TW202342468A - P2x3受體拮抗劑的晶型及其製備方法 - Google Patents

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Abstract

本公開涉及一種P2X3受體拮抗劑的結晶形式及其製備方法。具體而言，本公開提供了化合物(S)-1-(4-(1-((4-乙醯基嗎啉-2-基)甲基)-5-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-氯-5-氟苯基)吡咯烷-2-酮的結晶形式及其製備方法。

Description

P2X3受體拮抗劑的晶型及其製備方法
本公開屬於醫藥技術領域，涉及一種P2X3受體拮抗劑的結晶形式及其製備方法。
本申請要求申請日為2022/2/11的中國專利申請202210127962.8的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
P2X3受體在單一亞基上存在4個ATP結合位點，由2個跨膜結構域、位於胞內的N-末端和C-末端、位於胞外環結構的保守序列構成。在特異性的與傷害資訊有關的中小直徑神經元中均發現有P2X3受體的高度表達。同時，P2X3受體也參與一些非傷害性感覺的傳遞。它已被證實，P2X3受體參與膀胱感覺功能，是一個關鍵的受體介導的膀胱感覺信號，在含有豐富的感覺神經纖維的膀胱黏膜組織中的表達。在咽黏膜的感覺神經纖維中也有P2X3的表達，它與味覺的傳導、形成有關。
當有機體受到傷害或神經損傷後釋放大量ATP，啟動突觸前膜P2X3受體，引起大量Ca 2+內流，細胞內鈣濃度增加啟動蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），使得PKA、PKC磷酸化，同時促進了麩胺酸釋放，進一步啟動NMDA受體，導致興奮性突觸後電流的產生，引起中樞敏感化。許多研究表明，P2X3受體表達上調可導致痛敏形成，參與疼痛的信號傳遞。
MK-7264（Gefapixant）是一種磺胺類藥物，作為嘌呤P2X受體P2RX3的拮抗劑，可用於治療慢性咳嗽。
( S)-1-(4-(1-((4-乙醯基嗎啉-2-基)甲基)-5-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-氯-5-氟苯基)吡咯烷-2-酮（如下所示，WO2022033567）為一種新型P2X3拮抗劑，體外實驗表明其對P2X3具有優異的抑制活性，同時具有優異的體內代謝性能， 。
藥物的活性成分的晶型結構往往影響到該藥物的理化穩定性，結晶條件及儲存條件的不同有可能導致化合物的晶型結構的變化，有時還會伴隨著產生其他形態的晶型。一般來說，無定型的藥物產品沒有規則的晶型結構，往往伴有產物穩定性較差，析晶較細，過濾較難，易結塊，流動性差等缺陷。鑒於固體藥物晶型及其穩定性在臨床治療中的重要性，深入研究化合物( S)-1-(4-(1-((4-乙醯基嗎啉-2-基)甲基)-5-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-氯-5-氟苯基)吡咯烷-2-酮的固體形態，對開發適合工業生產且生物活性良好的藥物具有重要意義。
本公開提供了化合物(S)-1-(4-(1-((4-乙醯基嗎啉-2-基)甲基)-5-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-氯-5-氟苯基)吡咯烷-2-酮的A晶型，以繞射角2θ角度表示的X-射線粉末繞射圖，在11.750、13.120、19.224、20.324和23.625處有特徵峰。
在一些實施方案中，所述A晶型，以繞射角2θ角度表示的X-射線粉末繞射圖，在7.135、9.212、9.946、11.750、13.120、14.471、18.615、19.224、20.324、23.625和25.216處有特徵峰。
在一些實施方案中，所述A晶型，以繞射角2θ角度表示的X-射線粉末繞射圖，在7.135、9.212、9.946、11.750、12.656、13.120、14.216、14.471、17.170、18.615、19.224、20.324、20.905、22.081、23.625、25.216和27.718處有特徵峰。
在一些實施方案中，所述A晶型，以繞射角2θ角度表示的X-射線粉末繞射圖，在7.135、9.212、9.946、11.082、11.750、12.656、13.120、14.216、14.471、16.558、17.170、18.615、19.224、20.324、20.905、21.637、22.081、23.312、23.625、24.343、25.216、25.719、26.058、27.718、29.504和30.269處有特徵峰。
在另一些實施方案中，所述A晶型以繞射角2θ角度表示的X-射線粉末繞射圖譜如圖2所示。
在另一些實施方案中，所述2θ角誤差範圍為±0.20。
本公開另一方面還提供製備前述A晶型的方法，所述方法包括： 方法一： （a）將化合物(S)-1-(4-(1-((4-乙醯基嗎啉-2-基)甲基)-5-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-氯-5-氟苯基)吡咯烷-2-酮與溶劑（I）混合，攪拌溶解或加熱溶解，所述溶劑（I）選自醇類溶劑、酮類溶劑、酯類溶劑中的一種或多種， （b）析晶； 方法二： （a）將化合物(S)-1-(4-(1-((4-乙醯基嗎啉-2-基)甲基)-5-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-氯-5-氟苯基)吡咯烷-2-酮與溶劑（II）混合，攪拌溶解或加熱溶解，所述溶劑（II）選自乙醇、乙腈和四氫呋喃中的一種或多種， （b）加入溶劑（III），析晶，所述溶劑（III）選自甲基三級丁基醚、正庚烷、異丙醚中的一種或多種； 方法三： （a）將化合物(S)-1-(4-(1-((4-乙醯基嗎啉-2-基)甲基)-5-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-氯-5-氟苯基)吡咯烷-2-酮與溶劑（IV）混合，攪拌打漿，所述溶劑（IV）選自MTBE、環己烷和異丙醚中的一種或多種； 方法四： （a）將化合物(S)-1-(4-(1-((4-乙醯基嗎啉-2-基)甲基)-5-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-氯-5-氟苯基)吡咯烷-2-酮與溶劑（V）混合，揮發析晶，所述溶劑（V）選自DMSO。
在一些實施方案中，所述溶劑（I）選自乙醇、異丙醇、丙酮、甲基異丁基酮、2-丁酮、乙酸乙酯和乙酸異丙酯中的一種或多種。
另一方面，在一些實施方案，溶劑（I）、溶劑（II）、溶劑（IV）、溶劑（V）所用體積（ml）為化合物( S)-1-(4-(1-((4-乙醯基嗎啉-2-基)甲基)-5-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-氯-5-氟苯基)吡咯烷-2-酮重量的1-200倍，具體1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、200倍或任意兩數之間值。
本公開析晶方式包括但不限於攪拌析晶、靜止析晶或揮發析晶。在一些實施方案中，所述析晶為攪拌析晶。在一些實施方案中，所述析晶為靜止析晶。
本公開所述的製備方法還包括離心（過濾）、洗滌或乾燥步驟。
在另一些實施方案中，製備前述化合物的方法還包括過濾、洗滌或乾燥中的一個或多個步驟，所述乾燥優選減壓乾燥，壓強＜-0.08MPa。
本公開還提供了一種藥物組合物，其含有前述A晶型或由前述方法製備的A晶型，和任選自藥學上可接受的賦形劑中的藥用輔料。
本公開還提供了一種藥物組合物，其由前述的A晶型和任選藥學上可接受的賦形劑製備而成。
本公開還提供了一種藥物組合物的製備方法，包括將前述A晶型或由前述方法製備的A晶型與藥學上可接受的賦形劑混合的步驟。
本公開還提供了前述的A晶型或由前述方法製備的A晶型或由前述組合物在製備用於治療或預防與P2X3活性相關的疾病的藥物中的用途。
本公開還提供了前述的A晶型或由前述方法製備的A晶型或由前述組合物在製備用於治療或預防類疼痛、泌尿道疾病或咳嗽的藥物中的用途。
本公開還提供了用於治療或預防疼痛、泌尿道疾病或咳嗽的A晶型，以繞射角2 θ角度表示的X-射線粉末繞射圖，在11.750、13.120、19.224、20.324和23.625處有特徵峰。
依據《中國藥典》2015年版四部中「9103藥物吸濕性指導原則」中吸濕性特徵描述與吸濕性增重的界定， 潮解：吸收足量水分形成液體； 極具吸濕性：吸濕增重不小於15%； 有吸濕性：吸濕增重小於15%但不小於2%； 略有吸濕性：吸濕增重小於2%但不小於0.2%； 無或幾乎無吸濕性：吸濕增重小於0.2%。
在一些實施方案中，本公開A晶型為略有吸濕性。
本公開所述的「2 θ或2 θ角度」是指繞射角， θ為布拉格角，單位為°或度；每個特徵峰2 θ的誤差範圍為±0.20（包括超過1位元小數的數位經過四捨五入後的情況），具體為-0.20、-0.19、-0.18、-0.17、-0.16、-0.15、-0.14、-0.13、-0.12、-0.11、-0.10、-0.09、-0.08、-0.07、-0.06、-0.05、-0.04、-0.03、-0.02、-0.01、0.00、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20。
本公開中所述的「賦形劑」包括但不限於任何已經被美國食品和藥物管理局批准對於人類或家畜動物使用可接受的任何助劑、載體、助流劑、甜味劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、增香劑、表面活性劑、潤濕劑、分散劑、助懸劑、穩定劑、等滲劑或乳化劑。
本公開所述的「打漿」是指利用物質在溶劑中溶解性差，但雜質在溶劑中溶解性好的特性進行純化的方法，打漿提純可以去色、改變晶型或去除少量雜質。
本公開晶型製備方法中所用的起始原料可以是任意形式的式I所示化合物，具體形式包括但不限於：無定形、任意晶型、水合物、溶劑合物等。
本公開中所述的「差示掃描量熱分析或DSC」是指在樣品升溫或恆溫過程中，測量樣品與參考物之間的溫度差、熱流差，以表徵所有與熱效應有關的物理變化和化學變化，得到樣品的相變資訊。
本公開中所述乾燥溫度一般為25℃~100℃，優選40℃~70℃，更優選45℃~55℃，可以常壓乾燥，也可以減壓乾燥，壓強＜-0.08MPa，乾燥時間5~10h，優選7~8h。
本公開中數值如有關物質含量為測定計算的資料，不可避免存在一定程度的誤差。一般而言，±10%均屬於合理誤差範圍內。隨其所用之處的上下文而有一定程度的誤差變化，該誤差變化不超過±10%，可以為±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%或±1%，優選±5%。
化合物A：( S)-1-(4-(1-((4-乙醯基嗎啉-2-基)甲基)-5-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-氯-5-氟苯基)吡咯烷-2-酮。其製備方法參照WO2022033567中方法，並相關內容引用本文本以示說明。
本公開中實驗所用儀器的測試條件：
1、差示掃描量熱儀(Differential Scanning Calorimeter, DSC) 儀器型號：Mettler Toledo DSC 3+STARe System 吹掃氣：氮氣；氮氣吹掃速度：50 mL/min 升溫速率：10.0 ℃/min 溫度範圍：25-250℃
2、X-射線粉末繞射譜(X-ray Powder Diffraction, XRPD) 儀器型號：BRUKER D8 Discover X-射線粉末繞射儀 射線：單色Cu-Kα射線(λ=1.5406) 掃描方式：θ/2θ，掃描範圍(2θ範圍)：3~50° 電壓：40kV，電流：40mA
3、熱重分析儀（Thermogravimetric Analysis，TGA） 儀器型號：Mettler Toledo TGA2 吹掃氣：氮氣；氮氣吹掃速度：50 mL/min 升溫速率：10.0℃/min 溫度範圍：30-350℃
4、DVS為動態水分吸附 檢測採用Surface Measurement Systems advantage 2，在25℃，濕度從50% -95%-0%-95%-50%RH，步進為10%，判斷標準為每個梯度品質變化dM/dT小於0.002%，TMAX 360min，迴圈兩圈。
5、化合物的結構是通過核磁共振(NMR)或/和質譜(MS)來確定的。NMR位移(δ)以10-6 (ppm)的單位給出。 NMR的測定是用Bruker AVANCE NEO 500M，測定溶劑為氘代二甲基亞碸(DMSO-d6)、氘代氯仿(CDCl3)、氘代甲醇(CD3OD)，內標為四甲基矽烷(TMS)。 MS的測定用Agilent 1200 /1290 DAD- 6110/6120 Quadrupole MS液質聯用儀(生產商：Agilent，MS型號：6110/6120 Quadrupole MS)。waters ACQuity UPLC-QD/SQD(生產商：waters，MS型號：waters ACQuity Qda Detector/waters SQ Detector)。THERMO Ultimate 3000-Q Exactive (生產商：THERMO，MS型號：THERMO Q Exactive)
6、已知的起始原料可以採用或按照本領域已知的方法來合成，或可購買自ABCR GmbH & Co. KG，Acros Organics，Aldrich Chemical Company，韶遠化學科技(Accela ChemBio Inc) 、達瑞化學品等公司。
7、HPLC的測定使用安捷倫1260DAD高效液相色譜儀(ACE Excel C18 150×4.6mm色譜柱)和Thermo Dionex Ultimate 3000高壓液相色譜儀(Waters Xbridge C18 150×4.6mm色譜柱)。
以下將結合實施例或實驗例更詳細地解釋本公開，本公開中的實施例或實驗例僅用於說明本公開中的技術方案，並非限定本公開中的實質和範圍。
實施例1
步驟一：(R)-2-(((甲磺醯基)氧)甲基)嗎啉-4-羧酸三級丁酯(1b) 0°C氮氣保護下，向(2R)-2-(羥甲基)嗎啉-4-羧酸三級丁酯(100 g, 460.28 mmol)的甲苯(1000 mL)溶液中滴加三乙胺(96 mL, 690.41 mmol)和甲磺醯氯(49.63 mL, 635.71 mmol)，然後反應混合物在30°C下攪拌12小時。TLC (石油醚/乙酸乙酯= 1/1)顯示原料反應完全，反應液進行過濾，濾液用水(500 mL x 3)和食鹽水(500 mL x 3)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮，得到標題化合物1b (135g, 產率：99%)。 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ4.24 (d, J= 4.8 Hz, 2H), 3.92 (d, J= 11.2 Hz, 3H), 3.74-3.65 (m, 1H), 3.55 (dt, J= 2.4, 11.6 Hz, 1H), 3.08-3.06 (m, 3H), 3.04-2.91 (m, 1H), 2.79 (d, J= 14.4 Hz, 1H), 1.47 (s, 9H).
步驟二：(S)-2-((1,3-二氧代異吲哚啉-2-基)甲基)嗎啉-4-羧酸三級丁酯(1c) 向化合物1b (135 g，457.07 mmol)的N,N-二甲基乙醯胺(1350 mmol)溶液中加入鄰苯二甲醯亞胺鉀鹽(93.12 g，502.78 mmol)和四丁基溴化銨（14.73 g，45.71 mmol）。反應混合物在80℃下攪拌6小時。TLC（石油醚/乙酸乙酯=1/1）顯示起始材料被完全消耗。將反應混合物過濾，將濾液倒入水中（3L），過濾，濾餅用N-甲基吡咯烷酮-水（1/5，2. 4 L）在25℃下攪拌12小時，然後過濾，減壓乾燥濾餅，得到標題化合物1c（120 g，產率：73%）。 MS (ESI) m/z =291.1 [M-56+H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ7.86 (dd, J= 3.2, 5.2 Hz, 2H), 7.76-7.69 (m, 2H), 4.04-3.83 (m, 3H), 3.82-3.71 (m, 2H), 3.67 (dd, J= 4.8, 13.5 Hz, 1H), 3.44 (dt, J= 2.8, 11.2 Hz, 1H), 3.05-2.92 (m, 1H), 2.76 (br. s, 1H), 1.45 (s, 9H).
步驟三：(S)-2-(胺基甲基)嗎啉-4-羧酸三級丁酯(1d) 向化合物1c（100 g，288.70 mmol）的2-甲基四氫呋喃（1000 mmol）溶液中加入聯胺（10.40 mL，181.88 mmol）。反應混合物在80℃下攪拌3小時，過濾，濃縮濾液。殘餘物在乙酸乙酯（200 mmol）中攪拌30分鐘，過濾，減壓濃縮，得到標題化合物1d（68 g，產率：87%）。 MS (ESI) m/z =217.1 [M+H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ3.88-3.84 (m, 3H), 3.59-3.45 (m, 1H), 3.37-3.25 (m, 1H), 2.97-2.82 (m, 1H), 2.73 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 2.71 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 2.61-2.56 (m, 1H), 1.45 (s, 9H).
步驟四：(S)-2-((2-(4-溴-2-氯-6-氟苯基)-5-甲基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)甲基)嗎啉-4-羧酸三級丁酯(1f) 向化合物1d（67 g，248.18 mmol）的二甲基亞碸（350 mL）溶液中加入碳酸鈣（27 g，270.74 mmol）和1-氟-4-甲基-2-硝基苯（35 g，225.62 mmol）。反應混合物在110℃下攪拌了12小時。TLC(石油醚/乙酸乙酯=1/2)顯示起始材料被完全消耗。將反應混合物冷卻至47℃，並加入EtOH（350 mL）、連二亞硫酸鈉（157 g，902.47 mmol）和4-溴-2-氯-6-氟苯甲醛（43 g，180.49 mmol）。反應混合物在90℃下攪拌16小時。將反應混合物倒入水中（2 L），用乙酸乙酯（800 mL x 3）提取，濃縮有機層，將殘留物溶於乙酸乙酯（1. 5 L），用水（1 L x 3）和鹽水（800 mL x 2）洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮濾液，得到標題化合物1f (113 g, 產率：93%)。 MS (ESI) m/z = 538.1 [M+H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ7.64 (s, 1H), 7.56-7.52 (m, 1H), 7.40-7.32 (m, 2H), 7.20 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 4.11-3.96 (m, 3H), 3.76-3.67 (m, 2H), 3.61-5.57 (m, 1H), 3.33-3.29 (m, 1H), 2.79 (t, J = 10.4 Hz, 1H), 2.51 (s, 3H), 2.50-2.46 (m, 1H), 1.42 (s, 9H).
步驟五：(R)-1-(3-氯-5-氟-4-(5-甲基-1-(嗎啉-2-基甲基)-1H-苯并[d]咪唑-2-基)苯基) 吡咯烷-2-酮 (1h) 向化合物1f（113 g，152. 92 mmol）的二㗁烷（1000 mL）溶液，加入吡咯烷-2-酮（47 mL，611.67 mmol），碳酸銫（100 g，305.84 mmol），雙(二亞芐基丙酮)鈀（8.79 g，15.29 mmol），4,5-雙(二苯基膦)-9,9-二甲基氧雜蒽（17.70 g，30.58 mmol）。反應體系用氮氣置換三次，反應混合物在氮氣下於100℃攪拌2小時。然後在25℃下加入對甲苯磺酸（29 g，1529.18 mmol），在100℃下攪拌1小時。將反應混合物倒入水中（1000 mL），用乙酸乙酯（800 mLx6）提取，用1莫耳/升氫氧化鈉溶液將水相調節到pH=9。然後用二氯甲烷(800 mL x 5)提取水相，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮濾液，得到標題化合物1h (113 g, 產率：93%)。 MS (ESI) m/z = 443.1 [M+H] +. 1H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ7.74-7.65 (m, 1H), 7.61 (br. s, 2H), 7.38-7.36 (m, 1H), 7.16 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 4.15-3.91 (m, 2H), 3.87 (t, J= 7.2 Hz, 2H), 3.75-3.64 (m, 2H), 3.49-3.34 (m, 2H), 2.75-2.69 (m, 2H), 2.66 (t, J= 8.0 Hz, 2H), 2.50 (s, 3H), 2.45-2.33 (m, 2H), 2.31-2.25 (m, 1H), 2.21 (t, J= 7.6 Hz, 2H), 2.15-2.09 (m, 1H), 2.15-2.08 (m, 1H).
步驟六：(S)-1-(4-(1-((4-乙醯基嗎啉-2-基)甲基)-5-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-氯-5-氟苯基) 吡咯烷-2-酮(I) 向化合物1h（480 mg，1.08 mmol）的四氫呋喃（2.5 mL）溶液中，在0℃加入飽和碳酸氫鈉溶液（2.5 mL）和醋酸酐（221.3 mg，2.17 mmol）。混合物在室溫下攪拌0.5小時，然後用乙酸乙酯稀釋並分離。水相用乙酸乙酯提取。合併有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾並濃縮。將粗品（500 mg）在正己烷/乙酸乙酯（1/1，4mL）中攪拌過夜。將沉澱物過濾並乾燥，得到標題產品（400.0 mg，產率：76%)。經X-射線粉末繞射檢測，該產物為無定型，XRPD如圖1所示。 MS (ESI) m/z = 485.4 [M+H] +. 1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ7.88 (br s, 1H), 7.79 (br d, J= 11.6 Hz, 1H), 7.70 - 7.60 (m, 1H), 7.49 (br s, 1H), 7.20 - 7.12 (m, 1H), 4.33 - 4.16 (m, 2H), 4.03 (br d, J= 15.0 Hz, 1H), 3.97 - 3.87 (m, 3H), 3.78 (br d, J= 17.6 Hz, 1H), 3.68 - 3.55 (m, 1H), 3.12 (br d, J= 11.0 Hz, 1H), 2.99 (br d, J= 11.6 Hz, 1H), 2.81 - 2.70 (m, 2H), 2.58 (br d, J= 7.9 Hz, 2H), 2.44 (br s, 3H), 2.14 - 2.06 (m, 2H), 1.93 (s, 2H).
測試例1、體外生物活性評價
FLIPR測定法篩選化合物對hP2X3和hP2X2/3受體的拮抗活性(以鈣流信號變化表示化合物對離子通道的作用)。
1、實驗儀器及材料
儀器名稱 設備廠家 型號
FLIPR Molecular Devices TETRA
CO 2培養箱 Thermo Fisher 3111
試劑和耗材名稱 來源 貨號
FLIPR® Calcium 4 Assay Kit Molecular Devices R8141
FLIPR pipette Tips Molecular Devices 9000-0764
Matrix D.A.R.T.s Tips-30ul Thermo 5416
FBS Gibco 10099-141
DMEM Gibco 11965
Hygromycin B Invitrogen 10687010
G418 DISULFATE SALT SIGMA G5013
384-well Assay Plate Corning CC3712
384-well Compound Plate Corning CC3657
Echo qualified, 384-well polypropylene microplate LABCYTE P-05525
Probenecid Sigma P8761-25G
1x HBSS Invitrogen 14025
ATP hydrolytic enzyme Sigma A7646
HEPES Invitrogen 15630-080
Versene Gibco 15040066
αβ-meATP Sigma M6517
Stable cell line Chempartner 1321N1/hP2X3, 1321N1/hP2X2/3
2、實驗步驟 將穩定轉染hP2X3和hP2X2/3受體的1321N1細胞（貼壁細胞）消化，離心後用鋪板培養基(DMEM + 10% DFBS)重懸並計數，調整細胞到2*10 5個細胞/mL，在384-well Assay Plate中每孔鋪50 μL細胞，置於5% CO 2、37 ℃培養箱中培養16-24小時。用DMSO配製180倍所需濃度供試化合物(20 mM DMSO儲備液)，每孔取500 nL加到384-well Compound Plate中，補充30 μL FLIPR buffer (含1.26 mM Ca 2+的1* HBSS + 2 mM CaCl 2+ 20 mM HEPES)，振搖20-40 min以混勻。用FLIPR buffer配製3倍所需濃度促效劑α, β-meATP (hP2X3細胞需終濃度500 nM，hP2X2/3細胞需終濃度1000 nM)，每孔加35 μL促效劑到另一塊384-well Compound Plate中。取出鋪好培養16-24小時的細胞板，吸去細胞上清液，每孔加入30 μL Dye (FLIPR® Calcium 4 Assay Kit，FLIPR buffer稀釋)，孵育1小時。向每孔細胞中加15 μL化合物(FLIPR儀器加樣)，15分鐘後，每孔加22.5 μL促效劑，檢測螢光信號(激發光波長470 nm-495 nm，發射光波長515 nm -575 nm)。取信號峰值和谷值的差值作為基礎資料，以陽性藥最高濃度資料作為100 %抑制率，DMSO資料作為0 %抑制率，在軟體Graphpad Prism 6上擬合化合物的抑制效應曲線並計算IC 50值。 表1. 本發明化合物對hP2X3和hP2X2/3受體的半數抑制濃度(IC 50)
編號 hP2X3 (IC 50, nM) hP2X2/3 (IC 50, nM)
I 31.6 1927
測試例2、CYP抑制實驗 使用150個供體混合人肝微粒體(購自Corning, 貨號452117)評估人主要5個CYP亞型(CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4/5)的代表性受質代謝反應。通過液相色譜串聯質譜（LC/MS/MS）測定不同濃度待測化合物對非那西丁(CYP1A2)、雙氯芬酸鈉(CYP2C9)、S-美芬妥英(CYP2C19)、丁呋洛爾鹽酸鹽(CYP2D6)、咪達唑侖(CYP3A4/5)代謝反應的影響。
將30 μM非那西丁、10 μM雙氯芬酸鈉、35 μM S-美芬妥英、5 μM丁呋洛爾鹽酸鹽、3 μM咪達唑侖、1 mM NADPH、待測化合物(濃度分別為0.1、0.3、1、3、10、30 μmol/L)或陽性化合物或空白對照與混合人肝微粒體(0.2 mg/mL)的反應體系200 μL (100 mmol/L磷酸鹽緩衝液，pH 7.4，含體積比分別為0.3%的DMSO、0.6%的乙腈、0.1%的甲醇)在37 °C孵育5分鐘。然後加入200 μL含3%甲酸及40 nM 內標維拉帕米的乙腈溶液，4000 rpm離心50分鐘。置於冰上冷卻20分鐘，再4000 rpm離心20分鐘析出蛋白。取200 μL上清液進行LC/MS/MS分析。
峰面積根據色譜圖計算。殘餘活性比例（%）用如下公式進行計算： 峰面積比例 = 代謝產物峰面積 / 內標峰面積
殘餘活性比例（%） = 待測化合物組的峰面積比例 / 空白組的峰面積比例
CYP半數抑制濃度（IC 50）通過Excel XLfit 5.3.1.3計算得到。 測得的CYP半數抑制濃度（IC 50）數值見表2。 表2. 化合物對CYP的半數抑制濃度(IC 50)
編號 CYP 1A2 (μM) CYP 2C9 (μM) CYP 2C19 (μM) CYP 2D6 (μM) CYP 3A4/5 (μM)
I ＞30 ＞30 ＞30 ＞30 ＞30
測試例3、人肝細胞體外代謝穩定性檢測 利用LC/MS/MS測定反應體系中的化合物濃度，以此來計算待測化合物的固有清除率，並評估在人肝細胞中的體外代謝穩定性。 將247.5 μL 1×10 6細胞/mL的人肝細胞(購自BioreclamationIVT，貨號S01205)混合液和2.5 μL 100 μM的待測化合物或陽性對照加入孵育板起始反應。以37 oC和600 rpm進行孵育。分別在0.5，5，15，30，45，60，80，100和120分鐘轉移20 μL孵育體系到終止板上。之後用渦旋混勻2分鐘。以4000 rpm的速度將終止板離心20分鐘。轉移每個化合物的上清液40 μL至96孔進樣板中，之後加入160 μL純水稀釋樣品。
所得樣品由離子色譜圖定量。根據待測化合物或陽性對照的峰面積來計算殘餘率。斜率k使用Microsoft Excel由剩餘率的自然對數值對孵育時間的線性回歸測定。
固有清除率(in vitro CL int，μL/min/10 6細胞)根據下列等式由斜率值計算： in vitro CL int= kV/N V = 孵育體積 (0.25 mL)； N = 每個孔的細胞數 (0.25×10 6細胞) 測得的人肝細胞固有清除率值見表3。 表3.化合物人肝細胞固有清除率
編號 固有清除率 (μL/min/10 6細胞)
I ＜1
實施例2 秤取約8mg化合物A，加入0.04mL的異丙醇溶解，攪拌析晶，離心，真空乾燥得到固體。經X-射線粉末繞射檢測，該產物為A晶型，XRPD譜圖如圖2所示，其特徵峰位置如表4所示。DSC譜圖顯示，吸熱峰峰值198.77℃。TGA譜圖顯示，30-210℃失重0.27%。 表4
峰序號 2θ值[°或度] d[Å] 相對強度%
1 7.135 12.37901 34.4
2 9.212 9.59269 33.7
3 9.946 8.88639 32.6
4 11.082 7.97763 12.0
5 11.750 7.52533 56.7
6 12.656 6.98862 32.9
7 13.120 6.74280 89.3
8 14.216 6.22526 30.9
9 14.471 6.11603 47.6
10 16.558 5.34959 11.1
11 17.170 5.16036 27.5
12 18.615 4.76278 36.3
13 19.224 4.61337 86.6
14 20.324 4.36603 100.0
15 20.905 4.24603 32.4
16 21.637 4.10384 21.9
17 22.081 4.02240 25.7
18 23.312 3.81263 25.7
19 23.625 3.76293 66.1
20 24.343 3.65352 10.5
21 25.216 3.52895 49.9
22 25.719 3.46106 16.9
23 26.058 3.41678 13.0
24 26.751 3.32985 5.3
25 27.718 3.21580 25.3
26 28.367 3.14368 6.8
27 29.504 3.02514 14.8
28 30.269 2.95036 16.4
29 31.402 2.84644 5.1
30 31.666 2.82331 5.0
31 33.019 2.71069 4.5
32 33.975 2.63652 6.0
33 34.998 2.56179 8.1
實施例3 秤取約8mg化合物A，加入0.04ml的丙酮溶解，5min後固體析出，離心，真空乾燥得到固體。經X-射線粉末繞射檢測，X-射線繞射圖譜與實施例2一致，該產物為A晶型。
實施例4 秤取約8mg化合物A，加入0.04mL的乙酸乙酯溶解，5min後固體析出，離心，真空乾燥得到固體。經X-射線粉末繞射檢測，X-射線繞射圖譜與實施例2一致，該產物為A晶型。
實施例5 秤取約8mg化合物A，加入0.8mL的MTBE，室溫打漿，離心，真空乾燥得到固體。經X-射線粉末繞射檢測，X-射線繞射圖譜與實施例2一致，該產物為A晶型。
實施例6 秤取約8mg化合物A，加入0.8mL的環己烷，室溫打漿，離心，真空乾燥得到固體。經X-射線粉末繞射檢測，X-射線繞射圖譜與實施例2一致，該產物為A晶型。
實施例7 秤取約8mg化合物A，加入0.04ml 的DMSO，室溫攪拌溶解，溶液樣品於室溫慢速揮發得到固體。經X-射線粉末繞射檢測，X-射線繞射圖譜與實施例2一致，該產物為A晶型。
實施例8 秤取約7mg化合物A，加入0.07ml 的乙醇，室溫攪拌溶解，加入0.7ml MTBE，攪拌，固體析出，離心，真空乾燥得到固體。經X-射線粉末繞射檢測，X-射線繞射圖譜與實施例2一致，該產物為A晶型。
實施例9 秤取約7mg化合物A，加入0.07ml 的乙腈，室溫攪拌溶解，加入0.7ml 異丙醚，攪拌，固體析出，離心，真空乾燥得到固體。經X-射線粉末繞射檢測，X-射線繞射圖譜與實施例2一致，該產物為A晶型。
實施例10 秤取約7mg化合物A，加入0.07ml 的四氫呋喃，室溫攪拌溶解，加入0.7ml 異丙醚，攪拌，固體析出，離心，真空乾燥得到固體。經X-射線粉末繞射檢測，X-射線繞射圖譜與實施例2一致，該產物為A晶型。
實施例11 採用Surface Measurement Systems advantage 2，在25°C，濕度從50%起，考察濕度範圍為0%-95%，步進為10%，判斷標準為每個梯度品質變化dM/dT小於0.002%，每個濕度梯度執行時間TMAX為360min，迴圈兩圈。
供試品 0.0%RH-95.0%RH 0%RH-80.0%RH 晶型
晶型A 1.92% 1.49%（略有吸濕性） 未轉變
實施例12 將式（I）所示化合物的晶型A敞口平攤放置，分別考察在光照(4500Lux)、高溫(40°C、60°C)、高濕(RH 75%、RH 92.5%)條件下樣品的穩定性，取樣考察期為30天。 表5
條件 時間(天) 式（I）所示化合物的晶型A
色澤、性狀 純度% 晶型
起始 0 類白色固體 99.5 晶型A
40℃ 5 類白色固體 99.4 未轉變
10 類白色固體 99.5 未轉變
30 類白色固體 99.3 未轉變
60℃ 5 類白色固體 99.2 未轉變
10 類白色固體 99.4 未轉變
30 類白色固體 99.3 未轉變
75% RH 5 類白色固體 99.3 未轉變
10 類白色固體 99.4 未轉變
30 類白色固體 99.4 未轉變
92.5% RH 5 類白色固體 99.3 未轉變
10 類白色固體 99.3 未轉變
30 類白色固體 99.4 未轉變
4500 Lux 5 類白色固體 99.3 未轉變
10 類白色固體 99.3 未轉變
30 類白色固體 99.4 未轉變
結論：影響因素實驗表明：在光照、高溫40℃和60℃、高濕75%和92.5%條件下30天，式（I）所示化合物的晶型A物理和化學穩定性均良好。
實施例13 將式（I）所示化合物的晶型A，分別放置-20℃、4℃、25℃/60%RH和40℃/75%RH條件考察穩定性。 表6
樣品 放置條件 純度% 純度% 純度% 純度% 純度% 晶型
起始 1個月 2個月 3個月 6個月
晶型A -20℃ 99.5 99.5 99.3 99.4 99.4 未轉變
4℃ 99.5 99.3 99.3 99.3 99.3 未轉變
25℃/60%RH 99.5 99.3 99.4 99.5 99.4 未轉變
40℃/75%RH 99.5 99.3 99.4 99.4 99.4 未轉變
結論：長期加速實驗表明：在-20℃、4℃、25℃/60RH和4 0℃/75RH條件下6個月，式（I）所示化合物的晶型A物理和化學穩定性良好。
無
圖1：化合物的無定型XRPD圖譜。 圖2：化合物的A晶型XRPD圖譜。

Claims (10)

  1. 一種化合物(S)-1-(4-(1-((4-乙醯基嗎啉-2-基)甲基)-5-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-氯-5-氟苯基)吡咯烷-2-酮的A晶型，其中，以繞射角2θ角度表示的X-射線粉末繞射圖，在11.750、13.120、19.224、20.324和23.625處有特徵峰，優選在7.135、9.212、9.946、11.750、13.120、14.471、18.615、19.224、20.324、23.625和25.216處有特徵峰，更優選在7.135、9.212、9.946、11.750、12.656、13.120、14.216、14.471、17.170、18.615、19.224、20.324、20.905、22.081、23.625、25.216和27.718處有特徵峰。
  2. 如請求項1所述的A晶型，其中，以繞射角2θ角度表示的X-射線粉末繞射圖，在7.135、9.212、9.946、11.082、11.750、12.656、13.120、14.216、14.471、16.558、17.170、18.615、19.224、20.324、20.905、21.637、22.081、23.312、23.625、24.343、25.216、25.719、26.058、27.718、29.504和30.269處有特徵峰。
  3. 如請求項1或2所述的A晶型，其中，以繞射角2 θ角度表示的X-射線粉末繞射圖譜如圖2所示。
  4. 如請求項1-3任一項所述的A晶型，其中，所述2 θ角誤差範圍為±0.20。
  5. 一種製備請求項1-4任一項所述的A晶型的方法，選自如下任一方法， 方法一： （a）將化合物( S)-1-(4-(1-((4-乙醯基嗎啉-2-基)甲基)-5-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-氯-5-氟苯基)吡咯烷-2-酮與溶劑（I）混合，攪拌溶解或加熱溶解，所述溶劑（I）選自醇類溶劑、酮類溶劑、酯類溶劑中的一種或多種，優選乙醇、異丙醇、丙酮、甲基異丁基酮、2-丁酮、乙酸乙酯和乙酸異丙酯中的一種或多種， （b）析晶； 方法二： （a）將化合物( S)-1-(4-(1-((4-乙醯基嗎啉-2-基)甲基)-5-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-氯-5-氟苯基)吡咯烷-2-酮與溶劑（II）混合，攪拌溶解或加熱溶解，所述溶劑（II）選自乙醇、乙腈和四氫呋喃中的一種或多種， （b）加入溶劑（III），析晶，所述溶劑（III）選自甲基三級丁基醚、正庚烷、異丙醚中的一種或多種； 方法三： （a）將化合物( S)-1-(4-(1-((4-乙醯基嗎啉-2-基)甲基)-5-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-氯-5-氟苯基)吡咯烷-2-酮與溶劑（IV）混合，攪拌打漿，所述溶劑（IV）選自MTBE、環己烷和異丙醚中的一種或多種； 方法四： （a）將化合物( S)-1-(4-(1-((4-乙醯基嗎啉-2-基)甲基)-5-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)-3-氯-5-氟苯基)吡咯烷-2-酮與溶劑（V）混合，揮發析晶，所述溶劑（V）選自DMSO。
  6. 一種由請求項1-4任一項所述的A晶型製備得到的藥物組合物。
  7. 一種藥物組合物，含有請求項1-4任一項所述的A晶型或由請求項5所述方法製備得到的A晶型，和任選自藥學上可接受的賦形劑。
  8. 一種藥物組合物的製備方法，包括將請求項1-4任一項所述的晶型或由請求項5所述方法製備得到的晶型與藥學上可接受的賦形劑混合的步驟。
  9. 請求項1-4任一項所述的A晶型或由請求項5所述的方法製備得到A晶型或請求項6或7所述組合物在製備用於治療或預防與P2X3活性相關疾病的藥物中的用途。
  10. 請求項1-4任一項所述的A晶型或由請求項5所述的方法製備得到A晶型或請求項6或7所述組合物在製備用於治療或預防疼痛、泌尿道疾病或咳嗽的藥物中的用途。
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