TWI486570B - 使用濁度光散射技術以確保樣品妥適性之技術 - Google Patents

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Description

使用濁度光散射技術以確保樣品妥適性之技術 參考相關申請案
本案請求下列各案之權益：美國專利申請案第12/588,305號，申請日2009年10月9日，名稱「使用濁度光散射技術以確保樣品妥適性之技術」(代理人檔號74708.000601)，美國臨時專利申請案第61/242,628號，申請日2009年9月15日，名稱「使用濁度光散射技術以確保臨床子宮頸檢體之樣品妥適性之技術」(代理人檔號No. 74708.000600)及美國臨時專利申請案第61/183,857號，申請日2009年6月3日，名稱「使用濁度光散射技術以確保臨床子宮頸檢體之樣品妥適性之技術」(代理人檔號No. 74708.000300)，各案全文係以引用方式併入此處。本案亦為美國申請案第12/062,950號，申請日2008年4月4日之連續部分，該案係請求美國臨時專利申請案第60/910,565號，申請日2007年4月6日之權益，二案全文係以引用方式併入此處。
發明領域
本揭示大致上係有關經由使用光散射技術，特別為濁度估計已知流體體積內之細胞數目來測量臨床樣品之妥適性之方法。於另一面相，本揭示提供用於經由估算細胞數目來測量臨床樣品之妥適性之機器。此等機器可用於臨床樣品的高產出量處理。於另一面相中，本揭示提供判定一樣品是否含有樣品之測試具有知識利益之妥適材料之方法。
 發明背景
於臨床診斷、生命科學、法醫學、及生化武器等領域中，確保樣品妥適性測定可提供樣品分析程序之若干效果。有關樣品妥適性的資訊內容可提高對該樣品使用其它化學、物理、及/或生物檢定分析之隨後試驗結果的可信度及效果。資訊內容可改良病人的處理，原因在於藉由不妥適的樣品較為可能獲得錯誤代表病人健康狀況的資訊。為了避免報告不具代表性的健康結果，以及允許病人的再取樣，預期可獲得樣品妥適性測定的有利結果。此外，於進行其它樣品分析前對樣品妥適性的瞭解，經由避免對無法診療的不妥適樣品進行昂貴的試驗，可獲得時間、材料及勞力成本的節省。此外，對大族群之篩檢試驗進行樣品保證，此處顯著數目的試驗結果證實被分析物的不存在，可提高數值，驗證該結果對原先取樣實體具有代表性。
分析特定細胞類型、病毒、細菌或其它病原是否存在的臨床樣品由本試驗方法特別有利，原因在於此等方法將可協助確保試驗結果以及進一步提升功效。由樣品妥適性確保可能獲益的一個領域為用於HPV感染之子宮頸樣品試驗。例如已經證實複基因(digene) HC2高風險HPV DNA試驗(「HC2」)作為ASC-US細胞學病人之子宮頸癌篩檢計畫與臨床處置中之一個組成分極為具有價值。目前HC2 HPV DNA試驗用於CIN3子宮頸病灶的預測獲得約99.5%或以上之高度陰性預測值。雖言如此，檢驗室及病人可能期望經由樣品妥適性的測量而可提供額外控管及確保。也期望降低判定為不妥適的測試樣品的機會降低。
 發明概要
綜上所述，需要有一種測定樣品妥適性之方法。使用此等方法允許操作員判定排除被視為用於特定試驗方法為不妥適的樣品處理。此等方法可提供樣品妥適性知識，可用於詮釋試驗結果及病人醫療判定。舉例言之，若一樣品為不妥適，則可瞭解陰性結果並非必然代表真陰性，但陽性結果仍需考慮對某些類型測試具有資訊意義。樣品不妥適性測試可提供於試驗前再取樣來獲得妥適樣品的替代之道，藉此節省執行可能為無法確定的檢定分析的成本。如此，此處所述方法可對使用者提供較大決策能力，例如經由允許測定是否試驗不妥適的樣品，及可提供醫療業者及/或病人更明確瞭解陰性試驗結果的意義。較佳本發明實施例提供前述效果中之一者或多者，但另外或此外可實現其它好處。
本揭示提供可集合用於多項組合或單獨使用之多個發明。後文摘要提供此等發明之實施例而絕非囿限本案所請求專利之本發明。
於一個面相，本揭示提供一種樣品保證讀取器包含一個或多個通道來統一地或分開地測量一個或多個樣品的濁度，該等通道各自包含：一個或多個光源及一個或多個光檢測器，藉此測定一樣品是否為妥適或不妥適用於一次試驗。
於另一面相，本揭示提供經由軟體、韌體或硬體而可建置之一種自動化系統，因此當識別為不妥適或無法確保之樣品時可中斷處理。
於另一面相，本揭示提供一種於執行至少一項一次試驗前使用樣品保證讀取器來測定至少一個樣品之濁度，其中該一次測試為HPV一次或二次篩檢試驗。
於另一面相，本揭示提供一種於執行至少一項一次試驗前使用樣品保證讀取器來測定至少一個樣品之濁度，其中該一次測試為病毒感染篩檢試驗。
於另一面相中，本揭示提供一種經由進行包含樣品保證測定模組之一次試驗之自動化系統。
於另一面相，本揭示提供一種用於光學測量系統之樣品容器，該光學測量系統包含用於控制光束之照明角之透鏡，及用於控制發射光之路徑之透鏡中之至少一者。
於另一面相中，本揭示提供一種測定樣品妥適性之方法，包含：使用一處理器接收含有該樣品濁度之測量值之資料；使用一處理器，比較該濁度測量值相對於儲存於電子儲存裝置中之一項或多項特化標準；使用一處理器至少部分基於該比較測定樣品妥適性；及提供該樣品妥適性結果之一指標。
於另一面相，本揭示提供一種用於測定樣品妥適性之系統，包含：通訊式耦接電子儲存裝置之一處理器，其中該處理器係建置來：接收該樣品濁度之測量值；比較該濁度測量值相對於儲存於電子儲存裝置之一項或多項特化標準；至少部分基於該比較而測定一樣品妥適性結果；及提供該樣品妥適性結果之指標。
於另一面相，本揭示提供於進行包含一樣品保證測定模組之一次試驗前，於不同容器間移送一樣品之自動化系統。
圖式簡單說明
第1圖為樣品妥適性控制測量系統(「SAM」)之測試剖面圖。
第2圖為SAM之測試剖面圖。
第3圖為稱作為萃取管單元(「ETU」)之一多孔樣品容器之等角視圖。
第4圖為適合用於ETU中所含樣品之8-通道SAM之等角視圖。
第5圖為適合用於ETU中所含樣品之8-通道SAM之頂視圖，各發射光束路徑通過於使用期間相當受保護而免於刮擦之ETU之一部分。
第6圖為適合用於結合於樣品處理系統內部成為一模組之模組式8-通道SAM之等角視圖。
第7圖及第8圖顯示藉qPCR及樣品濁度測得樣品細胞度間之相關性。
第9圖顯示藉光學細胞計數測得之樣品細胞度與藉qPCR測得之樣品細胞度間之相關性。
第10圖顯示樣品濁度與藉光學細胞計數測得之樣品細胞度間之相關性。
第11圖顯示藉qPCR測得之樣品細胞度與樣品濁度間之相關性。
第12圖顯示對一串列臨床檢體稀釋藉光學細胞計數測得之樣品細胞度與樣品濁度間之相關性。
第13圖顯示對一串列臨床檢體稀釋藉光學細胞計數測得之樣品細胞度與藉qPCR測得之樣品細胞度間之相關性。
第14圖顯示對一串列稀釋藉qPCR測得之樣品細胞度與樣品濁度間之相關性。
第15圖顯示對1076個樣品之一族群藉qPCR測得之樣品細胞度與樣品濁度間之相關性。
第16圖顯示對第15圖所示樣品具有大於4毫升體積之一子集(PC_NOR=普澤西特(PreservCyt)/正常)藉qPCR測得之樣品細胞度與樣品濁度間之相關性。
第17圖顯示對第15圖所示樣品具有小於4毫升但大於2毫升之體積之一子集(PC_QNS=普澤西特/數量不足)藉qPCR測得之樣品細胞度與樣品濁度間之相關性。
第18圖顯示對第15圖所示樣品具有小於2毫升之體積之一子集(PC_QNS=普澤西特/數量不足)藉qPCR測得之樣品細胞度與樣品濁度間之相關性。
第19圖顯示細菌細胞數目與濁度間之相關性。
第20圖顯示細菌細胞數目與濁度間之相關性。
第21圖顯示總細胞數目(細菌細胞與人細胞之混合)與濁度間之相關性。
第22圖顯示自只含有介質之空白無刮痕樣品管測得之濁度值之分布。
第23圖顯示於一給定濁度截取值將被保留或去除之樣品分量。
第24圖至第25圖顯示對根據樣品體積被再劃分成為亞群之臨床樣品藉qPCR測得之細胞度分布及濁度值分布。於各圖中，各組的左柱係對應於體積大於4毫升之樣品(N：669)；各組之中柱係對應於體積為2毫升至4毫升之樣品(N：172)；及各組之右柱係對應於體積小於2毫升之樣品(N：240)。
第26圖顯示續沛(SurePath)(「SP」)樣品之濁度分布。
第27圖顯示用於樣品妥適性控制測量系統(「SAM」)之一工作模型之濁度標準品的信號/參考測量值。
第28圖顯示8-通道SAM之一工作模型之校準曲線。
第29圖顯示於8-通道SAM之一工作模型中對各個通道中之樣品體積之相依性。
第30圖顯示隨著時間之經過樣品的沈降及濁度測量結果。
第31圖顯示對五個濁度標準藉8-通道SAM所得濁度測量值與藉赫屈計(Hach Meter)測得之濁度之相關性(R2 =0.9993)。
第32圖顯示對臨床樣品藉8-通道SAM所得濁度測量值與藉赫屈計測得之濁度之相關性(n=235；R2 =0.83)。
第33圖顯示藉8-通道SAM所得空白樣品之濁度測量值之分布。
 較佳實施例之詳細說明
此處所述方法及裝置可用於多項工業及應用，以及使用多種樣品類型改良試驗結果的品質。如此包括舉例言之男性及女性人類組織樣品，組織樣品接受檢定分析是否有特定異常細胞類型、病毒、細菌等的存在。於揭示所提供之若干特定實例係有關經由評估組織樣品是否受到一個或多個病毒種系的感染來改善婦女健康。本實例中特別令人感興趣者為多種人乳突瘤病毒種系諸如HPV 16、HPV18、及HPV 45之分析檢測，該等病毒種系屬於已知可引發婦女子宮頸癌的高風險種系。使用既有方法檢測病毒通常係藉刷子/拭子刮取婦女病人子宮頸所採樣的上皮細胞懸浮於液體介質。介質的性質通常可避免***細菌或污染物的生長，提供上皮細胞及自由態病毒的穩定，且允許樣品分開用於多項試驗，允許檢測HPV或HPV感染結果，包括組織學檢查、免疫學檢定分析及DNA檢定分析。
不當的樣品取得或污染可能由於代表性自由態HPV病毒DNA的不存在或由於感染細胞的不存在結果導致獲得陰性結果。某些HPV病毒篩檢試驗諸如得自德國希爾登凱金公司(Qiagen GmbH)之混成捕捉(Hybrid Capture) 2(「凱金」)可檢測低抵5000個病毒複本之濃度。某些樣品獲得方案允許由醫療人員使用子宮頸刷子或拭子自女性病人子宮頸區刮取細胞。醫療人員即刻於在工廠內填裝有轉運介質諸如普澤西特(PreservCyt)(得自麻省馬波羅荷洛吉公司(Hologic Inc.))或續沛(SurePath)(得自北卡羅萊納州柏林頓BD診斷公司(BD Diagnostics))之新的樣品容器內即刻渦轉該刷子。容器加標記、密封，然後送至檢驗室接受HPV篩檢。此時介質與樣品組合且被視為相同。處理過程中可能出現若干形式的樣品取得錯誤或污染。若醫事人員並未以適當力道或技術刮取子宮頸內襯，則無法於刷子/拭子上收集代表性數目的上皮細胞。細胞自刷子/拭子移轉至轉運介質可能不良，結果導致較少或無代表性子宮頸細胞移轉入介質。收集期間可能發生污染。污染物諸如粉塵、細菌、顆粒、DNA酶、毛髮、黏膜等可能進入樣品容器、介質或樣品。另外，未使用的轉運介質容器可能被錯誤標記為病人樣品而送到檢驗室。此等樣品可能不適合用於試驗。若不適合的樣品接受檢驗，則將獲得陰性結果報告，而未能實際上測得病人的真健康狀況，如此病人健康仍屬未知。
當於檢驗室接收到樣品時，不妥適的樣品將從一次獲取容器內移轉及檢定分析來測定轉運介質內是否存在有HPV病毒。若干檢定分析要求流體均化至某種程度，而其它檢定分析則否。於自一次容器或隨後的容器移轉期間，對該檢定分析可能獲得不具代表性的樣品版本。舉例言之，若樣品係團聚於或沈降於樣品容器內，則取一份樣品可能無法代表整個樣品。非破壞性且同時耗用最小量樣品之建立樣品保證方法特別有利，原因在於樣品珍貴，樣品的獲得經常對病人造成微創傷而對一給定病人不可頻繁進行。本發明之較佳實施例可提供前述效果中之一者或多者，但另外或此外可實現其它效果。
無論病人真健康狀況如何，不妥適的樣品經常導致陰性HPV結果。基於qPCR檢測系統諸如羅氏與三波(Roche and ThirdWave)分銷的系統提供內部管制允許於被分析物檢測試驗期間驗證DNA的擴增。特定言之，此等試驗放大且檢測β-球蛋白。定量所存在的β-球蛋白濃度，提高樣品的保證性。β-球蛋白用來近似估算每毫升樣品介質中所存在的細胞數目，但β-球蛋白並非直接計算上皮細胞數目。也可使用其它「管家」基因諸如組織蛋白腖。由於β-球蛋白的測定係使用當同時作為被分析物試驗執行時被分析物的相同試劑。結果，試驗結果的可信度增高，但由於工廠之後對樣品妥適性的瞭解，無法節省時間、勞力或材料。
本文揭示提供於被分析物測定之前，以非破獲性空白差異對照或細胞度對照測定樣品妥適性之方法。當空白差異對照為測定空白介質與空白介質組合妥適性樣品間之物理性質變化之測定方法時，於本特例中，物理差異係源自於樣品與介質組合之細胞密度或細胞度。
於一個面相，本揭示說明一種用於建立樣品保證之裝置(對用來判定病人健康狀況之一給定臨床被分析物而言，欲測試之樣品妥適性之可信度)。顯示用於測定子宮頸組織樣品之樣品妥適性之裝置實例，該子宮頸組織樣品係收集於轉運介質或已經經過濃縮且再懸浮於用於隨後被分析物或妥適性測定之液體介質。此等方法可用作為下游診斷試驗的品質管制，諸如檢測於相同樣品內是否存在有HPV病毒。也可用作為於其它分子診斷試驗諸如披衣菌、***等診斷試驗前的品質檢查。
具體實施例可用於DNA分析檢定分析前分析樣品，諸如由凱金公司發展的下一代混成捕捉高風險(Next Generation Hybrid Capture High Risk)檢定分析。可結合藉此處所述系統實施例測定樣品妥適性一起進行之此種及其它檢定分析之實例，係揭示於美國臨時專利申請案第61/231,371號，申請日2009年8月5日，名稱「使用陰離子交換基體單離核酸之方法及套件組」及第61/147,862號，申請日2009年1月28日，名稱「利用混成捕捉技術之序列特異性大體積樣品製備溶液」，二案全文以引用方式併入此處。
雖然此等裝置可於一項或多項被分析物試驗檢測前、中或後檢測樣品妥適性，但經常較佳係於樣品處理之早期檢測樣品妥適性以節省成本。當測定樣品為不妥適而停止對該樣品的下游處理，可實現成本的節省。但儘管樣品不妥適仍然可繼續處理，舉例言之，即使樣品為不妥適，無法對陰性結果提供可靠的詮釋，雖言如此陽性結果(若獲得時)仍然有意義。
本揭示方法實例係使用類似於用於濁度計之光散射技術來估算流體中之顆粒濃度。例如，於環境科學領域，水源的濁度位準作為水品質的估值常使用單通道濁度計測定。濁度位準之一般測量方法係以光照明一液體樣品，於自光源照明的入射角檢測散射光。潛在的物理原理為液體中的顆粒物質吸收、反射、折射及繞射光。液體樣品上顯示的光將被吸收或被散射超越該照明光的入射角。通常檢測得愈多散射(偏離照明軸線)光，則流體內之顆粒量愈多。照明波長經選擇，允許感興趣的顆粒反射。於此種情況下，通常被反射偏離上皮細胞或自由態病毒的波長令人感興趣，原因在於不欲受理論所限，相信對子宮頸樣品或其它類似的樣品，細胞膜的反射偏離比較自由態病毒的反射偏離較可能導致可檢測的現象。
照明光源強度決定對具有某個顆粒密度之樣品(細胞度)可達成的信號對雜訊比。強度愈高，則減低信號的吸光比愈小。較佳光係聚焦於本體液體樣品體積內，遠離樣品容器表面，來確保散射測量值對整個樣品體積具有代表性。市售單通道濁度計，例如購自VWR及赫屈(Hach)公司之濁度計使用寬頻鹵素燈(鹵素光燈泡)及近紅外光發光二極體NIRLED)作為一次照明光源來評估濁度。使用寬頻光源是一種確保出現光散射的「散彈槍」辦法，但可能犧牲信號對雜訊比，因而減低裝置的檢測及解析度極限。此外，寬頻光源可能相對於單色光源浪費能量才能達到對液體樣品中之一給定顆粒濃度的相同信號位準。
較佳，光強度的控制及測量用來減少散射讀數間的變異性。舉例言之，於獨立測量光源的照明強度之閉路系統中，直接控制流至照明光源(例如LED)的電流可產生恆定照明強度。同理，照明光源強度可單純於較為開路方法中檢查來確保其係於可接受的強度範圍。基於光源之開路強度對最終檢測得之散射做校正，也可應用於預先經過校準的系統來校正來源光強度之變化。此處所述某些具體實施例基於測量得之來源強度作為減少讀數變異性的主要手段，使用後述開路範圍檢查及對所檢測之信號做校準前之校正。
光源較佳可產生單色光之光源實例包括雷射光世代；使用雙色濾鏡、選擇性吸收濾鏡(例如有色玻璃)、干涉濾鏡將寬頻光源濾波，或發光二極體。照明光源的單色程度愈高相信為愈佳，原因在於可減少樣品容器、液體樣品及周圍裝置組成材料的自發螢光量，特別當該單色光係於NIR光譜時尤為如此，此處通常較少材料被激勵成自發螢光。較佳避免自發螢光，原因在於容易升高背景信號及減低系統的信號對雜訊比，可能減低系統的檢測度及解析度極限。
光源之光束角及相干性影響樣品的散射圖案及表現型態。照明光源展開太接近於容器表面，若容器材料可作為導引至檢測器的光導管，則光源可能將光直接散射入測量檢測器，或將光直接反射或折射入測量檢測器。為了避免此種可能的背景信號來源，較佳係照明樣品檢測器的視野範圍內樣品的核心而非樣品的大剖面。典型地，於檢測器之視野範圍內照明體積愈大，則結果對整個樣品的本體體積愈具有代表性。
周圍光排除對於具有低檢測極限或接近截取值的精細解析度之光學裝置特別令人感興趣。較佳減少或去除背景雜訊位準。光學設計技藝界已知若干去除周圍光之方法，但此等方法顯然尚未應用於使用光散射法測定分析試驗前之樣品妥適性之特定應用用途。一種移除周圍光之方法係將照明光源偏極化，然後只檢測具有相似偏極化的光，藉此移除來自於其它可能的周圍光源之隨機偏極化光。如此減少周圍光的檢測位準。若已知周圍光光譜，則自可檢測光中濾波去除若干已知波長乃另一種排除周圍光的手段。於與常見周圍光源之強度變化頻率不同的且可區別的頻率，調變照明光源強度，允許自所檢測之信號中剔除電子信號或剔除周圍光之演算方式後處理信號。舉例言之，類比巴特沃(Butterworth)帶通濾波器或分開的雀比奇(ChebyChev)濾波可區別10Hz照明光源與50Hz至60Hz周圍光源及其諧波。
剔除周圍光源之最基本方法係以物理方式隔離/阻斷樣品及檢測器不接觸周圍光。於自動化系統中隔離可能提高成本、品質管制、總成的複雜度，或需要額外活動部件及對照。如此，某些實施例使用其它裝置剔除光同時建立更佳可接取的光路徑。
檢測波長通常係基於使用的檢測器於感興趣波長之敏感度選定。較佳於自樣品散射光範圍該檢測器之反應性可為人所接受。於若干具體實施例中，後述範圍係與照明光源之光相同波長。
來自於藉該樣品容器內之樣品所形成之彎液面的氣液面之反射比對信號造成負面影響，因此經由適當定位該檢測器，使得可檢測的被照明的樣品體積的位置遠離彎液面，可改良信號對雜訊比及限制對該散射信號之體積效應。
樣品容器或其開口允許照明光及散射光的傳輸。容器本身可有利地用來濾波、偏極化、或單純發射感興趣的光。本揭示之實施例將選擇於感興趣波長對該照明光源光具有高透射比之材料製造的樣品容器。容器之幾何形狀可經設計來避免照明光源或周圍光被導管導引至測量檢測器。容器的幾何形狀可作為透鏡，該透鏡係用來聚焦、散焦、旋轉、或以其它方式修改照明光源光束及/或由被檢測的散射器發出光線之形狀或角度來減小或放大該測量檢測器所可見的核心照明樣品體積，俾加強樣品妥適性的測定。本揭示實施例可使用樣品容器作為控制照明光束角度或檢測光的裝置。額外實施例係使用於照明光或散射光路徑內部使用透鏡或其它光學元件之光學操作。
樣品保證讀取器/計可包含單一或多個通道來統一或分開讀取一個或多個樣品。讀取器可包括均化機構，諸如軌道或線性攪動器/振搖器其於讀取之前或讀取之中混合樣品。另外，該讀取器/計可藉中央軟體或可規劃邏輯系統控制，其允許分開的軌道或線性攪動器/振搖器於讀取前或讀取中均化樣品。攪動器/振搖器可為以均化樣品之方式移動樣品容器的機器手臂。攪動器/振搖器機構也可由滴量器之操作提供；舉例言之，當滴量器用來將樣品移至其中測量樣品保證的容器時，滴量器本身的移動或滴量器的配送動作可提供期望的均化作用。
於讀取期間或於多次讀取期間，讀取器或樣品容器可經或可未經旋轉/掃描來演算方式綜合而報告樣品保證位準的單一測定值。轉動/掃描樣品的優點係允許更具代表性的詮釋樣品保證位準及/或減低對樣品容器之光學澄清度(缺乏刮痕、挖痕等)之相依性。
樣品保證讀取器包含一種通訊架構，該架構係與更大型自動化系統架構可相容來控制讀取器的定時及功能。讀取器可能危害放大檢測器所產生的小電流或小電壓之檢測器板。檢測器板之一個實例含有8具測量檢測器及其放大電路。讀取器可包含以光源照明樣品的照明板。照明板之一個實例含有8顆LED及其驅動器電路。讀取器可包含一功率分配架構，其取用外部提供的電力及分配該電力至模組中的功能性電子裝置。相信於發展時，用來供電、檢測、發射或解譯裝置所使用之電力及信號之電子裝置可安裝於實際光學測量位置的遠端。也須瞭解增加設計來改良裝置之電磁可相容性(EMC)諸如法拉第籠屏蔽、增加解耦電容、避免接地迴路等也可改良於寬廣多種環境之裝置效能。
實際上，屬於塑膠或玻璃之全部樣品容器皆具有可能改變光散射樣式之濁度或刮痕。具體實施例可利用樣品容器的旋轉/掃描來緩和此等效應。其它具體實施例可將測量檢測器採用於使用中及/或製造中不可能被刮擦的位置。另外或除了此等方法之外，於樣品移送至自動化系統之前或於樣品容器本身的製造過程早期，可做品管檢查樣品容器是否有刮痕。可使用額外保護膜、口袋或包裝來於讀取前保護樣品容器的無刮痕本質。
同理，較佳係於製造中控制且測定樣品於收集過程中可能混合的轉運介質或檢定分析介質的濁度。預先篩檢介質品質，將允許更密切背景位準控制，因而改良信號對雜訊效能。此外，介質濁度之絕對位準將影響系統的檢測極限。
定義
樣品為接受測試來測定有關該實體特性的一個子集或一整個實體。例如，人體可提供血樣，血樣將測試HIV病毒DNA被分析物。發現HIV陽性的個體將評估其血液中之病毒載荷量。由本文件所述方法可獲益之常用樣品類型為血液、血漿、尿液、組織刮取物、毛髮樣本、氣體樣本、液體樣本、固體樣本、或顆粒樣本，取決於應用用途及產業而定。
樣品保證係定義為樣品妥適性的可信度。
樣品妥適性係定義為其中試驗結果對該接受試驗實體的真實際狀況具有代表性或預測性的樣品，諸如個體體內是否存在有特定病毒(諸如HPV 16或其它)。
現在將參考下列特定非限制性實例說明本發明。
現在參考第1圖，顯示可測量樣品濁度之樣品妥適性控制測量系統(「SAM」) 100之第一實例。樣品提供於由殼體120所支載的容器150內。光源102可包含一LED，例如順著示意顯示的照明光束路徑104發光而照明樣品112。光被懸浮於樣品112內部的顆粒反射或散射，及順著發射光束路徑106行進至樣品檢測器108。樣品112有足夠量使得彎液面113係高於反射光或散射光的樣品112部分，部分光順著發射光束路徑106行進。參考檢測器110檢測由光源102發射順著參考光束路徑111之光來允許校正光源102發射之光強度。參考檢測器110檢測之光強度可用來校準來自光源102之光輸出(例如經由改變至本光源之電壓)，做為參考使得可經由比較藉樣品檢測器108及參考檢測器110檢測得之光信號來計算濁度，及作為光源102是否功能正常或功能異常而須更換的指標。
參考檢測器可用來監視LED光輸出之變化。標準市售或客製濁度校準器(呈不同顆粒/細胞密度或尺寸之特徵性顆粒/細胞懸浮液溶液)可用來映射測量檢測器與濁度位準間之關係。此外，映射濁度關係作為測量檢測器及參考檢測器之函數，可允許以光源之合理變化來校正濁度續數。一個映射實例為接近擷取值範圍之線性映射，此處測量檢測器信號對參考檢測器信號之比逐塊線性映射至多點(例如2點、3點、n點)校準曲線。
為了避免需要多個校準點來處理系統中自然的非線性度，檢測照明光源是否可工作及檢測器是否可工作的能力可結合入系統。例如，裝置可具有照明光源以已知頻率散光來驗證檢測器及光源二者皆可工作可有或可無樣品容器的存在。光通道的驗證則允許飽和信號於樣品妥適性的定性測定中被視為妥適樣品。例如，對飽和測量檢測器信號，樣品妥適性可單純報告為正，或另外報告為大於200,000細胞/毫升。此種光通道本身試驗允許經由將類比至數位轉換器(ADC)設定為更精細解析度來允許設計達成更高的解析度。典型地，已放大信號依各檢測器可於0伏特至12伏特間變化。若16位元ADC被設定為0.7伏特來涵蓋整個0-49NTU(濁度計量濁度單位)之範圍，則可改良接近截取值的解析度及減低樣品保證測定中之灰色地帶的可能。另外，報告整個婦女族群之獨特定量結果所需完整動態範圍可能要求檢測接近700FNU(佛馬金(Fromazin)濁度計量單位)。如此要求ADC設定於10伏特範圍，因此可顯著減低讀取器之接近擷取值的解析度。當期望樣品妥適性之定量測量時，可積極改變讀取範圍內的增益，或透過濁度的額外讀數來達成整個濁度範圍之更高敏感度。此種裝置也允許二進制式，因而不再需要主動增益控制。可進行高敏感度有限範圍讀取及低敏感度擴大範圍讀取之檢測電路之組成及規劃為技藝界所已知，在此無需詳細說明。
讀取器可透過通訊埠報告已校正之讀數至自動化系統。然後軟體比較該數值與對該樣品類型之預先界定的絕對截取值。具有光散射讀數大於或等於截取值之樣品可視為妥適。數值低於截取值之樣品被視為細胞度不足。
現在參考第2圖，顯示可測量樣品濁度之樣品妥適性控制測量系統(「SAM」) 200之另一實例。於此實施例中，發射光及/或檢測光行進通過成形為封閉、大致上封閉或篩檢偏離路徑之光束通道行進。光束通道可包括透光介質諸如空氣、氣體、玻璃、透明塑膠等預期可減少來自於周圍光之背景值及減少來自於樣品容器150中之缺陷之散射光。光源202之發射光行進通過輸入光束通道209及照明樣品212。懸浮於樣品212內部之顆粒反射光或散射光，若干光行進通過發射光束通道214至樣品檢測器208。由樣品容器250之被照明部分252中之刮痕或不完美散射的光被禁止或防止藉發射光束通道214行進至樣品檢測器208，可能減少背景數值，使得濁度測量值對樣品容器250之被照明部分252之刮痕相對不敏感。同理，參考檢測器210檢測由光源202順著參考光束通道216發射之光，參考光束通道216排除反射光、散射光、及周圍光，如此可減少到達參考檢測器210之背景信號與改良本測量方法之可信度。
第3圖顯示可用於此處所述方法及系統或用於其它方法作為中間容器之萃取管單元(「ETU」) 1100之具體實施例。本ETU 1100係類似於或相同於參考第4圖至第6圖之說明。典型地，ETU將包括識別特徵諸如條碼、及夾緊表面，該表面可協助藉自動化系統固持及/或移動ETU。ETU內部之個別樣品位置或試管可稱作為ETU管或ETU位置。
ETU 1100之實例包含一框架1102及多根試管1104。本實施例中，提供8根試管1104。但其它實施例中，也可使用12管ETU及有其它數目的試管之ETU。框架1102包含剛性結構，該結構有足夠強度來於整個處理步驟期間遞送其中所含的試管1104及樣品而於所施加的負載之下實質上並未變形。材料於系統內之操作溫度也須穩定且足夠強勁。適當材料例如包括金屬、木材或塑膠(例如尼龍、聚氯乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯類諸如ABS及HIPS等)。
試管1104可包含任何適當形狀。所示實施例有圓底，其可協助渦旋混合及減少滴量無效體積。錐形底試管可共享此等特性。其它形狀諸如平底試管可用於其它實施例。試管1104之尺寸及形狀可經組配來協助上游處理或下游處理。試管1104可由任一種適當材料諸如玻璃或塑膠製造。為了協助光學試驗，諸如濁度測試中之光學試驗，試管1104較佳部分或全部係由具有足夠澄清度或透明度可允許期望試驗之透明材料或半透明材料製成。試管1104可與框架1102一體成形(諸如由形成框架1102之相同材料形成或於框架1102內部原位模製)，或分開形成及接合至框架(諸如藉按捺嵌合、黏著劑、扣件、形成於試管1104上的螺紋等)。
試管1104可順著框架1102之縱向排列成行，但於其它實施例中，框架1102可具有不同形狀，試管1104可以任何其它適當陣列或樣式排列。如第3圖所示，框架1102為細長，且有放大端1106，結果導致順著框架1102之一個或兩個長邊形成凹部。於所示實施例中，由上方觀看，框架具有「狗骨」形。由於設置放大端1106的結果，當多個ETU彼此緊密堆積時，凹部於相鄰ETU間形成空間。如此允許夾具接取且個別抓住各個ETU 1100。
第4圖顯示適合用於多通道樣品容器諸如萃取管單元(「ETU」)之樣品妥適性控制測量系統(「SAM」)之具體實施例。ETU係與實例2所述類似或相同。SAM 400包括支載ETU 1100之殼體420。光源、檢測器、及ETU試管個別之建置類似實例1所述組態。於所述實施例中，各ETU試管1104有其本身的光源、樣品檢測器、及參考檢測器，但於附圖並未全部顯示或標示。來自各根試管下方光源之發射光照明各個樣品。懸浮各樣品內部的顆粒反射光或散射光，部分光行進通過各個發射光束通道414至各個樣品檢測器408。各個參考檢測器410檢測順著各參考光束通道416由各光源發射之光。各樣品檢測器及參考檢測器係安裝於一撐體422上，撐體422可包含一印刷電路板。於其它實施例中，多個檢測器及甚至發射器可整合於單一檢測器板，此種板包括於所示8-管系統中之全部八個測量檢測器。
照明光源可為紅LED或NIR LED，有5度或更緊密的光束角照明PS、PETG、PP、PC、PMMA、玻璃、或其它透明材料樣品容器(例如盛裝約1.5毫升樣品介質液體之5毫升圓底試管)。光束角夠窄而可避免到達彎液面前照明試管壁。此外，光束被導引於試管的平坦面或彎曲面，其主要係垂直於輸入照明光束，使得樣品容器壁不可能作用為光導管，原因在於預期此種排列可避免光的總內部反射及部分內部反射。當進入試管時，照明光束具有小點尺寸，縮小光束通過的試管面積。如此，只有此一相當小區對刮擦或混濁敏感，可能影響可用於樣品妥適性檢測的光數量及光方向。較佳本區維持無刮痕，但預期某些系統可耐受刮痕及其它瑕疵。測量檢測器的視野可包括被照明的核心流體區部分之大部分，及未照明核心區的小部分，來排除周圍光及來自於反射的二次散射而非一次照明。
於第4圖所示實施例中，各檢測器之位置係可檢測偏離ETU縱軸之夾角順著光束路徑發射之光。於此建置中，發射光束路徑較佳係行進通過ETU之受保護表面，亦即於使用期間較不可能對另一表面摩擦的ETU部分，如此被保護免於刮痕。於所示ETU 1100之實施例中，最可能被刮擦的試管表面係在切線切過全部試管外徑之順著該外部平面之試管側上，換言之，垂直於ETU 1100之長軸之試管部分。各試管1104之其餘部分藉相鄰試管1104至少保護至某種程度，原因在於物件必須至少部分介於相鄰試管間而接觸且損傷或刮傷試管表面之受保護部分。但末端試管並非必然有此種保護，發射光束路徑行進通過可能的暴露位置。例如於第4圖之實施例中，於最右側位置的檢測器(附接至撐體422)可通過未被相鄰試管保護的最右側試管部分檢測濁度。
現在參考第5圖，以俯視圖顯示SAM 500之另一個實施例。於此實施例中，四根最左側試管用之檢測器係位在ETU之與四根最右側試管之檢測器不同邊。此外，不似第4圖之實施例，檢測器全部皆定向為通過受相鄰試管保護之試管部分檢測濁度。於所示實施例中，各ETU有其本身之光源、樣品檢測器及參考檢測器(諸如第1圖或第2圖所示)，但圖中未顯示或未標示全部。各樣品檢測器及參考檢測器係安裝於撐體522，撐體522可包含印刷電路板。ETU 1100之個別試管內所含之樣品係藉光源由底下照明，自各樣品內所含顆粒散射光或反射光部分行進通過光徑514及藉樣品檢測器508檢測。參考檢測器510檢測自光源502順著參考光束通道516發射之光。光徑514、516及檢測器508、510係定向於相對於ETU 1100長軸之斜角，因此光徑通過試管之經保護部分(亦即相鄰於另一根試管或可免除接觸環境之其它結構部分)。此種建置也可協助多根SAM 500相鄰於彼此更緊密設置。
現在參考第6圖，檢測可結合入樣品處理系統成為一模組的8-通道SAM 600。殼體620含有類似於前文說明可安裝於自動化系統內之多通道SAM的組件。例如，自動化系統可使用個別容器或ETU或類似容器作為方法及系統中之中間容器。此等系統之實例說明於美國專利申請案第12/062,950號，名稱「用於處理子宮頸檢體之樣品製備系統及方法」，申請日2008年4月4日；美國專利申請案第12/588,304號(代理人檔號75820.000401)，名稱「自動化檢定分析及系統」，申請日2009年10月9日；及美國專利申請案第12/588,306號(代理人檔號74708.001001)，名稱「開放平台自動化樣品處理系統」，申請日2009年10月9日，各案全文係以引用方式併入此處。
第27圖顯示樣品妥適性控制測量系統(「SAM」)之工作模組之濁度標準品之信號/參考測量值。濁度標準品(具有已知濁度值之樣品)係使用8-通道SAM測定。信號/參考提供於樣品檢測器測得之信號對於參考檢測器測得之信號比。
第28圖顯示8-通道SAM之一工作模型之校準曲線。信號/參考值相對於濁度標準品之已知濁度值作圖，且將一線性標準曲線配合該資料。
第29圖顯示對8-通道SAM之工作模型之各通道中的樣品體積之相依性。對1.2毫升及以下的體積，電壓顯示對樣品體積的強力相依性，而對1.3毫升及以上的樣品體積，電壓係與體積相對獨立無關。共同考量，結果指示本模型可準確測量具有1.3毫升及以上體積之濁度，而對具有1.2毫升或以下體積之樣品，樣品體積對測量值產生顯著影響。為了提供測量準確度之更大保證，可選用更大的最小體積(例如於下列實例使用1.5毫升最小體積)。第30圖顯示隨著時間之經過樣品的沈降及濁度測量的結果。
實例 實例1 使用赫屈濁度計比較8-通道檢測系統
使用類似於第1圖至第2圖及第4圖至第6圖所示之8-通道檢測系統進行濁度測量，與使用濁度計(實驗室濁度計型號2100N，赫屈公司，科羅拉多州羅芙蘭(「赫屈計」))所做的濁度測量值。使用各裝置測量5個濁度標準品，獲得相關係數R2 =0.9993(第31圖)。此外，如第32圖所示，對於普澤西特介質(得自凱金公司)之臨床檢體，使用赫屈計及8-通道檢測系統所得測量值間有強力相關性(n=235；R2 =0.83)。結果，進一步證實使用8-通道檢測器系統實例所得測量值之有效性。
於此處所述實例及其它實例中，使用赫屈2100N或赫屈2100AN濁度計進行濁度測量大致上係根據下列方案進行。啟動濁度計，作動電腦上的「收集」程式。由頂選單選定「儀器」，然後「啟動」，然後「赫屈2100AN」。選定資料目的地，及以樣品濁度樣板啟用試算表。由頂選單選擇「儀器」，然後「指令」，然後由指令選單選擇「以1秒間隔做30次讀取」。藉掃描樣品條碼可得樣品ID值。1.5毫升至2毫升樣品體積滴量入聚苯乙烯試管或PETG試管，渦旋2分鐘然後置於赫屈計樣品插槽。然後由「指令選單」中選定「發送」。完成時，選定位在頂選單的「停止」鈕。最後，選擇「儀器」然後「退出」。
於本實例及此處所述其它實例中，使用8-通道濁度計之濁度測量大致上係根據如下方案進行。於電腦上，開啟SAC-UI(樣品妥適性控制-使用者界面)；如此啟用「凱金SAC界面模擬器」。SAC UI有四個指令選項。第1指令選項為「操作指令」、第2「診斷指令」、第3「校準指令」、第4「製造指令」。操作指令允許使用者改變使用者模式及獲得濁度測量值。校準指令允許使用者形成或上傳校準資料。由操作指令，選擇MD-設定模式，該模式設定為「M」(製造)；本模式允許使用者形成或上傳校準資料。然後選定「校準指令」，然後選定「CD-上傳校準」來上傳校準資料。其次，選定「操作指令」及模式設定為「O」(操作員模式)，解除校準資料存取作用狀態，防止意外改變單元的校準。一旦已經完成此等步驟，系統方便讀取樣品濁度。樣品以1.5毫升最小體積載荷於8-通道固持座。「操作指令」提供讀取及顯示濁度值兩項功能。「BG-開始讀取」發送欲讀取濁度之信號。「SA-獲取樣品」發送欲顯示濁度值之信號。點選「SA-獲取樣品」俾便瞭解濁度值。首先，選定BG-開始讀取，選定SA-獲取樣品。一旦完成濁度的讀取，於BG-開始讀取及SA-獲取樣品二欄上的錯誤框將顯示「無誤」。然後始於通道1(通道1、通道2、...通道7、通道8)，「結果框」顯示各通道的濁度結果。濁度值顯示至小數點三位數。所顯示之值為NTUx10。例如，若顯示之數值為「053」，則濁度為5.3NTU；若顯示數值為「235」，則濁度為23.5NTU。
實例2 空白樣品之濁度測量
測定「空白」樣品(只含水或普澤西特介質)之濁度。現在參考第33圖，空白介質對濁度值之貢獻極少。特別75%試管具有0.2NTU及以下之讀數，而97.5%具有0.9NTU之讀數。此等較高讀數(大於1.0)顯然係由於試管上的刮痕以及包裝方式。經由於製造、包裝或處理期間，減少對試管的刮痕進行測量，及/或進行測量減少刮痕的效應，諸如通過試管較不可能被刮傷部分透射光至樣品及至檢測器，例如如前文說明可減低刮痕的影響。
實例3
藉濁度測量測得之樣品細胞度、細胞計數、及DNA定量之比較。
本實例說明藉濁度測量測定之樣品濁度、藉血球計量術直接細胞計數、及藉qPCR之DNA定量之比較研究。後二方法，亦即藉血球計量術直接細胞計數、及藉qPCR之DNA定量，為廣為人所接受之細胞度測量方法，藉血球計量術之直接細胞計數一般被視為最準確方法。此等實驗係使用於馬里蘭州羅利之一群無偏廢婦女族群收集得之子宮頸樣品進行。收集數百個樣品及評估來獲得此初步資料。某些研究使用少於可得病人樣品總數。普澤西特(PC)樣品係得自馬里蘭州羅利之子宮頸中心。於濁度測量值、細胞計數及得自DNA量化之細胞密度進行比較研究。赫屈計測量含2毫升樣品液分之75毫升聚苯乙烯管內之濁度。
使用血球計來定量22微升樣品體積之細胞(N=99)。附有螢光檢測之史特吉(Stratagene)即時熱循環器用來使用qPCR ABIβ球蛋白對照組定量DNA(N=691，N=398)。然後DNA之定量轉換成細胞密度(細胞/毫升)供比較用。大部分樣品含有10,000-1,000,000細胞/毫升獲得大於10NTU(FNU)之數值。空白PC介質(N=100)驗證使用赫屈計2NTU之99.5% CI臨界值。配合此等資料之對數曲線顯示於第7圖。馬里蘭州羅利族群顯示qPCR值與濁度值間之中間相關性，R2 係等於約0.36。此等結果顯示待測族群本質及濁度與細胞度之實際關係係接近樣品妥適性之截取值。過度取樣典型族群，找出截取值範圍之數值(大於40NTU)，發現藉β球蛋白測得濁度與細胞密度間具有r2=0.52(N=398)之中等相關性(第8圖)。
為了測定變異性係藉特定樣品妥適性方法所造成或為實際樣品的變異性，濁度方法及qPCR方法比較人類細胞之血球計量術(手動細胞計數)估值。兩種方法相對於手動細胞計數方法作比較，發現兩種方法與細胞計數高度相關，但濁度法的相關性較高。現在參考第9、10及11圖，99個隨機選擇的低細胞度樣品分析濁度、β球蛋白qPCR、及血球學。濁度測量值與血球學間之相關性(R2 =0.7586)優於β球蛋白qPCR與血球學間之相關性(R2 =0.5722)，(濁度與qPCR間之相關性為R2 =0.5861)指示比較qPCR，濁度為測量細胞度之更準確方式。
為了進一步驗證樣品變異性關係及減小樣品變異性效應，5個細胞密度樣品做一系列稀釋，找出細胞計數與濁度間之相關性相當大，濁度或β球蛋白相對於細胞計數之r2大於0.89(第12、13及14圖)。本證據證實須定義截取值確保對90%至100%試驗族群之樣品妥適性。
現在參考第15圖，對普澤西特介質中超過1000個臨床檢體藉濁度測量及qPCR值評估細胞度，顯示濁度與細胞密度(細胞/毫升)間有大的相關性(R2 =0.672)。有不同樣品體積之資料子集係個別顯示：大於4毫升體積(N=669，R2 =0.311)(第16圖)；大於2毫升至小於4毫升體積(N=172，R2 =0.6004)(第17圖)；及小於2毫升體積(N=235，R2 =0.657)(第18圖)。總而言之，對普澤西特介質中超過1000個臨床檢體之此項濁度值及qPCR值比較研究，顯示濁度與細胞密度(細胞/毫升)間有大的相關性(R2 =0.7)。
於本實例及此處所述額外實例中，細胞計數大致上係根據下述方案進行。樣品使用機械混合器以4000rpm混合30秒。徹底混合後，然後滴量50微升樣品入1.5毫升離心管，添加5微升細胞染色(Cyto-stain)染料至樣品及混合。然後樣品-染料混合物於室溫培養30分鐘。使用去離子水然後70%酒精清潔血球計及蓋玻片，乾淨的蓋玻片小心放置於血球計上。然後滴量11微升樣品-染料混合物移至該腔室；然後藉毛細作用均勻分散。小心一旦已經添加樣品後不要移動蓋玻片，原因在於移動蓋玻片可能干擾細胞的均勻分布。透過顯微鏡觀看血球計，於至少五個1平方毫米面積方塊(各角落四個方塊及一個中心方塊)計數細胞。對下細胞樣品，共計數18個方塊。只有計算含於一方塊內或重疊方塊頂緣及左緣之該等細胞(重疊方塊底緣及右緣之細胞被刪除以免過度計數或重複計數)。若每個1平方毫米面積少於50個細胞或多於200個細胞，則調整稀釋程度及重新計數樣品。細胞濃度之計算如下：首先，細胞數除以計數方塊數目獲得每個方塊之平均細胞數目。每個方塊之平均細胞數目乘以104 而獲得於所計數樣品內之每毫升細胞數目；最後，若樣品已經稀釋，則此結果乘以稀釋因數來獲得原先未稀釋樣品中每毫升的細胞數目。
於本實例及此處所述其它實例中，自細胞萃取DNA係使用凱昂(QIAamp)萃取方案進行(QIA96最小洗提方案(QIA96 MinElute Protocol)-用於DNA單離)，大致進行如下。當套件組為新的時，藉添加30毫升乙醇至試劑瓶製備緩衝液AW2(連同13毫升預先計量部分)，緩衝液AW2瓶加標記顯示已經添加乙醇。試劑於室溫保持安定一年。全部樣品及試劑ATL、AL、AVE、AW2調整至室溫。深孔板加熱器啟動及平衡至56℃及70℃。足量緩衝液ATL以80：20比例混合蛋白酶K，添加100微升至各樣品。100微升緩衝液ATL/PK混合液添加至S-方塊(S-block)之各孔。然後各250微升樣品添加至S-方塊上的各孔及於孔板振搖器上以1100rpm混合15秒。然後孔板於深孔板加熱器於56℃培養30分鐘。於此培養期間cRNAAVE(參見下文)係根據後文計算經添加至緩衝液AL。然後自深孔孔板加熱器中移出S-方塊，添加250微升含cRNA之緩衝液AL至S-方塊之各孔及於孔板振搖器上以1100rpm混合15秒。然後S-方塊於70℃於深孔孔板加熱器內培養15分鐘。培養中，藉添加900微升水至平衡S-方塊中與樣品S-方塊中含樣品的相同位置而製造平衡S-方塊。然後添加300微升100%乙醇至各個樣品。然後將S-方塊加蓋及於1000rpm混合15秒，每5秒短暫暫停(混合期間小心避免波濺)。然後S-方塊於室溫培養5分鐘。使用多通道滴量管來將溶解產物自S-方塊移轉至新S-方塊上的QIA96孔板。孔板映射圖係以QIA96孔板上的各個位置加標記。然後QIA96孔板於3000rpm離心1分鐘。除非另行指示，否則以S-方塊置於QIA96孔板下方進行各自離心來捕捉廢量；各次離心後，將S-方塊傾倒及吸漬。自平衡S-方塊中的各個位置移出150微升。緩衝液AW2徹底振搖，750微升緩衝液AW2添加至QIA 96孔板之各孔及置於S-方塊上。然後QIA 96孔板於3000rpm離心1分鐘。添加750微升100%乙醇至QIA 96孔板中之各孔，於3000rpm離心1分鐘，然後又離心3分鐘。然後金偉(kimwipe)(或喜柏(Hyb)孔板)置於QIA 96孔板下方及於深孔加熱器內於56℃培養5分鐘來進一步乾燥膜。然後QIA 96孔板置於洗提孔板上，100微升緩衝液AVE直接添加至膜，然後35微升拓普-E(Top-E)流體添加至各孔及於室溫培養5分鐘。135微升水添加至「平衡」洗提孔板及於3000rpm離心1分鐘。然後試管內之洗提產物以各10毫升一份分配至多個孔板及儲存於-20℃(若同一天使用則儲存於4℃)。為了製造溶液cRNAAVE(攜帶者RNA於緩衝液AVE於1微克/微升)，310微升緩衝液AVE添加至含有310微克cRNA之試管(以凍乾形式提供)，溫和但徹底混合，然後添加1份至個別試管於-20℃儲存。然後製造含cRNA之緩衝液AL如下：對每個樣品，300微升緩衝液AL混合1.5微升cRNAAVE。實例：對96個樣本，混合28800微升緩衝液AL及144微升cRNAAVE。
於本實例及此處所述其它實例中，qPCR大致上係根據下述方案進行。於不含擴增子之室內，自-20℃冷凍器內移出PCR反應組分及允許其完全解凍。允許樣品、基因體DNA、及試劑於室溫完全解凍。製作基因體DNA之一系列稀釋液(分成各整份之前樣品渦旋10秒)。孔板之布局製作如下(STD=標準品；NTC=無樣板陰性對照品。)標準品及對照品佔據16個位置，每個孔板留下80個樣品的位置。
於無塵室內製造PCR母批料混合物。總體積為體積乘以需要反應的數目。使用重複滴量管，如孔板布局圖指示，使用重複滴量將45微升母批料混合物添加至各孔。標準品渦旋10秒，5微升添加至指定孔。自臨床樣品單離的DNA渦旋10秒，添加5微升至各個指定孔(普澤西特樣品)。添加5微升MBG(分子生物學等級)水至陰性對照(NTC)指定孔。
然後於史特吉qPCR機器進行樣品處理回合。熱循環週期規劃如下：
週期1
95℃ 5分鐘
週期2(45X)
95℃ 15秒
52℃ 30秒
72℃ 30秒
於該處理回合後儲存結果。若結果符合如下接受標準，則結果為可接受。標準曲線之斜率係於-2.5至-3.8之範圍；標準曲線之R2 係等於或大於0.90；及孔板中陰性對照之CT 係大於40週期。
實例4 含細菌細胞及人細胞之樣品濁度
因光散射為樣品中之反射性顆粒物質數目及大小二者之函數，測試濁度方法是否可區別來自於原先拭子之細菌與人細胞。現在參考第19、20及21圖，使用赫屈濁度計，由如下資料顯然當分開計算細菌及人細胞時，細菌的大小(約為上皮細胞尺寸的十分之一)並未主控濁度讀數。反而，人細胞的濁度讀數主控形成邊界該線的右下角。此外，細菌細胞數目與濁度之相關性係小於人細胞數目與濁度之相關性。此等結果提示濁度測量之主控因素為上皮細胞數目。
實例5 子宮頸樣品之濁度分布
第22圖顯示得自馬里蘭州羅利族群之樣品之濁度分布(進一步說明於如上實例4)。第23圖顯示馬里蘭州羅利族群基於對一給定樣品妥適性截取值判定，基於其濁度考慮為不妥適的分量。舉例言之，若選用截取值為9，則所研究族群中之2.5%被視為具有不妥適的細胞度。注意表計的臨界值只足夠檢測整個族群。用於HC2 HPV試驗，預期截取值為2至20FNU。藉此方法分析額外族群來判定樣品之代表性本質及截取值之臨床意義用於決定樣品是否為妥適。
實例6 藉qPCR對子宮頸樣品測定濁度及細胞度之分布
第24圖及第25圖分別藉β球蛋白qPCR及使用赫屈濁度計分析樣品之濁度及細胞度之分布及已轉化之細胞計數分布百分比。各圖中，各組的左柱係對應於體積大於4毫升之樣品(N：669)；各組之中柱係對應於體積2毫升至4毫升之樣品(N：172)；及各組之右柱係對應於體積小於2毫升之樣品(N：240)。第26圖顯示根據續沛(「SP」)方案所取之樣品之濁度分布。
實例7 對樣品妥適性之濁度截取值之測定
使用類似如上實例3所述系統之8-通道檢測系統，測得臨床樣品於普澤西特介質之濁度之1%最小值為7.4NTU。99.7%可信度間隔為2至11.6NTU。由800普澤西特樣品之濁度分析，2、7.5、及11.6之截取值將導致0.125%、1%、或1.75%族群之樣品為不妥適。如所述分析額外臨床樣品，藉此提供有較大統計威力的濁度分布測量值，及提供更準確測定可藉一給定濁度截取值排除之族群分量。
實例8 凱金HR HPV DNA試驗之充足臨界值之測定。
如前文討論，當一樣品中之細胞數目不足以允許檢測HPV感染之「簽章」(諸如HPV DNA)時，樣品為不妥適。採用之特定檢定分析指示陽性檢測所需樣品量；如此，隨著檢定分析敏感度的改良，樣品妥適性所需樣品逐漸減少；如此，可就特定檢定分析建立充足臨界值。此外，病人特異性特徵及樣品特異性特徵(諸如污染物及促成濁度之非期望物質)及其它變異性來源預期促成用於檢測之足夠數目細胞的變異。如此，妥適性「臨界值」可表示為樣品量與樣品足夠用於真陽性檢測之概率間之機率關係。
下述實例說明可用於對凱金HR HPV DNA試驗測定充足臨界值之方法(也稱作為HC2檢定分析)。獲得由HPV感染個體所得細胞樣品。藉細胞計數、藉基因體DNA定量、及/或藉濁度測量(也如前述實例所述)測定樣品之細胞含量。然後個別試驗已知細胞數目之一系列稀釋液來建立真HPV陽性臨床樣品獲得偽陰性結果之樣品濃度。藉此方式試驗由多個個體獨立收集的樣品，樣品數目足夠建立樣品濃度與真陽性HPV感染檢測之概率間之統計上有效的相關性。基於濁度測量值與HPV試驗結果間之相關性，然後於所得經界定的敏感度建立濁度臨界值，諸如90%、95%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%、99.95%、或99.99%概率，高於該臨界值濁度之樣品係用於欲檢測之真陽性HPV感染為妥適。
實例9 使用經測定之樣品妥適性來節省試劑或提供樣品保證之方法。
此處使用之方法及機器可用來測定樣品是否含有足量細胞或其它物質而可考慮為妥適獲得對一給定試驗高於預定臨界值的敏感度。如前文說明，對於某些試驗，可獲得陽性結果，即使樣品用於陰性結果提供可信度為不妥適仍然有意義。若未試驗不妥適的樣品，則可節省試劑，可能可降低成本。可事先做內設決策，唯有高於某個妥適性臨界值位準的樣品才接受試驗。另外或除了預設的內設標準之外，可對做決策者顯示指標，然後決策者被提供選項來判定是否須試驗不妥適的樣品(可能凌駕於內設值)。
此外，可提供樣品妥適指標連同試驗結果。樣品妥適性可指示為兩個或多個分開數值(例如「是」、「邊界」、或「否」)。舉例言之，可給予樣品妥適性作為可信度測量值，反映於該給定之測得之樣品妥適性位準，將檢測得陽性結果之統計概率。
此外，樣品妥適性可報告(例如作為個別數值或以摘要或集合形式報告)予負責收集樣品者或其它相關人員包括監督者、經理、訓練師等。樣品妥適性資訊可對此等個體提供回授而揭示是否需要適當校正動作。
雖然已經以實例及較佳實施例說明本發明，但須瞭解此處使用之語詞為說明性語詞而非限制性。可未悖離本發明之廣義面相之範圍及精髓，於隨附之申請專利範圍內做出變化。雖然此處已經參考特定裝置、材料、及實施例說明本發明，但須瞭解本發明並未囿限於所述之特定細節。本發明可擴充至落入隨附之申請專利範圍內之全部相當結構、裝置及用途。
100．．．樣品妥適性控制測量系統(SAM)
102．．．光源
104．．．照明光束路徑
106．．．發射光束路徑
108．．．樣品檢測器
110．．．參考檢測器
111．．．參考光束路徑
112．．．樣品
113．．．彎液面
120．．．殼體
150．．．容器
200．．．樣品妥適性控制測量系統(SAM)
202．．．光源
208．．．樣品檢測器
209．．．輸入光束通道
210．．．參考檢測器
212．．．樣品
214．．．發射光束通道
216．．．參考光束通道
250．．．樣品容器
252．．．被照明部分
400．．．樣品妥適性控制測量系統(SAM)
408．．．樣品檢測器
410．．．參考檢測器
414．．．發射光束通道
416．．．參考光束通道
422．．．撐體
500．．．樣品妥適性控制測量系統(SAM)
502．．．光源
508．．．樣品檢測器
510．．．參考檢測器
514．．．光徑
516．．．光徑、參考光束通道
522．．．撐體
600．．．8通道SAM
620．．．殼體
1100．．．萃取管單元(ETU)
1102．．．框架
1104．．．試管、ETU管
1106．．．放大端
第1圖為樣品妥適性控制測量系統(「SAM」)之測試剖面圖。
第2圖為SAM之測試剖面圖。
第3圖為稱作為萃取管單元(「ETU」)之一多孔樣品容器之等角視圖。
第4圖為適合用於ETU中所含樣品之8-通道SAM之等角視圖。
第5圖為適合用於ETU中所含樣品之8-通道SAM之頂視圖，各發射光束路徑通過於使用期間相當受保護而免於刮擦之ETU之一部分。
第6圖為適合用於結合於樣品處理系統內部成為一模組之模組式8-通道SAM之等角視圖。
第7圖及第8圖顯示藉qPCR及樣品濁度測得樣品細胞度間之相關性。
第9圖顯示藉光學細胞計數測得之樣品細胞度與藉qPCR測得之樣品細胞度間之相關性。
第10圖顯示樣品濁度與藉光學細胞計數測得之樣品細胞度間之相關性。
第11圖顯示藉qPCR測得之樣品細胞度與樣品濁度間之相關性。
第12圖顯示對一串列臨床檢體稀釋藉光學細胞計數測得之樣品細胞度與樣品濁度間之相關性。
第13圖顯示對一串列臨床檢體稀釋藉光學細胞計數測得之樣品細胞度與藉qPCR測得之樣品細胞度間之相關性。
第14圖顯示對一串列稀釋藉qPCR測得之樣品細胞度與樣品濁度間之相關性。
第15圖顯示對1076個樣品之一族群藉qPCR測得之樣品細胞度與樣品濁度間之相關性。
第16圖顯示對第15圖所示樣品具有大於4毫升體積之一子集(PC_NOR=普澤西特(PreservCyt)/正常)藉qPCR測得之樣品細胞度與樣品濁度間之相關性。
第17圖顯示對第15圖所示樣品具有小於4毫升但大於2毫升之體積之一子集(PC_QNS=普澤西特/數量不足)藉qPCR測得之樣品細胞度與樣品濁度間之相關性。
第18圖顯示對第15圖所示樣品具有小於2毫升之體積之一子集(PC_QNS=普澤西特/數量不足)藉qPCR測得之樣品細胞度與樣品濁度間之相關性。
第19圖顯示細菌細胞數目與濁度間之相關性。
第20圖顯示細菌細胞數目與濁度間之相關性。
第21圖顯示總細胞數目(細菌細胞與人細胞之混合)與濁度間之相關性。
第22圖顯示自只含有介質之空白無刮痕樣品管測得之濁度值之分布。
第23圖顯示於一給定濁度截取值將被保留或去除之樣品分量。
第24圖至第25圖顯示對根據樣品體積被再劃分成為亞群之臨床樣品藉qPCR測得之細胞度分布及濁度值分布。於各圖中，各組的左柱係對應於體積大於4毫升之樣品(N：669)；各組之中柱係對應於體積為2毫升至4毫升之樣品(N：172)；及各組之右柱係對應於體積小於2毫升之樣品(N：240)。
第26圖顯示續沛(SurePath)(「SP」)樣品之濁度分布。
第27圖顯示用於樣品妥適性控制測量系統(「SAM」)之一工作模型之濁度標準品的信號/參考測量值。
第28圖顯示8-通道SAM之一工作模型之校準曲線。
第29圖顯示於8-通道SAM之一工作模型中對各個通道中之樣品體積之相依性。
第30圖顯示隨著時間之經過樣品的沈降及濁度測量結果。
第31圖顯示對五個濁度標準藉8-通道SAM所得濁度測量值與藉赫屈計(Hach Meter)測得之濁度之相關性(R2 =0.9993)。
第32圖顯示對臨床樣品藉8-通道SAM所得濁度測量值與藉赫屈計測得之濁度之相關性(n=235；R2 =0.83)。
第33圖顯示藉8-通道SAM所得空白樣品之濁度測量值之分布。
100．．．樣品妥適性控制測量系統(SAM)
102．．．光源
104．．．照明光束路徑
106．．．發射光束路徑
108．．．樣品檢測器
110．．．參考檢測器
111．．．參考光束路徑
112．．．樣品
113．．．彎液面
120．．．殼體
150．．．容器

Claims (18)

  1. 一種用來確保樣品妥適性的自動化方法，該方法包含：提供一樣品於一測試容器中；啟動一照明光源使一照明光束通過該測試容器且進入該樣品中，其中該照明光束通過該測試容器時係以一直立方向朝上行進(travels upwards in a vertical direction)；檢測一發射光束之強度，該發射光束包含至少一部分已被該樣品散射之該照明光束；藉由順著一位於該測試容器下方和外面的參考光束路徑來傳輸一部分位於該照明光源和該測試容器之間的該照明光束，以產生一參考光束；使用一參考檢測器來測量該參考光束的強度；基於該發射光束的強度來產生一樣品濁度測量值；根據該樣品濁度測量值，來判定該樣品之妥適性以於該樣品的一次試驗中提供準確結果；進行該樣品的一次試驗以取得一次試驗結果；評估該一次試驗結果以判定是否該一次試驗結果是一陰性的一次試驗結果；及只有當該樣品被判定為妥適時，報告該陰性的一次試驗結果，以於該樣品的一次試驗中提供準確結果；其中該測試容器係一管單元的多數測試容器中之一者，該管單元包含一框架，該框架沿著一縱軸水平延伸，該多數的測試容器與該框架連結並沿著該縱軸被直 線排列，且其中該多數的測試容器之每一者以該直立方向向下延伸至該框架下方；及其中該發射光束係被一樣品檢測器所檢測，該樣品檢測器係沿著該測試容器的一垂直面被置放，其中該樣品檢測器係被置放於一發射光束路徑的末端，且其中該發射光束路徑沿著一平面延伸，該平面係垂直於該直立方向並與該縱軸呈一非垂直角度，藉以減少該發射光束通過該測試容器的一刮擦部分之可能性。
  2. 如申請專利範圍第1項之自動化方法，其中該樣品之妥適性的判定包含把該樣品濁度測量值與一個或多個預先設定的標準做比較。
  3. 如申請專利範圍第1項之自動化方法，其中該樣品濁度測定值係與該樣品內之蛋白質、核酸、細胞或病毒數目相關。
  4. 如申請專利範圍第1項之自動化方法，其中該樣品濁度測定值包含一該樣品的細胞數估計值，且該樣品妥適性的判定包含把該細胞數估計值與一細胞數最低值做比較。
  5. 如申請專利範圍第1項之自動化方法，更進一步包含儲存一個或多個樣品妥適性結果，並分析該一個或多個樣品妥適性結果來識別下列中之至少一者：樣品收集錯誤、樣品處置錯誤、樣品處理錯誤、樣品妥適性測量錯誤、樣品妥適性測量校準需求、及前述之組合。
  6. 如申請專利範圍第1項之自動化方法，更進一步包含提 供予一操作者該樣品妥適性之指標。
  7. 如申請專利範圍第6項之自動化方法，更進一步包含允許一決策者判定是否須試驗不妥適的樣品，如果該樣品被判定為不是妥適的。
  8. 如申請專利範圍第1項之自動化方法，更進一步包含如果該樣品妥適性被判定為是妥適的則執行該一次試驗，或如果該樣品妥適性被判定為不是妥適的則不執行該一次試驗。
  9. 如申請專利範圍第1項之自動化方法，其中該一次試驗的執行是在該樣品妥適性的判定後。
  10. 如申請專利範圍第1項之自動化方法，其中該樣品包含人子宮頸樣品，且該一次試驗為人類乳突瘤狀病毒篩檢試驗。
  11. 如申請專利範圍第1項之自動化方法，更進一步包含根據該參考光束的強度來控制該照明光源以調節該照明光束的強度。
  12. 如申請專利範圍第1項之自動化方法，更進一步包含使用該參考光束以判定是否該照明光束的強度是在可接受的強度範圍內。
  13. 如申請專利範圍第1項之自動化方法，更進一步包含於檢測該發射光束的強度之前或期間均化該樣品。
  14. 如申請專利範圍第13項之自動化方法，其中該樣品的均化包含使用軌道攪動器、線性攪動器、包含槳葉之混合器、以均化樣品之方式移動樣品容器之機器人手 臂、滴量器之抽吸、或滴量器之配送，以混合該樣品。
  15. 如申請專利範圍第1項之自動化方法，其中該照明光束包含單色光。
  16. 如申請專利範圍第1項之自動化方法，其中該發射光束通過該測試容器之一受保護表面。
  17. 如申請專利範圍第16項之自動化方法，其中該測試容器包含一圓柱形試管，該照明光束通過該圓柱形試管的一末端，且該發射光束通過該圓柱形試管的一側面。
  18. 如申請專利範圍第1項之自動化方法，其中該發射光束的強度之檢測包含於多個檢測器角度測量該發射光束，並經演算法綜合於多個檢測器角度的測量值以獲得單一濁度讀數。
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