｌ１のＴｙｒ３２と衝突することが明らかとなる（図３１）。図３１では、残基Ｔｙｒ３２、Ｉｌｅ３０ｃ、Ｉｌｅ２９、およびＧｌｙ７２の側鎖を棒として示す。平均よりも高い温度要因を有する残基を濃い色で示す（残基２８〜３０ｂ）。Ｔｙｒ３２とＧｌｙ７２との間の水素結合を点線によって例示する。
上記結果は、ＣＤＲ−Ｌ１を再編成する能力がｂＨ１の二重特異性に必要であることを示している。ＣＤＲ−Ｌ１の同様のコンホメーション柔軟性が、天然抗体の抗原認識において役割を果たすことが示されている（Ｊｉｍｅｎｅｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００：９２、２００３、Ｍｙｌｖａｇａｎａｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８１：３０１、１９９８）。図２６、２８、３０、３１、および３２は、ＰＹＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ Ｓｃｉｅｎｔｆｉｃ、Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）を用いて結晶構造の座標から作成した（ＰＤＢコード、３ＢＤＹ、３ＢＥ１、１Ｎ８Ｚ）。
ｂＨ１ショットガンスキャニング
ｂＨ１Ｆａｂの抗原結合部位を研究するために、ファージ表出Ｆａｂライブラリーを用いたショットガンスキャニングコンビナトリアル突然変異誘発を行った（Ｖａｊｄｏｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２０：４１５、２００２、Ｗｅｉｓｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：８９５０、２０００）。機能的クローンを単離するために抗原（ｈＶＥＧＦおよびＨｅｒ２−ＥＣＤ）に対する結合選別、続いてＤＮＡ配列決定を行うことで、それぞれの変化させた位置での野生型／突然変異体の比の計算が可能となった（Ｖａｊｄｏｓら、２００２）。その後、これらの比を使用して、ＶＥＧＦおよびＨｅｒ２の結合に対するそれぞれのスキャニングした側鎖の貢献を決定する。結果により、ＶＥＧＦおよびＨｅｒ２を結合することに関する機能的パラトープのマッピングが可能となった。
ｂＨ１ショットガンライブラリーの設計
ＣＤＲ中の溶媒に曝露された残基を、野生型残基をアラニンもしくは野生型（アラニンスキャニング）またはホモログ残基もしくは野生型（ホモログスキャニング）のどちらかとして変動させたファージ表出ライブラリーを用いてスキャニングした。遺伝暗号の性質により、Ｗｔ／アラニンまたはＷｔ／ホムログ（Ｈｏｍｌｏｇ）残基に加えて何らかの他の置換をライブラリー中に含めることが必要であった（図３３）。別々の重鎖および軽鎖のアラニンおよびホモログスキャニングライブラリーを構築した。ライブラリーは図３４に記載する。縮重は１．３×１０５〜１．３×１０８個の範囲であり、実際のライブラリーの大きさは６×１０９〜４×１０１０個であった。
ショットガンスキャニングライブラリーの構築
上述のように、Ｍ１３バクテリオファージの表面上にｂＨ１ Ｆａｂの表出を可能にするため、Ｍ１３遺伝子−３マイナーコートタンパク質のＣ末端ドメインと融合させたファージ上でｈｕ４Ｄ５Ｆａｂを表出するように設計された以前に記載したプラスミドＡＰ２００９を、標準の分子生物学技法を用いて、ｂＨ１Ｆａｂをコードするように改変した。軽鎖のＣ末端はエピトープ（ｇＤ）タグを含有していた。ｂＨ１ Ｆａｂの「ストップ鋳型」バージョンをライブラリーの鋳型として使用した（Ｓｉｄｈｕら、２００４）。軽鎖のアラニンおよびホモログスキャニングライブラリーはＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３中にストップコドンを有しており、重鎖のアラニンおよびホモログライブラリーはそれぞれの重鎖ＣＤＲ中にストップコドンを含有していた。ライブラリーは、以前に記載されている方法によって（Ｓｉｄｈｕら、２００４）、対応するストップ鋳型にＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発を用いて（Ｋｕｎｋｅｌら、１９８７）、構築した。
ライブラリーの選別
ＮＵＮＣの９６ウエルＭａｘｉｓｏｒｐ免疫プレートを５μｇ／ｍｌの捕捉標的（ｈＶＥＧＦ１０９、Ｈｅｒ２−ＥＣＤまたは抗ｇＤ ｍＩｇＧ）でコートし、ＰＢＳ中の１％のＢＳＡ（ｗ／ｖ）で遮断した。記載のように上述のライブラリーからのファージをＫＯ７ヘルパーファージ（ＮＥＢ）と共に繁殖させた（Ｌｅｅら、２００４ａ）。ライブラリーファージ溶液をコートしたプレートに１０１３個のファージ粒子／ｍｌの濃度で加え、１〜２時間室温でインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで８回洗浄し、続いて、結合したファージを０．１ＭのＨＣｌで３０分間溶出させた。各回の選別後の濃縮は既に記載のように決定した。２回の標的選別後、５〜１０倍の濃縮を示したｈＶＥＧＦ上で分類したＬＣ−ＡｌａおよびＬＣ−Ｈｏｍ以外のすべてのライブラリーで、５０〜１０００倍の濃縮が観察された。５０〜１０００倍の濃縮を示すそれぞれのライブラリーからのいくつかのランダムクローンを、記載のように配列決定のために選別した（Ｓｉｄｈｕら、２００４）。ライブラリーＬＣ−ＡｌａをファージＥＬＩＳＡにおいてｈＶＥＧＦ結合についてスクリーニングした（Ｓｉｄｈｕら、２０００）。ＢＳＡでコートしたコントロールプレート上のシグナルよりも少なくとも２倍高いｈＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡシグナルを示したクローンを、配列決定のために選別した。ＬＣ−Ｈｏｍライブラリーは、ｈＶＥＧＦ上でのさらに１回の選別、続いてファージＥＬＩＳＡスクリーニングおよびＶＥＧＦ結合クローンの配列決定に供した。
ＤＮＡの配列解析
様々な標的選別からのそれぞれのライブラリーからの高品質配列を翻訳およびアラインメントした（データ示さず）。分析に供したそれぞれのライブラリーからの配列の数を以下の表４に要約する。
Figure 0005796831
変化させた位置でのＷｔ／Ｍｕｔ比を計算することで（図３５および図３６）、記載したＦｗｔ／ｍｕｔ値の計算が可能となり（図３５および図３６）、これらは、記載のように標的選別からの比を表出選別からの比で除算することによって、表出について補正されている（Ｖａｊｄｏｓら、２００２）。１より高いＦｗｔ／ｍｕｔ値は、Ｗｔがこの位置で好ましいことを示し、１より低いＦｗｔ／ｍｕｔは、突然変異が好ましいことを示す。Ｆｗｔ／ｍｕｔ＞５は、抗原結合におけるその重要な役割を示している。それぞれのスキャニングしたＣＤＲ残基の重要性を図３７Ａ〜３７Ｄに例示する。結果により、重鎖および軽鎖のどちらからの残基も、どちらの抗原（Ｈｅｒ２およびｈＶＥＧＦ）の結合にエネルギー的に貢献することを実証している。Ｈｅｒ２結合に対するｂＨ１軽鎖および重鎖残基の影響を、その親抗体ｈｕ４Ｄ５と比較した（ＫｅｌｌｅｙおよびＯ’Ｃｏｎｎｅｌｌ、１９９３）（図３８）。
図３９Ａおよび図３９Ｂは、ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２との結合における、ｂＨ１ Ｆａｂのショットガンアラニンおよびホモログスキャニングを示す。アラニンの突然変異（ｍ１）、もしくはさらなる突然変異（ｍ２、ｍ３、ショットガン−アラニンコドンの制限による）、または相同的アミノ酸への突然変異（ｍ４）の効果を、ヒトＶＥＧＦ（図３９Ａ）またはＨＥＲ２（図３９Ｂ）と結合するクローンの中での野生型および突然変異体の発生率の比（ｗｔ／ｍｕｔ）として計算する。野生型残基のみが出現した場合は、比は野生型計数よりも大きい「＞」として示す。アミノ酸置換（ｍ１〜ｍ４）が何であるかは、Ｆ値の上付き文字として示す。野生型残基がアラニンである場合は、これをグリシンによって置換した（ｍ１）。「＊」は、ＶＥＧＦまたはＨＥＲ２複合体の形成の際に埋没されるｂＨ１残基の程度を示す（＊２５〜４９％の接近可能な面積が埋没している、＊＊５０〜７５％の接近可能な面積が埋没している、＊＊＊７５％以上の接近可能な面積が埋没している）。
エネルギー的相互作用に顕著に貢献する残基が機能的パラトープを構成し、これは構造的結合部位の部分組を構成する。抗原接触部位間の広範な重複とは対照的に、２つの機能的パラトープは限定的な重複を示す（図３２および４０）。具体的には、ショットガンスキャニング突然変異誘発に基づいて、ＶＥＧＦ（図４０Ａ）またはＨＥＲ２（図４０Ｂ）結合について、ΔΔＧ値（ｙ軸、ｋｃａｌ／ｍｏｌ）をそれぞれのアラニン（黒バー）または相同的アミノ酸（白バー）への突然変異についてプロットする。「†」は、この位置では突然変異が観察されなかったため、下限を表す。「＊」は、ＶＥＧＦまたはＨＥＲ２複合体の形成の際に埋没されるｂＨ１残基表面積の程度を示す。（＊２５〜４９％が埋没した、＊＊５０〜７５％、＊＊＊＞７５％）。ＶＥＧＦ結合相互作用は、コアホットスポットとしてＣＤＲ−Ｌ１のＴｙｒ３２およびＣＤＲ−Ｌ３のＨｉｓ９１を有するＬＣ ＣＤＲによって主に媒介されている（ΔΔＧｗｔ／ａｌａ＞１．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。ＨＥＲ２結合は主にＨＣ ＣＤＲによって貢献されている。図３２は、ｂＨ１およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体の残基をその機能的重要性に基づいてＦａｂ表面上に陰影をつけた、結晶構造を示す（濃い色および白文字、ΔΔＧ≧１．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、中間の色および黒文字、１≦ΔΔＧ＜１．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、薄い色および黒文字、０．５≦ΔΔＧ＜１ｋｃａｌ／ｍｏｌのアラニン突然変異）。黒い点線は図２８と同様に接触面積の輪郭を示す。白い点線は軽鎖および重鎖の境界線を示す。
ＶＥＧＦ結合およびＨＥＲ２結合では、機能的パラトープ残基はＨＣおよびＬＣにわたって分布されており、２本の鎖の相乗作用を示している。ＣＤＲ−Ｈ３のＴｒｐ９５が２つの相互作用の唯一の共通のホットスポット残基である（ΔΔＧｗｔ／ａｌａ＞１．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。上述のように、ＶＥＧＦ結合相互作用は主にＬＣ ＣＤＲによって媒介される一方で、ＨＥＲ２結合はＨＣ ＣＤＲによって支配される。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体と比較して、より弱いＨＥＲ２結合親和性を有するｂＨ１（３００倍）はＨＥＲ２結合に対して同じコアホットスポット残基を維持し（Ａｒｇ５０、Ｔｒｐ９５、およびＴｙｒ１００ａ）、他方で、周辺残基の重要性は再分布されている（図３２）。前提的に、ｈｕ４Ｄ５／Ｈｅｒ２結合に貢献する重鎖中の重要な側鎖のほとんどは、ｂＨ１／Ｈｅｒ２結合にも重要である（ΔΔＧ＞１．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。一部の変化は存在する。軽鎖残基は貢献により多くのシャフリングを有し、一部の残基は重要性が減り、一部は重要性が増す。全体的に、機能的部位はｂＨ１−ＶＥＧＦおよびｂＨ１−Ｈｅｒ２複合体の結晶構造からの構造的界面の一部である。
手短に言うと、ｂＨ１と２つの構造的に非関連の大きなタンパク質との相互作用は、それぞれの抗原とエネルギー的に相互作用しているｂＨ１残基の明確な組の結合によって特徴付けられている。２つの異なる抗原の２つの広範に重複する結合部位のほとんどは単一のコンホメーションを示すが、１つのＣＤＲループ（Ｌ１）の柔軟性により、ＨＥＲ２およびＶＥＧＦの両方の収容が容易となる。この機構は、非関連の小ハプテンまたはペプチドと結合する多重特異的性抗体で観察される分子万能性によく似ている。以前の研究が、単一の抗体コンホメーションの空間的に明確に異なる領域での小リガンドの示差的な配置（Ｓｅｔｈｉら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２４：４２９、２００６）、または抗原結合部位の複数の既存のコンホメーション（Ｊａｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９９：１３６２、２００３）のどちらかによって媒介される、多重特異性を説明している。限定的ＬＣ突然変異によって２つの非関連のタンパク質抗原と結合する抗体を産生させる方法によって、抗原認識における抗体分子の万能性をさらに強調する。
ｂＨ１親和性成熟
構造的および機能的な結果が利用可能になる前に軽鎖配列の最適化によってｂＨ１のＶＥＧＦ結合親和性を増加させることができるかどうかを調査する試みとして、ｂＨ１ Ｆａｂに非常に似ていると予想されるｈ４Ｄ５４２ Ｆａｂの結晶構造に基づいて高度に溶媒接近可能な位置にあるＣＤＲ残基を多様化したライブラリーを構築した（Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔら、２００１）。標的残基を野生型または数個の相同的残基のいずれかとして変動させた（図３４）。ライブラリーは、「ショットガンスキャニングライブラリーの構築」のセクションで記載のように構築した。溶液に基づく選別方法を用いて、記載のようにより高い親和性ＶＥＧＦ結合体を選別した。２回の溶液に基づく選別を行った。ビオチン標識したＶＥＧＦの濃度を、１回目の５０ｎＭから２回目の２０ｎＭまで減少させることによって、各選別の回でストリンジェンシーを増加させた。最終回の選別で１３８個のクローンを配列決定した。ほとんどのクローンはユニークであることが判明した。固定化したＶＥＧＦ（８〜１０９）、抗ｇＤ抗体、およびＨｅｒ２−ＥＣＤを用いた高スループットＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＶＥＧＦ、Ｈｅｒ２−ＥＣＤ、および抗ｇＤ ｍＩｇＧと結合したがＢＳＡと結合しなかったクローンを同定した。ＶＥＧＦ−ＥＬＩＳＡ結合シグナルを抗ｇＤ ＥＬＩＳＡシグナルによって正規化して、ＶＥＧＦ結合クローンの相対的親和性を推定した。高いＶＥＧＦ／抗ｇＤ比を有するクローンを、さらなる特徴付けのために選別した。選別したクローンのＶＥＧＦおよびＨｅｒ２に対する親和性は、競合ＥＬＩＳＡによって以前に記載したファージ表出Ｆａｂとして推定した。ｂＨ１変異体は、親ｂＨ１クローンと比較して改善されたＶＥＧＦ結合親和性を示す。興味深いことに、Ｈｅｒ２の親和性に基づく選別を行わなかったにもかかわらず、一部のクローンはＨｅｒ２結合に対してわずかに改善されたＩＣ５０値を有する。Ｈｅｒ２結合に能力を顕著な影響を与えずに、ＶＥＧＦ結合についてｂＨ１クローンを親和性成熟させることが可能なことを示している。親ｂＨ１クローンと比較してＨｅｒ２結合親和性が低下した、ＶＥＧＦの親和性が改善されたクローンが一部存在する。この結果は、ｂＨ１−Ｈｅｒ２複合体構造およびショットガンアラニンスキャニング分析に基づいて重鎖が結合エネルギーへの主な貢献者であることにもかかわらず、軽鎖がｂＨ１とＨｅｒ２との結合能力に能動的に貢献することを示している。特徴付けたクローンの配列およびＩＣ５０値を図４１に要約する。ほとんどの配列がユニークであるという発見は、これらの変異体の軽鎖配列はＶＥＧＦ結合に対して未だ完全に最適化されておらず、さらなる回数の選別によってｂＨ１クローンの親和性をさらに改善させることが可能であることを示唆している。
表５に示すように、単一のＦａｂの２つの抗原に対する顕著な親和性改善が達成可能であり、一般的に適用可能である。例えば、ヒトＶＥＧＦのＫＤは２５０（ｂＨ１、ＩｇＧ）から４１（ｂＨ１−８１、ＩｇＧ）または１６ｎＭ（ｂＨ１−４４、ＩｇＧ）に増加し、ＨＥＲ２のＫＤは２１（ｂＨ１、ＩｇＧ）から７（ｂＨ１−８１、ＩｇＧ）または１ｎＭ（ｂＨ１−４４、ＩｇＧ）まで増加した。
親和性は、ｂＨ１のＨＣおよびＬＣ ＣＤＲ中に突然変異を導入することによって改善させた。位置は、本明細書中に記載のＶＥＧＦおよびＨＥＲ２の機能的パラトープに関する情報に基づいて選別した。ｂＨ１変異体は、２つのステップで、本明細書中に記載のファージ表出ライブラリーの選別およびスクリーイング（ｓｃｒｅｅｉｎｇ）によって単離した。改善されたクローンｂｈ１−８１は、記載した軽鎖ホモログショットガンスキャニングライブラリーの親和性に基づく選別によって単離した。第２のステップでは、ｂＨ１−８１の残基をランダム化することによって、最高の親和性のクローン（ｂＨ１−４４）をライブラリーから単離した。具体的には、ｂＨ１−８１のＨＣおよびＬＣ中の部位をランダム化されたオリゴヌクレオチドを設計して（表５）、それぞれの位置で約５０％の野生型および５０％のすべての他の１９種のアミノ酸をコードさせた（Ｇａｌｌｏｐら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｉｍｉｓｔｒｙ、３７：１２３３、１９９４）。
ｂＨ１親和性改善変異体のＫＤ（表５）を、Ｆａｂ断片およびＩｇＧ抗体について測定した。本明細書中に記載のように、Ｆａｂ断片およびＩｇＧ抗体をそれぞれ大腸菌および２９３細胞中で発現させ、精製した。Ｌｅｅら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３４０：１０７３、２００４）に記載のように、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の測定値を使用して、Ｆａｂ断片およびＩｇＧ抗体の結合親和性を決定した。一価Ｆａｂ断片としての抗体の親和性を研究するために、抗原（ｈＶＥＧＦ１０９、マウスＶＥＧＦ１０２、およびＨＥＲ２ ＥＣＤ）を低密度でＢＩＡｃｏｒｅ ＣＭ５チップ上において固定化した。Ｆａｂ断片の段階希釈液を固定化した抗原と接触させ、結合応答をＳＰＲによって測定した。１：１のラングミュア結合モデルを使用してｋｏｎ、ｋｏｆｆ、およびＫＤを計算した。ＩｇＧ抗体のＫＤを決定するために、固定化した抗Ｆｃ抗体によってＩｇＧをＢＩＡｃｏｒｅ ＣＭ５チップ上に捕捉し、ｈＶＥＧＦ１０９、マウスＶＥＧＦ１０２、およびＨＥＲ２−ＥＣＤの段階希釈液に曝露させた。ＨＥＲ２では、単純な１；１のラングミュア結合モデルを用いてＫＤを決定し、一方で、ＶＥＧＦは二価分析物モデルを要した。すべての実験は３０℃で行った。
表５には、ランダム化された位置を太字で示し、ｂＨ１、ｂＨ１−８１、およびｂＨ１−４４のＣＤＲ配列（配列番号１〜９および３９〜４１）ならびにその親和性（表面プラズモン共鳴によって決定）を要約する。
Figure 0005796831
ヒトＶＥＧＦ１０９、マウスＶＥＧＦ１０２、およびＨＥＲ２ ＥＣＤに対する抗体の一価親和性をＢＩＡｃｏｒｅによって測定した。表５は、それぞれの結合相互作用の代表的な解離定数（Ｋｄ）を示す。ｂＨ１変異体は溶液競合実験において完全長タンパク質（ＶＥＧＦ１６５）およびＶＥＧＦ１０９と同様の親和性で結合するため（データ示さず）、ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ１０９）のレセプター結合断片をＢＩＡｃｏｒｅ実験で使用した。様々なアッセイ様式および評価モデルを用いて本明細書中に記載のＦａｂ断片／ＩｇＧ抗体Ｋｄを計算した。様々なアッセイ／評価様式により、個々の相互作用について一貫した解離定数が得られた。
実施例５．細胞アッセイにおけるＩｇＧ活性の分析
ｂＨ１および３−１抗体がｈＶＥＧＦ１６５に誘導されるヒト臍静脈内皮（ＨＵＶＥＣ）細胞の増殖を阻害できるかどうかを決定するために、これらを増殖アッセイで試験した。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｅａｓｔ Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，ＮＪ）を成長させ、記載のようにアッセイした（Ｆｕｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３：１１１９７、１９９８）。約４０００個のＨＵＶＥＣを９６ウエル細胞培養プレートのそれぞれのウエル中にプレートし、１．０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清を添加したダルベッコ変法イーグル／Ｆ−１２培地（１：１）（アッセイ培地）中で１８時間インキュベートした。その後、準最大ＤＮＡ合成を刺激することができるＶＥＧＦのレベルとして最初に滴定した固定量のＶＥＧＦ（０．２ｎＭの最終濃度）を含む新鮮なアッセイ培地、および漸増濃度の抗ＶＥＧＦ抗体（例えばｂＨ１）を細胞に加えた。３７℃で１８時間インキュベートした後、細胞を０．５μＣｉ／ウエルの［３Ｈ］チミジンで２４時間パルスし、収集してＴｏｐＣｏｕｎｔマイクロプレートシンチレーションカウンターで計数した。結果は、３−１およびｂＨ１はどちらも、ｈＶＥＧＦに誘導されるシグナルおよび続く増殖を妨げることによって、ＶＥＧＦに誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の成長を阻害できることを実証している。Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）抗体（抗ＶＥＧＦ）を陽性コントロールとして使用し、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体を陰性コントロールとして使用した（図４２）。
二重特異性抗Ｈｅｒ２／ＶＥＧＦ抗体と哺乳動物細胞上で発現されるＨｅｒ２との結合を研究するために、ｂＨ１およびｂＨ３抗体とＨｅｒ２を過剰発現するＮＲ６線維芽細胞（ＮＲ６−Ｈｅｒ２）との結合をフローサイトメトリーによって研究した。１００万個のＮＲ６−Ｈｅｒ２細胞を１００μｇ／ｍｌのＦａｂおよびＩｇＧと共に１時間インキュベートし、続いて、Ａｌｅｘａ４８８とコンジュゲートさせたマウス抗ヒトＩｇＧ抗体と共に１時間インキュベートした。陰性コントロールとして、非発現ＮＲ６細胞と結合するＦａｂおよびＩｇＧを研究した。図４３に実証するように、ｂＨ１およびｂＨ３はＮＲ６細胞上のＨｅｒ２とＦａｂとしておよびＩｇＧとして特異的に結合する。
図４４は、ｂＨ１とＶＥＧＦまたはＨＥＲ２との競合的結合実験の結果を示す。ｂＨ１は、ＶＥＧＦに誘導されるヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖を２００ｎＭのＩＣ５０で阻害し、これは３００ｎＭというその親和性、および、その減少した親和性が原因でＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体よりも低い効率ではあるが、５日間のインキュベーション後のＨＥＲ２を発現する乳癌細胞系ＢＴ４７４の増殖と一貫している（図４５）。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）ＩｇＧ抗体およびベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）がコントロールとして役割を果たした。図４５に示すように、ｂＨ１−８１およびｂＨ１−４４抗体は、ＶＥＧＦに誘導されるＨＵＶＥＣ細胞の増殖およびＢＴ４７４細胞の成長をｂＨ１よりも高い程度で阻害する。ｂＨ１変異体の増加した力価は、その相対的な親和性と相関している。最も高い親和性の変異体ｂＨ１−４４は、それぞれベバシズマブまたはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体に同様の力価でＨＵＶＥＣおよびＢＴ４７４細胞の成長を阻害する。
これらの実験を実施するために、ＶＥＧＦで刺激したＨＵＶＥＣを漸増濃度のヒトＩｇＧで処置し、２日間のインキュベーション後の増殖阻害をＬｉａｎｇら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８１：９５１、２００６）に記載のように測定した。乳癌細胞ＢＴ４７４は１０％のＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地中で培養した。アッセイでは、９６ウエルプレート中に１個のウエルあたり１０４個の細胞をプレートし、終夜（１８時間）、３７℃でインキュベートした。漸増濃度のヒトＩｇＧを細胞に加えた。その後、細胞を３７℃で５日間インキュベートし、続いて１０％のＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を製造者の指示に従って加えた。ＨＥＲ２発現細胞の増殖の抗体依存性阻害は、６時間後の蛍光シグナルを測定することによって決定した。
実施例６．結合特異性の分析
ＬＣライブラリーに由来する抗体の結合特異性を決定した。ＩｇＧと同族抗原を含めた様々な固定化した精製したタンパク質または細胞溶解物との結合をＥＬＩＳＡによってアッセイした。抗原を固定化し、１５μｇ／ｍＬの濃度のｈＩｇＧと共に１時間インキュベートした。結合したＩｇＧを分光光度によって検出した（４５０ｎｍの光学密度、ｙ軸、図４６）。アッセイに含めたタンパク質は（図４６中の左から右）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ）、マウス血管内皮増殖因子（マウスＶＥＧＦ）、血管内皮増殖因子Ｃ、（ｈＶＥＧＦ−Ｃ）、血管内皮増殖因子Ｄ、（ｈＶＥＧＦ−Ｄ）、ＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＨＥＲ２ ＥＣＤ）、表皮増殖因子レセプター細胞外ドメイン（ｈＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３細胞外ドメイン（ＨＥＲ３ ＥＣＤ）、ヒトデスレセプター５（ｈＤＲ５）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ、５％の乳、マウス線維芽細胞溶解物、およびｈＶＥＧＦ−ＡまたはＨＥＲ２ ＥＣＤを入れたマウス線維芽細胞溶解物であった。図４６では、誤差バーは２つ組の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。抗体ｂＨ３、３−１、ｂＤ１、ｂＤ２、４−１、および４−５は、マウスＶＥＧＦ、ＨＥＲ３ ＥＣＤ、Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ、５％の乳、ｈＶＥＧＦ−Ａを入れた細胞溶解物、およびＨＥＲ２ ＥＣＤを入れた細胞溶解物との結合について試験しなかった。
様々な抗体（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）抗体、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体、ｂＨ１、ｂＨ３、ｂＨ４、ｂＨ１−８１、およびｂＨ１−４４）がＶＥＧＦとＶＥＧＦレセプターとの結合を遮断する能力も決定した（図４７）。ビオチン標識したヒトＶＥＧＦ１６５（図４７Ａ）またはマウスＶＥＧＦ１６４（図４７Ｂ）を漸増濃度のＩｇＧで平衡化した（ｘ軸）。結合していないＶＥＧＦを固定化したヒトＶＥＧＦＲ２−ＥＣＤ Ｆｃ融合タンパク質上に捕捉し、分光光度によって検出した（４５０ｎｍの光学密度、ｙ軸）。同様の阻害がＶＥＧＦＲ１でも観察された。抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦとＶＥＧＦレセプターとの結合を遮断する。
抗原ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２は、溶液中のｂＨ１−４４二重特異性ＩｇＧ抗体との結合を競合することが示されている（図４８）。０．１ｎＭの濃度のヒトｂＨ１−４４ ＩｇＧ抗体を、０．１ｎＭのビオチン標識したヒトＶＥＧＦ１６５と共に、漸増濃度のＨＥＲ２ ＥＣＤの存在下でインキュベートした。ｂＨ１−４４を固定化した抗ヒトＦｃによって捕捉し、ｂＨ１−４４と結合したビオチン−ＶＥＧＦをストレプトアビジン−ＨＲＰで検出した。捕捉されたｂＨ１−４４と結合したＨＥＲ２ ＥＣＤは、ＨＥＲ２上の非重複エピトープと結合するマウス抗ＨＥＲ２抗体、続いてＨＲＰとコンジュゲートさせたヤギ抗マウスＩｇＧを用いて検出した（図４８Ａ）。０．２ｎＭの濃度のヒトｂＨ１−４４ ＩｇＧを、０．６ｎＭのビオチン標識したＨＥＲ２と共に、漸増濃度のヒトＶＥＧＦ１６５の存在下でインキュベートした。ｂＨ１−４４を固定化した抗ヒトＦｃによって捕捉し、ｂＨ１−４４と結合したビオチン−ＨＥＲ２をストレプトアビジン−ＨＲＰで検出した（図４８Ｂ）。
また、ｂＨ１およびｂＨ１−４４と細胞との特異的結合を、ＦＡＣＳを用いて検出した（蛍光活性化細胞分類、図４９）。二重特異性抗体（ｂＨ１およびｂＨ１−４４）はＨＥＲ２を発現するマウス線維芽細胞（ＮＲ６）と結合するが（図４９Ｂ）、ＨＥＲ２陰性のＮＲ６細胞とは結合しない（図４９Ａ）。５０〜１００万個の細胞を１５μｇ／ｍＬのｈＩｇＧと共に氷上で１時間インキュベートした。細胞と結合した一次抗体は、二次の蛍光ＰＥとコンジュゲートさせたヤギ抗ヒトＩｇＧを用いて検出した。細胞はＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて分析した。ラットｎｅｕ（ＨＥＲ２のラット相同分子種）でトランスフェクトしたマウス線維芽細胞に対する結合は検出されなかったため、ｂＨ１およびｂＨ１−４４はＨＥＲ２のラット相同分子種と交差反応しなかった。
ｂＨ１抗体変異体ｂＨ１−８１およびｂＨ１−４４の特異性をさらに特徴付けるため、免疫沈降実験を実施し、ｂＨ１抗体変異体は、ＶＥＧＦまたはＨＥＲ２をマウス線維芽細胞（ＮＲ６）溶解物から特異的に免疫沈降させるが、他のタンパク質はさせないことが示された（図５０）。ＮＲ６細胞を非特異的にビオチン標識し、溶解し、細胞膜タンパク質を洗剤で溶かした。５００〜１０００万個の細胞／ｍＬのＮＲ６細胞に対応する細胞溶解物、０．１μｇ／ｍＬのビオチン標識したＶＥＧＦ１６５を入れたＮＲ６細胞、またはＮＲ６細胞を過剰発現するＨＥＲ２を、１５μｇ／ｍＬの抗体と共にインキュベートした。抗体を、プロテインＡでコートしたセファロースビーズを用いて捕捉し、結合したタンパク質を溶出させた。溶出させたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。約２５〜５０，０００個の細胞に対応する細胞溶解物および約１２〜２５万個の細胞からの免疫沈降物をゲルに載せた。捕捉されたビオチン標識したタンパク質は、ストレプトアビジン−ＨＲＰを用いたウエスタンブロッティングによって検出した。
実施例７．ｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおけるＩｇＧ活性の分析
ｉｎ ｖｉｔｒｏのこれらの抗体の二重活性がｉｎ ｖｉｖｏの対応する活性に変換されるかどうかを評価するために、抗ＶＥＧＦ抗体（Ｃｏｌｏ２０５、結腸直腸癌細胞系）またはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体（ＢＴ４７４Ｍ１、乳癌細胞系）による処置に応答性であることが知られているマウス異種移植腫瘍モデルを用いた。具体的には、Ｃｏｌｏ２０５異種移植体をｎｕ／ｎｕマウスで使用し、ＢＴ４７４Ｍ１異種移植体をベージュヌードＸＩＤマウスで使用した。すべての動物研究は米国実験動物管理認定協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）およびＧｅｎｅｎｔｅｃｈ施設内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の指針に従っていた。
具体的には、ＢＴ４７４Ｍ１（インハウス）およびＣｏｌｏ２０５（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）細胞をＲＰＭＩ培地／１０％のウシ胎児血清中で培養した。５×１０６個のＢＴ４７４Ｍ１細胞をハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）に懸濁させ、マトリゲル（１：１）混合物を、エストラジオールペレットを皮下移植したＨａｒｌａｎベージュヌードＸＩＤマウス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の乳腺脂肪体内に注射した。Ｃｏｌｏ２０５異種移植体では、ＨＢＳＳ中の５×１０６個のＣｏｌｏ２０５細胞をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ｎｕ／ｎｕマウス（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）内に皮下注射した。平均の腫瘍の大きさが約２００ｍｍ３に達した後、マウスを８匹のマウス（ＢＴ４７４Ｍ１）または１０匹のマウス（Ｃｏｌｏ２０５）の７つの群へとランダムに群分けした。抗体は１週間に１回腹腔内投与した。腫瘍の大きさを１週間に２回測定した。体積はＶ＝０．５ａｂ２（ａは腫瘍の最長の寸法であり、ｂはａに垂直である）として計算した。統計的評価では一方向分析、続いて両側スチューデントｔ検定を使用した。多重比較（ボンフェローニ）によるアルファレベルの調節では、本発明者らの結論の有意性は変更されなかった。部分的応答（ＰＲ）とは、Ｖ０と比較して腫瘍体積が５０〜９９％低下した応答として定義した。血清試料は最初および３回目の処置の後の７日目に収集した。ヒト抗体の濃度はＥＬＩＳＡを用いて決定した。ロバ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃを免疫プレート上に固定化した。血清および標準抗体の希釈液をプレート上で２時間インキュベートした。結合した抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートさせたヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ、続いてＴＭＢ基質／１Ｍのリン酸によって検出した。プレートは４５０／６２０ｎｍで読み取った。試料の濃度は４−パラメータのアルゴリズムを用いて決定した。
ｂＨ１−４４で処置した群を、抗ＶＥＧＦ（Ｂ２０−４．１）（Ｌｉａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８１：９５１、２００６）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体、または組合せ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体＋抗ＶＥＧＦ）で処置した群と比較して、ｂＨ１−４４抗体がＶＥＧＦおよびＨＥＲ２に媒介される腫瘍成長を阻害できることをさらに確立させた。すべての群で、抗体は、処置の開始後の７日目にＣｏｌｏ２０５異種移植体からの血清中に高レベルで存在しており（ＥＬＩＳＡによって推定）、これは正常な薬物動態を示している（表６）。
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 １０ｍｇ／ｋｇで１週間に１回投薬したｂＨ１−４４は、コントロール抗体と比較してＣｏｌｏ２０５の腫瘍成長を阻害し（ｐ＜０．０００１、ｎ＝１０）、抗ＶＥＧＦ（１０ｍｇ／ｋｇ／週）としても同様の有効性を有している一方で、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体はＣｏｌｏ２０５の成長に影響を与えなかった（ｐ＝０．１２、ｎ＝１０）。予測どおり、組合せ処置では抗ＶＥＧＦ単独と同様の有効性が示された。１０および２０ｍｇ／ｋｇ／週で投与したｂＨ１−４４抗体では用量依存性の応答が得られた。ＢＴ４７４Ｍ１モデルでは、ｂＨ１−４４抗体で処置したマウスの群において有意な腫瘍成長の阻害が観察された（１０ｍｇ／ｋｇ／週、ｐ＝０．０００５、ｎ＝８および２０ｍｇ／ｋｇ／週、ｐ＝０．０００１、ｎ＝７）。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体またはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／抗ＶＥＧＦの組合せを投薬した群と同様、ｂＨ１−４４抗体で処置した腫瘍の半数より多くが、初期体積から５０％を超える回帰を示した（すなわち、部分的応答、図５１）。他方で、抗ＶＥＧＦ単独では、コントロールと比較してＢＴ４７４Ｍ１に対して中程度の成長阻害効果しか示されず（ｐ＝０．０６、ｎ＝７）、部分的応答を示さなかった。したがって、二重特異性ｂＨ１−４４抗体はｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍成長に重要な２つの明確に異なる機構を阻害することが示された。
上記結果は、ｉｎ ｖｉｖｏの腫瘍成長に重要な２つの機構を阻害する、ｂＨ１抗体の親和性が改善された変異体（例えばｂＨ１−４４およびｂＨ１−８１）の潜在性を示している。
実施例８．ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２とｂＨ１およびｂＨ１−４４との結合界面の特徴付け
ｂＨ１およびｂＨ１−４４の構造的特徴をさらに比較するために、ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２とこれらの抗体との結合界面を同定した。表７に記載した構造的接触を、結晶構造座標３ＢＤＹ（ｂＨ１／ＶＥＧＦ）および３ＢＥ１（ｂＨ１／ＨＥＲ２）に基づいて同定した。結合界面はプログラムＸＳＡＥを用いて計算した。このプログラムにより、界面が極性、疎水性、および混合として定義された。表７には、全表面積の＞２５％がＨＥＲ２またはＶＥＧＦの結合の際に埋没したｂＨ１残基を記載する。また、表７には、ｂＨ１残基の４．５Å以内のＶＥＧＦおよびＨＥＲ２残基も記載する。複合体形成の際に埋没されるそれぞれの残基の表面積を、ＩＭＯＬを用いて、結晶構造の座標３ＢＤＹ、３ＢＥ１、および１Ｎ８Ｚ（ＰＤＢ）に基づいて計算した。表１１に報告する極性および疎水性界面の領域は、極性界面領域および混合の半分を反映している。報告されている疎水性界面領域は、疎水性領域および混合の半分からなる。
結晶構造およびアラニンスキャニングにより、ｂＨ１がＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体と同じＨＥＲ２上の結合エピトープを保持することが示された（Ｂｏｓｔｒｏｍら、２００９）。ＨＥＲ２との複合体中のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｆａｂの結晶構造は、ｂＨ１／ＨＥＲ２複合体上に良好に重ね合わされる（標準偏差０．８Å）（Ｂｏｓｔｒｏｍら、２００９、Ｃｈｏら、２００３）。さらに、アラニンスキャニング突然変異誘発に基づいて全結合エネルギーの１０％よりも多くに貢献するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体残基は保存されており、その多くはｂＨ１およびｂＨ１−４４の結合ホットスポットの一部でもある（Ｂｏｓｔｒｏｍら、２００９、ＫｅｌｌｅｙおよびＯ’Ｃｏｎｎｅｌｌ、１９９３）（表１４、図６２）。ｂＨ１／ＶＥＧＦとｂＨ１／ＨＥＲ２との間の界面はそれぞれ１５０６Å２および１５７９Å２を埋没し、主に疎水性である（それぞれ６０％および６３％）。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＨＥＲ２結合界面はｂＨ１／ＨＥＲ２界面と同様の大きさおよび組成を有しており（１５２４Å２、６０％の疎水性、表１１）、高い形状相補性によっても特徴付けられている（表８）（Ｂｏｓｔｒｏｍら、２００９）。
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抗体と抗原との間の形状相補性（表８中でＳｃとして表す）を記載のように決定した（Ｌａｗｒｅｎｃｅら、１９９３）。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体およびＨＥＲ２の間の相補性に類似した、ｂＨ１／ＶＥＧＦおよびｂＨ１／ＨＥＲ２複合体の高い形状相補性は、報告された抗体−抗原複合体の範囲内にある（Ｓｃ約０．６４〜０．６８、Ｌａｗｒｅｎｃｅら、１９９３）。ＨＥＲ２とＶＥＧＦと結合したコンホメーションのｂＨ１との重ね合わせ、またはＶＥＧＦとＨＥＲ２と結合した形態のｂＨ１との重ね合わせにより、抗体を非関連の抗原と並置した際にわずかな形状相補性しか観察されないことが明らかとなる。（Ｓｃ約０．３５、Ｌａｗｒｅｎｃｅら、１９９３）。この結果は、ｂＨ１が再編成されて２つの異なる抗原を収容する程度を実証している。
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高親和性変異体ｂＨ１−４４をｂＨ１のファージ表出抗体ライブラリーから選別することによって、ｂＨ１の親和性を改善させた。ショットガンアラニンスキャニング突然変異原により、ｂＨ１−４４がｂＨ１の抗原結合のホットスポットを保存していたことが実証された（表９Ａ〜Ｂ、１０、および１４）。ｂＨ１−４４のショットガンアラニンスキャニング突然変異原は、ｂＨ１のショットガンアラニンスキャニング突然変異誘発について上述した技法を用いて行った。
表９Ａ〜Ｂでは、アラニンへの突然変異（ｍ１）、もしくはさらなる突然変異（ｍ２、ｍ３、ショットガンコドンの制限による）、または相同的アミノ酸への突然変異（ｍ４）の効果を、ＶＥＧＦ（表９Ａ）またはＨＥＲ２（表９Ｂ）結合クローンの野生型（ｗｔ）の発生率の比またはｗｔ／ｍｕｔの発生率の比として計算する。ｗｔがアラニンである場合は、これをグリシンによって置換した（ｍ１）。ｗｔ／ｍｕｔ比は、表出選別からのｗｔ／ｍｕｔ比で除算してＦ値をうることによって、タンパク質の折畳み／発現の効果について補正されている。表出の選別は、抗体軽鎖の非直鎖エピトープと結合するタンパク質Ｌと結合するクローンを選別することによって、独立して行った。Ｆａｂ重鎖のみをファージコートタンパク質（ｐ３）と融合させるため、タンパク質Ｌの結合は、適切な折畳みならびに軽鎖および重鎖の会合を示す。
表１０では、結晶構造中でＶＥＧＦおよび／またはＨＥＲ２と接触するｂＨ１およびｂＨ１−４４の抗体残基を記載する。結合のエネルギー的ホットスポットは、相互作用の全結合エネルギーの約１０％よりも高いΔΔＧｗｔ／ａｌａをもたらす抗体残基によって定義される。
表１１中のデータは、結合界面の極性および大きさがｂＨ１／ＶＥＧＦ、ｂＨ１／ＨＥＲ２、およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＨＥＲ２の複合体で類似していることを示す。ＸＳＡＥを用いてそれぞれの界面の極性を分析した。表１１に示すすべての数字は、別段に指定しない限りはÅ２での面積を表す。
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ＨＥＲ２／ＶＥＧＦ二重特異性ｂＨ１−４４抗体はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体のＨＥＲ２結合動態を維持する
ｂＨ１およびそのＦａｂ変異体と固定化したＶＥＧＦまたはＨＥＲ２との結合動態を研究するために、表面プラズモン共鳴を行った（表１２）。ＳＰＲに基づくアッセイは、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００を用いて行った。ＶＥＧＦ１０９およびＨＥＲ２細胞外ドメインを、５０〜１５０ＲＵの範囲のＲｍａｘを許容する密度でＣＭ５チップ上に固定化した。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中のＦａｂの段階希釈液を３０μｌ／分で注入した。結合応答は、ブランクのフローセルからの応答を減算することによって、およびバッファー効果を正規化することによって補正した。１：１のラングミュア当てはめモデルを用いてｋａ（会合速度）およびｋｄ（解離速度）を推定した。ＫＤ値はｋａおよびｋｄの比から決定した。
ｂＨ１ Ｆａｂ／ＶＥＧＦの相互作用は、比較的高い会合速度（ｋｏｎ＝３．７×１０４）および速い解離速度（ｋｏｆｆ＝０．０１３）によって特徴付けられており、これは３００ｎＭという中等度ＫＤをもたらす。ｂＨ１／ＨＥＲ２相互作用の親和性（ＫＤ＝２６ｎＭ、ｋｏｎ＝９．６×１０４、ｋｏｆｆ＝２．４×１０−３）は、より遅い会合速度および速い解離速度を有するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＨＥＲ２相互作用（ＫＤ＝０．５ｎＭ、ｋｏｎ＝７．１×１０５、ｋｏｆｆ＝３．５×１０−４）よりも５２倍低い。親和性が改善されたｂＨ１変異体であるｂＨ１−８１およびｂＨ１−４４は、ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２の相互作用の会合速度および解離速度のどちらの改善も表出した。高親和性クローンｂＨ１−４４は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）と同様の親和性でＨＥＲ２と結合する（ＫＤ＝０．２ｎＭ、表１２）。
表１２は、ＢＩＡｃｏｒｅを３０℃で用いた表面プラズモン共鳴の測定によって決定した、ｂＨ１変異体およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体の動態プロファイルを示す。これらの実験では、Ｆａｂを固定化したＶＥＧＦまたはＨＥＲ２と結合させ、１：１のラングミュア結合当てはめモデルを用いて会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）、および解離定数（ＫＤ）を決定した。ｂＨ１−４４抗体は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体と同様のＨＥＲ２に対する動態プロファイルおよび親和性を有する。ＶＥＧＦまたはＨＥＲ２との結合を失った２つの二重突然変異体（ｂＨ１−４４ Ｉ２９Ａ＋Ｙ３２ＡおよびｂＨ１−４４ Ｒ５０Ａ＋Ｒ５８Ａ）は、他方の抗原に対する動態プロファイルおよび親和性を保っていた。
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二重特異性抗体はＨＥＲ２およびＶＥＧＦと同様の熱力学的特性で相互作用する
ｂＨ１ Ｆａｂ変異体と２つの抗原、ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦのレセプター結合ドメイン、ＶＥＧＦ８〜１０９）およびＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）との間の相互作用のエンタルピー（ΔＨ）およびエントロピー（ΔＳ）変化も、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）を用いて決定した（図５９Ａ〜Ｆ、図６０、表１３）。
ＦａｂとヒトＶＥＧＦ１０９およびＨＥＲ２の細胞外ドメインとの間の相互作用のマイクロ熱量測定を、ＶＰ−ＩＴＣ滴定熱量計（Ｍｉｃｒｏｃａｌ Ｉｎｃ．）で記載のように行った（Ｓｔａｒｏｖａｓｎｉｋら、１９９９）。タンパク質溶液を広範にリン酸緩衝生理食塩水中へと透析した。バッファーの組成の違いによる混合熱効果を最小限にするために、抗原およびＦａｂは同じ容器中で透析した。１００〜２２０μＭの濃度のＦａｂを１０〜２２μＭの濃度の抗原溶液（ＨＥＲ２−ＥＣＤまたはＶＥＧＦ１０９）中へ滴定した。この抗原濃度は正確なエンタルピー測定に必要であったが、結合親和性が高い場合はＫＤの決定が妨げられる。１５または２０回の注入を行って２倍過剰の抗体を得た。反応の熱を決定し、Ｆａｂ希釈の熱を減算し、ΔＨを計算した。
表面プラズモン共鳴によって決定した解離定数（ＫＤ）（表１２）を用いて、
ΔＧ＝ＲＴ ｌｎ（ＫＤ）
に従って結合自由エネルギー（ΔＧ）を計算した。会合の際のエントロピー変化（ΔＳ）は、
ΔＳ＝（ΔＨ−ΔＧ）／Ｔ［式中、Ｔは温度（Ｋ）である］
に従って計算した。
ΔＣｐを決定するために、２０〜３７℃の範囲の様々な温度でマイクロ熱量測定を上述のように行った。ΔＣｐは、ΔＨを温度の関数としてプロットすることによって、直線回帰によって決定した（図６２）。
二重特異性抗体ｂＨ１とその２つの抗原ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２のどちらかとの相互作用を、最初に特徴付けた。ｂＨ１とＶＥＧＦおよびＨＥＲ２との結合は同様の熱力学的特性を示した（表１３）。３０℃でｐＨ７．４のＰＢＳ中で測定したどちらの相互作用も発熱性（ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２でそれぞれΔＨ＝−２．４および−２．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、表１３、図６０）であり、結合エネルギーに貢献する非常に好ましいエントロピー変化を有する（ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２でそれぞれ−ＴΔＳ＝−６．６および−７．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ、表１３、図６０）。
表１３は、ΔＧ（結合自由エネルギー）、ΔＳ（エントロピー変化）、およびΔＨ（エンタルピー変化）をｋｃａｌ／ｍｏｌで示す。示した親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ、３０℃による動態分析を用いた少なくとも２つの独立した実験で測定した。ΔＨはＩＴＣを用いて測定し、２回または３回の独立した測定の平均、続いて標準偏差を表す。ΔＧおよびΔＳは上述のように計算した。
高親和性変異体ｂＨ１−８１およびｂＨ１−４４は、ｂＨ１と同様の熱力学的プロファイルを表出した。また、ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２とのその相互作用も、好ましいエンタルピーおよびエントロピーから特徴付けた（表１３、図６０）。ＶＥＧＦ相互作用では、親和性の改善は、顕著により好ましいエンタルピー変化（ｂＨ１−４４ではΔＨ＝−７．１対ｂＨ１では−２．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、３０℃）およびわずかにより少ない正のエントロピー変化（ｂＨ１−４４では−ＴΔＳ＝−６．６対ｂＨ１では−４．７、３０℃、表１３、図６０）に関連していた。ＨＥＲ２に対する改善された親和性も、より好ましいエンタルピー変化に関連していた（ΔＨ＝−５．３対−２．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、３０℃、表１３、図６０）。
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ｂＨ１−４４およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は明確に異なる熱力学でＨＥＲ２と相互作用する
二重特異性抗体とは対照的に、ＨＥＲ２／Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）相互作用は、顕著なエントロピー変化を全く伴わない（−ＴΔＳ＝−０．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、図６０、表１３）大きな好ましいエンタルピー変化（ΔＨ＝−１３．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）によって特徴付けられている（Ｋｅｌｌｅｙら、１９９２）。ｂＨ１−４４はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）と同様の親和性でＨＥＲ２と相互作用するが、結合自由エネルギーはより大きなエントロピーコンポーネント（−ＴΔＳ＝−８．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ、３０℃）およびより小さなエンタルピーコンポーネント（ΔＨ＝−５．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、３０℃）からなる。明確に異なる熱力学的特性は、親和性、動態、およびエネルギー的ホットスポットの残基の多くを含めた、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）とｂＨ１−４４との間のＨＥＲ２結合特徴の多くの類似性と対照的である。ＨＥＲ２において全結合エネルギーの１０％よりも多く貢献するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）のホットスポット残基はｂＨ１およびｂＨ１−４４のそれに類似しているが、明らかな差異が存在する。
表１４は、アラニンスキャニング突然変異誘発によって決定したＨＥＲ２結合におけるｂＨ１、ｂＨ１−４４、およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）抗体ホットスポットを示す。突然変異誘発はＫｅｌｌｅｙら、１９９３に記載のように行った。表１４中の数字は、残基をアラニンへと突然変異させた場合の結合自由エネルギーの変化（ΔΔＧｗｔ−ｍｕｔ）を表す。表１４中のホットスポット残基に陰影をつけ、全結合自由エネルギー（ΔＧ）の１０％以上のΔΔＧとして定義する。
残基ＬＣ−Ｔｈｒ９４、ＨＣ−Ｔｙｒ３３、ＨＣ−Ａｓｐ９８はｂＨ１中の配列中で保存されているが、ＨＥＲ２結合において異なる機能を有する（表１４、図６１）。したがって、ＶＥＧＦ結合を補充したＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の抗原結合部位中の突然変異は、ＨＥＲ２との相互作用に影響を与える抗原結合部位に何らかの基礎的な変化を行ったと考えられる。二重特異性抗体は、ＨＥＲ２に対してＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）と同等に高い親和性をもたらす、異なるＨＥＲ２認識戦略を利用することによって、導入された突然変異を収容する。ｂＨ１−４４のＬＣ−Ｓｅｒ９４以外は、ＨＥＲ２に対する親和性をｂＨ１と比較して１００倍より高く改善させた突然変異は、結合ホットスポットの一部ではなく、既存の相互作用を最適化すると考えられることは、興味深い注記点である。
二重特異性相互作用における大きな負の熱容量
二重特異性相互作用を駆動する共通のエネルギーおよびそれらがどのように単一特異性親Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）のそれと区別されるかをさらに理解するために、一連の実験を行って、ｂＨ１−４４とＶＥＧＦまたはＨＥＲ２、およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）とＨＥＲ２の３つのＦａｂ／抗原の相互作用を研究した。二重特異性相互作用の熱容量は、結合のエンタルピー（ΔＨ）を２０℃〜３７℃の範囲の複数の温度（ΔＴ＝１７℃、図６２、表１５）で決定することによって測定した。熱容量（ΔＣｐ）はΔＨおよび温度（Ｔ）の関数であり、方程式：
ΔＣｐ＝δ（ΔＨ）／δＴ
によって説明することができる。
ΔＣｐはΔＨの温度依存性の勾配から直線回帰によって推定した（図６２、表１５）。ｂＨ１−４４のΔＣｐは、ＶＥＧＦとの相互作用では−４００ｃａｌ／ｍｏｌＫ、およびＨＥＲ２との相互作用では−４４０ｃａｌ／ｍｏｌＫであると決定された。大きな負の熱容量は、以前に記載のように疎水性効果の重要性を示しており（Ｋａｕｚｍａｎｎ、１９５９）、これは、２つの複合体の構造的界面の疎水性性質と一貫している（表１１）。以前に同様の温度間隔で−３７０ｃａｌ／ｍｏｌＫであると決定されたＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＨＥＲ２のΔＣｐは（Ｋｅｌｌｅｙら、１９９２）、ｂＨ１−４４／ＨＥＲ２のΔＣｐよりも小さいが、それでもＨＥＲ２結合の疎水性効果の重要な役割を示す。
結合自由エネルギーの全エントロピー変化（ΔＳ）は、３つの供給源（Ｍｕｒｐｈｙら、１９９４）、すなわち、結合表面の脱溶媒和に関連するエントロピー変化（ΔＳＳＯＬＶ）、回転および並進の自由度の損失からのエントロピー変化（ΔＳＲＴ）、ならびに相互作用分子の立体配置およびコンホメーションの力学の変化によるエントロピー変化（ΔＳＣＯＮＦ）からのエントロピー変化の和である。
（１）ΔＳＴＯＴ＝ΔＳＳＯＬＶ＋ΔＳＲＴ＋ΔＳＣＯＮＦ
典型的には、ΔＳＳＯＬＶのみが正であり、ΔＳＲＴおよびΔＳＣＯＮＦはどちらも負である。２つの分子の会合のクラティック（ｃｒａｔｉｃ）なエントロピー用語ΔＳＲＴは、記載のように−８ｃａｌ／Ｋｍｏｌであると推定することができる（Ｍｕｒｐｈｙら、１９９４）。ΔＳＳＯＬＶは、無極性表面積の埋込みによる疎水性効果によって支配されると予測することができ、ΔＣｐの関数として説明することができる。
（２）ΔＳＳＯＬＶ＝ΔＣｐ ｌｎ（Ｔ／Ｔ＊）、Ｔ＊＝３８５Ｋ
したがって、ΔＳＣＯＮＦは、
（３）ΔＳＣＯＮＦ＝ΔＳＴＯＴ−ΔＳＲＴ−ΔＳＳＯＬＶ
として推定することができる。
方程式（３）によれば、ΔＳＳＯＬＶは、ｂＨ１−４４／ＶＥＧＦでは９６ｃａｌｍｏｌ−１Ｋ−１、ｂＨ１−４４／ＨＥＲ２では１０５ｃａｌｍｏｌ−１Ｋ−１、およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＨＥＲ２では８９ｃａｌｍｏｌ−１Ｋ−１であると推定される（表１５）。これは、ｂＨ１−４４／ＶＥＧＦでは−７２ｃａｌｍｏｌ−１Ｋ−１、ｂＨ１−４４／ＨＥＲ２では−７０ｃａｌｍｏｌ−１Ｋ−１、およびＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ＨＥＲ２では−８０ｃａｌｍｏｌ−１Ｋ−１のΔＳＣＯＮＦへと変換される（表１５）。
その親Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）と比較した二重特異性Ｆａｂの全体的な構造的安定性を検査するために、示差スキャニング熱量（ＤＳＣ）を用いた熱変性実験を行った。熱変性実験はＭｉｃｒｏｃａｌ Ｉｎｃ．の示差スキャニング熱量計で行った。Ｆａｂを１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５、１５０ｍＭの塩化ナトリウムに対して透析した。溶液を０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調節し、１℃／分の速度で９５℃まで加熱した。融解プロファイルをベースライン補正し、正規化した。融解温度（ＴＭ）は製造者によって供給されたソフトウェアを用いて決定した。予測どおり、どのＦａｂも可逆的な熱変性プロファイルを表出しなかった（Ｋｅｌｌｅｙら、１９９２）（データ示さず）。二重特異性変異体のＴＭ（ｂＨ１、ｂＨ１−８１、およびｂＨ１−４４でそれぞれ７７．２℃、７５．６℃、７４．３℃、表１６）は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（８２．５℃）よりもわずかに低かったが、高いものであり、他の治療的抗体で報告されているものの範囲内であった（ＧａｒｂｅｒおよびＤｅｍａｒｅｓｔ、２００７）。
ＶＥＧＦまたはＨＥＲ２のみに対して高い親和性を有するｂＨ１変異体の結合動態および熱力学
興味深いことに、二重特異性抗体は、その結合エネルギーの大部分を共有のＶＥＧＦ／ＨＥＲ２結合部位の完全に異なる領域から引き出す。これらのデータは、残りの結合特異性に影響を与えずに二重特異性抗体のＶＥＧＦまたはＨＥＲ２結合機能を選択的に破壊することができることを示している。構造的研究により、ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２のｂＨ１上の構造的パラトープは顕著に重複することが示されたが、ｂＨ１およびｂＨ１−４４のショットガンアラニン突然変異誘発により、ＶＥＧＦおよびＨＥＲ２の相互作用はわずかな重複しか有さない２つのユニークなＣＤＲ残基の組によって媒介されることが実証された（図５４および５７、表９Ａ、９Ｂ、および１０）。ｂＨ１およびｂＨ１−４４のショットガンアラニンスキャニングにより、ＶＥＧＦ結合に重要なＬＣ−Ｉｌｅ２９、ＬＣ−Ｔｙｒ３２、およびＨＥＲ２結合のＨＣ−Ａｒｇ５０、ＨＣ−Ａｒｇ５８を含めた（図５４および５７、表９および１０）、一部のＣＤＲ残基がＶＥＧＦまたはＨＥＲ２のどちらかの結合に排他的に重要であることが示された（図５４および５７、表９Ａ、９Ｂ、および１０）。それぞれの相互作用におけるこれらの残基の側鎖のユニークな重要性を確認するために、それぞれの残基を、ｂＨ１−４４（ＬＣ−Ｉｌｅ２９、ＬＣ−Ｔｙｒ３２、ＨＣ−Ａｒｇ５０、ＨＣ−Ａｒｇ５８）またはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（ＨＣ−Ａｒｇ５０、ＨＣ−Ａｒｇ５８）の足場中で、個別にまたは組み合わせて、アラニンへと突然変異させ、突然変異体をＦａｂおよびＩｇＧとして発現させた。
重鎖を介して遺伝子ＩＩＩのＮ末端と融合したｂＨ１−４４またはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｆａｂをコードしているベクターを、Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発の鋳型として使用した（Ｋｕｎｋｅｌら、１９８７）。所望のアラニン突然変異を選別した位置に導入されるようにオリゴヌクレオチドを設計した。Ｆａｂアラニン突然変異体をファージとして発現させ、結合を競合ＥＬＩＳＡによって確認した（図５８）。その後、記載のように、重鎖および軽鎖可変ドメインをＦａｂおよびＩｇＧ発現ベクター内にクローニングし、ＦａｂおよびＩｇＧを発現させ、精製した（Ｂｏｓｔｒｏｍら、２００９）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより正しいタンパク質の大きさが確認された（図６５）。サイズ排除クロマトグラフィーにより５％未満の凝集レベルが示された。
２つの抗原との結合を競合ＥＬＩＳＡおよび／またはＢＩＡｃｏｒｅによって検査した。ｂＨ１−４４足場中のすべての単一アラニン突然変異が、結合を様々な度合で損なわせた（データ示さず）。最も著しい単一突然変異はＬＣ−Ｙ３２Ａであり、ＶＥＧＦ結合を顕著に破壊した一方で、ＨＥＲ２結合の親和性および動態が維持された（表１２、図５８、および図６３）。二重突然変異Ｉ２９Ａ＋Ｙ３２Ａ（ＬＣ）またはＲ５０Ａ＋Ｒ５８Ａ（ＨＣ）は、それぞれＶＥＧＦまたはＨＥＲ２との結合をほぼ完全に破壊した一方で、他の抗原に対する結合の親和性および動態が維持された（表１２、図５８、および図６３）。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）足場中のアラニン突然変異ＨＣ−Ｒ５０Ａ、ＨＣ−Ｒ５８ＡもＨＥＲ２との結合を様々な程度まで破壊した一方で、二重突然変異体ＨＣ Ｒ５０Ａ＋Ｒ５８Ａは検出可能なＨＥＲ２結合を示さなかった（表１２）。
次に、二重突然変異体の熱力学的パラメータを分析し、ｂＨ１−４４の値と比較した。ｂＨ１−４４突然変異体ＬＣ−Ｉ２９Ａ＋Ｙ３２ＡおよびＨＣ−Ｒ５０Ａ＋Ｒ５８ＡとそれぞれＨＥＲ２またはＶＥＧＦとの結合自由エネルギーは、エンタルピーおよびエントロピーの好ましい貢献から生じ（ＶＥＧＦではΔＨ＝−７．７および−ＴΔＳ＝−３．９、ＨＥＲ２ではΔＨ＝−６．４および−ＴΔＳ＝−７．６、表１３、図６０）、これは３０℃で測定したｂＨ１−４４とほぼ同等である（表１３、図６０）。したがって、二重突然変異体はｂＨ１−４４と同じ熱力学および動態のプロファイルを表出した。
特異性を変更させる残基の機能の構造的基礎
次に、それぞれの抗原複合体中の結合決定要因の特異的相互作用を明らかにするために、ＶＥＧＦまたはＨＥＲ２との複合体中のｂＨ１の結晶構造を分析した（Ｂｏｓｔｒｏｍら、２００９）（図６４）。生じた分析により、２つの特異性決定残基の突然変異が、どのように他方の親和性、動態、および結合熱力学に影響を与えずに一方の抗原の結合能力を破壊するかが説明された。ｂＨ１のＣＤＲ−Ｌ１はＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）からの配列の変化の大多数を含有し、ＶＥＧＦ結合に重要である。ｂＨ１のＣＤＲ−Ｌ１のコンホメーションは２つの複合体の構造で顕著に異なり、平均の偏差は４．６Åである（残基２７〜３２のＣα）。対照的に、ＶＥＧＦとの複合体中のｂＨ１ Ｆａｂの全体的なコンホメーションは、ＨＥＲ２と結合したＦａｂのそれと顕著に類似している（標準偏差＝０．７Å、３９８個の主鎖原子、Ｃα）。ＣＤＲ−Ｌ１ループはＶＥＧＦによって埋没された表面積の２６％を構成する一方で、このループはＨＥＲ２パラトープの周辺に位置し、ＨＥＲ２との接触に最小限しか関与していない。
２つの複合体の重ね合わせにより、ＶＥＧＦは、ＨＥＲ２と結合したコンホメーションでＣＤＲ−Ｌ１のＴｙｒ３２および隣接残基と衝突することが示された。Ｔｙｒ３２の主鎖Ｃα原子は２つの構造において同じ位置に存在するが、その側鎖は約１３０°回転している。ＶＥＧＦ複合体中では、Ｔｙｒ３２およびＩｌｅ２９は、ＶＥＧＦ結合に必要なＣＤＲ−Ｌ１のコンホメーションを可能にすることにおいて構造的な役割を果たすと考えられる。Ｔｙｒ３２からＡｌａまたはＰｈｅのどちらかへの突然変異は、ＶＥＧＦ結合には許容されない（Ｂｏｓｔｒｏｍら、２００９）。Ｔｙｒ３２の側鎖はＨＥＲ２に向けられているが、生産的な抗原接触に関与していると考えられていない。Ｉｌｅ２９はＨＥＲ２から遠く離れており、その側鎖は溶媒に曝露されており、また、Ｉｌｅ２９およびＴｙｒ３２からＡｌａへの突然変異はＨＥＲ２結合に良好に許容される。
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ｂＨ１／ＨＥＲ２複合体中のＨＥＲ２結合にユニークに重要な残基の構造も検査した。Ａｒｇ５０およびＡｒｇ５８の側鎖は、ｂＨ１−ＨＥＲ２構造中のＨＥＲ２上の酸性残基（Ｇｌｕ５５８およびＡｓｐ５６０）に対してパッキングしている（図６４）。ＬｙｓおよびＡｌａへの突然変異は破壊的であるため、相互作用は側鎖に高度に特異的であると考えられる（Ｂｏｓｔｒｏｍら、２００９）。しかし、ＶＥＧＦ構造中では、Ａｒｇ５０およびＡｒｇ５８は溶媒に曝露されており、ＶＥＧＦから遠く離れており、ＡｌａまたはＬｙｓへの突然変異は良好に許容される（Ｂｏｓｔｒｏｍら、２００９）。
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本明細書中で引用又は参照した特許、特許出願、特許出願公報及び他の出版物のすべては、特許、特許出願、特許出願公報又は他の出版物の各々が出典明記によって援用されるために具体的及び個々に示されるのと同程度に、出典明記によって本明細書中に援用される。

Claims (14)

  1. ６つの高頻度可変領域(ＨＶＲ)配列：
    (i) 配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１、
    (ii) 配列WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２、及び
    (iii) 配列HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３、及び
    更に、
    (iv) 配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１、
    (v) 配列RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び
    (vi) 配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３、
    を含むＨＶＲ配列を含んでなり、ヒト上皮性増殖因子レセプター２(ＨＥＲ２)およびヒト血管内皮性増殖因子(ＶＥＧＦ)を特異的に結合する、単離された抗体であって、
    ヒトのＶＥＧＦとの結合親和性が３ｎＭのＫｄ又はそれ以上に強く、ヒトのＨＥＲ２との結合親和性が０．２ｎＭのＫｄ又はそれ以上に強く、コントロールと比較して、ＶＥＧＦ誘導性の細胞増殖とＨＥＲ２発現細胞の増殖を阻害する抗体。
  2. ６つの高頻度可変領域(ＨＶＲ)配列：
    (i) 配列NIAKTISGY(配列番号：１)を含むＨＶＲ-Ｌ１、
    (ii) 配列WGSFLY(配列番号：２)を含むＨＶＲ-Ｌ２、及び
    (iii) 配列HYSSPP(配列番号：３)を含むＨＶＲ-Ｌ３、及び
    更に、
    (iv) 配列NISGTY(配列番号：７)を含むＨＶＲ-Ｈ１、
    (v) 配列RIYPSEGYTR(配列番号：８)を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び
    (vi) 配列WVGVGFYAMD(配列番号：９)を含むＨＶＲ-Ｈ３、
    を含むＨＶＲ配列を含んでなり、ヒト上皮性増殖因子レセプター２(ＨＥＲ２)およびヒト血管内皮性増殖因子(ＶＥＧＦ)を特異的に結合する、単離された抗体であって、
    ヒトのＶＥＧＦとの結合親和性が３ｎＭのＫｄ又はそれ以上に強く、ヒトのＨＥＲ２との結合親和性が０．２ｎＭのＫｄ又はそれ以上に強い抗体。
  3. 請求項２に記載の抗体の抗原結合断片。
  4. Ｆａｂ断片である、請求項３に記載の抗原結合断片。
  5. 前記抗体がモノクローナル抗体であるか、又はＩｇＧ抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
  6. ＨＥＲ２およびＶＥＧＦを特異的に結合し、
    Ｆａｂ断片又は単鎖可変断片(ｓｃＦｖ)である、
    請求項１又は２に記載の抗体の抗原結合断片。
  7. フレームワーク配列の少なくとも一部が、ヒトコンセンサスフレームワーク配列である、請求項１−６の何れか一項に記載の抗体又は抗原結合断片。
  8. ヒト患者における
    (a) 腫瘍、又は、
    (b) ＨＥＲ２の異常な活性化を伴う非悪性疾患
    を治療するために用いる医薬の調製における、請求項１−７の何れか一項に記載の抗体ないし抗原結合断片の使用であって、このとき抗体ないし抗原結合断片が被検体の腫瘍、又は非悪性疾患を治療又は予防するために十分な時間と量で投与される、使用。
  9. 前記腫瘍が結腸直腸腫瘍、乳癌、肺癌、腎臓細胞癌腫、膠腫、神経膠芽腫又は卵巣癌である、請求項８に記載の使用。
  10. 前記医薬が他の抗癌療法と共に投与される、請求項９に記載の使用。
  11. 前記他の抗癌療法が、第２の抗体ないし抗原結合断片、化学療法剤、細胞障害性薬剤、抗血管形成剤、免疫抑制剤、プロドラッグ、サイトカイン、サイトカインアンタゴニスト、細胞障害性放射線療法、副腎皮質ステロイド、制吐剤、癌ワクチン、鎮痛剤又は増殖阻害性剤を含み、前記第２の抗体ないし抗原結合断片が、請求項１−７の何れか一項に記載の抗体ないし抗原結合断片と異なる、請求項１０に記載の使用。
  12. 前記他の抗癌療法が、請求項１−７の何れか一項に記載の抗体ないし抗原結合断片の投与の前又は後に、あるいは、請求項１−７の何れか一項に記載の抗体ないし抗原結合断片と同時に、投与される、請求項１１に記載の使用。
  13. ヒト患者における
    (a) 腫瘍、又は、
    (b) ＨＥＲ２の異常な活性化を伴う非悪性疾患
    を治療するために用いる、請求項１−７の何れか一項に記載の抗体ないし抗原結合断片であって、このとき抗体ないし抗原結合断片が被検体の腫瘍、又は非悪性疾患を治療又は予防するために十分な時間と量で投与される、抗体ないし抗原結合断片。
  14. ヒト患者における
    (a) 腫瘍、又は、
    (b) ＨＥＲ２の異常な活性化を伴う非悪性疾患
    を治療する際に有用な組成物中に、活性成分として用いる請求項１−７の何れか一項に記載の抗体ないし抗原結合断片であって、このとき抗体ないし抗原結合断片が被検体の腫瘍、又は非悪性疾患を治療又は予防するために十分な時間と量で投与される、抗体ないし抗原結合断片。
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