TWI335354B

TWI335354B - Methods for the detection of the degree of the methylation of a target dna and kits

Info

Publication number: TWI335354B
Application number: TW096114234A
Authority: TW
Inventors: Yuk-Ming Dennis Lo; Kwan Chee Allen Chan; Chunming Ding
Original assignee: Univ Hong Kong Chinese
Priority date: 2006-09-27
Filing date: 2007-04-23
Publication date: 2011-01-01
Also published as: WO2008038000A8; US11898208B2; CN101153336A; TW200815755A; HK1115167A1; US10435754B2; WO2008038000A1; US20080081338A1; US9371566B2; US20140272975A1; US20200071771A1; US20170101685A1; CN101153336B

Description

1335354 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明關於一種檢測DNA序列甲基化程度的方法，以及利用DNA序列的曱基化程度來檢測、預後或監測個體中癌症的套組。【先前技術】已熟知腫瘤抑制基因在腫瘤細胞中被曱基化。因而，曱基化標誌物已被建議用於檢測或監測患者癌症。已有多種方法被提議用於檢測這些曱基化的序列。甲基化特異PCR(MSP)是檢測甲基化或未曱基化的⑽八取常用的方法。MSP涉及亞硫酸氫鹽轉化的步驟。用亞硫酸氫鈉使胞嘧啶脫氨基成為尿嘧啶，而5_甲基胞嘧啶保持凡好。曱基化特異PCR利用目標向亞硫酸氫鹽誘導的序列改變的PCR 5丨子，以特異性擴增甲基化的或未甲基化的等 2基因。亞硫酸氫鹽轉化破壞約95%的DNA。由於血清或血衆中遍的濃度通常很低，舰減少95%導致檢出率小於 50% 〇其他方法係使用特異性分解甲基化或未甲基化舰的限制性内切酶。特異性分解甲基&膽的酶很少。但是， ^異性分解未甲基化應的酶卻很容易得到。然後確立分 :否發生’並檢測所關注_是否f基化或未甲取決㈣用酶的特異性），其與癌症相關或不相關。. 先別已提出過f基化敏感的酶分解。例如，Silvaet al， 5l93-8805-PF;Kai 5 1335354 • · v

British Journal of Cancer, 80: 1 262-1 264，1 999 進行了甲基化敏感的酶分解及後續的PCR。但是，如 Yegnasubramanian etal, Nucleic Acids Research, Vol. 34，No. 3’ 2006 el9指出這些方法被產生的偽陽性所困擾。因此，本發明尋求提供甲基化敏感的檢測的更好方法，其可排除或減少偽陽性和/或偽陰性的產生。【發明内容】 • 根據本發明的第一方面，提供了檢測或監測包含至少 > 兩個甲基化敏感限制酶辨識位置的目標D N A序列的曱基化 « 程度的方法，所述方法包括： '： (a)辨識所述甲基化敏感限制酶辨識位置的一種或多種甲基化敏感限制酶分解含有該目標DNA序列的樣品；以及鲁（b)定量分解後該樣品中殘留的所述目標DNA序列，其中步驟（b)中得到的該目標DNA序列的含量表示曱基化的程度。本發明之方法係利用甲基化敏感限制酶在多個位置上切割目標DNA序列，大大提高了檢測的準確性。此外’本發明更提供了使用擇自來自個體之血液、血漿、血清、唾液、尿等生物樣品檢測或監測癌症的方法，所述方法包括： (a)從一生物樣品獲得DNA ; 6 5193-8805-PF；Kai ^35354 (b) 使用一種或多種曱基化敏感限制酶分解該dnA樣 σ · 口 ο j (c) 在步驟（b)之後量化或檢測目標DNA序列，其中目 b DNA序列含有至少兩個曱基化敏感限制酶的辨識位置；以及 (d)將來自該個體的該DNA序列的水平與上—Φ你干較’以檢測、預測或監測癌症在本發明的較佳實施例中’將聚合酶連鎖反應（pCR) 或即時定量聚合酶連鎖反應（Q_pCR)用於定量目標序列。較佳地，該曱基化敏感限制酶辨識未曱基化的序列。該目標序列為癌症患者之易被甲基化的序％，因此正 U的未甲基化的目標序列被分解，不被聚合酶連鎖反應擴增，而在癌症患者巾’目標序列被f基化並且不被酶分解，隨後可被例如使用聚合酶連鎖反應量化或檢測。本發月的方法可用於預測個體的癌症易感性、評估個體中癌症的階段、相泪,丨+ i k 預則個體存活的可能性、預測個體的復發的可能性或評估個體中治療的有效性。 4據本發明之第一形態，提供了檢測、預後或監測個體中癌症的套組，包括 (1)至少一種甲基化敏感限制酶·以及

(")-定量來自所述個體的樣品t目標麗序列元， T 其中所述目標DNA & + ,^ ^ ' 序列在癌症中表現出異常甲基化模式’並3有該甲基化敏减 U限制扭此辨識之至少兩個甲基化 5193-8805-PF；Kai 7 1335354 敏感限制酶辨識位置。在所述癌症為肝細胞癌的套組更包括定量樣品中甲胎蛋咽癌的本發明實施例中，本套 DNA的單元。本發明優選實施例中，所述白之單元。在所述癌症為鼻組更包括在樣品中定量Εβν 【實施方式】 • 纟發明提供評估、診斷、預測或監測個體中腫瘤的存在或進展的方法。該方法涉及使用甲基化敏感限制酶分解 MA序列。選擇含有至少兩個限制位置的"票驗序列， ϋ兩個限制位置可以〇基化或未甲基化的。較佳使用特定的甲基化敏感限制酶實施本方法，與甲基化序列相比， :該特定的甲基化敏感限制酶優先切割未甲基化的序列。甲基化序列保持未被分解並被檢測到。在未甲基化序列的至少-個曱基化敏感限制酶位置的切割導致該目標序列不能籲被檢測到或不可擴增。因此甲基化序列可與未甲基化序列區分開。本發明的一個實施例中，在諸如癌症患者的血漿或血清的生物樣品中檢測到的未被切割的目標序列的數量高於來自於健康的或沒有癌症的個體的同類型生物樣品中立貝的數里這疋因為與健康個體相比，癌症患者中的目標序列高度甲基化。或者，可以使用切割甲基化DNA的限制酶。未甲基化的DNA序列未被分解並且可被檢測到。本發明的另一實施例中’與來自於沒有癌症個體之同類型生物樣品中的數量 5193-8805-PF；Kai 8 1335354 相比，證實在諸如癌症患者的血漿或血清的生物樣品中檢測到較低數量的未被切割的目標序列。在本發明較佳實施例中，利用PCR擴增檢測目標序列。可以即時定量PCR。選擇特定的引子序列，使得該引子擴增的序列中存在至少兩個曱基化敏感限制酶位置。本發明的方法不使用亞硫酸氫鈉。使用合適方法（如PCR)來擴增被用於檢測未被切割的目標序列，由此確定未被限制酶切割之曱基化DNA的存在。根據本發明，可以使用任何適合的曱基化敏感限制酶。下表1列出了切割未曱基化的DNA的甲基化敏感限制酶的例子。表1 :曱基化敏感限制酶的例子酶辨識序列 CpG甲基化對酶限制性的影響* AatW GACGTC 阻止 Aji\ CACGTC 阻止 Bsm\, BshUm CGCG 阻止颜 2851 CGRYCG 阻止 BsMU ACCGGT 阻止 ^5^681 TCGCGA 阻止 Bspim TTCGAA 阻止 Bsp\i?>\ I RGCGCY 阻止細151 ATCGAT 阻止 Csel GACGC 阻止 CfrlOl RCCGGY 阻止 Cfrm CCGCGG 阻止 Cpol CGGWCCG 阻止 EccAllU AGCGCT 阻止 Ecd)2\ CGGCCG 阻止 Ec〇n\ CACGTG 阻止 Eco\m TACGTA 阻止 Ehe\ GGCGCC 阻止 5193-8805-PF;Kai 9 1335354

Espil CGTCTC 阻止 FsptA RTGCGCAY 阻止 Hhal; Ηϊιβ I GCGC 阻止 HinW GRCGYC 阻止 HpaU CCGG 阻止 Kpn2\ TCCGGA 阻止 MM ACGCGT 阻止 Notl GCGGCCGC 阻止 Nsb\ TGCGCA 阻止 Paul GCGCGC 阻止 Pdi\ GCCGGC 阻止 /¥72311 CGTACG 阻止 PpdlW YACGTR 阻止 Psp\m\ AACGTT 阻止 Pvu\ CGATCG 阻止 Sail GTCGAC 阻止 Sgs\ GGCGCGCC 阻止 Smal CCCGGG 阻止 Smu\ CCCGC 阻止 Ssi\ CCGC 阻止 Tail ACGT 阻止 Tau\ GCSGC 阻止辨識序列中的字母代碼代表不同的核苷酸組合，如下所示：R = G 或 A ; Y = C 或 T ; W = A 或 Τ ; M = A 或 C ; K = G 或 T ;

S = C 或 G ; H = A、C 或 T ; V = A、C 或 G ; B = C、G 或 T ; D = A、G 或 T ; N = G、A、T 或 C。辨識序列中的CpG二核苷酸用下劃線標出。這些CpG 二核苷酸的胞嘧啶殘基易被甲基化。*辨識序列中的CpG二核苷酸的胞嘧啶的曱基化防止該目標序列的酶切割。所述目標序列包含兩個或多個甲基化敏感限制酶位置。這些位置可以被相同或不同的酶辨識。但是，如此選擇這些位置，以使得當使用與曱基化序列相比優先切割未 5193-8805-PF;Kai 10 1335354 每個序列中至少兩個位置當其未f 甲基化的序列的酶時基化時被分解。至少兩個被優先兩個或多個位置在其次之實施例中，該目標序列含有切割甲基化序列的限制酶切割的位置。該可以被相同或不同的酶切割。根據本發明，可以^由田, 此了以使用任何適合的DNA甲基化標誌物。這些DNA甲基化桿社物曰如 '西& 铩^物疋所選定序列與正常個體相比

在癌症患者中顯示不同甲基化模式的標德物。選擇適當的標諸物使得待擴增序列含有至少兩個甲基化㈣限制酶位置°通吊k些甲基化標誌'物是這樣的基因，即其啟動子和/ 或編碼序列在癌症患者中被f基化。優選地，㉟選定序列在非癌的（n〇n-Cancer)或沒有癌症的（cancer_f ree)個體中未甲基化或以較低程度曱基化。適合的標誌物包括例如以SS/Vj。實際上，已證明似用於檢測或監測個體癌症時特別有效。因此，根據本發明的另一方面，提供了使用選自來自個體的血液、血漿·、血清、唾液、尿的生物樣品檢測或監測癌症的方法，所述方法包括： (a) 從所述生物樣品獲得DNA ; (b) 使用一種或多種曱基化敏感限制酶分解該DN A樣 (c) 在步驟（b)之後’量化或檢測目標DNA序列，其中該目標D N A序列是包含部分或全部似的序列；以及 (d) 將來自該個體的該DNA序列的水平與正常標準比 5193-8805-PF;Kai 11 1335354 較，以檢測、預測或監測癌症。下表2列出了與似啟動子超甲基化相關的腫瘤類型。表2 :不同癌症類型中啟動子超甲基化的頻率 (由高至低按頻率排列）癌症類型似5577/啟動子超甲基A的頻率肝 93%-100% '~ 乳腺 49%-95% 肺（小細胞） 79%-88% _ *** i\%-m ~~ 黑素瘤， 41°/〇-75% 胰腺 64% — 腎 36%-64% — 膀胱 47%,% — 結腸 12%-45% 卵巢 30%-40% 肺（非小細胞） 28%-40% 表3列出了其他優先選擇在腫瘤中表現超甲基化的腫瘤抑制基因。的例子

E-cadherin GSTPI —hMLHl __y、月、結腸直腸、***、膀肫肺月、膀脱、月!J列腺、乳腺、子宮頸、肝"^Γ、肺、印f Ϊ、結腸直

MGMT

5193-8805—PF;Kai 12 1335354 RARbeta socsl Rb VHL ' 肺、乳腺、鼻咽、***-- :结腸直腸、白血病、胃、0兵- 眼癌、肺' 食道、胃 …-—----- -----, 腎 ------ 依照本發明的方法，從患者取得或獲得樣品。適合的樣品包括血液、血漿、血清、唾液和尿。依照本發明使用的樣品包括全血、血漿或血清。從…製備血清或血紧的方法為本領域技術人員所習知]列如，血液可被置於含有 EDTA 或諸如 Vacutainer SST(Bect〇n ⑽，

FrankUnLake’ NJ，USA)的專門市售產品的試管中以防止血液凝結，隨後可以通過離心從全血中獲得血漿。血液凝結後可通過離心或不通過離心獲得血清。如果使用離心，通常但不專有地以適當的速度進行，如1500-3000 x 再被轉移到新試管進行DNA提取之前，可對血漿或血清進行更多的離心步驟。優選地，使用合適的DNA提取技術從樣品中提取⑽A。對於本領域技術人員來說，DNA提取是常規内容。已知從生物樣品（包括血液）中提取DNA的許多方法。可遵循DM 製備的一般方法，例如 Sambr〇〇k and RusseU，

Cloning a Laboratory Manual (分子克隆：實驗室手冊）3「d

Edition (2001 )所描述的。還可以使用各種可購得的試劑或套組從血液樣品中獲得DNA。依照本發明，使含有DNA的樣品與一種或多種在特定條件下優先切割未甲基化的DNA的限制酶共同處理，該特定條件為當目標序列中存在兩個或更多處於未甲基化狀熊 5193-8805-PF;Kai 13 I335354 的限制酶位元點時，所述罢忐J, 啤Γ以在至少一個這樣的位置处刀目標序列。依照本發明一樣品與-或多種在特定條件ρ 方面’ 3有μα的並… 切割甲基化嶋的限制酶 >*、同處理’ 5亥特定條林兔去條件為田目軚序列中存在兩個或更多處於甲基化狀態的限制酶位元點時，該限制酶可以在至少— 個這樣的位置處切割目標序列。較佳地，樣品在允許完全分解的條件下處理。這可以通過例如增加處理時間和/或增加酶的用量來達到。通常，樣品與100活性單位的甲基化敏感限制酶一起孵育多至小時。對於本領域技術人Μ來說，根據所用酶的量建立入適的條件是常規内容。 σ 醉育後，檢測未切的目標序列。較佳地，4過例如聚合酶鏈式反應（PCR)擴增來檢測這些序列。設計ΜΑ引子以擴增含有至少兩個甲基化敏感限制酶位置的序列。可以通過考察DNA甲基化標誌物並且確定這些標誌物中被甲基化敏感限制酶辨識的限制酶位置來確定這樣的序列。例如使用表丨中確定的甲基化敏感限制酶的辨識序列，可以在表3所列的曱基化標誌物中確定合適目標序列。使用似5^/74作為例子’目標序列可包含似幻>凡^基因的部分或全部啟動子序列和/或外顯子1 ^第9圖顯示該啟動子和外顯子1的序列（SEq ID NO. 1)。在較佳實施例中’該用於檢測的目標序列在圖9中用粗體突出。當使用曱基化敏感限制酶時，根據具體個體中該目標 14 5193-8805-PF;Kai 1335354 序列的曱基化狀態，會檢測到不同量之目標序列。在本發明的較佳實施例中’使用優先切割未曱基化DNA的曱基化敏感限制酶，則該目標序列不會在未曱基化狀態時（如在健康個體中）被檢測到。但是，如果該目標序列被甲基化（如在來自癌症患者的選定樣品中），則該目標序列不被限制酶切割’因此該目標序列可以通過PCR檢測到。因此’該方法可用於確定目標序列的甲基化狀態，並 φ 且提供該個體的癌症狀態的指示。本發明的方法可能另外包括量化或檢測對照序列。選擇在癌症中不顯示異常曱基化模式的序列作為對照序列。依“?、本發明的優先選擇方面，選擇含有至少兩個甲基化敏感限制酶辨識位置的對照序列。較佳地，選擇含有與目標 DNA序列相同數目的甲基化敏感限制酶辨識位置的對照序歹J通吊，通過擴增檢測該對照序列的存在或缺失，該擴增通過曱基化敏感限制酶分解後的聚合酶連鎖反應完成。 φ這類對”,、序列可用於評估一種或多種甲基化敏感限制酶的分解程度。例如，如果甲基化敏感限制酶分解後可檢測到對，.?、序列，其表明分解不完全並且可以重複該方法以確保發生70王刀解。較佳地，選擇含有與目標序列中相同的甲基化敏感限制酶辨識位置的對照序列。在一較佳實施例中，該對照序列是〆肌動蛋白基因序列。本方法可用於評估個體的腫瘤狀態。該方法可用於例如癌症的診斷和/或預後。該方法還可用於例如治療過程中癌症進程的監測。該方法還可用於監測隨時間發生的甲基 5193-8805-PF;Kai 15 1335354 - 化水平的變化，例如評估個體對腫瘤的易感性和疾病的進程。該方法還可用於預測疾病的後果或預測治療成功的可能性。在一較佳實施例中，該目標序列是似M/Vj並且被用於癌症的診斷。例如，甲基化可用於檢測和監測肝細胞癌或鼻咽癌。該方法在監測B型肝炎攜帶者或c型肝λ攜帶者向肝細胞癌轉化的易感性中特別有用。 φ 在本發明的另一方面，還提供了檢測、預後或監測個體中癌症的套組。該套組包括至少一種甲基化敏感限制酶’以及用於定量來自該個體的樣品中目標DNA序列的單元，其中該目標DNA序列在癌症中表現出異常甲基化模式’並且含有所述曱基化敏感限制酶能辨識的至少兩個甲基化敏感限制酶辨識位置。在一較佳的實施例中，目標DNA序列至少是^J 的一部分’所採用的甲基化敏感限制性酶為万s 〗。本發 • 明的套組更包含用於檢測樣品中對照DNA序列（如彳肌動蛋白基因序列）的單元。所述的定量目標DNA序列或對照 DNA序列的單元一般包括用於pCR或Q_pcR的試劑，例如引子、DNA聚合酶、核苷酸、缓衝液等，用於q_pcr的試劑還包括探針，較佳為螢光團標記的探針。在本發明的較佳實施例中’用於定量以5^/7/序列的 PCR 或 Q-PCR 所用引子為 SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 3， Q-PCR所用的探針包含SEq ID NO. 4的序列；用於定量/ 肌動蛋白基因序列的PCR或Q-PCR所用引子為SEQ ID NO. 5193-8805-PF;Kai 16 1335354 5 和 SEQ ID NO. 6，Q-ΡΠ?所用 64 柳 & ^ W LK所用的探針包含SEQ ID NO. Ί 的序列。對於用於肝細胞癌⑽）的套組，本發明更包括檢測甲型胎兒蛋白的單元。甲型胎兒蛋白是已知的肝細胞癌則的標諸物’其檢測方法和所用試劑為本領域技術人員所熟知對於用於鼻咽癌（APC)的套組，本發明更包括檢測EBV 刪的單7G。EBV DNA是已知的鼻咽癌標諸物，其檢測方法和所用試劑也為本領域技術人員所熟知。將目#廳序列的甲基化程度檢測和特定的標誌物的檢測進行結合，可大大提高檢測的準蜂性。以下將利用下列實施例更詳細地描述本發明。、實施例徵募了 63個(肝細胞癌（HCC)患^以及兩組對照。第一對照組由1 5個沒有慢性B型肝炎感染的健康對照個體組成。第二對照組由慢性B型肝炎攜帶者組成。對於每一個 HCC患者，徵募一個性別和年齡對應的慢性B型肝炎攜帶者作為對照。慢性乙型肝炎攜帶者具有發展Hcc的更高危險’並且因此成為HCC篩選的目標群體。從每一個研究個體收集4毫升靜脈血到含有EDTA的試管中。1，60 Og離心血液樣品10分鐘，並且再次以16, 〇〇〇g離心上清液分鐘。使用 QIAamp mini kit (Qiagen，Hilden，Germany) 從800仁L血漿中提取DNA並且用50/z L H2〇清洗。用i〇〇u 的及siUI酶分解35微升血漿⑽A，在60°C下分解於ix分解緩衝液中’持續進行丨6小時。 5193-8805-PF；Kai 17 1335354 -通過即時PCR確定血漿序列的濃度，該即時 PCR 使用的弓丨子為 5’ AGCCTGAGCTCATTGAGCTG3’ （SEQ ID NO· 2)和 5’ ACCAGCTGCCGTGTGG 3’ （SEQ ID NO. 3)，探針為 5，（FAM)-CCAACGCGCTGCGCAT-(MGB)3，（SEQ ID NO. 4)。每一反應含有 IX TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems，Foster City, USA) ' 引子各 3 0 0nM和85nM探針。以7. 1 5微升酶分解的血漿DNA混合物（相當於5.// L未分解的血漿DNA)作為每一個PCR反應的 ^ 範本。溫度模式設定為50°C 2分鐘、95°C 10分鐘、50個循環的95°C 15秒和60°C 1分鐘。所有的反應進行兩個重複並取平均值。似'尺Μ擴增子包含5個万以UI辨識位置。為確保限制酶分解的完全性，對每一個分解的樣品進行目標向，-肌動蛋白基因的即時PCR，該即時PCR引子包括 5’ GCGCCGTTCCGAAAGTT3’ （SEQ ID NO. 5)和 5’ CGGCGGATCGGCAAA3’ （SEQ ID NO. 6)以及探針 φ 5’ （FAM)-ACCGCCGAGACCGCGTC-(MGB)3，（SEQ ID NO. 7)。通過亞硫酸氫鹽測序，顯示Θ -肌動蛋白基因啟動子在血細胞和HCC組織中完全未曱基化。Θ肌動蛋白基因序列擴增子與似5^/7/擴增子有相似大小，並且含有相同數目的厶夕ίϋ I酶限制位。為研究未甲基化的和肌動蛋白基因序列的酶分解效率是否相似，用100U的酶分解1 # g的血沉棕黃層（buff y coat)，分解時間包括15分鐘、30分鐘、 45分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘、3小時、4小時、5 5193-8805-PF;Kai 18 1335354 小時、6小時、12小時和16小時。酶分解後測量每一個樣品中似6\9/以和夕肌動蛋白基因序列的濃度。如圖丄所不，這些血沉棕黃層DNA中似和^肌動蛋白基因序列的濃度程正相關（r= 〇 986，P〈〇. 0001，Pearson相關）。由於未曱基化的似/和々肌動蛋白基因序列的酶分解效率相似’所以β肌動蛋白基因序列在經分解之血清dna 樣品中的缺失顯示未曱基化的序列的完全分解。因此’所有Θ肌動蛋白基因序列信號為陽性的樣品都經進一步的6#分解直到在經分解的血清DNA樣品中檢測不到々肌動蛋白基因序列。在酶分解後，將63個HCC患者中的59個（93%) 和63個對應的慢性B型肝炎帶原者中的37個（58%)的血漿中檢測到心SS/Vj序列，如第2圖所示。HCC患者和慢性肝炎B帶原者的中位數血漿似/濃度分別為 770copy/mL和1 l8copy/mL。相反地，在15個健康者樣本中’所有的血漿中都檢測不到。不被分解的似SS/V/的血漿濃度沒有顯示與甲胎蛋白 (AFP)含量的任何顯著線性相關，其中甲型胎兒蛋白為已建立的HCC的腫瘤標誌物。參照第3圖、第4圖，我們已經證明血漿曱基化似55/7/的定量分析可以補充用於jjcc檢測的AFP分析》參照第5圖，在我們的實驗組中，62個患者中的16個有小於1〇 a g/L的低水平AFP。以300copy/mL 為界，血漿j分析鑒定了這1 6個有偽陰性afp結果的HCC患者中的13個（81%)。 5193-8805-PF；Kai 19 1335354 ** 第6圖證明了外科手術前血漿似5\S·凡Μ濃度小於 550copy/mL的HCC患者的存活可能性好于那些水平高於 550copy/mL 的患者（p=〇〇359，Kaplan-Meier 存活分析）。從手術切除腫瘤後1個月的HCC患者收集血液樣品。腫瘤切除前就有可檢測到的血漿以的59個患者中， 45人（76%)顯示手術後濃度減小。第7圖顯示在這45個患者中，13個在切除腫瘤後檢測不到似。中位數 RASSF1A 濃度從 770 copy/mL 下降到 _ 250copy/mL(p<〇. 〇〇〇1，Wilcoxon 測驗）。為進一步研究甲基化敏感限制酶分解後血漿必^ 的定量分析是否是具有凡Μ異常甲基化的癌症的通用標誌物，徵募了 6 7個鼻咽癌（NPC)患者研究抗酶分解的 WM/V]的血漿濃度與Epstein-Barr病毒（EBV)DNA的相關性。血漿EBV DNA是NPC的已建立標諸物並且已被證實反映腫瘤量（Lo YMD，Chan LY，Lo KW，Leung SF，Zhang J, 秦 Chan AT, Lee JC, Hjelm NM, Johnson PJ, Huang DP., Quantitative analysis of cell-free Epstein-Barr virus DNA in plasma of patients with nasopharyngeal carcinomaC鼻咽癌患者血漿中無細胞的Epstein_Barr病毒的定量分析）· Cancer Res 1 999; 59:1 188-91 )。第 8 圖顯示EBVDNA和抗酶分解的心$67^7/序列可分別在6 5 (9 4 % ) 和3 9 (5 8 %)個患者的血漿中檢測到。在可檢測到抗酶分解的WM/Vj和EBV DNA的患者中’這兩個j)NA序列的血漿濃度顯示正相關（!·= 0. 38，p= 〇. 〇19，Spearman相關）。 5193-8805-PF;Kai 20 1335354 甲基化敏感限制酶分解後，分析來自這6 7個NPC患者的29個腫瘤樣品的。酶分解後，似序列可在這29個病例中的25個中檢測到（86%)。對於這25個 j基因在腫瘤中超曱基化的病例，酶分解後，/ 序列可在20個病例（8〇%)的血漿中檢測到。該檢測率顯著好於之前的研究所報告的情況’該研究使用甲基化特異pCR 檢測血漿中超曱基化的凡^序列（w〇ng TS，Kwong dl， Sham JS, Wei WI, Kwong YL, Yuen AP. , Quantitative plasma hypermethylated DN A markers of undifferentiated nasopharyngeal carcinoma(無差異的鼻咽癌的定量血漿超曱基化DNA標誌物），Clin Cancer Res. 2004; 10:2401 -6)。在該報告中，曱基化的似Μ/人ί只在 5 %的N P C患者的血聚中檢測到。參考文獻：

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Claims

Γ335354 第096 η 4234號中文申請專利範圍修正本十、申請專利範圍：彦正曰期：99.7.20 作f'7月日修(束)正本 1. 一種檢測或監測包含至少兩個甲其於姑夕呵個宁基化敏感限制酶辨識位置之RASSF1A外顯子1咬# η _£»·沾田饮ji 丁 i及吴片奴的甲基化程度的方法，包括： (a)以辨識該甲基化敏感限制酶辨識位置之Bstui八解含有該RASSF1A外顯子1或其片段的樣品；以及 • (b)利用引子SEQ ID N0. 2及SEQ ID N0. 3來定量分解 φ 後該樣品中殘留之rassfia外顯子1或其片段，並且以石肌動蛋白基因序列的至少一部分作為對照DNA序列，其擴增引子為 SEQ ID N0. 5 及 SEQ ID N0. 6 ; 其中步驟（b)中所得到之該RASSF1A外顯子！或其月段的含量表示該甲基化程度。 ' 2.如申請專利範圍第1項所述之方法，其中在步驟（b) -中採用聚合酶連鎖反應，且該聚合酶連鎖反應之擴增子包含該至少兩個甲基化敏感限制酶辨識位置。 • 3.如申請專利範圍第1項所述之方法，其中在步該驟 (b)中採用即時定量聚合酶連鎖反應’且該即時定量聚合酶連鎖反應的擴增子包含該至少兩個甲基化敏感限制酶辨識位置。 4.如申請專利範圍第3項所述之方法，其中用於定量 RASSF1A外顯子i或其片段的即時定量聚合酶連鎖反應所用的探針為SEQ ID N0. 4 » 5·如申請專利範圍第1項所述之方法，其中當該 RASSF1A外顯子1或其片段以未甲基化狀態存在時，分解 5193-8805-PP! 1 1335354 後該樣品中之該RASSF1A外顯子1或其片段在至少一個甲基化敏感限制酶辨識位置處被BstUI所切割。 6. 如申請專利範圍第i項所述之方法，其中在步驟（a) 中，該樣品被過量之該甲基化敏感限制酶處理，及/或延長培養時間。 7. 如申請專利範圍第1、2或3項所述之方法，其中該方法更包括定量該樣品中的對照DNA序列以評估酶分解的 φ 程度或證實酶分解完全，且該對照DNA序列不在癌症中表現出異常的甲基化模式。 8. 如申請專利範圍第7項所述之方法’其中該rassfu 外顯子1或其片段中的該至少兩個甲基化敏感限制酶辨識位置存在於該對照DMA序列中。 ' 9.如申請專利範圍第8項所述之方法，其中相同數量之甲基化敏感限制酶辨識位置存在於該對照DNA序列及該 RASSF1A外顯子1或其片段中。 • 10·如中請專利範圍第i項所述之方法，其中該樣品為血液、血漿、血清、唾液或尿。 11. 一種檢測、預後或監測個體癌症的套組，包括 (i )BstUI ;以及 (Π)定量來自該個體樣品中RASSFU外顯子1或其片段之單元，其包括帛於聚合酶連鎖反應或即時定量聚合酶連鎖反應的試劑，該試劑包括引子SEQ ⑽2和D N0.3,其中該RASSF1A外顯子】或其片段在癌症中表現出異常甲基化模式，並且含有Bstui能辨識至少兩個甲基化 5193-8805-PF1 2 Γ335354 敏感限制酶辨識位置；及 (i i i )定量作為對照DNA序列的冷肌動蛋白基因至^ 一部分的單元，其包括用於聚合酶連鎖反應或即時定量聚合酶連鎖反應的引子SEq ID NO· 5及SEQ ID NO r υ· b ’該對照DNA序列不在該癌症中表現出異常甲基化模式。 12.如申請專利範圍第u項所述之套組，其中用於定量該RASSF1Α外顯子1或其片段的即時定量聚合酶連鎖反應試劑包括探針SEQ ID NO. 4。 13·如申請專利範圍第η項所述之套組，其中該套组更包括用於定量該樣品中甲型胎兒蛋白的單元。 14. 如申請專利範園第u項所述之套組，其中該套組更包括用於定量該樣品中EBV DNA的單元。 15. 如申請專利範圍第u項所述之套組，其中在該對照DNA序列中存在該至少兩個甲基化敏感限制酶辨識位置。 16. 如申請專利範圍第π項所述之套組，其中相同數量之甲基化限制酶辨識位置存在於該對照DNA序列及該 RASSF1A外顯子1或其片段中。 17. 如申請專利範圍第11項所述之套組，其中該癌症為肝細胞癌或鼻咽癌。 18. 如申請專利範圍第η項所述之套組，其中該個體為B型肝炎或C型肝炎帶原者。 19·如申請專利範圍第π項所述之套組，其中該樣品為血液、血漿、血清、唾液或尿。 5193-8805-PP1 3