HU219504B

HU219504B - A TGF-beta családba tartozó fehérjék, ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények és eljárás ezek előállítására

Info

Publication number: HU219504B
Application number: HU9503853A
Authority: HU
Inventors: Gertrud Hötten; Helge Neidhardt; Michael Paulista
Original assignee: Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh.
Priority date: 1993-08-10
Filing date: 1994-08-09
Publication date: 2001-04-28
Also published as: CN1129013A; PT713529E; EP0713529A1; HUT74271A; JPH09501053A; JP2006083178A; JP4297895B2; US5994094A; CA2169171A1; AU688362B2; IL110589A0; JP3795068B2; CA2169171C; CZ35796A3; NZ271376A; ATE189475T1; GR3032628T3; WO1995004819A1; AU7498694A; CZ288795B6

Abstract

A találmány tárgyát a TGF-? családba tartozó fehérjék és a kódoló DNS-szekvenciák képezik. A rekombináns TGF-? fehérje előállításáraeukarióta vagy prokarióta gazdasejtet használnak fel, amelybe atalálmány szerinti fehérjét kódoló DNS-t tartalmazó vektort építenekbe. A fehérjét a transzformált sejtekből vagy azok tenyészeteinekfelülúszójából nyerik ki. A fehérjét gyógyszerkészítményekhatóanyagaként csont-, porc-, kötőszövet-, bőr-, nyálkahártya-, hám-vagy fogkárosodások kezelésére vagy megelőzésére, fogbeültetéseknél éssebek gyógyításánál, illetve szövetregenerációs folyamatoknálhasználják fel. ŕ

Description

A találmány tárgyát a TGF-β családba tartozó fehérjék és a kódoló DNS-szekvenciák képezik.

A növekedési faktorok TGF-B (TGF=transforming growth factor=transzformáló növekedési faktor) családja, amelyhez a BMP-, TGF- és inhibinrokon fehérjék tartoznak [Roberts és Spom, Handbook of Experimental Pharmacology 95, 419-472 (1990)], különösen a gyógyászati kezelési módszerek és alkalmazások széles területén meghatározó. Ezek a faktorok a sebek gyógyítását és a szövetek regenerálását érintő eljárásoknál alkalmazhatók. Továbbá a TGF-β család több tagja elősegíti a szövetek növekedését, különösen a csontok növekedését, és ezáltal központi szerepet játszanak a porcok és csontok fejlődésének elindításában.

Wozney és Vale [Wozney, Progress in Growth Factor Research 1, 267-280 (1989); Vale et al., Handbook of Experimental Pharmacology 95, 211-248 (1990)] különböző növekedési faktorokat írnak le, mint például azokat, amelyek a BMP (BMP=bone morphogenetical protein=csontmorfogenetikus fehérje)- és az inhibincsoporttal rokonságban vannak. E csoportnak a tagjai szignifikáns szerkezeti hasonlóságokat mutatnak. Az éretlen fehéije egy aminoterminális szignálszekvenciából, egy előpeptidből és egy körülbelül 110 aminosavból álló karboxiterminális szekvenciából áll, amelynek az előfehérjéről történő leszakadásával jön létre az érett fehéije. A csoport tagjait továbbá aminosavszekvencia-homológia alapján definiáljuk. Az érett fehérje tartalmazza a legállandóbb szekvenciákat, különösen hét ciszteinmaradékot, amelyek a család tagjai körében állandók. A TGF-β típusú fehéijék többfunkciós, hormonálisán aktív növekedési faktorok. Rokon biológiai aktivitásokat mutatnak, mint például a sejtek kemotaktikus vonzása, a sejtdifferenciálódás és a szövet-indukáló képességek - mint például porc- és csontindukáló képességek - elősegítése. Az 5,013,649 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás olyan DNS-szekvenciákat fed fel, amelyek ΒΜΡ-2-ként jelölt, csontképző fehérjéket kódolnak, a 179 101 és 170 197 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentések pedig a BMP-1 és BMP-3 fehéijéket írják le. Továbbá sok sejttípus képes a TGF-β típusú fehéijék szintézisére, és gyakorlatilag minden sejt rendelkezik TGF-β receptorokkal.

Összességében ezek a fehérjék szerkezetükben olyan eltéréseket mutatnak, amely pontos biológiai szerepükben jelentős számú variációt eredményez. Továbbá különböző szövetfajták és fejlődési szintek széles tartományában találhatók. Ebből következően, tekintettel pontos szerepükre - például a szükséges sejtfiziológiai környezetre -, élettartamukra, célhelyükre, segítőfaktorok iránti igényükre és lebomlással szembeni ellenálló képességükre, eltéréseket mutathatnak. Ezért, jóllehet számos fehérjét leírnak, amelyek szövetinduktív, különösen csontinduktív potenciállal rendelkeznek, ezek természetes feladatát az élő szervezetben és - még inkább - gyógyászati jelentőségét részleteiben még fel kell deríteni. A TGF-β család eddig még ismeretlen, az osteogenesisben (csontok keletkezésében) vagy más szövetfajták differenciálódásában/indukciójában jelentős szerepet játszó tagjainak létezését nagy valószínűséggel feltételezik. Ezeknek az új TGF-β típusú fehéijéknek az izolálásánál komoly nehézséget jelent, hogy funkcióik egy hatásosan megkülönböztető biológiai meghatározás (bioassay) kifejlesztéséhez még nem elég pontosan ismertek. Másrészt a család ismert tagjainál elvárt nukleotidszekvencia-homológia túl csekély ahhoz, hogy a klasszikus nukleinsavhibridizációs technikákkal történő screenelést lehetővé tegye. Mindazonáltal sürgetően szükség van új TGF-β típusú fehérjék további izolálására és jellemzésére, a minden szükséges gyógyászati követelményt kielégítő, további indukáló- és differenciálófehérjék rendelkezésre bocsátása céljából. Ezek a faktorok gyógyászati felhasználásra kerülhetnének sérülések gyógyításában és a csontok és/vagy más szövetfajták, mint például a vese vagy a máj, degeneratív megbetegedéseinek kezelésében.

A WO 93/16099 számú közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben az MP-52 jelű TGF-β fehérjére megadnak egy nukleotid- és aminosavszekvenciát, ahol az érett peptidnek megfelelő szekvencia és az MP-52 előpeptidjének megfelelő szekvencia nagy része szerepel. Az MP-52 előpeptid teljes szekvenciáját nem közük.

A jelen találmány alapjául szolgáló feladat olyan DNS-szekvenciák elkészítését jelenti, amelyek a TGF-β fehérjék családjába tartozó új, mitogén és/vagy differenciáló/induktív - például csontképző - potenciállal rendelkező tagokat kódolnak. A találmány feladata kiváltképp az MP-52 TGF-β fehéije teljes DNS- és aminosavszekvenciájának rendelkezésre bocsátása.

Ezt a feladatot egy olyan DNS-molekula segítségével oldjuk meg, amely egy, a TGF-β családba tartozó fehérjét kódol, és magában foglalja

a) az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott nukleotidszekvenciának az érett fehéijét kódoló részét és adott esetben további funkciós részeit,

b) az a) szekvenciának a genetikai kód degenerációja keretein belül megfelelő nukleotidszekvenciát,

c) az a) és b) szekvenciák valamelyike allélszármazékának megfelelő nukleotidszekvenciát, vagy

d) az a), b) vagy c) szekvenciák valamelyikével hibridizáló szekvenciát azzal a feltétellel, hogy egy d) szerinti DNS-molekula legalább egy, a TGF-β családba tartozó érett fehérjét kódoló részt tartalmaz.

A találmány további kiviteli alakjait a 2-10. igénypontok tárgyai képezik. A találmány további ismérvei és előnyei az előnyben részesített kiviteli fonnák leírásából és az ábrákból derülnek ki. A következőkben a szekvenciavázlatokat és az ábrákat írjuk le röviden.

Az 1. számú szekvenciavázlat az MP-52 TGF-β fehérjét kódoló DNS teljes nukleotidszekvenciáját ábrázolja. Az ATG startkodon a 64C nukleotiddal kezdődik. Az érett fehéije startja az 1782. nukleotid mögött kezdődik.

A szekvencia típusa: nukleinsavszekvencia.

A szekvencia hossza: 2703 nukleotid.

New és eredete: MP-52 DNS.

HU 219 504 Β

A 2. számú szekvenciavázlat az MP-52 TGF-β fehérje teljes aminosavszekvenciáját mutatja, melyet az

1. számú szekvenciavázlatban bemutatott nukleotidszekvenciából vezettünk le.

A szekvencia típusa: aminosavszekvencia.

A szekvencia hossza: 501 aminosav.

Neve és eredete: MP-52 fehérje.

Az 1. ábra az MP-52 és a BMP fehéijecsalád néhány tagja aminosavszekvenciájának összehasonlítása a hét állandó ciszteinmaradék közül az elsőtől kiindulva. A * azt jelenti, hogy az aminosav minden összehasonlított fehérjében ugyanaz; + azt jelenti, hogy az aminosav az ΜΡ-52-vel összehasonlított fehérjék legalább egyikében megegyezik.

A 2. ábra a találmányban felhasznált oligonukleotid-primerek nukleotidszekvenciáit ábrázolja, és ezeknek a szekvenciáknak a TGF-β család ismert tagjaival történő összehasonlítását. A betűk közül az M A-t vagy C-t jelent, az 5 C-t vagy G-t, az R A-t vagy G-t és K G-t vagy T-t. A 2a. ábra az OD primer, a 2b. ábra az ÓID primer szekvenciáját mutatja be.

A 3. ábra jelmagyarázata a következő:

M: előzetesen megfestett fehérjemolekulatömeg-marker a feltüntetett molekulatömegekkel (Gibco BRL #26041-020)

1: Sejttenyészet-felülúszó (100 μί) rekombináns vírussal (inzertált MP-52 cDNS-t tartalmazó) történt fertőzés után redukálóközegben (1% β-merkaptoetanol)

2: Sejttenyészet-felülúszó (100 μί) vad típusú vírussal (idegen DNS-inzert nélkül) történt fertőzés után redukálóközegben (1% β-merkapto-etanol)

3: Sejttenyészet-felülúszó (500 μί) rekombináns vírussal (inzertált MP-52 cDNS-t tartalmazó) történt fertőzés után nem redukáló közegben

4: Sejttenyészet-felülúszó (500 μί) vad típusú vírussal (idegen DNS-inzert nélkül) történt fertőzés után nem redukáló közegben).

Az 5. ábra tárgya:

Meszet a teljes implantátumon keresztül (26 nappal a beültetés után) von Kossá szerint megfestve. A mineralizált szövet egyértelműen feketén kiemelkedik a környező izomszövetből.

A 6. ábra tárgya:

Metszet az implantátumból (26 nappal a beültetés után) Masson-Goldner szerint megfestve.

1: Szegély osteoblastokból (eredetiben rózsaszín)

2: Ostecid (eredetiben piros)

3: Mineralizált csontszövet (eredetiben zöld) osteocytákkal (eredetiben rózsaszín)

4: Csontvelő (eredetiben rózsaszíntől narancsig).

A találmány magában foglalja legalább az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott nukleotidszekvenciának az érett fehéijét kódoló részét és adott esetben további funkciós részeit, valamint ennek a szekvenciának a genetikai kód degenerációja keretein belül megfelelő nukleotidszekvenciákat és ilyen szekvenciák allélszármazékait. A találmány magában foglal továbbá a fenti szekvenciákkal hibridizáló szekvenciákat azzal a feltétellel, hogy egy ilyen DNS-molekula legalább egy, a

TGF-β családba tartozó érett fehérjét kódoló részt teljes egészében tartalmaz.

A „funkciós rész” kifejezés a találmány szerinti értelmezésben egy olyan fehérjerészt jelent, amely például szignálpeptid-, előpeptid-, illetve érett fehérjerészként képes működni, azaz az MP-52 természetes fehérjerészeinek legalább egy biológiai szerepét betölteni.

A fehérje érett részét kódoló terület az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott szekvencia 1783-2142. nukleotidok által határolt szakasza. Adott esetben a DNS-molekula magában foglalhatja még az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott szekvencia további funkciós részeit, nevezetesen a szignál- és/vagy előpeptidrészt kódoló nukleotidszekvenciákat. Különösen előnyös esetben a DNS-molekula tartalmazza a szignál- és előpeptidrészt és az érett fehérjerészt, azaz az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott szekvencia 640-2142. nukleotidjait. Másrészt a DNS-molekula az érett fehéijét kódoló rész mellett tartalmazhatja még más fehérjék

- különösen a TGF-β családba tartozó egyéb fehérjék, például a fent említett BMP-fehérjék - funkciós szignálés/vagy előpeptidrészeit. A megfelelő nukleotidszekvenciák kivehetők a fent említett referenciákból, melyeknek közléseire itt hivatkozunk.

A találmány magában foglal továbbá egy olyan DNS-molekulát is, amely a fent definiálthoz képest kiegészítésként az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott szekvencia 1270-1271. nukleotidjai között egy nem kódoló intronszekvenciát tartalmaz. Ez az intronszekvencia a DSM-nél letétbe helyezett SKL 52 (H3) MP 12 plazmidban található, amely az MP-52 genomiális nukleotidszekvenciáját mutatja.

A találmány tartalmazza még az MP-52 fehérjék λ 15.1 fág által kódolt cDNS-szekvenciáját is. Ez a szekvencia az 1. számú szekvencia 321. nukleotidjával kezdődik.

Bár az alléi-, degenerált és hibridizálószekvenciák

- amelyek a találmányban benne foglaltatnak - a nukleotid- és/vagy aminosavszekvenciákban bekövetkezett jelentéktelen változások alapján szerkezeti különbségeket mutatnak, az ilyen szekvenciák által kódolt fehérjék lényegében ugyanazokkal a hasznos tulajdonságokkal rendelkeznek, amelyek lehetővé teszik alapjában véve ugyanazon gyógyászati alkalmazásoknál történő bevetésüket.

A találmány szerinti „hibridizáció” megjelölés az általában használatos hibridizációs körülményeket jelenti, előnyösen óxSSC sókoncentrációt 62-66 °C-nál, amelyet egyórás, 0,6xSSC és 0,1% SDS keverékével történő mosás követ 62—66 °C-on. Különösen előnyben részesítjük „hibridizáció” alatt a szigorúbb hibridizációs körülményeket, 4xSSC sókoncentrációt 62-66 °C-nál, amelyet egyórás, 0,1 χ SSC és 0,1% SDS keverékével történő mosás követ 62-66 °C-on.

A találmány előnyben részesített kiviteli alakjai olyan a fentiekben definiált DNS-szekvenciák, amelyek gerinces állatokból, előnyösen emlősökből - mint például sertésekből, tehenekből és rágcsálókból, mint például patkányokból vagy egerekből, és különösen felsóbbrendűekből, mint az emberből - nyerhetők ki.

HU 219 504 Β

A találmánynak egy különösen előnyben részesített kiviteli alakja az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott, ΜΡ-52-ként jelölt szekvencia. Az MP-52 transzkriptumait embrionális szövetekből nyertük, és ezek egy olyan fehéqét kódolnak, amely jelentős aminosavhomológiát mutat a BMP típusú fehérjék érett részével (lásd az 1. ábrát). A BMP2 (=BMP2A) és BMP4 (=BMP2B) fehérjék szekvenciáit Wozney és munkatársai írták le [Science 242, 1528-1534 (1988). A BMP5, BMP6 és BMP7 megfelelő szekvenciáit Leleste és munkatársai cikkében találjuk meg [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9843-9847 (1990). Néhány, az ismert BMP szekvenciákra specifikus tipikus szekvenciahomológiát találtunk az MP-52 elópeptidrészében is, miközben az MP-52 prekurzorrészének más részel jelentős eltéréseket mutatnak a BMP prekurzoroktól.

A találmány további tárgyát egy olyan vektor képezi, amely egy találmány szerinti DNS-molekulának legalább egy másolatát tartalmazza. Egy ilyen típusú vektorban a találmány szerinti DNS-szekvencia előnyösen operatívan egy expressziós kontrollszekvenciával van összekapcsolva. Ilyen vektorok alkalmasak TGF-β típusú fehérjék előállítására stabilan vagy átmenetileg transzformált sejtekben. A transzformációhoz és a hozzá kapcsolódó tenyésztéshez különböző állati, növényi, gomba- és baktériumsejt-rendszereket használhatunk. A találmány szerinti vektorok előnyösen tartalmazzák a gazdasejtben történő replikációhoz szükséges szekvenciákat, és önálló szaporodásra képesek. Továbbá olyan vektorok alkalmazását részesítjük előnyben, amelyek szelektálható markergéneket tartalmaznak, amelyek által egy gazdasejt transzformációja kimutatható.

A találmány további tárgyát egy olyan gazdasejt képezi, amelyet egy találmány szerinti DNS-sel vagy egy találmány szerinti vektorral transzformáltunk. A példák megfelelő gazdasejtekre magukban foglalnak különböző eukarióta- és prokariótasejteket, mint például E. colit, rovarsejteket, növényi sejteket, emlősök sejtjeit és gombákat, mint például az élesztőt.

A találmány további tárgyát egy olyan, a TGF-β családba tartozó fehéije képezi, amelyet egy, az 1. igénypont szerinti DNS-szekvencia kódol. A találmány szerinti fehéqe előnyösen a 2. számú szekvenciavázlatban bemutatott aminosavszekvenciával rendelkezik és olyan biológiai tulajdonságokat mutat, mint például szövetinduktív, különösen csontinduktív és/vagy mitogén képességet, amelyek esetleg egy terápiás felhasználásnál meghatározóak. A fehéqe fent említett ismertető jegyei homodimerek vagy heterodimerek képződésétől függően változhatnak. Az ilyen szerkezetek klinikai felhasználásra szintén alkalmasnak bizonyulhatnak.

A találmány szerinti fehéijék biológiai sajátságait, különösen a mitogén és csontinduktív képességüket, meghatározhatjuk például Seyedin és munkatársai vagy Sampath és Reddi vizsgálatai alapján [Seyedin et al, *PNAS 82, 2267-2271 (1985); Sampath and Reddi, PNAS 78, 7599-7603 (1981)].

*PNAS=Proc. Natl. Acad. Sci. USA

A találmány további tárgyát egy, a TGF-β családba tartozó fehéqe előállítására szolgáló eljárás képezi, azzal jellemezve, hogy egy - találmány szerinti DNS-sel vagy találmány szerinti vektorral transzformált - gazdasejtet tenyésztünk, és a TGF-β fehéqét a sejtből és/vagy a tenyészet felülúszójából kinyeqük. Egy ilyen eljárás magában foglalja a transzformált sejtnek megfelelő tápoldatban történő tenyésztését és az előállított TGF-β típusú fehéijének a tisztítását. Az eljárás ily módon lehetővé teszi a kívánt fehéqe elegendő mennyiségének előállítását olyan gyógyászati kezelésnél történő beadáshoz vagy sejttenyésztéses technikák alkalmazásánál, amelyeknél növekedési faktorokra van szükség. A gazdasejt lehet baktérium, mint például Bacillus vagy E. coli, gomba, mint például élesztő, növényi sejt, mint például dohány, burgonya vagy Arabidopsis, vagy állati sejt, különösen gerinces sejtvonal, mint például Mo-, COS- vagy CHO-sejtvonalak, vagy rovarsejtvonal.

A találmány még további tárgyát olyan gyógyszerkészítmények előállítása képezi, amelyek gyógyászatilag hatásos mennyiségben tartalmaznak egy találmány szerinti TGF-β típusú fehéqét hatóanyagként. Egy ilyen készítmény adott esetben gyógyászatilag elfogadható hordozó-, segéd-, hígító- vagy töltőanyagot tartalmaz. Egy ilyen gyógyszerkészítmény felhasználható sebek gyógyításánál és szövetek regenerálásánál, valamint csont-, porc-, kötőszövet-, bőr-, nyálkahártya-, hám- vagy fogsérüléseknél és fogbeültetéseknél egymagában vagy más. hatóanyagokkal - például a TGF-β családba tartozó más fehéqékkel vagy növekedési faktorokkal, mint például EGF-fel (EGF=epidermal growth factor=hámeredetű növekedési faktor) vagy PDGF-fel (PDGF=platelet derived growth factor=vérlemezke-eredetű növekedési faktor) - kombinálva. Ezenkívül egy ilyen gyógyszerkészítmény felhasználható a betegségmegelőzésben, mint például az osteoporosis (csontritkulás) és az arthrosis (nem gyulladásos ízületi betegség) megelőzésében.

Egy másik lehetséges klinikai alkalmazása a találmány szerinti TGF-β családba tartozó fehéijéknek szervátültetéseknél a kilökődés megakadályozására immunszuppresszorként vagy az angiogenezissel összhangban történő beadás. A találmány szerinti gyógyszerkészítmény megelőző kezelésként vagy a plasztikai sebészetben is felhasználható. Továbbá a készítmény felhasználása nem korlátozódik a humán gyógyászatra, hanem állatokra különösen háziállatokra is kiteijedhet.

Végül a találmány további tárgyát egy olyan antitest képezi, amely a találmány szerinti fehérjékhez specifikusan kötődni tud, vagy egy ilyenfajta antitestfragmentum (például Fab vagy Fab’). Az ilyen specifikus antitest vagy antitestfragmentum előállítására vonatkozó eljárás az átlagszakember általános szaktudásához tartozik. Egy ilyen antitest előnyösen monoklonális antitest. Az ilyen antitestek vagy antitestfragmentumok diagnosztikai módszerekhez is alkalmasak lehetnének.

A továbbiakban a találmányt a következő példán keresztül szemléltetjük.

1. példa

Az MP-52 izolálása

1.1. Összes RNS-t izoláltunk humán embrionális szövetből (8-9 hetes) Chirgwin és munkatársai módszere

HU 219 504 Β szerint [Biochemistry 18, 5294-5299 (1979)]. A poli(A+)-RNS-t oligo(dT)-kromatográfiával választottuk el az összes RNS-től a gyártó előírásai szerint [Stratagene Poly(A) Quick-Sáulen],

1.2. A reverz transzkripciós reakcióhoz 1-2,5 pg poli(A+)-RNS-t 5 percre 65 °C-ra hevítettük, és gyorsan jéghidegre lehűtöttük. A reakciókeverék 27 E RNSGuard (Pharmacia), 2,5 pg oligo(dT)12-18 (Pharmacia), 5xpuffer (250 mmol/1 Tris-HCl pH 8,5, 50 mmol/1 MgCl₂, 50 mmol/1 DTT, 5 mmol/1 minden dNTP-ból, 600 mmol/1 KC1) és poli(A+)-RNS pg-onként 20 E AMV reverz transzkriptáz (Boehringer Mannheim) keverékéből állt. A reakciókeveréket (25 pl) 2 órán át 42 °C-on inkubáltuk.

1.3. A 2. ábrán bemutatott OD és ÓID dezoxinukleotidprimereket automata DNS-szintetizálóban (Biosearch) állítottuk elő. A tisztítás denaturáló poliakrilamidgélelektroforézissel és a főcsoportnak a gélből izotachoforézissel végzett izolálásával történt. Az oligonukleotidokat a TGF-β család ismert tagjainak nukleinsavszekvenciáit összevetve és a legállandóbb területek kiválasztásával terveztük meg. Ennek a területnek egy összehasonlítását mutatjuk be a 2. ábrán. A klónozás megkönnyítésére mindkét nukleotid tartalmazott EcoRI restrikciós hasítási helyeket, és az OD kiegészítésképpen egy Ncol restrikciós hasítási helyet az 5’ -végén.

1.4. A PCR-reakciónál 20 ng poli(A+)-RNS-nek megfelelő cDNS-t használtunk fel kiindulási anyagként. A reakciót 50 pl térfogatban végeztük el, amely lxPCR-puffer [16,6 mmol/1 (NH₄)₂SO₄, 67 mmol/1 Tris-HCl, pH 8,8, 2 mmol/1 MgCl₂, 6,7 pmol/l EDTA, 10 mmol/1 β-merkapto-etanol, 170 pg/ml marhaszérum-albumin (Gibco), 200 pmol/l minden dNTP-ból (Pharmacia), 30 pmol minden oligonukleotidból (OD és ÓID)] és 1,5 E Taq-polimeráz (AmpliTaq, Perkin Elmer Cetus) keverékét tartalmazta. A reakcióelegyre paraffint rétegeztünk, és 40 PCR-ciklusnak vetettük alá. A PCR-reakció termékeit fenol/kloroformos extrakcióval tisztítottuk, és etanolos kicsapással töményítettük.

1.5. A PCR-reakció termékét Sphl (Pharmacia) és AlwNI (Biolabs) restrikciós enzimekkel hasítottuk a gyártó előírásai szerint.

1.6. A restrikciós enzimekkel történt hasítás termékeit agarózgél-elektroforézissel frakcionáltuk. Etidium-bromidos színezés után a nem hasadt megsokszorozott termékeket (Amplifizierungsprodukte) kivágtuk a gélből, és fenolos extrakcióval izoláltuk. A kapott DNS-t végül kétszeri fenol/kloroformos extrakcióval tisztítottuk.

1.7. Egy etanolos kicsapás után az izolált DNS negyedét vagy ötödét újrasokszoroztuk, ahol ugyanazokat a körülményeket alkalmaztuk, mint az első sokszorozásnál, azzal az eltéréssel, hogy a ciklusok számát 13-ra csökkentettük. Az újbóli sokszorozás termékeit tisztítottuk, a fent említett enzimekkel hasítottuk, és a nem hasadt termékeket - amint azt fent a sokszorozott termékekre részleteztük - agarózgélből izoláltuk. Az újbóli sokszorozási kétszer ismételtük.

1.8. A gélből történő utolsó izolálás után a sokszorozott termékeket 4 E EcoRI (Pharmacia) segítségével hasítottuk a gyártó által ajánlott körülmények között. A restrikciós keverék negyedét az EcoRI-gyel hasított pBluescriptll SK+ (Stratagene) vektorba ligáltuk. A ligálás után 24 kiónt szekvenálással továbbanalizáltunk. Az AlwNI-gyel és SphI-gyel hasított minta egy új szekvenciát eredményezett, amelyet ΜΡ-52-vel jelöltünk. A többi klón túlnyomórészt BMP6 szekvenciákat tartalmazott, és egy tartalmazott BMP7 szekvenciát.

A kiónt a cDNS 3’-végével egészítettük ki a Frohmann által részletesen leírt módszer [Amplifications, Perkin Elmer Corp., Issue 5, 11-15 (1990)] szerint. Ugyanazt az embrionális RNS-t, amelyet előzőleg az MP-52 első fragmentumainak izolálására felhasználtunk, a fent leírtak szerint reverz transzkripciónak vetettük alá. A sokszorozás az MP-52 szekvencia adapterprimerének (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG) és egy belső primerének (CTTGAGTACGAGGCTTTCCACTG) felhasználásával történt. A sokszorozott termékeket az MP-52 szekvencia egy átfedő adapterprimerének (ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG) és egy átfedő belső primerének (GGAGCCCACGAATCATGCAGTCA) felhasználásával újra megsokszoroztuk. Az újbóli sokszorozás termékeit Ncol-gyel történt restrikciós hasítás után egy ugyanolyan módon hasított vektorba [pUC 19 (Pharmacia Nr. 27-4951-01) megváltoztatott többszörös klónozóhellyel, amely egy Ncol restrikciós hasítási helyet tartalmaz] klónoztuk és szekvenáltuk. A kiónokat az ismert MP-52 szekvencia 3’-végével történő szekvencia-átfedésük alapján jellemeztük. Egyet közülük szondaként használtunk fel egy humán genomiális génbank (Stratagene Nr. 946203) screenelésére Ausubel és munkatársainak részletesen leírt [Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley-Interscience (1989)] módszere szerint. 8 χ 10⁵ λ-fágból izoláltunk egy fágot (λ 2.7.4), amely egy körülbelül 20 kb inzertet tartalmaz, és a DSM-nél a 7387. szám alatt helyeztük letétbe. Ez a klón a mRNS-ből a leírt sokszorozási módszerek szerint izolált szekvencia mellett további szekvenciainformációkat tartalmaz az 5’-végen.

A szekvenciaanalízishez egy körülbelül 7,5 kb HindlII-fragmentumot egy ugyanolyan módon hasított vektorba (Bluescript SK, Stratagene Nr. 212206) szubklónoztunk. Ezt az SKL 52 (H3) MP12 jelű plazmidot szintén a DSM-nél helyeztük letétbe 7353. szám alatt. Az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott szekvenciainformáció a λ 2.7.4. fágból ered. A 640. helyzetben levő ATG az első ATG a leolvasási kereten belül (a 403. helyzetben egy stopkodon található). A szekvenciaadatok alapján feltehető, hogy ennél a transzláció startkodonjáról van szó.

A genomiális DNS egy körülbelül 2 kb intront tartalmaz az 1. számú szekvencia 1270. és 1271. bázispárjai között. Az intron szekvenciáját nem mutatjuk. Az illesztési hely (Splicestelle) helyességét egy olyan sokszorozott termék szekvenálásával állapítottuk meg, amely ebben a régióban található cDNS-ből ered. Ezeket a szekvenciainformációkat egy kissé módosított módszer segítségével kaptuk, amelyet részletesen Frohman [Amplifications, Perkin Elmer Corp., Issue 5, 11-15 (1990)]

HU 219 504 Β írt le. Ugyanazt az embrionális RNS-t, amelyet az MP-52 3’-végeinek izolálásához is felhasználtunk, az MP-52 szekvenciának egy belső, 5’-irányba mutató primerje (ACAGCAGGTGGGTGGTGTGGACT) behelyezésével reverz transzkripciónak vetettük alá. Az első cDNS-szál 5’-végéhez egy poliA-farkat illesztettünk terminális transzferáz segítségével. Kétlépéses sokszorozási végeztünk, először egy oligo(dT)-ből és egy adapterszekvenciából álló primer [AGAATTCGCATGCCATGGTCGACGAAGC (TI6)], és másodszor egy adapterprimer (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG) és az MP-52 szekvencia belső printerének (CCAGCAGCCCATCCTTCTCC) felhasználásával. A sokszorozott termékeket ugyanazon adapter primerek és az MP-52 szekvencia egy átfedő belső printerjének (TCCAGGGCACTAATGTCAAACACG) alkalmazásával újra megsokszoroztuk. Végül az újbóli sokszorozás termékeit egy átfedő adapterprimer (ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG) és az MP-52 szekvencia egy átfedő belső primerjének (ACTAATGTCAAACACGTACCTCTG) felhasználásával újra megsokszoroztuk. Az újrasokszorozott termékeket sima véggel egy olyan vektorba (Bluescript SK, Stratagene Nr. 212206) klónoztuk, amelyet előzőleg EcoRV-tel hasítottunk. A kiónokat a λ 2.7.4. DNS-ével való szekvenciaátfedésük alapján jellemeztük.

Továbbá humán fibroblasztok RNS-éből előállított és XgtlO-be klónozott cDNS-bankot screeneltünk. 2xl0⁶ fágot teszteltünk, ahol radioaktív szondaként a genomiális MP-52 DNS-ének egy körülbelül 1 kb nagyságú fragmentuma (2. exon a HindlII restrikciós hasítási helyig a 3’-nem transziáit területen) szolgált. Kiemeltünk 17 keverékplakkot, amelyeket az MP-52 szekvencia 5’- és 3’-területéről való primerek felhasználásával PCR-rel vizsgáltunk meg. Ezután 8 fágplakkot választottunk ki, és szétválogattuk azokat. A cDNS-t a fágokból EcoRI-gyel történő részleges hasítás révén izoláltuk, és a szintén EcoRI-gyel hasított Bluescript vektorba klónoztuk.

Egy eredményül kapott plazmid, az SK52L15.1MP25 szekvenálása azt mutatta, hogy a leghosszabb fág (15.1) az 1. számú szekvencia 321. nukleotidjánál kezdődik. Továbbá a szekvenálással megállapítottuk az illesztési helyet (1270. nukleotid).

Az SKL 52 (H3) MP12 plazmidot 7353. letéti szám alatt a DSM-nél (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig) helyeztük letétbe 1992. december 10-én.

A λ 2.7.4. fágot a 7387. letéti szám alatt helyeztük letétbe a DSM-nél 1993. január 13-án.

Az SK52L15.1MP25 plazmidot a 8421. letéti szám alatt helyeztük letétbe a DSM-nél 1993. július 16-án.

2. példa

Az MP-52 kifejezése

Az MP-52 kifejezésére különböző rendszereket teszteltünk. Vacciniavírusok expressziós rendszerként való felhasználását részletesen és a szakember számára megvalósíthatóan írják le a Current Protocols in Molecular Biology [Ausubel et al., Greene Publishing Associates and Twiley-Interscience, Wiley & Sons], a következőkben CP-vel rövidítve, 16. fejezetének 16.15-16.18-ig teijedő részében. A rendszer azon alapszik, hogy bizonyos vektorok alkalmazásával, homológ rekombinációval idegen DNS építhető be a vacciniavírus genomjába. E cél érdekében az alkalmazott vektor tartalmazza a TK (timidin kináz) gént a vacciniagenomból. Rekombináns vírusok szelekciójának lehetővé tételére a vektor tartalmazza továbbá az E. coli xantin-guanin-foszforibozil-transzferáz (gpt) gént [Falkner et al., J. Virol. 62, 1849-1854 (1988)]. Ebbe a vektorba klónoztuk a cDNS-t az ΜΡ-52-t kódoló összes területtel együtt. A cDNS az SK52L15.1MP25 plazmidból (DSM, 8421. letéti szám alatt) származik, amelyet azonban az 5’-nem transziáit terület nagy részének eltávolítására mindenekelőtt kivágtunk, és átmenetileg klónoztunk. Ehhez az SK52L15.1MP25 plazmidot Sall-gyel linearizáltuk, és az 5’-véget lépcsőzetesen, az ExoIII/ /Mung Beán Kit (Stratagene #200330) segítségével a gyártó utasításai szerint kivágtuk. BamHI-gyel történő restrikciós hasítás után a különböző szélességben kivágott MP-52 cDNS-eket agarózgélen a maradék vektortól elválasztottuk, izoláltuk és standard módszer szerint [Sambrook et al., Molecular Cloning, 2. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] egy EcoRV-tel és BamHI-gyel hasított pBluescript II SK vektorba (Stratagene #212206) klónoztuk átmenetileg (pSK52s). Az összes restrikciós hasítást a gyártó utasításai szerint végeztük. A szekvenázzal (USB/Amersham #70770) végzett szekvenálás többek között egy olyan kiónt eredményezett, amely az 1. számú szekvenciában az 576. nukleotiddal (64 bázispár távolságban a startkodontól) kezdődik. Ebből izoláltuk Sáli és SacI restrikcióval a cDNS-t és az ugyanígy hasított vektorba klónoztuk a vaccinia rekombinációjához. Az eredményül kapott plazmidot (pBPlMP52s) letétbe helyeztük a DSM-nél (9217. letéti szám alatt) 1994. május 24-én és rekombináns vacciniavírusok előállításához alkalmaztuk. Ehhez 80%-ban összefüggő 143B sejteket (HuTk-, ATCC CRL 8303) fertőztünk 35 mm-es tenyésztőcsészében 2 ml PBS-ben előkészített vad típusú vacciniavírussal (1 vírus/10 sejt), 30 percig szobahőmérsékleten történő alkalmankénti rázogatással. A felülúszó leszívása és 2 ml szaporító tápoldat (MÉM, Gibco BRL #041-01095) hozzáadása után 37 °C-on 2 órán át inkubáltuk. Ezután eltávolítottuk a tápoldatot, és ezeket a sejteket 1 ml MEM-be bemért 100 ng pBPlMP52s, 2 pg hordozó-DNS (borjútímusz, Boehringer Mannheim #104175) és 10 μΐ lipofektin (Gibco BRL #18292-011) keverékével transzformáltuk 37 °C-on, 15 órán át. 20% FCS-t (Gibco BRL #011-06290) tartalmazó 1 ml MÉM hozzáadása után további 24 órán át inkubáltuk 37 °C-on, majd a lizált sejteket lefagyasztottuk.

Az egyes rekombináns vírusok xantin-guanin-foszforibozil-transzferázra történő gpt szelekciója, izolálása és megsokszorozása lényegében a CP 16.17. részében leírtak szerint történt, azzal a különbséggel, hogy RK13-sejteket (ATCC CCL 37) használtunk.

HU 219 504 Β

Az MP-52 cDNS beépülését a vírus genomjába Dót biot- és Southern blot-analízissel (CP 16.18. rész) állapítottuk meg. Egy rekombináns vírust expressziós analízisre a 143B sejtvonalba (HuTk-, ATCC CRL 8303, ember) vittünk be. Az egybefüggő sejteket a sejtszámnak megfelelő mennyiségű vírussal fertőztük 45 percig 37 °C-on, majd hozzáadtuk a 10% FCS- és penicillin/sztreptomicin [1:500, Gibco BRL #043-05140H)] tartalmú, megfelelő szaporító tápoldatot (MÉM, Gibco BRL #041-01095). 6 órás 37 °C-on tartás után a tápoldatot eltávolítottuk, a sejteket kétszer mostuk például HBSS-sel (Gibco BRL #042-04180M), és FCS nélküli termelő tápoldatot (például MEM-et) adtunk hozzá. 20-22 órás termeltetés után a sejtek felülúszóját összegyűjtöttük. A kifejeződés vizsgálatát Western blottal végeztük standard módszerek alapján (CP 10.8. rész). Ehhez 100-500 μΐ sejtkultúra-feKilúszóból a fehérjéket ekvivalens térfogat aceton hozzáadásával és legalább egyórás jégen tartással kicsaptuk és lecentrifugáltuk. A pelleteknek egy felvevőpufferben (7 M karbamid, 1% SDS, 7 mM nátrium-dihidrogén-foszfát, 0,01 brómfenolkék és adott esetben 1% β-merkapto-etanol) történő újraszuszpendálását 15%-os poliakrilamid gélre történő felvitel követte. Markerfehérjeként egy megfestett fehérje-molekulatömeg-standardot (Gibco BRL #26041-020) alkalmaztunk. A PVDF-membránra (Immobilon #IPVH00010) való felvitelt és a membrán blokkolását standard módszerek szerint végeztük el.

Az MP-52 membránon történő kimutatásához MP-52 elleni poliklonális antitesteket állítottunk elő mind csirkékben, mind nyulakban. Ehhez az MP-52 érett részét 6 hisztidinnel az N-végen E. coliban kifejeztük és tisztítottuk, ahogyan azt például Hochuli és munkatársai leírták [Hochuli et al., BIO/Technology, 6, 1321-1325 (1988)]. Mindkét antitesttel specifikusan kimutatható az MP-52 kifejeződése, amelynél a dimer MP-52 felismerése kevésbé hatékony, mint a monomeré. A 3. ábrán bemutatott Western blothoz csirkeantitesteket használtunk, amelyeket PEG-precipitációval [Thalley et al., BIO/Technology 8, 934-938 (1990)] és membránhoz kötött antigénnel (érett MP-52 6 hisztidinnel) [18.17. in Sambrook et al., Molecular Cloning, 2. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] specifikusan megtisztítottunk. Második antitestként anti-csirke IgG-t alkalmaztunk hozzákapcsolt alkalikus foszfatázzal (Sigma A9171). A kimutatás Tropix Westem-Light Protein Detection Kittel (Serva #WL10RC) történt a gyártó utasításai szerint.

A 3. ábrán látható Western biot azt mutatja, hogy csak a rekombináns vírusoknál - a vad típusú vírusoknál (beépített idegen DNS nélküli) azonban nem - jelentek meg MP-52 specifikus sávok. Az MP-52 kifejeződése egy, a gélben nem redukáló körülmények között megjelenő, körülbelül 25 kD molekulatömegű kiválasztott fehérjét eredményez. Redukálókörülmények között a fehéije 14-15 kD-nál fut a gélben. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az MP-52 dimer érett fehérjeként fejeződik ki. A Western blot-nál a 60 kD fölötti területen fellépő gyenge sávok esetében valószínűleg el nem hasadt előfehéijék maradványairól van szó.

A futási viselkedés megerősíti ezenfelül a 2. számú szekvenciából levezethető elméleti molekulatömegeket, mely szerint a monomer MP-52 13,6 kD nagyságú.

Az MP-52 kifejeződése és az előfehérjék érett ΜΡ-52-vé történő hasadása bizonyíthatóan lehetséges különböző sejtvonalakban. Teszteltük a C127 (ATCC CRL 1616, egér), BHK21 (ATCC CCL 10, hörcsög), MRC-5 (ATCC CCL 171, ember) és 3T6-Swiss albínó (ATCC CCL 96, egér) sejteket.

Az MP-52 kifejeződését és érett ΜΡ-52-vé hasadását egy további eukarióta expressziós rendszerben is megmutattuk. Ehhez az MP-52 cDNS-ét (az 576. nukleotidtól kezdődően) a pSG5 expressziós plazmidba (Stratagene #216201) klónoztuk. A pSK52s plazmidot Clal-gyel és Xbal-gyel restrikciósán hasítottuk, és T4polimerázzal történő kezelés révén az MP-52 inzert áthajtó végeit tompává alakítottuk. Az EcoRI-gyel restrikciósán hasított és T4-polimerázos kezelés révén szintén tompa végű pSG5 vektorba történő klónozást standard módszerek szerint végeztük. Minden enzimes reakciót a gyártó utasításai szerint végeztünk. Az MP-52 inzert helyes irányát restrikciós analízissel és a T7 primerrel (Stratagene #300302) történő szekvenálással biztosítottuk. Az eredményül kapott pSG52s plazmid (1994, május 17-én a DSM-nél 9204. letéti szám alatt letétbe helyezve) együtt transzformálható egy olyan vektorral,, amely egy szelektálható markert kódol - mint például a G418-rezisztencia-gén - annak érdekében, hogy stabil sejtvonalakat kapjunk. E célból a pSG52s plazmidot a p3616 plazmiddal (1994. május 17-én a DSM-nél 9203. letéti szám alatt letétbe helyezve) együtt transzformáltuk L929 sejtekbe (ATCC CCL1, egér) lipofektinnel (Gibco BRL #18292-011) a gyártó utasításai szerint. A G418-cal végzett szelekció a szakember számára ismert módszerek szerint (CP 9.5. rész) történt, és olyan sejtvonalhoz vezetett, amely Western blotban kimutatható érett ΜΡ-52-t állít elő.

Az MP-52 kifejezésére egy további expressziós vektort állítottunk elő a pABWN plazmid [Niwa et al., Gene 108, 193-200 (1991)] (4. ábra) felhasználásával, amelyet Dr. Miyazaki bocsátott rendelkezésünkre.

Ehhez az 1. számú szekvencia 576. nukleotidjával kezdődő pSK52s plazmidból izoláltuk a HindlII fragmentumot, és az áthajtó végeket Klenow-fragmentummal kezelve tompa végűvé alakítottuk. Az adapter hozzákötésével a fragmentum mindkét végére egy-egy NotI restrikciós hasítási helyet vittünk be.

Adapter: AGCGGCCGCT

TCGCCGGCGA

A pABWN vektort Xhol-gyel restrikciósán hasítottuk, szintén Klenow-fragmentummal kezeltük, és borjúból származó bélrendszeri alkalikus foszfatázzal (Boehringer Mannheim) defoszforileztük. Ugyanazt a foszforilezett adaptert kötöttük hozzá oly módon, hogy az MP-52 fragmentum inszerciója Notl-gyel történő restrikciót követően lehetővé vált a vektoron létrehozott NotI hasítási helyre. Az eredményül kapott expressziós vektort ezt követően HindIII-MP52/pABWN-ként jelöltük. A klónozáshoz minden reakciót standard mód7

HU 219 504 Β szerek (például CP 3.16. rész) szerint végeztünk. A HindIII-MP52/pABWN expressziós vektor szerkezetét szekvenálással és restrikciós térképezéssel állapítottuk meg. A HindIII-MP52/pABWN tartalmazza az 1. számú szekvencia 576. nukleotidjával kezdődő és 2278. nukleotidjával végződő MP-52 szekvenciát. A HindIII-MP52/pABWN expressziós vektorral L-sejteket (egérfibroblasztokat) fertőztünk, és stabil transzformátumokat hoztunk létre belőlük. Ehhez minden esetben 4 ug plazmiddal (HindIII-MP52/pABWN-nel vagy pABWN-nel) fertőztünk 5χ10⁵ L-sejtet egy 6 cm-es tenyésztőcsészében 20 μΐ LipofectAMINE (Gibco BRL #18324012) reagens alkalmazása mellett. Ehhez az A oldatot (a mindenkori plazmid DNS 4 pgját 200 μΐ OPTI-MEM I-ben [Gibco BRL #31985)] óvatosan összekevertük a B oldattal (20 μΐ LipofectAMINE reagenst 200 μΐ OPTI-MEM I-ben), és szobahőmérsékleten 45 percig, a DNS-liposzóma komplex kialakulásáig inkubáltuk. Ezalatt a sejteket egyszer mostuk 2 ml OPTI-MEM I-gyel. Minden transzfekcióhoz 1,6 ml OPTI-MEM I-et adtunk a DNS-liposzóma komplexet tartalmazó edénybe. Az oldatot óvatosan összekevertük, és a mosott sejteket befedtük vele. A sejteket 5 órán át 37 °C-on inkubáltuk CO₂-atmoszférában a meghígított komplexszel. Az inkubálás után 2 ml DMEM (Gibco BRL, Dulbecco’s Modifiziertes Eagle Medium)/20% FCS tápoldatot adtunk hozzá. A transzfekció után 24 órával a tápoldatot friss DMEM/10% FCS-sel cseréltük le. A transzfekció kezdete után 48 órával 10 cm-es tenyésztőcsészébe vittük át a sejteket. A transzfekció kezdete után 72 órával 800 μΐ/ml koncentrációval kezdtük el a G418-szelekciót. A stabil kiónok 1 -2 hét elteltével jelentek meg.

Az egybefüggő transzformátumokról, amelyeket 3 napig egy 10 cm-es tenyésztőcsészében mostunk, 5 ml kondicionált DMEM-et kaptunk FCS-sel vagy a nélkül. A fertőzött sejtek 2 különböző sejttenyészetének (HindIII-MP52/pABWN és pABWN) felülúszóját, valamint a sejtlizátumot Western blottal vizsgáltuk. Érett MP52-t találtunk a kondicionált tápoldatban, valamint a HindIII-MP52/pABWN-nel fertőzött sejtek lizátumában, A kiónokat tovább klónoztuk, és az ΜΡ-52-t termelő sejteket minden esetben Western blot-analízissel válogattuk ki. A Western blot-analízisből történő becslések 1 mg/1 ΜΡ-52-termelést adtak.

3. példa

Az MP-52 biológiai aktivitása

Az MP-52 biológiai aktivitásának kimutatására és a találmány hasznosságának bizonyítására csontbetegségek elkerülésére és/vagy kezelésére irányuló gyógyászati alkalmazásoknál több in vitro és in vivő kísérletet végeztünk el.

1. In vitro vizsgálatok

1.1. Mivel a glükóz-amino-glükán (GAG) szintézisének fokozódását a kondrocitákban (chondrocyte=porcsejt) TGF-P-stimulációval magyarázzák [Hiraki et al., Biochimica et Biophysica Acta 969, 91-99 (1988)], megvizsgáltuk, vajon az MP-52 szintén kiváltja-e ezt a hatást. ΜΡ-52-t termelő L-sejt-transzformátumok (HindIII-MP52/pABWN-nel transzformálva) sejttenyészet-felülúszójának (DMEM 10% FCS-sel) felhasználásával teszteltük az MP-52 kondrogén aktivitását patkánymagzatvégtagok primer tenyészetében.

Ehhez 16 napos patkánymagzatok négy végtagját használtuk fel. A tripszinnel történt kezelés után nyert sejteket 10% FCS-sel kiegészített F-12 tápoldatban (Nutrient Mixture Ham’s F-12, Gibco BRL #21700) I típusú kollagénnel bevont, 24 mélyedést tartalmazó lemezre szélesztettük ki (3 χ 10⁵ sejt), és körülbelül 2 napig, egybefüggő sejttenyészet kialakulásáig tenyésztettük. 500 μΐ szaporító tápoldathoz (F-12 tápoldat 10% FCS-sel) HindIII-MP52/pABWN-nel fertőzött Lsejteknek, pABWN-nel fertőzött L-sejteknek minden esetben 56 μΐ kondicionált tápoldatát (KM) adtuk, vagy csak 56 μΐ tápoldatot (DMEM 10% FCS-sel). 0, 3, 6 és 9 napos időtartamra F-12 tápoldatot alkalmaztunk 10% FCS-sel, valamint a megfelelő kiegészítőkkel. Minden 3 napban kicseréltük a tápoldatot a megfelelő kiegészítőkkel együtt. Ezután a tenyészetet további 2 napig FCS nélküli F-12 tápoldatban, a megfelelő kiegészítők (kondicionált tápoldatok, illetve kontrolltápoldat) jelenlétében szaporítottuk, és utána 6 órára ³⁵Sszulfátot adtunk hozzá. A poliszacharidba beépült ³⁵S-t Pronase E-vel történő emésztést és kicsapást követően Hiraki és munkatársai leírása [Biochimica et Biophysica Acta 969, 91-99 (1988)] szerint mértük.

1. táblázat

Radioaktivitás (cpm/mélycdés)
Inkubációs napok száma	Kontroll-L-sejtek DMEM (10% FCS)	pABWN-nel fertőzött L-sejtek kondicionált tápoldata	HindIII-MP52/pABWN-nel fertőzött L-sejtck kondicionált tápoldata
2	3720+114	3865+120	4879+422
5	4188+135	4154+29	8223+275*
8	3546+160	3310+115	9890+1260*
11	3679+218	3633+167	7520+160*

Az értékek 3 vagy 4 szaporítási tétel±S. E. M.-re vonatkoznak.

* p<0,01 DMEM-mmel és pABWN-nel fertőzött L-sejtek kondicionált tápoldatához viszonyítva (Scheffe többszörös t-próbája).

HU 219 504 Β

Amint azt az 1. táblázat mutatja, az ΜΡ-52-t termelő transzformátumok sejttenyészeteinek felülúszói, összehasonlítva a tiszta tápoldattal (DMEM 10% FCS-sel) vagy a pABWN-nel fertőzött L-sejtek felülúszójával, szignifikánsan stimulálják a GAG-szintézist. Ez azt mutatja, hogy az MP-52 képes stimulálni a kondrocitadifferenciálódást.

1.2. A BMP család néhány tagjának egy, már leírt hatása az alkalikus foszfatáz (ALP)-aktivitás fokozása az osteoblasztokban (csontcsírasejtekben). A ROB-C26 (C-26) klonális patkánysejtvonal a relatív korai érési stádiumú osteoblasztokhoz tartozik [Yamaguchi et al., Calcif. Tissue Int. 49, 221-225 (1991)]. Csontinduktív fehérjékre, mint például a ΒΜΡ-2-re, leírták az ALPaktivitás növelésének képességét [Yamaguchi et al., J. Cell Bioi. 113, 681-687 (1991)].

Az ΜΡ-52-nek a C26-sejtekre gyakorolt hatását a következők szerint vizsgáltuk. A C26-sejteket 3 χ 10⁴ sejt/mélyedés mennyiségben 24 mélyedést tartalmazó lemezre szélesztettük ki, és α-MEM (Gibco BRL)/10%

FCS tápoldatban egybefüggő tenyészet eléréséig szaporítottuk. Mélyedésenként az ΜΡ-52-t termelő L-sejt5 transzformátumok (HindIII-MP52/pABWN), illetve a pABWN-nel fertőzött L-sejttenyészet felülúszójának 56-56 μΐ-ét, vagy csak L-sejttenyészet felülúszójának (DMEM/10% FCS) 56 μΐ-ét adtuk a C-26 sejtszaporító tápoldat 500 μΐ-éhez. 3 naponként végeztünk egy10 egy tápoldatcserét a megfelelő kiegészítőkkel együtt. Az ALP-aktivitást a sejtkivonatokban 0, 3, 6, 9 és 12 nap elteltével p-nitro-fenil-foszfáton mint szubsztráton alapuló standard technikák segítségével határoztuk meg, ahogyan azt például Takuwa és munkatársai leír15 ták [Takuwa et al., Am. J. Physiol. 257, E797-E803 (1989)].

2. táblázat

ALP-aktivitás (nmol/perc) mélyedésenként
Inkubációs napok száma	Kontroll- L-sejtek DMEM (10% FCS)	pABWN-nel fertőzött L-sejtek kondicionált tápoldata	HindlII-MP52/pABWN-nel fertőzött L-sejtek kondicionált tápoldata
0	41,8±2,8	41,8±2,8	41,8±2,8
3	136,3±3,7	125,8±2,3	181,3± 14,2*
6	129,0±7,8	119,3±6,4	258,0±8,3*
9	118,4±3,7	110,l±2,8	258,4± 10,6*
12	121,2±3,2	125,3±6,0	237,8±ll,O*

Az értékek 4 szaporítási tétel±S.D.-re vonatkoznak.

* p<0,01 DMEM és pABWN-nel fertőzött L-sejtek kondicionált tápoldatához viszonyítva (Scheffe többszörös t-próbája).

Amint azt a 2. táblázat mutatja, az ALP-aktivitás MP-52 hozzáadásával szignifikánsan nő a tiszta DMEM/10%

FCS tápoldatával és a pABWN-nel fertőzött L-sejtek tápoldatával összehasonlítva. Ez az eredmény azt mutatja, 40 hogy az MP-52 nemcsak a kondrociták differenciálódását, hanem az osteoblastok differenciálódását és érését is befolyásolhatja.

Egy további osteoblast-sejtvonal (MC3T3-E1, egér), amely Takuwa és munkatársai leírása szerint 45 [Biochem. Biophys. Rés. Com. 174, 96-101 (1991)] ΒΜΡ-2-vel kezelve az ALP-aktivitás növekedését mutatja, az ΜΡ-52-t termelő L-sejt-transzformátumok (HindIII-MP52/pABWN) kondicionált tápoldatával vagy rekombináns vacciniavírus-fertőzéssel kiváltott 50 ΜΡ-52-termelés utáni tápoldattal történő inkubálás után semmiféle változást nem mutat az ALP-aktivitásban. Ez arra utal, hogy az MP-52 részben a ΒΜΡ-2-től eltérő sejtspecifitással rendelkezik. A különböző célhelyek által feltételezett eltérő funkciók az egyes TGF-β 55 családtagok számára komoly gyógyászati jelentőséggel bírhatnak.

2. In vivő kísérletek

2.1. A legmegbízhatóbb lehetőség a csontfejlődés vizsgálatára az in vivő ektópiás csontképződésen alapul. 60

Ez kiváltható például ásványi anyagoktól megfosztott csontmátrix beültetésével [Urist, Science 150, 893-899 (1965)]. Inaktív mátrixnak csontindukáló fehérjékkel történő kombinációja révén kiválthatjuk ugyanezt a folyamatot, ahogyan azt például Sampath és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7599-7603 (1981)] leírták. Ez a csontképződési folyamat hasonlít az embrionális endokondrális (porcon belüli) csontképződéshez és a felnőttcsont -yógyuláshoz. Tehát ez a módszer lehetőséget nyújt fehéqék csontindukáló képességének in vivő vizsgálatára.

Egy ilyen kísérlethez vacciniarendszerben (lásd a 2. példát) kifejezett és kinyert MP-52 fehéqét részlegesen tisztítottunk és beültettük. Ehhez 143B sejteket (HuTk-, ATCC CRL 8303) szaporítottunk tenyésztőcsészében és rázatott lombikban egybefüggő tenyészet eléréséig és - ahogyan azt a 2. példában az expressziós analízisnél leírtuk - rekombináns vírusokkal fertőztük, mostuk és körülbelül 20 órán át hagytuk az ΜΡ-52-t MÉM tápoldatban (Gibco BRL, körülbelül 1 ml/10⁶sejt) akkumulálódni. Kontrollként ugyanazt az összetételt alkalmaztuk a vírus vad típusával fertőzve. A sejttenyészet felülúszóját (kondicionált tápoldat) minden tételből összegyűjtöttük és centrifugáltuk (40 000xg

HU 219 504 Β percig 4 °C-on). A vírusok eltávolítására a felülúszókat szervetlen szűrőn (0,1 pm pórusméretű, Whatman, Anotop 25) szűrtük át. Az MP-52 jellemzése során meg tudtuk mutatni, hogy ez a fehéije heparin Sepharose-hoz kötődik. Ezt a tulajdonságát egy részleges tisztításhoz használtuk ki. Ehhez a szűrt és centrifügált, kondicionált tápoldatot 50 mM Tris pH 7,0, 100 mM NaCl és 6 M karbamid végső koncentrációra egészítettük ki, és egy előzőleg A pufferrel (50 mM Tris pH 7,0, 100 mM NaCl és 6 M karbamid) ekvilibrált heparinoszlopra (HiTrap™, Pharmacia #17-0407-01) vittük fel. A feltöltött oszlopot A pufferrel mostuk, és B puffer (50 mM Tris pH 7,0, 600 mM NaCl és 6 M karbamid) 100 lineáris gradiensével 0,5 ml/perc áramlási sebesség mellett, 50 percen belül eluáltuk (2,5 ml/ffakció). Karbamid használata nem elengedhetetlenül szükséges. A Western blot-analízis (lásd a 2. példát) során ellenőrizni tudtuk, hogy az MP-52 reprodukálhatóan főleg 2 frakcióban, körülbelül 250-400 mM NaCl-nál eluál. Ezeknek a frakcióknak kis részleteit szintén ezüsttel színezett 15%-os poliakrilamid gélben (Silver Stain-II, Daiichi #SE140000) vizsgáltuk meg a gyártó utasításai szerint, és a frakciókat összegyűjtöttük. Az összehasonlító frakciókat a vad típusú vírusfertőzést követően a kondicionált tápoldattól megtisztítva, ezüsttel színezett gélben végzett analízis után szintén összegyűjtöttük.

Az MP-52-vel végzett további kísérletekből adódott, hogy az MP-52 hidroxi-apatithoz is kötődik. Ezért elvileg el lehet érni egy kiegészítőtisztítást hidroxi-apatit-oszlopon, illetve helyettesíthetjük a heparinoszlopot hidroxi-apatit-oszloppal (például: BIO-RAD, Econopac HTP). Elképzelhetők további tisztításokhoz más, a szakember által ismert módszerek is, mint például gélszűrő oszlopok, ioncserélő oszlopok, affinitásoszlopok, fémkelát oszlopok vagy hidrofób kölcsönhatásokon alapuló oszlopok.

A heparin Sepharose kromatográfiával előtisztított MP-52 fehérjét, illetve a megfelelő, még fertőző fehérjéket, amelyek a vad típussal fertőzött sejttenyészetek felülúszóiban is megtalálhatók, tovább tisztítottuk reverz fázisú HPLC segítségével. Ehhez C8-oszlopot (Aquapore RP300, Applied Biosystems, részecskenagyság: 7 pm, pórusméret: 300 Á) használtunk, amelyet előzőleg 10% B pufferrel ekvilibráltunk (A puffer: 0,1% trifluor-ecetsav; B puffer: 90% acetonitril, 0,1% trifluor-ecetsav). Az oszlopot a heparinoszlopról összegyűjtött, ΜΡ-52-tartalmú frakciókkal történő feltöltése után alaposan átmostuk 10% B pufferrel. A megkötődött fehéijét a következő gradienssel eluáltuk: 10-50% B puffer 20 percig és 50-100% B puffer 50 percig. 500 pl-ig gyűjtöttünk frakciókat, és mind Western blottal, mind ezüsttel színezett gélben analizáltuk azokat. Az MP-52 fehéije a választott feltételek mellett körülbelül 55-65% acetonitrilnél eluál. Az ΜΡ-52-t tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük. Ugyanez történt a megfelelő kontrolltisztítások frakcióival, amelyeket a vad típusú vírussal fertőzött sejtek sejttenyészetének felülúszójából végeztünk el.

A részlegesen tisztított MP-52 fehérje Western blot-analízis alapján becsült 50 ng/ml koncentrációban az ALP-aktivitás egyértelmű növekedését mutatta ROB-C26-sejtekre 3 napos inkubálást követően.

Részlegesen tisztított MP-52 fehérjét, illetve a megfelelően részlegesen tisztított, vad típusú vírussal fertőzött sejttenyészet felülúszójából nyert kontrollfehérjét mátrixszal rekonstruáltunk, és beültettük patkányokba a porc- és csontképzés képességének bizonyítására.

Elvileg felhasználhatók lennének különböző, a szakember számára ismert mátrixanyagok, azaz természetes (módosított is) és szintetikusan előállított mátrixok, előnyben részesítjük azonban a biológiailag összeférhető, in vivő biológiailag lebontható porózus anyagokat. Ezekben a kísérletekben patkányokból kivett csontmátrixot használtunk, amelyet lényegében a Sampath és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 6591-6595 (1983)] által leírtakhoz hasonlóan preparáltunk. A patkánycsontból (Femur és Tibia) 24 órás 0,6 M sósavas kezeléssel kivontuk az ásványi anyagokat, és ezután eltávolítottuk a még előforduló csontvelőt. Vízzel történő mosás és háromórás kloroform/metanolban (1/1) történő zsírtalanítás után a csontot levegőn megszárítottuk, lefagyasztottuk, malomban porrá őröltük, és a 400-1000 pm-es részecskéket kirostáltuk. Ezután a mátrixot 7 napig szobahőmérsékleten 4 M guanidin-HCl-ban proteázinhibitorok jelenlétében extraháltuk. Erőteljes vízzel való mosás után a mátrixot liofileztük és 4 °C-on tároltuk. Az így kezelt mátrixok önmagukban már nem mutatnak csontindukáló aktivitást.

Fehéijék különböző - a szakember által ismert módszerekkel kombinálhatok az extrahált csontmátrixszal. Az MP-52 fehéijét, illetve kontrollfehéijét, amelyet mind heparin Sepharose-on, mind reverz fázisú HPLC-vel megtisztítottunk, acetonitril/trifluor-ecetsav oldatban az elúció után implantátumonként 25 mg mátrixszal egyesítettük, jól összekevertük és liofileztük. A mátrixhoz kötött MP-52 beültetéséhez két, körülbelül 3 hónapos patkányt (Whistar) használtunk, amelyeket előzőleg elkábítottunk egy narkotizálószer - 0,2 ml Rompun (Bayer) 0,5 ml Ketanest 50-nel (Parké Davis) - testtömeg 100 g-onként 0,14 ml-ének izomba oltásával. Az implantátumok számára kétoldalú zsebeket preparáltunk a hasizomzatba (a mellkas alatt, körülbelül 0,5 cm-re indítva a legalsó bordaívtől). A mátrixhoz kötött ΜΡ-52-t (Western biot alapján becsülve körülbelül 2-4 pg-ot), valamint a megfelelő, mátrixhoz kötött kontrollfehéijét 0,9%-os sóoldattal (Delta Pharma) átnedvesítettük, és az izomzsebekbe töltöttük. Az izomzsebeket, valamint a szükséges bőrvágásokat végül bevarrtuk. A patkányokat Cyclosporin Aval (Sandimmun) immunszuppresszáltuk.

18, illetve 26 nap után kivettük az implantátumokat a patkányokból és szövettani vizsgálatokhoz fixáltuk azokat. Mivel az ΜΡ-52-t tartalmazó implantátum 26 nap után már makroszkopikusan sejtetni engedte a csontképződést, ezt metszetkészítéshez metil-metakrilátba ágyaztuk, a többi implantátumot pedig paraffinba ágyaztuk. A mineralizált porc- és csontszövetet von

HU 219 504 Β

Kessa festési technikájának [Romeis, B.: Mikroskopische Technik, Ed.: Böck, P., Urban und Schwarzenberg; München, Baltimore, Wien (1989)] segítségével feketén hívtuk elő. A Masson-Goldner féle króm(III)mal történő festésnél [Romeis, B.: Mikroskopische Technik, Ed.: Böck, P., Urban und Schwarzenberg; München, Baltimore, Wien (1989)] a mineralizált csontszövet és a kollagén fényes zöldre, az osteoid (csontszerű rész) pirosra és a citoplazma vörösesbarnára színeződik. Mindkét festési technikát alkalmaztuk mindkét patkányból kivett implantátumoknál. Mindkét festési technikával, mindkét kísérleti állatnál egyértelmű porc- és csontképződést tudtunk kimutatni azokban az implantátumokban, amelyek ΜΡ-52-t tartalmaztak. A kontrollfehéqének megfelelő implantátumok semmiféle porc- vagy csontképződést nem mutattak. A porcosodás első lépcsői kondrocitákkal, porcterületek a kezdődő extracelluláris mátrixképződéssel és ezek mineralizációja koncentrikus körökben az MP-52 implantátumban 18 nap után nagyobb részarányú, mint a 26 naposban. Azonban már a 18 napos implantátumban is kimutatható érett csontszövet vektoriális osteoidképződéssel, továbbá egyenként csontsejtek a csontban. Továbbá felismerhetők zárt csontocskák kezdődő csontvelőképződéssel. A 26 napos implantátumnál is kimutathatók még porcterületek kezdődő mátrixképződéssel és kalcifikálódással, a zöldre színeződött mineralizált csontszövet - csontsejtekkel és osteoidszegéllyel - részaránya azonban egyértelműen gyarapodott. Ebben az implantátumban is kimutatható csontvelőképződés szórványos zsírsejt-előfordulással. Szemléltetésként az 5. ábra mutatja színes (von Kossá) bizonyítékát a 26 napos teljes implantátum csontanyagának. A 6. ábrán ugyanannak az implantátumnak egy kis metszetét mutatjuk Masson-Goldner-féle festést követően. Ez aktív csontot mutat kockaszerű osteoblastokból álló szegéllyel és osteoidot, amelyben egyenként beépült osteoblasztok ismerhetők fel. A további részeken egyenként láthatók csontsejtek a mineralizált csontszövetben (az eredeti preparátumon zöldre színezve). A csontvelőképződés szintén kimutatható.

A kísérlet azt mutatja, hogy a rekombináns technikával előállított MP-52 egymagában, egy mátrixszal kombinálva, képes a porcon belüli csontképződést kiváltani.

2.2. Az eredmények megerősítése érdekében egy további ektópiás csontképzési tesztet végeztünk MP-52 Lsejt-transzformátumok felhasználásával. ΜΡ-52-t termelő (HindIII-MP52/pABWN-nel transzformált) és MP—52-t nem termelő (pABWN-nel transzformált) L-sejteket (1 χ 10⁶ sejtet) oltottunk három hím kopasz egér mindegyikének mindkét oldali combizomzatába. Három hét után minden állatot leöltünk, a combizomzatot leválasztottuk, és mind alacsony energiájú röntgensugárzással, mind szövetpatológiailag megvizsgáltuk.

Amint azt a 3. táblázatban feltüntettük, a röntgensugárzásos analízis minden ΜΡ-52-t termelő L-sejttel történt oltás helyén tömör anyagot mutat az izomszövetben. A szövettani vizsgálatokkal egyszerű porcképződést és kalcifikálódott porcképződést tudtunk megállapítani az izmokban. Ezek az eredmények is azt támasztják alá, hogy az MP-52 képes kiváltani a porcon belüli csontképződést.

3. táblázat

	ΜΡ-52-t termelő sejtek (HindIII-MP52/pABWN)	Kontrollsejtek (pABWN)
Tömör anyag a röntgenanalízisnél	3/3	0/3
Porcsejtek a szövettani vizsgálatnál	3/3	0/3
Kalcifikálódó porcképződés szövettani vizsgálatnál	3/3	0/3

Az elvégzett kísérletek megerősítik, hogy az MP-52 fehérje stimulálja a nem differenciálódott mesenchyma (alapszövet)-sejtekből történő porcképződést, valamint az osteoblastok differenciálódását és érését. Ez porcon belüli csontképződéshez vezet, amely az embrionális csontképződésnél és a csonttörések gyógyításánál történő indítólépéshez hasonló.

A kísérleteknél felsorolt feltételek az ΜΡ-52-aktivitást szemléltetik és nem tekintendők korlátozásnak. A találmány más formában is vizsgálható és jellemezhető.

A bejelentésben megnevezett sejtvonalakra és plazmidokra a letétbe helyezési elismervényeket csatoljuk mellékletként, amelyekből a letétbe helyezési adatok világosan láthatók.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. DNS-molekula, amely egy, a TGF-β családba tartozó fehérjét kódol, és magában foglalja

a) az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott nukleotidszekvenciának az érett fehérjét kódoló részét és adott esetben további funkciós részeit,

b) az a) szekvenciának a genetikai kód degenerációja keretein belül megfelelő nukleotidszekvenciát,

c) az a) és b) szekvenciák valamelyike allélszármazékának megfelelő nukleotidszekvenciát, vagy

d) az a), b) vagy c) szekvenciák valamelyikével hibridizáló szekvenciát,

HU 219 504 Β azzal a feltétellel, hogy egy d) szerinti DNS-molekula legalább egy, a TGF-β családba tartozó érett fehérjét kódoló részt teljes egészében tartalmaz.
2. Vektor, amely az 1. igénypont szerinti DNS-molekulának legalább egy másolatát tartalmazza.
3. Gazdasejt, amely egy 1. igénypont szerinti DNSsel vagy egy 2. igénypont szerinti vektorral transzformálva van.
4. A 3. igénypont szerinti gazdasejt, amely baktérium-, gomba-, növényi vagy állati sejt.
5. A TGF-β családba tartozó fehérje, amelyet egy, az 1. igénypont szerinti DNS-szekvencia kódol.
6. Az 5. igénypont szerinti fehérje, amely a 2. számú szekvenciavázlatban bemutatott aminosavszekvenciával vagy adott esetben annak funkciós részeivel rendelkezik.
7. Eljárás egy, a TGF-β családba tartozó fehéije előállítására, azzal jellemezve, hogy a 3. vagy 4. igénypont szerinti gazdasejtet tenyésztünk, és a TGF-β fehéijét a sejtből és/vagy a tenyészet felülúszójából nyerjük.
8. Gyógyszerkészítmény, amely hatóanyagként legalább egy, az 5. vagy 6. igénypont szerinti fehérjét tartalmaz, adott esetben gyógyászatilag szokásos hordozó-, segéd-, hígító- vagy töltőanyagokkal együtt.
9. A 8. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagot egy természetes vagy szintetikus anyagú mátrixra visszük fel és/vagy abba beépítjük.
10. A 9. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, az zal jellemezve, hogy a mátrix anyaga egy biokompatibilis, in vivő biológiailag elbontható porózus anyag.
11. A 8-10. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy azt a segédanyagok megválasztásával az angiogenezis elősegítésére meg felelő gyógyszerkészítmény alakjában készítjük ki.
12. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, amely hatóanyagként egy 5. vagy 6. igénypont szerint előállított fehérjét tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerint előállított fehéqéket adott esetben a szokásos gyógyászati segédanyagokkal csont-, porc-, kötőszövet-, bőr-, nyálkahártya-, hám- vagy fogkárosodások kezelésére vagy megelőzésére, fogbeültetéseknél és sebek gyógyításánál, illetve szövetregenerációs folyamatoknál történő felhasználásra szolgáló gyógyszerkészítményekké formulázzuk.
13. Antitestek vagy antitestfragmentumok, azzal jellemezve, hogy az 5. vagy 6. igénypont szerinti fehérjéhez kötődnek.