TW448183B - New growth/differentiation factor of the TGF-β family - Google Patents
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Description
經濟部中央標準局負工消費合作社印製 448183 _ A 7 _ — B7__ 五、發明説明(1 ) 本發明是有關TG F — 家族新穎的生長/分化因子 ,及指導合成彼之DNA序列。 生長因子中之TGF —卢家族包括有BMP -, TGF-及抑制素一相關之蛋白質(Roberts and Sporn, Handbook of Experimental Pharmacology 95(1990), 4l9- 4 72 ),其特別和大範圍的醫學._,禅.摩、方.拷及/應用有關。 這些因子適用於有關傷口癒合及組織再生之方法中。再者 TGF —卢族中有許多成員可誘導組織生長,特別是骨骼 的生長,因此在軟骨及骨骼之發展誘導上扮演關鑑性角色 0
Wozney(Progress in Growth Factor Research 1( 1 9 8 9 ) , 2 6 7 - 2 8 0 )及 V a 1 e e t a 1 ( H a n d b ο o k o f E x p e r i ra e n t a 1 P h a r ra a c o 1 o g y 9 5 (1 9 9 0 ) , 2 1 1 - 2 4 8 )描述許 多生長因子,如與BMP群(骨骼形態建成蛋白質(bone morphogenetic proteins)及抑制素群。這些族群之成員 顯現重要的結構相似性。蛋白質之前軀體包括胺基末端之 訊號序列,前肽及約110個胺基酸之羧基末端序列,後 者可自前軀體解離並構成成熟的蛋白質。此外其成員可由 胺基酸序列同質性界定。成熟的蛋白質含有最具保留性之 序列,特別在此家族成員中保留的7個半胱胺酸殘基。類 —TG F —召蛋白質爲多功能且激素上活性之生長因子。 其也有相關的生物活性,如細胞向化吸引,細胞分化之促 進及組織誘導之能力如軟骨誘導及骨骼誘導之能力。U S 專利No. 5,0 1 3,6 4 9揭示DNA序列,其係指 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝. 訂 _經濟部中央標準局只工消费合作社印裝 448183 A7 ___^__一 B7___ 五、發明説明(2 )
導合成骨一誘導性蛋白質,命名爲BMP — 2,且U S専 利系列No179 101及170 197揭示BMP 蛋白質BMP— 1及BMP — 3。再者許多型式的細胞可 合成類TGF —々蛋白質,且特別是具有TGF _卢受體 的所有細胞。 整體而言,這些蛋白質在其結構±顯示差異,.此在其 H -a» ·.·'> · —· k · ι-~ , 確實的生物功能上造成顯著的變化。此外·,其可見於各種 不同型式之組織及在各種發展階段。結果,就其確實功能 可呈現差異,如,所需之細胞生理環境,其軎命,標的位 置,辅助因子之需求及其對抗降解之穩定性。.因此,雖然 呈現組織誘導性且特別是骨一誘導性潛力的許多蛋白質己 被描述,其在有機體中之天然功能,且更重要的是其醫學 相關性仍需更詳盡檢視。TG F —々族成員之存在仍未知 ,此點被視爲有高度可能性,此對成骨作用或其他組織型 式之分化/誘導作用十分重要。然而,這些新穎類_ TG F — ^蛋白質在分離時之主要困難爲其功能尙未能夠 確實描述,故不足以發展高度有識別力的生物分析法。在 另一方面,與其他族中成員預期的核苷酸序列同質性太低 ,以致無法以典型的核酸雜交技術來加以篩選。縱然如此 ,新的類一TGF-/?蛋白質之進一步分離及鑑定是迫切 的需要,可提供進一步誘導性及促進分化之蛋白質,符合 所有欲求的醫學先決條件。這些因子可醫療上用於傷口之 癒合,及治療骨骼及/或其他組織型式,如腎或肝,之變 性疾病。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本買) 裝---1---訂----Γ-線 448183 A7 一—-B7 五、發明説明(3 ) 在專利案PCT/EP 9 3/0 0 3 5 0中述及 TGF — /?蛋白質MP — 5 2之核苷酸及胺基酸序列,其 中示出相當於成熟肽之序列及相當於MP - 5 2前肽之大 部份序列。並未掲示前肽MP— 5 2完整的序列。 本發明所依據之目標是提出可指導合成TG F —冷蛋 白質家族新成員之DNA序列,甚.具._有._致,突,..及/ _或誘導 分化,如骨誘導潛力。因此,本發明目的特別是提出 TGF蛋白質MP — 5 2完整的DNA及胺基酸序列。 此目的可以DNA分子來達成,其係可指導合成 TGF —卢族蛋白質,且包括 (a〉指導合成成熟蛋白質之部份,及若欲求時示於 SEQ ID No. 1之核苷酸序列進一步的功能性部 份, (b )在遺傳密碼簡併性範圍內,相當於(a )序列之核 替酸序列, (c )相當於(a)及(b )序列之一核苷酸序列之內偶 質衍生物,或 (d)可與(a) ,( b ) (c)序列之一雜交之序列。 經濟部中央標準局男工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 限制條件爲,依據(d )之DNA分子含有至少是指導合 成TGF —々族成热蛋白質之部份。 本發明進一步的具體實例是有關申請專利範圍第2至 1〇項之主題。本發明其他的特色及優點可由較佳具體實 例及圖片之說明衍生出來。序列及圖片現在簡要說明。 SEQ ID No. 1示出可指導合成TGF -召 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 448 18 A7 B7 五、發明説明(4 ) 蛋白質MP — 5 2之DNA之完整的核苷酸序列。ATG 起始密碼子始自6 4 0核苷酸。成熟蛋白質之起點在 1 7 8 2核苷酸後開始。
SEQ ID No. 2示出TGF—万蛋白質MP —5 2完整的胺基酸序列,其係衍生自sEQ ID
No. 1中所示之核苷酸序列........................... 圖1爲MP-5 2及BMP蛋白質族許多成員胺.基酸 序列間之比較,始自7個固有的半胱胺酸殘基中第一個。 表示在所有比較蛋白質中胺基酸是相同的;+表示胺基酸 相當於與MP — 5 2比較之蛋白質中至少一個。 圖2示出用於本發明之寡核苷酸引子之核苷酸序列, 及這些序列與TG F —々族已知成員序列之比較。Μ表示 Α或C,S表示C或G,R表示Α或G,且Κ表示G或Τ ,2 a示出引子0D之序列,2 b示出引子〇 I D之序列 Ο 經濟部中央標华局負工消费合作社印製 本發明包括至少可指導合成成熟蛋白質之部份,及必 要時示於SEQ ID No.1中核苷酸序列進一步的 功能性部份,以及在遺傳密碼簡併性及此序列尉偶質衍生 物範圍內,相當於此序列之序列。此外本發明也包括可與 此序列雜交之序列,限制條件爲此DN A分子完全含有至 少可指導合成TG F — 核成熟蛋白質之部份。 在本發明中之 '"功能部份★一語表示可作用如訊號肽 ,前肽或成热蛋白質部份之蛋白質部份,即其符合MP — 5 2天然蛋白質部份至少一種生物功能。 -7 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標芈(CNS ) A4規格(210Χ:297公釐) 448183 A7 _______ ~ B7_ 五、發明説明(5 ) 指導合成蛋白質成熟部份之區域,跨過SEQ ID N 〇 . 1序列的核苷酸1 7 8 3- 2 1 4 2。若必要時, DNA分子也可包栝SEQ I D No. 1所示序列進 一步的功能性部份,即指導合成訊號及/或前肽部份之核 苷酸序列◊DNA分子包括訊號及前肽部份及成熟蛋白質 部份之序列時爲特性(即SEQ ._U,. . ..No ,…1所示序 列之核苷酸6 4 0 — 2 1 4 2。另一方面,;DNA分子也 可包括來自其他蛋白質之功能性訊號及/或前肽部份,並 加上指導合成成熟蛋白質之部份,特別是來自TGF — 族的其他蛋白質,如上述的BMP蛋白質。個別的核苷酸 序列示於上述之參考中,由是完成揭示之參考文獻。 再者本發明也包括如上定義之DN· A分子,其中含有 SEQ ID No.1中所示序列介於梭苷酸1270 及1 2 7 1之非編碼***子序列。此***子序列含於質體 S K L 52 (H3)MP1 2,其貯置在DSM,且具 有MP — 5 2之基因體核酸序列。. 本發明也包括爲噬菌體;I 1 5 . 1所編碼的MP — 經濟部中央標準局員工消资合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本萸) 5 2蛋白質之cDNA序列。此序列始自SEQ ID No. 1之核苷酸321。 雖然本發明所包括的對偶質,簡併及雜交序列,由於 其核苷酸及/或胺基酸序列中些微變化而有結構上的差異 ,爲此序列編碼之蛋白質,基本上仍有相同的有用特性, 如此其基本上可有相同的醫療用途。 依據本發明之^雜交#術語表示一般的雜交條件,較 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 448183 A7 B7 五、發明説明(6 ) 佳的條件爲6XSSC之塩濃度,在6 2 — 6 6°<:下,繼 以 0· 6XSSC,〇. 1%SDS’ 在 62 — 66°C 洗 一小時。特佳的、雜交’條件表示迫切的雜交條件,撞濃 度爲4XSSC,在6 2 — 6 6°C下,繼以0· IX SSC,0_ 1%SDS 在 6 2 — 6 6 °C 下洗一小時。 本發明較佳的具體實例爲如上._.宽.舅列,其 可得自脊椎動物,較好是晡乳動物如豬,牛及 齒類如大 鼠或老鼠,且特別是得自靈長類,如人類。 本發明特性之具體實例爲SEQ ID No. 1所 示之命名爲MP— 5 2之序列。MP — 5 2之轉錄子可得 自胚胎組織,且可指導合成一蛋白質,其與類一 BMP蛋 白質之成熟部份有相當的胺基酸同質性(見圖1 ) ° BMP2 (二 BMP2A)及 BMP4 (=BMP2B) 之蛋白質序列,由Wozney et: al·,述於Science 2 4 2 ( 1 988) > 1 528-1 5 3 4 〇BMP5 »BMP6 及BMP 7相當的序列,由Celeste et al·,述於?1"0。 Natl. Acad. Sci. USA8 7 ( 1 9 9 0 ) » 9 8 4 3 經濟部中央標準局男工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 9 8 4 7。與已知BMP序列特異的許多典型的序列同質 性,也具於MP — 5 2之前肽部份,反之MP 一 5 2前軀 體部份之其他部份呈現與BMP前軀體相當多的差異° 此外,本發明是有關一種載體,其含有至少—套數的 根據本發明之DNA分子,依據本發明之DN A序列’在 此載體中較好操作性鏈結至表現控制序列上。此& 在穩定或瞬時的轉彤細胞中產生類TG F — Θ蛋白質°各 本紙張尺度逍用中國國家標準(CNS ) A4規格(210 X 297公釐) '448183 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 -B7 五、發明説明(7 ) 種動物、植物、眞菌及細菌系統可用於轉形及接縯的培養 。依據本發明之載體較好含有於宿主細胞中複製所必需之 序列,且是可自動複製的。再者,所使用的載體較好含有 可篩選之標幟基因,其可用來偵測宿主細胞之轉形作用。 此外,本發明是有關一種宿主細胞,其可爲依據本發 明之D N A或依據本發明之載體所Jf.里.。:適合_的.+宿丰細胞 實例包括各種眞核及原核細胞,如大腸桿菌,昆蟲細胞, 植物細胞,哺乳動物細胞及眞菌,如酵母。 此外,本發明是有關TGF-万族之蛋白質,其由依 據申請專利範圍第1項之D NA序列所編碼。依據本發明 之蛋白質較好具有SEQ ID No. 2所示之胺基酸 序列,或若欲求時其功能性部份,且呈現生物特性如組織 誘導性,特別是骨誘導性及/或致突變能力,其可能與治 療應用有關。蛋白質上述之特性,可依同二體或異二體之 形成而變化。此種結構也可証明適合臨床應用。 依據本發明蛋白質之生物特性,特別是致突變及骨一 誘導性潛力可予以決定,·如依據Seyedin et al.,PNAS 82 (1985),2267.2271或Sampath and Reddi ,PNAS 78(1981) ,7599-7603之分析法。 再者,本發明是有關產製TGF 一万族蛋白質之方法 ,其特徴在於培養以本發明D N A或本發明載體所轉形之 宿主細胞,並自細胞及/或培養物上清液中分離出TGF —卢蛋白質。此方法包括於適合的培養基中培養經轉形之 宿主細胞,並純化所產生之類TGF—卢蛋白質。以此方 (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公酱) -1 Q - 經濟部中央標準局員工消f合作社印¾. 48 1 83 A7 —B7 五、發明説明(8 ) 法可產生適量的欲求蛋白質,應用於轚療或於需要生長因 子之細胞培養技術中。宿主細胞可以是一種細菌,如芽孢 桿菌或大腸桿菌,眞菌如酵母、植物細胞如煙草、馬鈴薯 或芥菜或動物細胞,且特別是脊椎動物細胞株如 Μό COS或CHO細胞株或昆蟲細胞株。 本發明另一主題是提出藥學軋座濟..,.¾也含.有.藥學上 活性劑量的類TGF — 蛋白質(依據本發明)充作活性 物質。若欲求時,此種組成物包括藥學上可接受之載劑物 質,輔助物質,稀釋劑或充塡劑。此種藥學組成物可用於 傷口癒合及組織再生,以及用於癒合骨骼、軟骨、結締組 織、皮庙、粘膜、上皮或牙齒傷痛處,及應用於齒科移植 物,可單獨的或配合其他活性物質,如TGF_ /3族的其 他蛋白質,或生.長因子如EGF (上皮出長因子)或 PDGF(血小板衍生之生長因子)。再者,此藥學組成 物可用於預防疾病,如預防骨質疏鬆症及關節炎。 本發明TGF —点蛋白質另一可能的臨床應用,是將其 作用爲免疫反應之遏止者,以避免器官移植之排斥,或配 合血管形成而應用。依據本發明之藥學組成物也可預防性 應用或應用於美容手術。此外,組成物之移藥並不限於人 類,也可包括動物且特別是龐物。 最後,本發明也包括可與本發明蛋白質專一性結合之 抗體,或此種抗體片段(如Fab或Fab-)。產生專 一性抗體或抗體片段之方法爲一般精藝者一般技術知織之 部份。此抗體較好是一種單株抗體。此種抗體或抗體片段 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. -* 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2IOX297公釐) 11 Μ8 1 83 Α7 Β7 五、發明説明(9 ) 也適用於診斷方法。 進一步以實例來闡明本發明。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實例 MP— 5 2之分離 1 · 1 依據 Chirgwin et al.,Biop丸 eraistiry .18(1 9 79), 5294-5299。之方法自人類胚盤組織(8至9週大 )中分離出總RNA°Po 1 y (A*) RNA以 〇 1 i go (dT)層析法自總RNA中分離出來 ,依廠商指示進行(S t: r a t a g e n e Ρ ο I y ( A ) Q u i c k columns) ° 1. 2於逆轉錄反應中,將1至2. 5微克poly ( A十)RNA加熱至6 5 °C歷5分鐘,再快速冷卻 在冰上。反應混合物含有2 7單位1?^八—
Gu a r d (Pharmacia) ,2 . 5 微克 〇l igo (dT) 12—18 ( Pharmacia) » 5 x緩衝溶液(2 5 G毫莫耳/升Tf i s/ HC1 ,pH8. 5,50 毫莫耳/ 升 MgCl2 經濟部中央棣準局贯工消费合作社印製 ,5 0毫莫耳/升DTT,5毫莫耳/升各 dNTP,6 0 0毫莫耳/升KC 1 )及2 0單位 A Μ V 逆轉錄酶(B 〇 e h r i n g e r M a η n h e i !ii )每微克 P〇 1 y (A + ) RNA計。反應混合物在4 2°C 下培育2小時。 1. 3示於圖2之去氧核苷酸引子OD及OID在自動化 本紙浪尺度適用中國國家標iMCNS ) A4说格(2!0X297公釐) 12 1 Ο - 448183 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 一 B7五、發明説明(10 ) D N A合成儀上備妥(Biasearch)。以變性聚丙 烯醯胺凝膠電泳進行純化,再利用等速電泳方法自 凝膠中分離出主帶。比較T G F —点族已知成員之 核酸序列以設計寡核苷酸,並選出最具保留性之區 域。此區域之比較示於圖2。爲促進選殖,二核苷 酸均含有EcoRI限制兔置丄.且.〇 d謂.外..地在其 5 >末端含有一個Nco I陔制位置。 1. 4相當於2 0毫微克po 1 y (A*) RNA之 c DNA充作PCR反應中之起始物質。反應進行 的體積爲5 0微升,且含有1 X PCR緩衝溶液( 16. 6毫莫耳/升(NH4) 2S〇4,6 7毫莫 耳 /升 Tr i s/HCl ρ Η 8 . 8,2 毫莫耳 /升 MgCl2,6. 7 微莫耳/升 EDTA, 1 0毫莫耳/升毓基乙醇,1 7 0微克/毫升 牛血清白蛋白(Gibco) ,200微莫耳/升 各dNTP (Pharmacia),3 0微微莫耳各寡核苷 酸(0D及0ID)及1.‘ 5單位Taq聚合酶( Amp liTaq,Perkin Elmer Cetus)。反應混合物覆 以石蠟膜,再進行4 0個PCR循環。PCR反應 產物以酚/氯仿萃取純化,再以乙醇沈澱濃縮。 1 . 5 PC R反應產物以限制酶S p h I (Pharmacia) 及A lwN I (Biolabs)依廠商指示解離。 1 - 6限制酶解離產物以瓊脂糖凝膠電泳分級分離。經以 溴化乙錠染色後,未解離之擴大產物自凝膠中切出 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝
,1T δ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210X 297公釐) 448183 A7 __— B7_ __ 五、發明説明(η) ,並以酚萃取分離。所得之DNA再以酚/氯仿萃取 純化二次。 1. 7經乙醇沈澱後,1/4或1/5的經分離DNA, 利用和第一次擴大反應相同的條件再擴大,但循環 數減少至1 3。純化再擴大產物,以如上相同酵素 解離,且未解離之產物自孝.屑__後凝展中允離码評估 擴大產物。再擴大步驟重覆二次。 1. 8經自凝膠中最後分離之後,擴大產物以4單位 E c 〇 R I (Pharmacia)在廠商建議之條件下解離 0 1/4的限制混合物與經Ec oRI解離之載體 pBluescriptll SK+ ( Stratagene)連接。2 4 個純 系於連接之後進一步利用定序分析。樣品以 AlwNI及SphI解離,生成命名爲NP— 5 2之新序列。其他純系主要含有BMP 6序列, 且一者含有BMP 7序列。 經濟部中央摞準局只工消f合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)
依據 P e r k i η - E 1 m e r C 〇 r p . , 1 s s u e 5 (19 9 0 ) , P P 11- 1 5 所 發表之Amplification,由Frohmann詳述之方法知純系完 -全至cDNA之3^^端。已被用未分離MP — 5 2第一片 段之相同的胚盤mRNA,如前述般逆轉錄。利用MP — 5 2序列之承接子引子(AGAATTCGCATGCC ATGGTCGACG)及內部引子(CTTGAGTA CGAGGCTTTCCACTG)進行擴大作用。擴大 產物利用MP — 5 2序列重畳的承接子引子( ATTCG 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) -14 - 448183 A7 -B7 _______ 五、發明説明(12) CATGCCATGGTCGACGAAG)及重疊的內 部引子(GGAGCCCACGAATCATGCAGT CA)再擴大。經以Nc ο I限制解離後,再擴大產物選 殖及定序至已以相同方式解離之'載體內(pUC 1 9 (
Pharmacia No .27 - 495 1 - 0 1 )具有經修飾之多重選殖位置, 其中含有一個單一的N C ο I限_並卑序。.純系以 其重叠於已知MP — 5 2序列3 /端之序列鑑定之。這些 純系之一可充作探針,以依據Ausubel et a丨詳述之方法 筛選人類基因庫(Stiratagene No.946203) ( Current Protocols in Molecular Bio!ogy,publ ished by Greene Publishing Associates and Wiley- t
Interscience (1989))。一噬菌體(λ 2 . 7 . 4 )分離 自約8X1 05λ噬菌體,其中含有約2 0 kb之嵌入, 且在DSM下貯置,編號No. 7387。此純系除了以 所述之擴大方法分離自mRNA之序列外,進一步在5 / 端含有序列資料。 於序列分析方面,約7. 5kb之Hi nd I I I片 經濟部中央標準局Η工消f合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 段繼代選殖至以相同方式解離之載體中(BUescript SK, Stratagene No.2 1 2 2 0 6 )。命名爲 SKL 5 2 ( H3 ) MP 1 2的此質體也貯置在DSM,編號7 3 5 3 。示於SEQ ID No.1的序列資料,衍生自噬菌 體λ 2. 7. 4。在6 4 0位置之ATG是在讀譯架構內 的第一個ATG (停止密碼發生於位置4 (3 3 )。依據序 列資料可假設,此係轉譯作用之起始密碼子。 本紙蒗尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 經濟部中央標準局只工消費合作社印製 448183 A7 一 B7 _ 五、發明説明(η) 基因體DNA,在SEQ ID No. 1之 1 2 7 0及1 2 7 1鹸基對之間含有一個約2 k b之*** 子。***子之序列未示出。將擴大產物定序可証寅剪接位 置之正確性,其係衍生自含有此區之cDNA。這些序列 資料可利用略修飾方法獲得,其詳述於Frchinaiin ( Amplifications, pubii.shed by Perkin-Elmer C o r p o r a t i o n , I s s u e 5 ( 1 9 9 0 ) , p p 11 -1 5 )。用來分離 Μ P - 5 2 3 —端之相同的胚盤RNA,利用和ΜΡ — 5 2序列5 >方向確定方向之內部引子逆轉錄(ACAG CAGGTGGGTGGTGTGGACT) ° ρο 1 y A尾利用末端轉移酶粘附至第一cDNA股之5/端。進 行二步驟擴大作用,首先使用由〇 1 i g 〇 dT及承接子 序列組成之引子(AGAATTCGCATGCCATG GTCGACGAAGC(T16),其次是來自ΜP-5 2序列之承接子引子(AGAATTCGCATGCC ATGGTCGACG)及內部引子(CCAGCAGC CCATCCTTCTCC)0 擴大產物利用MP — 5 2序列相同的承接子引子及重@的 內部引子(TCCAGGGCACTAATGTCAAA CACG)再擴大。接下來再擴大產物利用MP— 5 2序 列重疊的承接子引子(ATTCGCATGCCATGG TCGACGAAG)及重壘的內部引子(ACTAATG TCAAACACGTACCTCTG)再擴大。最終的 再擴大產物,以平鈍端選殖至載體(Bluescript SK, 本紙張尺度適用中國國家標率(CNS ) A4規格(21〇Χ297公釐) -16 - I.------^丄 I 裝------訂----—〉鍊 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 448183 A7 B7 五、發明説明(14) .
Stratagene No.2 1 2 2 0 6 ),其已經 E c 〇 RV 解離 。純系以其與Λ 2. 7. 4 DNA重疊之序列鑑定之。 此外篩選c DNA庫,其產自人類纖維母細胞之 RNA,並選殖至Agt 1 0。在此方法中,利用約1 kb的基因體MP— 5 2 DNA片段(第2個表現子至 在3 一未轉譯區中之Hindi jL丄麗氣位置),.爲.放射活 性探針,試驗2X1 06噬菌體。挑出1 7個混合的噬菌 斑,以 PCR檢査利甩MP—52序列5/及3>區之
引子進行。接下來,選出8個噬菌體斑並分離。cDNA 以E c 〇 R I部份解離分離自噬菌體,並選殖至已經 E c 〇 R I解離之Bluescript載體內。 定序生成的質體之一,SK5 2L15. 1MP2 5
顯示最長的噬菌體(15. 1)始自SEQ I D
No. 1之第3 2 1號核苷酸,此外,以定序來証實剪接 位置(第1270號核苷酸)。 質體 SKL5 2 (H3) MP1 2 於 1 9 9 2 年 1 2 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 月 1 0 日貯於 DSM ( 'Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Ze1 lku1turen,Mascheroder W e g ^,3 8 1 2 4 Braunschweig) No. 7 3 5 3 ° 嚒菌體λ2. 7. 4於1993年1月13日貯於 DSM.No. 7387° 質體 SK52L15. 1ΜΡ25 於 1993 年 7 月 16曰貯於DSM,No. 8421。 17 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸依尺度適用_國國家標準(CNS ) A4規格(2!0X297公釐) A7 B7 五、發明説明(15) 實例2 Μ P 5 2之表現
I 檢査各系統以表現ΜΡ 5 2,以牛痘苗病毒爲表現系 ,其可爲精藝者再生,且詳述於C u r r e n t P r q t 〇 c ο 1 s in Molecular BioIogy(Ausubel e t a 1 . , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience,
Wiley & Sons),在以下縮寫爲CP,於第1 6章, 1 6 . 15-16. 1 8中。此系統之基礎事實爲,利用 某些載體,外來DNA可利用同質重組作用整合至牛痘苗 病毒之基因體內。基於此目的,所使用之_體含有來自牛 痘曲基因體之TK(胸苷激酶)基因。爲了使可選擇重組 病毒,載體中另外含有大腸桿菌眞嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖 基轉移酶基因(g p t ) (Falkner et Virol. 62 (1988),1849-1854)。具有 MP 5 2 完全區域之 c D N A 選殖至此載體。然而來自質體SK5 2 LI 5. 1 MP25 之 cDNA(DSM,貯置 No. 8421)先 刪除再繼代選殖以移去5 >未轉譯區大部份。針對此,質 體 SK52L15. 1MP25 以 Sail 線化,且 5 一 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁〕 端以 E c ο I I 1/ 四季豆套組(Stratagene #200330) 依廠商指示逐步刪除。經以B amH.I限制酶作用後, MP 5 2 cDNA删除至不同程度,再自殘留的載體中 分離,並以瓊脂糖凝膠分離,再依標準方法(Sambrook e t a 1 . , Molecular Cloning, second edition, Cold SpringHarbor Laboratory Press 1989)繼代選殖( 本紙張尺度逋用中國囤家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) -18 - 4 48 183 A7 -B7 五、發明説明(16) pSK5 2 s )至已經Ec oRV及BamHl限制之 pBluescriptll SK 載體(Stratagene #212206)中。戶斤有 的限制作用均依廠商指示來進行。以定序酶(U S B / Amershara #70770 )定序尤其可生成始自S E Q i D No. 1 5 7 6核苷酸之純系(距起始密碼子有64驗 基對遠)。以Sal I及Sac .,1,.11作.用自.此中分離出 cDNA嵌入子,再選殖至另外解離之載體,以於牛痕曲 病毒系統中重組。生成之質體(PBP IMP 5 2 s於 1994年5月24日貯於DSM(No. 9217), 且可用來產生重組體牛痘苗病毒。於此,在3 5毫米培養 皿中以野生型牛痘苗病毒感染多達8 0 %匯集之i 4 3B 細胞(HuTk,ATCCCRL 8303),反應 係於2毫升PBS中,以室溫進行3 0分鐘並偶而溴盪( 每10個細胞有1個病毒),上清液經吸取後,加入2毫 升培養基(MEM,Gibco ML #04 卜 01095),其在 3 7 經濟部中央榡準局员工消"合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)· °C下培育2小時。培養基再移去,並以1 0 〇毫微克 pBPlMPu 5 2 s,2微克載劑DNA (牛胸腺, Boehringer Mannheim #104175)及 1 0 微升 Lipofectin( Gibco BRL # 1 8 29 2 - 0 1 1 )於1毫升MEM進行這些細胞之 轉形作用,於3 7 °C下歷1 5小時。經以含有2 0% FCS (Gibco BRL #01卜06290)於 1 毫升 MEM 加入後 ,再於3 7 °C下培育2 4小時,之後將溶解細胞冷凍。 黃嘌呤一鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶之g p t篩選,及 個別重組病毒之分離及擴大(基本上如CP 1 6 . 1 7中 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) _ "jg - 1 4481b〇 A7 B7 五、發明説明(17) 所述進行,但使用RK1 3細胞(ATCC CCL3 7 )° 以點吸潰及南方吸漬分析(CP1 6. 18)証實 --—, MP 5 2 cDNA整合至病毒基因體,重組病毒應用於 在細胞株143B(HuTk- ,ATCC CRL 8 3 0 3,人類)中之表現分析。的.細胞以根#於細 胞數之許多病毒在3 7 °C下感染4 5分,再加至含有1 〇 %FCS及青徽素/鏈霉素(1 : 50 0,Gibco BRL#0 4 3 — 0 5 1 4 0H)個別的培養基中(ME M,Gibco BRL #041 — 01095)。經 過3 7°C下6小時後,移出培養基,細胞以HBSS (G ibco BRL#042-04180M)洗二次,再 加入無FCS之產製培養基(如MEM)。經2 0_2 2 小時之產製,收集細胞上清液。利用西方墨點法,依標準 方法(CP10. 8>分析表現。於此,將來自10 0_ 5 0 0微升細胞培養上清液之蛋白質加等量丙酮沈澱之, 再於冰上至少培育1小時並離心。再懸浮團塊至應用緩衝 溶(7M尿素,1%SDS,7mM磷酸二氫鈉, 經濟部中央標準局货工消贽合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 〇 · 01%溴酚藍,及必要時之1%/?_毓基乙醇)之後 ,在1 5 %聚丙烯醯胺凝膠上進行分離。以預染色之蛋白 質分子量標準品(Gibco BRL #2604卜020)爲標幟蛋白質 。依標準方法轉移至PVDF膜(ImniQbilon # ί PVH000 1 0 )及阻斷此膜。 爲了偵測膜上的ΜΡ 5 2,在雜及兔子體內產生拮抗 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210X297公釐) -20 . 4 4 8 1 8 3 A7 -B7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 五、發明説明(18) MP 5 2之多株抗體。於此,在N_末端有6個組胺酸之 MP 5 2成熟部份表現於大腸桿菌中,再如Hechuli et al 所述(BIO/Techno 丨 ogy,Vol.6,1 321 - 1325 ( 1988)純化 。此二抗體均可用來專一地偵測MP 5 2之表現,其中雙 體MP5 2之確認不如單體有效率。雞抗體用於圖3之西 方墨點分析中,其已經PEG沈澱法(Thalley et al., SlO/Technology vol. 8 934-938(1990)及利用與膜結合 之抗原(成熟的MP5 2,含有6個組胺酸)( 1 8 .1 7 於Sambrook et a 1 . , Molecular cloning second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)專一地純化。以偶合有驗性雜酸酶(Sigma A9171)之抗一雞I g G爲第二抗體。利用Tropixffestern -Light蛋白質偵測套組(Serva #WL10RC)進行偵測,依廠 商指示進行。 圖3之西方墨點顯示MP 5 2 -專一帶只在重組病毒 時發生,野生型則否(無整合的外來DNA)〇MP52 之表現可在未還原條件之凝膠上生成視分子量約2 5 k D a之經分泌蛋白質。在還原條件下,蛋白質在凝膠上 爲14一15kDa。這些結果顯示MP52呈雙對成熟 蛋白質型式表現。在6 0 kD a以上區域出現之弱帶(出 現於西方墨點)可能是未解離前軀體蛋白質之殘基。移動 特性也証實,可由SEQ ID No. 2中衍生出理論 的分子量,於此成熟的單體mp 5 2具有1 3 . 6 k D a 之大小。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝·
1-IT 線 本紙張尺度適用中國國家標率(CNS ) A4規格(210X297公釐) - 21 _ 彳8§件处4 :第83:l〇8337號專利中請案中文説明書修正頁 丨 你ιΤ 民國85年04月修正丨 五、發明説明(l9 ) 阳.4. 02補充 已証明可於各種細胞株中表現及解離前軀體蛋白質成 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲成熟的MP5 2 °測試Cl 2 7 (ATCC CRL 1616 老鼠),BHK21 (ATCC CCL10, 倉鼠),MRC — 5(ATCC CCL 171,人類) 及3T6 —端士白變種(ATCC CCL9 6,老鼠) 細胞。 經濟部中央標隼局員工消費合作社印袋 於進一步的眞核表現系中也可証明表現及解離形成成 热的MP5 2。於此,MP5 2中之cDNA (始自 5 7 6核苷酸選殖至表現質體PSG5 (Stratagene # 216201)。質體 PSK5 2 s ,以 C 1 a I 及 Xb a I 限. 制,且MP 5 2嵌入子突出端以T4聚合酶處理使成鈍端 。選殖至已經Ec oR I限制及T4聚合酶處理使平鈍化 之載體P S G 5中,此依標準方法進行。所有酵素反應均 依廠商指示進行。以限制酶分析及T 7引子定序( Stratagene #300302)確定MP 5 2嵌入子之正確方向。 生成之質體PSG5 2 ,在1 9 9 4年5月1 7日貯置在 DSM,No. 9204。利用pSG5構築另一表現質 體。生成之質體PSG5 2 g含有衍自SK5 2 L 15. IMP 2 5完全的MP 5 2讀譯架構,其中含有相 反方向之cDNA及某些衍自質體SKL 5 2 (H3 ) MP12額外的5 “未轉譯序列,始自SEQ ID No. 1之1 〇 6 位置。質體pSG52g則於1994年8月30日寄存於食品工業 發展硏究所,編號No.940024。此2表現質體均可以指導 本紙張尺度適用中國國家榇準(CNS ) A4規格(210X297公釐)_ 448183 經濟部中央標準局Η工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明(2〇) 獲得穩定的細胞株。基於此目的,P SG 5 2 S與質體 p3616(貯置於 17. 05. 94,DSM9203 )共轉形於L9 2 9細胞(ATCC CCL 1 ,老鼠), 依廠商指示以 Lipofectin 進行(Gibco BRL #1 8292 - 0 1 1 ) 。依精藝者熟悉的方法進行G418之篩選,且生成可在 西方墨點上產生可偵測之成熟M 之細胞择。 利用質體 pABWN (Niwa et al·,Gene 108(1991) ,193-200及圖4 )可產生MP 5 2進一步的表現載體,此 質體由Dr.Miyazaki提供。於此,始自SEQ ID No.1 576核苷酸之質體PSK52s之Hind I I I片段分離出來,且突出端再以克林諾(Klenow)片 段處理使成平鈍端。經由承接子之連接,在片段二端引入 Not I限制解離位置。
承接子:AGCGGCCGCT TCGCCGGCGA 載體pABWN以Xh ο I限制,也以KlenQw片段處理及 以來自牛小腸鹼性磷酸酶去磷醯化。連接上相同的磷醯化 承接子,如此將以No t I限制之MP 5 2片段嵌入載 體中經產生之No t I解離位®將是可能的。所生成之 表現載體命名爲Hi nd I I ϊ— MP5 2/pABWN 。所有選殖中之反應均依檫準方法進行(如CP單位 3 - 1 6 )。以定序及限制輿圖証實Hi nd ί I I- MP52/pABWN表現載體之結構。Hi,nd I I I ~MP5 2/pABWN含有始自5 7 6核苷酸之 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) -23 - (請先閒讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝-----;I 訂-- ^-----——^—— 經濟部中央標隼局負工消费合作社印製 448183 A7 一 B7 五、發明説明(21 )
MP5 2序列,且終於2 2 7 8核苷酸序列(於SEQ ID No. 1 ) 〇
Hi nd I I I— ΜΡ5 2/pABWN 轉感於,ρ 細 聛_ (老鼠纖維母細胞),且可由此發展出穩定的轉形細 胞0 於此,各4微克的質體(H i ..MJP 5 2 /pABWN或pABWN)利用2 0微升 iipofectAMINE 試劑(Gibco BRL # 1 83 2 4 -012)轉感於 5 X 105 L細胞中,於6公分之培養皿內。此時Α溶液(
4微克個別的DNA於2 0 0微升〇PTI — MEM I (Gibco BEL #3 1 9 8 5 )小心地與B溶液(2 0微升 lipofecUMINE試劑於 2 0 0 微升 OPT I — MEM I 混合,並在室溫下培育4 5分以形成DNA脂質體複合物 。在此過程中,細胞以2毫升OPT I — MEM I洗一 次,於各轉感作用中,加1 . 6毫升OPT I _MEMI 至有D N A脂質體複合物之容器內。溶液小心混合,洗過 之細胞再以其耰上。細胞與稀複合物在3 7。(:,(:〇2培 育箱中培育5小時。培育後加入2毫升DMEM (Gibco BRL Dulbecco、經修飾之伊耳格氏培養基)/ 2 0 % FCS。於轉感2 4小時後,以新鮮的DMEM/1 0% FCS更換培養基。於轉感開始後4 8小時,細胞轉移至 1 〇公分之培養皿中。轉感7 2小時後,G4 1 8篩選以 8 0 0微克/毫升開始進行。在1至2週後出現穗定的純 系0 (請先閣讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) -〇4 - 經濟部中失標孪局負工消費合作社印製 448183 A7 -B7 五、發明説明(22) 自1 0公分培養皿中已生長3天之匯集狀的轉形細胞 中取得有或無F C S之調適DMEM共5毫升。以西方墨 點法檢査經轉感細胞及溶胞產物中二種不同的細胞培養上 清液(Hi ndl I I - MP5 2/ pABWN 及 PABWN)。於此方法中成熟的MP52見於經 Hi ndl I I-MP52/p A—HN.释感之調竭培養 基及溶胞產物中。純系進一步選殖,且可產生MP 5 2之 細胞於西方墨點分析後個別篩選出來。自西方墨點分析中 估計知MP 5 2產製高達每升有1毫克。 實例3 Μ P 5 2之生物活性 進行試管內及活體內許多實驗,以偵測ΜΡ 5 2之生 物活性,以及証明本發明在骨+胳疾病預防及/或治療之醫 學應用上之有用性。 1 .試管內分析 1.1 由於經TGF — Θ刺激後,在軟骨細胞中可見聚葡萄 糖胺(GAG)合成有所增加(Hiraki el: al·, Biochimica et Biophysica Acta 969(1988), 9 1 — 9 9 ),因此檢査MP 5 2是否也有此影響。在胎鼠四肢 初級培養中進行MP 5 ?之軟骨產生活性,利用可產生 MP52之L細胞轉形細胞(以Hindi I I — 本紙張尺度適用中國国家標準(CNS ) A4規格(210 X 2S»7公釐) --------1',·裝------訂----—」線 (請先閏讀背面之注意事項再填寫本頁) '448183 A7 -B7 五、發明说明(23) MP 5 2/P ABWN所轉感)之培養物上清液(含有 1〇%FCS之DMEM)進行。 此中使用16天大胎盤之四肢。經胰蛋白酶作用後, 於含有1 0%FCS之F — 1 2培養基(Nutrient mixture Ham(s F-12,Gibco BRL #21700)所得之細胞塗佈 在3X1 〇5細胞上,於2 4孔洞盤中,亘其上塗覆有膠 · · ,. · · .r_ I- 經濟部中失標準局負工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 原蛋白I型,並培養約2天直到呈匯集狀爲止。在各例中 ,加入 5 6 微升 Hi nd I I I— MP5 2/pABWN —L細胞轉感子,pABWN — L細胞轉感子之調適培養 基(CM)或僅加培養基(含有1 0%FCS之DMEM )至5 0 0微升培養基中(含有1 0%FCS之F—1 2 培養基。使用含有1 〇%FCS及個別添加物之F — 1 2 培養基,歷0、3、6及9天。含有個別添加物之培養物 每3天更換。之後培養物在無FCS之F—12培基中再 培養2天,有個別添加物之存在(調適培養基或對照培養 基)再加入35S硫酸埠歷6小時。在鏈黴蛋白酶E水解, 以及如 Hiraki et ai(Biochiraica et Biophysica Acta 969 (1988) ,91-99)所述之沈澱作用之後,偵測納入多醣 中之35 S。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格UlOXW7公釐〉 A7 B7 五、發明説明(24) 射活性(c pm/孔洞) pABWN-L轉 HindIII-MP52/ 形細胞之 pABWN-L細胞轉
CM 形子之CM 3865土 120 4879土 422 4154土29_.___822 3 土.275'. 3310 士 115 9890 士 126(Γ 3633 士 167 7520 ± 160· 3或4種培養物混合 ΕΜ及p ABWN — L細胞轉形 s多重t _試驗) MP 5 2.之轉形細胞的培養物上 10%FCS之DMEM)或與 胞培養物上清液比較,均可顯著 示MP 5 2可刺激軟骨細胞之分 經濟部中央標华局買工消費合作社印製 表 1 放 培 育 天 數 對照L 細胞 之 DMEM(10¾ FCS) 2 3720 士 114 5 4188 土 135 8 3546 士 160 11 3679 士 218 土 S E • Μ .之 數値爲 * • P < 0 .0 1 對D Μ 子 之 C M ( Sc h e f f e * 如 表 1 所示, 可產生 清 液 ί 與 純 的培養 基(含 經 P A B W N轉感 之L細 地 刺 激 G A G合成 。此顯 化 〇 在 B Μ P族某 些成員 胚 細 胞 中 刺 激鹼性 磷酸酶 胞 株 R 0 Β -C 2 6 ( C 相 當 早 期 階 段。(Y a ra a g u c ]η t. 49(1991),221 -225)。 Yaraagu c h 1 e t a 1 ( J . Ce 1 1 述 爲 骨 誘 導 性蛋白 質所有 (請先閱讀背而之注意事項再填寫本莧) 中已被描述的一種作用是可在骨 (ALP活性)。純系的大鼠細 —2 6 )是骨胚細胞中在成熟的 hi et al.,CaIcif, Tissue 刺激A L P活性之能力,由 Biol · 1 13 ( 199 1 ),681 -687)描 ,如 BMP — 2 (J.Cell 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4规格(210X:297公釐) A7 B7 五、發明説明(25) 1 1 3 ( 1 99 1 ) ,6 8 1 - 687 )。 NP 5 2對C 2 6細胞之影響檢査如下:C 2 6細胞 以每孔洞3 X 1 04細胞塗佈在2 4孔洞盤上,並在“一 MEM (Gibco BRL) /1 0%FCS中培養至呈匯合狀 。5 6微升可產生MP 5 2之L細胞轉形子(
Hi nd I I I— MP5 2/pABWN)·之細胞培養上 清液,或P ABWN — L細胞轉感子之細胞培養上清液, 或僅L細胞之細胞培養上清液(含1 0%FCS之 D Μ E Μ ),加至5 0 0微升C — 2 6細胞培養基。培養 基中個別添加物每3天更換一次。於0,3,6,9及 12天後以檩準技術之助決定細胞萃取物中之ALP活性 ,技術之依據如Takuwa et al所述以磷酸對位硝基苯基酯 爲受質(A m . J · P h y s i ο 1 2 5 7 ( 1 9 8 9 ) , E 7 9 7 - E 8 0 3 )。 表2 每孔洞之ALP活性(毫微莫耳/分) 培育天數對照L細胞 pABWN-L Hindni-MP52/ 之DMEM(10% 細胞轉感子pABWN-L細胞轉 !v、裝------_訂-----^―線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局Μ工消費合作社印製
0 3 6 9 12 土 S FCS) 4 1 . 8 土 2 . 8 136 . 3 土 3·7 129. 0± 7.8 118.4土 3.7 1 2 1 . 2 ± 3 · 2 之CM 41 . 8± 2 125.8土 2 119 · 3 土 6 110 . 1 ± 2 125 . 3 土 6 感子之CM 4 1 . 8 ± 2 . 8 181 . 3土 14 . 2 258 · 0 土 8.3· 258.4土 10.6 237 . 8 ± 11 〇 D之數値爲4培養物之混合 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(2S0X297公釐) -28 - 448183 A7 __ -- B7 五、發明説明(26 ) ’ :p < 0 . 0 1 對 DMEM及 pABWN — L 細胞轉 感子之CM而言(Scheffe’s多重t 一試驗) 如表2所示,加上MP 5 2可造成ALP活性顯著的 增加,此係與純DMEM/10%FCS培養基及來自經 P ABWN感染之L細胞培養基比較而言。此結果顯示 MP 5 2不僅可造成軟骨細胞分化,具可造成骨胚細胞之 分化及成熟。 另一種骨胚細胞株(MC3T3— E1,老鼠)其經 BMP — 2處理可造成ALP活性之增加,如Takuwa et al所述(Bioc.lieni,Biophys.Res.Coni. 174 (ΙΘΘΙί,θβ-ίΟΙ), 經過與可產生 MP 5 2 之 L 細胞轉感子 (
Hi nd I I I-MP5 2/pABWN)調適培養基培 育後,或經重組牛痘苗病毒感染產生MP 5 2後之培養基 培育,對於ALP活性並無變化。此顯示MP 5 2具有細 胞專一性,其可部份脫離BMP — 2。由於個別TGF — 族成員不同的標的位置所致的不同功能,是極具醫學相 關性的。 經濟部中央標準局爲工消资合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 2 .活體內實驗 2 . 1 檢査骨骼發展之最決定性可能性是依據液體內之異位 性骨形成。此可經由去礦物質之骨基質移植而誘導( Urist ,Science 1 50 ( 1 965 ),893 - 899 )。混合失去活性之 基質與骨誘導性蛋白質(可誘導相同之過程,如Sampath 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 經濟部中央標準局只工消费合作社印製 A7 B7 五、發明説明(27) et al.(PNAS'. Proc.Nat1 . Acad Sci.USA 7 8 ( 1 98 1 ),7599 -2603)所述。此骨形成之過程,類似胚胎軟骨之骨形成, 及成人骨骼癒合。因此此方法可用來檢査蛋白質之活體內 骨誘導性能力。 經由牛痘苗系統中表現而得之MP 5 2蛋白質(見實 例2 )部份純化及移植以進行此霞寬轉:。_ 於此,將 1 4 3 B 細胞(HuTk,ATCC CRL 8303)培養 於培養皿中及滾動燒瓶中直到呈匯集狀,再以重組病毒感 染,如實例2所述以供表現分析,將之洗滌且含MP 5 2 在MEM中累稹約2 0小時(Gibco BRL,約每1 06細胞 /毫升)。相同的製劑以野生型病毒感染充作對照組。收 集各製劑之細胞培養上清液(調適培養基),並離心( 4 0 0 0 0xg) ,4eC下3 0分鐘)。爲了移去病毒, 上清液經無機濾膜過濾(0 . 1微米孔徑,Whatman,
Anotop 25)。於MP 5 2鑑定過程中顯示,此蛋白質可與 肝素—Sepharose結合。此特性可利用於部份純化。於此, 經過濾及離心之調適培養基便達5 OmM Tris ρ Η 7. 0,100mM NaCl及6Μ尿素之終濃度,再 塡料至肝素管柱(H i T r a p T M , P h a r m a c i a # 1 7 - 0 4 0 7 - 0 1 ), 其已經A緩衝溶液平衡(5 OmM Tris pH7. 0,
1 0 OmM NaC 1及6M尿素)經塡料之管柱以A緩 衝溶液洗滌,再以至1 0 緩衝液(5 OmM
Tris ρ Η 7 . 0 » 6 0 0 m Μ NaCl 及 6Μ 尿 素)之線性梯度在50分鐘內以0. 5毫升/分流速溶離 I I -'4^· ,. 訂 | 線 / ^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家梂準(CNS ) A4規格(210X297公釐) -30 - 經濟部中央標準局負工消资合作社印製 A7 —B7 五、發明説明(28)
(每流份2. 5毫升)。尿素之使用並非絕對必要°MP 5 2溶離物主要再現於2 5 0至4 0 OmM NaCl處 的2個流份,此可以西方墨點分析檢査(見實例2 )。這 些流份各自取一份,並依廠商指示(S Π ver Stai η- I I , 1^^(;11丨#5£14〇0〇〇)在銀染之15%聚丙烯醯胺凝膠上檢 査,並匯集流份。可比較之流份敢,®:Λ .之此.调在_辉野生 型病毒感染後之調適培養基中所純化的,再以銀染之凝膠 分析。 在MP 5 2上進一步的檢査顯示,MP 5 2也可與羥 磷灰石結合。因此以羥磷灰石管柱,或以其替代肝素管柱 (如B I O-RAD,Eccno-pac HTP)。·達到額外的純化 是可能的。精藝者已知的其他方法爲進一步純化也是可想 像到的,如:凝膠過篩管柱,離子交換管柱,親和力管柱 ,金屬螯合物管柱,或以疏水***互作用爲基礎之管柱。 以肝素一Sepharose層析預純化之MP 5 2.蛋白質, 或仍有摻雜的相當的蛋白質,其仍存在於以野生型感染之 細胞培養上清液中,利用逆相HP LC進一步純化。於此 ,利用 C 8 管柱(Aquapore RP300,Applied Biosysteras ,粒子大小:7微米,孔徑:3 0 0埃),其以1 0%B 緩衝溶液(A緩衝液,0. 1 %三氟醋酸;及緩衝溶液: 9 0%乙睛,0. 1%三氟醋酸)。以來自肝素管柱,含 有MP 5 2匯集之流份塡於管柱之後,將之以1 緩 衝溶液充份洗滌。以下列梯度溶離經結合之蛋白質;1〇 —5 0%B緩衝溶液歷2 0分,及5 0 — 1 〇 〇%B緩衝 .n —ϋ J i —I! I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 一線 本纸張尺度適用中國國家摞準(CNS ) A4規格(210X297公釐) -31 必 48 1 83 經濟部中央捃华局負工消费合作社印裝 A7 -B7 五、發明説明(29) 溶波5 0分鐘。收集5 0 0微升流份,以西方墨點及銀染 凝膠分析,在選定條件下,MP5 2在約5 5至6 5%乙 腈之範圍下溶離。匯集含有MP 5 2之流份。以經野生型 病毒感染之細胞培養上清液之對照純化所得之相當流份進 行相同步驟。 以西方墨點佶計之約5 0毫微裏/毫升濃度下之經部 份純化之MP 5 2蛋白質,在ROB — C 2 6細胞中經3 天培育之後,也顯示AL P活性有顯著的增加。 來自以野生型病毒感染後,相當的部份純化細胞培養 上清液中之部份純化之MP 5 2蛋白質或對照蛋白質,以 基質重組,並植入大鼠以証明其於軟骨及骨骼形成上之能 力。 原則上精藝者已知之各種基質物質均可使用,即天然 的(也可經修飾)及合成製備之基質,然而,以可被生物 降解之生物可相容之多孔物質爲較佳。於這些實驗中,使 用大鼠之骨基質,其基本上以類似Sara path et al之方式 製備(PNAS 80(1983) »6591- 6 5 9 5 )。大鼠骨骼(大腿骨及脛骨)在0. 6 MHC 1中去礦物質化2 4小時,再移去仍存在之骨髓。 經以水洗及在氯仿/甲醇(1/1)混合物中脫脂3小時 之後,骨骼風乾,在冷凍狀況下以磨機輾磨,再篩出介於 4 0 0及1 0 0 0微米之粒子大小。接下來,基質在4M 抓塩酸中,於蛋白酶抑制劑存在下在室溫萃取7天。經水 充份洗滌之後,基質冷凍乾燥再貯於4 °C。以此方式處理 I i 1 n : ^ I ί 银 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X2W公釐} - 32 - 448183 A7 "B7 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 五、發明説明(3〇) 1 | 之 基 質 本身 不 顯 出 骨骼 誘 導活性。 1 1 蛋 白質 可 以 精 截者 已 知之各種方法混合以經萃取之骨 1 基 質 0 已利 用 肝 素 -Se ph arose以及逆相Η P L C純化之 1 Μ P 5 2蛋 白 質 或 對照 組 蛋白質,經在乙睛/三氟醋酸溶 請 先 1 1 I 液 中 溶 離之 後 9 混 合以 2 5毫克基質,此以每植入物各例 讀 背 1 1 而 言 9 混合 均 勻 冷凍 再 冷凍乾燥。 之 注 1 1 於與基 質 結 合 之Μ P 5 2植入方面,使用2隻約3個 忍 事 項 杯 <1 月 大 ( Wh i s t a Γ ) 之大鼠, 事先以***肌內注射麻醉之 U Ή ( δ % 本 ( 0 2毫 升 Ro in p ay er)混合以0. 5毫升Ketanest 頁 1 1 5 0 ( Park e Da Vi s )每] -00克體重注入0.14毫升 1 1 1 0 在 腹 部肌 肉 中 準 備雙 邊 口袋以供植入(在喉嚨下,於最 1 1 低 肋 骨 弧下 約 0 * 5公 分 處開始)。與基質結合的MP— 1 訂 5 2 ( 由西 方 思 點 估計 約 2至4微克),以及與相當基質 1 1 結 合 之 對照 組 蛋 白 質, 以 0. 9 %食塩水潤濕(Delta 1 I Ph a r m a ), 並 引 入 肌肉 袋 中。再縫合肌肉袋及必需的皮膺 1 傷 □ 0 大鼠 以 環 孢 靈A ( Sandimmun)免疫抑制之。 線 經 1 8 或 2 6 天後 取 出植入物,再固定以行組織學檢 1 1 査 0 由 於2 6 天 後 有Μ P 5 2之植入物,可被推測已發生 1 i 巨 觀 的 骨形 成 9 將 之包 埋 在異丁烯酸甲酯中以製成薄片, i I 其 他 植 入物 包 埋 於 石蠟 中 。礦物質化之軟骨及骨骼組織, 1 1 利 用 V 0 η Κ 〇 S S a 染色技術(R 〇 m e i s , B , ; % M i k r 〇 s k 〇 p i s c h e \ I 1 Te c h n i k", Ed : Bo ck , P t Urban and Schwarzenberg; 1 1 Mu ώ i c h ,Ba 1 t i mo re ,Vi e η na ( 1 989 )以黑色强調之。在依 1 1 據 Ma s s o n ' G o t d n e r 之三 鉻 染色中(Romeis,B.; ' 1 i i 本紙乐尺度適用中國國家梯準(CNS ) A4規格(210 X 297公釐) -33 - - 4 4 8 1 8 3 A7 一 B7 五、發明説明(31 )
Mikr〇sk〇pische Technik^ , Ed : Bock ,P. ;Ur ban and S c Inr a r z e n b e r g ; M u n i c h , B a 1 t i ia o r e > V i e n n a ( 19 8 9 ),經礦 物質化之骨骼組織及膠原蛋白被染成亮綠色,骨樣染紅且 細胞質爲微紅一稼色。此二染色技術均可用於二大鼠之植 入物。在二實驗中偵測含有MP 5 2植入物中,軟骨及骨 骼之形成,利用二染色技術進行..。„_有.麗JP.奪白霄之._相當的 植入物,不論在軟骨或骨骼上均無形成發生。有軟骨細胞 之軟骨前軀體數目,及有細胞外基質最初形成之軟骨Μ域 ,及其呈向心圓乏礦物化作用,在1 8天後之ΜΡ 5 2植 入物中較2 6天者爲高。然而,在1 8天之植入物中也可 測及有向量骨樣形成之成熟骨骼組織,及在骨骼中的個別 骨細胞。此外在骨髓彤成開始,可覯察到閉合之小骨。在 2 6天後之植入物中,也可測及有最初基質形成及鈣化之 軟骨區域,經礦物質化之骨組織染成綠色,且骨細胞及骨 樣綠顯著地增加。在此植入物中,也可測及骨髓形成且伴 隨經分離之脂質細胞之發生。爲說明起見,圖5示出來自 2 6天完全植入物骨髓物質之染色試驗(依據VQn Kossa 染色法)。相同植入物的小切片圖示於圖6 ,此爲 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
Masson-Go丨dner染色之後。其示出有立方骨胚細胞及骨樣 之邊綠之活性骨骼,其中可確認被個別包埋之骨胚細胞。 再者於礦物化骨組織中也可見個別的骨細胞(在原先製劑 中被染成綠色)。也可偵測到骨髓之形成。 寅驗顯示,單獨的重組產生之MP 5 2,加上基質, 可誘導軟骨骨骼之形成。 -34 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS )六4说格(210X297公釐) A7 -B? 五、發明説明(32) 2 . 2 爲了証實結果,進行利用MP 5 2 L細胞轉形子對 骨骼形成之進一步異位試驗。可產生MP 5 2之L細胞( 以 1111:(1111一]\1?52/0八6双]^轉感的)(1 X 1 06細胞)及不產生(PABWN —轉感的)的L細 胞注入3隻公裸鼠雙側之大腿肌肉。3週後殺死動物,大 腿肌切出,以低能量X射線照射及組織病理學檢查。 以X射線照射分析顯示,在肌肉組織注射位置處有可 產生MP-5 2的所有L細胞之稠密物質,如表3 ‘所列。 可利用組織學檢査決定肌肉中簡單軟骨之形成及鈣化軟骨 之形成。這些結果也証實,MP 5 2可誘導軟骨骨骼之形 成0 表3 : (請先閏讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝. 訂 經濟部中央標华局負工消资合作杜印製 X射線分析 之稠密物質 組織學分析 之軟骨細胞 組織學分析 之鈣化軟骨 之形成 產製MP 5 2之細胞 (Hindi I I — MP5 2/ pABWN) 3/3 對照組細胞 (p A B W N 0/3 0/3 羅 -35 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐〉 A7 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ____B7___ 五、發明說明(3 所進行的實驗証實,MP 5 2蛋白質可刺激軟骨自未 分化間充質細胞之形成,以及軟胚細胞之分化及成熟。此 可造成軟骨骨骼之形成,其類似胚胞骨骼形成及骨析癒合 中之誘導聯級。 在實驗中所陳述之條件可視爲Μ P 5 2活性之說明| 但非予以限制。本發明也可以另一型式檢査及鑑定。 1Γ式簡孃:~_說明 广 圖1說明ΜΡ — 5 2與ΒΜΡ蛋白質族之成員的胺基 酸序列之比較。 圖2 a和2b說明本發明所使用之寡核苷酸引子的核苷 酸序列及其與T G F - jS族已知成員之序列的比較。 圖3說明西方墨點法顯示MP — 5 2專一帶僅顯現於 重組病毒組。 圖4說明雞石一肌動蛋白啓動子。 圖5說明經Von Kossa染色後通過整個移植體之切片( 移植後26天)。 圖6說明經Masson-Goldner染色後之移植物橫切片( 移植後2 6天)。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) l·---------—、J 裝------ 丨—訂—I----I > (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 448183
附件二A :第83108337號專利申請案 中文補充實施例 民國85年f月呈 抗體之製備、純化與鑑定 L用於產製抗原之質體 用於免疫接種之抗原衍自於大腸桿菌中表現之蛋白質 。吾等將成熟MP52主要部份(於專利案83108337 SEQ ID 卯:2中之383-501胺基酸),在^"-末端加上含有6個組胺 酸之額外的10個胺基酸(MHHHHHHKLI),繼代選殖至表現 載體pBP2中。所生成之質體PBP2HB-MP52亦於圖1 ( DSM 10028,1995年 1 月 2 日)。大腸桿菌BL21(DE3)LysS ( AGS/Novagen, #69451-1)含有指導合成T7 RNA聚合酶之基 因,其可依操作指示經由IPTG之誘導作用表現HB-MP52。 HB-MP52依傳統方法純化自包涵體。簡言之,大腸桿菌細 胞離心,團塊再懸浮於溶解緩衝溶液中(250 mM NaC芡, 0.5¾ NP40,20禮 Tris PH8.0, ImM DTT)。細胞以冷凍及 解凍共三次再充份音波震盪(在冰中至少5次,各1分鐘 並有間斷)而充份溶解之。包涵體可以離心收集(10分鐘 ,10°C下,12000xg)。另外細胞可由再懸浮(50 mM Tris, PH8.0, 0.2M NaCl, 2mM EDTA, ImM DTT, ImM PMSF, 0.2 毫克/毫升溶菌酶)及培育20分鐘而溶解。加入TritonX-100(1/10原先體積)後,溶液依上述音波震盪。接下來在 蔗糖溶液(10mM Tris, pH8.0, IraM EDTA, 0.2M NaCl, -1- 40%蔗糖)上平覆相同體積之溶胞產物並離心(30分鐘, • 4°(T, 1200xg)。利用二種方法,經由溶解緩衝溶液、PBS 、含有去污劑之P B S及/或含有0.5— 2 Μ搓酸胍( GuCl)之溶液之洗滌,則在團塊內之包涵體可以出來,依 所要求之純度而定。在以Ni2+NTA吸附劑接下來純化His-MP52之例子中,.以溶解緩衝溶液之數次洗滌步驟即已足夠 。以鎳嵌合管柱純化His-MP52,基本上依Hochuli等人之 方法進fr ( BIO/Technology Vol,6,1321-1325)。衍自 1公升培養物之包涵體再懸浮於1〇毫升GuCl溶液中(6M GuCI、0· 1M 磷酸鈉、1 mM DTT pH8.0)。團塊 音波震盪至完全溶解爲止。有蛋白質溶液之管子固定在旋 轉輪上,其可緩慢自旋30分鐘。接下來加入1毫升Ni2+_ N T A瓊脂糖珠粒(Quiagen #30230),且令His-MP52與 旋轉輪上之珠粒結合1 - 2小時,室溫下。瓊脂糖珠粒/ 蛋白質溶液倒入管柱內(由重力流動)並以上述的GuCl溶 液(共5毫升)洗滌。HB-MP52以6毫升相同的GuCl溶液 溶離,除了 P Η爲4,並將溶離液每1毫升收集成1份。 含有H i s —ΜΡ 5 2之流份以所選用之緩衝溶液透析。 在數份製劑中,H i s _MP 5 2可再進一步利用逆相Η PLC純化(Nucleosil 300-7C4, Macherey-Nagel #715023),利用在〇.l%TF A中之0 — 90 %乙睛梯度(流 速:2毫升/分鐘。在使用前,H i s — Μ P 5 2可視所 需再折疊成其二元的生物活性型式。 圖1 :產製抗原His-MP52所需之質體ρΒΡ2ΜΡ52ΗΒ 448 183 (Ampr•:氨苄青黴素抗性,Τ 7 :T7 RN A聚合酶 RBS :核糖體結合位置)。 針對抗體鑑定目的,吾等使用無His —附尾之MP52 ,以避免由相對於N-末端人造胺基酸之抗體所致之僞陽 性結果。因此,在大腸桿菌((537)中表現另一個融合蛋 白質,PEX-MP52,其含部份的MS2 —聚合酶(約11〇)及大 部份成熟的MP52 (專利案83108337 SEQ ID N0:2中之383-501胺基酸)。分離出包涵體,蛋白質再以製備式聚丙烯醯 胺凝膠及電泳溶離法進一步純化。此外,利用p B P 2載 體(pBP2MP5 2m,DSM 10029 , 1995年 1 月 2曰)表現成熟的MP 5 2 (專利案83108337 SEQ ID N0:2 中382-501胺基酸),其僅在N-末端含額外一個甲硫胺酸 。可比照MB—MP 5 2進行MP 5 2 m之表現、純化及 再折疊,例外之處爲鎳-嵌合管柱,及因此包涵體更嚴格 之洗滌。 2.於兔子中產製抗體 吾等開始在各兔子上免疫接種,其係皮下注入5 0 0 至 微克His - MP52,其溶於Tris/尿素緩 衝溶液,並依操作指示加入佐劑ABM3 (PANSYstem #25 -0301)製備之。兔子在固定時間架構下追加3〇〇至400微克 抗原’其係溶解於Tris/尿素緩衝溶液中,並依操作指示 加入佐劑 ABM2 (PNASystem #25-0201)而製備。 於所有兔子5次追加後,由各自之耳靜脈收集血樣。 -3- 448183 令血液在37eC下凝塊歷1小時,再置4 °c下一夜。凝塊及 任何留下來的不溶物質以離心移去(l〇0〇Xg,10分鐘,4 °C )且抗體利用蛋白質A管柱自血清內分離,基本上如 Haeioff, E.及 Lane, D 所述(Antibodies, A Laboratory Mannal, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, chapter 8)。簡s 之’蛋白質一a —Sepharose CL_4B ( Pharmacia,#17-078001)平衡於 IX TBS中(137 mM NaCl, 5mM Tris, 3.8mM HC〗加NaOH調至pH8.0)並依操作指示充 作管柱(5毫升)。將約15毫升血清加入1M Tris PH8.0使 達到5 mM Tr is之終濃度,並混以15毫升IX TBS,過濾( Nalgene #155-045)再塡加至pr〇tein-A管柱。管柱以 IX TBS(25毫升)洗滌,再以0.1M檸檬酸溶離。收集流份(各 2毫升),以2.8毫升0.5祕以111)04中和再以?65(58 1111 Na2HP〇4、 17mM NaH2P〇4· H2〇, 68mM NaCl·, pH7.35)透 析。含有抗體的流份匯集,且以Bradford方法侬操作指示 (Coomassie Protein Assay Reagenz, Pierce, #232000 )決定蛋白質濃度。抗體以1毫克/毫升以上之蛋白質濃 度貯於一 80°C下,並視所需加上0.02%NaN3。 進行ELISAs方法定量抗體而鑑定之。基於此目的,在 微滴定盤上(Nunc maxisorb, #442404)上塗覆不同量之 pEx-MP52(100微升/孔洞),且盤中留下的蛋白質結合位置 以牛奶粉阻斷(200微升/孔洞)。至於pEx蛋白交叉反應用 之陰性對照組(無MP52),也塗覆在微滴定盤孔洞中。抗體 之使用濃度爲10微克/毫升。以二次抗體(Anti- Rabbit -4· 448183
IgG鹼性磷酸酶共軛物,Sigraa #A-8025)及對位一硝基苯 基磷酸酯(Sigma # N9389)進行偵輒。在405毫微米波長 下追踪顏色之展開。得自一隻兔子數次追加注射所得之 ELISA結果(兔子2號)示於實例之圖2中0 圖2 : pEx -MP52之抗體(10微克/毫升),係2號兔子在第 3次(兔子2/2)、第4次(兔子2/3)、及第6次(兔子 2/5)追加後於EISA上試驗之結果(於405毫微米下 追踪)。 抗體利用西方墨點分析法進—步鑑定。聚丙烯醯胺凝 膠(15%PAGE,1.5毫升)右轉移緩衝溶液中(〇 7Μ甘胺酸 、0 _ 026M Tr is , 15%乙酵、1〇mM DTT)中平衡 5 一 1〇分鐘 。PVDF膜(ImmobilonP-Transfennembran, Millipore #IPVH 00010)切成疑膨大小之尺寸(約8.5X5,5公分之分 離凝膠),立即浸入甲醇內,以水潤濕再於轉移緩衝溶液 中平衡5 — 10分鐘。於4 1之轉移緩衝溶液中進行1小時 之轉移,利用固定電踺(loov)及H〇efer之電泳(TE 22 Mini Transph〇r)進行。接下來,膜以洗滌緩衝溶液(pBS ,0.1% Tween)洗二次(各5分鐘),係在室溫下震盪進行 。在接下來的處理中使用來自TROpIxl SERVAiffe s tern-
Lighf;TM Rabbit套組試劑(?LI〇RC)。膜浸於阻斷緩衝溶 液中(0.2¾ I-BUck,pBS,〇1% Tffeen_2〇, 〇 〇2% NaNs ,依操作指示製備),於室溫下阻斷丨.5小時,或是在4 °C —夜。MPa確認抗體稀釋於阻斷緩衝溶液中,使終濃度 爲1微克/毫升。膜在室溫下培育I.5小時,或4 °C下一 夜,'與此第一抗體培育。經阻斷緩衝溶液中洗3次(各10 分鐘)後,鹼性磷酸酶共軛之二次抗體(TR0PIX 1 SERVA, ACIIR)以1 : 1000稀釋於阻斷緩衝溶液中,再與 膜在室溫下培育45-60分鐘。膜再次在阻斷緩衝溶液中洗 3次(各10分鐘)。基於偵測目的,膜在分析緩衝溶液( 0.二乙醇胺、1 mM MgCl2 PH10.0 )中培育2次(各 5分鐘),於Nitro-block中5分鐘(1 : 20稀釋於分析緩 衝溶液),於分析緩衝溶液再2次(各5分鐘),於受質 溶液(受質以1 : 100稀釋於分析緩衝溶液,各膜約3毫 升)中5分鐘,再置於二片透明薄紙間。對高性能發光偵 測膜(Hyperfilm ECL, Amershenn #RPN 3103)之曝露時 間依訊號强度由數秒至數分鐘。 圖3 :利用兔子抗體(R=2/5, 1微克/毫升) 1 :MP52m (25毫微克)在大腸桿菌中表現、純化及 在還原條件下再折疊(ΙΟΟτηΜ DTT)。 2 : MP52ra ( 25毫微克)在大腸桿菌中表現、純化及 在非還原條件下再折疊。 3:細胞培養上清液(1毫升)爲以重組病毒(有 嵌入之MP52 cDNA,見專利案83108332)在還原 條件下(lOOmM DTT)感染後。 4:細胞培養物上清液(1毫升)爲以野生型病毒 (無嵌入之外來DNA,見專利案83108332 ) 在還原條件下(100 raM DTT)感染後。 44SI 8 3 5 :細胞培養物上清液(1毫升)爲以重組病毒( ‘ 其嵌有MP 52 cDNA,見專利案83108332 >在非 還原條件下感染後。 6:細胞培養物上清液(1毫升)爲以野生型病毒 (未嵌入外來DN A,見專利案83108332 )在 非還原條件下感染後。 Μ :預先染色的蛋白質分子量標幟(Gibco BRL #26041020) 兔子抗體可偵測原核及眞核細胞中所表現之成熟 MP52。其也可偵測前軀體,且可能是在眞核細胞中表現的 另外經處理修飾之前軀體。 3.於雞中產製抗體 吾等以3 00至4 0 0微克的His —MP 52肌內注 射開始雞之免疫接種。雞以1 5 0至3 0 0微克抗原每2 至3週追加注射,歷約1年。爲了免疫接種目的,抗體先 溶解在Tris/尿素緩衝溶液中,再與雞用佐劑混合(LES+ STM, PANSystem #25-0401 ),依操作指示進行。抗體分 離自蛋黃。完整的蛋黃自蛋白中小心分離,以蒸餾水之緩 和蒸汽洗數次/再以剃刀打破。將得3至4個蛋之打破的 蛋黃過篩壓擠,匯集,抗體再以P E G沈澱法純化,基本 上如Thalley, B.S, & Carroll, S.B.(Biotechnology 8, 1990, 934-938)所述。其與7倍體積之蛋萃取緩衝溶液 (1〇011^1磷酸鈉,〇.111化(:1,?117.5)混合,再於冰上 7 448183 ·· ... ·., 緩緩加入PEG 6 Ο Ο 0 ,伴隨緩和攪拌至3.5¾終濃度 。當PEG完全溶解,溶液離心( 9000Xg, 10分鐘,4 Ό),丟棄團塊且上清液經粗綿布過濾以除去脂質層。加 入P E G便達12%終濃度,再如上述地分離。含有抗體之 團塊再溶解於萃取緩衝溶液中(原先蛋黃體積之2倍), 並再加P E G至12 %終濃度,如上述。離心後,上清液丟 棄且團塊離心二次(2分鐘,4 υ,300Xg )以除去留下 的殘量P E G。抗體團塊再懸浮於含有NaN3 0.02¾之PBS 中(原先之蛋黃體積)、過濾(Nalgene #155-045 )且蛋 白質濃度以Bradford方法決定(考馬斯蛋白質分析試劑, Pierce #23200) ° 進行ELISA以比較不同時間之抗體品質。抗原(0.5 微克pEx_MP52)塗布在微量滴定盤,且盤中留下的蛋白 質結合位置以奶粉阻斷之。抗體(與大腸桿菌蛋白質預先 培育)於使用時是稀釋成1〇微克/毫升。依2中所述進行 偵測,除了利用不同的二次抗體爲例外(抗-雞IgG鹼性 磷酸酶共轭物,Sigma #A-9121,1 : 10000稀釋)。所生 成之雞(B )有關之抗體校價甜線示於圖4中作爲實例。 圖4 :拮抗MP 5 2之抗體效價曲線(0.5微克pEx-MP52/ 每孔洞)。雞抗體(以PEG方法純化並與大腸桿 菌蛋白質預先培育)使用時稀釋成10微克/毫升。 ELISA中之呈色於405毫微米下偵測(〇D405)。 通常P E G沈澱作用本身即是充份之純化步驟,旦抗 8 體已可用於西方墨點及ELISAs分析。然而來自雞蛋黃之抗 體製劑有時會含有可與大腸桿菌蛋白質反應之抗體(依所 使用之雞免疫狀況而定)。於雞B之例子中,吾等改善純 化步驟,並移去可與大腸桿菌蛋白質顯示出親和力之抗體 Ο 大腸桿菌BL21(DE3)Lys S株生長、以苷波震盪溶解 ,且分離出之蛋白質共價偶合至AminoLink管柱上( immuno pure, Amino link 套組,Pierce #44890〉,依操 作指示進行(BL21-管柱)。取一份純化自蛋之抗體塡至此 管柱中,且收集含有H i s —MP 52抗體之流份。以此方 法可移去大部份但非全部的可與大腸桿菌蛋白質反應之抗 體,可由ELISA証實。然而,吾等決定純化可與MP 5 2 最佳反應抗體。基於此目的,吾等在免疫接種後約2 0 0 —2 4 0天時,自最高値處採取多種抗體(圖4 )。 用於經由吸附至及溶解自其抗原而特異地純化抗體, 有許多方法是已知的(如見,Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988,第8章 )。在此方法中,純抗原結合至固相載體上,且僅有在多 株抗體匯集中之抗原,特異的抗體可與之結合。非特異的 抗體可由數次洗滌步驟移去,且可溶解出特異的抗體。此 方法可用於自混合的多株抗體匯集,或僅確認部份MP 5 2或二元的MP 5 2之抗體分離特異的抗體。吾等採用抗 原與膜之結合。結而,若在較大量的抗體時則建議使用管 柱。又將Hi S-MP5 2曝於一片Immobilon膜上( 4 id )83
Millipore #IPVH ΟΟΟΙΟ),且蛋白質再以UV—光共價交聯 之^將膜在0.2% Tween 20中阻斷後,將之與抗體共培育 ,該抗體已經P E G沈澱作用純化及以B L — 2 1管柱純 化一夜。經充份之洗滌步驟後,抗體以0.1M甘胺酸PH2.8 溶離,再以Tris,PH 9中和。 各純化步驟以ELISA控制。典型的純化概圖(自雞之 抗體B 2 5 )示於表1中。 ELISA証實抗體與濾膜之有效結合及其溶離。 抗體 0D 450 0D 450 pEx-MP52-BL21 (稀釋) ( 微克 pEx-MP52 0.5微克EL21蛋白質 蛋白質 B25(l:1000) .0.85 0.21 0,64 在BL-21管柱後 B25其餘的(1 : 1000) 0.27 0.22 0,05 濾膜培育後 溶離之流份F1 (1 :5000) 1.1 0.16 0.94 (1:25000) 0,47 0,13 0.34 溶離之流份F2 (1:5000) 0.45 0.14 0.31 (1:25000) 0. 19 0,13 0.06 溶離之流份F3 (1:5000) 0.25 0. 11 0,14 (1 :25000) 0,17 0.16 0.01 10, S4B183 表1:以抗原結合特異地純化雞抗體。 匯集得自數次雞抗體之第1(F1)及某些第二溶離 流份(F 2 ),其屬於圖4中免疫接種後約2 0 〇 — 2 4 0 天之最高値(B —匯集物),並保持在—20°C之40%甘油 中。匯集物在ELISAs及西方墨點上測試。ELISA以經塗覆 之pEx-MP52所得之結果示於圖5中。 圖5 :在pEx-MP52上,以特異經純化之雞抗體所得之ELIS 結果(B—匯集物1 : 1000稀釋)( 405毫微米下 之吸光度) 依2所述進行西方墨點分析,但略有小修改。雞抗體 以1 :10000稀釋,且使用抗-雞鹼性磷酸酶共軛之2次 抗體(SIGMA Α91Ή)。 利用雞抗體進行之西方墨點分析,已揭示於專利案 83108337中。 3.於老鼠中產製抗體 吾等依據傳統方法再進一步分離單株抗體。這些技術 詳述於Peters, J.H.Q. Baumgarten,. H. (1990,
Monok1ona 1 e Antikorper-Herstellung und cherakter Bierung, Springer Verlag, 2 Auflape)及Harlow, E. and Lane, D. (Antibodies, A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, ch6)。上清液 -11- SSQ ) 83 以ELISA及西方墨點分析來篩選與MP52具親和力之抗體。 細胞培養物上清液之抗體濃縮再純化,.利用Protein G管 柱(Inimun〇Pure plus (G)IgG Purification 套組, Pierce, #44795)依操作指示進行。在篩選方法中,分離 出數個與MP52具親和力之單株抗體。 於ELISA分析中,吾等塗覆不同量之二元MP52m至微 量滴定盤中。依2所述進行ELISA之顯色,變化之處爲使 用直接拮抗老鼠抗體之另一鹼性磷酸酶共軛之二次抗體( TROPIX/SERVA, AZ12M)。其中一抗體之結果示於圖S中。 圖G :來自老鼠之抗體(1 1 7毫微克/微升)於二元 MP52m上之ELISA測試。 -12-
Claims (1)
- ABCD ^ 440183 六、申請專利範仏_主‘大.[ 附件 / ( A ) -'----1 第83108337號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國8 9年1 0月修正 1 ·—種編碼TGF — 万族蛋白質之DNA分子,其 係選自 _ : _ (1)如下所示SEQ I D N 0 . 1之完整核苷酸序 列或其簡併序列: . . . ................ TTTftGfCAGCMGACATCAGfsGaGTAATUAAriGSTrTGGSlTCGftMTCGOmCCAA 120 TTCCTGftGTrCAG^mCTAAAAGATmTCTGaGCACCTQIAGXCrGTGftGTCICTCT ig〇 GTGTCTGTGTGTGTCTCTGtGTCICTGTCi^GIAaTnCftCIGGAAAGGAnCAAASCm 240 G3^3ftMMMAACTGGftGCACACAG33GCAnACGCCATTCTTCCTTCTiaaAAAA 300 TCCCTCAGCCITftTftCAAQ0CTCCriCAAGCCCTCSCTCAGTIGTGCftSGAGAA?iG3333 3 6 0 CGGTIGGCmClCCmCAAGAACGftGrmT丄,丄CftSClGCTCACTGGftGftCGGTGCAC 420 GTCTCGMR^AGSGCAmCCACEATCaS?iCTaa2aCAAACACACACCCGGCAGftClT 4 8 0 CAftGfiCTCICftGftCIGAGGftGAAftSXTnCCTICTGCTGCTfiCIGZIGCTGOOGCTGCX 540 TTTGAAAGTCCACTCCITICMKGT丄IT丄CCIGCCAAACCftGft33CACCmOCT3^TG2 600 CGCIGTJL。丄CmG3TGTCMnCftGCGG2TG3CCAGAG3iTCAGftCT0CCCAAACTCCTC 660 ACmenGCrnG3rftCCTG3ClTS3CTG3^CIG3^nCA2CTGCACrGTGTrGGGT 720 GDCCCrGACTTK53DZAS%aCCCCAGG3SJ〇CAG3CCAG3A2TOGCCAAAGCAGAGSr: 7 80 AAGGASAG3CCCCCCGTGGOOCGGAACGTCnCAG3CCAS3333ICACftCTmG3IG33 840 .G3GG3^ACCAAIG2CAATCXaG33CAAAG3GaG3CACCGG3CAG?OiGGAG3CCTGACA 9 0 0 CAG2CCAAGAAGG?CTGAACCCAAAAAS^IG3CCCCCAGACCG3XGSXCIlGAACCCAftG 960 CCAGGftCACCCTCCCCAAftCAAGGCAGGCXACAGCCCGSACTCTCACCCCAAAAGGiOC 102 0 CTTCCS33AG3ZAAGS2ACCCCCAAAAGCAGGATCTGICCCCAGnCCTTCCTCCIGAAG 10 8 0 AAGG2CAGGGAGXCG3GCCCCCACGAGftGCCCAAGGAGXGTn〇3CCCACCCCCCATC 114 0 ACACaXACGACTACATCCTCTCGCTGTftCAGS^CGCTGTCOGftTGrTCACAGAAAGGGA 1200 GGCAA2AG2AGCGTGAAGTK53AG3CTG3CCTG32CAACACCATCACCAGCTnATTCAC 12 6 0 AAAGSS^AAGftTCftCCGAGGTCCCGTGCJICAGGAAGCAGftGGTACCTCTTTGACAlTAGT 工 3 2 ◦ GCCCXQ3AGAAG2AIG3GCTCrrG333GCCGA!XTGCG3\ICTXG3GGAAGAAGCCCTCG 13 8 0 GACAOGGCCAAGCCAGCGGCOXCGGAGGCXSG2G3GC1GCGZftiXTGA?y3CTCTCCAGC 14 4 0 TGCCCCAG3G3CCG3ZftG2CGG0CTCCTTGC1G3AIGTGCG2TCCGICCCAGGCCrGGAC 15 0 0 ΚΞΑΤΟΤ03ηα33ήα7Γσπσ3^ΑΤΟΓ33ΑΑ〇2ΊυΓΤ〇αΞΑΑΑ2ΤηΆΑαΑΑΟΐα332: 1560 " CAGCTGTGCCTG3AGCTCGftGGCCTG33AAOGGG32AGG3CCGTCGACCICCGTCG0CIG 16 2 0 本紙張尺度適用中國國家橾率(CMS丁A4规格< 210X297公笨.)_ 1 _ (讀先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財4局員工消^合作社印製AS BS CS D8 六、申請專利範圍 __________ · _____ GGCITC3?CCGCGCCGCCCG32AG^rCCLACGftGAAG3CCCTGTICCK53IGTTT3GCCG2 1680 ACCAASAAACa^GACCTGnCmAMTGAGATrAAGGCCCGCTCTGGCCAGGACGAIAAG 17 40 ACCGTGTATGAGTftCCTGTlCAG^2A32GXGAAAACG3CG33CCCCACTG3XACTCGC 1 _ CAG332AAGCGACCCAGCAAGAACmTAAG3^ia^TGCAGTCX^AAG3CACTGCATGTC I860 AACTTCAAG3^2ATG3GCTC3^CG?CrCGATCATCGCACCCCnCAGTftOGftGGnTTC 1920 CACIGCGAGGGSCTGTaXftGTTCCCATTGCGCICCCACCTGGAGSCCACGAATCATCXlA 19 8 0 CTCAJCCAGACCCTGArGAA^TCCATC3ACCCCGAGTOCA2A2CAC0CA〇rTGCTGTCTG 2040 CCCACGD33CrcAGTCCCMCAGCATCCICnCAITGACTCiaXAA2AACGTGGTCTM: 2100 AASCACTATCASGftCATC^TCCTSSOICGTCTGXTGCAG^rAGZAGCACTGGXCrCT . 2160 GTCTTCCT333T5XACATCCCAAGAGCCCCTTCCTGCACTCCTG^AICACAGAGG33T 2 2 2 0 ^W^AGCTGTGSCAGOAGCAICEAGACAGCTTGGGTGAAAGSGGAI'ICCAMj'AGCTrG 2 2 8 0 CTCGC 丄 eiC'iGAGTGTGftCTTCGGrEAAAGGCCOCCmmnXLftCAAGTTCCCCTGGCT 2340 G^GGMTGCTGCCCGTCIOCTGAIGTGACCAGTGXAGXACAG^TCCAGGGAGACAGAC 2 4 0 0 TCTGAAT3GGACTG^GTC0CAGGAAACAGTGCnTCCGATGAGft!2TCAGCCCACCAmC 2 4 6 0 TCTTCACCTGGGXnCTCAGCCTCTGGaCTCTCCrAASZACCTCTCAGGAGAG2CACAG 2 5 20 GTGGCACIGCCTCCTCAAAICACAITICTGCCTCTCGACTTCCTGXCarrcSGftCACTTG 2580 AGAAGCTSACIG33CAAGW3TG3GftGAGAftGftGGAGAGGGCnG3ftIftGAGTTGRGG?CT 2 6 4 0 GIGAGGCTGITAa=Cr3TrAG?imAAATCrftIATTGKrGAGAIftAAAAGCAAAACTGTG 7000 CCT ; ' 2703 (2 ) S E Q I D No:l 中第 1783 至 2142 位置之核苜酸所組成之核苷酸序列,或其簡併序列;及, (3) SEQ ID No : 1中第1837至2142位置之核 替酸所組成之核旮酸序列,或其簡併序列。 2 .—種TG F — $族之蛋白質,其係具有如下所示 之胺基酸序列: APUVTRQGK RPSKNLKA^C SRXAXHVTSrX DMGWDDWIIA PIEYEATBCE GLCEFPiLRSH- :LEPTtiEAVIQ TLMNSKDPSS TJ^TCCVPTTR,LSP工SILFID SANNWYXQY EDKWZS(^GC R j 3 .如申請專利範圍第2項之蛋白質,其係充作抗原 決定基或抗原以誘發免疫反應* 4. 一種產製如申請專利範圍第2或3項之丁GF— <3族蛋白質之方法,其係包含(a )在可令該TGF_y9 本纸佚尺度逋用中國®家椹车(CNS>A4洗格( 210X297公«.)- 2 _ --------HV-- {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -3. ¥ 經濟部智慧si/?-局員工;fl費合作社印製 • iMM— 1^|[ ABCD 六、申請專利範圍 族蛋白質表現之條件下,於適當之培養基中培養選自細菌 或哺乳勖物細胞之轉形宿主細胞,其中該宿主細胞係被包 含申請專利範圍第1項之D N A分子的質體pBP1MP52s, pSG52s,pSG52g 或 HintJin-MP52/pABWN 所轉形或轉感;及 (b )藉由習知方法,自該細胞或細胞培養物上清液中單 離與純化該TGF — 卢族蛋白質。 . 5 . —種用於治療或預防骨骼,軟骨,結締組織,皮 虜’粘膜,上皮或牙齒之傷害,及應用於牙科植入物及應 用於傷口癒合及組織再生過程之藥學組成物,其係含有至 少一種如申請專利範圍第2或3項之蛋白質以充作活性物 質,及/或習用之藥學載劑物質,佐劑,稀釋劑或充填劑 〇 6 .如申請專利範圍第5項之藥學組成物,其中該蛋 白質係含於天然或合成之基質材料中或位於該基質材料上 〇 7 ·如申請專利範圍第6項之藥學組成物,其中該基 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 料 材 性 孔 多 變 容 相 可 物 生 之 解 分 可 性 物 生 爲 係 料 材 質 經濟部智慧財是局員工消費合作社印製 本紙張尺度逋用中國國家揉準(CNS>A4規格(2丨0X297公釐)一 3 _
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