JP7249433B2 - 蜂毒抽出物を有効成分として含有する神経炎症疾患の予防または治療用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、蜂毒抽出物を有効成分として含有する神経炎症疾患の予防または治療用組成物に関する。

中枢神経係（ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ、ＣＮＳ）で慢性炎症は、代謝性合併症（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）及び神経退行性疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）を含む多様な病理生理学的過程と密接な関連がある。活性化されたミクログリア細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ）は、慢性炎症環境下で視床下部及び海馬のような部位から検出され、活性化されたミクログリア細胞由来の炎症媒介体は、神経損傷を引き起こして、代謝障害及び神経退行性疾患に影響を与える。これにより、ミクログリア細胞の活性抑制は、視床下部及び／または海馬のような中枢神経係で非正常な慢性炎症反応を保護するための重要な戦略として考慮する。

アルツハイマー病（ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＡＤ）は、認知症を起こす最もありふれた神経退行性疾患であって、主要症状としては記憶力減退、言語能力低下、視空間認知能力低下などがある。アルツハイマー病の発病原因及び機転は、いまだに正確に明らかになっていないが、患者の脳で老人斑（ｓｅｎｉｌｅ ｐｌａｑｕｅ）と神経原線維塊（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅ）が観察されており、前記神経原線維塊は、β‐アミロイド（β－ａｍｙｌｏｉｄ、Ａβ）とＡＰＰ－Ｃタンパク質（ａｎｔｉ－ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）のような毒性タンパク質による神経細胞死、シナプス損失及びタウ（ｔａｕ）タンパク質の変性及び過リン酸化によって形成することが明かになった。

アルツハイマー病の患者の脳から見つけられるアミロイドプラーク（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｌａｑｕｅ）の主要成分であるβ‐アミロイド（Ａβ）は、３６～４３のアミノ酸からなるペプチドであって、アミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＡＰＰ）から作られるものと知られている。アミロイド前駆体タンパク質は、β－とγ－セクレターゼ（ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）とによって分解するが、前記分解酵素をターゲットとしてβ‐アミロイドの濃度を減らす研究が進められたが、β‐アミロイドの生成機転をターゲットとする治療物質は、アルツハイマー病に対する治療効果が微々たる実情である。

また、能動及び受動免疫治療法が動物実験で治療効果が明らかになった後、アルツハイマー患者を対象とする研究でアルツハイマー動物モデルに抗原であるＡβ４２を用いて能動免疫を誘導した時、Ａβプラークが減少し、モリス水迷路（Ｍｏｒｒｉｓ ｗａｔｅｒ ｍａｚｅ）実験で記憶力の向上を示した。しかし、合成ＡβペプチドであるＡＮ１７９２／ＱＳ－２１を用いてアルツハイマー患者を対象とした臨床２相試験で６％の患者が脳髄膜炎を示して、臨床試験が中断された。最近施行された臨床試験でも、Ａβプラークが減少したが、進行性神経細胞の退化を改善することはできなかった。

パーキンソン病（ｐａｒｋｉｎｓｏｎ'ｓ ｄｉｓｅａｓｅ、ＰＤ）は、アルツハイマー病と共に老年期に表われる代表的な神経退行性疾患の１つであって、６５歳人口で約１％程度が発病し、年を取るほどその発病率が増加すると知られている。パーキンソン病は、運動性障害を示すが、安静時振戦（ｔｒｅｍｏｒ）、硬直（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）、運動緩徐（ｂｒａｄｙｋｉｎｅｓｉａ）、姿勢の不安定（ｐｏｓｔｕｒａｌ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）などが代表的な症状である。また、パーキンソン病は、ミクログリア細胞症（ｍｉｃｒｏｇｌｉｏｓｉｓ）、星状膠細胞症（ａｓｔｒｏｇｌｉｏｓｉｓ）、ドーパミン性ニューロンの進行的な退化、ドーパミン性ニューロンでレビー小体（Ｌｅｗｙ ｂｏｄｉｅｓ）の存在、及び脳黒質緻密部（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ ｐａｒｓ ｃｏｍｐａｃｔａ）でα－シヌクレイン（α－ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）が蓄積する特徴を有する。

パーキンソン病の正確な原因は、いまだに明確に知られていないが、農薬のような神経毒素による環境的要因、遺伝的要因、ミトコンドリアの機能障害、老化などが関連していると把握され、特に、活性化されたミクログリア細胞及び神経炎症が、このような神経退行性疾患の発病で重要な役割をすると報告されている。

現在、パーキンソン病の症状を軽減させる薬物が、Ｌ－ドパ（Ｌ－ｄｏｐａ）製剤、ドーパミン水溶体作用剤、抗コリン薬剤、エルデプリル（Ｅｌｄｅｐｒｙｌ）など多数存在するが、これらの薬物のほとんどは、原因的な治療ではなく、症状を調節する役割を行うだけであり、病気の進行を抑えることができる薬物はいまだに報告されていない。

また、前記薬物は、持続的な服用を必要とするので、このような薬物の慢性的な使用は、心身を弱化させる副作用を起こる危険性が大きい。例えば、抗コリン薬剤は、自律神経系異常や精神機能の異常などが表われれて、高齢の患者に持続的に投与することに限界がある。Ｌ－ドパ製剤の場合、長期間の服用によって漸次的に効果が減少され、体が捻れるか、手、足が自然に動く異常運動が生じるなどの副作用が発生する。その他、高周波を利用した神経刺激術、すなわち、高周波破壊術または深部脳刺激術などの手術治療も行われているが、侵襲的な手術を必要とし、多くのコストがかかるという問題点がある。

したがって、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中などの疾患の予防または治療のために、より効果的な新たな治療剤の開発が至急な実情である。

本発明の目的は、神経炎症疾患を根本的に予防または治療するための薬学組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、神経炎症疾患の予防または治療のために、前記組成物を皮下投与する方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、神経炎症疾患を予防または改善するための健康機能食品組成物を提供することである。

前記目的を果たすために、本発明による神経炎症疾患の予防または治療用薬学組成物は、ＰＬＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２）含量が５０～８５％である蜂毒抽出物を有効成分として含有することができる。

本発明による神経炎症疾患の予防または治療用皮下投与用薬学組成物は、ＰＬＡ２含量が５０～８５％である蜂毒抽出物を有効成分として含有することができる。

本発明による神経炎症疾患の予防または治療用薬学組成物は、前記ＰＬＡ２含量が５０～８５％である蜂毒抽出物を有効成分として含有する薬学組成物及びＳＴＡＴ３抑制剤またはＮＦ－κＢ抑制剤から選択する１つ以上の抑制剤を含みうる。

本発明による前記薬学組成物を神経炎症疾患の予防または治療のために皮下投与する。

本発明による神経炎症疾患の予防または改善用健康機能食品組成物は、ＰＬＡ２含量が５０～８５％である蜂毒抽出物を有効成分として含有することができる。

また、本発明による神経炎症疾患の予防または改善用健康機能食品組成物は、前記ＰＬＡ２含量が５０～８５％である蜂毒抽出物を有効成分として含有する健康機能食品組成物及びＳＴＡＴ３抑制剤またはＮＦ－κＢ抑制剤から選択する１つ以上の抑制剤を含みうる。

本発明による薬学組成物または健康機能食品組成物は、５０～８５％のＰＬＡ２を含有した蜂毒抽出物を有効成分として含有することにより、神経毒性による運動機能低下を改善させ、Ｔｈ１及びＴｈ１７の分極の減少及びＴＨ－陽性ドーパミン性神経細胞の増加を通じて神経保護の効果を有することができ、炎症誘発性サイトカインの発現を減少させ、調節Ｔ細胞を活性化して神経炎症反応を調節することにより、より優れた神経炎症緩和効果を有しうる。

また、本発明による薬学組成物は、皮下投与するか、ＳＴＡＴ３抑制剤またはＮＦ－κＢ抑制剤と併用することにより、神経炎症疾患の予防または治療効果をさらに向上させて、より効果的に神経炎症疾患を予防または治療することができる。

ＰＬＡ２含有量による効能評価のために、マウスにＭＰＴＰ（１－Ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌ－１，２，３，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、２０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔注射した後、６日間Ｓｉｇｍａ ＰＬＡ２、ｃｒｕｄｅ Ｂｅｅ Ｖｅｎｏｍ、ＰＬＡ２ ３１％含有蜂毒抽出物（ＰＬＡ２ ３１％）、ＰＬＡ２ ５３％含有蜂毒抽出物（ＰＬＡ２ ５３％）、及びＰＬＡ２ ７８％含有蜂毒抽出物（ＰＬＡ２ ７８％）をそれぞれ０．５ｍｇ／ｋｇずつ皮下注射する動物実験スケジュールを示した図面である。 ポールテスト（ｐｏｌｅ ｔｅｓｔ）による行動実験を測定したグラフであって、ＭＰＴＰが注射されたマウスが下側に向かって完全に背を向けた時間（Ｔ－ｔｕｒｎ、左）及びマウスが底面まで到達するのにかかる総時間（Ｔ－ＬＡ、右）値に対して蜂毒抽出物内ＰＬＡ２含有量の影響を示す。誤差棒（ｅｒｒｏｒ ｂａｒ）は、平均±ＳＥＭを示し、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１であって、ＭＰＴＰ注入マウスの黒質（ｓｕｂｔａｎｔｉａ ｎｉｇｒａ、ＳＮ）と有意な差を意味する。 ＭＰＴＰが注射されたマウスで調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の分化に対する蜂毒抽出物内ＰＬＡ２含有量の影響を示したものであって、脾臓細胞でＴｒｅｇ分化は、ＣＤ４、ＣＤ２５及びＦｏｘｐ３を発現する細胞を流細胞分析法で測定することで確認した。誤差棒は、平均±ＳＥＭを示し、Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ ｔ－ｔｅｓｔによって有意性が決定され、^＊Ｐ＜０．０５であって、ＭＰＴＰ注入マウスと有意な差を意味する。 ＭＰＴＰが注射されたマウスでＴｈ１／１７細胞の分化に対する蜂毒抽出物内ＰＬＡ２含有量の影響を示したものであって、脾臓細胞でＴｈ１／１７細胞分化は、（Ａ）Ｔｈ１（ＣＤ４＋ＩＦＮ－γ^＋）及び（Ｂ）Ｔｈ１７（ＣＤ４＋ＩＬ－図１７のＡ^＋）を発現する細胞を流細胞分析法で測定することで確認した。誤差棒は、平均±ＳＥＭを示し、^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１であって、ＭＰＴＰ注入マウスと有意な差を意味する。 ＰＬＡ２含有量が異なる蜂毒抽出物を処理した群の黒質（ＳＮ）組織試料からチロシンヒドロキシラーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ；ＴＨ）を確認するために免疫組織化学染色を行ったものであって、脳組織は、ドーパミン性神経細胞に対する損傷分析のためにＴＨで染色し、ＳＮでＴＨ－陽性ニューロンの数は、半分定量的な尺度を使用して定量化した。ランダムに選択されたあらゆる組織学的イメージをスコアリングし、このデータは、三回の独立した実験の代表値であって、平均±ＳＥＭで示し、スケールバー（Ｓｃａｌｅ ｂａｒｓ）は、５．０μｍである。^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１であって、ＭＰＴＰ群と有意な差を意味する。 ミクログリア細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）でＬＰＳで誘導されたアミロイド生成及び神経炎症に対する蜂毒抽出物の効果を示したものであって、図６のＡは、ｂｖＰＬＡ２（ＰＬＡ２）処理によるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、β－セクレターゼ１（Ｂｅｔａ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ １、ＢＡＣＥ１）、β‐アミロイド（Ａβ）のウェスタンブロット分析結果、図６のＢは、ｂｖＰＬＡ２処理によるβ－セクレターゼ活性分析結果グラフ、図６のＣは、ｂｖＰＬＡ２処理によるｉＮＯＳ、ＣＯＸ－２及びＩＢＡ－１のウェスタンブロット分析結果、図６のＤは、ＮＦ－κＢサブユニットのウェスタンブロット分析結果、及び図６のＥは、ｂｖＰＬＡ２処理による炎症誘発性サイトカインのｑＲＴ－ＰＣＲ分析結果である。 蜂毒抽出物及びＮＦ－κＢ抑制剤（Ｂａｙ １１－７８０２）の併用効果を確認したものであって、図７のＡは、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ－２の炎症性タンパク質での効果、図７のＢは、ＮＦ－κＢ信号伝達経路（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ）関連因子に対する効果、及び図７のＣは、炎症誘発性サイトカインでの効果を示す。 インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）実験の概略的な手続きである。 ＬＰＳ－誘導マウスの記憶力改善に対する蜂毒抽出物の効果に関するものであって、図９のＡ及び図９のＢは、モリス水迷路実験の結果グラフ、図９のＣは、プローブテスト結果グラフ、及び図９のＤは、手動回避実験結果グラフを示す。 ＬＰＳ－誘導マウスの脳組織でアミロイド症の減少に対する蜂毒抽出物の効果に関するものであって、図１０のＡは、ｂｖＰＬＡ２処理によるβ－アミロイド生成変化グラフ、図１０のＢは、ｂｖＰＬＡ２処理によるβ－セクレターゼ活性分析結果グラフ、及び図１０のＣは、ｂｖＰＬＡ２処理によるＡＰＰ、ＢＡＣＥ１、β－アミロイド（Ａβ）のウェスタンブロット分析結果である。 ＬＰＳ－誘導マウスの脳の神経炎症に対する蜂毒抽出物の効果に関するものであって、図１１のＡは、ＧＦＡＰ及びＩＢＡ－１の反応性細胞の数の変化を示し、図１１のＢは、ｉＮＯＳ及びＣＯＸ－２の反応性細胞の数の変化を 示す。 ＬＰＳ－誘導マウスの脳組織の炎症反応及び炎症誘発性サイトカインに対する蜂毒抽出物の効果に関するものであって、図１２のＡは、ｂｖＰＬＡ２処理によるｉＮＯＳ、ＣＯＸ－２、ＧＦＡＰ及びＩＢＡ－１のウェスタンブロット分析結果、図１２のＢは、ｂｖＰＬＡ２処理によるＮＦ－κＢサブユニットなどのウェスタンブロット分析結果、及び図１２のＣは、ｂｖＰＬＡ２処理による炎症誘発性サイトカインの発現量変化グラフである。 ＬＰＳ－誘導マウスの脳組織の調節Ｔ細胞に対する蜂毒抽出物の効果に関するものであって、図１３のＡ及び図１３のＢは、ＴｒｅｇマーカーであるＦｏｘｐ３の免疫組織化学結果、図１３のＣは、ｑＲＴ－ＰＣＲによるＦｏｘｐ３発現量を示した図面である。 蜂毒抽出物の投与経路によるＬＰＳ－誘導マウスの記憶力改善効果に関するものであって、図１４のＡ~図１４のＤは、投与経路による行動実験の結果であり、図１４のＥは、投与経路によるアミロイド症の変化を比較したものである。 Ｔｇ２５７６マウスで遺伝的に誘導された記憶損傷に対する蜂毒抽出物の効果に関するものであって、図１５のＡは、ｂｖＰＬＡ２投与による実験手続きを概略的に示し、図１５のＢ~図１５のＤは、ｂｖＰＬＡ２処理による行動実験結果を示した図面である。各値は、１０匹マウスの平均±ＳＥＭを示し、^＊Ｐ＜０．０５であって、対照群と有意な差を意味する。 β－アミロイド（Ａβ）蓄積に対する蜂毒抽出物の抑制効果及びＡβ生成と関連した因子に関するものであって、図１６のＡは、チオフラビンＳ染色（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ Ｓ ｓｔａｉｎｉｎｇ）結果、図１６のＢは、ＡＰＰ及びＢＡＣＥ１のウェスタンブロット結果、図１６のＣ及び図１６のＤは、Ａβ_１－４２及びＡβ_１－４０のレベルをＥＬＩＳＡで評価した結果、及び図１６のＥは、β－セクレターゼ活性分析結果であって、各値は、１０匹マウスの平均±ＳＥＭを示し、^＊＊ｐ＜０．０１であって、対照群と有意な差を意味する。図１６のＦは、ＢＶ－２ミクログリア細胞でのＡβ_１－４２レベルをＥＬＩＳＡで評価した結果、図１６のＧは、ＢＶ－２細胞でβ－セクレターゼ活性分析結果であって、各値は、３匹マウスの平均±ＳＥＭを示す。図１６のＨは、ＢＶ－２細胞でＡＰＰ及びＢＡＣＥ１のウェスタンブロット結果であって、^＃＃ｐ＜０．０５、^＃＃＃ｐ＜０．００１であって、対照群と有意な差を意味し、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１であって、ＬＰＳ群と有意な差を意味する。 Ｔｇ２５７６マウスで遺伝的に誘導された神経炎症に対する蜂毒抽出物の抑制効果に関するものであって、図１７のＡは、海馬でＧＦＡＰ、ＩＢＡ－１、ｉＮＯＳ及びＣＯＸ－２の免疫染色、図１７のＢは、前記免疫染色の陽性細胞数の定量化、図１７のＣは、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ－２、ＧＦＡＰ及びＩＢＡ－１のウェスタンブロッティング結果であり、図１７のＤは、その発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲで評価した結果である。各値は、１０匹マウスの平均±ＳＥＭを示し、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１であって、対照群と有意な差を意味する。 ＢＶ－２細胞でＬＰＳ－誘導された神経炎症に対する蜂毒抽出物の抑制効果に関するものであって、図１８のＡは、細胞生存率の分析結果、図１８のＢは、酸化窒素分析、図１８のＣは、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ－２及びＩＢＡ－１のウェスタンブロット結果、図１８のＤは、炎症誘発性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインのｑＲＴ－ＰＣＲで評価した結果である。各値は、３個の他の実験の平均±ＳＥＭを示す。^＃ｐ＜０．０５、^＃＃＃ｐ＜０．００１であって、対照群と有意な差を意味し、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１であって、ＬＰＳ群と有意な差を意味する。 ＳＴＡＴ３活性化に対する蜂毒抽出物の抑制効果に関するものであって、図１９のＡは、ＳＴＡＴ３及びマイトジェン活性タンパク質キナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ、ＭＡＰＫ）信号伝達経路と関連した因子のレベルをＴｇ２５７６マウスの脳でウェスタンブロッティングした結果であって、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１であって、対照群と有意な差を意味する。図１９のＢは、ＢＶ－２細胞でのウェスタンブロッティング結果、図１９のＣは、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）活性分析結果であって、各値は、３個の他の実験の平均±ＳＥＭを示す。図１９のＤは、ＳＴＡＴ３のレベルをウェスタンブロット分析した結果である。 蜂毒抽出物のＳＴＡＴ３のリンカードメイン（Ｌｉｎｋｅｒ Ｄｏｍａｉｎ、ＬＤ）直接結合に関するものであって、図２０のＡは、ｂｖＰＬＡ２及びＳＴＡＴ３のドッキングモデルに拡大されたイメージで紫色部分はｂｖＰＬＡ２を意味し、緑色部分はＳＴＡＴ３を意味する。図２０のＢは、ＳＴＡＴ３組み替えタンパク質の多様な形態の概略図のドメイン構造であり、図２０のＣは、プルダウン分析遂行結果、図２０のＤは、ＬＰＳ－誘導されたＳＴＡＴ３ルシフェラーゼ活性分析結果、図２０のＥは、ＳＴＡＴ３の多様な突然変異形態で形質感染されたＢＶ－２細胞で炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６）のｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲで評価した結果である。各値は、３個の他の実験の平均±ＳＥＭを示す。^＃＃ｐ＜０．０１、^＃＃＃ｐ＜０．００１であって、対照群と有意な差を意味し、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１であって、ＬＰＳ処理されたｗｉｌｄ ｔｙｐｅ群と有意な差を意味する。 ＢＶ－２細胞で蜂毒抽出物及びＳＴＡＴ３抑制剤の併用効果に関するものであって、図２１のＡは、ＢＶ－２細胞でＡβ_１－４２のレベルをＥＬＩＳＡで評価した結果、図２１のＢは、ＢＶ－２細胞でβ－セクレターゼの活性分析結果、図２１のＣは、ＢＶ－２細胞でＡＰＰ及びＢＡＣＥ１のウェスタンブロット分析結果、図２１のＤは、ＢＶ－２細胞でｉＮＯＳ及びＣＯＸ－２のウェスタンブロット分析結果、図２１のＥは、ｂｖＰＬＡ２またはＳｔａｔｔｉｃで処理されたＢＶ－２細胞で炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６）のｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ－ＰＣＲによって評価したものである。各値は、３個の他の実験の平均±ＳＥＭを示す。^＃＃＃ｐ＜０．００１であって、対照群と有意な差を意味し、^＊Ｐ＜０．０５であって、ｂｖＰＬＡ２処理群と有意な差を意味する。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明者は、蜂毒原物から精製された多様な濃度のＰＬＡ２が含有された蜂毒抽出物のうち、特定濃度のＰＬＡ２が含有された蜂毒抽出物でパーキンソン病及びアルツハイマー病動物モデルの治療効能が向上することを確認することにより、本発明を完成した。

本明細書において、「予防」とは、本発明による薬学組成物または健康機能食品組成物の投与によって神経炎症疾患、または前記疾患の少なくとも１つ以上の症状の発生を抑制させるか、発病を遅延させるあらゆる行為を意味する。また、再発を予防または防止するために、前記疾病に快方に向かう対象の治療を含む。

本明細書において、「治療」とは、本発明による薬学組成物の投与によって神経炎症疾患、または前記疾患の少なくとも１つ以上の症状を緩和、減少、または消滅させるなど、その症状を好転させるか、有利に変更するあらゆる行為を意味する。

本明細書において、「改善」とは、本発明による健康機能食品組成物の摂取によって神経炎症疾患、または前記疾患の少なくとも１つ以上の症状を緩和、減少、または消滅させるなど、その症状を好転させるか、有利に変更するあらゆる行為を意味する。

本明細書において、「薬学組成物」とは、特定の目的のために投与する組成物であって、本発明の目的上、神経炎症疾患、または前記疾患の少なくとも１つ以上の症状を予防するか、または治療するために投与することを意味する。

本明細書において、「健康機能食品」とは、健康機能食品に関する法律第６７２７号による人体に有用な機能性を有した原料や成分を使用して製造及び加工した食品を含み、栄養供給の以外にも、本発明の目的上、神経炎症疾患の予防、生体防御、免疫、回復などの生体調節機能が効率的に表われるように加工された医学、医療効果が高い食品を意味する。

本明細書において、「抽出物」とは、抽出方法、抽出溶媒、抽出された成分または抽出物の形態を問わず、天然物の成分を抜き取ることで得られた物質を意味するものであって、天然物の成分を抜き取って得られた物質を抽出後、他の方法で加工または処理して得られる物質をいずれも含みうる。

本発明は、蜂毒抽出物を有効成分として含有する神経炎症疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。

本明細書において、「蜂毒（ｂｅｅ ｖｅｎｏｍ、ＢＶ）」とは、ミツバチ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）の腹部から生成する酸性及び塩基性分泌物の混合物であって、無色の苦い液体形態を帯び、その主な成分は、ペプチドであるメリチン（ｍｅｌｉｔｔｉｎ）、アパミン（ａｐａｍｉｎ）及び肥満細胞脱顆粒化（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｎｇ、ＭＣＤ）ペプチド及び酵素であるホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２；ＰＬＡ２）などであり、それ以外のさまざまな微量の成分を含むが、ミツバチから限定するものではない。

前記蜂毒抽出物は、ＰＬＡ２含量が５０～８５％である蜂毒抽出物であり、望ましくは、ＰＬＡ２含量が７０～８０％、より望ましくは、ＰＬＡ２含量が７８％である蜂毒抽出物である。

前記蜂毒抽出物は、蜂毒から当該技術分野において通常使う方法によって抽出して製造可能であり、市中で利用可能なものを購入して使用することができるが、これに限定するものではない。

前記蜂毒抽出物は、神経毒性による運動機能低下を改善させることができ、Ｔｈ１及びＴｈ１７の分極を減少させ、ＴＨ－陽性ドーパミン性神経細胞を増加させて神経保護の効果を有しうる。前記蜂毒抽出物は、炎症誘発性サイトカインの発現を減少させ、調節Ｔ細胞を活性化して神経炎症反応を調節することにより、神経炎症緩和効果を有しうる。また、前記蜂毒抽出物は、β－セクレターゼ（β－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）の活性を減少させることにより、β‐アミロイド（Ａβ）の蓄積を抑制させることができる。

本発明の一実施例によれば、ＰＬＡ２含量が３１％、５３％または７８％である蜂毒抽出物を投与したパーキンソン病動物モデルで運動機能低下改善効果、神経保護効果などが表われ、特に、ＰＬＡ２ ７８％の蜂毒抽出物で前記効果が最も大きいと確認された。より詳細なことは、下記の実施例で後述する。

本発明は、蜂毒抽出物を有効成分として含有する神経炎症疾患の予防または治療用皮下投与用薬学組成物を提供する。

前記蜂毒抽出物は、ＰＬＡ２含量が５０～８５％である蜂毒抽出物であり、望ましくは、ＰＬＡ２含量が７０～８０％、より望ましくは、ＰＬＡ２含量が７８％である蜂毒抽出物である。

前記蜂毒抽出物は、皮下経路に投与され、３．７５ｍｇ／ｋｇ以上７．５ｍｇ／ｋｇ未満の含量で皮下投与されうる。

本発明は、蜂毒抽出物を有効成分として含有する前記薬学組成物及びＳＴＡＴ３抑制剤またはＮＦ－κＢ抑制剤から選択する１つ以上の抑制剤を含む神経炎症疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。

前記薬学組成物は、ＳＴＡＴ３またはＮＦ－κＢの活性を抑制する抑制剤と併用することにより、前記蜂毒抽出物による神経炎症緩和効果、アミロイド蓄積阻害効果などをさらに向上させうる。

前記ＳＴＡＴ３抑制剤は、Ｓｔａｔｔｉｃ、ＳＴＡ－２１、Ｓ３１－２０１、Ｓ３１－Ｍ２００１、Ｓ３１－１７５７、クルクミン－プロリン（Ｃｕｒｃｕｍｉｎ－ｐｒｏｌｉｎｅ）、クリプトタンシノン（Ｃｒｙｐｔｏｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ）、ＨＩＣ １、ＰＤ１５３０３５、ＴＧ１０１２０９、ＰＰ２、Ｓｏｐｈｏｒａｆｌａｖａｎｏｎｅ Ｇなどから選択され、前記ＮＦ－κＢ抑制剤は、Ｂａｙ １１－７８０２、ＰＤＴＣ、ＭＧ－１３２、ＭＧ－１１５、ＭＬＮ－４９２４、ＪＳＨ－２３、ＰＧＥ２、ＬＹ ２９４００２などから選択されうるが、これらに限定するものではない。

本発明による薬学組成物において、前記神経炎症疾患は、アルツハイマー病、血管性痴呆、前頭側頭葉痴呆、アルコール性痴呆、パーキンソン、及び脳卒中からなる群から選択する疾患であるが、これらに限定するものではない。

本明細書において、「神経炎症疾患」とは、神経膠細胞によって媒介する中枢神経係での炎症疾患であって、望ましくは、「脳神経炎症疾患」を意味することができ、前記神経炎症の影響で発生する神経退行性疾患（退行性脳疾患）、炎症性脳疾患、代謝性合併症などをいずれも含みうる。

本発明による薬学組成物は、薬学的分野の通常の方法によって製造可能である。前記薬学組成物は、剤型によって薬学的に許容可能な適切な担体と配合され、必要に応じて、賦形剤、希釈剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、結合剤、崩壊剤、溶剤などをさらに含んで製造可能である。本明細書において、「薬学的に許容可能な」とは、前記組成物に露出する細胞やヒトに毒性がないことを意味する。前記適切な担体などは、本発明による蜂毒抽出物の活性及び特性を阻害しないものであって、投与形態及び剤型によって異なるように選択されうる。

本発明による薬学組成物は、如何なる剤型でも適用可能であり、より詳細には、通常の方法によって経口型剤型、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の非経口型剤型で剤形化して使われ、望ましくは、腹腔または皮下投与のための注射剤剤型で剤形化することができる。

前記経口型剤型のうち、固形剤型は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などの形態であって、少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、セルロース、ゼラチンなどを混ぜて調剤することができ、単純な賦形剤の以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も含まれうる。また、カプセル剤型の場合、前述した物質の以外にも脂肪油のような液体担体をさらに含みうる。

前記経口型剤型のうち、液状剤型は、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使われる単純希釈剤である水、流動パラフィンの以外に、さまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれうる。

前記非経口剤型は、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれうる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使われる。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、トゥイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使われる。これに限定されず、当該技術分野に知られた適した製剤をいずれも使用可能である。

また、本発明による薬学組成物は、治療効能の増進のためにカルシウムやビタミンＤ_３などをさらに添加することができる。

本発明による薬学組成物において、前記薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本明細書において、「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な恵み／危険の比率で疾患の治療に十分であり、副作用を起こさない程度の量を意味する。

前記薬学組成物の有効容量レベルは、使用目的、患者の年齢、性別、体重及び健康状態、疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与方法、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、配合または同時使われる薬物を含んだ要素及びその他の医学分野によく知られた要素によって異なるように決定する。例えば、一定ではないが、一般的に、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇであって、望ましくは、０．０１～１０ｍｇ／ｋｇを１日１回~数回投与する。前記投与量は、如何なる面でも本発明の範囲を限定するものではない。

本発明による薬学組成物は、神経炎症疾患が発生する任意の動物に投与することができ、前記動物は、例えば、ヒト及び霊長類だけではなく、牛、豚、馬、犬などの家畜などを含みうる。

本発明による薬学組成物は、製剤形態による適当な投与経路に投与され、目的組織に到達することができる限り、経口または非経口の多様な経路を通じて投与する。投与方法は、特に限定する必要なしに、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮膚塗布、呼吸器内吸入、子宮内軽膜または脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅ－ｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射などの通常の方法で投与する。

望ましくは、皮下経路に投与され、この際、前記蜂毒抽出物は、３．７５ｍｇ／ｋｇ以上７．５ｍｇ／ｋｇ未満の含量で投与する。

本発明による薬学組成物は、神経炎症疾患の予防または治療のために単独で使いうるあるいは手術、手術または他の薬物治療などと併用しても使いうる。

本発明は、前記薬学組成物を神経炎症疾患の予防または治療のために皮下投与する方法を提供する。

本発明の一実施例によれば、前記蜂毒抽出物を腹腔経路または皮下経路に投与した場合、皮下経路に投与した時、パーキンソン病またはアルツハイマー病などの神経炎症疾患の治療効果がさらに高いことを確認することができた。より詳細なことは、下記の実施例で後述する。

本発明は、蜂毒抽出物を有効成分として含有する神経炎症疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。

前記蜂毒抽出物は、ＰＬＡ２含量が５０～８５％である蜂毒抽出物であり、望ましくは、ＰＬＡ２含量が７０～８０％、より望ましくは、ＰＬＡ２含量が７８％である蜂毒抽出物である。

前記健康機能食品組成物及びＳＴＡＴ３抑制剤またはＮＦ－κＢ抑制剤から選択する１つ以上の抑制剤を含む神経炎症疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。

これに相応する特徴は、前述した部分で代替可能である。

本発明による健康機能食品組成物において、前記健康機能食品は、神経炎症疾患の予防または改善目的として、粉末、顆粒、精製、カプセル、シロップまたは飲料などで製造可能である。前記健康機能食品が取ることができる形態には限定がなく、前記薬学組成物と同じ方式で製剤化されて機能性食品として用いるか、各種の食品に添加する。

本発明による健康機能食品組成物において、前記健康機能食品は、通常の意味の食品をいずれも含みうる。例えば、飲料及び各種ドリンク、果実及びその加工食品（フルーツ缶詰、ジャムなど）、魚類、肉類及びその加工食品（ハム、ベーコンなど）、パン類及び麺類、クッキー及びスナック類、乳製品（バター、チーズなど）などが可能であり、通常の意味での機能性食品をいずれも含みうる。また、動物のための飼料として用いられる食品も含みうる。

本発明による健康機能食品組成物は、当業者で通常使われる食品学的に許容可能な食品添加剤（食品添加物）及び適切なその他の補助成分をさらに含んで製造可能である。食品添加物としての適否は、他の規定がない限り、 韓国の食品医薬品安全庁に承認された食品添加物公典の総則及び一般試験法などによって当該品目に関する規格及び基準によって判定することができる。前記「食品添加物公典」に収載された品目としては、例えば、ケトン類、グリシン、クエン酸カルシウム、ニコチン酸、ケイ皮酸などの化学的合成物；紺色素、甘草抽出物、結晶セルロース、コウリャン色素、グアーガムなどの天然添加物；Ｌ－グルタミン酸ナトリウム製剤、麺類添加アルカリ剤、保存料製剤、タール色素製剤などの混合製剤類などが挙げられる。

前記その他の補助成分は、例えば、香味剤、天然炭水化物、甘味剤、ビタミン、電解質、着色剤、ペクチン酸、アルギン酸、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸化剤などをさらに含有することができる。特に、前記天然炭水化物としては、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、及びデキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールを使用し、甘味剤としては、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味剤やサッカリン、アスパルテームのような合成甘味剤などを使用することができる。

例えば、錠剤形態の健康機能食品は、本発明の有効成分である蜂毒抽出物を賦形剤、結合剤、崩壊剤及び他の添加剤と混合した混合物を通常の方法で顆粒化した後、滑沢剤などを入れて圧縮成形するか、前記混合物を直接圧縮成形することができる。また、前記錠剤形態の健康機能食品は、必要に応じて矯味剤などを含有することもできる。

カプセル形態の健康機能食品のうち、硬質カプセル剤は、通常の硬質カプセルに前記蜂毒抽出物を賦形剤などの添加剤と混合した混合物を充填して製造することができ、軟質カプセル剤は、前記蜂毒抽出物を賦形剤などの添加剤と混合した混合物をゼラチンのようなカプセル基剤に充填して製造することができる。前記軟質カプセル剤は、必要に応じてグリセリンまたはソルビトールなどの可塑剤、着色剤、保存剤などを含有することができる。

丸形態の健康機能食品は、前記蜂毒抽出物と賦形剤、結合剤、崩壊剤などを混合した混合物を既存に公知の方法で成形して調剤することができ、必要に応じて白糖や他の除皮剤で除皮することができ、または、澱粉、タルクのような物質で表面をコーティングすることもできる。

顆粒形態の健康機能食品は、前記蜂毒抽出物と賦形剤、結合剤、崩壊剤などを混合した混合物を既存に公知の方法で粒状に製造することができ、必要に応じて着香剤、矯味剤などを含有することができる。

本発明による健康機能食品に含有された前記蜂毒抽出物の有効容量は、神経炎症疾患の予防または改善など、その使用目的によって適切に調節する。

前記健康機能食品組成物は、食品を原料として一般薬品の長期服用時に発生する副作用などがない長所があり、携帯性に優れて、神経炎症疾患の予防または改善のための補助剤として摂取する。

以下、本発明の理解を助けるために、実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものであり、本発明の範囲が、下記の実施例に限定するものではない。本発明の実施例は、当業者に本発明をより完全に説明するために提供するものである。

＜実施例１＞蜂毒抽出物内ＰＬＡ２含有量による濃度別のげっ歯類の単回投与の毒性評価
１．毒性評価方法 ：［Ｃ５７のＢＬ／６Ｎ ＷＴ＋ＰＬＡ２］
－動物モデル：ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ、７週齢、雄Ｃ５７のＢＬ／６Ｎマウス（大韓バイオリンクから購入）
－薬物種類：ＰＬＡ２含有量が１００％である蜂毒抽出物（１００％ ＰＬＡ２）、ＰＬＡ２含有量が８０％である蜂毒抽出物（８０％ ＰＬＡ２）、ＰＬＡ２含有量が５０％である蜂毒抽出物（５０％ ＰＬＡ２）、ＰＬＡ２含有量が３０％である蜂毒抽出物（３０％ ＰＬＡ２）
－投与経路：皮下注射（Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ＳＣ）
－投与容量：１５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、３．７５ｍｇ／ｋｇ １回／１日
－観察期間及び内容：投薬後、３日間毎日死亡有無観察
－グループ：下記の各グループ当たり５匹ずつ総６５匹
ａ．Ｃｏｎｔｒｏｌ（ｓａｌｉｎｅ、ＷＴ）ｈ．５０％ ＰＬＡ２（１５ｍｇ／ｋｇ）
ｂ．１００％ ＰＬＡ２（１５ｍｇ／ｋｇ）ｉ．５０％ ＰＬＡ２（７．５ｍｇ／ｋｇ）
ｃ．１００％ ＰＬＡ２（７．５ｍｇ／ｋｇ）ｊ．５０％ ＰＬＡ２（３．７５ｍｇ／ｋｇ）
ｄ．１００％ ＰＬＡ２（３．７５ｍｇ／ｋｇ）ｋ．３０％ ＰＬＡ２（１５ｍｇ／ｋｇ）
ｅ．８０％ ＰＬＡ２（１５ｍｇ／ｋｇ）ｌ．３０％ ＰＬＡ２（７．５ｍｇ／ｋｇ）
ｆ．８０％ ＰＬＡ２（７．５ｍｇ／ｋｇ）ｍ．３０％ ＰＬＡ２（３．７５ｍｇ／ｋｇ）
ｇ．８０％ ＰＬＡ２（３．７５ｍｇ／ｋｇ）

２．評価結果
下記表１は、本発明の実施例１による毒性評価の結果である。

表１を参照すれば、ＰＬＡ２ ３０％含有蜂毒抽出物とＰＬＡ２ ５０％含有蜂毒抽出物との概略の致死量（Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ ｌｅｔｈａｌ ｄｏｓｅ：ＡＬＤ）は、１５ｍｇ／ｋｇ、ＰＬＡ２ ８０％含有蜂毒抽出物の概略の致死量は、７．５ｍｇ／ｋｇ、ＰＬＡ２ １００％含有蜂毒抽出物の概略の致死量は、３．７５ｍｇ／ｋｇ程度であるということを確認することができる。

＜実施例２＞パーキンソン病（ＰＤ）動物モデルで蜂毒抽出物内ＰＬＡ２成分の含有量による治療効果の評価
本実施例は、１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン塩酸塩（１－Ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌ－１，２，３，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＭＰＴＰ）で誘導されたパーキンソン病動物モデルで蜂毒抽出物内ＰＬＡ２成分の含有量による効能を評価するために行われた。

１．試験物質
１）試験物質
－名称：ｃｒｕｄｅ Ｂｅｅ Ｖｅｎｏｍ（飼養ミツバチ蜂毒抽出物）／ＰＬＡ２ ３１％含有蜂毒抽出物（ＰＬＡ２ ３１％）／ＰＬＡ２ ５３％含有蜂毒抽出物（ＰＬＡ２ ５３％）／ＰＬＡ２ ７８％含有蜂毒抽出物（ＰＬＡ２ ７８％）
－外観：白色粉末（Ｗｈｉｔｅ ｐｏｗｄｅｒ）
－入手量：１５ｍｇ／１１．１ｍｇ／１０．３ｍｇ／１９．９ｍｇ
－保管条件：冷凍（－２０℃）
－供給源：イニストエスティ（株）

２）対照物質
－名称：Ｂｅｅ Ｖｅｎｏｍ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２（Ｓｉｇｍａ ＰＬＡ２、Ｓｉｇｍａ ｃｏｄｅ ＃：Ｐ９２７９）
－外観：凍結乾燥粉末（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ ｐｏｗｄｅｒ）
－入手量：１ｍｇ
－保管条件：冷凍（－２０℃）
－供給源：シグマ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）

３）惹起用物質
－名称：ＭＰＴＰ（１－Ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌ－１，２，３，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）
－外観：白色粉末
－入手量：１００ｍｇ
－保管条件：室温
－供給源：シグマ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）

２．材料及び方法
１）試験系
実験を行うのに当たって、マウスは、サイズが小さく、扱いやすくて動物実験に容易であり、マウスを使用しても、十分な組織結果と実験結果とが得られるので、大韓バイオリンク（大韓民国忠清北道陰城郡三成面徳湖路２７７）から供給された７週齢雄Ｃ５７のＢＬ／６Ｊマウスを試験に利用した。この系統のマウスは、腫瘍学、免疫学、毒性学研究に広く使われている。
－入手日：２０１８年０３月０２日
－入手時の性別、動物数及び体重範囲：雄４３匹、２０～２５ｇ
－投与開始時の体重範囲：２０～２５ｇ
－使用動物数：雄４３匹

２）飼育環境
（１）環境条件及び飼育方法
ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｆｒｅｅ）環境で飼育され、２２±１℃の温度、相対湿度５５±１５％、換気回数１０～２０回／ｈｒ、照明時間１２時間（午前７時点灯～午後７時消灯）及び照度１５０～３００Ｌｕｘに調節した。あらゆる実験は、大韓民国慶煕大学校動物実験倫理委員会の承認（ＫＨＵＡＳＰ（ＳＥ）－１７－１４９）によって進められた。
（２）飼料及び水
飼料は、実験動物用固形飼料をオリエントバイオから供給されて自在に摂取させ、水は、上下水道を微細濾過器で消毒した後、水瓶を用いて自在に摂取させた。

３）試験群の構成及び投与量の設定
（１）試験群の構成
－対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ群）
－ＭＰＴＰ群（ｎｏ ｔｒｅａｔ群）
－Ｓｉｇｍａ ＰＬＡ２群（０．５ｍｇ／ｋｇ）
－ｃｒｕｄｅ Ｂｅｅ Ｖｅｎｏｍ群（０．５ｍｇ／ｋｇ）
－ＰＬＡ２ ３１％群（ＰＬＡ２ ３１％含有蜂毒抽出物、０．５ｍｇ／ｋｇ）
－ＰＬＡ２ ５３％群（ＰＬＡ２ ５３％含有蜂毒抽出物、０．５ｍｇ／ｋｇ）
－ＰＬＡ２ ７８％群（ＰＬＡ２ ７８％含有蜂毒抽出物、０．５ｍｇ／ｋｇ）

（２）投与量の設定
ＭＰＴＰ群は、２０ｍｇ／ｋｇずつ１日に２時間隔で４回腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ、ＩＰ）経路に４回注射した。
Ｓｉｇｍａ ＰＬＡ２群、ｃｒｕｄｅ Ｂｅｅ Ｖｅｎｏｍ群、ＰＬＡ２ ３１％群、ＰＬＡ２ ５３％群及びＰＬＡ２ ７８％群は、０．５ｍｇ／ｋｇずつ６日間１日に１回皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ、ＳＣ）経路に注射した。

（３）群分離
動物の群分離は、次のように実施した。動物は、ＭＰＴＰ注射後、翌日午前に行動実験（Ｐｏｌｅ ｔｅｓｔ）教育を行い、その結果を有し、各群に最大限均等に分布するようにランダム法で分配して試験群の構成表に指定された数になるようにした。

（４）識別
個体識別は、油性ペンでしっぽに表示して区分した。飼育箱子には、試験番号、試験責任者名、試験担当者名、非常連絡先などを記載した個体識別カードを付着した。

（５）投与試験物質の調剤
ＭＰＴＰ １００ｍｇを１×ｆｒｅｅ ｂａｓｅ ｓａｌｉｎｅ ｂｕｆｆｅｒに溶かして２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で調剤した。前記濃度値は、投与濃度２０ｍｇ／ｋｇをマウス一匹当たり腹腔内投与（ＩＰ）で２００μＬ注射する時を計算した結果値である。

Ｓｉｇｍａ ＰＬＡ２、ｃｒｕｄｅ Ｂｅｅ Ｖｅｎｏｍ、ＰＬＡ２ ３１％含有蜂毒抽出物（ＰＬＡ２ ３１％）、ＰＬＡ２ ５３％含有蜂毒抽出物（ＰＬＡ２ ５３％）及びＰＬＡ２ ７８％含有蜂毒抽出物（ＰＬＡ２ ７８％）も、１×ｆｒｅｅ ｂａｓｅ ｓａｌｉｎｅ ｂｕｆｆｅｒに溶かして１ｍｇ／ｍＬの濃度で調剤した後、投与濃度０．５ｍｇ／ｋｇで希釈して実験動物に皮下（ＳＣ）経路に投与した。

４）試験方法
（１）動物実験
ＭＰＴＰでパーキンソン病を誘導する場合、マウスは、ＭＰＴＰ－ＨＣｌ（２０ｍｇ／ｋｇ ｆｒｅｅ ｂａｓｅ ｉｎ ｓａｌｉｎｅ）を２時間隔で４回腹腔内投与した。最後のＭＰＴＰ注射後、１２時間後に、ＭＰＴＰを打たれたマウスにＳｉｇｍａ ＰＬＡ２、ｃｒｕｄｅ Ｂｅｅ Ｖｅｎｏｍ、ＰＬＡ２ ３１％、ＰＬＡ２ ５３％及びＰＬＡ２ ７８％（各０．５ｍｇ／ｋｇ）を皮下経路に６日間注射した（図１）。一部のマウスには、対照群としてビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）のみを注射した。ＭＰＴＰ注射後、マウスの致死率は、各群で約０～３０％未満であった。各群間には、大きな差がなかった。

（２）ポールテストによる行動実験の測定
ガーゼが巻かれている木柱（長さ５０ｃｍ、直径０．８ｃｍ）の最頂点にマウスが上側に向かうように置き（マウスは、柱の底面まで下がることができる）、マウスが下側に向かって完全に背を向けた時間（Ｔ－ｔｕｒｎ）とマウスが底面まで到達するのにかかる総時間（ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｉｍｅ、Ｔ－ＬＡ）とを記録し、限定時間は、３０秒と定めた。各マウス当たり５回検査し、最もよく出た３個の測定値の平均を計算した。マウスが底面にジャンプするか、滑る場合は除いた。

（３）Ｔｈ１、Ｔｈ１７及びＴｒｅｇ個体数の流細胞分析
ヘルパーＴ細胞のサブセット（Ｔ－ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ）の流細胞分析をｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ４、ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ２５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ／ｒａｔ Ｆｏｘｐ３、ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ－γ及びＰｅｒＣＰ－Ｃｙａｎｉｎｅ５．５－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ／ｒａｔ ＩＬ－１７Ａ抗体を使用して行った。

調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を染色するために、２×１０^６ Ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度の脾臓細胞を採取し、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、染色緩衝液（ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）に希釈したＦＩＴＣ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ＣＤ４とＰＥ－ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉ－ＣＤ２５抗体で４℃の暗中で３０分間染色した。引き続き、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、固定／透過緩衝液（ｆｉｘａｔｉｏｎ／ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）に４℃の暗中で１時間固定させた。連続して、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４℃の暗中で一晩中Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ ａｎｔｉ－Ｆｏｘｐ３抗体で染色した。洗浄後、細胞を１％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）に固定させ、４℃の暗中に保管した後、検出を行った。

細胞内サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）染色のために、２×１０^６ Ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度の脾臓細胞を５０ｎｇ／ｍＬのホルボールミリスタートアセタート（ｐｈｏｒｂｏｌ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ ａｃｅｔａｔｅ、ＰＭＡ）と１，０００ｎｇ／ｍＬのイオノマイシン（ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）とで１時間刺激させた後、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐを入れ、４時間培養した。培養した細胞を収集し、ＰＢＳで２回洗浄した後、染色緩衝液に希釈したＦＩＴＣ－ｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉ－ＣＤ４抗体で４℃の暗中で３０分間染色した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞をＩ．Ｃ固定緩衝液に室温の暗中で３０分間固定させた。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を４℃の暗中で一晩中ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ＩＦＮ－γとＰｅｒＣＰ－Ｃｙａｎｉｎｅ５．５－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ＩＬ－１７Ａ抗体で染色した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を１％パラホルムアルデヒドに固定させ、４℃の暗中に保管し、その後に検出を行った。サンプルをＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ流細胞計測器で分析した後、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用してグラフィック及び表形式でデータを生成した。

（４）組織処理及び免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＩＨＣ）
マウスをイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ、Ｆｏｒａｎｅ溶液；中外製薬、ソウル）で麻酔させ、心臓端部にＰＢＳを注入して灌流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）した後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）に溶解させた４％パラホルムアルデヒドを灌流して固定させた。

固定させたマウスの脳を解剖し、４℃で２日間４％パラホルムアルデヒドで固定させた後、３０％スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）溶液に移して、脳が沈むまで４℃に保管した。組織をＯＣＴ化合物で固定させ、組織切片器（ｓｌｉｄｉｎｇ ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を使用して低温保持装置で３０μｍの厚さの冠状切片で連続して切り取った。連続する６個のあらゆる組織を集めて免疫組織化学染色を実施した。

１次抗体としてチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；１：１０００）を貼り付けた。ＰＢＳで洗浄した後、組織をビオチニル化された２次抗体を貼り付け、アビジン－ビオチン複合キット（ａｖｉｄｉｎ－ｂｉｏｔｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｋｉｔ、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット）で処理した。引き続き、反応物質として０．１Ｍリン酸緩衝液に溶解されている０．０５％ジアミノベンジジン－ＨＣｌ（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ－ＨＣｌ、ＤＡＢ）と０．００３％過酸化水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ）とで組織を発色させた。引き続き、発色された組織をスライドガラス（ｓｌｉｄｅ ｇｌａｓｓ）とカバーガラス（ｃｏｖｅｒ ｇｌａｓｓ）とでマウンティング（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）し、光学顕微鏡で分析した。

（５）立体的細胞数の数え
脳の黒質（ＳＮ）部分でＴＨ陽性ドーパミン性ニューロンの総数に対する客観的な立体評価は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＣＡＳＴ（ｃｏｍｐｕｔｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｔｅｒｅｏｔｙｐｅ ｔｏｏｌｂｏｘ）システムのバージョン２．１．４で光学分別器の方法を使用して行われた。

細胞数を数えるために、組織の緻密部（ｐａｒｓ ｃｏｍｐａｃｔａ）の頭端部から網部（ｐａｒｓ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ）のしっぽ端部まで（前後、ｂｒｅｇｍａから－２．０６ｍｍ～－４．１６ｍｍ）ＳＮ部位全体が含まれた。実際の計算は、１００×倍率（Ｏｉｌ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）を使用して行われた。総細胞数は、光学分別器（ｏｐｔｉｃａｌ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ）の方程式によって算出した。各標本のあらゆる組織に対して３００ポイント以上分析した。

（６）統計学的分析
あらゆる実験結果に対する有意性差異分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖｅｒｓｉｏｎ５、ＣＡ、ＵＳＡ）で平均値を分散分析した後、多重比較をする時は、ｏｎｅ－ｗａｙ Ａｎｏｖａ、Ｎｅｗｍａｎ－Ｋｅｌｕｓ ｔｅｓｔによってＰ－ｖａｌｕｅが０．０５よりも小さい時、統計的に有意な差を示すと判断した。単一比較をする時は、ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ ｔ－ｔｅｓｔによってＰ－ｖａｌｕｅが０．０５よりも小さい時、統計的に有意な差を示すと判断した。あらゆる実験は、盲検法で行われ、同じ条件下で独立して反復された。

３．結果
１）ＭＰＴＰで誘発された神経毒性（ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）で運動機能に対する蜂毒抽出物内ＰＬＡ２の含有量による効果確認

ＭＰＴＰで誘発された神経毒性で蜂毒抽出物内ＰＬＡ２の含有量による効果を評価するために、マウスにＭＰＴＰを投与し、最後のＭＰＴＰ注射後、１２時間後から６日間１日に１回Ｓｉｇｍａ ＰＬＡ２、ｃｒｕｄｅ Ｂｅｅ Ｖｅｎｏｍ、ＰＬＡ２ ３１％（ＰＬＡ２ ３１％含有蜂毒抽出物）、ＰＬＡ２ ５３％（ＰＬＡ２ ５３％含有蜂毒抽出物）、ＰＬＡ２ ７８％（ＰＬＡ２ ７８％含有蜂毒抽出物）または生理食塩水を皮下経路に投与した。

ロコモータ（ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ）活動、行動評価（ｒｏｔａｒｏｄ ｔｅｓｔ）、前足適応歩行検査（ｆｏｒｅｐａｗ ａｄｊｕｓｔｉｎｇ ｓｔｅｐ）、ポールテストなどを含んだ多様な行動テストが、パーキンソン病（ＰＤ）マウスモデルに一般的に使われており、本実施例では、ＰＤ関連運動障害に対する蜂毒抽出物の神経保護の効果をＭＰＴＰ誘発マウスモデルのポールテストによって評価した。

その結果、図２のように、ＭＰＴＰのみを投与した群は、他の対照群と比較した時、Ｔ－ｔｕｒｎとＴ－ＬＡとの時間が非常に延びたが、ＰＬＡ２ ３１％、ＰＬＡ２ ５３％、ＰＬＡ２ ７８％投与群は、ｓｉｇｍａ ＰＬＡ２を投与した群ほどＴ－ｔｕｒｎとＴ－ＬＡとの時間が非常に短縮されて改善効果があるということを確認することができた。特に、ＰＬＡ２ ７８％を投与した群が最も効果が大きいと表われた。一方、ＭＰＴＰ群とｃｒｕｄｅ Ｂｅｅ Ｖｅｎｏｍ群との間のＴ－ｔｕｒｎとＴ－ＬＡ時間には大きな差がないと表われた。

２）ＭＰＴＰで誘導されたＰＤマウスでＴｒｅｇ細胞数に対する蜂毒抽出物内ＰＬＡ２の含有量による影響確認
以前研究で、ＰＤ患者は、対照群に比べてＴｒｅｇ細胞の比率が減少し、ＰＤ患者から作用Ｔ（ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ）細胞機能を抑制する能力の低下が観察された。これにより、Ｔｒｅｇ細胞の比率に対するｂｖＰＬＡ２成分の含有量による影響を流細胞分析（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）で評価した。

その結果、図３のように、対照群とＭＰＴＰ群との間にＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の数は、有意な差は発見されていない。しかし、対照群に比べてＳｉｇｍａ ＰＬＡ２とＰＬＡ２ ７８％とを投与した群では、Ｔｒｅｇ細胞の数が７０％以上増加したことを確認することができ、ＰＬＡ２ ３１％とＰＬＡ２ ５３％とを投与した群でも、Ｔｒｅｇ細胞の数が若干増加したと表われた。一方、ｃｒｕｄｅ Ｂｅｅ Ｖｅｎｏｍを投与した群では、Ｔｒｅｇ細胞の数に有意な差が誘発されていない。

３）ＭＰＴＰで誘導されたＰＤマウスでＴｈ１及びＴｈ１７細胞数に対する蜂毒抽出物内ＰＬＡ２の含有量による効果確認
引き続き、Ｔ－ｈｅｌｐｅｒ細胞表現型に対する蜂毒抽出物内ＰＬＡ２の含有量による効果を確認した。ＩＦＮ－γ及びＩＬ－１７Ａで表現したことは、Ｔｈ１、そして、Ｔｈ１７細胞の代替にしたものであり、流細胞分析で、この細胞の分布を確認した。

その結果、図４のように、Ｔｈ１の数は増加し、ＭＰＴＰ群でＴｈ１／Ｔｈ２均衡がＴｈ１側に移動して、Ｔｈ１類型の反応が向上したということを確認することができる。Ｔｈ１７細胞も、ＭＰＴＰ群で増加するということを確認することができた。一方、ＭＰＴＰ群に比べてＳｉｇｍａ ＰＬＡ２とＰＬＡ２ ７８％とを投与した群で分極化されたＴｈ１とＴｈ１７細胞のＩＦＮ－γとＩＬ－１７Ａ発現が減少すると表われた。

４）蜂毒抽出物内ＰＬＡ２の含有量がＭＰＴＰ神経毒性に対するＳＮのドーパミン性神経細胞に及ぼす影響確認
ドーパミン性神経細胞に対する蜂毒抽出物内ＰＬＡ２の含有量による保護効果を評価するために、ＴＨ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）－陽性神経細胞の数を測定した。

その結果、図５のように、ＭＰＴＰ群は、対照群に比べてＴＨ－陽性神経細胞の数が３倍程度減少したと表われた。ＭＰＴＰと蜂毒抽出物とを処理後、ＴＨ－免疫染色された線条体で生き残ったドーパミン性神経細胞を分析した結果、Ｓｉｇｍａ ＰＬＡ２とＰＬＡ２ ７８％とを皮下経路に投与した群では、ＳＮ内の生き残ったＴＨ－陽性神経細胞の数が増加したことを確認することができ、ＰＬＡ２ ３１％とＰＬＡ２ ５３％とを投与した群でも、ＴＨ－陽性神経細胞の数が中間程度増加したことを確認することができた。一方、ｃｒｕｄｅ Ｂｅｅ Ｖｅｎｏｍを投与した群では、ＳＮ内のドーパミン性神経細胞が顕著に減少したと表われた。

４．結論
本実施例では、パーキンソン病（ＰＤ）動物モデルで蜂毒抽出物内ＰＬＡ２の含有量による最大の効能を調査した。以前研究結果で、ＰＤの病的側面の一時的な進行を予防するための蜂毒抽出物投与の最善の経路が皮下（ＳＣ）という事実を確認し、蜂毒抽出物を皮下経路に注射した時、ＭＰＴＰによって誘導されたＰＤマウスモデルで神経炎症反応を調節することにより、ドーパミン性神経細胞が保護された。

ＰＤの病的側面を改善するために、蜂毒抽出物内ＰＬＡ２成分の最適含有量を確認した本実施例によれば、ＰＬＡ２成分が７８％含有された薬物で治療した時、ＭＰＴＰ毒性モデルでｓｉｇｍａ ＰＬＡ２と類似しているレベルの向上した運動機能、Ｔｈ１及びＴｈ１７分極の減少、ＴＨ－陽性ドーパミン性神経細胞の増加を含む最上の神経保護の効果を示すということを確認することができた。

したがって、ＭＰＴＰで誘導されたＰＤマウスモデルで神経損傷を予防するための最適のＰＬＡ２成分含有量であるＰＬＡ２ ７８％含有蜂毒抽出物（ＰＬＡ２ ７８％）が含有された薬物は、蜂毒抽出物内ＰＬＡ２含有量が３１％または５３％である薬物よりも最も効果が良いと見られ、ＰＬＡ２ ７８％薬物の皮下投与経路は、ＰＤ患者の治療に潜在的な応用が可能であると判断する。

＜実施例３＞アルツハイマー病（ＡＤ）動物モデルで蜂毒抽出物内ＰＬＡ２成分の含有量による治療効果の評価
１．実験方法
１）材料
ｂｖＰＬＡ２（ＰＬＡ２ ７５～８５％含有蜂毒抽出物）は、イニストエスティ（ＩＮＩＳＴｓｔ Ｃｏ．，ＬＴＤ、Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）から供給され、リン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ；最終濃度１ｍｇ／ｍＬ）に溶解させた後、使用するまで－２０℃で保管された。

ＬＰＳは、Ｓｉｇｍａ（ｓｅｒｏｔｙｐｅ ０１１１：Ｂ４；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入し、ＬＰＳ（最終濃度１ｍｇ／ｍＬ）をＰＢＳに溶解させた後、その分取量は、使用するまで－２０℃で保管された。

Ａβ_１－４２は、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ｒａｔ；Ｂｒｉｓｔｏｌ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）から購入し、Ａβ_１－４２（最終濃度２００μＭ）を０．１％アンモニアに溶解させた後、－７０℃で保管された。

２）水迷路実験（Ｗａｔｅｒ ｍａｚｅ ｔｅｓｔ）
水迷路実験は、記憶力実験に一般的に使われる方法によって行われた。迷路実験は、ＳＭＡＲＴ－ＣＳ（Ｐａｎｌａｂ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）プログラム及び装備によって行われた。円形プラスチックプール（高さ：３５ｃｍ、直径：１００ｃｍ）は、２２～２５℃に保持されたスキムミルク（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）で不透明に製造された水で満たした。脱出プラットホーム（高さ：１４．５ｃｍ、直径：４．５ｃｍ）は、水面下１～１．５ｃｍに浸漬されている。試験テストは、単一プラットホームの２つの回転開始位置で行われた。試験テスト後に、マウスは、１２０秒間プラットホームで留まった後、それらのケージに送られた。各マウスの脱出遅延時間（ｅｓｃａｐｅ ｌａｔｅｎｃｙ）及び脱出距離（ｅｓｃａｐｅ ｄｉｓｔａｎｃｅ）は、ＳＭＡＲＴ－ＬＤ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｐａｎｌａｂ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）に連結されたプールの中央上のカメラでモニタリングされた。

３）プローブテスト（Ｐｒｏｂｅ ｔｅｓｔ）
記憶保持能力をテストするために、水迷路実験２４時間後、プローブテストが行われた。水迷路実験で使われたプールからプラットホームを除去し、マウスが自在に泳ぐようにした。ＳＭＡＲＴ－ＬＤ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｐａｎｌａｂ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）を用いて６０秒間各マウスの水泳パターンをモニタリングし、記録した。保有した空間記憶力は、ターゲット四分面（ｔａｒｇｅｔ ｑｕａｄｒａｎｔ）領域で所要時間によって計算された。

４）手動回避実験（Ｐａｓｓｉｖｅ ａｖｏｉｄａｎｃｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｔｅｓｔ）
手動回避実験は、一般的に記憶力テストのための簡単な実験として知られている。手動回避反応は、８ｍｍ間隔の３．１７５ｍｍステンレススチール棒の格子床がある小さなゲートを通じて互いに隣接した明るい区画（ｉｌｌｕｍｉｎａｔｅｄ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）及び暗い区画（ｄａｒｋ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）（それぞれ２０．３×１５．９×２１．３ｃｍ）に分けられた「ｓｔｅｐ－ｔｈｒｏｕｇｈ」装置（Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．、Ｖｅｒｍｏｎｔ、ＵＳＡ）を用いて決定された。

１日目、マウスは、訓練試験のために暗い区画から遠く離れた明るい区画に置いた。マウスが暗い区画に完全に移動すれば、電気衝撃（０．４５ｍＡ、３ｓ ｄｕｒａｔｉｏｎ）が発生した。その後、マウスは、それらのケージに送り返された。訓練試験１日後、マウスを明るい区画に置き、「ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ」と定義された暗い区画に入る留まる時間を測定した。マウスが暗い区画に入った時間を記録し、段階別の留まる時間を通じて説明した。記憶力試験は、３分の締め切り時間限定を設定した。

５）脳組織の収集及び保存
行動実験後、マウスは、ＣＯ_２吸入を通じた麻酔下に、ヘパリンが含まれたＰＢＳを灌流させた。脳から頭蓋骨（ｓｋｕｌｌ）を直ちに除去した後、海馬（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）領域のみを分離して生化学分析時まで－８０℃で保管した。

６）チオフラビンＳ染色
３０％スクロース溶液に移された後、脳は、凍結組織切片器（ｃｒｙｏｓｔａｔ ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ、Ｌｅｉｃａ ＣＭ １８５０；Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）を用いて２０μｍの切片に切断された。蒸留水で５分間洗浄した後、脳切片は、ゼラチン－コーティングされたスライドに移して１％チオフラビンＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）が含まれた５０％エタノールに８分間置いた。引き続き、脳切片を蒸留水で洗浄した後、５０、７０、９０及び１００％のエタノールの各等級で２分間脱水させた。その後、切片は、マウンティング媒体（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ^ＴＭ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）でマウンティングされた。チオフラビンＳ染色は、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ａ１；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（×５０及び×２００）を用いて確認した。

７）β－セクレターゼ活性分析
マウス脳でのβ－セクレターゼ活性は、商業的に利用可能なβ－セクレターゼ活性分析キット（Ａｂｃａｍ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して決定した。可溶化された膜をβ－セクレターゼ抽出緩衝液を使用して脳組織から抽出し、アイスで１時間インキュベーションし、４℃で１０分間５０００×ｇで遠心分離して上澄み液を収集した。

総５０μＬの試料（総タンパク質１００μｇ）または空試料（ｂｌａｎｋ）（β－セクレターゼ抽出緩衝液５０μＬ）を各ウェル（９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に添加した後、５０μＬの２×反応緩衝液（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）及び２μＬのβ－セクレターゼ基質を３７℃の暗室で１時間インキュベーションした。蛍光分光計（Ｇｅｍｉｎｉ ＥＭ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、それぞれ３３５及び４９５ｎｍの励起及び放出波長で蛍光を判読した。

８）β－アミロイド（Ａβ）の測定
脳組織の溶解物は、プロテアーゼ抑制剤が含まれたタンパク質抽出緩衝液を通じて収得された。Ａβ_１－４２及びＡβ_１－４０レベルは、それぞれ特異的マウスβ－アミロイドペプチド１－４２酵素－連結された免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）キット（ＣＳＢ－Ｅ１０７８７ｍ；ＣＵＳＡＢＩＯ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＵＳＡ）及びマウスβ－アミロイドペプチド１－４０ ＥＬＩＳＡキット（ＣＳＢ－Ｅ０８３００ｍ；ＣＵＳＡＢＩＯ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＵＳＡ）を使用して決定された。

タンパク質は、タンパク質抽出緩衝液（ＰＲＯ－ＰＲＥＰ；Ｉｎｔｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｋｙｕｎｇｋｉ－ｄｏ、Ｋｏｒｅａ）を用いて脳組織から抽出され、アイス（ｉｃｅ）で１時間インキュベーションされ、４℃で１５分間１３，０００×ｇで遠心分離された。簡略に、１００μＬの試料は、予備コーティングされたプレートに添加されて３７℃で２時間インキュベーションされた。結合されていない物質を除去した後、Ａβに特異的なビオチン－結合（ｂｉｏｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）抗体をウェルに添加した。洗浄後に、アビジン－結合（ａｖｉｄｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）がウェルに添加された。結合されていないアビジン－酵素試薬を除去するために洗浄した後、基質溶液をウェルに添加し、初期段階で結合されたＡβの量に比例して発色させた。発色を止め、色の強度を測定した。

９）免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）
３０％スクロース溶液に移された後、脳は、凍結組織切片器（Ｌｅｉｃａ ＣＭ １８５０；Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）を用いて２０μｍの切片に切断された。それぞれ１０分間ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄された後、試料は、抗原回復（ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）及び内因性ペルオキシダーゼ（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）の遮断のために、３％過酸化水素及び１％トリトン－Ｘ（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）が含有されたＰＢＳで３０分間インキュベーションされ、追加的にそれぞれ１０分ずつ２回ＰＢＳで洗浄された。

脳切片は、１時間３％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）溶液でブロックされ、グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＦＡＰ；１：３００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ．ｉＮＯＳ；１：３００；Ａｂｃａｍ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）、イオン化されたカルシウム結合アダプタ分子１（ｉｏｎｉｚｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｄａｐｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １、ＩＢＡ－１；１：３００；Ａｂｃａｍ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）及びシクロオキシゲナーゼ２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ２、ＣＯＸ－２；１：３００、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、ＣＯ、ＵＳＡ）で４℃で一晩中インキュベーションされた。

１次抗体でインキュベーションした後、脳切片は、それぞれ１０分ずつＰＢＳで３回洗浄された。洗浄後、脳切片は、ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ、ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ、またはｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｇｏａｔ ＩｇＧ－ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）２次抗体（１：５００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）で１～２時間室温でインキュベーションされた。脳切片は、それぞれ１０分ずつＰＢＳで３回洗浄され、最大１０分間クロモゲンジアミノベンジジン（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）反応によって視覚化された。

最終的に、脳切片は、エタノールから脱水され、キシレン（ｘｙｌｅｎｅ）から除去され、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈａｍｐｔｏｎ、ＮＨ、ＵＳＡ）でマウンティングされて光学顕微鏡（Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ．Ａ２；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ；×５０及び×２００）で評価された。

１０）ウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）
ターゲットタンパク質を検出するために、ｉＮＯＳ、ＩＢＡ－１、ＧＦＡＰ、ＡＰＰ及びＢＡＣＥ１（１：１０００；Ａｂｃａｍ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、ＣＯＸ－２（１：１０００；Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、ＣＯ、ＵＳＡ）、Ｃ－ジュンＮ末端リン酸化酵素（ｃ－Ｊｕｎ Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ、ＪＮＫ）、細胞外信号－調節リン酸化酵素（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ、ＥＲＫ）１／２、ｐ－ｐ３８及びｐ３８（１：０００；Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、ＭＡ、ＵＳＡ）、ｐ－ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ３、ｐ－ＥＲＫ１／２、ｐ－ＪＮＫ、及びβ－ａｃｔｉｎ（１：２００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）に対する特異的抗体を使用した。

ブロットは、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入したａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ、ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ及びａｎｔｉ－ｇｏａｔのような対応するコンジュゲートされた２次抗体と共にインキュベーションされた。免疫反応性タンパク質は、強化された化学発光ウェスタンブロッティング検出システム（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）で検出された。

１１）サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）レベル測定
炎症誘発性（ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）及び抗炎症性（ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインレベルは、定量的逆転写重合酵素連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）で測定された。総ＲＮＡは、海馬組織からＲｉｂｏＥＸ（Ｇｅｎｅａｌｌ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）を使用して抽出し、ｃＤＮＡは、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて合成した。

ｑＲＴ－ＰＣＲは、カスタム設計されたプライマーのための７５００ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）で行われ、β－ａｃｔｉｎは、ＨｉＰｉ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＥＬＰＩＳ ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を用いてハウスキーピングコントロール（ｈｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）として使われた。

９４℃で３分の初期変性段階、９４℃で３０秒の変性段階、６０℃で３０秒のアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）段階及び７２℃で１分の延長段階で構成されたサイクリング条件は、４０サイクルに繋がった。ターゲット遺伝子発現に対して収得された値は、β－ａｃｔｉｎで標準化し、対照群試料で発現に対して定量化した。

各試料は、下記表２のプライマーで行われた。

１２）ＢＶ－２ミクログリア細胞の培養
ミクログリア細胞ＢＶ－２を培養してＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）またはＡβ_１－４２（２．５μＭ）及びＰＢＳに溶解されたｂｖＰＬＡ２の多様な濃度（０．０１、０．１、１μｇ／ｍＬ）を同時に処理した。細胞は、２４時間後に収得して細胞生存率（Ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）、酸化窒素（Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ）濃度及び炎症誘発性サイトカインのレベルを測定した。

１３）細胞生存率の分析
ＢＶ－２細胞は、９６ウェルプレートにプレーティングされた後、２４時間ｂｖＰＬＡ２（０－１μｇ／ｍＬ）で処理された。処理後、ＭＴＴ溶液［３－（４，５－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－Ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ］（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によって細胞生存率が測定された。細胞培地の１／１０容量のＭＴＴ溶液を各ウェルに添加し、混合物をＣＯ_２インキュベーターで２時間インキュベーションした後、除去した。細胞から前記混合物を除去した後、培地の同一容量ほどジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、ＤＭＳＯ）を添加した。引き続き、マイクロプレート吸光度リーダー機で５７０ｎｍの波長で各ウェルの吸光度を判読した。

１４）酸化窒素分析
ＢＶ－２細胞は、９６ウェルプレートで成長された後、２４時間多様な濃度のｂｖＰＬＡ２（０．０１、０．１、１μｇ／ｍＬ）の不在または存在でＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）と共に、またはなしに培養された。酸化窒素検出キット（ＮＯ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｉｎｔｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｋｙｕｎｇｋｉ－ｄｏ、Ｋｏｒｅａ）によって上澄み液の亜硝酸塩（ｎｉｔｒｉｔｅ）濃度が分析された。５２０ｎｍの吸光度は、マイクロプレート吸光度リーダー機によって測定され、一連の公知の濃度の亜硝酸ナトリウムが標準として使われた。

１５）プルダウン分析（Ｐｕｌｌ－ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ）
ｂｖＰＬＡ２をエポキシ－活性化されたセファロース４Ｂ（Ｅｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｋｏｒｅａ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）で接合させた。

簡単に説明すれば、ｂｖＰＬＡ２ １ｍｇをカップリング緩衝液（ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ；０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３及び０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ１１．０）の１ｍＬに溶解させた。エポキシ－活性化されたセファロース４Ｂビーズ（ｂｅａｄｓ）０．１ｇを膨潤させ、焼結されたガラスフィルターで１ｍＭ ＨＣｌで洗浄した後、カップリング緩衝液で洗浄した。エポキシ－活性化されたセファロース４ＢビーズをｂｖＰＬＡ２含有されたカップリング緩衝液に添加して４℃で一晩中回転させた。対照群非結合セファロース４Ｂビーズは、ｂｖＰＬＡ２なしに前記のように製造された。

洗浄後、非占有結合部位をブロッキング緩衝液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ；０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で室温で３時間ブロックさせた。ｂｖＰＬＡ２－結合セファロース４Ｂは、３周期の交替ｐＨ洗浄緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ １：０．１Ｍ ａｃｅｔａｔｅ及び０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０；ｂｕｆｆｅｒ ２：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ及び０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で洗浄された。以後、ｂｖＰＬＡ２－接合ビーズは、結合緩衝液（ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ；０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ及び０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で平衡化された。

ｂｖＰＬＡ２及びＳＴＡＴ３の結合を立証するために、ＳＴＡＴ３タンパク質をＳＴＡＴ３ ＤＮＡで形質注入を通じて過発現させた。ＢＶ－２細胞は、製造社のプロトコルによってＯｐｔｉ－ＭＥＭでＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ(R) ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いてＳＴＡＴ３ ＤＮＡ（７００ｎｇ／ｐｅｒ ｗｅｌｌ ｏｆ ａ ｓｉｘ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）で形質注入された。ＢＶ－２細胞溶解物（１ｍｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、ｂｖＰＬＡ２－結合セファロース４Ｂまたは非結合セファロース４Ｂと混合されて４℃で一晩中培養された。以後、ビーズは、ＴＢＳＴで３回洗浄された。

結合タンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ、ＳＤＳ）ローディング緩衝液で溶離され、ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離した後、ＳＴＡＴ３に対する抗体（１：２００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ、ＵＳＡ）で免疫ブロッティングした。

１６）ルシフェラーゼ分析
ＢＶ－２細胞は、１２ウェルプレート（８×１０^４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）にプレーティングされ、２４時間、製造社の仕様（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）によってＯｐｔｉ－ＭＥＭでＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を使用してＳＴＡＴ３－Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）プラスミドで一時的に形質注入された。形質注入された細胞は、２４時間、１μｇ／ｍＬのＬＰＳ及び０．０１、０．１及び１μｇ／ｍＬのｂｖＰＬＡ２で処理された。ルシフェラーゼ活性は、製造社の仕様（ＷｉｎＧｌｏｗ、Ｂａｄ Ｗｉｌｄｂａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ(R) Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）及び発光測定器（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅ）を用いて測定された。

１７）ドッキング実験（Ｄｏｃｋｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）
ＳＴＡＴ３を利用したｂｖＰＬＡ２のドッキング研究は、Ａｕｔｏｄｏｃｋ ＶＩＮＡ（Ｔｒｏｔｔ ａｎｄ Ｏｌｓｏｎ、２０１０）を使用して行われた。ＳＴＡＴ３［ＰＤＢ：３ＣＷＧ］及びｂｖＰＬＡ２［ＰＤＢ：１ＰＯＣ］の３次元構造は、タンパク質データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ）から検索され、Ａｕｔｏｄｏｃｋ－Ｔｏｏｌｓを用いてさらに準備された。グリッドボックス（ｇｒｉｄ ｂｏｘ）は、ＳＴＡＴ３モノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）を中心とし、グリッドボックスのサイズは、全体モノマーを含むように調整された。ドッキング実験は、１６、２４、３２、４０、及び６０の多様なデフォルト消尽値（ｄｅｆａｕｌｔ ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅｎｅｓｓ ｖａｌｕｅｓ）で行われた。最上のバインディングモデルに対する分子グラフィックは、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｒ ２．０．を使用して生成された。

１８）統計分析
データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０３；ＧｒａｐｈＰａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して分析した。データは、平均±ＳＥＭで示した。あらゆるデータの差は、ｏｎｅ－ｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ（ＡＮＯＶＡ）で評価された。ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ ｔ－ｔｅｓｔでＰ値が統計的有意性を示した時、その差は、Ｄｕｎｎｅｔｔ'ｓ ｔｅｓｔによって評価された。ｐ＜０．０５の値は、統計的に有意なものと見なされた。

２．ｉｎ ｖｉｔｒｏでの蜂毒抽出物の効果
１）神経炎症（ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）及びアミロイド生成（ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ）でのｂｖＰＬＡ２効果確認
ｂｖＰＬＡ２の処理によるミクログリア細胞（ＢＶ－２ ｃｅｌｌｓ）でのアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、β－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、β‐アミロイド（Ａβ）の発現レベル変化をウェスタンブロットで確認した。その結果、図６のＡのように、ＬＰＳ処理によって細胞内ＡＰＰ、ＢＡＣＥ１、β－Ａｍｙｌｏｉｄ（Ａβ）のレベルが増加し、ｂｖＰＬＡ２処理時に、濃度依存的にそのレベルが減少すると表われた。

活性化されたβ－セクレターゼによってβ－アミロイドが生成するために、β－セクレターゼ活性分析（β－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ）を進行した。その結果、図６のＢのように、ＬＰＳによって増加したβ－セクレターゼ活性がｂｖＰＬＡ２処理時に、濃度依存的に減少すると表われた。

ｉＮＯＳ、ＣＯＸ－２のような炎症性タンパク質（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）と活性化されたミクログリア細胞のマーカーであるＩＢＡ－１のレベルをウェスタンブロットで確認した。その結果、図６のＣのように、ＬＰＳ処理時に、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ－２及びＩＢＡ－１の発現レベルが増加し、ｂｖＰＬＡ２処理時に、濃度依存的にｉＮＯＳ、ＣＯＸ－２及びＩＢＡ－１の発現レベルが減少すると表われた。

ｂｖＰＬＡ２がＮＦ－κＢの転座（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）抑制に影響を与えるかを確認するために、ＢＶ－２細胞の核でのＮＦ－κＢサブユニットのレベルをウェスタンブロットで測定した。その結果、図６のＤのように、ｐ６５、ｐ５０いずれもＬＰＳ処理時に、核での発現レベルが増加したが、ｂｖＰＬＡ２処理時に、濃度依存的にその発現レベルが減少すると表われた。

また、ｂｖＰＬＡ２が炎症反応を促進する炎症誘発性サイトカイン減少に影響を与えるかを確認するために、ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。その結果、図６のＥのように、炎症誘発性サイトカインのうち、神経細胞に多く分布しているＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６のレベルがＬＰＳ処理によって急増し、ｂｖＰＬＡ２処理時に、濃度依存的にＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６のレベルがいずれも減少すると表われた。

これを通じて、ｂｖＰＬＡ２は、β－セクレターゼ活性低下とＡＰＰ、ＢＡＣＥ１の細胞内レベルを下げてミクログリア細胞内のβ－アミロイド蓄積阻害効果を有するということを確認することができ、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ－２の細胞内レベルを減少させ、炎症誘発性サイトカインの発現レベルを減少させて神経炎症緩和効果も有するということを確認することができる。

２）蜂毒抽出物の神経炎症での併用（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）効果確認
蜂毒抽出物とＮＦ－κＢ抑制剤との神経炎症での併用効果を確認するために、ＢＶ－２細胞にＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）、ｂｖＰＬＡ２（１００ｎｇ／ｍＬ）を処理してウェスタンブロットとｑＲＴ－ＰＣＲとを行った。

まず、ウェスタンブロットで神経炎症と関連があるｉＮＯＳ、ＣＯＸ－２のレベルを測定した結果、図７のＡのように、ｂｖＰＬＡ２とＮＦ－κＢ抑制剤であるＢａｙ １１－７８０２とを個別的に処理した場合に、ｉＮＯＳとＣＯＸ－２いずれも減少し、ｂｖＰＬＡ２とＮＦ－κＢ抑制剤Ｂａｙ １１－７８０２とを共に細胞に処理した場合には、ｉＮＯＳとＣＯＸ－２とのレベルがさらに多く減少すると表われた。

ＮＦ－κＢ信号伝達経路と関連したｐ－ＩκＢαの細胞内レベルと細胞核内でのｐ６５、ｐ５０のレベルとをウェスタンブロットで測定した結果、図７のＢのように、ｂｖＰＬＡ２とＮＦ－κＢ抑制剤（Ｂａｙ １１－７８０２）とを個別的に細胞に処理した時、いずれもＬＰＳ処理によるｐ－ＩκＢα、ｐ６５、ｐ５０の増加が緩和され、ｂｖＰＬＡ２、ＮＦ－κＢ抑制剤（Ｂａｙ １１－７８０２）を共に処理した時、ｐ－ＩκＢα、ｐ６５、ｐ５０のレベルがさらに減少すると表われた。

ＢＶ－２細胞でＬＰＳ処理による炎症誘発性サイトカインであるＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６の増加にｂｖＰＬＡ２とＮＦ－κＢ抑制剤が如何なる影響を及ぼすかを調査するために、ｑＲＴ－ＰＣＲで細胞内発現量を測定した。その結果、図７のＣのように、ｂｖＰＬＡ２、ＮＦ－κＢ抑制剤（Ｂａｙ １１－７８０２）を個別的に処理した時、ＬＰＳによって増加したＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６の発現量が減少したことを確認することができ、この２つを共に処理した時は、炎症誘発性サイトカインの発現量が個別的に処理したものよりもさらに減少して対照群のレベルまで減少したと表われた。

したがって、ミクログリア細胞（ＢＶ－２ ｃｅｌｌｓ）でｂｖＰＬＡ２の神経炎症緩和効果は、ＮＦ－κＢ抑制剤（Ｂａｙ １１－７８０２）と共にした時、さらに大きな効果を示すということを確認することができる。

３．アルツハイマー動物モデルで蜂毒抽出物の効果－ＬＰＳ誘導神経炎症マウス
１）蜂毒抽出物の記憶力緩和の効果確認
本実施例でのアルツハイマー動物モデルは、ＬＰＳを注射して神経性炎症を誘導したマウスであって、記憶力減退やβ－アミロイド蓄積などがアルツハイマー患者と類似している態様を示す。

ｂｖＰＬＡ２がアルツハイマー治療に効果があるかを調査するために、一週間ＬＰＳを２５０μｇ／ｋｇの容量で腹腔内注射（Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）してアルツハイマーを誘導し、同時に一週間に３回ｂｖＰＬＡ２を腹腔内注射で投与した（図８）。それぞれの注射は、同時に投与せず、２時間以上の一定の時間間隔を置いて投与し、ＬＰＳとｂｖＰＬＡ２との投与と共にアルツハイマーの代表的症状である記憶力減退程度を測定するために、誘導及び投与の間に行動実験を進行した。

学習能力と空間記憶能力との評価に多く使われる行動実験であるモリス水迷路実験（Ｍｏｒｒｉｓ ｗａｔｅｒ ｍａｚｅ）を６日間１日に２回ずつ進行した。その結果、図９のＡ及び図９のＢのように、６日目に対照群は、平均２４．６４秒に３５２．６１ｃｍを動かしてプラットホーム（ｐｌａｔｆｏｒｍ）を探したが、ＬＰＳ群は、平均３７秒に５０２．７９Ｃｍを動かしてプラットホームを探すと表われた。一方、ｂｖＰＬＡ２を２ｍｇ／ｋｇを投与した群では、平均２６．１４秒に２２９．９７ｃｍを動かしてプラットホームを探すと表われた。

すなわち、ＬＰＳ群が対照群よりもプラットホームを探すのにさらに長時間がかかり、移動距離が遠いことから、学習能力と空間記憶能力とが低下したと見られる。一方、ｂｖＰＬＡ２投与群は、濃度依存的にプラットホームを探すのにかかった時間（ｅｓｃａｐｅ ｌａｔｅｎｃｙ）と距離（ｅｓｃａｐｅ ｄｉｓｔａｎｃｅ）とが減少と見て、ｂｖＰＬＡ２の投与がＬＰＳ処理によるマウスの学習能力と空間記憶能力との低下を緩和させることを確認することができる。

モリス水迷路が終わった翌日に記憶保持能力を評価するために、プローブテストを進行した。その結果、図９のＣのように、対照群は、６０秒間ターゲットに平均２４．８３％留まったが、ＬＰＳ群は、同じ時間ターゲットに平均１７．７９％であって、留まる時間が減少した。一方、ｂｖＰＬＡ２ ０．０２、０．２及び２ｍｇ／ｋｇを投与した群では、それぞれ平均２３．４４％、２５．３３％及び２７．２９％であって、留まる時間がＬＰＳ群よりも増加したと表われた。

最後の行動実験でどれほど長く記憶しているかを試験するために、手動回避実験（ｐａｓｓｉｖｅ ａｖｏｉｄａｎｃｅ ｔｅｓｔ）を進行した。その結果、図９のＤのように、あらゆる群で訓練試験（ｔｒａｉｎｉｎｇ ｔｒｉａｌ）では、明るい区画から暗い区画に移動するのにかかる時間の差はなかったが、翌日試験する時には、対照群が平均６９．６３秒間留まり、ＬＰＳ群は、平均１８．４５秒留まった。一方、ｂｖＰＬＡ２ ０．２と２ｍｇ／ｋｇとを投与した群でそれぞれ平均４６．９２と６７．５９秒とに明るい区画で留まる時間がＬＰＳ群よりも多く増加したと表われた。

したがって、前記のアルツハイマー動物モデルでの行動実験結果から見る時、ｂｖＰＬＡ２は、アルツハイマーの代表的症状である学習能力、空間記憶能力、記憶保持能力及び記憶力の低下を緩和させることを確認することができる。

２）蜂毒抽出物のアミロイド症（ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）の減少効果確認
蜂毒抽出物がアミロイド症に効果を示すかを確認するために、マウスの脳組織でのβ－アミロイド（Ａβ）生成をＥＬＩＳＡで測定した。その結果、図１０のＡのように、ＬＰＳ群で対照群よりもβ－アミロイドが平均的に約１．６倍さらに蓄積され、ｂｖＰＬＡ２投与群は、濃度依存的にβ－アミロイドの蓄積が減少すると表われた。

β－アミロイド（Ａβ）は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を分解するβ－セクレターゼによって生成するために、β－セクレターゼの活性を測定するβ－セクレターゼ活性分析を進行した。その結果、図１０のＢのように、ＬＰＳ群で対照群よりもβ－セクレターゼの活性が増加し、ｂｖＰＬＡ２処理によって濃度依存的にβ－セクレターゼの活性が減少すると表われた。

また、マウスの脳組織でｂｖＰＬＡ２の処理によるＡＰＰ、ＢＡＣＥ１、β－アミロイド（Ａβ）のレベル変化をウェスタンブロットで確認した結果、図１０のＣのように、ＬＰＳ群では、ＡＰＰ、ＢＡＣＥ１、Ａβレベルが急増したが、ｂｖＰＬＡ２投与群では、濃度依存的にそのレベルが減少すると表われた。

これを通じて、ｂｖＰＬＡ２がβ－アミロイド蓄積に影響を与えるβ－セクレターゼの活性を減少させることにより、ＡＰＰ、ＢＡＣＥ１、Ａβのレベルを減少させてアルツハイマー症状を緩和させることを確認することができる。

３）蜂毒抽出物の神経炎症緩和の効果確認
ＬＰＳでアルツハイマーを誘導したマウスの脳組織で神経炎症の変化に蜂毒抽出物が如何なる影響を及ぼすかを確認するために、炎症性タンパク質の発現程度と星状膠細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）とミクログリア細胞との活性を免疫組織化学の方法で確認した。

その結果、図１１のＡのように、ＬＰＳ群で対照群よりもＧＦＡＰ－反応性細胞（ＧＦＡＰ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｃｅｌｌ）及びＩＢＡ－１－反応性細胞（ＩＢＡ－１－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｃｅｌｌ）の数が増加すると表われ、これは、星状膠細胞とミクログリア細胞とが活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）されて神経退行性疾病を進行させると見られる。一方、ｂｖＰＬＡ２を投与した群では、ＧＦＡＰ－反応性細胞とＩＢＡ－１－反応性細胞との数が濃度依存的に減少すると表われて、ｂｖＰＬＡ２がアルツハイマーのような神経退行性疾病の発病を阻害させるということを確認することができる。

また、図１１のＢのように、ＬＰＳ群で対照群よりもｉＮＯＳ－反応性細胞及びＣＯＸ－２－反応性細胞の数が増加すると表われて、これにより、ＬＰＳによって脳組織に炎症が生じたということが分かる。一方、ｂｖＰＬＡ２を処理したマウスの脳組織でｉＮＯＳ－反応性細胞とＣＯＸ－２－反応性細胞とが濃度依存的に減少すると表われて、ｂｖＰＬＡ２が神経炎症反応の緩和に役に立つことを確認することができる。

４）神経炎症変化に対する蜂毒抽出物の影響確認
ＬＰＳでアルツハイマーを誘導したマウスの脳組織で神経炎症の変化に蜂毒抽出物が如何なる影響を及ぼすかを調べるために、炎症性タンパク質の発現程度と星状膠細胞及びミクログリア細胞の活性とをウェスタンブロットで確認した。

その結果、図１２のＡのように、ＬＰＳ群で対照群よりもｉＮＯＳとＣＯＸ－２との発現量が多く増加すると表われて、ＬＰＳによって脳組織に炎症が生じたということを確認することができる。一方、ｂｖＰＬＡ２を処理したマウスの脳組織でｉＮＯＳとＣＯＸ－２との発現量が濃度依存的に減少すると表われて、ｂｖＰＬＡ２が神経炎症反応の緩和に役に立つことを確認することができる。

また、ＬＰＳ群で対照群よりもＧＦＡＰ（星状膠細胞活性化マーカー）とＩＢＡ－１（ミクログリア細胞活性化マーカー）との発現が増加し、これを通じて星状膠細胞とミクログリア細胞との活性化によって神経退行性疾病が進行すると判断することができる。一方、ｂｖＰＬＡ２を投与した群では、ＧＦＡＰとＩＢＡ－１との発現が減少すると表われて、ｂｖＰＬＡ２がアルツハイマーのような神経退行性疾病の発病を阻害させると判断することができる。

ｂｖＰＬＡ２がマウスの脳組織でＮＦ－κＢの転座抑制に影響を与えるかを確認するために、海馬部分の核（ｎｕｃｌｅａｒ）でのＮＦ－κＢサブユニット（ｓｕｂｕｎｉｔ）であるｐ５０及びｐ６５のレベルと細胞質（ｃｙｔｏｓｏｌ）でのｐ－ＩκＢαのレベルとをウェスタンブロットで測定した。

その結果、図１２のＢのように、ｐ６５及びｐ５０いずれもＬＰＳ群で核でのレベルが増加し、ｂｖＰＬＡ２投与時に、濃度依存的にそのレベルが減少すると表われた。また、ｐ－ＩκＢαの場合にも、ＬＰＳ群でそのレベルが増加し、ｂｖＰＬＡ２投与時に、濃度依存的にそのレベルが減少すると表われた。

マウスの脳組織で炎症反応を促進する炎症誘発性サイトカインの発現量減少にｂｖＰＬＡ２が影響を及ぼすかを調査するために、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６の発現量をＥＬＩＳＡを通じて測定して比較した。

その結果、図１２のＣのように、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６の発現量がＬＰＳ群で対照群よりも急増すると表われ、ｂｖＰＬＡ２処理時に、濃度依存的にＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６のレベルがいずれも非常に減少すると表われた。

このような結果を総合してみる時、ｂｖＰＬＡ２の投与がＬＰＳで誘導されたアルツハイマーマウスモデルでの神経炎症緩和に役に立つと判断することができる。

５）Ｔｒｅｇ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ）に対する蜂毒抽出物の効果確認
ＬＰＳでアルツハイマーを誘導したマウスの脳組織で炎症反応を抑制する調節Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ）に蜂毒抽出物が如何なる影響を及ぼすかを調べるために、ＴｒｅｇのマーカーであるＦｏｘｐ３の程度を免疫組織化学、ｑＲＴ－ＰＣＲ及びウェスタンブロットを通じて確認した。

その結果、図１３のＡ及び図１３のＢのように、ＬＰＳ群で対照群よりもＦｏｘｐ３－反応性細胞の数が減少したと表われて、ＬＰＳによる炎症が生じたということを確認することができる。また、ｂｖＰＬＡ２を処理したマウスの脳組織でＦｏｘｐ３－反応性細胞の数が濃度依存的に増加すると表われて、ｂｖＰＬＡ２がＴｒｅｇを活性化して神経炎症の緩和に役に立つと確認することができる。

マウスの脳組織でＦｏｘｐ３発現量にｂｖＰＬＡ２が影響を及ぼすかを調査するために、ｑＲＴ－ＰＣＲを進行した結果、図１３のＣのように、Ｆｏｘｐ３発現量がＬＰＳ群で対照群よりも減少し、ｂｖＰＬＡ２処理時に、濃度依存的にＦｏｘｐ３発現量が対照群レベルに再び回復すると表われた。

マウスの脳組織でＦｏｘｐ３レベルの変化があるかを確認するために、ウェスタンブロットを進行した結果、図１３Ｄのように、Ｆｏｘｐ３発現量がｂｖＰＬＡ２処理時に、濃度依存的に増加すると表われた。

これを通じて、ｂｖＰＬＡ２が調節Ｔ細胞を活性化してアルツハイマーによる神経炎症症状の緩和させると判断することができる。

６）蜂毒抽出物の投与経路による記憶力緩和及びβ－アミロイド（Ａβ）蓄積阻害効果の比較
蜂毒抽出物の投与経路による記憶力緩和及びβ－アミロイド蓄積阻害効果を比較するために、一週間ＬＰＳを２５０μｇ／ｋｇの容量で毎日腹腔注射してアルツハイマーを誘導し、同時に一週間に３回ｂｖＰＬＡ２を０．２ｍｇ／ｋｇの容量で腹腔注射または皮下注射の方法で投与した（図８）。それぞれの注射は同時に投与せず、２時間以上の一定の時間間隔を置いて投与し、ＬＰＳとｂｖＰＬＡ２との投与と共にアルツハイマーの代表的症状である記憶力減退程度を測定するために、誘導及び投与の間に行動実験を進行した。

学習能力と空間記憶能力との評価に多く使われる行動実験であるモリス水迷路を６日間１日に２回ずつ進行した結果、図１４Ａ及び図１４Ｂのように、６日目に対照群は、平均２４．６４秒に３５２．６１ｃｍを動かしてプラットホームを探したが、ＬＰＳ群は、平均３７秒に５０２．７９Ｃｍを動かしてプラットホームを探した。一方、ｂｖＰＬＡ２を０．２ｍｇ／ｋｇを腹腔注射で投与した群では、平均２８．９４秒に４０４．９ｃｍ、皮下注射で投与した群では、平均２２．０８秒に３１９．６ｃｍを動かしてプラットホームを探すと表われた。

したがって、皮下注射（０．２ｍｇ／ｋｇ）でｂｖＰＬＡ２を投与した時、マウスの学習能力と空間記憶能力との低下緩和効果が腹腔注射で投与した時よりも大きいと確認することができる。

モリス水迷路が終わった翌日に記憶保持能力を評価するために、プローブテストを進行した結果、図１４Ｃのように、対照群は、６０秒間ターゲットに平均２４．８３％留まったが、ＬＰＳ群は、同じ時間ターゲットに平均１７．７９％に留まる時間が減少した。一方、ｂｖＰＬＡ２ ０．２ｍｇ／ｋｇを腹腔注射で投与した群では、平均２５．３３％、皮下注射で投与した群では、２６．２２％であって、皮下注射で投与した群で腹腔注射で投与した群に比べて留まる時間が増加したことを確認することができた。

最後の行動実験でどれほど長く記憶しているかを試験するために、手動回避実験を進行した結果、図１４Ｄのように、あらゆる群でｔｒａｉｎｉｎｇ ｔｒｉａｌでは明るい区画から暗い区画に移動するのにかかる時間の差はなかったが、翌日試験時には対照群が平均６９．６３秒間留まり、ＬＰＳ群は平均１８．４５秒留まった。一方、ｂｖＰＬＡ２ ０．２ｍｇ／ｋｇを腹腔注射で投与した群で平均４６．９２秒、皮下注射で投与した群では平均３８．０３秒であって、腹腔注射で投与した群で明るい区画に留まる時間がさらに長いと確認された。

したがって、前記のアルツハイマー動物モデルでの行動実験結果を見る時、ｂｖＰＬＡ２は皮下注射で投与した時、同一容量の腹腔注射投与方法よりもアルツハイマーの代表的症状である学習能力、空間記憶能力、記憶保持能力及び記憶力の低下緩和効果がさらに大きいことを確認することができる。

また、ｂｖＰＬＡ２の投与方法の差がアミロイド症で効果の差を示すかを見るために、マウスの脳組織でのβ－アミロイド生成をＥＬＩＳＡで測定した。その結果、図１４のＥのように、対照群よりもＬＰＳ群でβ－アミロイドのレベルが大きく増加し、ｂｖＰＬＡ２処理時に、減少したことを確認することができた。

特に、腹腔注射で投与した群よりも皮下注射で投与した群のβ－アミロイドレベルがさらに低いと表われ、皮下注射でｂｖＰＬＡ２を投与した時、対照群と類似しているレベルに減少したことを確認することができた。

４．アルツハイマー病動物モデルでの蜂毒抽出物の効果－Ｔｇ２５７６マウス
１）実験動物選定及び処理
本実施例に使われたアルツハイマー動物モデルは、アルツハイマーマウスモデルとして広く使われる痴呆誘発形質転換Ｔｇ２５７６マウス（ｓｗＡＰＰ；早期発現型家族性アルツハイマー病（ｅａｒｌｙ－ｏｎｓｅｔ ｆａｍｉｌｉａｌ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）を有したスウェーデン家族から見つけられた二重突然変異（Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）を含んだマウス）であり、これは、年齢に依存的なβ－アミロイド（Ａβ）の増加、アミロイド板の生成を示す。Ｔｇ２５７６マウス脳のアミロイド蓄積は、シナプトフィジン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ）のタンパク質発現減少、神経シナプス形成、細胞骨格形成、代謝に関連したタンパク質の遺伝子発現の減少を示す特性を有する。

Ａβ注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）モデルは、マウスの脳一側半球にＡβ注入ポンプを注入して１４日間脳内Ａβの濃度を３００ｐｍｏｌを保持させて神経退化と学習及び記憶の損傷とを伴った脳機能損傷を誘導するマウスモデルである。これは、Ｔｇ２５７６がヒトＡＰＰ６９５（ｓｗＡＰＰ）遺伝子を発現して脳内アミロイド蓄積を起こすという点で代替が可能であり、Ａβ ｉｎｆｕｓｉｏｎモデルが単純にＡβによる神経毒性で脳機能損傷を起こすのに対して、Ｔｇ２５７６マウスは、遺伝子による複合的な機転によって脳機能損傷を起こすので、アルツハイマー治療剤の開発にさらに適している。

また、ｓｗＡＰＰ／ＰＳ２マウスは、Ｔｇ２５７６マウスモデルのようなｓｗＡＰＰ遺伝子を含み、突然変異型ＰＳ２遺伝子を発現するモデルとして遺伝的にアミロイド蓄積が起こってアルツハイマー病マウスモデルとして使われるマウスである。これは、先天的にアミロイド蓄積が起こってアルツハイマー性痴呆症状を示すということでＴｇ２５７６に代替が可能なので、本実施例では、Ｔｇ２５７６マウスをアルツハイマー動物モデルとして選定した。

１２ヶ月齢Ｔｇ２５７６マウスを食品医薬品安全処の人道的動物管理及び使用指針によって管理して扱った。スウェーデン二重突然変異（ｈＡＰＰ；ＨｕＡＰＰ６９５；Ｋ６７０ Ｎ／Ｍ６７１ Ｌ）を有するヒトＡＰＰ６９５を保有したＴｇ２５７６マウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ、ＵＳＡ）から購入し、菌株は、大韓民国忠北大学校の動物実験室で保持された。Ｔｇ２５７６マウスは、各グループ当たり１０匹ずつ対照群及びｂｖＰＬＡ２（１ｍｇ／ｋｇ）処理群の２つのグループにランダムに分けられた。

ｂｖＰＬＡ２は、４週間週当たり２回ずつ腹腔内投与され、対照群マウスは、代案として同一容量のビヒクルが投与された。学習及び記憶能力の行動実験は、水迷路、プローブ及び手動回避実験を用いて評価された。マウスは、ＣＯ_２窒息によって行動実験後、犠牲された。

２）蜂毒抽出物のＴｇ２５７６マウスから遺伝的に誘導された記憶障害緩和の効果確認
本実施例に用いられたＡＤ（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）マウスモデルであるＴｇ２５７６マウスは、スウェーデンで家族性ＡＤから見つけられた突然変異でヒトＡＰＰを過発現する。Ｔｇ２５７６マウスは、最大６ヶ月までＡβを迅速に生産した後、９～１２ヶ月の間にＡβプラーク（ｐｌａｑｕｅｓ）生成を始める。１３ヶ月にＡβプラークのレベルが急激に蓄積され、マウスは、認知能力損傷のようなＡＤの症状を示す。

Ｔｇ２５７６ ＡＤマウスモデルで蜂毒抽出物の記憶力改善効果を確認するために、マウスに４週間週２回ずつｂｖＰＬＡ２（１ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射で投与した（図１５のＡ）。投与４週後、学習能力及び空間記憶能力を評価するために、モリス水迷路、プローブ及び手動回避実験を連続して行った。脱出遅延時間及び距離は、記憶力改善でｂｖＰＬＡ２の影響を決定するために測定された。

その結果、図１５のＢ及び図１５のＣのように、６日目対照群の平均脱出遅延時間及び水泳距離は、それぞれ約２９．７１±４．１８９秒及び３４６．１±７１．４３ｃｍに表われた。一方、ｂｖＰＬＡ２投与群の平均脱出遅延時間及び距離は、それぞれ１９．３６±２．７９０秒及び１８６．８±２８．４８ｃｍであって、対照群と比較して著しく減少したと表われた。

モリス水迷路が終わった翌日に記憶保持能力を評価するために、プローブテストを進行した。その結果、図１５のＤのように、ターゲット四分面での平均留まる時間は、対照群（１２．３１±３．３５５％）に比べてｂｖＰＬＡ２投与群（３０．５４±４．９９２％）で有意に増加すると表われた。

プローブテスト２日後に手動回避実験を進行した結果、図１５のＥのように、対照群は明るい区画で３６．１７±８．３１０秒の平均ｓｔｅｐ ｔｈｒｏｕｇｈ留まった時間が表われ、ｂｖＰＬＡ２投与群は１０７．５±２０．９０秒であって、対照群に比べて有意に増加した値を示した。

３）蜂毒抽出物のＡβ蓄積抑制の効果確認
Ａβ蓄積は、ＡＤの原因として最もよく知られている。これにより、Ｔｇ２５７６マウスの脳で遺伝的に誘導されたＡβ蓄積に蜂毒抽出物が及ぼす影響を確認するために、チオフラビンＳ染色を行った。チオフラビンＳ染色は、主にＡβプラークから見つけられるＡβのβ－シート構造（β－ｓｈｅｅｔ－ｒｉｃｈ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）染色に使われる。その結果、図１６のＡのように、対照群と比較してｂｖＰＬＡ２投与群でＡβプラークの蓄積が非常に減少すると表われた。

Ａβ生産に関与するＡＰＰ及びＢＡＣＥ１のレベルは、Ｔｇ２５７６マウス脳のウェスタンブロット分析を用いて検出した。その結果、図１６のＢのように、対照群と比較してｂｖＰＬＡ２投与群でＡＰＰ及びＢＡＣＥ１の発現レベルが減少すると表われた。

ＥＬＩＳＡは、Ｔｇ２５７６マウス脳でＡβ_１－４２レベル及びＡβ_１－４０レベルを定量的に測定するために行われた。その結果、図１６のＣのように、対照群のＡβ_１－４２レベルは、脳で３０３９±１１６．８ｐｇ／ｍｇのタンパク質、ｂｖＰＬＡ２投与群は２２３６±２４４．９ｐｇ／ｍｇのタンパク質と表われた。また、図１６のＤのように、対照群のＡβ_１－４０レベルは、脳で２１８２±１６８．６ｐｇ／ｍｇ、ｂｖＰＬＡ２投与群は１５９３±５３．２５ｐｇ／ｍｇであると表われた。２群の前記アミロイドレベルを比較すれば、ｂｖＰＬＡ２投与は、Ｔｇ２５７６マウスの脳でＡβレベルを有意的に減少させるということを確認することができる。

ｂｖＰＬＡ２によってアミロイド生成が如何に減少するかを確認するために、脳でβ－セクレターゼ活性を分析した。その結果、図１６のＥのように、ｂｖＰＬＡ２投与でβ－セクレターゼ活性が有意に減少するということを確認した。

ｂｖＰＬＡ２のＢＶ－２細胞で細胞生存率に対する影響は、ＭＴＴ分析によって決定された（図１８のＡ）。ｂｖＰＬＡ２（０．０１、０．１、１μｇ／ｍＬ）処理された群は、対照群と比較して細胞生存率に対する有意な変化はなかったので、ｂｖＰＬＡ２は、ＢＶ－２細胞で１μｇ／ｍＬまでは毒性がないと判断する。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでアミロイド生成に対するｂｖＰＬＡ２の影響を調査するために、ＢＶ－２細胞にＬＰＳ及び多様な濃度のｂｖＰＬＡ２（０．０１、０．１、１μｇ／ｍＬ）を２４時間処理した。ＢＶ－２細胞でのＡβ_１－４２レベルは、ＥＬＩＳＡによって決定された。

その結果、図１６のＦのように、対照群でＡβ_１－４２レベルは、１４４．９±３．５８７ｐｇ／ｍｇに表われ、ＬＰＳ群では、３５６．５±６．０３０ｐｇ／ｍｇに非常に増加したと表われた。しかし、ｂｖＰＬＡ２処理群では、濃度依存的に減少してｂｖＰＬＡ２ １μｇ／ｍＬ処理群で２７３．７±２３．３３ｐｇ／ｍｇまで減少すると表われた。

図１６のＧを参照すれば、β－セクレターゼ活性も、対照群に比べてＬＰＳ群で非常に増加したが、ｂｖＰＬＡ２処理によって濃度依存的に減少することを確認することができた。

ＡＰＰ及びＢＡＣＥ１の発現レベルは、ウェスタンブロット分析で測定された。その結果、図１６のＨのように、ＡＰＰ及びＢＡＣＥ１の発現は、対照群と比較してＬＰＳ群で非常に増加した一方、ｂｖＰＬＡ２処理群で減少すると表われた。

４）Ｔｇ２５７６マウス脳での神経炎症に対する蜂毒抽出物の効果確認
ＡＤのさらに他の特徴は、星状膠細胞及びミクログリア細胞の活性化（すなわち、神経炎症）である。マウス脳で神経炎症関連タンパク質の発現レベルを調査するために、免疫組織化学及びウェスタンブロットを行った。

その結果、図１７のＡ及び図１７のＢのように、それぞれ反応性星状膠細胞と活性化されたミクログリア細胞のマーカーであるＧＦＡＰ及びＩＢＡ－１の数は、対照群と比較してｂｖＰＬＡ２投与されたマウスで減少すると表われ、炎症性タンパク質であるｉＮＯＳ及びＣＯＸ－２の数も、ｂｖＰＬＡ２投与群で減少した。

また、図１７のＣのように、ｉＮＯＳ及びＣＯＸ－２の発現レベルがｂｖＰＬＡ２投与されたＴｇ２５７６マウスの脳で減少し、ＧＦＡＰ及びＩＢＡ－１の発現レベルも、ｂｖＰＬＡ２投与群の脳で有意的に減少すると表われた。

炎症誘発性サイトカインの生成は、炎症発生のマーカーとしてよく知られており、抗炎症性サイトカインの生成は、炎症の減少を示す。これにより、炎症誘発性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインの生成レベルを決定するために、ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。

その結果、図１７のＤのように、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６のような炎症誘発性サイトカインのｍＲＮＡレベルが対照群と比較してｂｖＰＬＡ２投与群の脳で減少すると表われた。その代りに、ＩＬ－４及びＴＧＦ－βのような抗炎症性サイトカインのｍＲＮＡレベルは、対照群と比較してｂｖＰＬＡ２投与群で有意的に増加すると表われた。しかし、抗炎症性サイトカインであるＩＬ－１０の発現レベルは、ｂｖＰＬＡ２投与群マウスの脳で減少した。

５）ＢＶ－２ミクログリア細胞での神経炎症に対する蜂毒抽出物の効果確認
ミクログリア細胞でｂｖＰＬＡ２の抗炎症効果は、酸化窒素濃度及び炎症関連タンパク質、炎症誘発性サイトカイン及び抗炎症性サイトカインの発現レベルを通じて調査された。

活性化された大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）では、酸化窒素（ＮＯ）が分泌され、ｂｖＰＬＡ２の処理によってＢＶ－２細胞での神経炎症の緩和程度を確認するために、酸化窒素分析（Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ａｓｓａｙ）を行った結果、図１８のＢのように、酸化窒素濃度は、ＬＰＳ群と比較してｂｖＰＬＡ２処理群で１４．９２±２．１５４％まで有意的に減少すると表われた。

図１８のＣを参照すれば、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ－２及びＩＢＡ－１の発現は、ＬＰＳ群に比べてｂｖＰＬＡ２処理群で濃度依存的に有意に減少すると表われ、図１８のＤを参照すれば、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６のような炎症誘発性サイトカインの発現レベルは、ＬＰＳ群で非常に増加し、ｂｖＰＬＡ２処理群で濃度依存的に減少し、一方、ＩＬ－４及びＴＧＦ－βのような抗炎症性サイトカインの発現レベルは、ＬＰＳ群で非常に減少したが、ｂｖＰＬＡ２処理群で濃度依存的に回復することを確認することができた。

図面に図示されていないが、ｂｖＰＬＡ２がＡβ誘導された神経炎症の抑制効果を有するか否かを確認するために、ウェスタンブロット分析及びｑＲＴ－ＰＣＲを行った結果、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ－２、及びｐ－ＳＴＡＴ３の発現は、Ａβ処理群と比較してｂｖＰＬＡ２処理群で濃度依存的に有意に減少した。炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６）のレベルは、Ａβ処理によって非常に増加し、ｂｖＰＬＡ２処理群で濃度依存的に減少した。これを通じて、ｂｖＰＬＡ２がＢＶ－２細胞でＬＰＳまたはＡβによって誘導された炎症反応に対する抑制効果を有するということを確認することができる。

６）ｂｖＰＬＡ２及びＳＴＡＴ３の結合を通じたＳＴＡＴ３活性化に対する蜂毒抽出物の抑制効果確認
ｂｖＰＬＡ２の抗神経炎症効果に如何なる信号伝達経路が関与するかを調査するために、炎症と関連性が高いＳＴＡＴ３及びマイトジェン活性タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）信号伝達経路と関連した因子のレベルをＴｇ２５７６マウスの脳でウェスタンブロッティングを用いて確認した。

その結果、図１９のＡのように、ｂｖＰＬＡ２投与群でｐ－ＳＴＡＴ３のレベルが有意に減少し、ＭＡＰＫ信号でｐ－ＥＲＫのレベルのみが有意に減少すると表われた。

これを通じて、ｂｖＰＬＡ２は、ＳＴＡＴ３信号伝達経路と密接な関連があると見なされて、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）によって活性化されたＢＶ－２細胞にｂｖＰＬＡ２（０．０１、０．１、１μｇ／ｍＬ）を処理してｐ－ＳＴＡＴ３のレベルを評価した。

図１９のＢを参照すれば、ウェスタンブロット分析で対照群と比較してＬＰＳ処理によってｐ－ＳＴＡＴ３のレベルが非常に増加したが、濃度依存的にｂｖＰＬＡ２処理によって減少すると表われた。特に、ｂｖＰＬＡ２ １μｇ／ｍＬ処理された場合、ｐ－ＳＴＡＴ３のレベルは、対照群と類似したレベルに減少した。

ＳＴＡＴ３プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｏｒ）に対する翻訳活性（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ）でｂｖＰＬＡ２の効果を確認するために、ルシフェラーゼ活性分析を行った。その結果、図１９のＣのように、ＢＶ－２細胞でｂｖＰＬＡ２は、ＳＴＡＴ３ルシフェラーゼ活性を濃度依存的に減少させるということを確認することができた。

ｂｖＰＬＡ２の効果がＳＴＡＴ３に結合するものと関連があるかを決定するために、プルダウン分析及びｂｖＰＬＡ２とＳＴＡＴ３との間のドッキング実験を行った。セファロース４Ｂビーズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ ｂｅａｄｓ）及びｂｖＰＬＡ２－結合セファロース４Ｂビーズ（ｂｖＰＬＡ２－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ ｂｅａｄｓ）でＳＴＡＴ３を過発現するＢＶ－２細胞から全体細胞溶解物をインキュベーションした後、ａｎｔｉ－ＳＴＡＴ３抗体で免疫ブロッティングによって検出した。

その結果、図１９のＤのように、ＳＴＡＴ３タンパク質レベルは、ｂｖＰＬＡ２－結合セファロース４Ｂビーズでさらに高いと表われ、これを通じて、ｂｖＰＬＡ２がＳＴＡＴ３に直接結合することができるということを確認することができる。

７）ＳＴＡＴ３のＬＤ（ｌｉｎｋｅｒ ｄｏｍａｉｎ）に直接結合する蜂毒抽出物
ｂｖＰＬＡ２がＳＴＡＴ３に結合する部位を確認するために、ｂｖＰＬＡ２及びＳＴＡＴ３の間の計算分子ドッキングモデリングを行った。その結果、図２０のＡのように、ｂｖＰＬＡ２がＳＴＡＴ３の多様なアミノ酸、特に、ＳＴＡＴ３のリンカードメイン（ＬＤ）（Ｔｈｒ５００、Ａｓｐ５０２、Ｇｌｎ５０３、Ｇｌｕ５０６、Ｓｅｒ５０９、Ｔｒｐ５１０、Ｓｅｒ５１３、Ｌｙｓ５１７、Ａｒｇ５１８、Ｌｅｕ５２０、及びＩｌｅ５２２で構成されたバインディングポケット内部）に直接結合すると表われた。

ＳＴＡＴ３の如何なるドメインがｂｖＰＬＡ２と相互作用するかを見つけ出すために、ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ、ＤＢＤ）－ｎｕｌｌ及びＬＤ－ｎｕｌｌのような多様な突然変異形態でＳＴＡＴ３を用いてプルダウン分析、ルシフェラーゼ活性分析及びｑＲＴ－ＰＣＲを行った（図２０のＢ）。

ｂｖＰＬＡ２及びＳＴＡＴ３のＬＤの間の相互作用を確認するために、ｂｖＰＬＡ２－結合セファロース４Ｂビーズ（ｂｖＰＬＡ２－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ ｂｅａｄｓ）とｗｉｌｄ ｔｙｐｅ（ＷＴ）－ＳＴＡＴ３、ＤＢＤ－ｎｕｌｌ ＳＴＡＴ３及びＬＤ－ｎｕｌｌ ＳＴＡＴ３で形質注入された細胞溶解物を使用してプルダウン分析を行った。その結果、図２０のＣのように、ｂｖＰＬＡ２－結合セファロース４Ｂビーズは、ＷＴ－ＳＴＡＴ３及びＤＢＤ－ｎｕｌｌ ＳＴＡＴ３をプルダウンさせたが、ＬＤ－ｎｕｌｌ ＳＴＡＴ３は、フルダウンされていない。

図２０のＤを参照すれば、ＳＴＡＴ３のルシフェラーゼ活性は、ＷＴ－ＳＴＡＴ３、ＤＢＤ－ｎｕｌｌ ＳＴＡＴ３、またはＬＤ－ｎｕｌｌ ＳＴＡＴ３で形質注入されたＢＶ－２細胞いずれもでＬＰＳ処理によって有意に増加し、ｂｖＰＬＡ２は、ＬＤ－ｎｕｌｌ ＳＴＡＴ３ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）を除いたＷＴ－ＳＴＡＴ３ベクターまたはＤＢＤ－ｎｕｌｌ ＳＴＡＴ３ベクターのＢＶ－２細胞でＳＴＡＴ３ルシフェラーゼ活性を減少させると表われた。

ＷＴ－ＳＴＡＴ３、ＤＢＤ－ｎｕｌｌ ＳＴＡＴ３またはＬＤ－ｎｕｌｌ ＳＴＡＴ３で形質注入されたＢＶ－２細胞でｂｖＰＬＡ２の抗炎症効果が異なるか否かを確認するために、ｑＲＴ－ＰＣＲを行った。その結果、図２０のＥのように、ＷＴ－ＳＴＡＴ３またはＤＢＤ－ｎｕｌｌ ＳＴＡＴ３で形質注入されたＢＶ－２細胞では、ｂｖＰＬＡ２によってＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６のレベルが減少すると表われたが、ＬＤ－ｎｕｌｌ ＳＴＡＴ３で形質注入されたＢＶ－２細胞では、前記サイトカインのレベルがｂｖＰＬＡ２処理によってほとんど影響を受けないと表われた。これを通じて、ｂｖＰＬＡ２は、ＳＴＡＴ３のＬＤに結合することにより、ＳＴＡＴ３の活性化を抑制することができるということを確認することができる。

８）アミロイド生成及び神経炎症に対する蜂毒抽出物及びＳＴＡＴ３抑制剤のシナジー効果確認
アミロイド生成及び神経炎症でＳＴＡＴ３抑制剤（Ｓｔａｔｔｉｃ）及び蜂毒抽出物の抑制効果をＢＶ－２細胞でテストした。ｉｎ ｖｉｔｒｏでアミロイド生成及び神経炎症に対してｂｖＰＬＡ２及びＳｔａｔｔｉｃの併用効果を決定するために、ＢＶ－２ミクログリア細胞にＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）、Ｓｔａｔｔｉｃ（１μＭ）、またはｂｖＰＬＡ２（１μｇ／ｍＬ）を２４時間処理した。

ＢＶ－２細胞のＡβ_１－４２レベルに対しては、ＥＬＩＳＡによって測定された。図２１のＡを参照すれば、Ａβレベルが、Ｓｔａｔｔｉｃ処理群は２６４．２±４．３８４ｐｇ／ｍｇであり、ｂｖＰＬＡ２処理群では２７３．７±２３．３３ｐｇ／ｍｇであると表われた。このようなレベルは、Ｓｔａｔｔｉｃ及びｂｖＰＬＡ２の併用処理した群で１９９．４±２０．３９ｐｇ／ｍｇのタンパク質で有意に減少した。

図２１のＢを参照すれば、Ａβ生成に直接作用するβ－セクレターゼ活性は、対照群と比較してＬＰＳ処理で非常に増加し、ＳｔａｔｔｉｃまたはｂｖＰＬＡ２の処理で減少し、Ｓｔａｔｔｉｃ及びｂｖＰＬＡ２の併用処理によって有意に減少したと表われた。

そして、図２１のＣのように、ＢＶ－２細胞でＬＰＳ処理によってＡβ及びＢＡＣＥ１の増加した発現レベルは、ｂｖＰＬＡ２処理によって減少したが、併用処理した時、さらに大きく減少するということをウェスタンブロットによって確認することができた。

神経炎症に対するＳｔａｔｔｉｃ及びｂｖＰＬＡ２の併用効果を調査するために、ＢＶ－２細胞で炎症性タンパク質及び炎症誘発性サイトカインのレベルを評価した。その結果、図２１のＤのように、ＬＰＳ処理によって増加したｉＮＯＳ及びＣＯＸ－２のような炎症性タンパク質の細胞内レベルがｂｖＰＬＡ２またはＳｔａｔｔｉｃによって減少し、２つを共に使用した時、さらに多く減少すると表われた。

また、図２１のＥのように、ＬＰＳ処理によって増加したＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６の発現レベルは、ｂｖＰＬＡ２またはＳｔａｔｔｉｃの処理によって減少し、これを共に処理した時、ＳｔａｔｔｉｃまたはｂｖＰＬＡ２を単一処理する時よりもＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６のレベルが有意にさらに減少すると表われた。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者にとって、このような具体的な記述は、単に望ましい実施形態に過ぎず、これにより、本発明の範囲が限定するものではないという点は明白である。すなわち、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲とそれらの等価物とによって定義する。

Claims (7)

1. ＰＬＡ２含量が７５～８５％である蜂毒抽出物を調製する工程を含む、神経炎症疾患の予防または治療用薬学組成物の製造方法。
2. 前記蜂毒抽出物は、
   神経毒性による運動機能低下を改善させることを特徴とする、請求項１に記載の神経炎症疾患の予防または治療用薬学組成物の製造方法。
3. 前記蜂毒抽出物は、
   Ｔｈ１及びＴｈ１７の分極を減少させ、ＴＨ－陽性ドーパミン性神経細胞を増加させて神経保護の効果を有することを特徴とする、請求項１に記載の神経炎症疾患の予防または治療用薬学組成物の製造方法。
4. 前記蜂毒抽出物は、
   β‐アミロイドの蓄積を減少させることを特徴とする、請求項１に記載の神経炎症疾患の予防または治療用薬学組成物の製造方法。
5. 前記組成物は、
   皮下経路に投与することを特徴とする、請求項１に記載の神経炎症疾患の予防または治療用薬学組成物の製造方法。
6. 前記蜂毒抽出物は、
   ３．７５ｍｇ／ｋｇ以上７．５ｍｇ／ｋｇ未満の含量で投与することを特徴とする、請求項５に記載の神経炎症疾患の予防または治療用薬学組成物の製造方法。
7. 前記神経炎症疾患は、
   アルツハイマー病、血管性痴呆、前頭側頭葉痴呆、アルコール性痴呆、パーキンソン、及び脳卒中からなる群から選択することを特徴とする、請求項１に記載の神経炎症疾患の予防または治療用薬学組成物の製造方法。
   

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