DE10139283A1

DE10139283A1 - Verfahren und Nukleinsäuren zur Analyse von Colon-Krebs

Info

Publication number: DE10139283A1
Application number: DE10139283A
Authority: DE
Inventors: Juergen Distler; Fabian Model; Heike Taubert
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2001-08-09
Filing date: 2001-08-09
Publication date: 2003-03-13
Also published as: CA2455161A1; WO2003014388A3; EP1421220A2; JP2005525783A; WO2003014388A2; US20050064410A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft chemisch modifizierte genomische Sequenzen, Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion des Cytosin-Methylierungsstatus genomischer DNA wie auch zwei Verfahren zur Ermittlung genetischer und/oder epigenetischer Parameter von Genen zur Verwendung bei der Charakterisierung, Bewertung, Einstufung und/oder Diagnose von Dickdarmkrebs oder der Prädisposition für Dickdarmkrebs.

Description

Gebiet der Erfindung

Die durch methodische Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie studierten Beobachtungsebenen sind die Gene, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus resultierenden Proteine. Die Frage, welches Gen zu welchem Zeitpunkt im Lauf der Entwicklung eines Individuums angeschaltet wird und wie die Aktivierung und Inhibierung eines spezifischen Gens in spezifischen Zellen und Geweben kontrolliert werden, ist mit dem Grad und Charakter der Methylierung der Gene oder des Genoms korrelierbar. In diesem Zusammenhang können sich pathogene Zustände in einem geänderten Methylierungsmuster einzelner Geen oder des Genoms manifestieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, Oligonukleotide, PNA-Oligomere und ein Verfahren zur Charakterisierung, Bewertung, Einstufung, Behandlung und/oder Diagnose von Dickdarmkrebs oder der Prädisposition für Dickdarmkrebs, durch Analyse der genetischen und/oder epigenetischen Parameter der genomischen DNA und insbesondere deren Cytosin-Methylierungsstatus.

Stand der Technik

Dickdarmkrebs ist die zweithäufigste Ursache für den Krebstod in den Vereinigten Staaten. Er bezeichnet jeden Krebs im Colon (Dickdarm) vom Anfang des Dickdarms (Caecum) bis zum Ende des Dickdarms (Rectum). Dickdarmkrebs ist ein maligner Tumor im Inneren des Dickdarms. Er beginnt mit einer einzelnen Zelle, die mutiert und zu einem sichtbaren Polypen heranwächst. Wenn es einem Polypen gestattet wird, im Dickdarm zu verbleiben, kann er zu einem Krebsgeschwür heranwachsen, das andere Organe befällt. Die Mechanismen, die hinter der Weiterentwicklung zur Bösartigkeit liegen, sind noch nicht völlig verstanden, jedoch benötigen die meisten Polypen 3-7 Jahre um krebsartig zu werden. Vorbeugung gegen Dickdarmkrebs bedeutet diesen Prozess durch Entfernen des Polypen zu stoppen, bevor dieser krebsartig wird. Dickdarmkrebs stellt eine Wechselwirkung zwischen dem Genom der kolonrektalen Epithelzelle und der Wirtsumgebung dar. Beide Faktoren sind für die Entwicklung des Tumors essentiell. Dickdarmkrebs kann in nicht-erbliche, die selten vor dem Alter von 40 und in erbliche Typen, die häufig bei jüngeren Menschen auftreten, unterschieden werden.
Menschlicher Dickdarmkrebs unterliegt einem vielstufigen Karzinogenese-Weg vom adenomatösen Polypen zum Karzinom. Eine Zahl genetischer Ereignisse sind charakterisiert und schließen Veränderungen in "Tumor-Unterdrückungs"- und Suszeptibilitätsgenen, die normalerweise Proteine kodieren, welche die Zellzyklus-Progression und den programmierten Zelltod (K. W. Kinzler, B. Vogelstein; Landscaping the cancer terrain. Science, 15. Mai 1980 280 (5366): 1036-7) regulieren, ein. Aufgrund der hohen Verbreitung von Dickdarmkrebs in der alternden Bevölkerung und der hohen Mortalitätsrate bei fortgeschrittener Krankheit, werden neue Präventionsstrategien benötigt. Nachdem die Krebsdiagnose gestellt wurde ist es wichtig, das Ausmaß oder das "Stadium" des Krebses zu bestimmen, bevor über den Behandlungsplan entschieden wird. Einteilung in Stadien ist ein Verfahren, das Fortschreiten des Krebses im Patienten zu evaluieren und beschreibt das Ausmaß zu welchem sich der Krebs auf andere Teile des Körpers ausgebreitet hat. Es gibt verschiedene Systeme, um das Ausmaß oder das Stadium des Krebses zu klassifizieren. Eines der beiden bekanntesten Systeme ist das Stadium "I, II, III, IV"-System, das vier Stadien des Krebses definiert. Stadium I repräsentiert frühen Krebs mit einem kleinen Tumor ohne Ausbreitung auf die Lymphknoten. In den Stadien II und III ist der Tumor stufenweise weiter fortgeschritten, während Stadium IV sich auf eine metastatische Krankheit bezieht, die sich auf andere Gebiete des Körpers ausgebreitet hat. Ein sehr wichtiger Punkt, den man bei diesem System der Einstufung in Stadien bedenken muss ist, dass sie grobe Schätzungen über das Stadium der Krankheit und die Überlebenschancen bereitstellen. Die Zahlen sind nur Durchschnittswerte. Sie sagen nichts über das Ausbrechen oder die Prognose für einen bestimmten Patienten aus.
Gene, die mit Dickdarmkrebs in Zusammenhang stehen, schließen p16 (C. Y. Dai, E. E. Furth, R. Mick, J. Koh, T. Takayama, Y. Niitsu, G. H. Enders. p16 (INK4a) expression begins early in human colon neolasia and correlates inversely with markers of cell proliferation. Gastroenterology. Okt. 2000; 119(4): 924-42, p27 (D. F. Liu, K. Ferguson, G. S. Cooper, W. M. Grady, J. Willis. p27 cellcycle inhibitor is inversely correlated with lymph node metastases in right-sided colon cancer. J. Clin. Lab. Anal. 1999; 13(6): 291-5), p53 (D. Arango, G. A. Corner; S. Wadler, P. J. Catalano, L. H. Augenlicht. c-myc/p53 interaction determines sensitivity of human colon carcinoma cells to 5-fluorouracil in vitro and in vivo. Cancer Res. 15. Juni 2001; 61(12): 4910-5), cdc2 (L. Moragoda, R. Jaszewski, A. P. Majumdar. Curcumin induced modulation of cell cycle and apoptosis in gastric and colon cancer cells. Anticacer Res. März-April 2001; 21(2A): 873-8), PCNA (Y. Zhang, T. Iwama, K. Sugihara. Histochemical study of apoptosis and cell proliferation in hereditary intestinal diseases. J Med Dent Sci. Juni 1998; 45(2): 77-84), CEA (I. Vogel, H. Francksen, E. Soeth, D. Henne- Bruns, B. Kremer, H. Juhl. The carcinoembryonic antigen and its prognostic impact on immunocytologically detected intrapertoneal colorectal cancer cells. Am J Surg. Februar 2001; 181(2): 188-93), c-erbB2 (P. Fric, V. Sovova, E. Sloncova, Z. Lojda, A. Jirasek, J. Cermak. Different expression of some molecular markers in sporadic cancer of the left and right colon. Eur J Cancer Prev. August 2000; 9(4): 265-8), Estrogen-Rezeptor (M. Campbell-Thompson, I. J. Lynch, 8. Bhardwaj. Expression of esrogen receptor (ER) subtypes and ERbeta isoforms in colon cancer. Cancer Res. 15. Januar 2001; 61(2): 632-40), Progesteron- Rezeptor (0. Reich, S. Regauer, W. Urdl, M. Lahousen, R. Winter. Expression of oestrogen and progesteron receptors in low grade endometrial stromal sarcomas. Br J Cacer. März 2000; 82(5): 1030-4) und Myoglobin (A. Nakao, K. Sakagami, M. Uda, S. Mitsuoka, H. Ito. Carcinosarcoma of the colon: report of a case and review of the literature. J. Gastroenterol. April 1998; 33(2): 276-9) ein.
5-Methylcytosin ist die am häufigsten auftretende kovalente Basenmodifikation in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt zum Beispiel in der Regulation der Transkription, bei der genetischen Prägung und in der Tumorgenese eine Rolle. Deshalb ist die Identifikation von 5- Methylcytosin als ein Bestandteil der genetischen Information von erheblichem Interesse. Jedoch können die 5- Methylcytosin-Positionen nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten besitzt wie Methylcytosin. Weiterhin geht die von 5-Methylcytosin getragene epigenetische Information während der PCR-Amlifikation völlig verloren.
Ein relativ neues und gegenwärtig am häufigsten verwendetes Verfahren, DNA auf 5-Methylcytosin zu analysieren, basiert auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, welches durch anschließende alkalische Hydrolyse zu Uracil umgewandelt wird, das in seinem Basenpaarungsverhalten mit dem von Thymin übereinstimmt. 5- Methylcytosin bleibt unter diesen Bedingungen jedoch unverändert. Folglich wird die Original-DNA in einer solchen Art umgewandelt, dass Methylcytosin, das ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten nicht vorn Cytosin zu unterscheiden war, nun als das einzige verbleibende Cytosin unter Verwendung "normaler" molekularbiologischer Techniken, wie beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung, detektiert werden kann. Diese Techniken basieren alle auf der Basenpaarung, die nun vollständig ausgewertet werden kann. Hinsichtlich der Empfindlichkeit wird der Stand der Technik durch ein Verfahren bestimmt, das die zu analysierende DNA in eine Agarose-Matrix einschließt, wodurch die Diffusion und Renaturierung der DNA verhindert werden (Bisulfit reagiert nur mit einzelsträngiger DNA), und welches alle Ausfällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (a. Olek, J. Oswald, J. Walter. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analyis. Nucleic Acids Res. 15 Dezember 1996; 24(24):5064-6). Durch Verwendung dieses Verfahrens ist es möglich, einzelne Zellen zu analysieren, was das Potential dieses Verfahrens veranschaulicht. Jedoch werden momentan nur individuelle Regionen bis zu einer Länge von ungefähr 3000 Basenpaaren analysiert, eine umfassende Analyse von Zellen auf Tausende von möglichen Methylierungsereignissen ist nicht möglich. Auch kann dieses Verfahren nicht zuverlässig sehr kleine Fragmente aus kleinen Probenmengen analysieren. Diese gehen trotz des Diffusionsschutzes durch die Matrix verloren.
Einen Überblick über weitere bekannte Verfahren zur Detektion von 5-Methylcytosin gibt folgender Übersichtsartikel: T. Rein, M. L. DePamphilis, H. Zorbas, Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.
Bis heute, mit wenigen Ausnahmen (z. B. M. Zeschigk, C. Lich, K. Buiting, W. Doerfler, B. Horstehmke. A singletube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader- Willi syndrome based an allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. März-April 1997; 5(2): 94-8), wird die Bisulfit-Technik nur in der Forschung verwendet. Es werden jedoch immer kurze spezifische Fragmente eines bekannten Gens nachfolgend auf eine Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder vollständig sequenziert (A. Olek, J. Walter. The preimplantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. November 1997; 17(3):275-6) oder es werden individuelle Cytosin-Positionen durch Primerextensionsreaktionen (M. L. Gonzalgo, P. A. Jones. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extensions (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 15. Juni 1997; 25(12): 2529-31, WO-Patent 9500669) oder durch enzymatischen Verdau (Z. Xiong, P. W. Laird. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 15. Juni 1997; 25(12): 2532-4) detektiert. Weiterhin wurde auch die Detektion durch Hybridisierung beschrieben (Olek et al., WO 99/28498).
Weitere Publikationen, die sich mit der Verwendung der Bisulfit-Technik zur Methylierungsdetektion in einzelnen Genen beschäftigen, sind: G. Grigg, S. Clark. Sequencing 5-Methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. Juni 1994; 16(6): 431-6, 431; M. Zeschnigk, B. Schmitz, B. Dittrich, K. Buiting, B. Horstehmke. Imprinting segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Gent. März 1997; 6(3): 387-95; R. Feil, J. Charlton, A. P. Bird, J. Walter, W. Reik. Methylation analysis an indiviual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 25. Februar 1994; 22(4): 695-6; V. Martin, S. Ribieras, X. Song-Wang, M. C. Rio, R. Dante. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 19. Mai 1995; 157(1-2): 261-4; WO 97/46705, WO 95/15373 und WO 95/45560.
Einen Überblick über den Stand der Technik bei der Oligomer-Array-Herstellung geben eine Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, Januar 1999), veröffentlicht im Januar 1999 und die darin zitierte Literatur.
Fluoreszierend markierte Sonden werden häufig zum Scannen immobilisierter DNA-Arrays verwendet. Die einfache Anlagerung von Cy3- und Cy5-Farbstoffen an das 5'-OH-Ende der spezifischen Sonde ist besonders für Fluoreszenz-Marker geeignet. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonde kann zum Beispiel mit einem konfokalen Mikroskop erfolgen. Cy3- und Cy5-Farbstoffe sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.
Matrix-unterstützte Laserdesorptions/Ionsiations- Massenspektrometrie (MALDI) ist eine sehr wirkungsvolle Entwicklung zur Analyse von Biomolekülen (M. Karas, F. Hillenkamp. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 15 Oktober 1988; 60(20): 2299-301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Die Matrix wird durch einen kurzen Laserpuls verdampft, wodurch das Analytmolekül in unfragmentiertem Zustand in die Dampfphase überführt wird. Der Analyt wird durch Zusammenstoss mit Matrix-Molekülen ionisiert. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Aufgrund ihrer unterschiedlichen Massen werden die Ionen auf unterschiedliche Geschwindigkeiten beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor schneller als größere.
MALDI-TOF-Spektrometrie ist hervorragend zur Analyse von Peptiden und Proteinen geeignet. Die Analyse von Nukleinsäuren ist um einiges schwieriger (I. G. Gut, S. Beck. DNA and Matrix Assisted Laser Desorptions Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147-57). Die Empfindlichkeit für Nukleinsäuren ist ungefähr 100mal schlechter als für Peptide und sinkt disproportional mit steigender Fragmentgröße. Bei Nukleinsäuren, die ein mehrfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozess über die Matrix wesentlich weniger effektiv. In der MALDI-TOF-Spektrometrie spielt die Auswahl der Matrix eine ganz besonders wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind verschiedene sehr wirkungsvolle Matrizes gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation erzeugen. Es gibt jetzt verschiedene entsprechende Matrizes für DNA, jedoch ist der Unterschied in der Empfindlichkeit nicht verringert worden. Der Unterschied in der Empfindlichkeit kann durch solche chemische Modifizierung der DNA verringert werden, bei denen sie einem Peptid ähnlicher wird. Phosphorthioat-Nukleinsäuren, bei denen die üblichen Phosphate des Rückgrats durch Thiophosphate ersetzt werden, können unter Verwendung einfacher Alkylierungsverfahren (I. G. Gut, S. Beck. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. nucleic Acida Res. 25. April 1995; 23(8):1367-73) in eine ladungsneutrale DNA überführt werden. Die Kopplung eines Ladungs-Markers an diese modifizierte DNA resultiert in einem Anstieg der Empfindlichkeit auf das gleiche Niveau, das man für Peptide ermittelt hat. Ein weiterer Vorteil des Ladungs- Taggings ist die gesteigerte Stabilität der Analyse gegenüber Verunreinigungen, welche die Detektion unmodifizierter Substrate wesentlich erschweren.
Genomische DNA wird aus DNA aus Zellen, Gewebe oder anderen Test-Proben unter Verwendung von Standardverfahren erhalten. Diese Standard-Methodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis Ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung offenbart, dass atypische Methylierung in den Genen Estrogen-Rezeptor, p21, p27, Progesteron-Rezeptor, Myoglobin, pcna, cdc2, c-erbB2, p53 und CEA positiv mit der Dickdarm-Karzinogenese korreliert werden können. Das erlaubt die Detektion von Dickdarm- Karzinomen oder der Prädisposition für Dickdarmkrebs durch ein Assay, das die Methylierung in den Genen durch Restriktionsenzym-Analyse oder unter Verwendung eines auf Nukleinsäuren basierenden Verfahrens detektiert. Weiterhin sind nun therapeutische Methoden wie der Austausch von abnormal methylierten Genen durch korrekt methylierte Gene möglich.
Die offenbarte Erfindung stellt ein Verfahren und Nukleinsäuren zur Analyse von Dickdarmkrebs-Karzinomen bereit. Sie offenbart ein Mittel zur Unterscheidung zwischen gesundem und krebsartigen Dickdarmkrebsgewebe. Dadurch wird ein Mittel zur verbesserten Diagnose, Prognose, Bewertung und Einstufung von Dickdarmkrebs auf molekularer Ebene, im Gegensatz zu gegenwärtig verwendeten, relativ subjektiven Verfahren wie die histologische Analyse, bereit gestellt. Weiterhin zeigt die offenbarte Erfindung dadurch Verbesserungen gegenüber dem Stand der Technik, dass gegenwärtige Verfahren der histologischen und cytologischen Analyse es erforderlich machen, dass die Biopsie ein ausreichendes Maß an Gewebe enthält. Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Klassifizierung von Schnellschnitten verwendet werden.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Detektion einer proliferativen Störung von Dickdarmzellen bereit, dadurch gekennzeichnet, dass die Target-Nukleinsäure der Gene Estrogen-Rezeptor, p21, p27, p16, Progesteron-Rezeptor, Myoglobin, pcna, cdc2, c-erbB2, p53 und CEA mit einem Reagenz oder einer Reihe von Reagenzien in Kontakt gebracht wird/werden, die geeignet sind zwischen methylierten und nicht-methylierten CpG-Dinukleotiden innerhalb der Target-Sequenz zu unterscheiden.
Die vorliegende Erfindung macht ein Verfahren zur Ermittlung genetischer und/oder epigentischer Parameter genomischer DNA verfügbar. Dieses Verfahren ist zur Bewertung, Einstufung, Behandlung und/oder Diagnose von Dickdarmkrebs geeignet. Das Verfahren ermöglicht die Analyse von Cytosin-Methylierungen und Einzelnukleotid- Polymorphismus.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die folgenden Schritte:
Im ersten Schritt des Verfahrens muss die genomische DNA- Probe aus Gewebe oder zellulären Quellen isoliert werden. Solche Quellen können Zell-Linien, histologische Schnitte, Körperflüssigkeiten, zum Beispiel Cerebrospinalflüssigkeit oder lymphatische Flüssigkeit, oder in Paraffin eingebettetes Gewebe, zum Beispiel Gehirn, Zentralnervensystem oder lymphatisches Gewebe einschließen. Die Extraktion kann mit für den Fachmann geläufigen Mitteln erfolgen, einschließlich der Verwendung detergenter Lysate, Ultraschall und Vortexing mit Glasperlen. Wenn die Nukleinsäuren extrahiert worden sind, wird die genomische doppelsträngige DNA zur Analyse verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die DNA vor der chemischen Behandlung gespalten werden, und zwar durch alle im Stand der Technik bekannten Mittel, insbesondere Restriktionsendonukleasen.
Im zweiten Schritt des Verfahrens wird die genomische DNA-Probe in solcher Art chemisch behandelt, dass an der 5'-Position unmethylierte Cytosin-Basen in Uracil, Thymin oder eine andere Base umgewandelt werden, die sich in Bezug auf ihr Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet. Das wird im Folgenden als "chemische Vorbehandlung" bezeichnet.
Die oben beschriebene Behandlung der genomischen DNA wird bevorzugt mit Bisulfit (Sulfit, Dislufit) durchgeführt gefolgt von alkalischer Hydrolyse, was zu Umwandlung von nicht-methylierten Cytosin-Nukleasen in Uracil oder eine andere Base führt, die sich in Bezug auf ihr Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet.
Fragmente der chemisch vorbehandelten DNA werden unter Verwendung Sätzen von Primer-Olignukleotiden entsprechend der Sequenz ID 76 bis 97 und einer, bevorzugt wärmestabilen Polymerase, amplifiziert. Wegen statistischer und praktischer Gesichtspunkte werden mehr als zehn unterschiedliche Fragmente mit einer Länge von 100-2000 Basenpaaren amplifiziert. Die Amplifikation mehrerer DNA- Segmente kann simultan in ein und demselben Reaktionsbehälter durchgeführt werden. Gewöhnlich wird die Amplifikation durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt.
Das Verfahren wird auch durch die Verwendung alternativer Primer ermöglicht, wobei die Gestaltung dieser Primer dem Fachmann bekannt ist. Diese sollten mindestens zwei Oligonukleotide enthalten, deren Sequenzen umgekehrt komplementär oder identisch zu einem wenigstens 18 Basenpaaren langen Segment der im Anhang spezifizierten Basensequenzen (Seq. ID Nr. 32 bis Seq. ID Nr. 75) sind. Diese Primer-Oligonukleotide sind bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass sie keine CpG-Dinukleotide enthalten. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens sind die Sequenzen dieser Primer-Oligonukleotide so gestaltet, dass sie sich selektiv nur an die für Dickdarmgewebe spezifische DNA anlagern und diese amplifizieren und dabei die Amplifikation von Hintergrund-DNA oder nicht interessierender DNA minimal halten. Im dieser Erfindung bedeutet Hintergrund-DNA genomische DNA, die kein relevantes gewebsspezifisches Methylierungsmuster hat, wobei in diesem Fall das relevante Gewebe gesundes und krankes Dickdarmgewebe ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass wenigstens ein Primer-Oligonukleotid während der Amplifikation an eine feste Phase gebunden ist. Die verschiedenen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomer-Sequenzen können auf einer ebenen festen Phase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters ausgerichtet sein, wobei die Festphasenoberfläche bevorzugt aus Silikon, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold zusammengesetzt ist, es aber auch möglich ist, dass andere Materialien wie Nitrocellulose oder Plastik verwendet werden können.
Die mittels Amplifikation erhaltenen Fragmente können einen direkt oder indirekt detektierbaren Marker tragen. Bevorzugt sind Marker in Form von Fluoreszenzmarkern, Radionukliden oder abtrennbaren Molekülfragmenten, welche eine typische Masse besitzen, die im Massenspektrometer detektiert werden kann, wobei es bevorzugt ist, dass die erzeugten Fragmente für eine bessere Detektierbarkeit im Massenspektrometer eine einfach positive oder negative Nettoladung haben. Die Detektion kann mittels Matrixunterstützter Laserdesorptions/Ionsiations- Massenspektrometrie (MALDI) oder unter Verwendung von Elektrospray-Massenspektrometrie (ESI) ausgeführt und sichtbar gemacht werden.
Die im zweiten Schritt des Verfahrens erhaltenen Amplifikate werden nachfolgend an ein Array oder einen Satz von Oligonukleotiden und/oder PNA-Sonden hybridisiert. In diesem Zusammenhang findet die Hybridisierung wie im Folgenden beschrieben statt. Der Satz von Sonden, der während der Hybridisierung benutzt wird, setzt sich bevorzugt aus mindestens 10 Oligonukleotiden oder PNA- Oligomeren zusammen. Bei diesem Prozess dienen die Amplifikate als Sonden, die an Oligonukleotide hybridisieren, welche zuvor an eine feste Phase gebunden wurden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Oligonukleotide aus der Gruppe, welche die Seq. IDs 98 bis 523 umfasst, ausgewählt. Die nichthybridisierten Fragmente werden nachfolgend entfernt. Die Oligonukleotide enthalten wenigstens eine Basensequenz mit einer Länge von 10 Nukleotiden, welche umgekehrt komplementär zu oder identisch ist mit einem Segment der Basensequenzen, die im Anhang spezifiziert wird, wobei das Segment wenigstens ein CpG-Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG- Dinukleotids ist das fünfte oder neunte Nukleotid vom 5'- Ende des 10-Mers. Es existiert für jedes CpG-Dinukleotid ein Oligonukleotid.
Im fünften Schritt des Verfahrens werden die nichthybridisierten Amplifikate entfernt.
Im letzten Schritt des Verfahrens werden die hybridisierten Amplifikate detektiert. In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, dass an die Amplifikate gebundene Marker an jeder Position der festen Phase, an der sich eine Oligonukleotid-Sequenz befindet, identifizierbar sind.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Marker der Amplifikate Fluoreszenz-Marker, Radionuklide, oder abtrennbare Molekülfragmente mit einer typischen Masse sind, die im Massenspektrometer detektiert werden können. Das Massenspektrometer ist zur Detektion der Amplifikate, den Fragmenten der Amplifikate oder von Sonden, die komplementär zu den Amplifikaten sind, bevorzugt, da es möglich ist, die Detektion mittels Matrix-unterstützter Laserdesorptions/Ionsiations-Massenspektrometrie (MALDI) oder unter Verwendung von Elektrospray- Massenspektrometrie (ESI) auszuführen und sichtbar zu machen. Die erzeugten Fragmente können zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer eine einfach positive oder negative Nettoladung haben.
Das oben genannte Verfahren wird bevorzugt zur Ermittlung genetischer und/oder epigenetischer Parameter genomischer DNA verwendet.
Um das Verfahren zu ermöglichen, stellt die Erfindung weiterhin die chemisch modifizierte DNA der Gene Estrogen-Rezeptor, p21, p27, p16, Progesteron-Rezeptor, Myoglobin, pcna, cdc2, c-erB2, p53 und CEA wie auch Oligonukleotide und/oder DNA-Oligomere zur Detektion von Cytosin-Methylierungen bereit. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass genetische und epigenetische Parameter und im Besonderen die Cytosin- Methylierungsmuster genomischer DNA insbesondere zur Charakterisierung, Bewertung, Einstufung und/oder Diagnose von Dickdarmkrebs geeignet sind.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren von Seq. ID Nr. 12 über Seq. ID Nr. 523 können zur Charakterisierung, Bewertung, Einstufung und/oder Diagnose genetischer und/oder epigenetischer Parameter genomischer DNA verwendet werden.
Diese Ziel wird erfindungsgemäß unter Verwendung einer Nukleinsäure erreicht, die eine Sequenz der Länge von mindestens 18 Basen der chemisch vorbehandelten genomischen DNA gemäß einer der Seq. ID Nr. 32 bis Seq. ID Nr. 75 und dazu komplementäre Sequenzen enthält.
Chemisch modifizierte Nukleinsäure konnte bisher nicht mit der Ermittlung krankheitsrelevanter genetischer oder epigenetischer Parameter in Zusammenhang gebracht werden.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung wird weiterhin durch ein Oligonukleotid oder Oligomer zur Analyse chemisch vorbehandelter DNA, zur Detektion genomischer Cytosin- Methylierungszustände erreicht, wobei die Oligonukleotide mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 10 Nukleotiden haben, die an die chemisch vorbehandelte genomische DNA gemäß der Seq. ID Nr. 32 über Seq. ID Nr. 75 hybridisiert. Die erfindungsgemäßen Oligomer- Sonden stellen wichtige und wirkungsvolle Werkzeuge da, die es zum ersten mal möglich machen, spezifische genetische und epigenetische Parameter von Dickdarmkrebs zu ermitteln, insbesondere zum Gebrauch bei der Charakterisierung, Bewertung, Einstufung und/oder Diagnose von Dickdarmkrebs. Die Basensequenz der Oligomere enthält bevorzugt wenigstens ein CpG-Dinukleotid. Die Sonden können auch in Form einer PNA (Peptidnukleinsäure) vorliegen, die besonders bevorzugte Paarungseigenschaften hat. Besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Oligonukleotide, in welchen das Cytosin des CpG-Dinukleotid das 5-te - 9- te Nukleotid vom 5'-Ende des 13-Mers ist; im Fall von PNA-Oligomeren ist es bevorzugt, dass das Cytosin des CpG-Dinukleotids das 4-te - 6-te Nukleotid vom 5'-Ende des 9-Mers ist.
Die erfindungsgemäßen Oligomere werden gewöhnlich in sogenannten "Sätzen" verwendet, die wenigstens ein Oligomer für jedes der CpG-Dinukleotide der Sequenzen von Seq. ID Nr. 32 bis Seq. ID Nr. 75 enthält. Bevorzugt ist ein Set, das wenigstens ein Oligomer für jedes der CpG-Nukleotide von Seq. ID Nr. 32 bis Seq. ID Nr. 75 enthält.
Für die erfindungsgemäßen Sätze von Oligonukleotiden ist es bevorzugt, dass mindestens ein Oligonukleotid an eine feste Phase gebunden ist. Es ist weiterhin bevorzugt, dass alle Oligonukleotide eines Satzes an eine feste Phase gebunden sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Satz von wenigstens 10 n (Oligonukleotide und/oder PNA- Oligomere), der zur Detektion von Cytosin- Methylierungszuständen in chemisch vorbehandelter genomischer DNA (Seq. ID Nr. 32 bis Seq. ID Nr. 75 und dazu komplementäre Sequenzen) geeignet ist. Diese Sonden ermöglichen die Charakterisierung, Bewertung, Einstufung und/oder Diagnose genetischer oder epigenetischer Parameter von Dickdarmkrebs.
Weiterhin ermöglichen die Sonden die Diagnose von Prädisposition für Dickdarmkrebs. Der Satz von Oligomeren kann auch zur Detektion von Einzelnukleotid- Polymorphismus (SNPs) in chemisch vorbehandelter genomischer DNA gemäß einer der Seq. ID Nr. 32 bis Seq. Nr. 75 verwendet werden.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass eine Zusammenstellung verschiedener Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere (ein sogenanntes Array), die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, in solcher Weise vorliegt, dass sie gleichfalls an eine feste Phase gebunden ist. Dieses Array verschiedener Oligonukleotid- und/oder PNA- Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet sein, dass es auf einer Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet ist. Die Festphasenoberfläche ist bevorzugt aus Silikon, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold zusammengesetzt. Jedoch sind auch Nitrocellulose und Kunststoffe wie Nylon, die in Form von Pellets oder auch als Harz-Matrizes existieren können, möglich.
Demgemäss ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines an ein Trägermaterial gebundenen Arrays zur Bewertung, Einstufung und/oder Diagnose von Dickdarmkrebs, wobei in dem Verfahren wenigstens ein Oligomer erfindungsgemäß an eine feste Phase gekoppelt ist. Verfahren zur Herstellung solcher Arrays mittels Festphasenchemie und photolabiler Schutzgruppen sind zum Beispiel dem aus US-Patent 5,744,305 bekannt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen DNA-Chip zur Charakterisierung, Bewertung, Einstufung und/oder Diagnose von Dickdarmkrebs. Weiterhin ermöglicht der DNA-Chip die Diagnose von Prädisposition für Dickdarmkrebs. Der DNA-Chip enthält wenigstens eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung. DNA-Chips sind zum Beispiel aus dem US-Patent 5,837,832 bekannt.
Darüber hinaus ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Kit, das zum Beispiel aus einem Bisulfit-enthaltenden Reagenz, einem Satz von Primer-Nukleotiden mit mindestens zwei Oligonukleotiden, deren Sequenz in jedem der Fälle mit den in Anhang spezifizierten Basensequenzen (Seq. ID Nr. 32 über Seq. ID Nr. 75) korrespondiert oder zu ihnen komplementär ist, Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomere wie auch Instruktionen zur Durchführung und Auswertung des beschriebenen Verfahrens, zusammengesetzt sein kann.
Das erfindungsgemäße Kit kann jedoch auch nur einen Teil der vorstehend genannten Komponenten enthalten.
Die erfindungsgemäßen Oligomere oder deren Arrays wie auch ein erfindungsgemäßes Kit sind zur Verwendung für die Charakterisierung, Bewertung, Einstufung und/oder Diagnose von Dickdarmkrebs oder zur Diagnose der Prädisposition für Dickdarmkrebs gedacht. Erfindungsgemäß wird das Verfahren bevorzugt zur Analyse wichtiger genetischer und/oder epigenetischer Parameter innerhalb genomischer DNA, insbesondere zur Verwendung bei der Charakterisierung, Bewertung, Einstufung und/oder Diagnose von Dickdarmkrebs und Prädisposition für Dickdarmkrebs verwendet.
Die erfindungsgemäßen Verfahren werden zum Beispiel zur Charakterisierung, Bewertung, Einstufung und/oder Diagnose von Dickdarmkrebs verwendet.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein Verfahren zur Analyse des Methylierungsstatus genomischer DNA, ohne dass eine chemische Vorbehandlung erforderlich ist. Im ersten Schritt des Verfahrens muss die genomische DNA-Probe aus Gewebe oder zellulären Quellen isoliert werden. Solche Quellen können Zell-Linien, histologische Schnitte, Körperflüssigkeiten, zum Beispiel Cerebrospinalflüssigkeit oder lymphatische Flüssigkeit, oder in Paraffin eingebettetes Gewebe, zum Beispiel Gehirn, Zentralnervensystem oder lymphatisches Gewebe, einschließen. Die Extraktion kann mit für den Fachmann geläufigen Mitteln erfolgen, einschließlich der Verwendung detergenter Lysate, Ultraschall und Vortexing mit Glasperlen. Wenn die Nukleinsäuren extrahiert worden sind, wird die genomische doppelsträngige DNA zur Analyse verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die DNA vor der chemischen Behandlung gespalten werden, und zwar durch alle im Stand der Technik bekannten Mittel, insbesondere Restriktionsendonukleasen. Im zweiten Schritt wird die DNA dann mit methylierungssensitiven Restriktionsenzymen verdaut. Der Verdau wird so ausgeführt, dass die Hydrolyse der DNA an der Restriktionsstelle Informationen über den Methylierungsstatus eines spezifischen CpG-Dinukleotids gibt.
Im dritten Schritt werden die Restriktionsfragmente amplifiziert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dazu eine Polymerase-Kettenreaktion verwendet.
Im letzten Schritt werden die Amplifikate detektiert. Die Detektion kann durch alle im Stand der Technik bekannten Verfahren, zum Beispiel Gelelektrophorese-Analyse, Hybridisierungsanalyse, Inkorporation detektierbarer Tags in die PCR-Produkte, DNA-Analyse, MALDI- oder ESI-Analyse geschehen, ist jedoch nicht auf diese beschränkt.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Diagnose und/oder Prognose von für Patienten oder Individuen nachteiligen oder relevanten Ereignissen, bei denen wichtige genetische und/oder epigenetische Parameter innerhalb der genomischen DNA, die durch erfindungsgemäße Mittel erhalten werden, mit einem anderen Satz genetischer und/oder epigenetischer Parameter verglichen werden können, und wobei die Differenz als Basis für eine Diagnose und/oder Prognose von für Patienten oder Individuen nachteiligen oder relevanten Ereignissen dient.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung ist der Begriff "Hybridisierung" als Bindung eines Oligonukleotids in der Proben-DNA an eine vollständig komplementäre Sequenz, nach den Grundsätzen der Watson-Crick-Basenpaarung zu verstehen, wodurch eine Duplex-Struktur gebildet wird.
Der Begriff "funktionelle Varianten" bezeichnet alle DNA- Sequenzen, die komplementär zu einer DNA-Sequenz sind, und die unter strengen Bedingungen an die Referenzsequenz hybridisieren.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung sind "genetische Parameter" Mutationen und Polymorphismen genomischer DNA und Sequenzen, die für ihre weitere Regulierung benötigt werden. Als Mutationen sind insbesondere Insertionen, Deletionen, Punkt-Mutationen, Inversionen und Polymorphismen und besonders bevorzugt SNPs (Einzelnukleotid- Polymorphismen), zu bezeichnen.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung sind "epigenetische Parameter" insbesondere Cytosin-Methylierungen und weitere chemische Modifikationen von DNA-Basen genomischer DNA und weiterer Sequenzen, die für ihre Regulierung benötigt werden. Weitere epigentische Parameter schließen zum Beispiel die Acetylierung von Histonen ein, die zwar nicht direkt unter Verwendung des beschriebenen Verfahrens analysiert werden kann, die jedoch mit der DNA-Methylierung korreliert.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung auf der Basis der Sequenzen und Beispiele detaillierter beschrieben, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Die Seq. ID 1 bis 11 repräsentieren die genomische DNA der Gene Estrogen-Rezeptor, p21, p27, p16, Progesteron- Rezeptor, Myoglobin, pcna, cdc2, c-erbB2, p53 und CEA. Diese Sequenzen wurden aus Genbank gewonnen und werden genommen um alle geringfügigen Variationen des Sequenzmaterials einzuschließen, die gegenwärtig nicht vorhersehbar sind, wie zum Beispiel geringfügige Deletionen und SNPs, ist jedoch nicht auf diese beschränkt.
Die Seq. ID 12 bis 31 repräsentiert Segmente genomischer DNA, die besonders zur Determination von profilerativen Störungen/Abweichungen von Dickdarmzellen geeignet sind.
Die Seq. ID 32 bis 75 stellt die chemisch vorbehandelte Sequenz der Gene Estrogen-Rezeptor, p21, p27, p16, Progesteron-Rezeptor, Myoglobin, pcna, cdc2, c-erbB2, p53 und CEA dar. Diese Sequenzen werden verwendet, um alle geringfügigen Variationen des Sequenzmaterials einzuschließen, die gegenwärtig nicht vorhersehbar sind, zum Beispiel geringfügige Deletionen und SNPs, ist jedoch nicht auf diese beschränkt.
Die Sequenzen mit geraden Sequenznummern (z. B. ID Nr. 32, 34, 36, . . .) stellen in allen Fällen Sequenzen chemisch vorbehandelter genomischer DNAs dar.
Sequenzen, mit ungerade Sequenznummern (z. B. Seq. ID Nr. 33, 35, 37, . . .) stellen in allen Fällen die Sequenzen chemisch vorbehandelter DNAs dar. Diese genomischen DNAs sind komplementär zu den genomischen DNAs aus welchen die vorhergehende Sequenz erzeugt wurde (z. B. ist die komplementäre Sequenz zur genomischen DNA, aus der Seq. ID Nr. 32 erhalten wurde die genomische Sequenz aus welcher Seq. ID Nr. 33 erzeugt wurde; die komplementäre Sequenz zur genomischen DNA aus welcher Seq. ID Nr. 33 erzeugt wurde, ist die Sequenz aus welcher Seq. ID Nr. 34 erzeugt wurde, etc.).
Sequenz ID Nr. 76 bis 97 stellt die Sequenz von Primer- Oligonukleotiden zur Amplifikation chemisch vorbehandelter DNA gemäß den Seq. IDs 32 bis 75 dar.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung im Detail, ohne ihren Umfang zu beschränken.

Beispiel 1

Beschreibung der PCR

Die Einzelgen-PCR-Reaktion wurde mittels eines Thermocylers (Epperdorf GmbH) unter Verwendung von 10 ng Bisulfit-behandelter DNA, 6 µmol eines jeden Primers, 200 µM jedes dNTPs, 1,5 mM MgCl₂ und 1 U HotstartTaq (Qiagen AG) durchgeführt. Die weiteren Bedingungen entsprachen den vom Taq-Polymerase-Hersteller empfohlenen. Einzelgene wurde durch PCR unter Ausführung eines ersten Denaturierungsschritts über 14 Minuten bei 96°C, gefolgt von 39 Zyklen (60 sec bei 96°C, 45 sec bei 55°C, 75 sec bei 72 °C) und nachfolgender abschließender Elongation für 10 min bei 72°C, amplifiziert. Die Bisulfit-DNA wurde entsprechend eines bekannten Verfahrens aus genomischer DNA hergesellt, die einzeln aus 12 übereinstimmenden Proben des Adenokarzinoms des Dickdarms und gesundem Dickdarmgewebe isoliert wurden. Die genomische DNA wurde unter Verwendung des Wizzard-DNA-Isolierungs-Kits (Promega, Madison) isoliert.

Beispiel 2

Methylierungsanalyse des Gens p16.

Das folgende Beispiel betrifft ein Fragment des Gens p16, in welchem ein spezifisches CG-Dinukleotid auf Methylierung analysiert werden soll.
Im ersten Schritt wird eine genomische Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Dislufit) derart behandelt, dass alle in der 5'-Position der Base nichtmethylierten Cytosine so verändert werden, dass eine andere Base in Bezug auf das Basenpaarungsverhalten substituiert wird, während an der 5'-Position methyliertes Cytosin unverändert bleibt.
Wenn Bisulfit-Lösung für die Reaktion verwendet wird, tritt eine Addition an die nicht-methylierten Cytosin- Basen ein. Weiterhin muss ein Denaturierungs-Reagenz oder Lösemittel wie auch ein Radikalfänger anwesend sein. Eine nachfolgende alkalische Hydrolyse bewirkt dann die Umwandlung der methylierten Cytosin-Nukleobasen in Uracil.
Die chemisch umgewandelte DNA wird dann zur Detektion methylierter Cytosine verwendet. Im zweiten Verfahrensschritt wird die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen Lösung verdünnt. Bevorzugterweise wird die DNA nachfolgend desulfoniert. Im dritten Schritt des Verfahrens wird die DNA in einer Polymerase-Kettenreaktion polymerisiert, bevorzugt unter Verwendung einer wärmestabilen DNA-Polymerase. Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Gens p16 analysiert. Zu diesem Zweck wird ein definiertes Fragment mit einer Länge von 598 bp mit den spezifischen Primer-Oligonukleotiden TTGAAAATTAAGGGTGAGG (Sequenz ID 82) und CACCCTCTAATAACCAACCA (Sequenz ID Nr. 83) amplifiziert. Das Amplifikat dient als Probe, die unter Ausbildung einer Duplex-Struktur an ein Oligonukleotid hybridisiert, das vorher an eine Festphase gebunden wurde, zum Beispiel TAAGTGTTCGGAGTTAAT (Seq. ID Nr.: 238), wobei sich das zu detektierende Cytosin in Position 439 des Amplifikats befindet. Die Detektion des Hybridisierungsprodukts basiert auf mit Cy3 und Cy5 fluoreszierend-markierten Primer-Oligonukleotiden, die zur Amplifikation verwendet wurden. Eine Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem Oligonukleotid findet nur statt, wenn ein methyliertes Cytosin an dieser Stelle in der Bisulfit-behandelten DNA vorgelegen hat, wie Fig. 1A für gesundes Gewebe zeigt. Demgemäss ist der Methylierungszustand des spezifischen zu analysierenden Cytosins aus dem Hybridisierungsprodukt ableitbar.
Um den Methylierungsstatus der Position zu verifizieren, wird eine Probe des Amplifikats außerdem an ein anderes Oligonukleotid hybridisiert, das zuvor an eine Feststoffphase gebunden wurde. Das Oligonukleotid ist mit Ausnahme der fraglichen Position mit dem vorher zur Analyse des Methylierungsstatus verwendeten Oligonukleotid identisch. An der zu analysierenden Position umfasst dieses Oligonukleotid eine Thymin-Base an statt einer Cytosin-Base, d. h. TAAGTGTTTGGAGTTAAT (Seq. ID Nr.: 239). Deshalb findet die Hybridisierungsreaktion nur statt, wenn ein unmethyliertes Cytosin an der zu analysierenden Position anwesend war, wie in Fig. 1B für Tumorgewebe gezeigt wird.

Beispiel 3

Unterscheidung zwischen Dickdarmtumor- und gesundem Dickdarmgewebe

Unterscheidung zwischen gesunden Proben und Adenkarzinom- Tumoren. Zur Voraussage der Tumorklasse zwischen gesundem und Tumorgewebe haben wir eine Support-Vektor-Maschine (SVM) an einem Satz ausgewählter CpG-Stellen (F. Model, P. Adorjan, A. Olek, C. Piepenbrock, Feature selection for DNA methylation based cancer classification. Bioinformatics. Juni 2001 17. Suppl. 1: S. 157-64) verwendet. Zuerst bewerteten wir die CpG-Stellen für eine vorgegebene Trennungsaufgabe nach ihrer Signifikanz für den Unterschied zwischen den beiden Kategoriemitteln. Die Signifikanz eines jeden CpG wurde durch einen Zweiproben t-Test abgeschätzt (W. Mendenhall, T. Sincich, Statistics for engineering and the sciences (Prentice-Hall, New Jersey 1995)).
Um die Methylierungsmuster mit einem Adenokarzinom-Tumor in Beziehung zu setzen, ist es zuerst erforderlich die DNA-Methylierungsmuster gesunden Gewebes und Adenokarzinom-Tumorgewebes vergleichend zu analysieren (Fig. 2 A und B). Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse werden in einer Datenbank gespeichert und die CpG-Dinukleotide, die in diesen beiden Gruppen unterschiedlich methyliert sind, werden identifiziert. Das kann durch die Bestimmung individueller CpG-Methylierungsraten durchgeführt werden, was zum Beispiel durch Sequenzierung geschehen kann, die jedoch zur Quantifizierung von Methylierung an einer spezifischen CpG-Stelle ein relativ ungenaues Verfahren ist, oder aber in sehr präziser Art, durch methylierungssensitive "Primer-Extensionsreaktion". In einer besonders bevorzugten Variante, wie in den vorstehenden Beispielen veranschaulicht, kann der Methylierungsstatus von Hunderten oder Tausenden von CpGs auf einem Oligomer-Array analysiert werden. Es ist auch möglich, die Muster zum Beispiel durch Cluster-Analysen zu vergleichen, welche zum Beispiel mit einem Computer durchgeführt werden können. Eine Tafel genomischer Fragmente 11 unterschiedlicher Gene (in Tabelle 1 aufgeführt) wurden Bisulfit-behandelt und durch Singleplex PCRs gemäß Beispiel 1 amplifiziert. Für den Fachmann ist es jedoch offensichtlich, dass es auch möglich ist, andere Primer zu verwenden, welche die genomische, Bisulfit-behandelte DNA in entsprechender Weise amplifizieren und/oder die PCRs im Multiplex-Format auszuführen. Jedoch sind die in Tabelle 1 aufgelisteten Primer-Oligonukleotid-Paare besonders bevorzugt. Um Adenokarzinom-Tumor- von gesunden Kontroll-Proben zu unterscheiden, wurden optimale Ergebnisse unter Einschluss von wenigsten 6 CpG-Dinukleotiden erhalten, wobei die aussagekräftigsten Unterscheidungen innerhalb der p16-, p53-, CEA-, c-erbB2- und Estrogenrezeptor-Gene (vergleiche Fig. 2, Tab. 1) lokalisiert sind. Zusätzlich zeigt die Mehrheit der analysierten CpG-Dinukleotide der Tafel unterschiedliche Methylierungsmuster zwischen den zwei Phenotypen. Die Ergebnisse bestätigen, dass Methylierungs- Fingerabdrücke geeignet sind, um Differentialdiagnose von Adenokarzinom-Tumoren bereitzustellen und könnte deshalb bei einer großen Zahl klinischer Situationen angewendet werden. Zur Kategorienvorhersage wurde eine SVM auf die signifikantesten CpG-Positionen trainiert, wobei die optimale Zahl der CpG-Stellen von der Komplexität der Trennungsaufgabe abhängt. Die Ausführung der SVM erfolgte unter Verwendung des Sequential Minimal Optimization Algorithmus um die 1-Norm der trennenden Soft Margin- Hyperebene zu finden (N. Christiani, J. Shawe-Taylor, An Introduction to Support Vektor Machines,. Cambridge University Press, Cambridge 2000). Die Kastenbegrenzung wurde auf C = 10 eingestellt. Die Verallgemeinerungsleistung wurde durch Näherung über 50 Kreuzvalidierungsläufe bei zufällig permutierten Proben, die in 8 Gruppen eingeteilt wurden, abgeschätzt.

Beispiel 4

Analyse des Methylierungsstatus der informativsten CpG-Positionen der Gene c-erB2, p53, CEA, p16 und ER1

Der Methylierungsstatus der informativsten CpG-Positionen der Genfragmente der Gene c-erbB2, p53, CEA, p16 und ER1 wird in diesem Beispiel gezeigt. Gemäß Beispiel 2, in dem der Methylierungsstatus durch Spots gezeigt wird, beschreibt Tabelle 2 in detaillierter Weise den Methylierungsstatus verschiedener Genfragmente mehrerer Patienten durch Berechnung des Methylierungsstatus von Dickdarmtumor- und gesundem Dickdarmgewebe. Die erste Spalte kennzeichnet das spezifische Genfragment, die zweite Spalte beschreibt die untersuchten CpG-Oligonukleotide, die dritte Spalte veranschaulicht die Diagnose des untersuchten Gewebes (T = Tumor, H = gesund) und die Säulen 4 bis 17 zeigen den Logarithmus des Verhältnisses des Fluoreszenz- Signals des CG-Oligonukleotids zum TG-Oligonukleotid des Dickdarmtumor- und gesunden Dickdarmgewebes von 14 verschiedenen Patienten.
Ein Vergleich des Methylierungsstatus von Gen p16, Patient 11 zum Beispiel zeigt, dass in dieser Probe gesundes Gewebe weniger methyliert ist als Tumorgewebe. Das umgekehrte Verhältnis kann zum Beispiel für das Gen c-erbB2 bei Patient 11 beobachtet werden. In diesem Fall ist die Tumor-Probe stärker methyliert als das gesunde Gewebe. Die analysierten CpG-Positionen zeigen, dass die Gene p53, CEA, p16 und ER1 hypermethyliert sind, wohingegen cerbB2 in den meisten Tumor-Proben im Vergleich zu gesunden Kontrollen hypomethyliert ist.

Beispiel 5

Identifizierung des Methylierungsstatus der CpG-Stelle der Gene CEA und p16 durch den Verdau mit methylierungssensitiven Restriktionsenzyme

Im CEA-Gen wird ein definiertes Fragment mit einer Länge von 351 bp, welches 7 CpG-Stellen enthält, mit den spezifischen Primer-Oligonukleotiden TGGTTAAATGTGTGGGAGAT (Sequenz ID 524) und TCCTGAGTGATGTCTGTGTG (Sequenz ID Nr. 525) und im p16-Gen wird ein definiertes Fragment mit einer Länge von 391 bp, das 26 CpG-Stellen enthält, mit spezifischen Primer-Oligonukleotiden ATGACACCAAACACCCCGAT (Sequenz ID Nr. 527) und CTGTCCCTCAAATCCTCTG (Sequenz ID Nr. 527) amplifiziert. CGCG für das Gen CEA mit Cytosin an den Positionen 127 und 129 des Amplifikats und CGCG für Gen p16 mit Cytosin an den Positionen 362 und 364 des Amplifikats sind in der Erkennungssequenz des SacII- Restriktionsenzyms, CCGCGG, lokalisiert. Die Spaltung von SacII wird durch die Methylierung von mindestens einem der zwei CpG-Dinukleotide blockiert.
Die aus dem Adenokarzinom von Dickdarmgewebe und aus gesundem Dickdarmgewebe isolierte genomische DNA, wurde durch SacII, entsprechend der Empfehlung des Herstellers (New England Biolabs GmbH), hydrolysiert.
10 ng der durch SacII gespaltenen DNA wurden als Templat für die Amplifizierung der oben angegebenen CEA- und p16- Genfragmente verwendet. Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung eines Thermocyclers (Epperdorf GmbH) durchgeführt, wobei 10 ng DNA, 6 µmol jedes Primers, 200 µM jedes dNTP, 1,5 mM MgCl₂ und 1 U HotstartTaq (Qiagen AG) verwendet wurden. Die anderen Bedingungen entsprachen den vom Taq-Polymerase-Hersteller empfohlenen. Unter Verwendung der oben genannten Primer wurden die Genfragmente durch PCR mit einem ersten Denaturierungsschritt für 14 min bei 96°C, gefolgt von 30-45 Zyklen (Schritt 2: 60 sec bei 96°C, Schritt 3: 45 sec. bei 55°C, Schritt 4: 75 sec bei 72°C) und einem folgenden abschließenden Elongationsschritt für 10 min bei 72°C amplifiziert. Das Vorliegen von PCR-Produkten wurde durch Agarose- Gelelektrophorese analysiert.
PCR-Produkte waren bei aus Dickdarmkrebsgewebe gewonnener und durch SacII hydrolysierter DNA dann detektierbar, wenn Schritt 2 bis Schritt 4 des Zyklisierungsprogramms 34, 37, 39, 42 und 45 mal wiederholt wurde. Im Gegensatz dazu waren PCR-Produkte bei aus gesundem Dickdarmgewebe isolierter und mit SacII hydrolysierter DNA nur dann detektierbar, wenn das Zyklisierungsprogramm 42 und 45 mal wiederholt wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass wenigstens eine der CpG-Positionen, die innerhalb der SacII-Erkennungssequenz der analysierten CEA- und p16-Genfragmente lokalisiert ist, in den Krebsproben einen höheren Methylierungsstatus im Vergleich zu den gesunden Kontrollen zeigten.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1

Fig. 1 zeigt die Hybridisierung fluoreszierend markierter Amplifikate an Oligonukleotide, die an eine Oberfläche gebunden sind. Probe A stammt von gesundem Gewebe, Probe B von Dickdarm-Adenokarzinomgewebe. Fluoreszenz an einem Spot, durch einen Pfeil hervorgehoben, zeigt Hybridisierung des Amplifikats gegenüber dem Oligonukleotid an. Hybridisierung an ein CG-Oligonukleotid mit der Sequenz TAAGTGTTCGGAGTTAAT (Seq. ID Nr.: 238) bedeutet Methylierung an der analysierten Cytosin-Position, Hybridisierung an ein TG-Oligonukleotid mit der Sequenz TAAGTGTTTGGAGTTAAT (Seq. ID Nr.: 239) bedeutet keine Methylierung an der analysierten Cytosin-Position. Es ist sichtbar, dass Probe A in Bezug auf die CG-Positionen des Amplifikats von Gen 16 unmethyliert war, wohingegen im Vergleich dazu Probe B einen höheren Methylierungsgrad an der gleichen Stelle hatte.

Fig. 2

Unterscheidung zwischen Darmkrebstumor- (A) und gesundem Dickdarmgewebe (B). Große Methylierungswahrscheinlichkeit entspricht rot, Ungewissheit schwarz und geringe Wahrscheinlichkeit grün. Die Marker auf der linken Seite des Plots sind Gen- (z. B. für das Häufigste: 2069) und CpG- Identifikatoren (z. B. für das Häufigste: 1485A). Die Hybridisierung wurde mit Cy5-markierten Amplifikaten, erzeugt durch Singleplex-PCR-Reaktionen, unter Verwendung von Primer-Oligonukleotiden, wie sie in Tabelle 1 gezeigt werden, ausgeführt. Die Marker auf der rechten Seite geben die Signifikanz (p-Wert, T-Test) der Differenz zwischen dem Mittel der beiden Gruppen. Jede Reihe entspricht einem Einzel-CpG und jede Säule dem Grad der Methylierung einer Probe. Die CpGs sind nach ihrem Beitrag zur Unterscheidung der Differentialdiagnose der beiden krankhaften Veränderungen mit steigendem Beitrag von oben nach unten sortiert.

Sequenzprotokoll

Claims

1. Verfahren zur Detektion einer, mit den Genen Estrogen-Rezeptor, p21, p27, p16, Progesteron-Rezeptor, Myoglobin, pcna, cdc2, c-erbB2, p53 und CEA in Zusammenhang stehenden, proliferativen Störung von Dickdarmzellen in einem Lebewesen, welches das in Kontakt bringen der Target-Nukleinsäure einer biologischen Probe mit mindestens einem Reagenz oder einer Reihe von Reagenzien umfasst, worin das Reagenz oder die Reihe von Reagenzien zwischen methylierten und nichtmethylierten CpG-Dinukleotiden innerhalb der Target- Nukleinsäure unterscheiden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dass die folgenden Schritte umfasst:
Gewinnung einer biologischen Probe, die genomische DNA enthält
Extraktion der genomischen DNA
in der biologischen Probe werden in der 5'-Position unmethylierte Cytosin-Basen durch Behandlung zu Uracil oder einer anderen Base umgesetzt, die sich in Bezug auf das Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet;
Fragmente der vorbehandelten genomischen DNA werden unter Verwendung von Primer-Oligonukleotid-Sätzen gemäß Seq. ID 76 bis Seq. ID 97, und Polymerase amplifiziert, wobei die Amplifikate einen detektierbaren Marker tragen;
Detektion der Fragmente
Identifizierung des Methylierungsstatus einer oder mehrerer Cytosin-Positionen

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz eine Bisulfit-, Hydrogensulfit- oder Disulfit-Lösung ist.

4. Verfahren wie in Anspruch 2 dargestellt, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.

5. Verfahren wie in einem der Ansprüche 2 bis 5 dargestellt, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als zehn verschiedene Fragmente mit einer Länge von 100-2000 Basenpaaren amplifiziert werden.

6. Verfahren wie in einem der Ansprüche 2 bis 5 dargestellt, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mehrerer DNA-Segmente in einem Reaktionsbehälter durchgeführt wird.

7. Verfahren wie in einem der Ansprüche 2 bis 5 dargestellt, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerase eine wärmebeständige DNA-Polymerase ist.

8. Verfahren wie in einem der Ansprüche 2 bis 7 dargestellt, dadurch gekennzeichnet, dass die Marker der Amplifikate Fluoreszenz-Marker sind.

9. Verfahren wie in einem der Ansprüche 2 bis 7 dargestellt, dadurch gekennzeichnet, dass die Marker der Amplifikate Radionuklide sind.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass jedes Amplifikat durch Hybridisierung an ein Oligonukleotid oder ein Peptid- Nukleinsäure(PNA)-Oligomer detektiert wird.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid- oder Peptid- Nukleinsäure(PNA)-Oligomer aus der Gruppe ausgewählt wird, die Seq. ID 98 bis 523 umfasst.

12. Verfahren wie in einem der Ansprüche 2 bis 7 dargestellt, dadurch gekennzeichnet, dass die Marker der Amplifikate abtrennbare Molekülfragmente mit einer typischen Masse sind, die im Massenspektrometer detektierbar sind.

13. Verfahren wie in einem der Ansprüche 2 bis 7 dargestellt, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikate oder die Fragmente der Amplifikate im Massenspektrometer detektiert werden.

14. Verfahren wie in einem der Ansprüche 12 und/oder 13 dargestellt, dadurch gekennzeichnet, dass die erzeugten Fragmente, zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer, eine einfach positive oder negative Nettoladung haben.

15. Verfahren wie in einem der Ansprüche 12 bis 14 dargestellt, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion mittels Matrix-unterstützter Laserdesorptions/Ionisations- Massenspektrometrie oder unter Verwendung von Elektropray-Massenspektrometrie (ESI) ausgeführt und sichtbar gemacht wird.

16. Verfahren wie in einem der Ansprüche 12 und/oder 13 dargestellt, dadurch gekennzeichnet, dass die erzeugten Fragmente, zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer, eine einfach positive oder negative Nettoladung haben.

17. Verfahren wie in Anspruch 2 dargestellt, dadurch gekennzeichnet, dass der Amplifikationsschritt aufgrund des spezifischen Methylierungsstatus von Dickdarmgewebe, bevorzugter Weise besonders interessierende DNA in gesundem und/oder erkranktem Dickdarmgewebe und nicht Hintergrund-DNA amplifiziert.

18. Verfahren gemäß Anspruch 1, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Gewinnung einer biologischen Probe, die genomische DNA enthält

b) Extraktion der genomischen DNA

c) Verdau der Target-Nukleinsäuren mit einem oder mehreren methylierungssensitiven Restriktionsenzymen

d) Amplifikation des DNA-Verdaus

e) Detektion der Amplifikate

19. Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei die Target- Nukleinsäure eine oder mehrere Sequenzen aus der Gruppe der Seq. ID 12 bis Seq. ID 31 oder daran hybridisierende Sequenzen und deren Fragmente umfasst.

20. Verfahren wie in den Ansprüchen 18 und 19 dargestellt, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.

21. Verfahren wie in einem der Ansprüchen 18 bis 20 dargestellt, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mehrerer DNA-Segmente in einem Reaktionsbehälter durchgeführt wird.

22. Verfahren wie in einem der Ansprüche 18 bis 21 dargestellt, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerase eine wärmebeständige DNA-Polymerase ist.

23. Eine Nukleinsäure der vorbehandelten genomischen DNA, gemäß einer der Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe der Seq. ID Nr. 32 bis Seq. ID Nr. 75, und dazu komplementären Sequenzen.

24. Ein Oligomer, insbesondere ein Oligonukleotid- oder Peptid-Nukleinsäure(PNA)-Oligomer, das mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 10 Nukleotiden umfasst, die an eine chemisch vorbehandelte DNA, gemäß der Seq. ID Nr. 32 bis Seq. ID Nr. 75 gemäß Anspruch 23, hybridisiert oder mit ihr identisch ist.

25. Ein Oligomer oder Peptid-Nukleinsäure(PNA)-Oligomer, wie in Anspruch 24 dargestellt, worin die Basensequenz mindestens eine CpG-Dinukleotid-Sequenz enthält.

26. Ein Oligomer oder Peptid-Nukleinsäure (PNA)-Oligomer, wie in Anspruch 24 dargestellt, dadurch gekennzeichnet, dass das Cytosin von mindestens einem CpG- Dinukleotids ungefähr im mittleren Drittel des Oligomers lokalisiert ist/sind.

27. Ein Peptid-Nukleinsäure(PNA)-Oligomer, insbesondere ein Oligonukleotid gemäß einer der Sequenzen, ausgewählt aus der Gruppe, welche die Seq. ID Nr. 98 bis Seq. ID Nr. 523 umfasst.

28. Ein Satz von Oligomeren oder Peptid- Nukleinsäure(PNA)-Oligomeren, das mindestens zwei Oligomere gemäß einem der Ansprüche 23 bis 27 umfasst.

29. Satz von Oligomeren oder Peptid-Nukleinsäure (PNA)- Oligomeren, wie in Anspruch 28 dargestellt, der Oligomere zur Detektion des entsprechenden genomischen Methylierungsstatus aller CpG-Dinukleotide innerhalb einer der Sequenzen gemäß Seq. ID Nrn. 32 bis 75, gemäß Anspruch 23 und dazu komplementären Sequenzen, umfasst.

30. Satz von mindestens zwei Oligomeren oder Peptid- Nukleinsäure(PNA)-Oligomeren, wie in Anspruch 24 dargestellt, als Primer-Oligonukleotide zur Amplifikation von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID 32 bis Seq. ID 75 und/oder dazu komplementären Sequenzen und deren Segmenten.

31. Satz von Oligomeren oder Peptid-Nukleinsäure(PNA)- Oligomeren, wie in Anspruch 23 und 24 dargestellt, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Oligonukleotid an eine feste Phase gebunden ist.

32. Verwendung eines Satzes von Oligomeren oder Peptid- Nukleinsäure(PNA)-Oligomeren, wie in Anspruch 23 bis 26 dargestellt, als Sonde zur Bestimmung des Methylierungsstatus und/oder Einzelnukleotid- Polymorphismus (SPNs) einer entsprechenden genomischen DNA durch Analyse einer chemisch vorbehandelten DNA gemäß Anspruch 2.

33. Verwendung chemischer vorbehandelter genomischer DNA gemäß Anspruch 23, zur Bestimmung des Methylierungsstatus einer entsprechenden genomischen DNA und/oder Detektion von Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNPs).

34. Verfahren zur Herstellung einer Anordnung von verschiedenen Oligomeren oder Peptid-Nukleinsäure (PNA)- Oligomeren (Array), zur Analyse von Krankheiten, die mit dem entsprechenden Methylierungsstatus des CpG- Dinukleotids innerhalb einer der Seq. ID Nr. 32 bis Seq. ID Nr. 75 und dazu komplementären Sequenzen in Zusammenhang stehen, worin mindestens ein Oligomer gemäß einem der Ansprüche 23 bis 27 an eine feste Phase gekoppelt ist.

35. Eine Anordnung verschiedener Oligomere oder Peptid- Nukleinsäure(PNA)-Oligomeren (Array), die gemäß Anspruch 34 erhältlich ist.

36. Ein Array verschiedener Oligonukleotid- und/oder Peptid-Nukleinsäure(PNA)-Oligomer-Sequenzen, wie in Anspruch 35 dargestellt, dadurch gekennzeichnet, dass diese auf einer ebenen festen Phase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.

37. DNA/PNA-Array zur Analyse von profilerativen Veränderungen von Prostatazellen, die in Zusammenhang mit dem Methylierungsstatus von Genen stehen , mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der vorstehenden Ansprüche umfassend.

38. Array, wie in einem der Ansprüche 35 bis 37 dargestellt, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphasen- Oberfläche aus Silikon, Glass, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold zusammengesetzt ist.

39. Kit, das ein Bisulfit-Reagenz ( = Disulfit, Hydrogensulfit), wie auch Oligonukleotide und/oder PNA- Oligomere gemäß einem der Ansprüche 23 bis 30 umfasst.