CN110607350B - 一种基于G-四链体的鉴别BstUI甲基化敏感位点的方法 - Google Patents

一种基于G-四链体的鉴别BstUI甲基化敏感位点的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于G‑四链体的鉴别BstUI甲基化敏感位点的方法，属于生化分析领域。首先，以含G‑四链体序列、经不同甲基化修饰的Hairpin DNA为底物，加入BstUI，于60℃反应，含BstUI甲基化敏感位点的Hairpin DNA底物不能被识别，从而不能被剪切，而不含BstUI甲基化敏感位点的Hairpin DNA底物能被剪切，释放出G‑四链体片段；最后，向体系中加入N‑甲基卟啉二丙酸IX，与G‑四链体结合产生强荧光信号，可根据荧光信号的强弱鉴别BstUI的甲基化敏感位点。此外，也可通过凝胶电泳对反应后的DNA进行表征以判断甲基化敏感位点。本方法提供了两种灵活的鉴别方式，并鉴别了新的BstUI的甲基化敏感位点。

Description

一种基于G-四链体的鉴别BstUI甲基化敏感位点的方法
技术领域
本发明涉及一种基于G-四链体的鉴别BstUI甲基化敏感位点的方法，属于生化分析领域。
背景技术
限制性内切酶，又称限制酶，是可以识别特定的脱氧核苷酸序列，并对在每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。限制作用实际就是限制酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保护。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。大多数限制酶对DNA甲基化敏感，当限制酶目标序列与甲基化位点重叠时，对酶切反应会产生影响。因此，为有效的切割DNA，必须同时考虑DNA甲基化和限制酶对该类型甲基化的敏感性。
BstuI是一种商品化的限制性内切酶，被广泛应用于DNA甲基化的相关研究中。目前BstUI的甲基化敏感信息文献报道较模糊，仅指明其为CpG甲基化敏感的限制性内切酶，但具体甲基化敏感位点并不清楚。REBASE是一个非常有用的资源库，可查询限制性内切酶全面信息及更新信息，包括限制性内切酶的特异性、灵敏度和商业化来源等。REBASE中提供的BstUI的识别序列以及甲基化敏感相关信息如图1所示。
本发明旨在建立一种基于G-四链体的鉴别BstUI甲基化敏感位点的方法，通过合理设计底物DNA序列，以聚丙烯酰氨凝胶电泳或以N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)与G-四链体结合产生的强荧光为信号源，实现对BstUI的甲基化敏感位点的鉴别，为现有资料提供补充。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于G-四链体的鉴别BstUI甲基化敏感位点的方法。首先，以含有G-四链体序列、经不同甲基化修饰的Hairpin DNA为底物，加入对甲基化敏感的限制性内切酶BstUI，于60℃条件下进行剪切反应，含有BstUI甲基化敏感位点的HairpinDNA底物不能被BstUI识别，从而不能被剪切，而不含BstUI甲基化敏感位点的Hairpin DNA底物能被剪切，从而可释放出G-四链体片段；最后，向体系中加入N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)，其与G-四链体结合后，产生强荧光信号，可根据荧光信号的强弱鉴别BstUI的甲基化敏感位点。此外，也可同时通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对剪切反应后的DNA进行表征以判断甲基化敏感位点。本方法提供了两种灵活的鉴别方式，并鉴别了新的BstUI的甲基化敏感位点。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种基于G-四链体的鉴别BstUI甲基化敏感位点的方法，包括以下步骤：
(1)将含有G-四链体序列的底物DNA(经不同甲基化修饰)溶于TE缓冲液(10mMTris-HCl,1mM EDTA,pH 8.0)中，配制成100μM的底物DNA，于水浴中加热至90℃，保持5min，缓慢冷却至室温，得到100μM的Hairpin DNA底物。
(2)将2μL 100μM的Hairpin DNA底物加到100μL 1×CutSmart缓冲液(50mMPotassium Acetate,20mM Tris-acetate,10mM Magnesium Acetate,100μg/ml BSA,pH7.9)，加入3μL 1000U/mL BstuI，以，于60℃水浴中进行BstUI催化的剪切反应，反应时间2h。
(3)剪切反应完毕后，可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和荧光测定两种方式鉴别BstUI甲基化敏感位点，即以15％PAGE表征经不同甲基化修饰的底物DNA被剪切的情况；或者，向体系中加入2μL 100μM N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)，涡旋1min,测定荧光强度，激发波长399nm。
本发明的有益效果
本发明建立了基于G-四链体的鉴别BstUI甲基化敏感位点的方法。该方法操作简单，提供了两种灵活的鉴别方式，并鉴别了新的BstUI的甲基化敏感位点，补充了现有的BstUI的甲基化敏感信息，为与BstUI的使用相关的甲基化研究提供了参考。
附图说明
图1REBASE库中BstUI的识别序列及甲基化敏感序列；
图2检测原理示意图；
图3为可行性验证的荧光分析结果；
图4为Dnmt1活性检测的线性回归分析结果。
具体实施方式
本发明结合实例做进一步描述，但并不限制本发明。
实例1：
(1)试剂与仪器
HPLC纯化的底物DNA(甲基化程度不同)均购于生工生物工程股份有限公司(上海)，溶于TE缓冲液，经90℃退火处理得到100μM的Hairpin DNA底物储备液；10000U/mL的BstuI、10×CutSmart缓冲液均购于New England Biolabs(伊普斯维奇，英格兰)；N-甲基卟啉二丙酸IX购于Frontier Scientific(美国)。
凝胶电泳分离采用通用Mini垂直电泳仪(生工生物工程股份有限公司，上海)。
荧光分析采用HORIBA Fluoromax-4荧光仪(日本)，激发波长为399nm，狭缝宽度为5nm。
(2)BstUI甲基化敏感位点鉴别
本方法采用4种不同甲基化程度底物DNA，其序列如表1所示。其中，波浪线部分为能够形成G-四链体序列，下划线部分为BstuI的识别序列，/i5MedC/表示的是胞嘧啶C的5位碳原子上的甲基化修饰。将底物DNA经90℃退火处理，可得Hairpin DNA，一方面G-四链体被封闭保护，另一方面形成BstuI识别所需的双链DNA区域。
表1.不同甲基化程度的底物DNA
Figure BDA0002222222450000031
本方法的检测原理如图2所示，首先以不同甲基化程度的Hairpin DNA为底物，圆点虚线代表能形成G-四链体的片段，粗实线代表BstUI的识别的区域。加入甲基化敏感的限制性内切酶BstUI，底物DNA则可被BstUI识别时，将被剪切，从而释放出能形成G-四链体的DNA片段，此片段可与NMM结合，从而产生远远强于NMM自身荧光强度的强荧光。反之，当底物DNA不能被BstUI识别(BstUI阻止)时，底物DNA不能被剪切，不能形成G-四链体-NMM的结合物，从而荧光较弱，故可根据荧光强度来鉴别BstUI的甲基化敏感位点。
基于以上原理，进行了如下实验：
将2μL 100μM的Hairpin DNA底物加到1×CutSmart缓冲液(50mM PotassiumAcetate,20mM Tris-acetate,10mM Magnesium Acetate,100μg/ml BSA,pH 7.9)中，加入3μL 10000U/mL BstuI，以超纯水稀释至终体积为100μL，于60℃水浴中进行BstuI催化的剪切反应，反应时间2h。剪切反应完毕后，将样品以15％聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)进行分离，观察底物DNA的剪切情况。或者，取10μL剪切反应完毕后的DNA样品，加入0.2μL100μM N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM，溶于DMSO)，以TE缓冲液稀释至200μL，涡旋1min，进行荧光测定。
15％PAGE的表征结果如图3所示，四个底物DNA，每个底物两平行，其中1和2为S-A，3和4为S-B，5和6为S-C，7和8为S-D。可见，S-A和S-C均未被剪切，其甲基化位点阻止BstUI的识别，S-B和S-D均被剪切，表明BstUI可将其识别。故此，可知，在BstUI的识别序列5’-CGCG-3’中，第一个胞嘧啶C一旦被甲基化(S-A、S-C)，BstUI的识别就会被阻止，而第一个胞嘧啶C未被甲基化时，第二个胞嘧啶C是否甲基化(S-B、S-D)，均不影响BstUI的识别。
荧光测定的结果如图4所示，单独NMM存在下，其自身荧光较弱；当底物DNA能被BstUI识别时，可剪切释放出G-四链体片段，因此可与NMM结合形成增强的荧光强度；当底物DNA不能BstUI识别时，不能释放G-四链体片段，因此荧光强度较弱。
以上结果证明了本方法的可行性。

Claims (4)

1.一种基于G-四链体的鉴别BstUI甲基化敏感位点的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）将含有G-四链体序列、经不同甲基化修饰的底物DNA溶于TE缓冲液中，配制成100 μM的底物DNA，于水浴中加热至90℃，保持5 min，缓慢冷却至室温，得到100 μM的HairpinDNA底物；所述Hairpin DNA底物中G-四链体封闭保护并形成BstUI识别所需的双链DNA区域；
（2）将2 μL 100 μM的Hairpin DNA底物加到100 μL 1 ×CutSmart缓冲液，加入3 μL10000 U/mL BstUI，于60℃水浴中进行BstUI催化的剪切反应，反应时间2h；
（3）剪切反应完毕后，向体系中加入2 μL 100 μM N-甲基卟啉二丙酸 IX（NMM），涡旋1min, 测定荧光强度，激发波长399 nm。
2.根据权利要求1所述的基于G-四链体的鉴别BstUI甲基化敏感位点的方法，其特征在于：所述TE缓冲液成分为10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0。
3.根据权利要求1所述的基于G-四链体的鉴别BstUI甲基化敏感位点的方法，其特征在于：所述CutSmart缓冲液成分为50 mM Potassium Acetate，20 mM Tris-acetate，10 mMMagnesium Acetate，100 μg/ml BSA，pH 7.9。
4.根据权利要求1所述的基于G-四链体的鉴别BstUI甲基化敏感位点的方法，其特征在于：所述N-甲基卟啉二丙酸 IX（NMM）是溶于DMSO中。
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