TW202340233A

TW202340233A - 肽用於治療神經退行性疾病或改善認知功能的用途

Info

Publication number: TW202340233A
Application number: TW112112599A
Authority: TW
Inventors: 承鑫劉
Original assignee: 大陸商首創生物技術有限公司
Priority date: 2022-04-01
Filing date: 2023-03-31
Publication date: 2023-10-16
Also published as: WO2023184473A1; WO2023186062A1

Abstract

本發明涉及肽用於治療神經退行性疾病或改善認知功能的用途。本發明涉及神經退行性疾病和認知障礙症的治療；以及認知功能的改善和提高。具體而言，本發明涉及肽用於預防或治療神經退行性疾病和認知障礙症，優選阿爾茨海默病和帕金森病的用途。本發明還涉及肽用於改善或提高受試者認知功能的用途。

Description

肽用於治療神經退行性疾病或改善認知功能的用途

本發明涉及神經退行性疾病和認知障礙症的治療；以及認知功能的改善和提高。具體而言，本發明涉及肽用於預防或治療神經退行性疾病和認知障礙症，優選阿爾茨海默病和帕金森病的用途。本發明還涉及肽用於改善或提高受試者認知功能的用途。

神經退行性疾病或神經退化性疾病(Neurodegenerative Disorder或Neurodegenerative Disease)是神經元逐漸退化所直接導致的疾病。退行性過程可涉及神經元結構的進行性損失、神經元功能的進行性損失、或進行性神經元細胞死亡。這種進行性神經退行經常導致身體殘疾和精神惡化。許多神經退行性疾病是嚴重的進行性和不間斷疾病，並且治療方法很少。阿爾茨海默病(AD)和帕金森病(PD)是最主要的兩種神經退行性疾病。認知障礙症(Neurocognitive Disorder)也稱為癡呆症(Dementia)，是腦部疾病的其中一類，此症導致思考能力和記憶力長期而逐漸地退化，並使個人日常生活活動受到影響。最常見的癡呆症類型是阿爾茨海默病，阿爾茨海默病患者占所有癡呆症患者人數的50%到70%。癡呆症影響全球三千六百萬人口。大約10%的人口，會在有生之年中發病。癡呆症與年齡(老化)息息相關，約3%的人口在65到74歲之間得到癡呆症，另外19%的人口則在75到84歲之間，而將近一半的人口超過85歲得到癡呆症。阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease, AD)是一種發病進程緩慢、隨著時間不斷惡化的慢性神經退行性疾病。最常見的早期症狀為喪失短期記憶，當疾病逐漸進展，症狀可能逐漸出現，包括語言障礙、定向障礙、情緒不穩、喪失動機、無法自理和許多行為問題。當情況惡化時，患者往往會因此和家庭或社會脫節，並逐漸喪失身體機能，最終導致死亡。雖然疾程因人而異，但診斷後的平均餘命約為三到九年。在AD中，海馬體(hippocampus)是首先受到損傷的區域，表現症狀為記憶力衰退以及方向知覺的喪失(見Yangling Mu et al., Adult hippocampal neurogenesis and its role in Alzheimer's disease, Mol Neurodegener, 2011; 6: 85)。AD的進程與大腦中的β-澱粉樣蛋白(Aβ)斑塊沉積和Tau蛋白有關(見Clive Ballard et al., Alzheimer's disease, The Lancet. 2011 March, 377(9770): 1019–1031)。最近研究發現，神經炎症或小膠質細胞的啟動參與了阿爾茨海默病中tau蛋白纏結在新皮質中的擴散，進而導致阿爾茨海默病患者認知功能障礙的發生(見Tharick A. Pascoal et al., Microglial activation and tau propagate jointly across Braak stages, Nature Medicine, 27, pages1592–1599(2021 August))。小膠質細胞啟動是人類大腦免疫反應的一部分，是與阿爾茲海默病發展相關的關鍵因素。小膠質細胞的過度啟動不僅僅是一種炎症附帶現象，更是一種關鍵的上游機制，對AD的發展至關重要。研究還發現，神經炎症和某些炎症細胞因數參與AD的病理學(見Rishika Dhapola et al., Recent advances in molecular pathways and therapeutic implications targeting neuroinflammation for Alzheimer’s disease, Inflammopharmacology volume 29, pages1669–1681(2021 November))。因此，減少Aβ斑塊沉積、緩解神經炎症以及抑制小膠質細胞的啟動可視為治療或緩解AD的有效手段。帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一種影響中樞神經系統的慢性神經退行性疾病，主要影響運動神經系統。它的症狀通常隨時間緩慢出現，早期最明顯的症狀為顫抖、肢體僵硬、運動功能減退和步態異常，也可能有認知和行為問題。認知障礙症在病情嚴重的患者中相當常見。帕金森病的主要病理變化發生在中腦黑質腹側的緻密部，主要症狀大多數因為黑質緻密部的多巴胺性神經元退化(Jose A Obeso et al., Functional organization of the basal ganglia: therapeutic implications for Parkinson's disease, Movement Disorders, Volume 23, Issue S3 p. S548-S559, Sept. 2008)。司來吉蘭是一種單胺氧化酶(MAO)-B抑制劑(MAOI)，2006年美國FDA批准司來吉蘭用於治療PD患者。本領域中存在有效治療神經退行性疾病或者由神經退行性疾病引起的認知障礙症的藥物的需求。 WO2013/173941和CN104321337A公開了一種具有11至14個氨基酸殘基的鎮痛肽，經序列比對匹配兔α1-抗蛋白酶的片段。WO2016/165101公開了所述肽可以有效抑制HCV複製。此外，WO2016/165102和CN107847550A公開了該肽用於治療腦卒中(一種急性的腦血管疾病)，驗證了所述肽能夠通過腦血屏障，並通過體外細胞實驗驗證了所述肽對PC12細胞免受谷氨酸和過氧化氫誘導的細胞毒性的保護作用。這些檔通過引用結合到本文中。WO2016/165102中測試的PC12細胞是一種衍生自顯示神經節細胞的某些特徵的大鼠腎上腺髓質的嗜鉻細胞瘤，其特別用於建立細胞缺氧損傷模型，從而類比急性腦血管疾病中的迅速缺氧和毒性狀態。然而，阿爾茨海默病和帕金森病屬於慢性疾病，它們並非由腦血管栓塞或破裂而導致的急性大腦缺氧和毒性引起。現有技術尚未提及所述肽用於治療AD或PD的可能性。

本發明目的包括提供用於治療神經退行性疾病和認知障礙症的藥物，以及提供用於改善或提高受試者認知功能的活性成分或組合物。本發明目的還包括提供用於治療阿爾茨海默病和帕金森病的藥物。本發明的技術問題之一通過提供本發明的肽以及包含所述肽的組合物來解決。本發明涉及一種肽，其具有SEQ ID NO: 1或2的氨基酸序列或其變體或片段。“變體”和“片段”意指與本發明肽相比具有一定的氨基酸殘基變化並且基本上保留與所述肽的相同或類似的生物功能或活性的肽。氨基酸序列的變體可以是與所述氨基酸序列具有至少某個百分比同一性的氨基酸序列的變體，或者與所述氨基酸序列相比具有至少一個或多個氨基酸突變的氨基酸序列的變體。例如，所述變體可以與SEQ ID NO: 1或2的氨基酸序列具有至少70%的同一性。或者，所述所述變體可以在SEQ ID NO: 1或2的氨基酸序列中具有0至4個氨基酸突變。氨基酸序列的片段可以是與所述氨基酸序列相比在C-端和/N-端具有一個或多個缺失的氨基酸序列。所述缺失可以是1-5個，例如1、2、3、4或5個。氨基酸序列的片段的長度可以是8至20個氨基酸，例如10至15個氨基酸，例如10、11、12、13、14或15個氨基酸。在一個方面中，本發明的肽選自： a) 包含與DEAQETAVSSH(SEQ ID NO: 1)具有至少70%同一性的氨基酸序列的肽； b) 包含在DEAQETAVSSH(SEQ ID NO: 1)中具有0至4個氨基酸突變的氨基酸序列的肽； c) 包含與DEAQETAVSSHEQD(SEQ ID NO: 2)具有至少70%同一性的氨基酸序列的肽；或 d) 包含在DEAQETAVSSHEQD(SEQ ID NO: 2)中具有0至4個氨基酸突變的氨基酸序列的肽。在一個方面，本發明肽包含與SEQ ID NO: 1具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或者100%同一性的氨基酸序列。在一個方面，本發明肽包含在SEQ ID NO: 1中或相對於SEQ ID NO: 1具有0至4個氨基酸突變，例如0至3個，例如1至3個，例如0、1、2、3或4個氨基酸突變的氨基酸序列。在一個方面，本發明肽包含與SEQ ID NO: 2具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或者100%同一性的氨基酸序列。在一個方面，本發明肽包含在SEQ ID NO: 2中或相對於SEQ ID NO: 2具有0至4個氨基酸突變，例如0至3個，例如1至3個，例如0、1、2、3或4個氨基酸突變的氨基酸序列。氨基酸突變可以選自氨基酸的添加、缺失或取代。添加可以是氨基酸序列中兩個氨基酸殘基之間***氨基酸，或者是在氨基酸序列C-端或者N-端的添加。缺失可以是氨基酸序列中兩個氨基酸殘基之間刪除氨基酸，或者是氨基酸序列C-端或者N-端的缺失。取代可以是氨基酸序列中任意氨基酸殘基的取代。優選地，氨基酸的添加、缺失或取代發生在序列的C-端或者N-端。取代可以是保守取代。保守取代是指性狀相近的氨基酸分子之間的取代，其中的性狀包含分子的離子性、疏水性和分子量等。性狀相近的氨基酸可以按以下分類：脂肪族氨基酸(例如甘氨酸, 丙氨酸, 纈氨酸, 亮氨酸, 異亮氨酸)；含羥基或含硫氨基酸(例如絲氨酸, 半胱氨酸, 蘇氨酸, 甲硫氨酸)；環狀氨基酸(例如脯氨酸)；芳香族氨基酸(例如苯丙氨酸, 酪氨酸, 色氨酸)；鹼性氨基酸(例如組氨酸, 賴胺酸, 精氨酸)和酸性或醯胺類氨基酸(例如天冬氨酸, 谷氨酸, 天冬醯胺, 穀氨醯胺)。本領域技術人員理解，構成肽、多肽或蛋白的二十種常見的氨基酸及其字母縮寫如下表1所示。技術人員可以例如根據下表1或者公知常識確定本發明肽的氨基酸殘基順序和組成。氨基酸突變可以位於氨基酸序列的C-端和/或N-端。例如，所述肽可以在SEQ ID NO: 1的C-端或者N-端具有1個、2個或3個氨基酸添加。例如，所述肽可以在SEQ ID NO: 2的C-端或者N-端具有1個、2個或3個氨基酸缺失。在一個方面，本發明的肽可以具有8至20個氨基酸的長度，優選10至18個氨基酸長度，更優選11至14個氨基酸長度。例如，所述肽的長度可以為10、11、12、13、14、15、16、17或18個氨基酸。在一個方面，本發明的肽可以選自 1) 包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列組成或者由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列表示的肽；或者 2) 包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列組成或者由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列表示的肽。在一個方面，本發明的肽由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列組成。或者，本發明的肽由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列組成。在一個方面，本發明涉及本文所述的肽在製備用於預防、治療或改善有需要的受試者中神經退行性疾病的組合物中的用途。在一個方面，本發明涉及肽，其用於預防、治療或改善有需要的受試者中神經退行性疾病。在一個方面，本發明涉及一種預防、治療或改善有需要的受試者中神經退行性疾病的方法，所述方法包括將有效量的肽給予需要的受試者。神經退行性疾病可包括認知障礙症。在一個方面，神經退行性疾病是慢性神經退行性疾病。在一個方面，本發明涉及本文所述的肽在製備用於預防、治療或改善有需要的受試者中認知障礙症的組合物中的用途。在一個方面，本發明涉及肽，其用於預防、治療或改善有需要的受試者中認知障礙症。在一個方面，本發明涉及一種預防、治療或改善有需要的受試者中認知障礙症的方法，所述方法包括將有效量的肽給予需要的受試者。認知障礙症可以由神經退行性疾病引起。或者，認知障礙症可以伴隨神經退行性疾病。在一個方面，神經退行性疾病或認知障礙症選自阿爾茨海默病或帕金森病。因此，本發明的肽可以用於預防、治療或改善阿爾茨海默病。此外，本發明的肽可以用於預防、治療或改善帕金森病。認知可以是機體認識和獲取知識的智慧加工過程，涉及學習、記憶、語言、思維、精神、情感等一系列隨意、心理和社會行為。認知障礙可以包括與上述學習記憶以及思維判斷有關的大腦高級智慧加工過程出現異常，從而引起嚴重學習、記憶障礙，同時伴有失語或失用或失認或失行等改變的病理過程。在一個方面，本發明涉及本文所述的肽在製備用於改善、增強或恢復有需要的受試者中認知功能或認知能力的組合物中的用途。在一個方面，本發明涉及肽，其用於改善、增強或恢復有需要的受試者中認知功能或認知能力。在一個方面，本發明涉及一種改善、增強或恢復有需要的受試者中認知功能或認知能力的方法，所述方法包括將有效量的肽給予需要的受試者。在該方面中，認知功能或認知能力包括感知能力、思維邏輯能力、記憶能力、語言能力、學習能力、情緒控制能力、社交能力或注意力。在該方面中，所述受試者具有認知功能或認知能力衰退，例如年齡老化而引致的或伴隨年齡老化的認知功能或認知能力衰退。或者，所述受試者可以患有認知障礙症或神經退行性疾病引起，優選由神經退行性疾病引起的認知障礙症，更優選阿爾茨海默病或帕金森病。在一個方面，認知障礙症特徵在於或表現在於溝通障礙、判斷力差、難以進行簡單任務、遺漏或放錯物件、語言障礙、性格突變、行為能力下降、時間及空間感混亂、理解能力下降、問題解決能力下降、注意力下降、社交能力下降、感知障礙、思維邏輯障礙或記憶障礙。在一個方面，神經退行性疾病或認知障礙症為阿爾茨海默病。所述阿爾茨海默病特徵在於在大腦特別是海馬體中β-澱粉樣蛋白(Aβ)沉積、神經炎症、和/或膠質細胞異常或活化。阿爾茨海默病的預防、治療或改善通過減少或緩解在大腦中β-澱粉樣蛋白(Aβ)沉積、神經炎症和/或膠質細胞異常或活化來實現。在一個方面，本發明涉及本文所述的肽在製備用於減少或緩解受試者大腦特別是海馬體中β-澱粉樣蛋白(Aβ)沉積、神經炎症和/或膠質細胞異常或活化的組合物中的用途。所述受試者可以是神經退行性疾病患者或認知障礙症患者，優選阿爾茨海默病患者。本文所述的肽可以有效減少或緩解受試者大腦例如海馬體中的Aβ或Aβ斑塊沉積。此外，所述肽可以減少或緩解受試者大腦例如海馬體或者皮層中炎症因數的表達或水準。炎症因數可以選自IL-1β、IL-6或TNF-α。所述肽還可以減少或緩解大腦海馬體膠質細胞異常或活化。膠質細胞也可稱為神經膠質細胞，可以選自星形膠質細胞或小膠質細胞，優選小膠質細胞。在一個方面，神經退行性疾病或認知障礙症為帕金森病。所述帕金森病特徵在於大腦黑質神經元異常或損傷。帕金森病的預防、治療或改善通過減少或緩解大腦黑質神經元異常或損傷來實現。在一個方面，本發明涉及本文所述的肽在製備用於減少或緩解受試者大腦黑質神經元異常或損傷的組合物中的用途。所述受試者可以是神經退行性疾病患者或認知障礙症患者，優選帕金森病患者。在一個方面，受試者或患者是哺乳動物。在一個方面，受試者或患者是人，例如中年人或老年人，優選老年人。中年人可以是40至59歲的人或者45至59歲的人。老年人可以是60歲以上、65歲以上、70歲以上、75歲以上或80歲以上的人。在一個方面，受試者可以是認知功能或認知能力衰退的受試者，例如年齡老化而引致的或伴隨年齡老化的認知功能或認知能力衰退。所述衰退通常是指慢性衰退。本發明的組合物包含本文所述的肽。本發明的組合物還可以包含藥用輔料、溶媒或載體；或者人體可接受的藥用輔料、溶媒或載體。組合物可以是藥物組合物或者營養組合物。藥物組合物可以是藥物。營養組合物可為營養補充劑、營養補充品、膳食補充劑、飲食補充劑、保健食品、保健品、營養品或健康食品的形式。本文所述的“組合物”總體上可以包括改善或提高受試者(例如人)的健康況狀或治療所述受試者的疾病的物質或配方。本文所述的“營養組合物”可以指滿足受試者(例如人)至少部分營養物需求、調節所述受試者身體機能、調理受試者生理功能和/或改善受試者健康狀態的可服用的物質或配方。例如，營養組合物可以是啟動、調節或改善認知功能或認知能力的保健品、功能性食品、膳食補充劑、營養品或健康食品。本文所述的“藥物組合物”可以指用於預防、治療、緩解、改善、調理或調節受試者(例如人)的疾病、病症、症狀或病狀的可服用的物質或配方。例如，藥物組合物可以是藥物的形式，包括口服藥物，例如藥片、藥丸或膠囊等。本發明的多肽或組合物的服用可以是口服形式。用於口服的組合物可以使用本領域已知的載體、溶媒或賦形劑以適合於口服施用的劑量進行配製。這樣的載體使得組合物能夠配製成適合於受試者攝入的片劑、丸劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、混懸劑等。此外，本發明的多肽或組合物可被製備成注射劑，例如肌肉注射劑、腹膜內注射劑、腹腔注射劑、皮下注射劑或者靜脈注射劑。注射劑可以呈溶液、乳濁液或混懸液形式，以及臨用前配成溶液或混懸液的粉末或濃溶液。本領域技術人員理解，注射劑中還可包含溶劑例如水、等滲劑、緩衝劑、防腐劑、助溶劑、增溶劑、助懸劑和乳化劑等。術語“有效量”或“治療有效量”是指本發明的肽或組合物有效治療受試者的疾病或病症或者改善或提高其健康狀況的量。改善或提高其健康狀況包括提高或改善認知功能或能力。本發明的肽可以按0.01mg/kg至10mg/kg、0.02 mg/kg至8mg/kg、0.04mg/kg至5mg/kg、0.05mg/kg至1 mg/kg、0.1mg/kg至0.8mg/kg或0.2mg/kg至0.5mg/kg的量給予受試者。例如，本發明的肽可以按0.04mg/kg、0.16 mg/kg或0.64mg/kg的量給予受試者。治療有效量可以是這些劑量。本發明的肽或組合物可以按一天一次的間隔給藥，持續至少1周，例如1至4周。本發明的肽可以按肽組合的形式給予受試者或製備成組合物。本發明的組合物可包含這樣的肽組合。例如，所述肽組合包含具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或其變體的第一肽以及具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或其變體的第二肽。

除非另有說明，否則本文使用的所有科學術語都和本領域一般技術人員通常理解的含義一致。下文描述了示例方法和材料，可以使用其等同物。本文提及的所有出版物和其它參考文獻都通過引用整體結合到本文中。提供以下的實施例是為了進一步闡述本發明。以下實施例無意以任何理由限制本發明的範圍。 實施例 實施例 1 – 本發明肽對阿爾茨海默病模式動物 APP/PS1 小鼠神經保護作用的研究PKT101肽：DEAQETAVSSHEQD(SEQ ID NO: 2) PKT002肽：DEAQETAVSSH(SEQ ID NO: 1) 可通過WO2013/173941和WO2016/165102中描述的方法獲得上述肽。 1. 材料和方法5月齡的APP/PS1雄性小鼠60隻，隨機分為4組，每組15隻，分別每日腹腔注射生理鹽水、PKT101(8mg/kg)、PKT002(8mg/kg)和PKT101/PKT002(8mg/kg)聯合給藥，為期4周。每組腹腔注射終體積為80μL，每週給藥結束後，隨機取出20-35隻小鼠測量體重，體重平均數作為下周給藥劑量的重要依據。對小鼠進行短期學習記憶(Y迷宮和新物體識別)、條件性恐懼記憶和社交行為學檢測，並通過硫磺素染色和6E10免疫螢光染色檢測大腦皮層和海馬斑塊沉積情況；通過免疫螢光染色觀察皮質和海馬腦區小膠質細胞和星形膠質細胞的活化情況；酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測炎症因數白介素- 1β(IL-1β)、白介素- 6(IL-6)和腫瘤壞死因數(TNF-α)的含量。 1.1. 行為學檢測 1.1.1. 短期學習記憶 1.1.1.1. Y 迷宮本實驗所使用的Y迷宮裝置，三個臂之間夾角為120度，相互聯通，三個臂尺寸相同，均為長寬高29cm × 8cm × 15cm，在臂內側貼上不同圖案為小鼠作為視覺標記，分別命名為起始臂，新奇臂和其他臂。實驗流程分為兩部分，適應階段和測試階段，兩次間隔1-2h。適應是將新奇臂用擋板隔開，小鼠只能在起始臂和其他臂內自由活動，每隻小鼠適應時間為5min，測試階段是在1-2h後，將新奇臂打開，小鼠可以在三個臂內自由活動，每隻小鼠測試時間為5min。實驗過程中用Topscan軟體即時記錄小鼠進入新奇臂的時間與次數。每次實驗結束後都需用75%酒精清理實驗器具，清除小鼠氣味。 1.1.1.2. 新物體識別本裝置在進行測試前，要對小鼠消除陌生感，每天撫摸小鼠，以免操作時對小鼠產生刺激。第1階段(熟悉期)，在裝置中放入2個相同的物體(AB，確保物體沒有氣味，不被推動)，物體距離兩側壁10cm，將小鼠從兩物體中間放入裝置中，用攝像頭及軟體來記錄小鼠在每個物體上的探索時間(以嘴或者鼻子接觸到物體和湊近物體約2-3 cm範圍都算對物體的探索)，在5min內(許多實驗已經證實熟悉期2min時，動物對新奇事物已經有偏好，而多熟悉3 min則偏好更加明顯)測定動物探索每個物體的次數、時間和距離。第2階段(測試期)，第1階段完成後的1h作為檢測記憶的時間間隔，將兩個相同物體中的一個物體替換成一個不同的物體放入裝置中(AC或BC)，同樣將小鼠從兩個物體中間放入裝置中，記錄5min內小鼠對新舊物體探索的次數、時間和距離，即小鼠在新舊物體周圍活動的次數、時間和距離，檢測小鼠的認知情況。每次實驗結束後都需用75%酒精清理實驗器具。若小鼠認知能力差，則在新舊物體的探索無差異；若小鼠認知能力正常，則對新事物的探索時間較舊事物長。認知指數(recognition index，RI)計算公式為：RI = 新物體 /(新物體 + 舊物體)×100 %。 1.1.2. 條件性恐懼記憶本實驗第1天將小鼠放入箱內(箱子底部為銅條柵欄，可通電)，適應3min後，讓小鼠在箱內繼續停留6min，在此期間，每2min同時給予一次單一頻率聲音刺激(1.0 KHZ，70db，30s)以及不可逃避足底電擊(0.8 mA，2s)，共三次，記錄小鼠6min內聲音和電擊誘發僵直行為的總時間，隨後放回飼養籠。每次實驗結束後用75%酒精擦拭箱底。24h後將已建立條件恐懼的小鼠放入原來的箱內，立即給予相同強度的聲音刺激(1.0KHZ，70db，30s)，記錄小鼠3min內聲音誘發僵直行為。僵直行為定義為除呼吸外無其他運動行為。記錄環境和聲音誘發僵直時間百分比。 1.1.3. 社交行為 1.1.3.1. 社交偏好階段實驗開始前，將小鼠放在行為測試室適應0.5h，用所測試的長方形箱子等分為Empty、Center和Stranger-1三個區域。將同性別同背景相同月齡的小鼠放進Stranger-1區域裡的金屬籠子裡，另外一側箱子的金屬籠子空著。將測試小鼠從中間(Center)的箱子裡放入，使測試小鼠可以在三個箱子中自由活動5min。拍攝並記錄相關參數：進入每個箱子持續的時間，當小鼠的頭和四爪都進入一個箱子就認為它處在那個箱子中。 1.1.3.2. 社交記憶階段在社交記憶階段實驗中空著的金屬籠子中放入同性別同背景不同月齡的小鼠(Stranger-2)，然後記錄5min，觀察測試小鼠在Stranger-1和Stranger-2區域活動的時間。 1.2. 腦組織取材和切片製備 1.2.1. 取材在小鼠行為學檢測結束後及時取材。麻醉後經眼球取血。用生理鹽水由心臟左心室灌流，灌注至肝臟呈土黃色，更換4%多聚甲醛溶液灌注5min，取腦置入4%多聚甲醛，4℃固定過夜。切取海馬和皮層部分的腦組織，進行蔗糖梯度脫水。 1.2.2. 冰凍切片製備應用萊卡冰凍切片機對OCT樹脂包埋的腦組織，進行冠狀切片，片厚10 μm，收集於PBS中用於免疫螢光染色和Aβ病理組織學分析。 1.3. 免疫螢光染色切片用10%胎牛血清PBS溶液室溫下封閉1h。棄去封閉液，加入鼠源性6E10抗體、雞源性膠質纖維酸性蛋白抗體和兔源性鈣離子結合受體分子 1(inized calcium binding adapter molecule 1，Iba1)抗體，4℃孵育過夜。次日洗去一抗，PBS洗3遍，每次5min。加入相應種屬的二抗(山羊抗雞IgG-488；驢抗兔IgG-488；驢抗鼠IgG-647)，室溫避光孵育1h。棄去二抗PBS洗3次，每次5min，DAPI染色室溫10min，棄去DAPI，PBS洗3遍。抗螢光淬滅劑封片，螢光顯微鏡下攝片。 1.4. 硫磺素 S 染色硫磺素S可以標記腦片上的Aβ核心斑塊，脫蠟水化後的組織切片即可染色，採用1%硫磺素染色5min，流水沖洗1min，70%酒精分色30s，再用抗螢光淬滅劑封片，螢光顯微鏡下攝片。 1.5. 圖像分析採用Leica顯微鏡拍攝免疫螢光染色的組織切片，應用ImageJ軟體採用灰度閾值分析方法，統計GFAP、Iba1、6E10、硫磺素的陽性面積百分比，每組5隻小鼠，每隻小鼠選擇3張切片，取其平均值作為該組的統計結果。 1.6. 酶聯免疫吸附實驗 (ELISA) 1.6.1. 取材小鼠麻醉後，斷頭處死，剝離頸部和頭部皮膚，暴露顱骨，沿矢狀縫剪開顱骨，分離顱骨後取出腦組織。將皮層組織和海馬組織分別放入標記好的離心管中，迅速在液氮中冷凍，轉移到-80℃冰箱保存。 1.6.2. 樣品準備冰盒上取皮層和海馬組織10-20mg左右，放入1.5mL離心管中稱量後按品質體積比1:10加入RIPA裂解液，剩餘組織放回原來的管子，用液氮速凍。同時離心管中加入兩枚鋼珠，放入勻漿機配平後勻漿裂解，然後冰上搖晃30 min。取出鋼珠，12000rpm，4℃，15min離心，充分吸取上清，轉移至新的1.5mL離心管中。採用蛋白定量法定量蛋白濃度。 1.6.3. ELISA樣本加入稀釋液稀釋到適當濃度，將稀釋好的樣品加入酶標反應孔，用於測試白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因數-α(TNF-α)3種促炎指標，每樣品至少加雙孔，標準品和樣本每孔45μL，隨後在樣本和標準品孔中加入50μL生物素化抗體工作液，用封板紙封住反應孔板，置室溫孵育2h(使用微量振盪器，頻率，300rpm)。提前30min製備酶結合底物，室溫避光放置。棄去孔中液體後在吸水紙上拍乾，洗滌次數5次，洗滌方法：吸乾孔內反應液，將洗滌液加入孔板，放置2min略作搖動。除空白孔外的每孔加100μL酶結合底物工作液，置室溫孵育1h(使用微量振盪器，頻率，300rpm)。棄去孔中液體後在吸水紙上拍乾，洗滌次數5次，除空白孔外的每孔加100 μL顯色底物工作液，室溫避光放置15min。除空白孔外的每孔加入終止液100μL終止反應，於20min內測定實驗結果。450 nm波長下檢測，標準孔和測試孔的吸收值。根據標準孔和已知濃度繪製標準曲線，後由標準曲線換算出測試孔的的實際濃度，最後根據蛋白濃度得出每毫克腦組織中含有的目標蛋白質量。 2. PKT101 、 PKT002 和 PKT101/PKT002 聯合給藥後對 APP/PS1 小鼠認知行為的影響應用Y迷宮實驗評價各組小鼠的短期記憶，結果顯示：較對照組APP/PS1小鼠相比，PKT101治療組APP/PS1小鼠進入新奇臂的時間有所增加，而PKT002和PKT101/ PKT002聯合治療組APP/PS1小鼠進入新奇臂的時間顯著性增加(圖1A)。應用新物體識別實驗評價各組小鼠的短期記憶，結果顯示：較對照組相比，上述三種治療組APP/PS1小鼠識別新物體的指數顯著性增加(圖1B)。應用條件恐懼記憶評價各組小鼠的恐懼記憶，結果顯示：PKT101、PKT002和PKT101/ PKT002聯合治療組APP/PS1小鼠恐懼時間百分比均未出現明顯的變化，但相對於對照組有所減少(圖1C)；應用三箱實驗評價各組小鼠的社交能力，結果顯示：在社會偏愛階段，PKT101表現出對同性別小鼠(Stranger1)偏愛(圖1D左)，提示社會學習能力有所提高；在社會記憶階段，PKT101組中對Stranger1仍有一定偏愛(圖1D右)。實驗結果還見下表2。 3. PKT101 、 PKT002 和 PKT101/PKT002 聯合給藥後對 APP/PS1 小鼠 Aβ 沉積的影響應用硫磺素染色和6E10免疫螢光染色，分別評價各組小鼠皮層和海馬纖維性和彌散性Aβ斑塊沉積情況，硫磺素染色結果顯示：與對照組相比，PKT101、PKT002和PKT101/PKT002聯合治療組APP/PS1小鼠海馬Aβ斑塊均顯著減少，另對皮層中沉積Aβ斑塊沒有影響(圖2A，C)。6E10染色結果顯示，PKT101、PKT002和PKT101/PKT002聯合給藥後對APP/PS1小鼠海馬Aβ沉積顯著性降低，而對皮層中Aβ沉積沒有影響(圖2B，D)。實驗結果還見表3。 4. PKT101 、 PKT002 和 PKT101/PKT002 聯合給藥後改善 APP/PS1 小鼠海馬 Aβ 斑塊周圍膠質細胞活化通過6E10、GFAP和Iba1共標染色分別評價APP/PS1小鼠海馬和皮層Aβ斑塊周圍小膠質細胞和星形膠質細胞活化情況，結果顯示：與對照組相比，PKT101、PKT002和PKT101/PKT002聯合治療組小鼠海馬小膠質細胞活化程度均明顯降低(圖3A-B)。PKT002和PKT101/PKT002聯合給藥治療組顯著降低小鼠海馬星形膠質細胞活化(圖3A，C)。與對照組相比，PKT101、PKT002和PKT101/PKT002聯合給藥治療組小鼠大腦皮層膠質細胞活化均未見明顯改善(圖4A-B)。實驗結果還見表4。 5. PKT101 、 PKT002 和 PKT101/PKT002 聯合給藥後對 APP/PS1 小鼠海馬和大腦皮層 IL-1β 、 IL-6 和 TNF-α 含量的影響應用ELISA檢測各組小鼠海馬和大腦皮層炎症因數IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，結果顯示：與對照組相比，PKT101、PKT002和PKT101/PKT002聯合治療小鼠海馬炎症因數IL-6和TNF-α的含量顯著性降低，PKT002和PKT101/PKT002聯合治療組IL-1β的含量顯著性降低(圖5A)，而上述三組小鼠大腦皮層IL-6的表達顯著性降低，其他炎症因數IL-1β和TNF-α表達均未見顯著性差異(圖5B)。實驗結果還見表5。 6. 結論PKT101和PKT002單獨治療以及PKT101/PKT002聯合治療均能不同程度改善APP/PS1小鼠短期認知障礙、減低海馬Aβ負荷沉積、膠質細胞活化和炎症因數的含量。 實施例 2 – 本發明肽對 MPTP 亞急性帕金森病小鼠模型藥效學實驗研究PKT101肽：DEAQETAVSSHEQD(SEQ ID NO: 2) PKT002肽：DEAQETAVSSH(SEQ ID NO: 1) 可通過WO2013/173941和WO2016/165102中描述的方法獲得上述肽。 1. 材料和方法應用MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶)建立亞急性帕金森病小鼠模型。小鼠稱重後記錄，按照20mg/kg頸後部皮下注射MPTP，每天一次，連續注射5天，最後一次給藥後的第1、3、7和14天時進行後續實驗。將168隻健健康成年C57BL/6J雄性小鼠，按體重隨機分為八組，為正常對照(Sham)組(n=20)、MPTP模型組(n=28)、PKT101低劑量(0.5mg/kg/d)治療組(n=20)、PKT101中劑量(2mg/kg/d)治療組(n=20)、PKT101高劑量(8mg/kg/d)治療組(n=20)、PKT002(8mg/kg/d)治療組(n=20)、PKT101(8mg/kg/d)+PKT002(8mg/kg/d)合併治療組(n=20)和陽性對照藥司來吉蘭(Selegiline，咪多吡)(0.5 mg/kg/d)治療組(n=20)。從第一次MPTP給藥後1小時開始腹腔注射相應藥物進行治療，持續7或14天，每天一次。MPTP模型組小鼠給予等體積生理鹽水(0.1mL/10g)。Sham組小鼠僅給予等體積生理鹽水(0.1mL/10g)。在MPTP最後一次給藥後的第1、3、7和14天時進行曠場、爬杆和轉棒實驗，評價小鼠的行為學改變。在MPTP最後一次給藥後的第7和14天時對中腦進行尼氏和TH染色，計數黑質緻密部尼氏和TH陽性細胞數量，評價相應腦區多巴胺能神經元損傷程度。 2. 行為學評價分別在MPTP最後一次給藥後的第1、3、7和14天時進行行為學評價。 2.1. 曠場試驗曠場試驗用於評價小鼠的自主運動能力。開放式曠場裝置由不透明的藍色塑膠製成，大小為60cm×60cm×45 cm。測試時，將每隻小鼠從中心區域放入箱內，同時開始記錄每隻小鼠在5min內的運動軌跡，使用軟體(Clever Sys Inc.，VA，USA)計算總運動路程。每隻小鼠測試結束後，使用75%乙醇擦拭曠場區域，防止上一隻小鼠的氣味對下一隻鼠造成影響。 2.2. 爬杆試驗爬杆試驗用於評估小鼠的運動協調功能。所用杆子直徑lcm，高度50cm，立杆頂端固定有直徑為1.2cm的木球，將立杆用防滑膠帶裹住以防止小鼠滑落。將小鼠頭部向上置於杆頂，小鼠開始向上爬時啟動計時器，記下小鼠從開始運動到越過杆頂所需時間(T-Turn)和從開始運動到爬至底部四爪落地時間(T-TLA)。正式測試前，需對每隻小鼠進行三次連續訓練。測試期間，需連續測量三次，取其中所用最短時間。 2.3. 轉棒測試使用轉棒試驗評估小鼠的運動平衡能力和肢體協調性。將小鼠放於rotarod測試儀滾筒上，將轉速設成2分鐘內從5rpm/min勻速增加到25rpm/min，小鼠從滾筒上掉落至下方感應區域時會有紅外感應器接收信號，記錄小鼠在儀器滾筒上運動的時間。正式測試前，需對每隻小鼠進行三次連續訓練。測試期間，需連續測量三次，取平均掉落時間(潛伏期)。 3. 免疫組化研究分別在MPTP最後一次給藥後的第7和14天取每組一半的小鼠，用4%水合氯醛麻醉、生理鹽水+4%PFA灌注取腦組織。後經由20%(v/v)和30%(v/v)的蔗糖溶液梯度脫水各3天後，將小鼠腦組織用O.C.T.膠包埋後冰凍，冰凍切片機(Leica)連續組織切片(20 μm)，收集相關區域腦片置於凍存液(甘油：0.01M PBS = 1:1)中，於-80℃保存待用。 3.1. 尼氏染色尼氏體是胞質內的一種嗜鹼性物質，廣泛見於各種神經元，用於計算腦神經元數量。按照尼氏染色試劑盒進行染色。 3.2. TH(Tyrosine hydroxylase ，酪氨酸羥化酶 ) 染色TH主要標記黑質緻密部多巴胺能神經元，MPTP造模後該腦區TH陽性神經元會顯著減少。取出中腦腦片，0.01M PBS 10min洗片一次後，以3% H ₂O ₂孵育15min以去除內源性過氧化物酶活性，0.01 M PBS 10min×3洗去H ₂O ₂，然後用含5% BSA和0.3% Triton X-100的PBS於室溫下封閉1小時，繼而孵育小鼠抗TH一抗(T2928，Sigma，USA)4℃過夜，二抗室溫孵育1小時，PBS洗滌5min×3次後二氨基聯苯氨(diaminobenzidin，DAB)避光顯色。 4. 細胞計數和資料處理及分析免疫組織化學陽性細胞計數採用體式學計數系統(Stereo Investigator，MBF bioscience)計算黑質緻密部的尼氏小體陽性細胞和TH ⁺細胞數，細胞計數在×20物鏡下進行。所有資料均採用Mean ± S.E.M的表示，採用GraphPad Prism 8.0統計分析軟體進行統計學處理。計量資料採用One-way ANOVA合併Dunnett’s test 分析各組與造模組之間的差異， p＜ 0.05表示差異具有統計學意義。 5. 實驗結果 5.1. PKT101 和 PKT002 對小鼠 MPTP 亞急性模型後生存率的影響MPTP亞急性給藥使得小鼠在造模後精神萎靡、厭食、體重下降，並出現豎尾反應，但本次實驗中未出現小鼠的死亡，藥物治療各組小鼠也未出現死亡現象。 5.2. PKT101 和 PKT002 對小鼠 MPTP 亞急性模型後體重改變的影響MPTP亞急性給藥使得小鼠在造模後進食量小，7天內小鼠體重略降低，14天後進食逐漸增加，體重逐漸恢復。各組處理對小鼠體重無顯著影響。結果如圖6所示。 5.3. PKT101 和 PKT002 對小鼠 MPTP 亞急性模型後在礦場實驗中自主運動能力的影響如表6和圖7所示，MPTP亞急性模型中，小鼠在造模後1、3、7和14天時出現曠場試驗中總運動路程的減少，表明自主活動能力的下降。陽性對照藥司來吉蘭(Selegiline)在1、3、7和14天均能顯著改善MPTP誘導的總運動路程減低。PKT101和PKT002在14天內也均有顯著的改善作用。在14天時，單PKT101給藥低、中和高劑量增加為模型組的221.1%、253.9%和255.3%；單PKT002給藥增加為模型組的213.0%；PKT101和PKT002合併給藥增加為模型組的214.8%。 5.4. PKT101 和 PKT002 對小鼠 MPTP 亞急性模型後在爬杆實驗中運動協調能力的影響如表7~8和圖8~9，MPTP亞急性模型中，小鼠在造模後1、3、7和14天時出現爬杆實驗中T-Turn和T-TLA時間的延長，表明運動協調能力的下降。陽性對照藥司來吉蘭(Selegiline)在1、3、7和14天均能顯著改善MPTP誘導的T-Turn和T-TLA時間延長。PKT101和PKT002在14天內也均有顯著的改善作用。對T-Turn，在14天時，單PKT101給藥低、中和高劑量分別減少為模型組的26.1%、24.6%和26.0%；單PKT002給藥減少為模型組的24.4%；PKT101和PKT002合併給藥減少為模型組的21.6%。對T-TLA，在14天時，單PKT101給藥低、中和高劑量分別減少為模型組的68.8%、65.1%和38.6%；單PKT002給藥減少為模型組的46.0%；PKT101和PKT002合併給藥減少為模型組的46.3%。 5.5. PKT101 和 PKT002 對小鼠 MPTP 亞急性模型後在轉棒實驗中運動平衡能力的影響如表9和圖10，MPTP亞急性模型中，小鼠在造模後1、3、7和14天時出現轉棒實驗中掉落潛伏期的縮短，表明運動平衡能力的下降。陽性對照藥司來吉蘭(Selegiline)在1、3、7和14天均能顯著改善MPTP誘導的潛伏期時間縮短。PKT101和PKT00在14天內均有顯著的改善作用。在14天時，單PKT101給藥低、中和高劑量的潛伏期分別延長為模型組的121.7、119.9%和118.3%；單PKT002給藥延長為模型組的120.3%；PKT101和PKT002合併給藥延長為為模型組的120.9%。 5.6. 立再適對小鼠 MPTP 亞急性模型後黑質緻密部尼氏陽性染色神經元數量的影響如表10和圖11，MPTP亞急性模型中，小鼠在造模後7和14天時出現黑質緻密部尼氏染色陽性神經元數量的減少，表明該腦區神經元的死亡。陽性對照藥司來吉蘭(Selegiline)在7和14天均能顯著改善MPTP誘導的黑質緻密部尼氏染色陽性神經元數量的減少。PKT101和PKT002在7和14天時也均有顯著的改善作用。在7天時，單PKT101給藥低、中和高劑量的尼氏陽性細胞數量分別增加為模型組的120.9%、124.0%和130.9%；單PKT002給藥的尼氏陽性細胞數量增加為模型組的124.5%；PKT101和PKT002合併給藥的尼氏陽性細胞數量增加為模型組的128.0%。在14天時，單PKT101給藥低、中和高劑量的尼氏陽性細胞數量分別增加為模型組的124.9%、130.9%和141.1%；單PKT002給藥的尼氏陽性細胞數量增加為模型組的128.5%；PKT101和PKT002合併給藥的尼氏陽性細胞數量增加為模型組的141.5%。 5.7. PKT101 和 PKT002 對小鼠 MPTP 亞急性模型後黑質緻密部 TH 陽性染色神經元數量的影響如表11和圖12，MPTP亞急性模型中，小鼠在造模後7和14天時出現黑質緻密部TH陽性神經元數量的減少，表明該腦區多巴胺能神經元的死亡。陽性對照藥司來吉蘭(Selegiline)在7和14天均能顯著改善MPTP誘導的黑質緻密部TH染色陽性神經元數量的減少。PKT101和PKT002在7和14天時也均有顯著的改善作用。在7天時，單PKT101給藥低、中和高劑量的TH陽性細胞數量分別增加為模型組的114.5%、124.9%和129.7%；單PKT002給藥的TH陽性細胞數量增加為模型組的129.9%；PKT101和PKT002合併給藥的TH陽性細胞數量增加為模型組的130.3%。在14天時，單PKT101給藥低、中和高劑量的TH陽性細胞數量分別增加為模型組的125.6%、136.0%和137.5%；單PKT002給藥的TH陽性細胞數量增加為模型組的128.1%；PKT101和PKT002合併給藥的TH陽性細胞數量增加為模型組的137.7%。 6. 結論多肽PKT101和PKT002持續7天和14天治療均能顯著改善MPTP亞急性模型後小鼠行為學障礙，可增加曠場試驗中總運動路程，縮短爬杆實驗T-Turn時間和T-TLA時間，延長轉棒實驗潛伏期，但各組間劑量依賴關係不明顯。同時，PKT101和PKT002均能緩解MPTP誘導的黑質緻密部尼氏陽性和TH陽性神經元數量減少。這些結果表明PKT101和PKT002均具有對MPTP亞急性模型的神經保護作用，PKT101和PKT002合併給藥與分別單獨給藥相比，無明顯差別。 實施例 3 – 本發明肽對神經退行性疾病模型中膠質細胞和神經元損傷保護作用的初步研究 1. 實驗目的在細胞水準上，初步探究PKT001、PKT002對膠質細胞和神經元等損傷的保護作用，討論對神經退行性疾病治療的通用機制。 2. 實驗方案小鼠或人的膠質瘤細胞和神經元細胞等，分別按照1、3、9 ug/ml PKT001、PKT002實驗組和對照組進行預處理24h後，再加入脂多糖(LPS，1 μg/ml)誘導48h，進行膜聯蛋白V(Annexin V)/碘化丙啶(PI)雙染色流式分析凋亡細胞比例，檢測PKT001、PKT002給藥對各個神經系細胞凋亡的影響。 3. 實驗材料 細胞株GL261小鼠膠質細胞瘤細胞，培養基：DMEM +10%FBS+ 1%P/S； LN229人膠質瘤細胞，培養基：DMEM+10%FBS+ 1%P/S； WERI-RB-1 人視網膜神經膠質瘤細胞，培養基RPMI-1640+10%FBS+1%P/S； SK-N-SH 人神經母細胞瘤細胞，培養基：MEM(含NEAA)+10%FBS+1%P/S； HT22 小鼠海馬神經元細胞，培養基：DMEM +10%FBS+1%P/S； neuro-2a(N2A)小鼠腦神經瘤細胞，培養基：MEM(含NEAA)+10%FBS+1%P/S；培養條件：37℃，5% CO ₂. 實驗所用的細胞均處於對數生長期。 4. 實驗步驟 PKT001 和 PKT002 對神經系細胞凋亡的影響(1)細胞傳代鋪板：取正常培養的細胞，吸去原培養液，加入PBS洗後加入胰酶消化1-3min後終止消化，用移液槍吹打成單個細胞，細胞懸液200g離心5min，用培養基重懸，取20μl 細胞懸液加入20μl台盼藍進行計數，3*10 ⁵個/孔(6孔板)進行鋪板，3個複孔，5% CO ₂，37℃過夜培養。 (2)加藥處理： ①　Cell； ②　Cell+LPS(1 μg/ml)； ③　Cell+PKT001(1 μg/ml)+LPS(1 μg/ml)； ④　Cell+PKT001(3 μg/ml)+LPS(1 μg/ml)； ⑤　Cell+PKT001(9 μg/ml)+LPS(1 μg/ml)； ⑥　Cell+PKT002(1 μg/ml)+LPS(1 μg/ml)； ⑦　Cell+PKT002(3 μg/ml)+LPS(1 μg/ml)； ⑧　Cell+PKT002(9 μg/ml)+LPS(1 μg/ml)；共8組，藥物先給藥預處理24h後，再LPS誘導處理48h，隨後進行相關檢測。 (3)凋亡檢測： ①　收集細胞：200g，4℃離心5min收集細胞。 ②　用預冷的PBS洗滌細胞2次，每次200g，4℃離心5min。 ③　吸棄PBS，加入100μL 1×Binding Buffer重懸細胞。 ④　加入5μL Annexin FITC和2μL PI，輕輕混勻。 ⑤　避光、室溫反應15min。 ⑥　加入300μL 1×Binding Buffer，混勻後放置於冰上，樣品在1小時內用流式細胞儀檢測。 5. 實驗結果 5.1. PKT001 和 PKT002 對 LPS 誘導 GL261 小鼠膠質細胞瘤細胞凋亡的影響應用Annexin V-FITC/PI雙染色流式分析法，實驗結果顯示：與LPS對照組相比，1-9μg/ml PKT001預處理後，LPS誘導48h GL261細胞凋亡比例顯著降低；1-9μg/ml PKT002預處理後，LPS誘導48h GL261細胞凋亡比例顯著降低。結果如圖13所示。 5.2. PKT001 和 PKT002 對 LPS 誘導 LN229 人膠質瘤細胞 凋亡的影響與LPS對照組相比，1μg/ml PKT001預處理後，LPS誘導48h LN229細胞凋亡比例未顯著性變化，3μg/ml和9μg/ml PKT001預處理後，LPS誘導48h LN229細胞凋亡比例顯著降低。1-9μg/ml PKT002預處理後，LPS誘導48h LN229細胞凋亡比例顯著降低。結果如圖14所示。 5.3. PKT001 和 PKT002 對 LPS 誘導 WERI-RB-1 人視網膜神經膠質瘤細胞 凋亡的影響與LPS對照組相比，1-9μg/ml PKT001預處理後，LPS誘導48h WERI-RB-1細胞凋亡比例顯著降低；1-9μg/ml PKT002預處理後，LPS誘導48h WERI-RB-1細胞凋亡比例顯著降低。結果如圖15所示。 5.4. PKT001 和 PKT002 對 LPS 誘導 neuro-2a(N2A) 小鼠腦神經瘤細胞凋亡的影響與LPS對照組相比，1μg/ml和3μg/ml PKT001預處理後，LPS誘導48h N2A細胞凋亡比例未顯著性變化，9μg/ml PKT001預處理後，LPS誘導48h N2A細胞凋亡比例降低，有顯著性差異。1-9μg/ml PKT002預處理後，LPS誘導48h N2A細胞凋亡比例顯著降低。結果如圖16所示。 5.5. PKT001 和 PKT002 對 LPS 誘導 HT22 小鼠海馬神經元細胞凋亡的影響實驗結果顯示：與LPS對照組相比，1-9μg/ml PKT001預處理後，LPS誘導48h HT22細胞凋亡比例顯著降低；1-9μg/ml PKT002預處理後，LPS誘導48h HT22細胞凋亡比例顯著降低。結果如圖17所示。 5.6. PKT001 和 PKT002 對 LPS 誘導 SK-N-SH 人神經母細胞瘤細胞 凋亡的影響與LPS對照組相比，1μg/ml PKT001預處理後，LPS誘導48h SK-N-SH細胞凋亡比例未顯著性變化，3μg/ml和9μg/ml PKT001預處理後，LPS誘導48h SK-N-SH細胞凋亡比例顯著降低。1-9μg/ml PKT002預處理後，LPS誘導48h SK-N-SH細胞凋亡比例顯著降低。結果如圖18所示。

[圖1]. PKT101、PKT002和PKT101/PKT002聯合服用對APP/PS1小鼠短期工作記憶、條件恐懼記憶和社交能力的影響。(A)Y迷宮實驗中對照組(Con)，PKT101，PKT002和PKT101/PKT002聯合治療組小鼠進入新奇臂時間百分比的統計圖。(B)新物體識別實驗中，四組小鼠新物體識別認知指數統計圖。(C)條件恐懼記憶實驗中，四組小鼠僵直不動時間統計圖。(D)社交偏好和社會記憶實驗中，(左) 小鼠進入Empty室和Stranger-1室的時間百分比統計圖；(右) 小鼠進入Stranger-1室和Stranger-2室的時間百分比統計圖。結果以均值±標準誤的方式表示，n = 13-15每組。資料在D圖中，四組小鼠進入Empty室和Stranger-1的時間百分的比較以及四組小鼠進入Stranger-1室和Stranger-2室的時間百分比的比較使用T檢驗，其他統計圖使用單因素方差分析。Enter number: 進入次數；Recognition index: 認知指數；Time spent: 耗時；% of freezing: 僵直時間百分比。 [圖2]. PKT101、PKT002和PKT101/PKT002聯合服用對APP/PS1小鼠海馬和皮層Aβ斑塊沉積的影響。(A)對照組(Con)、PKT101、PKT002和PKT101/ PKT002聯合治療組小鼠硫磺素S染色的螢光圖。尺規為200 μm。(B)免疫螢光實驗顯示四組小鼠皮層和海馬6E10表達的螢光圖。尺規為200 μm。(C)四組小鼠皮層和海馬硫磺素S陽性表達Aβ斑塊定量統計圖。(D)四組小鼠皮層和海馬6E10陽性表達面積百分比的統計圖。結果以均值±標準誤的方式表示，n = 4-5每組，統計圖使用單因素方差分析。Cortext：皮層；Hippocampus：海馬體；Relative Density：相對密度；Positive area of 6E10+：6E10+的陽性區域。 [圖3]. PKT101、PKT002和PKT101/PKT002聯合服用對APP/PS1小鼠海馬Aβ斑塊周圍膠質細胞活化的影響。(A)免疫螢光實驗顯示對照組(Con)、PKT101、PKT002和PKT101/PKT002聯合治療組組小鼠海馬Iba1，GFAP和6E10表達的螢光圖。尺規為50 μm。(B)四組小鼠海馬Iba1和GFAP陽性表達面積百分比統計圖。結果以均值±標準誤的方式表示，n = 4-5每組，統計圖使用單因素方差分析。Positive area of Iba1+：Iba1+的陽性區域；Positive area of GFAP+：GFAP+的陽性區域。 [圖4]. PKT101、PKT002和PKT101/PKT002聯合服用對APP/PS1小鼠皮層Aβ斑塊周圍膠質細胞活化的影響。(A)免疫螢光實驗顯示對照組(Con)、PKT101、PKT002和PKT101/PKT002聯合治療組小鼠皮層Iba1，GFAP和6E10表達的螢光圖。尺規為50 μm。(B)四組小鼠皮層Iba1和GFAP陽性表達面積百分比統計圖。結果以均值 ± 標準誤的方式表示，n = 5每組，統計圖使用單因素方差分析。Positive area of Iba1+：Iba1+的陽性區域；Positive area of GFAP+：GFAP+的陽性區域。 [圖5]. PKT101、PKT002和PKT101/PKT002聯合服用對APP/PS1小鼠海馬和皮層區IL-1β，IL-6和TNF-α含量的影響。(A)ELISA檢測對照組(Con)、PKT101、PKT002和PKT101/PKT002聯合治療組小鼠海馬中炎症因數IL-1β，IL-6和TNF-α的表達。(B)ELISA檢測四組小鼠皮層中炎症因數IL-1β，IL-6和TNF-α的表達。結果以均值 ± 標準誤的方式表示，n = 5每組，統計圖使用單因素方差分析。Cortext：皮層；Hippocampus：海馬體；Relative expression of IL-1β：IL-1β的相對表達；；Relative expression of IL-6：IL-6的相對表達；；Relative expression of TNF-α：TNF-α的相對表達。 [圖6]. PKT101和PKT002對小鼠MPTP亞急性模型後體重改變的影響。0~7天時，n=20或28；14天時，n=10或14。Sham：正常對照組；Selegiline：司來吉蘭治療組。 [圖7]. PKT101和PKT002對MPTP亞急性模型後小鼠在礦場實驗中總運動路程的影響(1、3、7和14天)。 ^*** p＜0.001, ^** p＜0.01 vs.Sham; ^### p＜0.001, ^## p＜0.01, ^# p＜0.05 vs.MPTP。 [圖8]. PKT101和PKT002對MPTP亞急性模型後小鼠在爬杆實驗中T-Turn的影響(1、3、7和14天)。***p＜0.001, **p＜0.01 vs. Sham；###p＜0.001, ##p＜0.01, #p＜0.05 vs. MPTP。 [圖9]. PKT101和PKT002對MPTP亞急性模型後小鼠在爬杆實驗中T-TLA的影響(1、3、7和14天)。***p＜0.001 vs. Sham; ###p＜0.001, ##p＜0.01, #p＜0.05 vs. MPTP。 [圖10]. PKT101和PKT002對MPTP亞急性模型後小鼠在轉棒實驗中潛伏期的影響(1、3、7和14天)。***p＜0.001 vs. Sham; ###p＜0.001 vs. MPTP。 [圖11]. PKT101和PKT002對MPTP亞急性模型後小鼠黑質緻密部尼氏陽性神經元數量的影響(7和14天)。***p＜0.001 vs. Sham; ##p＜0.01, #p＜0.05 vs. MPTP; 尺規為250µm。 [圖12]. PKT101和PKT002對MPTP亞急性模型後小鼠黑質緻密部TH陽性神經元數量的影響(7和14天)。*p＜0.05 vs. Sham; ###p＜0.001, ##p＜0.01 vs. MPTP; 尺規為250µm。 [圖13]. PKT001和PKT002預處理對LPS誘導GL261細胞凋亡的影響。 [圖14]. PKT001和PKT002預處理對LPS誘導LN229凋亡的影響。 [圖15]. PKT001和PKT002預處理對LPS誘導WERI-RB-1細胞凋亡的影響。 [圖16]. PKT001和PKT002預處理對LPS誘導N2A細胞凋亡的影響。 [圖17]. PKT001和PKT002預處理對LPS誘導HT22細胞凋亡的影響。 [圖18]. PKT001和PKT002預處理對LPS誘導SK-N-SH細胞凋亡的影響。

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Claims

一種肽在製備用於預防、治療或改善有需要的受試者中神經退行性疾病或認知障礙症的組合物中的用途，所述肽選自： a) 包含與DEAQETAVSSH (SEQ ID NO: 1)具有至少70%同一性的氨基酸序列的肽； b) 包含在DEAQETAVSSH (SEQ ID NO: 1)中具有0至4個氨基酸突變的氨基酸序列的肽； c) 包含與DEAQETAVSSHEQD (SEQ ID NO: 2)具有至少70%同一性的氨基酸序列的肽；或 d) 包含在DEAQETAVSSHEQD (SEQ ID NO: 2)中具有0至4個氨基酸突變的氨基酸序列的肽。
如請求項1的用途，其中所述認知障礙症由神經退行性疾病引起。
如請求項1或2的用途，其中神經退行性疾病或認知障礙症選自阿爾茨海默病或帕金森病。
一種肽在製備用於改善、增強或恢復有需要的受試者中認知功能或認知能力，優選包括感知能力、思維邏輯能力、記憶能力、語言能力、學習能力、情緒控制能力、社交能力或注意力的組合物中的用途，所述肽選自： a) 包含與DEAQETAVSSH (SEQ ID NO: 1)具有至少70%同一性的氨基酸序列的肽； b) 包含在DEAQETAVSSH (SEQ ID NO: 1)中具有0至4個氨基酸突變的氨基酸序列的肽； c) 包含與DEAQETAVSSHEQD (SEQ ID NO: 2)具有至少70%同一性的氨基酸序列的肽；或 d) 包含在DEAQETAVSSHEQD (SEQ ID NO: 2)中具有0至4個氨基酸突變的氨基酸序列的肽。
如請求項4的用途，其中所述受試者具有認知功能或認知能力衰退，例如年齡老化而引致的或伴隨年齡老化的認知功能或認知能力衰退；或者所述受試者患有認知障礙症或神經退行性疾病，優選由神經退行性疾病引起的認知障礙症，更優選阿爾茨海默病或帕金森病。
如請求項1-3和5中任一項的用途，其中認知障礙症特徵在於溝通障礙、判斷力差、難以進行簡單任務、遺漏或放錯物件、語言障礙、性格突變、行為能力下降、時間及空間感混亂、理解能力下降、問題解決能力下降、注意力下降、社交能力下降、感知障礙、思維邏輯障礙或記憶障礙。
如前述請求項中任一項的用途，其中所述神經退行性疾病或認知障礙症為阿爾茨海默病，其中 a) 所述阿爾茨海默病特徵在於在大腦中β-澱粉樣蛋白(Aβ)沉積、神經炎症、和/或膠質細胞異常或活化；或者 b) 阿爾茨海默病的預防、治療或改善通過減少或緩解在大腦中β-澱粉樣蛋白(Aβ)沉積、神經炎症和/或膠質細胞異常或活化來實現。
如前述請求項中任一項的用途，其中所述神經退行性疾病或認知障礙症為帕金森病，其中 a) 所述帕金森病特徵在於大腦黑質神經元異常或損傷；或者 b) 帕金森病的預防、治療或改善通過減少或緩解大腦黑質神經元異常或損傷來實現。
如前述請求項中任一項的用途，所述受試者是人，優選老年人。
如前述請求項中任一項的用途，所述組合物為藥物組合物或營養組合物，優選所述藥物組合物或營養組合物包含所述肽和藥用輔料、溶媒或載體。
如前述請求項中任一項的用途，所述肽選自： a) 包含與DEAQETAVSSH (SEQ ID NO: 1)具有至少80%同一性的氨基酸序列的肽； b) 包含在DEAQETAVSSH (SEQ ID NO: 1)中具有0至3個氨基酸突變的氨基酸序列的肽； c) 包含與DEAQETAVSSHEQD (SEQ ID NO: 2)具有至少80%同一性的氨基酸序列的肽；或 d) 包含在DEAQETAVSSHEQD (SEQ ID NO: 2)中具有0至3個氨基酸突變的氨基酸序列的肽。
如前述請求項中任一項的用途，所述氨基酸突變選自氨基酸的添加、缺失或取代。
如前述請求項中任一項的用途，所述氨基酸突變位於氨基酸序列的C-端和/或N-端，優選是氨基酸序列的C-端和/或N-端的添加或缺失。
如前述請求項中任一項的用途，所述肽具有8至20個氨基酸的長度，優選10至18個氨基酸長度，更優選11至14個氨基酸長度。
如前述請求項中任一項的用途，所述肽選自 1) 包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列組成或者由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列表示的肽；或者 2) 包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列組成或者由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列表示的肽。