TWI440470B

TWI440470B - 含改良抗體分子之醫藥配方

Info

Publication number: TWI440470B
Application number: TW099108118A
Authority: TW
Inventors: Tomoyuki Igawa; Shinya Ishii; Atsuhiko Maeda; Mika Sakurai; Tetsuo Kojima; Tatsuhiko Tachibana; Hirotake Shiraiwa; Hiroyuki Tsunoda; Yoshinobu Higuchi; Chifumi Moriyama; Akira Hayasaka
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2009-03-19
Filing date: 2010-03-19
Publication date: 2014-06-11
Also published as: AR075908A1; AU2010225951A1; JP5661553B2; WO2010106812A1; RU2011142184A; SG174428A1; SG10201703707YA; KR101468271B1; JP4885308B2; JP2012504106A; AU2010225951B2; KR20110139745A; TW201100100A; RU2565809C2; SG10201900451SA; JP2011173918A

Description

含改良抗體分子之醫藥配方

本發明係關於一種含有多胜肽及/或抗體之配方，特別是關於一種含有高濃度之經修飾的抗IL6受體抗體的穩定液體配方。

近年來，已有各種抗體配方被開發出來且實用化。多種配方用於靜脈內注射。由於每次投予的抗體量大(約100mg~200mg)，且皮下注射的體積通常受限，因此，設計用於皮下注射用的含抗體配方需要增加液體中的抗體濃度。

含有高濃度抗體的溶液中會發生不欲的崩解，此崩解包括了形成不溶及/或可溶的凝集物。此等不溶及可溶的凝集物由於與抗體分子結合，而可能形成於液體狀態中。當配方液體長時間儲存，抗體分子的生物活性可能由於天冬醯胺(aspargine)殘基的去醯胺化(deamidation)而喪失或降低。冷凍及解凍循環也會形成崩解及凝集的抗體分子。

已有許多針對提供穩定化配方的方案被提出，其中，即使當該配方長時間貯存，有效成分的喪失會降低。此種配方係藉由將一有效成分與各種添加劑溶解於緩衝溶液中而獲得。目前對於提供抑制長時間儲存中二聚體化及去醯化、及穩定及適合皮下投予的含高濃度抗體之配方仍有需求。

抗體由於在血漿中高度穩定且副作用少，作為醫藥品受到注重。其中，已有多種IgG型抗體醫藥品可在市場上取得，目前許多抗體醫藥品正在開發當中(Janice M Reichert,Clark J Rosensweig,Laura B Faden & Matthew C Dewitz,Monoclonal antibody successes in the clinic,Nature Biotechnology 23,1073-1078(2005) and Pavlou AK,Belsey MJ.,The therapeutic antibodies market to 2008.,Eur J Pharm Biopharm. 2005 Apr;59(3):389-96)。IL-6為一種細胞激素，涉及多種自體免疫疾病、發炎性疾病、惡性腫瘤等(Nishimoto N,Kishimoto T.,Interleukin 6: from bench to bedside.,Nat Clin Pract Rheumatol. 2006 Nov;2(11):619-26)。TOCILIZUMAB為一種人型化抗IL-6受體IgG1抗體，專一性地連接於IL-6受體。TOCILIZUMAB會中和IL-6的生物活性，因此被認為可作為IL-6相關疾病性的治療劑，例如：類風濕性關節炎(WO 92/19759,WO 96/11020,WO96/12503,及Maini RN,Taylor PC,Szechinski J,Pavelka K,Broll J,Balint G,Emery P,Raemen F,Petersen J,Smolen J,Thomson,D,Kishimoto T;CHARISMA Study Group.,Double-blind randomized controlled clinical trial of the interleukin-6 receptor antagonist,Tocilizumab,in European patients with rheumatoid arthritis who had an incomplete response to methotrexate.,Arthritis Rheum,2006 Sep;54(9):2817-29)。在日本，TOCILIZUMAB已被證實作為卡斯托曼病(Castleman disease)及類風濕性關節炎的治療劑(Nishimoto N,Kanakura Y,Aozasa K,Johkoh T,Nakamura M,Nakano S,Nakano N,Ikeda Y,Sasaki T,Nishioka K,Hara M,Taguchi H,Kimura Y,Kato Y,Asaoku H,Kumagai S,Kodama F,Nakahara H,Hagihara K,Yoshizaki K,Kishimoto T. Humanized anti-interleukin-6 receptor antibody treatment of multicentric Castleman disease. Blood. 2005 Oct 15;106(8):2627-32)。

人型化抗體，例如TOCILIZUMAB為第一代抗體藥品。為了改良第一代抗體藥品的效力、便利性及成本，目前正開發第二代抗體藥品。多種可應用於第二代抗體藥品的技術正在開發。已有報導增強效應子(effector)功能、抗原結合能力、藥動學、及穩定性的技術，以及減少免疫原性風險的技術。作為增強藥物效力或減低劑量的方法，已報導藉由IgG抗體的Fc區域的胺基酸取代，增強抗體依存性細胞媒介的細胞毒性活性(ADCC活性)、或補體依存性細胞毒性活性(CDC活性)的技術(Kim SJ,Park Y,Hong HJ.,Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies.,Mol Cells. 2005 Aug 31;20(1):17-29. Review)。再者，親和性成熟化(Affinity maturation)據報告作為用於增強抗原結合能力或抗原中和能力的技術(Rothe A,Hosse RJ,Power BE. Ribosome display for improved biotherapeutic molecules. Expert Opin Biol Ther. 2006 Feb;6(2):177-87)。此技術能藉由導入胺基酸突變於變異區等之互補決定(CDR)區，使增強抗原結合活性。此抗原結合能力之增強，改良體外生物學活性或減少劑量，且因此改良體內的效力(Rajpal A,Beyaz N,Haber L,Cappuccilli G,Yee H,Bhatt RR,Takeuchi T,Lerner RA,Crea R.,A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries.,Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Jun 14;102(24):8466-71. Epub 2005 Jun 6)。現在，Motavizumab(由親和性成熟化生產)正在進行臨床試驗，期待其比起第一代抗RSV抗體醫藥品，Palivizumab有更優越的效果(Wu H,Pfarr DS,Johnson S,Brewah YA,Woods RM,Patel NK,White WI,Young JF,Kiener PA. Development of Motavizumab,an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract. J Mol Biol. 2007,368,652-665)。已有人報告具有親和性約為0.05nM的一種抗IL-6受體抗體(即，較TOCILIZUMAB具有更大的親和性)(WO 2007/143168)。然而，並未有人報告敘述具有高於0.05nM之親和性的人類抗體、人型化抗體或嵌合抗體。

目前的抗體醫藥品面臨的一個問題在於，伴隨著投予極大量的蛋白質所帶來的高生產成本。比如，TOCILIZUMAB，一人型化抗IL-6受體IgG1抗體，以靜脈內注射據估計劑量為約8mg/kg/月(Maini RN,Taylor PC,Szechinski J,Pavelka K,Broll J,Balint G,Emery P,Raemen F,Petersen J,Smolen J,Thomson D,Kishimoto T;CHARISMA Study Group.,Double-blind randomized controlled clinical trial of the interleukin-6 receptor antagonist. Tocilizumab,In European patients with rheumatoid arthritis who had an incomplete response to methotrexate.,Arthritis Rheum. 2006 Sep;54(9):2817-29)。於慢性自體免疫疾病，較佳的投予形式為皮下配方。一般而言，皮下配方需要為高濃度配方。從穩定性等的角度，IgG型抗體配方的極限，一般為約100mg/ml(Shire SJ,Shahrokh Z,Liu J. Challenges in the development of high protein concentration formulations. J Pharm Sci. 2004 Jun;93(6):1390-402)。可藉由增加抗體在血漿中的半衰期以延長其藥效、賦予此抗體高穩定性，提供能以皮下投予、長間隔投予的低成本、便利的第二代抗體醫藥品，藉此減少投予的蛋白質量。

FcRn與抗體藥動學密切相關。關於同型抗體的血漿中半衰期差異，已知IgG1及IgG2比起IgG3及IgG4具有優越的血漿中半衰期(Salfeld JG. Isotype selection in antibody engineering. Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72)。作為更進一步改良具有優越血漿半衰期的IgG1及IgG2抗體的方法，已知有以恆定區的胺基酸置換，增強對FcRn結合的方法(Hinton PR,Xiong JM,Johlfs MG,Tang MT,Keller S,Tsurshita N,m An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life.,J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56 and Ghetie V,Popov S,Borvak J,RaduC,Matesoi D,Medesan C,Ober RJ,Ward ES.,Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis.,Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40)。從免疫原性的觀點，相較於恆定區，將可變區的胺基酸取代，可進一步改良血漿半衰期(WO 2007/114319)。然而，至今為止，尚沒有報告經由改變可變區來改良IL-6受體抗體的血漿半衰期之方法。

另一項在開發生物醫藥品時遭遇的重要問題為免疫原性。一般而言，小鼠抗體的免疫原性，藉由抗體人型化會減低。據推測，免疫原性風險可藉由使用生殖細胞系(germline)框架序列作為抗體人型化中的模板而進一步減低(Hwang WY,Almagro JC,Buss TN,Tan P,Foote J. Use of human germline genes in a CDR homology-based approach to antibody humanization. Methods. 2005 May;36(1):35-42)。然而，即便是人類抗TNF抗體，Adalimumab，仍顯示高頻率(13%~17%)的免疫原性，而且在顯現免疫原性的病患中，治療效果被發現下降(Bartelds GM,Wijbrandts CA,Nurmohamed MT,Stapel S,Lems WF,Aarden L,Dijkmans BA,Tak P,Wolbink GJ. Clinical response to adalimumab: The relationship with anti-adalimumab antibodies and serum adalimumab concentration in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2007 Mar 9;[Epub ahead of print]and Bender NK,Heilig CE,Droll B,Wohlgemuth J,Armbruster FP,Heilig B. Immunogenecity,efficacy and adverse events of adalimumab in RA patients. Rheumatol Int. 2007 Jan;27(3):269-74)。即便是人類抗體的CDR，也可能存在T細胞抗原決定位，且在CDR的T細胞抗原決定位為免疫原性的可能原因。已知預測T細胞抗原決定位的電腦模擬(in silico)及體內(in vivo)方法(Van Walle I,Gansemans Y,Parren PW,Stas P,Lasters I. Immunogenicity screening in protein drug development. Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar;7(3):405-18 and Jones TD,Philips WJ,Smith BJ,Bamford CA,Nayee PD,Baglin TP,Gaston JS,Baker MP. Identification and removal of a promiscuous CD4+ T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J Thromb Haemost. 2005 May;3(5):991-1000)。據推測，免疫原性風險可藉由使用此等方法移除T細胞抗原決定位而減低(Chirino AJ,Ary ML,Marshall SA. Minimizing the immunogenicity of protein therapeutics. Drug Discov Today. 2004 Jan 15;9(2):82-90)。

人型化抗IL-6受體IgG1抗體，TOCILIZUMAB，為人型化小鼠抗體PM1而得到的IgG1抗體。CDR的移植係使用人類NEW及REI序列分別作為H及L鏈的模板框架而進行。然而，為了維持活性，有5個小鼠序列胺基酸保留在框架中作為必要胺基酸(Sato K,Tsuchiya M,Saldanha J,Koishihara Y,Ohsugi Y,Kishimoto T,Bendig MM. Reshaping a human antibody to inhibit the interleukin 6-dependent tumor cell growth. Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6)。先前並無報告將在人型化抗體TOCILIZUMAB框架中的剩餘小鼠序列全部人型化而不減低活性者。再者，TOCILIZUMAB的CDR序列為小鼠序列，因此，如同Adalimumab，在CDR可能具有T細胞抗原決定位，而可能會有潛在的免疫原性風險。於TOCILIZUMAB的臨床試驗中，有效劑量8mg/kg中未檢測到抗TOCILIZUMAB抗體，但是，在2mg/kg及4mg/kg的劑量有觀察到(WO 2004/096273)。此顯示關於TOCILIZUMAB之免疫原性仍有改良的餘地。然而，並無藉由胺基酸置換來減低TOCILIZUMAB免疫原性風險的報告。

TOCILIZUMAB同型物(isotype)為IgG1。此同型物的差異，係指恆定區序列的不同。由於恆定區序列被推測對於效應子功能、藥物動力、物理性質等有強烈的影響，因此，在開發抗體醫藥品時，選擇恆定區序列十分重要(Salfeld JG. Isotype selection in antibody engineering. Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72)。近年來，抗體醫藥品的安全性變得很重要。抗體Fc部分與Fcγ受體的交互作用(效應子功能)，可能會在TGN1412第I期臨床試驗中造成嚴重的負效果(Strand V,Kimberly R,Isaacs JD. Biologic therapies in rheumatology: lessons learned future directions. Nat Rev Drug Discov. 2007 Jan；6(1):75-92)。針對設計為中和抗原生物活性的抗體醫藥品而言，對於效應子功能例如ADCC重要的結合至Fcγ受體，並不需要。從負效果的觀點來看，結合至Fcγ受體甚至是不宜的。減少結合至Fcγ受體的方法，係將IgG抗體的同型物從IgG1改變為IgG2或IgG4(Gessner JE,Heiken H,Tamm A,Schmidt RE. The IgG Fc receptor family. Ann Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48)。從藥物動力學及Fcγ受體結合的觀點，IgG2比IgG4更適合(Salfeld JG. Isotyper selection in antibody engineering. Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72)。TOCILIZUMAB為一IL-6受體的中和抗體，其同型物為IgG1。因此，從潛在的不利效果的觀點，IgG2可能為較佳的同型物，因為不需要如ADCC的效應子功能。

同時，當開發抗體醫藥品時，蛋白質的物化性質，尤其同質性(homogeneity)及穩定性非常關鍵。已知IgG2同型物具有由鉸鏈區的雙硫鍵衍生出的顯著異質性(Dillon TM,Ricci MS,Vezina C,Flynn GC,Liu YD,Rehder DS,Plant M,Henkle B,Li Y,Deechongkit S,Varnum B,Wypych J,Balland A,Bondarenko PV. Structural and functional characterization of disulfide isoforms of the human IgG2 subclass. J Biol Chem. 2008 Jun 6;283(23):16206-15)。欲在生產之間維持衍生自雙硫鍵的目標物質/相關物質關聯的異質性，大規模製造為醫藥品並不容易且可能更花費成本。因此，希望儘可能為單一物質。再者，針對抗體之H鏈C端序列的異質性，已有刪除C端胺基酸離胺酸殘基，以及藉由刪除兩C端甘胺酸及離胺酸之胺基酸的醯胺化C端羧基之報導(Johnson KA,Paisley-Flango K,Tangarone BS,Porter TJ,Rouse JC. Cation exchange-HPLC and mass spectrometry reveal C-terminal amidation of an IgG1 heavy chain. Anal Biochem. 2007 Jan 1;360(1):75-83)。於開發IgG2同型物抗體為醫藥品時，較佳為減低此種異質性且維持高穩定性。為了生產便利的、穩定的、高濃度、皮下投予的配方，較佳為不僅穩定性高，而且血漿中半衰期優於TOCILIZUMAB之同型物IgG1者。然而，並無人報導具有IgG2同型物恆定區之抗體的橫定區序列，與具有IgG1同型物恆定區之抗體相比，具有降低的異質性、高穩定性及優越的血漿半衰期。

本發明之一目的在於提供一種醫藥配方(以下也可稱為「藥劑」或「醫藥組合物」，包含優於人型化抗IL-6受體IgG1抗體TOCILIZUMAB的第二代分子，藉由改變TOCILIZUMAB的可變區及恆定區的胺基酸序列，以增強抗原中和能力以及改良藥物動力，使得能以較低投予頻率而展現延長的治療效果，且改良免疫原性、安全性以及物理化學性質(穩定性及同質性)。

再者，本發明之配方提供含有高濃度之多胜肽及/或抗體之配方，在長時間保存或多次冷凍/解凍循環期間，該多胜肽及/或抗體的二聚體化及去醯胺化受到抑制，及該配方為穩定且適於用在皮下投予。

已有密集的研究以解決上述問題，且已發現可藉由添加胺基酸精胺酸或其鹽於溶液中作為穩定劑，可得到穩定、含高濃度多胜肽/含抗體之配方。

以下將詳述本發明。研究著重在獲得一種醫藥配方，以第二代分子觀點來看為穩定的，第二代分子優於第一代人型化抗IL-6受體IgG1抗體TOCILIZUMAB。關於所關注的抗體的結果，本案發明人等發現到：於TOCILIZUMAB的可變區的多重CDR突變，會改良對抗原的結合能力(親和性)。本案發明人等因此藉由使用此等突變的組合，而成功地改良親和性。本案發明人等亦藉由導入降低可變區序列之等電點的修飾，而成功地改善藥物動力學。本案發明人等亦藉由使得對於IL-6受體抗原的結合為pH-依存性，而成功地改良藥物動力學，使得單一抗體分子可以中和多倍的抗原。再者，他們藉由將殘留在TOCILIZUMAB框架中的小鼠來源的序列完全地人型化，而且減少於電腦模擬預測到的在可變區中的T細胞抗原決定位胜肽的數目，成功地降低免疫原性風險。再者，本案發明人等尚成功地發現針對TOCILIZUMAB之恆定區的新穎恆定區序列，相較於IgG1，其對於Fcγ受體之結合減低，可改良安全性，且比起IgG1，藥物動力學改善，且減少因為IgG2的鉸鏈區雙硫鍵造成的異質性，及因為H鏈C端造成的異質性，而不減損穩定性。本案發明人等成功地藉由適當地組合CDR、可變區及恆定區中的此等胺基酸序列改變，製造優於TOCILIZUMAB的第二代分子。

本發明關於一種醫藥配方，包含一人型化抗IL-6受體IgG抗體，其具有優越的抗原(IL-6受體)結合能力、優越的藥物動力學、優越的安全性以及物理性質(穩定性及同質性)，且進一步，能藉由改變人型化抗IL-6受體IgG1抗體TOCILIZUMAB的可變區及恆定區的胺基酸序列，而減少免疫原性；並關於用於製造此等醫藥組合物的方法。更詳言之，本發明提供如下：

(1)　一種醫藥組合物，包含至少一種選自以下的多胜肽：

(a)一多胜肽，包含CDR1、CDR2、CDR3，該CDR1包含序列識別號1(VH4-M73之CDR1)、該CDR2包含序列識別號2(VH4-M73之CDR2)，及該CDR3包含序列識別號3(VH4-M73之CDR3);

(b)一多胜肽，包含CDR1、CDR2、CDR3，該CDR1包含序列識別號4(VH3-M73之CDR1)、該CDR2包含序列識別號5(VH3-M73之CDR2)，及該CDR3包含序列識別號6(VH3-M73之CDR3);

(c)一多胜肽，包含CDR1、CDR2、CDR3，該CDR1包含序列識別號7(VH5-M83之CDR1)、該CDR2包含序列識別號8(VH5-M83之CDR2)，及該CDR3包含序列識別號9(VH5-M83之CDR3)；

(d)一多胜肽，包含CDR1、CDR2、CDR3，該CDR1包含序列識別號10(VL1之CDR1)、該CDR2包含序列識別號11(VL1之CDR2)，及該CDR3包含序列識別號12(VL1之CDR3)；

(e)一多胜肽，包含CDR1、CDR2、CDR3，該CDR1包含序列識別號13(VL3之CDR1)、該CDR2包含序列識別號14(VL3之CDR2)，及該CDR3包含序列識別號15(VL3之CDR3)；

(f)一多胜肽，包含CDR1、CDR2、CDR3，該CDR1包含序列識別號16(VL5之CDR1)、該CDR2包含序列識別號17(VL5之CDR2)，及該CDR3包含序列識別號18(VL5之CDR3)。

(2)一種醫藥配方，包含至少一種選自以下的抗體：

(a)一抗體，包含一重鏈可變區及一輕鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含序列識別號1(VH4-M73之CDR1)之CDR1、包含序列識別號2(VH4-M73之CDR2)之CDR2，及包含序列識別號3(VH4-M73之CDR3)之CDR3；該輕鏈可變區包含：包含序列識別號10(VL1之CDR1)之CDR1、包含序列識別號11(VL1之CDR2)之CDR2，及包含序列識別號12(VL1之CDR3)之CDR3；

(b)一抗體，包含一重鏈可變區及一輕鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含序列識別號4(VH3-M73之CDR1)之CDR1、包含序列識別號5(VH3-M73之CDR2)之CDR2，及包含序列識別號6(VH3-M73之CDR3)之CDR3；該輕鏈可變區包含：包含序列識別號13(VL3之CDR1)之CDR1、包含序列識別號14(VL3之CDR2)之CDR2，及包含序列識別號15(VL3之CDR3)之CDR3；及

(c)一抗體，包含一重鏈可變區及一輕鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含序列識別號7(VH5-M83之CDR1)之CDR1、包含序列識別號8(VH5-M83之CDR2)之CDR2，及包含序列識別號9(VH5-M83之CDR3)之CDR3；該輕鏈可變區包含：包含序列識別號16(VL5之CDR1)之CDR1、包含序列識別號17(VL5之CDR2)之CDR2，及包含序列識別號18(VL5之CDR3)之CDR3；

(d)　一抗體，包含一重鏈可變區及一輕鏈可變區，該重鏈可變區包含：序列識別號19(VH4-M73之可變區)；該輕鏈可變區包含：序列識別號22(VL1之可變區)；

(e)　一抗體，包含一重鏈可變區及一輕鏈可變區，該重鏈可變區包含：序列識別號20(VH3-M73之可變區)；該輕鏈可變區包含：序列識別號23(VL3之可變區)；

(f)　一抗體，包含一重鏈可變區及一輕鏈可變區，該重鏈可變區包含：序列識別號21(VH5-M83之可變區)；該輕鏈可變區包含：序列識別號24(VL5之可變區)；

(g)　一抗體，包含一重鏈及一輕鏈，該重鏈包含：序列識別號25(VH4-M73)；該輕鏈包含：序列識別號28(VL1)；

(h)　一抗體，包含一重鏈及一輕鏈，該重鏈包含：序列識別號26(VH3-M73)；該輕鏈包含：序列識別號29(VL3)；

(i)　一抗體，包含一重鏈及一輕鏈，該重鏈包含：序列識別號27(VH5-M83)；該輕鏈包含：序列識別號30(VL5)。

(3)如(1)或(2)之穩定的醫藥配方，包含一組胺酸及/或檸檬酸鹽緩衝液。

(4)如(1)~(3)中任一項之穩定的醫藥配方，包含至少一陽離子性胺基酸。

(5)如(1)~(4)中任一項之穩定的醫藥配方，包含1~500mM組胺酸及/或檸檬酸鹽緩衝液、1~1500mM的至少一陽離子性胺基酸、1~200mg/mL的抗體，及1~400mM的碳水化合物。

(6)如(4)或(5)之配方，其中該陽離子性胺基酸為精胺酸。

(7)如(5)或(6)之配方，其中，該碳水化合物為蔗糖或海藻糖(trehalose)。

(8)如(1)至(7)中任一項之配方，更包含一界面活性劑。

(9)如(1)至(8)中任一項之配方，包含多胜肽及/或抗體之量為至少10mg/ml。

(10)如(1)至(9)中任一項之配方，包含多胜肽及/或抗體之量為至少50mg/ml。

(11)如(1)至(10)中任一項之配方，包含多胜肽及/或抗體之量為至少80mg/ml。

(12)如(1)至(11)中任一項之配方，包含多胜肽及/或抗體之量為少於或等於240mg/ml。

(13)如(1)至(12)中任一項之配方，其中，pH介於4.5~7.0。

(14)如(13)之配方，其中，pH介於5.5~6.6。

(15)如(1)至(14)中任一項之配方，其中，該配方為液體。

(16)如(15)之配方，其中，在該配方製配期間，未經冷凍乾燥。

(17)如(1)至(16)中任一項之配方，其中，該多胜肽及/或抗體分子的二聚體化減少。

(18)如(1)至(17)中任一項之配方，其中，該多胜肽及/或抗體分子的二聚體化受抑制。

(19)　如(1)至(18)中任一項之配方，係供皮下投予。

(20)　一種穩定含有該抗體之溶液的方法，包含添加至少一陽離子性胺基酸，其中，該抗體為選自以下的至少一種抗體：

(b)　一抗體，包含一重鏈可變區及一輕鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含序列識別號4(VH3-M73之CDR1)之CDR1、包含序列識別號5(VH3-M73之CDR2)之CDR2，及包含序列識別號6(VH3-M73之CDR3)之CDR3；該輕鏈可變區包含：包含序列識別號13(VL3之CDR1)之CDR1、包含序列識別號14(VL3之CDR2)之CDR2，及包含序列識別號15(VL3之CDR3)之CDR3;

(c)一抗體，包含一重鏈可變區及一輕鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含序列識別號7(VH5-M83之CDR1)之CDR1、包含序列識別號8(VH5-M83之CDR2)之CDR2，及包含序列識別號9(VH5-M83之CDR3)之CDR3;該輕鏈可變區包含：包含序列識別號16(VL5之CDR1)之CDR1、包含序列識別號17(VL5之CDR2)之CDR2，及包含序列識別號18(VL5之CDR3)之CDR3;

(d)一抗體，包含一重鏈可變區及一輕鏈可變區，該重鏈可變區包含：序列識別號19(VH4-M73之可變區);該輕鏈可變區包含：序列識別號22(VL1之可變區);

(e)一抗體，包含一重鏈可變區及一輕鏈可變區，該重鏈可變區包含：序列識別號20(VH3-M73之可變區);該輕鏈可變區包含：序列識別號23(VL3之可變區);

(f)一抗體，包含一重鏈可變區及一輕鏈可變區，該重鏈可變區包含：序列識別號21(VH5-M83之可變區);該輕鏈可變區包含：序列識別號24(VL5之可變區);

(g)一抗體，包含一重鏈及一輕鏈，該重鏈包含：序列識別號25(VH4-M73);該輕鏈包含：序列識別號28(VL1);

(h)一抗體，包含一重鏈及一輕鏈，該重鏈包含：序列識別號26(VH3-M73);該輕鏈包含：序列識別號29(VL3);

(i)一抗體，包含一重鏈及一輕鏈，該重鏈包含：序列識別號27(VH5-M83)；該輕鏈包含：序列識別號30(VL5)。

(21)一種穩定抗體的方法，該抗體於一冷凍/解凍循環之溶液中，包含添加至少一陽離子性胺基酸，其中該抗體選自以下至少一種抗體：

(b)一抗體，包含一重鏈可變區及一輕鏈可變區，該重鏈可變區包含：包含序列識別號4(VH3-M73之CDR1)之CDR1、包含序列識別號5(VH3-M73之CDR2)之CDR2，及包含序列識別號6(VH3-M73之CDR3)之CDR3；該輕鏈可變區包含：包含序列識別號13(VL3之CDR1)之CDR1、包含序列識別號14(VL3之CDR2)之CDR2，及包含序列識別號15(VL3之CDR3)之CDR3；

(h)　一抗體，包含一重鏈及一輕鏈，該重鏈包含：序列識別號26(VH3-M73)；該輕鏈包含：序列識別號29(VL3)；及

上述人型化抗IL-6受體IgG抗體已有增強的效力及改良的藥物動力學；因此，能以較少的投予頻率發揮延長的治療效果。

本發明提供一種醫藥配方，包含至少一種選自以下的多胜肽：

(a)一多胜肽，包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1包含序列識別號1(VH4-M73之CDR1)、該CDR2包含序列識別號2(VH4-M73之CDR2)，該CDR3包含序列識別號3(VH4-M73之CDR3)；

(b)一多胜肽，包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1包含序列識別號4(VH3-M73之CDR1)、該CDR2包含序列識別號5(VH3-M73之CDR2)，該CDR3包含序列識別號6(VH3-M73之CDR3)；

(c)一多胜肽，包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1包含序列識別號7(VH5-M83之CDR1)、該CDR2包含序列識別號8(VH5-M83之CDR2)，該CDR3包含序列識別號9(VH5-M83之CDR3)；

(d)一多胜肽，包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1包含序列識別號10(VL1之CDR1)，該CDR2包含序列識別號11(VL1之CDR2)，該CDR3包含序列識別號12(VL1之CDR3)；

(e)一多胜肽，包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1包含序列識別號13(VL3之CDR1)，該CDR2包含序列識別號14(VL3之CDR2)，該CDR3包含序列識別號15(VL3之CDR3)；

(f)一多胜肽，包含CDR1、CDR2及CDR3，該CDR1包含序列識別號16(VL5之CDR1)，該CDR2包含序列識別號17(VL5之CDR2)，該CDR3包含序列識別號18(VL5之CDR3)。

本發明之多胜肽及抗體可依照習知方法配方(參見例如 Remington’ s Pharmaceutical Science,latest edition,Mark Publishing Company,Easton,USA)。

本發明中使用的「醫藥配方」、「藥劑」，及「醫藥組合物」，係指含有多胜肽及/或抗體作為有效成分的液體或固體配方，其係製備為適用於直接或是復原後投予動物，例如人類。若有需要，此配方可含有醫藥上可接受之載體及/或添加物。例如，洗滌劑(例如，PEG、Tween、Pluronic)、賦形劑、抗氧化劑(例如，抗壞血酸、甲硫胺酸)、著色劑、風味劑、保存劑、安定劑、緩衝劑、螯合劑(例如EDTA)、懸浮劑、等張劑、黏結劑、崩散劑、潤滑劑、流動促進劑，及矯味劑。

本發明之含有多胜肽及/或抗體之配方，較佳為不含HAS(人類血清白蛋白)、明膠、及此等蛋白質作為安定劑。

本發明之含有多胜肽及/或抗體之配方，較佳為一液體醫藥配方，其包含高濃度的多胜肽及/或抗體，濃度不低於10mg/mL，較佳為不低於50mg/mL，更佳為不低於80mg/mL。濃度介於10~240mg/mL，可為10mg/mL，較佳為50mg/mL，更佳為100~200mg/mL。

本發明之液體醫藥配方，較佳為不經過冷凍乾燥步驟製造。

可用於本發明之緩衝藥劑，為可調整pH於所欲範圍，且為醫藥上可接受者。本發明之含高濃度多胜肽及/或抗體之配方，配方之pH較佳為4.5~7，更佳為5.5~6.6。此等緩衝劑為熟習該技術領域之人士所知者，例如包括無機鹽例如磷酸鹽(鈉鹽或鉀鹽)，及碳酸氫鈉；有機酸鹽例如檸檬酸鹽(鈉鹽或鉀鹽)，乙酸鈉及琥珀酸鈉；及酸例如磷酸、碳酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸，及葡萄糖酸。

再者，也可使用Tris緩衝液、Good’s緩衝液，例如：MES及MOPS、組胺酸(例如組胺酸鹽酸鹽)，及甘胺酸。依照本發明之含有高濃度多胜肽及/或抗體之配方，此緩衝液較佳為一組胺酸或檸檬酸鹽緩衝液，更佳為組胺酸緩衝液。該緩衝溶液之濃度，一般而言為1至500mM，較佳為5至100mM，更佳為10至20mM。當使用組胺酸緩衝液時，該緩衝溶液所含組胺酸濃度，較佳為5至25mM，更佳為10至20mM。

本發明之配方可進一步包含界面活性劑。典型之界面活性劑之例子，包括：非離子性界面活性劑，例如山梨糖醇酐脂肪酸酯，例如山梨糖醇酐單癸酸酯、山梨糖醇酐單月桂酸酯、及山梨糖醇酐單棕櫚酸酯；甘油脂肪酸酯例如甘油單癸酸酯、甘油單肉豆蔻酸酯、及甘油單硬脂酸酯；多聚甘油脂肪酸酯例如十甘油單硬脂酸酯、十甘油二硬脂酸酯、及十甘油單亞油酸酯；聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單棕櫚酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯、及聚氧乙烯山梨糖醇酐三硬脂酸酯；聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯，例如聚氧乙烯山梨糖醇四硬脂酸酯、及聚氧乙烯山梨糖醇四油酸酯；聚氧乙烯甘油脂酸酯酯，例如聚氧乙烯甘油單硬脂酸酯；聚乙二醇脂肪酸酯，例如聚乙二醇二硬脂酸酯；聚氧乙烯烷基醚，例如聚氧乙烯月桂醚；聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚，例如聚氧乙烯聚氧丙二醇醚、聚氧乙烯聚氧丙烯丙醚、及聚氧乙烯聚氧丙烯鯨蠟醚；聚氧乙烯烷基苯醚，例如聚氧乙烯壬基苯醚；聚氧乙烯硬化篦麻子油，例如，聚氧乙烯篦麻子油，及聚氧乙烯硬化篦麻子油(聚氧乙烯氫化篦麻子油)；聚氧乙烯蜂蠟衍生物，例如聚氧乙烯山梨糖醇蜂蠟；聚氧乙烯羊毛脂衍生物，例如：聚氧乙烯羊毛脂；HLB為6至18之界面活性劑，例如聚氧乙烯脂肪酸醯胺，例如聚氧乙烯十八醯胺；陰離子界面活性劑，例如具有C₁₀ -C₁₈ 烷基之烷基硫酸鹽，例如鯨蠟基硫酸鈉、月桂基硫酸鈉，及油基硫酸鈉；聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽，其中，加成之氧乙烯單元的平均莫耳數為2至4，且烷基之碳原子數為10至18，例如聚氧乙烯月桂基硫酸鈉；具有C₈ -C₁₈ 烷基之烷基磺基琥珀酸鹽，例如月桂基磺基琥珀酸鈉；天然界面活性劑例如卵磷脂，及甘油磷酸脂；抱合磷脂質，例如鞘磷脂；及C₁₂ -C₁₈ 脂肪酸之蔗糖酯。此等界面活性劑可各別添加到本發明之配方，或可將兩種以上的此等界面活性劑組合添加。

較佳的界面活性劑為聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯及聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚，更佳為聚山梨糖醇酯20、21、40、60、65、80、81及85，Pluronic形式的界面活性劑，且最佳為聚山梨糖醇酯20及80，及Pluronic F-68(Poloxamer 188)。

添加到本發明之抗體配方的界面活性劑量，一般為0.0001至10%(w/v)，較佳為0.001至5%，更佳為0.005至3%。

本發明之配方，可更包含一酸性胺基酸，例如精胺酸，以及甲硫胺酸、甘胺酸、丙胺酸、***酸、色胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺、谷醯胺、及此等胺基酸作為安定劑。

依照本發明之含抗體之配方或含抗體之溶液配方中，可藉由添加碳水化合物(例如糖類)抑制在冷凍/解凍循環期間形成二聚體。可使用之糖類包括非還原性之寡糖，例如非還原性二糖例如蔗糖及海藻糖，或非還原性三糖例如棉子糖，更佳為非還原性寡糖。較佳的非還原性寡糖為非還原性二糖，更佳為蔗糖及海藻糖。

依照本發明之含抗體之配方或含抗體之溶液配方中，可藉由添加碳水化合物(例如糖類)抑制長時間保存期間形成多聚體以及分解產物。可使用之糖類包括糖醇，例如甘露醇以及山梨醇；及非還原性寡糖，例如，非還原性二糖，例如蔗糖，以及海藻糖，或非還原性三糖，例如棉子糖，其中，較佳者為非還原性寡糖。較佳的非還原性寡糖為非還原性二糖，更佳者為蔗糖及海藻糖。

糖類可添加0.1~500mg/mL，更佳為10~300mg/mL，又更佳為25~100mg/mL。

於另一方面，依照本發明之配方較佳為實質上由以下成分組成：

A)經修飾的抗IL-6受體抗體；

B)陽離子性胺基酸(例如精胺酸、組胺酸，及/或離胺酸)；

C)緩衝劑(例如，組胺酸或檸檬酸鹽)。

依用途，可在本配方中包含碳水化合物(例如糖類)及/或界面活性劑。

作為安定劑，可包含：甲硫胺酸、甘胺酸、丙胺酸、***酸、色胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺、谷醯胺、及此等胺基酸。

此處使用之「實質上組成」，意指不包含通常添加在配方中的成分以外的成分，通常添加在配方中的成分係如下述選擇性的添加劑成分，比如：懸浮劑、溶解化劑、等張劑、保存劑、吸附抑制劑、稀釋劑、載體、pH調整劑、鎮靜劑、含硫之還原劑，及抗氧化劑。

懸浮劑之例，包括甲基纖維素、聚山梨醇酯80、羥基乙基纖維素、***膠(gum rabic)、粉末化黃耆膠、羧基甲基纖維素鈉，及聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯。

溶解化劑之例，包括聚氧乙烯氫化篦麻子油、聚山梨醇酯80、菸鹼醯胺、聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯、聚乙二醇(macrogol)，及篦麻子油脂肪酸乙酯。

等張劑之例，包括氯化鈉、氯化鉀，及氯化鈣。

保存劑之例，包括對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚，及氯甲酚。

吸附抑制劑之例子，包括：人類血清白蛋白、卵磷脂、葡聚糖、氧乙烯-氧丙烯共聚物、羥基丙基纖維素、甲基纖維素、聚氧乙烯氫化篦麻子油，及聚乙二醇。

含硫之還原劑之例子，包括具有氫硫基之化合物，例如：N-乙醯基半胱胺酸、N-乙醯基同半胱胺酸、硫辛酸(thioctic acid)、硫二乙二醇、硫乙醇胺、硫甘油、硫山梨醇、硫甘醇酸及其鹽，硫代硫酸鈉、谷胱甘肽，及C₁ -C₇ 硫烷。

抗氧化劑之例，包括：異抗壞血酸(erythorbic acid)、二丁基羥基甲苯、丁基化羥基苯甲醚(anisole)、α-生育酚、生育酚乙酸酯、L-抗壞血酸及其鹽、L-抗壞血醯基棕櫚酸酯、L-抗壞血醯基硬脂酸酯、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、沒食子酸三戊酯、沒食子酸丙酯，及螯合劑例如乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、焦磷酸鈉，及偏磷酸鈉。

然而，依本發明之配方(藥劑、醫藥組合物)，可用於預防或治療包括發炎疾病之IL-6相關之疾病，不限於上述，且可適當包含其他習知的載體。詳言之，例如稍微去水的矽酸、乳糖、結晶纖維素、甘露醇、澱粉、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、聚乙烯基乙縮醛二乙基胺基乙酸酯、聚乙烯基吡咯酮、明膠、中鏈脂肪酸甘油酯、聚氧乙烯氫化篦麻子油60、蔗糖、羧基甲基纖維素、玉米澱粉，及無機鹽。

其中也可含其他低分子量的多胜肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠，及免疫球蛋白；及胺基酸。當製備用於注射的水溶液時，將此等抗IL-6受體抗體溶解於例如含有生理食鹽水、葡萄糖或其他佐劑之等張溶液。佐劑，包含例如：D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇，及氯化鈉。再者，可組合適當的溶解劑，例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)，及非離子性界面活性劑(聚山梨醇酯80及HCO-50)。

視需要，可將此等多胜肽包裹在微膠囊內(由羥基纖維素、明膠、聚(甲基丙烯酸甲酯)等製作的微膠囊)，或使進入膠體藥物遞送系統(微脂體、白蛋白微球體、微乳劑、奈米微粒、奈米膠囊等)(參見例如”Remington’s Pharmaceutical Science 16^th edition”,Oslo Ed.(1980))。又，製備藥劑為持續釋放藥劑的方法為已知，且可應用在此多胜肽(Langer et al.,J. Biomed. Mater. Res.(1981)15:167-277；Langer,Chem. Tech.(1982)12:98-105; US Patent No. 3,773,919; European Patent Application(EP) No. 58,481; Sidman et al.,Biopolymers(1983) 22:547-56; EP No. 133,988)。又，用於皮下投予的液體體積可藉由添加或混合透明質酸酶至一藥劑中而增加(例如見WO2004/078140)。

本發明之醫藥組合物可藉由口服及非口服兩者投予，但較佳為以非口服投予。詳言之，此等組合物係以注射或經皮膚對於病患投予。注射包括，例如：利用靜脈內、肌肉內或皮下注射等的全身性及局部投予。此等組合物可在處理部位或該部位周邊藉由尤其是肌肉內注射而局部注射。經皮膚劑型，包括例如：軟膏劑、凝膠、乳霜、敷糊劑(poultice)及貼劑，其可局部或全身性投予。再者，投予方法可視病患的年紀及症狀適當選擇。投予劑量可從每次投予每公斤體重例如0.0001mg~100mg有效成分的範圍中選擇。或者，當此等組合物係對於人類病患投予時，例如，投予劑量可從每位病患每次投予每公斤體重例如0.001mg~1000mg有效成分。單一投予劑量較佳為包括例如，本發明抗體約0.01~50mg/kg體重。然而，本發明之抗體之劑量不限於此等劑量。

如同可由下述實施例之結果所見，依照本發明，可得到穩定的配方，其中，藉由添加一種以上陽離子性胺基酸(精胺酸、組胺酸，及/或離胺酸，更佳為精胺酸)，或組合陽離子性胺基酸及其他的胺基酸在此配方中，長時間保存或冷凍/解凍期間，抗體之二聚體化及去醯胺化少。

為了評估此含有高濃度抗體之配方的保存期間穩定性，本案發明人等藉由進行尺寸排除層析(size exclusion chromatography)及陰離子交換層析試驗，研究各種添加劑的效果。結果，發現到：於含有胺基酸精胺酸之緩衝溶液中溶有高濃度抗體之溶液，二聚體之量低於沒有添加精胺酸之溶液者。此等結果顯示，精胺酸作為安定劑可有效抑制抗體二聚體化。

因此，藉由添加精胺酸作為安定劑，可提供一種穩定的抗體配方，其中，減少抗體之二聚體化。

本發明之一具體實施例為，一種穩定的含有抗體的配方，特徵為：於一緩衝的溶液中含有一抗體及精胺酸。

用在本發明之精胺酸，可為任何精胺酸化合物本身、其衍生物及其鹽，較佳為L-精胺酸及其鹽。

當依照本發明之配方含有精胺酸，精胺酸之濃度較佳為1~1500mM，更佳為50~1000mM，又更佳為50~200mM。

本發明之多胜肽不特別限定，然而，較佳為具有結合到人類IL-6受體之活性的抗原結合物質。此等抗原結合物質，較佳為包含例如：抗體重鏈可變區(VH)、抗體輕鏈可變區(VL)、抗體重鏈、抗體輕鏈，及抗體。

上述(a)~(f)之多胜肽中，(a)~(c)之多胜肽為較佳之抗體重鏈可變區之例子，而(d)~(f)之多胜肽為抗體輕鏈可變區之例子。

此等可變區可使用作為一抗人類IL-6受體抗體之一部分。使用如此之可變區的抗人類IL-6受體抗體具有優越的結合活性、優異的藥物動力學、優異的安全性、減少的免疫原性，及/或優越的物理化學性質。於本發明中，優異的藥物動力學或藥物動力學之改良，係指以下任何一項：「清除率(CL)」降低、「曲線下面積(AUC)」增加、「平均殘留時間」增加，及”血漿半衰期(t1/2)”增加，此等係由當抗體投予到體內時，從血漿濃度之時間變化而計算的藥物動力學參數。在此，優越的物理化學性質或改良的物理化學性質，係指改良的穩定性、減少的異質性等，但不限於此。

與本發明之CDR連結之人類抗體框架區係選取使CDR形成有利之抗原結合部位者。本發明中，針對此等可變區而使用之FR不特別限定，可使用任意FR；然而，較佳為使用人類衍生的FR。可使用具有天然序列的人類衍生之FR。或者，視需要，可將一個以上胺基酸取代、刪除、加成及/或***等導入到具有天然序列的框架區，使得此CDR形成足夠的抗原結合部位。可利用例如測量及評估針對具有胺基酸取代之FR之抗體對於一抗原之結合活性，而選擇具有所望性質之突變FR序列(Sato,K. et al.,Cancer Res.(1993) 53,851-856)。

又，可在上述CDR序列中將1個以上的胺基酸進行取代、刪除、加成，及/或***。較佳為，一個以上胺基酸進行取代、刪除、加成及/或***之後，一CDR序列，就結合活性、中和活性、穩定性、免疫原性，及/或藥物動力學，與改變前的CDR序列相比，具有同等活性。欲取代、刪除、加成及/或***之胺基酸數目，不特別限定，然而，較佳為3個胺基酸以下，更佳為為2個胺基酸以下，又更佳為每個CDR，1個胺基酸以下。

用於將一個以上胺基酸殘基取代為其他關注之胺基酸的方法，例如：點突變(Hashimoto-Gotoh,T,Mizuno,T,Ogasahara,Y,and Nakagawa,M.(1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152. 271-275:Zoller. MJ. and Smith. M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100,468-500;Kramer,W,Drutsa,V,Jansen,HW,Kramer,B,Pflugfelder,M,and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DAN approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12,9441-9456;Kramer W,and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154,350-367;Kunkel,TA(1985)Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 82,488-492)。此方法可用於將抗體中之所望胺基酸以關注的其他胺基酸取代。再者，作為胺基酸取代之方法，可利用基因庫技術例如框架曳步(framework shuffling)(Mol. Immunol. 2007 Apr;44(11):3049-60)及CDR修復(US2006/0122377)，進行胺基酸取代以得到適當的框架及CDR。

本發明亦提供一種醫藥配方，包含選自以下至少一種抗體：

(d)一抗體，包含一重鏈可變區及一輕鏈可變區，該重鏈可變區包含：序列識別號19(VH4-M73之可變區)；該輕鏈可變區包含：序列識別號22(VL1之可變區)；

(e)一抗體，包含一重鏈可變區及一輕鏈可變區，該重鏈可變區包含：序列識別號20(VH3-M73之可變區)；該輕鏈可變區包含：序列識別號23(VL3之可變區)；

(f)一抗體，包含一重鏈可變區及一輕鏈可變區，該重鏈可變區包含：序列識別號21(VH5-M83之可變區)；該輕鏈可變區包含：序列識別號24(VL5之可變區)；

(g)一抗體，包含一重鏈及一輕鏈，該重鏈包含：序列識別號25(VH4-M73)；該輕鏈包含：序列識別號28(VL1)；

(h)一抗體，包含一重鏈及一輕鏈，該重鏈包含：序列識別號26(VH3-M73)；該輕鏈包含：序列識別號29(VL3)；

以上所述抗體，可使用為具有優越結合活性、優異之藥物動力學、優異之安全性、減低之免疫原性，及/或優越的物理化學性質的抗人類IL-6受體抗體。

與本發明之CDR連結之人類抗體框架區係選取會使得CDR形成有利之抗原結合部位者。本發明中，針對此等可變區而使用之FR不特別限定，可使用任意FR；然而，較佳為使用人類衍生的FR。可使用具有天然序列的人類衍生之FR。或者，視需要，可將一個以上胺基酸取代、刪除、加成及/或***等導入到具有天然序列的框架區，使得此CDR形成足夠的抗原結合部位。可利用例如測量及評估針對具有胺基酸取代之FR之抗體對於一抗原之結合活性，而選擇具有所望性質之突變FR序列(Sato,K. et al.,Cancer Res.(1993)53,851-856)。

同時，本發明之抗體使用之恆定區不特別限定，可使用任意的恆定區。較佳的使用於本發明抗體的恆定區，包括例如：人類衍生的恆定區(衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、Cκ、Cλ等的恆定區)。可在此人類衍生的恆定區進行1個以上的胺基酸的取代、刪除、加成及/或***。較佳的人類衍生重鏈恆定區包括，例如：包含胺基酸序列識別號31之恆定區(VH4-M73之恆定區)、包含胺基酸序列識別號32之恆定區(VH3-M73之恆定區)、包含胺基酸序列識別號33之恆定區(VH5-M83之恆定區)，而較佳之人類衍生之輕鏈恆定區包括，例如：包含胺基酸序列識別號34之恆定區(VL1)、包含胺基酸序列識別號35之恆定區(VL3)、包含胺基酸序列識別號36之恆定區(VL5)。

此等抗體的各可變區，可作為與抗人類IL-6受體反應的分子的一部分。此等恆定區尚可包含1個以上胺基酸(例如，5個或以下胺基酸，較佳為3個或以下胺基酸)的取代、刪除、加成，及/或***。用於將一個以上胺基酸殘基取代為其他關注之胺基酸的方法，包括例如上述方法。

本發明尚包括包含上述可變區之多胜肽。

此等抗體之各重鏈及輕鏈，可作為與抗人類IL-6受體反應的分子的一部分。使用此等重鏈及輕鏈的抗人類IL-6受體抗體，具有優越的結合活性、優異的藥物動力學、優異的安全性、減低的免疫原性，及/或優越的物理化學性質。

此等重鏈及輕鏈尚可包含1個或以上胺基酸(例如，10個或以下胺基酸，較佳為5個或以下胺基酸，更佳為5個或以下胺基酸)的取代、刪除、加成，及/或***。用於將一個以上胺基酸殘基取代為其他關注之胺基酸的方法，包括例如上述方法。

1個或以上胺基酸的取代、刪除、加成，及/或***，可針對可變區、恆定區或兩者進行。

本發明更包括包含上述重鏈及輕鏈的多胜肽。

本發明之抗體較佳為人型化抗體。

人型化抗體也稱為再改造(reshaped)抗體。此一人型化抗體係藉由將來自於非人類哺乳動物的互補決定區(CDR)移植到人類抗體之CDR而得到。習知的用於製備此種抗體的基因重組技術為已知(見European Patent Application No. EP 125023;WO 96/02576)。

尤其，例如，使關注之CDR及關注的框架區(FR)連結的經設計的DNA序列，係使用製備的數個寡核苷酸使具有與CDR及FR均有重疊部分的末端作為引子而以PCR合成(見WO98/13388敘述之方法)。人型化抗體係藉由以下得到：將得到的DNA連接到編碼為人類抗體恆定區或經修飾的人類抗體恆定區的DNA；將上述***到一表現載體；及將此載體導入到一寄主以生產此抗體(見European Patent Application No. EP 239400，及Internationa1 Patent Application Publication No. WO 96/02576)。

與CDR連結之人類抗體框架區係選取使CDR形成有利之抗原結合部位者。視需要，可將胺基酸取代、刪除、加成，及/或***導入到抗體可變區的框架區。

一人類抗體恆定區，或其中1個以上胺基酸經過取代、刪除、加成及/或***的經改變的人類抗體恆定區，可作為人型化抗體之恆定區。

例如，H鏈可使用C γ 1、C γ 2、C γ 3、C γ 4、C mu、C δ、C α 1、C α 2、C epsilon，L鏈可使用C κ及C λ。C κ的胺基酸序列顯示於序列識別號38，編碼為此胺基酸序列的核苷酸序列顯示於序列識別號37。C γ 1的胺基酸序列顯示於序列識別號40，編碼為此胺基酸序列的核苷酸序列顯示於序列識別號39。C γ 2的胺基酸序列顯示於序列識別號42，編碼為此胺基酸序列的核苷酸序列顯示於序列識別號41。C γ 4的胺基酸序列顯示於序列識別號44，編碼為此胺基酸序列的核苷酸序列顯示於序列識別號43。

又，人類抗體C區可經修飾以改良抗體穩定性或抗體生產穩定性。任意同型物之人類抗體，例如，IgG、IgM、IgA、IgE或IgD，可使用在抗體人型化。然而，本發明較佳為使用IgG。IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等可作為IgG使用。

人型化抗體的可變區(例如CDR及FR)及恆定區的胺基酸，可在製備後刪除、加成、刪除及/或取代為胺基酸。本發明之抗體也包括此種包含胺基酸取代等的人型化抗體。

本發明之抗體，只要具有IL-6受體結合活性及/或中和活性，不僅包括以IgG代表的雙價抗體，也包括單價抗體，及以IgM代表的多價抗體。本發明之多價抗體包括抗原結合部位相同的多價抗體，以及全部或部分抗原結合部位不同的多價抗體。本發明之抗體只要其結合於IL-6受體蛋白質，不僅包括完整的抗體分子，也包括微小抗體(minibody)及其修飾產物。

微小抗體係包含欠缺完整抗體的一部分(例如完整的IgG等)之抗體片段之抗體，且只要具有IL-6受體結合活性及/或中和活性且包含欠缺完整抗體之一部分的抗體片段者，即不特別限定。本發明之微小抗體不特別限定，只要其具有完整抗體之一部分即可。然而，此等微小抗體較佳為包含VH或VL，更佳為包含VH及VL。其他本發明中之較佳的抗體，包括例如：包含抗體CDR之微小抗體。此等微小抗體可包含抗體之6個CDR的全部或一部分。

本發明之微小抗體較佳為具有小於完整抗體的分子量。然而，此等微小抗體可以形成多聚物，例如二聚物、三聚物或四聚物，且因此其分子量有時會大於完整的抗體。

尤其，抗體片段包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2及Fv。同時，微小抗體包括例如：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、svFc(單鏈Fv)、雙抗體(diabody)，及sc(Fv)2(單鏈(Fv)2)。此等抗體的多聚物(例如：二聚物、三聚物、四聚物，及多聚物)，也包括在本發明之微小抗體。

抗體片段可藉由例如以酵素處理抗體以生產抗體片段而得到。已知產生抗體片段的酵素，包括例如：木瓜酵素、胰蛋白酶，及胞漿素(plasmin)。或者，可藉由將編碼為此抗體片段的基因導入到一表現載體，並表現在適當的寄主細胞而構築(見例如：Co,M.　S.　et　al.,J.　Immunol.(1994)152,2968-2976;Better,M. & Horwitz,A. H. Methods in Enzymology(1989)178,476-496;Pluckthun,A. & Skerra,A. Methods in Enzymology(1989) 178,476-496;Lamoyi,E.,Methods in Enzymology(1989) 121,652-663;Rousseaux,J. et al.,Methods in Enzymology(1989) 121,663-669;Bird,R.E. et al., TIBTECH(1991) 9,132-137。

分解酵素切割於抗體片段的特定部位，產生如下示之特定結構的抗體片段。基因工程技術可應用於此種酵素方法得到的抗體片段，以刪除抗體的任意的部位。

使用上述分解酵素得到的抗體片段如下：

木瓜酵素消化：F(ab)2或Fab

胰蛋白酶消化：F(ab’)2或Fab’

胞漿素消化：Facb

本發明之微小抗體，只要有IL-6受體結合活性及/或中和活性，包括欠缺任一區域的抗體片段。

「雙抗體(diabody)」，意指以基因融合構築的雙價抗體片段(Holliger P et al.,1993,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448;EP 404,097;WO 93/11161等)。雙抗體係由2條多胜肽鏈組成的二聚物。於形成二聚物的各多胜肽鏈，VL及VH一般係以同鏈的連結子(linker)連結。一般而言，雙抗體中的連結子短至使得VL及VH不能彼此結合。詳言之，構成連結子的胺基酸殘基數，例如約5個殘基。因此，編碼在同一多胜肽上的VL及VH，不能形成單鏈可變區片段，且將會與另一單鏈可變區片段形成二聚物。結果，此雙抗體具有2個抗原結合部位。

ScFv抗體，係藉由以連結子等連結VH及VL而產生的單鏈多胜肽(Huston,J. S. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.(1988)85,5879-5883;Plueckthun”The Pharmacology of Monoclonal Antibodies”Vol. 113,eds.,Resenburg and Moore,Springer Verlag,New York,pp. 269-315,(1994))。scFv的H鏈V區及L鏈V區，可自任何此處所述抗體而來。用於連結V區的胜肽連結子，不特別限定。例如，可使用包含約3至25個殘基的任何單鏈胜肽作為連結子。詳言之，可使用以下所述胜肽連結子等。

該二鏈的V區可藉由例如上述PCR連結。首先，編碼如下示DNA之一的完整胺基酸序列或所欲的部分胺基酸序列的DNA作為模板，經PCR連結該V區：編碼抗體之H鏈或H鏈V區的DNA序列，及編碼抗體之L鏈或L鏈V區的DNA序列。

編碼H鏈或L鏈之V區的DNA，使用一對引子經PCR擴增，該對引子含有欲擴增的DNA的兩端的對應序列。然後，可製備編碼此胜肽連結子部分的DNA。此編碼胜肽連結子的DNA也可利用PCR合成。將可用於連結分別合成的V區擴增產物之核苷酸序列，加到欲使用的引子5’端。然後，使用[H鏈V區DNA]-[胜肽連結子DNA]-[L鏈V區DNA]的各DNA及組合PCR引子進行PCR。

此組合PCR引子，包括一組引子，其中之一與[H鏈V區DNA的5’端]黏合，另一引子與[L鏈V區DNA]之3’端黏合。換言之，此組合PCR引子為一組引子，可使用於擴增欲合成的編碼為scFv之全長序列的DNA。同時，將可用於連結各V區DNA的核酸序列加至[胜肽連結子DNA]。然後，將此等DNA連結，並且使用組合PCR引子產生完整的scFv作為最後的擴增產物。一旦編碼scFv的DNA產生，可藉由習知方法得到包含此等DNA的表現載體，及經此等表現載體形質轉換的重組細胞。又，此scFv可經由培養得到的重組細胞而表現此scFv編碼DNA而獲得。

欲連結之VH及VL的順序不特別限定，可以任意順序安排。可能的安排如下：

[VH]連結子[VL]

[VL]連結子[VH]

sc(Fv)2為一單鏈微小抗體，係藉由使用連結子等連結2個VH及2個VL而形成(Hudson et al.,1999,J Immunol. Methods 231:177-189)。Sc(Fv)2可例如使用一連結子連結scFv生產。

較佳者，一抗體之2個VH及2個VL可以從單鏈多胜肽的N端，以VH、VL、VH及VL的順序安排([VH]連結子[VL]連結子[VH]連結子[VL])。然而，2個VH及2個VL的順序不限於上述安排，且可以任意順序安排。安排的例子如下：

[VL]連結子[VH]連結子[VH]連結子[VL]

[VH]連結子[VL]連結子[VL]連結子[VH]

[VH]連結子[VH]連結子[VL]連結子[VL]

[VL]連結子[VL]連結子[VH]連結子[VH]

[VL]連結子[VH]連結子[VL]連結子[VH]

微小抗體的VH或VL的胺基酸序列，可包括取代、刪除、加成及/或***。又，只要VH及VL組合時具有抗原結合活性，則可刪除一部分或也可加入其他的多胜肽。又，此等可變區可為嵌合化或人型化。

本發明中，可用於連結抗體可變區的連結子，包括可用基因工程導入的任意胜肽連結子，及合成連結子，例如，Protein Engineering,(1996)9(3),299-305所揭露的連結子。

本發明中的較佳連結子，為胜肽連結子。胜肽連結子的長度不特別限定，熟習此項技藝的人士可依用途適當選擇長度。典型的長度為1~100個胺基酸，較佳為3~50個胺基酸，又較佳為5~30個胺基酸，更佳為12~18個胺基酸(例如，15個胺基酸)。

例如，用於胜肽連結子的胺基酸序列，包括以下序列：

Ser

Gly Ser

Gly Gly Ser

Ser Gly Gly

Gly Gly Gly Ser(序列識別號45)

Ser Gly Gly Gly(序列識別號46)

Gly Gly Gly Gly Ser(序列識別號47)

Ser Gly Gly Gly Gly(序列識別號48)

Gly Gly Gly Gly Gly Ser(序列識別號49)

Ser Gly Gly Gly Gly Gly(序列識別號50)

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser(序列識別號51)

Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly(序列識別號52)

(Gly Gly Gly Gly Ser(序列識別號47))n

(Ser Gly Gly Gly Gly(序列識別號48))n

其中，n為1以上的整數。

胜肽連結子的胺基酸序列，可由熟習該技術領域之人士依照用途適當選擇。例如，上述決定胜肽連結子長度的”n”，通常為1~5，較佳為1~3，又較佳為1~2。

合成的連結子(化學***聯劑)，包括例行性用於交聯胜肽的交聯劑，例如，N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、二琥珀醯亞胺辛二酸酯(DSS)、雙(磺基琥珀醯亞胺基)辛二酸酯(BS3)、二硫雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DSP)、二硫雙(磺基琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇雙(琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇雙(磺基琥珀醯亞胺基琥珀酸酯)(磺基-EGS)、雙琥珀醯亞胺基酒石酸酯(DST)、雙磺基琥珀醯亞胺基酒石酸酯(磺基-DST)、雙[2-琥珀醯亞胺基氧羰基氧]乙基]碸(磺基-BSOCOES)。此等交聯劑，為市售可得。

一般而言，需要3個連結子來連結4個抗體可變區。此等多數連結子可為相同或不同的連結子。

本發明中的抗體也包括在一抗體的胺基酸序列加入1個以上胺基酸的抗體。再者，本發明之抗體也包括上述抗體與另一胜肽或蛋白質融合的融合蛋白質。此融合蛋白質可藉由以下方式製備：將編碼一抗體之多核苷酸及編碼另一胜肽或多胜肽的多核苷酸在框架中連接，將此DNA導入一表現載體，並且於寄主中表現此載體。可使用熟習此項技術領域之人士已知的技術。與本發明之抗體融合的胜肽或多胜肽，可為一已知胜肽，例如，FLAG(Hopp,T. P et al.,BioTechnology 6,1204-1210(1988));6xHis，由6個組胺酸(histidine)殘基組成；10x His；流感病毒凝集素(HA)、人類c-myc片段、VSV-GP片段、p18HIV片段、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40 T抗原片段、lck tag、α-tubulin 片段、B-tag，及蛋白C片段。與本發明之抗體融合的多胜肽，例如，GST(谷胱甘肽-S-轉移酶)、HA(流感病毒凝集素)、免疫球蛋白恆定區、β-半乳糖苷酶，及MBP(麥芽糖結合蛋白質)。可將市售可得的編碼為此等胜肽或多胜肽的多核苷酸與編碼為本發明所述抗體之多核苷酸融合。融合多胜肽可藉由表現如此得到的融合多核苷酸而製備。

又，本發明所述抗體也可為連結到各種分子的接合抗體，各種分子例如，聚合物，包括聚乙二醇(PEG)及透明質酸；放射性物質；螢光物質；冷光物質；酵素，及毒素。此等接合抗體可藉由將得到的抗體以化學性修飾獲得。抗體修飾的方法在此技術領域中已建立(見例如US5057313，US5156840)。本發明之”抗體”也包括此等接合抗體。

又，本發明之抗體包括具有經改變之糖鏈的抗體。

又，本發明中使用的抗體可為雙特異性抗體(bispecific antibody)。雙特異性抗體係指在同一抗體分子上具有可辨識不同抗原決定位的可變區。本發明中之雙特異性抗體可為辨識IL-6受體分子上之不同抗原決定位的雙特異性抗體，或者其中一抗原結合部位辨識IL-6受體且另一抗原結合部位辨識另一物質的雙特異性抗體。結合於包括本發明之IL-6受體辨識抗體的雙特異性抗體的另一抗原結合部位的抗原，包括例如，IL-6、TNF α、TNFR1、TNFR2、CD80、CD86、CD28、CD20、CD19、IL-1 α、IL-beta、IL-1R、RANKL、RANK、IL-17、IL-17R、IL-23、IL-23R、IL-15、IL-15R、Blys、淋巴毒素α、淋巴毒素β、LIGHT配體、LIGHT、VLA-4、CD25、IL-12、IL-12R、CD40、CD40L、BAFF、CD52、CD22、IL-32、IL-21、IL-21R、GM-CSF、GM-CSFR、M-CSF、IFN-α、VEGF、VEGFR、VEEGF、EGFR、CCR5、APRIL，及APRILR。

用於產生雙特異性抗體之方法為已知。雙特異性抗體可藉由例如將兩種類型的辨識不同抗原的抗體連結而製備。欲連結的抗體可為半分子，各包含一H鏈及一L鏈，或四分之一分子，僅包括一H鏈。或者，可利用融合生產不同單株抗體之融合瘤，而製備生產雙特異性抗體的融合細胞。又，可利用基因工程技術生產雙特異性抗體。

如下述，本發明使用的抗體視精製方法或用於生產此抗體的細胞或寄主，在胺基酸序列、分子量、等電點、存在/不存在糖鏈，及型態，可能有所不同。然而，只要所得到的抗體在功能上等同於本發明所述抗體，則應視為包含於本發明中。例如，當於原核細胞例如大腸桿菌中表現一抗體，則甲硫胺酸會加到原始的抗體胺基酸序列的N末端。此等抗體也包括在本發明所述抗體。

本發明之抗IL-6受體抗體之多胜肽等，可利用熟習該技術領域之人士已知方法生產。

抗IL-6受體抗體，可利用熟習該技術領域之人士已知的基因重組技術，依據所得到的抗IL-6受體抗體的序列製備。詳言之，抗IL-6受體抗體可藉由依據IL-6受體辨識抗體的序列，構築編碼該抗體之多核苷酸，將此多核苷酸***一表現載體，然後將其於適當的寄主細胞中表現而製備(參見例如，Co,M. S. et al.,J. Immunol.(1994) 152,2968-2976;Better,M. and Horwitz,A. H.,Methods Enzymol.(1989) 178,476-496;Pluckthun,A. and Skerra,A.,Methods Enzymol.(1989) 178,497-515；Lamoyi,E.,Methods Enzymo1.(1986) 121,652-663；Rousseaux,J. et al.,Methods Enzymol.(1986) 121,663-669；Bird,R. E. and Walker,B. W.,Trends Biotechnol.(1991) 9,132-137)。

因此，本發明提供(i)生產本發明之多胜肽之方法，或(ii)生產一多胜肽之方法，該多胜肽係由編碼本發明之多胜肽之基因編碼，其中，該等方法包含以下步驟：培養包含一載體之寄主細胞，其中，該載體中導入有編碼本發明之多胜肽的多核苷酸。

詳言之，本發明提供生產本發明之多胜肽之方法，包含以下步驟：

(a)培養一寄主細胞，該寄主細胞包含一載體，該載體中導入有編碼為本發明之多胜肽的基因；

(b)得到由此基因編碼的多胜肽。

載體之例子，包括：M13型載體、pUC型載體、pBR322、pBluescript及pCR-Script。或者，當目標經由次選殖及切下cDNA，上述以外的載體例子尚包括：pGEM-T、pDIRECT及pT7。表現載體尤其有用於生產本發明所述抗體。例如，當表現載體用於表現在大腸桿菌，則此載體應具備能在大腸桿菌中擴增的特徵。此外，當寄主為大腸桿菌例如JM109、DH5α、HB101或XL1-Blue，具有能使其有效率地在大腸桿菌中表現的啟動子為必要，例如，lacZ啟動子(Ward et al.,Nature(1989) 341,544-546;FASEB J.(1992) 6,2422-2427)、araB啟動子(Better et al.,Science(1988)240,1041-1043)、T7啟動子等。除了上述以外，此種載體包括pGEX-5X-1(Pharmacia)、”QIAexpress system”(Quiagen)、pEGFP，及pET(於此情形，寄主較佳為BL21，其表現T7 RAN聚合酶)。

又，表現質體載體可包含針對抗體分泌的訊息序列。就用於抗體分泌的訊息序列而言，可使用pe1B訊息序列(Lei,S. P. et al.,J. Bacteriol.(1987) 169,4379)以提供在大腸桿菌胞外質內生產。載體可利用例如氯化鈣法或電穿孔法導入到寄主細胞內。

除了針對大腸桿菌的載體，用於生產本發明所述抗體的載體，包括例如：哺乳動物衍生的表現載體(例如pcDNA3(Invitrogen)、pEF-BOS(Nucleic Acids. Res.(1990)18(17),p5322)、pEF及pCDM8)、昆蟲細胞衍生之表現載體(比如”Bac-to-BAC baculovirus expression system”(Gibco-BRL)及pBacPAK8)、植物衍生之表現載體(例如，pMH1及pMH2)、動物病毒衍生之表現載體(比如，pHSV、pMV及pAdexLcw)、反轉錄病毒衍生之表現載體(比如pZIPneo)、酵母菌衍生之表現載體(比如”Pichia Expression Kit”(Invitrogen)、pNV11及SP-Q01)，及枯草桿菌(Bacillus subtilis)衍生之表現載體(例如pPL608及pKTH50)。

當使用表現質體載體於動物細胞例如CHO、COS及NIH3T3中表現時，必需具有用於在此等細胞中表現的啟動子，例如：SV40啟動子(Mulligan et al.,Nature(1979)277,108)、MMLV-LTR啟動子、EF1α啟動子(Mizushima et al.,Nucleic Acids Res.(1990)18,5322，或CMV啟動子。更佳為，此載體具有用於選擇經形質轉換之細胞的基因(例如，抗藥性基因，其容許以藥劑(新黴素(neomycin)、G418等)區分。具有此等特徵的載體包括例如：pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV，及pOP13。

此外，當目標穩定地表現基因及在細胞中擴增基因複製數，可使用一方法，對於欠缺核酸合成路徑之CHO細胞導入具有DHFR基因之載體以彌補此欠缺(例如，pSV2-dfhr(“Molecular Cloning 2^nd edition” Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989))，並將此載體使用胺甲葉酸(methotrexate，MTX)擴增。又，當目標為過渡性的基因表現，可使用一方法，將帶有表現SV 40 T抗原於其染色體的基因的COS細胞以帶有SV40複製起點(pcD等)的載體形質轉換。可使用衍生自多瘤病毒、腺病毒、牛乳突瘤病毒(BPV)等的複製起點。又，為了擴增寄主細胞株中的基因複製數，此表現載體可包含胺基配糖體轉移酶(APH)基因、胸腺嘧啶激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤-鳥糞嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等，作為選擇標記。

得到之本發明所述抗體，可從寄主細胞或從細胞外(培養基等)單離，並且純化成實質上為純且同質的抗體。此等抗體可使用習知之分離及用於抗體精製的方法精製，而不限定。例如，抗體可藉由適當選擇及組合管柱層析、過濾、超過濾、鹽析、溶劑沉澱、溶劑萃取、蒸餾、免疫沉澱、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電聚膠、透析、再結晶等，而分離及精製。

層析包括例如：親和性層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾、反向層析，及吸附層析(Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1996)。此等層析可使用液相層析例如，HPLC、FPLC實施。用於親和性層析的管柱，包括proteinA管柱，及proteinG管柱。使用proteinA管柱之例，包括HyperD、POROS及Sepharose FF(GE Amersham Biosciences)。本發明尚包括使用此等精製方法高度精製的抗體。

得到的抗體的IL-6受體結合活性，可利用熟習該技術領域之人士已知的方法測定。用於測定抗體之抗原結合活性的方法，包括例如：酵素連結免疫吸附試驗(ELISA)、酵素免疫分析(EIA)、放射性免疫分析(RIA)及螢光抗體方法。例如，當使用酵素免疫分析，係將含有抗體之樣本例如精製過的抗體及抗體生產細胞的培養上清，加至塗佈抗原的平盤。加入標記有酵素例如鹼性磷解酶的二次抗體。並將此等平盤溫育。清洗後，加入酵素基質例如對硝基苯基磷酸酯，並且測定吸光值以評估抗原結合活性。

醫藥組合物

本發明提供醫藥組合物，其包含上述多胜肽作為有效成分。本發明之醫藥組合物，可使用在IL-6相關疾病，例如類風濕性關節炎。因此，本發明也提供一種藥劑，用於治療疾病例如，類風濕性關節炎，其包含一種上述抗體作為有效成分。較佳的目標疾病之例子，包括但不限於：類風濕性關節炎、幼年特發性關節炎、全身性幼年特發性關節炎、卡斯托曼病(Castleman disease)氏病、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、狼瘡腎炎、Crohn氏病、淋巴瘤、潰瘍性大腸炎、貧血、血管炎、川崎病、Still氏病、類澱粉沉積症、多發性硬化症、移殖、年齡相關之視網膜斑退化、僵直性脊椎炎、牛皮癬、牛皮癬關節炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、IgA腎病、骨性關節炎、氣喘病、糖尿病性腎病、GVHD、內膜異位、肝炎(NASH)、心肌梗塞、動脈硬化、敗血症、骨質疏鬆症、糖尿病、多重骨髓瘤、***癌、腎癌、B細胞非Hodgkin氏淋巴瘤、胰臟癌、肺癌、食道癌、直腸癌、癌惡病質、癌神經侵入、心肌梗塞、近視脈絡膜新生血管、特發性脈絡膜血管新生、葡萄膜炎、慢性甲狀腺炎、延遲的過敏、接觸性皮膚炎、過敏性皮膚炎、間皮瘤、多發性肌炎、皮肌炎、全葡萄膜炎、前葡萄膜炎、中葡萄膜炎、鞏膜炎、角膜炎、眼窩發炎、視神經炎、糖尿病性視網膜病變、增殖性玻璃體視網膜病變、乾眼症，及手術後發炎。

用語「包含一抗IL-6受體抗體作為有效成分」，係指包含一抗IL-6受體抗體作為至少一種有效成分，但不特別限制其內容。又，本發明之醫藥組合物，可以組合上述多胜肽及其他有效成分。

本發明之醫藥組合物，可使用於治療用途，也可用於預防用途。

本發明之胺基酸序列包括的胺基酸，可經轉譯後修飾。例如，利用焦谷胺醯胺酸化將N末端的谷醯胺(Gln)殘基修飾為焦谷胺酸(pGlu)殘基，為熟習該技術領域之人士周知的方法。自然地，此種經轉譯後修飾之胺基酸也包括在本發明之胺基酸序列。

結合到本發明之抗體的糖鏈，可為任意結構。297位(EU編號法)的糖鏈，可為任意糖鏈結構(較佳為岩藻糖化糖鏈)，或在該位置不具糖鏈(例如，可藉由在大腸桿菌中生產抗體，或藉由導入改變使得在297位(EU編號法)無糖鏈結合)。

所有在此引用的先前技術，引入於此說明書作為參考。

實施例

以下，將由實施例協助說明本發明，但應了解不限定於此等實施例。

實施例1

鑑別可變區之突變部位以供增強TOCILIZUMAB對於IL-6受體之親和性

構築一已導入有突變之CDR序列之基因庫，並分析以改良TOCILIZUMAB(H鏈WT-IgG1/序列識別號53;L鏈WT-κ/序列識別號54)對於IL-6受體之親和性。CDR突變庫之篩選，找出改良針對IL-6受體之親和性的突變。此突變顯示於圖1。此等突變的組合得到高親和性TOCILIZUMAB，例如，RDC-23(H鏈RDC23H-IgG1/序列識別號55;L鏈RDC-23L-κ/序列識別號56)。在RDC-23及TOCILIZUMAB之間，比較對可溶性IL-6受體之親和性，以及使用BaF/gp130確認的生物活性(見此方法之參考實施例)。

親和性測定的結果顯示於表1。使用BaF/gp130確認之生物學活性結果(IL-6之最終濃度為30ng/ml)，顯示於圖2。結果顯示，與TOCILIZUMAB相比，RDC-23之親和性約高60倍，且以BaF/gp130之100%抑制濃度表示的活性，約高100倍。

實施例2

鑑別突變以供經由減低等電點而改良TOCILIZUMAB之藥物動力學

為了改良TOCILIZUMAB之藥物動力學，檢查以鑑別會降低可變區之等電點但不會顯著降低對於IL-6受體之結合的突變部位。篩選可變區中的突變部位，其係依照TOCILIZUMAB之三維結構模型預測者，找出會降低可變區之等電點但不會顯著降低對於IL-6受體之結合的突變部位。此等顯示於圖3。組合此等突變，得到具有降低之等電點的TOCILIZUMAB，包括例如：H53/L28(H鏈H53-IgG1/序列識別號57;L鏈L28-κ/序列識別號58)。在H53/L28及TOCILIZUMAB之間，比較針對IL-6受體之親和性、等電點、於小鼠中之藥物動力學，及使用BaF/gp130確認之生物學活性(見本方法之參考實施例)。

親和性測定之結果，如表2所示。使用BaF/gp130得到之生物學活性之測定結果(IL-6之最終濃度為30ng/ml)如圖4所示。結果顯示，比起TOCILIZUMAB，H53/L28之親和性高約6倍，且以BaF/gp130之100%抑制濃度表示之活性高約數倍。

以熟習該技術領域之人士已知的等電點電泳確認的等電點結果，顯示TOCILIZUMAB及H53/L28的等電點各為約9.3，及6.5~6.7。因此，比起TOCILIZUMAB，H53/L28的等電點減低約2.7。又，使用GENETYX(GENETYX CORPORATION)計算VH/VL的可變區的理論等電點。結果顯示：TOCILIZUMAB及H53/L28的理論等電點各為9.20及4.52。因此，與TOCILIZUMAB相比，H53/L28的等電點減低約4.7。

為了評估具有減低的等電點的經改變的抗體H53/L28的藥物動力學，比較正常小鼠的TOCILIZUMAB與H53/L28的藥物動力學。對於小鼠(C57BL/6J;Charles River Japan,Inc.)以靜脈內(IV)或皮下(SC)投予1mg/kg的單一劑量的TOCILIZUMAB或H53/L28，以評估血漿濃度的時間變化。針對TOCILIZUMAB及H53/L28靜脈內投予或皮下投予後之血漿濃度的時間變化，各顯示於圖5及圖6。使用WinNonlin(Pharsight)獲得之藥物動力學參數(清除率(clearance,CL)及半衰期(T1/2)顯示於表3。H53/L28靜脈內投予後之血漿半衰期(T1/2)延長為TOCILIZUMAB之約1.3倍，而清除率減少約1.7倍。H53/L28皮下投予後之T1/2增加為TOCILIZUMAB之約2倍，而清除率減少約2.1倍。因此，發現到：可經由胺基酸取代，使TOCILIZUMAB之等電點降低，藉此顯著改良藥物動力學。

實施例3

鑑別減低TOCILIZUMAB之免疫原性的突變部位

鑑別減少存在於可變區之T細胞抗原決定位之免疫原性風險的突變

使用TEPITOPE(Methods. 2004 Dec;34(4):468-75)分析TOCILIZUMAB序列的可變區存在的T細胞抗原決定位。結果，預測L鏈CDR2具有許多結合於HLA的T細胞抗原決定位(即，具有高免疫原性風險的序列)。因此，實施TEPITOPE分析以檢查會降低L鏈CDR2之免疫原性風險但不會降低穩定性、結合活性或中和活性的胺基酸取代。

如下所述，篩選結果證明可藉由取代TOCILIZUMAB之L鏈CDR2(序列識別號59)L51的蘇胺酸為甘胺酸，及L53之精胺酸為谷胺酸(序列識別號60)，以減低免疫原性但不降低穩定性、結合活性或中和活性(Kabat’s numbering;Kabat et al.,(1991) Sequence of Proteins ofImmunological Interest,NIH))。

TOCILIZUMAB L鏈CDR2(序列識別號59)

TOCILIZUMAB L鏈CDR2，移除T細胞抗原決定位(序列識別號60)。

實施例4

藉由將TOCILIZUMAB之可變區框架序列完全人型化，而減低免疫原性風險

於TOCILIZUMAB人型化的處理，保留一些小鼠序列於框架序列中以維持結合活性(Cancer Res. 1993 Feb 15;53(4):851-6)。此等序列為TOCILIZUMAB之可變區序列之H鏈FR1中的H27、H28、H29、H30及H鏈FR3中的H71(Kabat’s numbering; Kabat EA et al.,(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,NIH))。保留的小鼠序列，為潛在的增加免疫原性風險的原因。因此，吾人評估是否可將框架序列完全人型化以進一步減低TOCILIZUMAB之免疫原性風險。

結果顯示，TOCILIZUMAB之完整框架可以藉由取代TOCILIZUMAB之H鏈FR1(序列識別號61)為以下之人型化H鏈FR1-A(序列識別號62)，及取代H鏈FR3(序列識別號63)為以下之人型化H鏈FR3(序列識別號64)，而完全人型化但不減低穩定性、結合活性或中和活性。

TOCILIZUMAB H鏈FR1(序列識別號61)

人型化H鏈FR1-A(序列識別號62)(衍生自生殖細胞系IMGT hVH_4)

TOCILIZUMBA H鏈FR3(序列識別號63)

人型化H鏈FR3(序列識別號64)(衍生自Mol. Immunol. 2007. 44(4):412-422)

實施例5

依據TOCILIZUMAB之pH依存性連接於IL-6受體，鑑別改善藥物動力學之突變部位

改善TOCILIZUMAB之藥物動力學之方法之一，為改良該分子，使得TOCILIZUMAB之單一分子重複地連接並中和數分子的IL-6受體。假設當TOCILIZUMAB連接於膜型IL-6受體後，TOCILIZUMAB藉由與膜型IL-6受體連接，經由內化而進入胞內內囊胞，然後以連接於膜型IL-6受體之狀態傳遞到溶菌體，由溶菌體所分解。詳言之，一分子的TOCILIZUMAB通常與一或二個膜型IL-6受體分子連接(以單價或雙價方式)，且在內化後於溶菌體中分解。因此，一分子的TOCILIZUMAB僅能連接並中和一個或二個分子的膜型IL-6受體。

因此，本案發明人想到是否可創造使TOCILIZUMAB以pH依存的方式結合，其中，TOCILIZUMAB的結合可維持於中性條件下，而於酸性條件下則該連接顯著減低，以pH依存方式結合的TOCILIZUMAB能在內囊胞中從膜型IL-6受體(抗原)分離，並藉由連接存在於內囊胞的FcRn而返回血漿中，如圖7所示。一旦返回血漿中，以pH依存方式結合的TOCILIZUMAB可再次與膜型IL-6受體連接。利用此重複於血漿中之結合及於內囊胞中之分離，推想一分子的TOCILIZUMAB可重複地連接/中和數個分子的IL-6受體。因此以pH依存方式結合的TOCILIZUMAB推測比起TOCILIZUMAB具有較佳的藥物動力學。

於內囊胞中酸性條件下從IL-6受體分離的TOCILIZUMAB，其結合必相較於在中性條件下顯著地減弱。於細胞表面上，需要強力的IL-6受體結合以中和化；因此，於細胞表面pH，pH7.4，抗體與IL-6受體之結合必需同等或強於TOCILIZUMAB。已有報告顯示內囊胞pH一般為5.5~6.O(Nat Rev Mol Cell Biol. 2004 Feb;5(2):121-32)。因此，若以pH依存方式結合的TOCILIZUMAB修飾成於pH5.5~6.0微弱地連接於IL-6受體，則可預測於內囊胞中會在酸性條件下從IL-6受體分離。詳言之，若以pH依存方式結合的TOCILIZUMAB修飾成於pH7.4，其為細胞表面pH，強力地連接於IL-6受體，且於內囊胞pH，pH5.5~6.0，微弱地連接於IL-6受體，則一分子的TOCILIZUMAB可結合及中和數分子的IL-6受體，且藥物動力學可因此而改善。

對於結合TOCILIZUMAB至IL-6受體提供pH依存性之可能方法之一，為在TOCILIZUMAB之可變區引入組胺酸殘基，因為組胺酸殘基的pKa為約6.0~6.5，且其質子分離狀態在中性(pH7.4)與酸性(pH5.5~6.0)之間改變。故，依據TOCILIZUMAB之三維結構模型，針對鑑別在可變區引入組胺酸的部位進行篩選。又，將TOCILIZUMAB之選擇的可變區序列隨機以組胺酸取代以設計一篩選之庫。篩選係使用於pH7.4結合於IL-6受體且於pH5.5~5.8從IL-6受體分離或親和力降低，作為指標。

結果，本案發明人等發現：提供pH依存性(於pH7.4結合、於pH5.8分離的性質)結合TOCILIZUMAB至IL-6受體之突變部位，顯示於圖8。於圖8中，H27的酪胺酸取代為組胺酸，為H鏈FR1的突變，並非在CDR。然而，如Eur. J. Immunol.(1992) 22:1719-1728所述，在H27具有組肽酸之序列為一人類序列(序列識別號65)。因此，藉由使用以下框架組合實施例4，可將該抗體完全人型化。

人型化H鏈FR1-B(序列識別號65)

突變之組合，包括例如：H3pI/L73(H鏈H3pI-IgG1/序列識別號66；L鏈L73-κ/序列識別號67)可產生具有pH依存性結合性質的TOCILIZUMAB。H3pI/L73及TOCILIZUMAB對於可溶性IL-6受體於pH7.4的親和性、於pH7.4及pH5.8從膜型IL-6受體分離之速率、使用BaF/gp130之生物學活性，及於食蟹猴及人類IL-6受體基因轉殖小鼠中之藥物動力學被進行比較(見此方法之參考實施例)。

於pH7.4針對於可溶性IL-6受體之親和性試驗結果，如表4所示。使用BaF/gp130得到之生物學活性之試驗結果(最終IL-6濃度為30ng/ml)如圖9所示。此等結果顯示，H3pI/L73在針對可溶性IL-6受體於pH7.4之親和性及於BaF/gp130之活性上，可與TOCILIZUMAB相比。

TOCILIZUMAB或H3pI/L73於pH7.4及pH5.8從膜型IL-6受體分離之速率，測定結果如表5所示。與TOCILIZUMAB相比，於pH5.8的H3pI/L73的分離速率較快，且從膜型IL-6受體分離之速率的pH依存性增加約2.6倍。

單一劑量的TOCILIZUMAB或H3pI/L73以1mg/kg靜脈內投予到食蟹猴以評估血漿濃度的時間變化。TOCILIZUMAB或H3pI/L73以靜脈投予後之血漿濃度時間變化，顯示於圖10。結果顯示，於食蟹猴，H3pI/L73之藥物動力學，比起TOCILIZUMAB顯著改良。

單一劑量的TOCILIZUMAB或H3pI/L73以25mg/kg靜脈內投予到人類IL-6受體基因轉殖小鼠(hIL-6R tg小鼠；Proc Natl Acad Sci USA. 1995 May 23;92(11):4862-6)以評估血漿濃度的時間變化。TOCILIZUMAB或H3pI/L73以靜脈投予後之血漿濃度時間變化，顯示於圖11。結果顯示，於人類IL-6受體基因轉殖小鼠，H3pI/L73之藥物動力學，比起TOCILIZUMAB顯著改良。

H3pI/L73，一具有pH依存性結合性質之TOCILIZUMAB，於食蟹猴及人類IL-6受體基因轉殖小鼠，比起TOCILIZUMAB顯示顯著改良的藥物動力學。此代表藉由提供於pH7.4結合於抗原及pH5.8從抗原分離之性質，可利用單一分子將數分子IL-6受體結合及中和。亦可認為可藉由使IL-6受體結合比起與H3pI/L73更具pH依存性，而更進一步改良藥物動力學。

實施例6

TOCILIZUMAB恆定區之最適化

減低TOCILIZUMAB H鏈C端之異質性

已有人報告，針對IgG抗體之H鏈C端序列之異質性，由於刪除兩C端胺基酸，甘胺酸及離胺酸，刪除C端胺基酸離胺酸殘基及醯胺化C端羧基。(Anal Biochem. 2007 Jan 1;360(1):75-83)。又，於TOCILIZUMAB，其主要成分為一序列，其核苷酸序列中的C端胺基酸離胺酸藉由轉譯後修飾而刪除；然而，次要成分中的離胺酸保留，且次要成分中的C端羧基由於刪除甘胺酸及離胺酸兩者而醯胺化也貢獻於異質性。欲以大規模製備其為醫藥品而維持在生產間之目標物質/相關物質相關之異質性，並不容易且成本高。若有可能，希望開發抗體為醫藥品時，為單一物質且異質性減小。因此，當開發抗體為醫藥品時，較佳為H鏈C端異質性不存在。

C端胺基酸經改變以減少C端胺基酸異質性。結果顯示，C端衍生之異質性，可藉由預先從核苷酸序列刪除TOCILIZUMAB之H鏈恆定區之C端之離胺酸及甘胺酸殘基而避免。以陽離子交換層析評估以下之異質性：TOCILIZUMAB、缺少C端離胺酸殘基之TOCILIZUMAB(TOCILIZUMABδK：H鏈WT-IgGIδK/序列識別號68；L鏈WT-κ/序列識別號54)、缺少C端離胺酸及甘胺酸殘基之TOCILIZUMAB(TOCILIZUMABδGK：H鏈WT-IgG1δGK/序列識別號69;L鏈WT-κ/序列識別號54)。使用ProPac WCX-10 4x250mm(Dionex)管柱；移動相A使用25mmol/LMES/NaOH(pH6.1)及移動相B使用25mmol/L MES/NaOP,250mmol/L NaCl(pH6.1)。使用適當的流速及梯度。陽離子交換層析獲得之評估結果顯示於圖12。結果顯示，C端胺基酸異質性可藉由從核苷酸序列，預先刪除H鏈恆定區之C端之離胺酸及甘胺酸殘基而減低，而非僅預先刪除H鏈恆定區之C端之離胺酸殘基。所有的人類抗體IgG1、IgG2、IgG4恆定區之C端序列依照EU編號法(見Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242)在447位及446位各具有離胺酸及甘胺酸。因此，本研究中發現的用於減低C端胺基酸異質性的方法，期待使用在IgG2及IgG4恆定區及其變異體。

減少IgG2同型物TOCILIZUMAB中之雙硫鍵衍生的異質性

TOCILIZUMAB之同型物為IgG1。因為TOCILIZUMAB為一中和性抗體，連接於Fcγ受體，在免疫原性及不利效果的觀點上，可能不利。用於減低Fcγ受體結合之可能方法，為將IgG抗體之同型物從IgG1變換為IgG2或IgG4(Ann Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48)。從Fcγ受體I結合及藥物動力學之觀點，比起IgG4更希望為IgG2(Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1369-72)。同時，蛋白質之物理化學性質，尤其是同質性及穩定性於開發抗體為醫藥品時非常重要。IgG2同型物據報告由於在鉸鏈區的雙硫鍵而具有非常高的異質性(J Biol Chem. 2008 Jun 6;283(23):16206-15)。欲大規模生產其為醫藥品而同時在生產間維持目標物質/相關物質相關的衍生自雙硫鍵的異質性，並不容易且成本高。因此，儘可能希望為單一物質。因此，當開發IgG2同型物抗體為醫藥品時，較佳為減少衍生自雙硫鍵之異質性而不降低穩定性。

對於降低IgG2同型物之異質性的用途，對各種變異體進行評估。結果發現，使用WT-SKSC恆定區(序列識別號70)能降低異質性而不降低穩定性之方法，其中，IgG2恆定區序列H鏈CH1區之131位之半胱胺酸殘基及133位之精胺酸殘基(EU編號法)，各取代為絲胺酸及離胺酸，且H鏈上部鉸鏈中219位之半胱胺酸殘基，取代為絲胺酸。製備TOCILIZUMAB-IgG1(H鏈WT-IgG1/序列識別號53;L鏈WT-κ/序列識別號54)、TOCILIZUMAB-IgG2(H鏈WT-IgG2/序列識別號71;L鏈WT-κ/序列識別號54)及TOCILIZUMAB-SKSC(H鏈WT-SKSC/序列識別號70;L鏈WT-κ/序列識別號54)並用於評估異質性及穩定性。異質性係以陽離子交換層析評估。使用ProPac WCX-10(Dionex)管柱：移動相A使用20mM乙酸鈉(pH5.0)及移動相B使用20mM乙酸鈉、1M NaCl(pH5.0)。使用適當的流速及梯度。由陽離子交換層析得到的評估結果，如圖13所示。穩定性依據以差示掃描熱量計(DSC)(VP-DSC:Microcal)決定之熱變性(Tm值)中的中間溫度評估。於20mM乙酸鈉、150mM NaCl、pH6.0及Fab區之Tm值的DSC測定結果，如圖14所示。

結果顯示，比起TOCILIZUMAB-IgG1，TOCILIZUMAB-IgG2的異質性明顯增加；然而，異質性可藉由轉變為TOCILIZUMAB-SKSC而顯著減低。又，與TOCILIZUMAB-IgG1相較，TOCILIZUMAB-IgG2之DSC在Fab區之熱變性峰部，有一低穩定性的肩峰(Fab*)成分，即低Tm，其推測係由於異質性成分而生。然而，當轉變為TOCILIZUMAB-SKSC，認為由於異質成分而產生的肩峰(低Tm)消失，且Tm值約94℃，等同於TOCILIZUMAB-IgG1及TOCILIZUMAB-IgG2之Fab區。故，TOCILIZUMAB-SKSC顯示高穩定性。

鑑別TOCILIZUMAB之恆定區之藥物動力學改良突變部位

如上述，起自IgG1，其為TOCILIZUMAB之同型物，減低C端異質性及減低IgG2同型物之抗體恆定區的異質性而同時減少結合至Fcγ受體並維持高穩定性，可以達成。又，較佳為該恆定區也較IgG1，TOCILIZUMAB之同型物，具有更優越的藥物動力學性質。

為了尋找比具有IgG1同型物恆定區之抗體具有更優越之血漿半衰期的恆定區，實施篩選以鑑別用於改良TOCILIZUMAB-SKSC之藥物動力學之突變部位，該TOCILIZUMAB-SKSC具有與上述具有IgG2同型物恆定區之抗體相關的高穩定性及減低的異質性。結果，發現到WT-M58(序列識別號72(胺基酸序列)，其中，相較於WT-SKSC，EU編號的137位的谷胺酸取代為甘胺酸，138位之絲胺酸取代為甘胺酸，268位之組胺酸取代為谷醯胺，355位之精胺酸取代為谷醯胺，419位之谷醯胺取代為谷胺酸，其中，446位之甘胺酸及447位之離胺酸被刪除以減少H鏈C端的異質性。此外，製備WT-M44(序列識別號73)(胺基酸序列)，相對於IgG1，具有434位的天冬醯胺取代為丙胺酸。又，從M44刪除446位之甘胺酸及447位之離胺酸以產生WT-M83(序列識別號74(胺基酸序列))，以減低H鏈C端之異質性。此外，藉由將WT-M58的434位的天冬醯胺以丙胺酸取代，而生產WT-M73(序列識別號75(胺基酸序列))。

製備TOCILIZUMABM-44(H鏈WT-M44/序列識別號73;L鏈WT-κ/序列識別號54)、TOCILIZUMABM-58(H鏈WT-M58/序列識別號58/序列識別號72;L鏈WT-κ/序列識別號54)及TOCILIZUMAB-M73(H鏈WT-M73/序列識別號75;L鏈WT-κ/序列識別號54)，並使用人類FcRn基因轉殖小鼠評估其對於人類FcRn及藥物動力學(見本方法之參考實施例)。

使用Biacore評估TOCILIZUMAB-IgG1、TOCILIZUMAB-M44、TOCILIZUMAB-M58及TOCILIZUMAB-M73於人類FcRn的結合。如表6所示，TOCILIZUMAB-M44、TOCILIZUMAB-M58及TOCILIZUMAB-M73分別優於TOCILIZUMAB-IgG1之結合的約2.7倍、1.4倍、3.8倍。

就TOCILIZUMAB-IgG1、TOCILIZUMAB-M44、TOCILIZUMAB-M58，及TOCILIZUMAB-M73於人類FcRn基因轉殖小鼠中的藥物動力學進行評估。結果如圖15所示。如圖15所示，比起TOCILIZUMAB-IgG1，TOCILIZUMAB-M44、TOCILIZUMAB-M58，及TOCILIZUMAB-M73，均顯示較佳的藥物動力學。改良藥物動力學之效果與結合至人類FcRn之能力係具相關性。尤其，28天後在血漿中的TOCILIZUMAB-M73的濃度，比起TOCILIZUMAB-IgG1，改良約16倍。因此，推測具有M73之恆定區之抗體在人類，也比起具有IgG1恆定區之抗體，具有顯著改良的藥物動力學性質。

實施例7

製備具有改良的PK/PD的全人型化IL-6受體抗體

利用組合上述實施例中發現到的TOCILIZUMAB的可變區及恆定區的多個突變，製備TOCILIZUMAB變異體。從許多篩選中找到的完全人型化IL-6受體抗體，為：Fv3-M73(H鏈VH4-M73/序列識別號25;L鏈VL1-κ/序列識別號28)、Fv4-M73(H鏈VH3-M73/序列識別號26;L鏈VL3-κ/序列識別號29)及Fv5-M83(H鏈VH5-M83/序列識別號27;L鏈VL5-κ/序列識別號30)。

比較製備的Fv-M73、Fv4-M73、Fv5-M83對IL-6受體之親和性與TOCILIZUMAB對IL-6受體之親和性(見本方法之參考實施例)。此等抗體對可溶性IL-6受體於pH7.4的親和性，如表7所示。又，比較其與TOCILIZUMAB及對照組(已知的參考實施例中所述高親和性抗IL-6受體，及US2007/0280945所述VQ8F11-21 hIgG1)的BaF/gp130中和活性(見本發明之參考實施例)。使用BaF/gp130決定此等抗體之生物學活性的結果如圖16所示(TOCILIZUMAB、對照組、Fv5-M83最終IL-6濃度為300ng/ml)及圖17所示(TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73最終IL-6濃度為30ng/ml)。如表7所示，Fv3-M73、Fv4-M73比起TOCILIZUMAB的親和性高約2~3倍，而Fv5-M83比起TOCILIZUMAB親和性高約100倍(因難以測定Fv5-M83之親和性，使用Fv5-IgG1測定親和性(H鏈VH5-IgG1/序列識別號76;L鏈VL5-κ/序列識別號30)，Fv5-M83具有一IgG1形式的恆定區；該恆定區通常認為對親和性無影響)。如圖17所示，Fv3-M73、Fv4-M73比起TOCILIZUMAB的活性稍高。如圖16所示，Fv5-M83的活性非常強，以50%抑制濃度計，高於TOCILIZUMAB 100倍。Fv5-M83也以50%抑制濃度計，比起對照組(已知的高親和性抗IL-6受體抗體)顯示約10倍高的中和活性。

決定TOCILIZUMAB、Fv3-M73及Fv4-M73於pH7.4及pH5.8從膜型IL-6受體分離之速率。如表8(見本方法參考實施例)所示結果證明，Fv3-M73及Fv4-M73從膜型IL-6受體之分離速率之pH依存性，比起TOCILIZUMAB，各改善約11倍及10倍。相對於如實施例5所述H3pI/L73之分離速率的pH依存性有相當大的改善，顯示當相較於H3pI/L73，Fv3-M73及Fv4-M73之藥物動力學可顯著改善。

使用熟習該技術領域之人士已知的方法，以等電聚焦電泳決定TOCILIZUMAB、對照組、Fv3-M73、Fv4-M73、Fv5-M83的等電點。結果顯示，TOCILIZUMAB之等電點約9.3；對照組之等電點約8.4~8.5;Fv3-M73之等電點約5.7~5.8;Fv4-M73之等電點約5.6~5.7;Fv5-M83之等電點約5.4~5.5。因此，比起TOCILIZUMAB及對照組，各抗體具有顯著較低的等電點。又，以GENETYX(GENETYX CORPORATION)計算可變區VH/VL之理論等電點。結果顯示，TOCILIZUMAB之等電點約9.20;對照組之等電點為7.79;Fv3-M73之等電點為5.49;Fv4-M73之等電點為5.01;Fv5-M83之等電點為4.27。因此，比起TOCILIZUMAB及對照組，各抗體具有顯著較低的等電點。由實施例2中顯示藉由降低等電點，藥物動力學改良，故Fv3-M73、Fv4-M73及Fv5-M83被認為比起TOCILIZUMAB及對照組，藥物動力學改善。

使用TEPITOPE(Methods. 2004 Dec;34(4):468-75)分析TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73及Fv5-M83的可變區序列的T細胞抗原決定位。結果，預測TOCILIZUMAB具有T細胞抗原決定位，其中有許多結合於HLA，如實施例3所示。反之，預測結合於T細胞抗原決定位之序列數目，在Fv3-M73、Fv4-M73及Fv5-M83顯著減少。此外，Fv3-M73、Fv4-M73或Fv5-M83的框架不具有小鼠序列，且因此完全人型化。此等表示比起TOCILIZUMAB，Fv3-M73、Fv4-M73及Fv5-M83的免疫原性風險可能顯著減低。

實施例8

於猴中之完全人型化IL-6受體抗體之PK/PD測試

TOCILIZUMAB、對照組、Fv3-M73、Fv4-M73及Fv5-M83，以靜脈內注射一次劑量1mg/kg到食蟹猴以評估血漿濃度之時間變化(見本方法之參考實施例)。靜脈內注射後之TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73及Fv5-M83的血漿濃度時間變化，如圖18所示。結果顯示，Fv3-M73、Fv4-M73及Fv5-M83，比起TOCILIZUMAB及對照組，在食蟹猴中顯示顯著改良的藥物動力學。其中，比起TOCILIZUMAB，Fv3-M73及Fv4-M73顯示高度改良的藥物動力學。

評估各抗體中和膜型食蟹猴IL-6受體之效力。於抗體投予後(TOCILIZUMAB為第3日至第10日)，將食蟹猴IL-6從第6至第18日，以5 μg/kg每天以皮下投予在下背，並於24小時後決定各動物的CRP濃度(見本方法之參考實施例)。各抗體投予後之CRP濃度之時間變化，顯示於圖19。為了評估各抗體中和可溶性食蟹猴IL-6受體之效力，決定食蟹猴中之游離可溶性食蟹猴IL-6受體的血漿濃度，並且，計算游離可溶性IL-6受體之百分比(見本方法之參考實施例)。各抗體投予後之游離可溶性IL-6受體之百分比時間變化，如圖20所示。

比起TOCILIZUMAB及對照組(已知的高親和性抗IL-6受體抗體)，Fv3-M73、Fv4-M73及Fv5-M83以較持續方式中和膜型食蟹猴IL-6受體，且在較長期間內抑制CRP增加。又，比起TOCILIZUMAB及對照組，Fv3-M73、Fv4-M73及Fv5-M83以較持續方式中和游離可溶性食蟹猴IL-6受體，且在較長期間內抑制游離可溶性食蟹猴IL-6受體增加。此等發現證明，Fv3-M73、Fv4-M73及Fv5-M83比起TOCILIZUMAB及對照組，在持續中和膜型及可溶性IL-6受體方面為佳。其中，Fv3-M73、Fv4-M73在持續中和方面顯著優越。同時，Fv5-M83比起Fv3-M73、Fv4-M73，更強力抑制CRP及游離可溶性食蟹猴IL-6受體。因此，Fv5-M83據認為在中和膜型及可溶性IL-6受體方面，強於Fv3-M73、Fv4-M73及對照組(已知的高親和性抗IL-6受體抗體)。據認為此等食蟹猴體內的結果，反映相對於對照組，Fv5-M83對IL-6受體的較強親和力及Fv5-M83在BaF/gp139試驗系中的較強生物學活性。

此等發現代表，比起TOCILIZUMAB及對照組，Fv3-M73、Fv4-M73於作為抗IL-6抗體中和抗體的活性具有高度優越的持續性，且因此能顯著減低劑量及投予頻率。又，Fv5-M83證明在作為抗IL-6受體中和抗體之活性強度及強度持續性方面，顯著優越。因此，Fv3-M73、Fv4-M73及Fv5-M83期待作為醫藥品IL-6拮抗劑為有用。

實施例9

選擇Fv4-M73用之穩定的緩衝液種類

以如上所述方法製備Fv4-M73。由於Fv4-M73，如實施例6-7，由非天然恆定區M73組成以改良異質性、穩定性、安全性及藥物動力學，Fv4-M73之穩定性概況(比如，最穩定緩衝液種類)，可能與由天然恆定區組成之抗體例如IgG1不同。據報告，由天然IgG1恆定區組成的抗體，通常在組胺酸-乙酸鹽緩衝液中為最穩定(WO/2006/044908)。因此，測定緩衝液種類對於Fv4-M73之穩定性的效果。

將Fv4-M73配方於4種不同的pH6.0的緩衝液配方中，使最終濃度為37mg/mL(如表9所述)。將此等樣本於40℃的保存條件保存超過2個月的期間，以UV檢測，以尺寸排除層析及陰離子交換層析分析，此等配方中形成的凝集物百分比，以時間顯示於圖21。凝集物之百分比增加，代表抗體之穩定性下降的指標。因此，使用百分比增加，作為比較不同緩衝液的穩定效果的指標。

如圖21所示，具組胺酸-HCl緩衝液(配方A)及檸檬酸鹽緩衝液(配方D)之配方，最為穩定，而具乙酸鹽緩衝液之配方(配方C)最為不穩定。組胺酸-乙酸鹽(配方B)比起組胺酸-HCl緩衝液稍為較不穩定，據推測係由於乙酸鹽緩衝液之去穩定化作用所致。

因此，發現到：具有非天然恆定區之Fv4-M73在組胺酸-HCl緩衝液及檸檬酸鹽緩衝液中為最穩定，而非如報導的組胺酸-乙酸鹽緩衝液為天然IgG1抗體最為穩定之緩衝液種類。

方法

尺寸排除層析(SEC) ：實施尺寸排除層析法，以篩選存在抗體凝集物及片段的抗體配方。將樣本注入尺寸排除G3000 SW_XL 管柱(TOSOH)。移動相為50mM磷酸鈉、300mM氯化鈉(pH7.0)、以流速0.5mL/min等梯度流動。提取的蛋白質於200nm偵測UV吸光度。檢測到的任何蛋白質種類的相對量，係以產物峰部相對於所有其他檢測到之峰部的總面積百分比表現。早於抗體單體峰部提取出的峰部，記錄為凝集物百分位，而晚於抗體單體峰部但早於緩衝液峰部提取出的峰部，記錄為片段百分位。

樣本製備：將樣本以移動相稀釋為0.3~2mg/mL，並注射15μL至管柱中。

陰離子交換層析：實施陰離子交換層析以分析存在異質性之抗體配方，尤其是存在去醯胺化(係在主峰部後以酸性種類提出的經去醯胺化者)。將樣本於40℃注入DEAE-NPR 管柱(TOSOH)。移動相(A)為10mMTris-HCl(pH7.5),B)、10mM Tris-HCl、500mM氯化鈉(pH7.5)，梯度為100%移動相A，之後30分鐘70%移動相A及30%移動相B，然後1分鐘100%移動相B，然後維持4分鐘將管柱以流速1.0mL/min清洗。提取的蛋白質於280nm檢測UV吸光度。

樣本製備：將樣本以移動相稀釋為0.05~0.33mg/mL，並注射100μL至管柱中。

實施例10

pH、NaCl及精胺酸-HCl對於Fv4-M73於100mg/mL之穩定性的作用

將Fv4-M73配方在不同的緩衝液配方(如表10所示，使最終濃度為100mg/mL，並以尺寸排除層析法及陰離子交換層析法，以UV檢測保存在25及40℃超過2個月的樣本，並且也檢測冷凍-解凍的樣本(於-20℃冷凍0.5天，再於室溫解凍30分鐘。配方中存在的凝集物百分比，及於25及40℃保存2/4/8週後比起起初增加的凝集物百分比，如圖22-25所示。凝集物增加量作為穩定性降低的指標。

實際值(pH)

圖26中的低分子量種類(LMW)，推測係弱點例如鉸鏈部在酸性或鹼性條件下直接水解胜肽鍵的結果。此對於液體配方中的單株抗體於高溫為尤其常見。酸性種類於約22.5~26分鐘提取出，其於鹼性條件增加，且見於圖27，推測係由於天冬醯胺殘基之非酵素性去醯胺化(常見的抗體修飾)，其據報告，藉由將抗體在高溫於鹼性pH溫育後，觀察更為酸性之種類，係參與單株抗體之電荷異質性。考慮圖22-26之結果，發現Fv4-M73關於凝集及分解，在pH值約5.5~6.3於溶液中為穩定的。觀察到，關於相對於總峰部面積之主峰部比值，pH約5.5~6.3為最適穩定度(圖27-28)。

在本研究中，將100mM NaCl添加到含有20mM緩衝劑及50mM NaCl(20mM緩衝液，150mM NaCl)的緩衝液中，能帶來與含有20mM緩衝劑及50mM NaCl(20mM緩衝液，50mM NaCl)同等穩定的抗體溶液，表示NaCl沒有穩定作用。而添加100mM精胺酸至含有20mM緩衝劑及50mM NaCl(20mM緩衝液、50mM NaCl及100mM精胺酸-HCl)之緩衝液中，顯示相對於凝集，該抗體溶液之顯著穩定作用，代表精胺酸-HCl具有顯著的穩定效果。就緩衝劑而言，使用組胺酸-HCl緩衝液比起檸檬酸鹽緩衝液的溶液穩定性稍佳。

關於冷凍-解凍研究(“FT”代表冷凍/解凍循環之數)，如圖29所示，較低pH或較低鹽濃度之配方中觀察到顯著量的凝集物。添加100mM精胺酸到含有20mM緩衝劑及50mM NaCl(20mM緩衝液、50mM NaCl、100mM精胺酸-HCl)之緩衝液中，顯示在形成凝集物方面，比起添加100mM NaCl(20mM緩衝液、150mM NaCl)更為有效，顯示精胺酸-HCl對冷凍-解凍具有顯著的穩定作用。最適穩定性在含有100mM精胺酸-HCl之約5.0~6.6之pH觀察到。

實施例11

糖及精胺酸-HCl對於Fv4-M73在100mg/mL的作用

將Fv4-M73配方於4種不同的緩衝液配方中，使最終濃度為100mg/mL(如表11所述)。將此等樣本於25及40℃的保存條件保存超過2個月的期間，以UV檢測，以尺寸排除層析法及陰離子交換層析法分析，並使進行一特定數的冷凍/解凍循環(於-20度冷凍0.5日，並於室溫解凍30分鐘)。配方中含的凝集物的百分比，從起初之增加以時間繪圖並顯示於圖30及31。凝集物量之增加百分比，為穩定性降低之指標。

如圖30及31所示，配方F及G比起配方H提供較少的穩定性，顯示蔗糖及海藻糖比起精胺酸-HCl於保存在25及40℃的液體條件下，具有較小的穩定作用，而於冷凍-解凍，配方F及G比起配方H提供可匹敵的或更高的穩定性，顯示蔗糖或海藻糖在冷凍-解凍具有顯著的穩定作用。

實施例12

Fv4-M73於200mg/mL之穩定性：pH、精胺酸-HCl及海藻糖的作用

將Fv4-M73配方在如表12所述6種不同的配方，最終濃度200mg/mL。

將樣本各於5℃及-20℃溫育3個月及6個月，將3個月樣本及6個月樣本以如實施例9所述使用尺寸排除層析法分析，以UV檢測。3個月及6個月後，於5℃在此配方中凝集物從起始增加的百分比，如圖32所示。3個月及6個月後，於-20℃在此配方中凝集物從起始增加的百分比，如圖33所示。

如圖32所示，於保存在5℃之液體條件下，Fv4-M73顯然在較低pH較穩定(於pH5.5最穩定，於pH6.5最不穩定)，且於較高精胺酸濃度較穩定(於150mM精胺酸-HCl最穩定，於50mM精胺酸-HCl最不穩定)。添加50mM海藻糖顯示對於保存於5℃之液體條件中的Fv4-M73有一些穩定作用。因為抗體之醫藥液體配方常保存在5℃，故較佳的Fv4-M73的液體配方應至少包含100mM精胺酸-HCl及組胺酸緩衝液pH5.5~pH6.0，及視需要的額外的穩定劑。

如圖33所示，於-20℃之冷凍保存條件，Fv4-M73在較高pH較為穩定，且明顯在較高精胺酸濃度較為穩定(在150mM精胺酸-HCl最穩定，且於50mM精胺酸-HCl最不穩定)。添加50mM海藻糖於-20℃保存之冷凍保存條件下，顯示對於Fv4-M73有顯著的穩定作用。抗體的大批物質時常以冷凍狀態保存在-20~-70℃。考量在冷凍狀態的保存及運送成本，希望為-20℃保存。較佳的用於在-20℃保存Fv4-M73之大批物質配方，應至少包含100mM精胺酸-HCl及組胺酸緩衝液pH5.5~pH6.5及糖(例如海藻糖)。

參考實施例

製備可溶性重組人類IL-6受體

依如下方式生產係為抗原之人類IL-6受體之可溶性重組人類IL-6受體。產生結構性地表現含有來自J. Biochem.(1990)108,673-676(Yamasaki et al.,Science(1988)241,825-828(GenBank *X12830)之N末端第1~344位胺基酸序列之可溶性人類IL-6受體的CHO細胞株。將可溶性人類IL-6受體從表現SR344之CHO細胞培養上清，以3管柱層析精製：Blue Sepharose 6 FF管柱層析、使用固定化有專一於SR344之抗體的管柱進行親和性層析，及凝膠過濾管柱層析。以主峰部提取的分部，使用作為最終精製樣本。

製備可溶性重組食蟹猴IL-6受體(cIL-6R)

依據已揭露的恆河猴(Rhesus monkey)IL-6受體的基因序列(Birney et al.,Ensembl 2006,Nucleic Acids Res. 2006 Jan 1;34(Database issue:D556-61)，製備寡DNA引子。使用此引子，以從食蟹猴之胰臟製備之cDNA為模板，以PCR製備編碼為完整食蟹猴IL-6受體基因之DNA片段。將得到的DNA片段***哺乳動物表現載體，並使用此載體製作穩定的表現CHO細胞株(cyno. sIL-6R生產CHO細胞株)。將cyno. sIL-6R生產CHO細胞株使用HisTrap管柱(GE Healthcare Bioscience)精製，並以Amicon Ultra-15 Ultracel-10k(Millipore)濃縮。進一步在Superdex200pg16/60凝膠管柱(GE Healthcare Bioscience)精製後，得到最終精製的可溶性食蟹猴IL-6受體的樣本(以下稱為cIL-6R)。

製備重組食蟹猴IL-6(cIL-6)

以如下程序製備食蟹猴IL-6。製備寄存於SWISSPROT存取編號P79341之編碼為212個胺基酸的核苷酸序列，並選殖到一哺乳動物表現載體。將得到的載體導入CHO細胞，以製備一穩定的表現細胞株(cynoIL-6生產CHO細胞株)。將cynoIL-6生產CHO細胞株之培養基使用SP-Sepharose/FF管柱(GE Healthcare Bioscience)精製，並以Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Millipore)濃縮。進一步在Superdex200pg16/60凝膠管柱(GE Healthcare Bioscience)精製後，再以Amicon Ultra-15 Ultracel-5k(Millipore)濃縮後，得到最終精製的食蟹猴IL-6樣本(以下稱為cIL-6)。

製備已知的高親和性抗IL-6受體抗體

構築一哺乳動物細胞表現載體以表現VQ8F11-21 hIgG1，VQ8F11-21 hIgG1為已知的高親和性抗IL-6受體抗體。VQ8F11-21 hIgG1敘述於US2007/0280945 A1(US2007/0280945 A1；各於序列識別號77及78所列H鏈及L鏈的胺基酸序列)。使用合成寡DNA(組合PCR)之組合以PCR構築抗體可變區，並使用IgG1作為恆定區。將抗體可變區及恆定區以組合PCR(assembly PCR)組合在一起，並***哺乳動物表現載體以構築供關注之H鏈及L鏈的表現載體。以熟習該技術領域之人士已知的方法決定得到的表現載體的核苷酸序列。使用如實施例1所述方法，構築表現載體，表現及純化該高親和性抗IL-6受體抗體(以下簡稱為”對照組”)。

製備、表現及精製TOCILIZUMAB變異體

依照QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)所附指導手冊，製備TOCILIZUMAB變異體。將得到的質體片段***哺乳動物細胞表現載體，以構築供關注之H鏈及L鏈的表現載體。以熟習該技術領域之人士已知的方法確認得到之表現載體的核苷酸序列。抗體以如下方法表現。將人類胚胎腎癌衍生之HEK293H細胞株(Invitrogen)懸浮於補充有10%胎牛血清(Invitrogen)之DMEM(Invitrogen)。將細胞以細胞密度5~6x10⁵ cells/ml各注10mL於供黏著細胞之培養皿(直徑10cm；Corning)，並在CO₂ 培養箱(37℃，5%C0₂ )培養一整天及一整夜。然後，以抽吸除去培養基，添加6.9mL CHO-S-SFM-II培養基(Invitrogen)。將製備的質體以脂轉染法導入細胞。收集的到的培養上清，離心(約2000g，5min，室溫)以移除細胞，並經0.22μm濾膜MILLEX-GV(Millipore)過濾以除菌，以得到上清。將抗體從得到之培養上清，使用rProtein A Sepharose^TM Fast Flow(Amersham Biosciences)以熟習該技術領域之人士所知方法精製。為了決定精製抗體的濃度，使用光譜分光計測定280nm的吸光度。以PACE方法(Protein Science 1995;4:2411-2423)計算吸光度係數，由決定的值計算抗體濃度。

建立人類gp130-表現BaF3細胞株

使用以下所述程序建立表現人類gp130之BaF3細胞株，以得到以IL-6依存方式增殖的細胞株。

以PCR擴增全長人類gp130 cDNA(Hibi et al., Cell(1990) 63:1149-1157(GenBank #NM_002184)，並選殖到表現載體pCOS2Zeo以構築pCOS2Zeo/gp130。pCOS2Zeo為一表現載體，係藉由從pCHOI(Hirata et al.,FEBS Letter(1994) 456:244-248)移除DHFR基因表現區並***Zeocin抗藥基因之表現區而構築。全長人類IL-6R cDNA以PCR擴增，並選殖到pcDNA3.1(+)(Invitrogen)以構築hIL-6R/pcDNA3.1(+)。

將pC0S2Zeo/gp130 10μg與懸浮在PBS之BaF3細胞(0.8x10⁷ cells)混合，然後，於0.33kV及950micro FD使用Gene Pulser(Bio-Rad)脈衝。將具有以電穿孔法導入基因之BaF細胞於補充有0.2ng/ml小鼠IL-3(Peprotech)及10%胎牛血清(以下稱為FBS,HyClone)之RPMI 1640培養基(Invitrogen)培養一整天及一晚，並藉由添加補充有100ng/ml人類IL-6(R＆D systems)、100ng/ml人類IL-6可溶性受體(R＆D systems)及10% FBS之RPMI 1640培養基，以建立一表現人類gp130之BaF3細胞株(以下稱為”BaF3/gp130”)。此BaF/gp130於存在人類IL-6(R＆D systems)及可溶性人類IL-6受體時增殖，且可用於評估抗IL-6受體抗體之生長抑制活性(或IL-6受體中和活性)。

以表現人類gp130之BaF細胞株(BaF/gp130)評估生物學活性

使用以IL-6/IL-6受體依存方式增殖之BaF3/gp130，評估IL-6受體中和活性。以補充有10%FBS之RPMI 1640清洗3次後，將BaF/gp130於補充有600ng/ml或60ng/ml人類IL-6(TORAY)、適量可溶性人類IL-6受體及10%FBS之RPMI1640懸浮成5x10⁴ cells/ml(最終濃度為300ng/ml或30ng/ml)。將細胞懸浮液分注(50 microliter/well)於96井平盤(CORNING)。然後，將經精製的抗體以含有10%FBS之RPMI1640稀釋，並添加至各井(50microliter/well)。將細胞於5%CO₂ 下於37℃溫育3天。將WST-8試劑(Cell Counting Kit-8;Dojindo Laboratories)以PBS稀釋2倍。當20μL藥劑添加至各井後，立即使用SUNRISE CLASSIC(TECAN)測量450nm(參考波長：620nm)之吸光度。培養2小時後，再於450nm(參考波長：620nm)測量吸光度。在2小時期間，使用吸光度之改變作為指標評估IL-6受體中和活性。

依據Biacoare分析對可溶性人類IL-6受體之結合

使用Biacore T100(GE Healthcare)分析抗原-抗體反應動力學。藉由以胺偶合方法固定化適當量的蛋白A或蛋白A/G或抗IgG(γ鏈專一性)F(ab’)2在感應晶片上，將該關注的抗體於pH7.4結合在晶片上，並在該晶片上於pH7.4跑動調整為各種濃度的可溶性IL-6受體作為分析物，測定可溶性人類IL-6受體抗體交互作用。所有的測定係於37℃進行。由測定值得到之感應譜，計算動力學參數，結合速率常數k_a (1/Ms)及解離速率常數k_d (1/s)。然後，依據此速率常數，決定K_D (M)。使用Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)決定各自的參數。

使用Biacore評估從膜型IL-6受體之pH依存性解離

使用Biacore T100(GE Healthcare)觀察於pH5.8及pH7.4，與膜型IL-6受體的抗原抗體交互作用。藉由評估與固定化在感應晶片上的可溶性人類IL-6受體的結合，來評估與膜型IL-6受體之結合。SR344係以熟習該技術領域之人士所知的方法生物素化(biotinylate)。基於生物素與鏈親和素(Streptavidin)間的親和性，經由鏈親和素將經生物素化的可溶性人類IL-6受體固定化在感應晶片上。所有的測定係於37℃進行。移動相緩衝液為10mM MES(pH5.8)、150mM NaCl及0.05% Tween20。將顯示pH依存性結合的選殖體(clone)，於pH7.4的條件注入，以連接到可溶性人類IL-6受體(注射樣本緩衝液為10mM MES(pH7.4)、150mM NaCl及0.05% Tween20)。然後，於pH5.8觀察各選殖體的pH依存性解離，此pH為移動相之pH。使用Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)，藉由僅符合在pH5.8的解離相，計算於pH5.8之解離速率常數(kd(1/s))。樣本濃度為0.25 μg/ml。結合實施於10mM MES(pH7.4)、150mM NaCl、及0.05% Tween 20，解離實施於10mM MES(pH5.8)、150mM NaCl及0.05% Tween20。同樣地，藉由僅符合在pH7.4的解離相，計算於pH7.4之解離速率常數(kd(1/s))。樣本濃度為0.5 microgramme/ml。結合實施於10mM MES(pH7.4)、150mM NaCl、及0.05% Tween 20，解離實施於10mM MES(pH7.4)、150mM NaCl及0.05% Tween20。

評估對於人類FcRn之結合

FcRn為FcRn及β2-微球蛋白之複合體。依已揭露的人類FcRn基因序列(J. Exp. Med.(1994) 180(6):2377-2381)製備寡DNA引子。使用人類cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA,Clontech)作為模板及已製備的引子，以PCR製備編碼為完整基因的DNA片段。使用得到的DNA片段作為模板，以PCR擴增編碼為含有訊息區(Met1-Leu290)之胞外區的片段，並***一動物細胞表現載體(列於序列識別號79之人類FcRn之胺基酸序列)。同樣地，依據已揭露的人類β2-微球蛋白基因序列(Proc. Nat1. Acad. Sci. USA(2002)99(26):16899-16903)，製備寡DNA引子。使用人類cDNA(Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA,CLONTECH)作為模板及製備的引子，以PCR製備編碼為完整基因的DNA片段。使用此得到的DNA片段作為模板，以PCR擴增含有信息區(Met1-Met119)之編碼為完整β2-微球蛋白之DNA片段，並***一哺乳動物細胞表現載體(列於序列識別號80之人類β2-微球蛋白之胺基酸序列)。

以如下程序表現可溶性人類FcRn。將針對人類FcRn及β2-微球蛋白構築之質體，使用10% FBS以脂質轉染法導入人類胚胎腎癌衍生之細胞株HEK293H(Invitrogen)之細胞中。收集得到之培養上清，依照J. Immunol. 2002 Nov1;169(9):5171-80所述方法，精製FcRn係使用IgG Sepharose6 Fast Flow(Amersham Biosciences)，再使用HiTrap Q HP(GE Healthcare)進一步精製。

決定小鼠血漿中之抗體濃度

依照熟習該技術領域之人士所知的方法，以ELISA決定小鼠血漿中之抗體濃度。

以PK/PD測試確認猴血漿中之抗體濃度、CRP濃度， 及游離可溶性IL-6受體

使用熟習該技術領域之人士已知方法以ELISA確認食蟹猴中的血漿濃度。

以自動化分析儀(TBA-120FR;Toshiba Medical Systems Co.)使用Cias R CRP(KANTO CHEMICAL CO.,Inc.)決定CRP之濃度。

以如下程序確認食蟹猴中游離的可溶性食蟹猴IL-6受體之血漿濃度。藉由載入30μL食蟹猴血漿於0.22 μM濾杯乾燥(Millipore)之一適當量的rProtein A Sepharose Fast Flow樹脂(GE Healthcare)，使所有在血漿中之IgG型之抗體(食蟹猴IgG、抗人類IL-6受體抗體，及抗人類IL-6受體抗體-可溶性食蟹猴IL-6受體複合體)吸附到蛋白A。然後，將杯中之溶液使用高速離心轉下以收集通過的溶液。通過的溶液不含蛋白A連接的抗人類IL-6受體抗體-可溶性食蟹猴IL-6受體複合體。因此，可藉由測定通過ProteinA之溶液中的可溶性食蟹猴IL-6受體濃度，決定游離之可溶性IL-6受體濃度。使用熟習此項技術領域之人士已知用於測定可溶性人類IL-6受體之濃度的方法，確認可溶性食蟹猴IL-6受體之濃度。使用如上述製備之可溶性食蟹猴IL-6受體(cIL-6R)作為標準。以下式計算游離之可溶性IL-6受體之百分比。

<210>　74

<211>　447

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　74

<210>　75

<211>　443

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　75

<210>　76

<211>　449

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　76

<210>　77

<211>　446

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　77

<210>　78

<211>　214

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　78

<210>　79

<211>　267

<212>　PRT

<213>　Homo sapiens

<400>　79

<210>　80

<211>　99

<212>　PRT

<213>　Homo sapiens

<400>　80

<210>　81

<211>　16

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　81

<210>　82

<211>　16

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　82

<210>　83

<211>　16

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　83

<210>　84

<211>　10

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　84

<210>　85

<211>　10

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　85

<210>　86

<211>　10

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　86

<210>　87

<211>　11

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　87

<210>　88

<211>　11

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　88

<210>　89

<211>　11

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　89

<210>　90

<211>　9

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　90

<210>　91

<211>　9

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　91

<210>　92

<211>　9

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　92

<210>　93

<211>　30

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　93

<210>　94

<211>　30

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　94

<210>　95

<211>　6

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　95

<210>　96

<211>　6

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　96

<210>　97

<211>　14

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　97

<210>　98

<211>　14

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　98

<210>　99

<211>　16

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　99

<210>　100

<211>　11

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　100

<210>　101

<211>　11

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　101

<210>　102

<211>　23

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　102

<210>　103

<211>　23

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　103

<210>　104

<211>　11

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　104

<210>　105

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　105

<210>　106

<211>　15

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　106

<210>　107

<211>　7

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　107

<210>　108

<211>　7

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　108

<210>　109

<211>　7

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　109

<210>　110

<211>　32

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　110

<210>　111

<211>　32

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　111

<210>　112

<211>　10

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　112

<210>　113

<211>　10

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　113

<210>　114

<211>　30

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　114

<210>　115

<211>　6

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　115

<210>　116

<211>　11

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　116

<210>　117

<211>　7

<212>　PRT

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工合成的多胜肽序列

<400>　117

圖1顯示改良TOCILIZUMAB對IL-6受體之親和性的突變部位表。TOCILIZUMAB之HCDR2序列顯示於序列識別號81；突變後的HCDR2序列(上列)顯示於序列識別號82；突變後的HCDR2序列(下列)顯示於序列識別號83;TOCILIZUMAB之HCDR3序列顯示於序列識別號84；突變後之HCDR3序列(上列)顯示於序列識別號85；突變後之HCDR3序列(下列)顯示於序列識別號86;TOCILIZUMAB之LCDR1序列顯示於序列識別號87；突變後之LCDR1序列(上列)顯示於序列識別號88；突變後之LCDR1序列(下列)顯示於序列識別號89;TOCILIZUMAB之LCDR3序列顯示於序列識別號90；突變後之LCDR3序列(上列)顯示於序列識別號91；突變後之LCDR3序列(下列)顯示於序列識別號92。

圖2顯示於BaF/gp130中之TOCILIZUMAB及RDC-23之中和活性之圖。

圖3顯示能夠減低可變區之等電點而不顯著減低TOCILIZUMAB對IL-6受體結合的突變部位表。圖中的星號代表對於等電點無影響但是為了轉變為人類序列而突變的突變部位。TOCILIZUMAB之HFR1序列顯示於序列識別號93；突變後之HFR1序列顯示於序列識別號94;TOCILIZUMAB之HCDR1序列顯示於序列識別號95；突變後之HCDR1序列顯示於序列識別號96;TOCILIZUMAB之HFR2序列顯示於序列識別號97；突變後之HFR2序列顯示於序列識別號98;TOCILIZUMAB之HCDR2序列顯示於序列識別號81；突變後之HCDR2序列顯示於序列識別號99;TOCILIZUMAB之HFR4序列顯示於序列識別號100；突變後之HFR4序列顯示於序列識別號101;TOCILIZUMAB之LFR1序列顯示於序列識別號102；突變後之LFR1序列顯示於序列識別號103;TOCILIZUMAB之LCDR1序列顯示於序列識別號87；突變後之LCDR1序列顯示於序列識別號104;TOCILIZUMAB之LFR2序列顯示於序列識別號105；突變後之LFR2序列顯示於序列識別號106;TOCILIZUMAB之LCDR2序列顯示於序列識別號107；突變後之LCDR2序列顯示於序列識別號108及109;TOCILIZIMAB之LFR3序列顯示於序列識別號110；突變後之LFR3序列顯示於序列識別號111;TOCILIZUMAB之LFR4序列顯示於序列識別號112；突變後之LFR4序列顯示於序列識別號113。

圖4顯示於BaF/gp130中之TOCILIZUMAB及H53/L28的中和活性。

圖5顯示靜脈內投予之後小鼠體內的TOCILIZUMAB及H53/L28的血漿濃度的時間變化。

圖6顯示皮下投予之後小鼠體內的TOCILIZUMAB及H53/L28的血漿濃度的時間變化。

圖7圖示IgG分子能藉由在內囊胞(endosome)中從膜型抗原分離而再結合於另一抗原。

圖8顯示能對TOCILIZUMAB結合於IL-6受體提供pH依存性的突變部位(結合於pH7.4，分離於pH5.8)。TOCILIZUMAB之HFR1序列顯示於序列識別號93；突變後之HFR1序列顯示於序列識別號114;TOCILIZUMAB之HCDR1序列顯示於序列識別號95；突變後之HCDR1序列顯示於序列識別號115;TOCILIZUMAB之LCDR1序列顯示於序列識別號87；突變後之LCDR1序列顯示於序列識別號116;TOCILIZUMBA之LCDR2序列顯示於序列識別號107；且，突變後之LCDR2序列顯示於序列識別號117。

圖9顯示於BaF/gp130中之TOCILIZUMAB及H3pI/L73之中和活性。

圖10顯示靜脈內投予後，於食蟹猴體內的TOCILIZUMAB及H3pI/L73的血漿濃度的時間變化。

圖11顯示靜脈內投予後，於人類IL-6受體基因轉殖小鼠體內的TOCILIZUMAB及H3pI/L73的血漿濃度的時間變化。

圖12顯示利用陽離子交換層析評估TOCILIZUMAB、TOCILIZUMAB δ K、TOCILIZUMAB δ GK的C端衍生的異質性的結果。

圖13顯示利用陽離子交換層析評估TOCILIZUMAB-IgG1、TOCILIZUMAB IgG-2、TOCILIZUMAB SKSC的雙硫鍵衍生的異質性的結果。

圖14顯示利用差示掃描熱量計(DSC)得到的TOCILIZUMAB-IgG1、TOCILIZUMAB IgG-2、TOCILIZUMAB SKSC的變性曲線，及針對各Fab區的Tm值。

圖15顯示靜脈內投予後，於人類FcRn轉殖基因小鼠體內的TOCILIZUMAB-IgG1、TOCILIZUMAB-M44、TOCILIZUMAB-M58、TOCILIZUMAB-M73的血漿濃度的時間變化。

圖16顯示於BaF/gp130中之TOCILIZUMAB、對照組及Fv5-M83的中和活性。

圖17顯示於BaF/gp130中之TOCILIZUMAB、Fv3-M73、Fv4-M73的中和活性。

圖18顯示靜脈內投予後，於食蟹猴體內的TOCILIZUMAB、對照組、Fv3-M73、Fv4-M73及Fv5-M83的血漿濃度的時間變化。

圖19顯示靜脈內投予後，於食蟹猴體內的TOCILIZUMAB、對照組、Fv3-M73、Fv4-M73及Fv5-M83的CRP濃度的時間變化。

圖20顯示靜脈內投予後，於食蟹猴體內的TOCILIZUMAB、對照組、Fv3-M73、Fv4-M73及Fv5-M83的游離可溶的IL-6受體的百分比的時間變化。

圖21顯示不同配方(A-D)經時形成抗體Fv4-M73之高分子量物質(HMW)的差異。

圖22顯示於不同的pH值、緩衝液種類、NaCl濃度、有或無精胺酸，在2個時間點(25℃)，形成抗體Fv4-M73之高分子量物質(δ HMW：從起始之增加值)的差異。

圖23顯示於不同的pH值、緩衝液種類、NaCl濃度，及有或無精胺酸，在2個時間點(25℃)，形成抗體Fv4-M73之高分子量物質(HMW)的差異。

圖24顯示於不同的pH值、緩衝液種類、NaCl濃度，及有或無精胺酸，在3個不同的時間點(40℃)，形成抗體Fv4-M73之高分子量物質(δHMW：從起始之增加值)的差異。

圖25顯示於不同的pH值、緩衝液種類、NaCl濃度，及有或無精胺酸，在1個時間點(40℃)，形成抗體Fv4-M73之高分子量物質(HMW)的差異。

圖26顯示於不同的pH值、緩衝液種類、NaCl濃度，及有或無精胺酸，在3個不同的時間點(40℃)，形成抗體Fv4-M73之高分子量物質(δLMW：從起始之增加值)的差異。

圖27顯示於保存在不同的pH值下的抗體Fv4-M73的溶液進行陰離子交換層析法的結果。

圖28顯示保存在不同的pH值、不同的NaCl濃度、精胺酸及兩種不同的緩衝液下，抗體Fv4-M73的溶液進行陰離子交換層析法的結果。

圖29顯示針對不同次數的冷凍/解凍循環、不同的NaCl濃度、精胺酸、及2種不同的緩衝液，形成抗體Fv4-M73之高分子量物質(δHMW：從起始之增加值)的差異。

圖30顯示針對3個不同時間點(於40℃及25℃)及4種不同的配方(E-H)，形成抗體Fv4-M73之高分子量物質(δHMW：從起始之增加值)的差異。

圖31顯示針對2個不同次數的冷凍/解凍循環及4種不同的配方(E-H)，形成抗體Fv4-M73之高分子量物質(δHMW：從起始之增加值)的差異。

圖32顯示在經過5℃之3個月及6個月後，6種不同配方形成抗體Fv4-M73之高分子量物質(δHMW：從起始之增加值)的差異。

圖33顯示在經過-20℃之3個月及6個月後，6種不同配方形成抗體Fv4-M73之高分子量物質(δHMW：從起始之增加值)的差異。

Claims

一種醫藥配方，包含至少一個抗體選自：(a)一抗體，包含一重鏈可變區及一輕鏈可變區，該重鏈可變區包含序列識別號20之序列(VH3-M73之可變區)，該輕鏈可變區包含序列識別號23之序列(VL3之可變區)；以及(b)一抗體，包含一重鏈及一輕鏈，該重鏈包含序列識別號26之序列(VH3-M73)，該輕鏈包含序列識別號29之序列(VL3)。
如申請專利範圍第1項之穩定的醫藥配方，包含組胺酸及/或檸檬酸鹽緩衝液。
如申請專利範圍第1或2項之穩定的醫藥配方，包含至少一種陽離子性胺基酸。
如申請專利範圍第1或2項之穩定的醫藥配方，包含1~500mM組胺酸及/或檸檬酸鹽緩衝液、1~1500mM的至少一種陽離子性胺基酸、1~200mg/mL的抗體、及1~400mM的碳水化合物。
如申請專利範圍第4項之醫藥配方，其中該陽離子性胺基酸為精胺酸。
如申請專利範圍第4項之醫藥配方，其中，該碳水化合物為蔗糖或海藻糖。
如申請專利範圍第1或2項之醫藥配方，更包含一界面活性劑。
如申請專利範圍第1或2項之醫藥配方，其中該醫藥配方含有至少10mg/ml的該多胜肽及/或抗體。
如申請專利範圍第1或2項之醫藥配方，其中該醫藥配方含有至少50mg/ml的該多胜肽及/或抗體。
如申請專利範圍第1或2項之醫藥配方，其中該醫藥配方含有至少80mg/ml的該多胜肽及/或抗體。
如申請專利範圍第1或2項之醫藥配方，其中該醫藥配方含有少於或等於240mg/ml的該多胜肽及/或抗體。
如申請專利範圍第1或2項之醫藥配方，其中該醫藥配方具有pH介於4.5~7.0之範圍。
如申請專利範圍第12項之醫藥配方，其中該醫藥配方具有pH介於5.5~6.6之範圍。
如申請專利範圍第1或2項之醫藥配方，其中該配方為液體。
如申請專利範圍第14項之醫藥配方，其中，在該配方製備期間，該醫藥配方不經過冷凍乾燥。
如申請專利範圍第1或2項之醫藥配方，其中，該多胜肽及/或抗體分子的二聚體化減少。
如申請專利範圍第1或2項之醫藥配方，其中，該多胜肽及/或抗體分子的二聚體化受抑制。
如申請專利範圍第1或2項之醫藥配方，其中，該醫藥配方係供皮下投予。
一種穩定含有抗體的溶液之方法，包含添加至少一種陽離子性胺基酸，其中，該抗體為選自以下的至少一種抗體： (a)一抗體，包含一重鏈可變區及一輕鏈可變區，該重鏈可變區包含序列識別號20之序列(VH3-M73之可變區)，該輕鏈可變區包含序列識別號23之序列(VL3之可變區)；以及(b)一抗體，包含一重鏈及一輕鏈，該重鏈包含序列識別號26之序列(VH3-M73)，該輕鏈包含序列識別號29之序列(VL3)。
一種穩定抗體的方法，該抗體於一冷凍/解凍循環之溶液中，包含添加至少一種陽離子性胺基酸，其中該抗體選自以下至少一種抗體：(a)一抗體，包含一重鏈可變區及一輕鏈可變區，該重鏈可變區包含序列識別號20之序列(VH3-M73之可變區)，該輕鏈可變區包含序列識別號23之序列(VL3之可變區)；以及(b)一抗體，包含一重鏈及一輕鏈，該重鏈包含序列識別號26之序列(VH3-M73)，該輕鏈包含序列識別號29之序列(VL3)。