KR20200116054A - 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 PLA2(phospholipase A2) 함량이 50 내지 85%인 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 봉독 추출물은 신경 독성에 의한 운동 기능 저하를 개선시키고, 신경보호 및 신경염증 완화 효과를 가짐으로써 신경염증 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 약학 조성물은 피하 투여하거나 STAT3 억제제 또는 NF-κB 억제제와 병용함으로써 신경염증 질환의 예방 또는 치료 효과를 더욱 향상시킬 수 있어, 보다 효과적으로 신경염증 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING NEUROINFLAMMATION DISEASES COMPRISING BEE VENOM EXTRACT}

본 발명은 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

중추신경계(central nervous system, CNS)에서 만성 염증은 대사 합병증(metabolic complications) 및 신경 퇴행성 질환(neurodegenerative diseases)을 포함하는 다양한 병리생리학적 과정과 밀접한 관련이 있다. 활성화된 미세아교세포(microglia)는 만성 염증 환경 하에서 시상하부 및 해마와 같은 부위에서 검출되고, 활성화된 미세아교세포 유래 염증 매개체는 신경 손상을 야기하여 대사 장애 및 신경 퇴행성 질환에 영향을 준다. 이에 따라서, 미세아교세포의 활성 억제는 시상하부 및/또는 해마와 같은 중추신경계에서 비정상적 만성 염증 반응을 보호하기 위한 중요한 전략으로 고려된다.

알츠하이머병(alzheimer's disease, AD)은 치매를 일으키는 가장 흔한 신경 퇴행성 질환으로서, 주요 증상으로는 기억력 감퇴, 언어능력 저하, 시공간파악능력 저하 등이 있다. 알츠하이머병의 발병원인 및 기전은 아직까지 정확하게 밝혀지지는 않았으나, 환자의 뇌에서 노인반점(senile plaque)과 신경섬유 덩어리(neurofibrillary tangle)가 관찰된 바 있고, 상기 신경섬유 덩어리는 베타-아밀로이드(β-amyloid, Aβ)와 APP-C 단백질(anti-amyloid precursor protein)과 같은 독성 단백질에 의한 신경세포 사멸, 시냅스 손실 및 타우(tau) 단백질의 변성 및 과인산화에 의해 형성됨이 밝혀졌다.

알츠하이머병 환자의 뇌에서 발견되는 아밀로이드 플라크(amyloid plaque)의 주요 성분인 베타-아밀로이드(Aβ)는 36 내지 43의 아미노산으로 이루어진 펩타이드로, 아밀로이드 전구 단백질(amyloid precursor protein, APP)로부터 만들어지는 것으로 알려져 있다. 아밀로이드 전구 단백질은 β-와 γ-세크레타제(secretase)에 의해 분해되는데, 상기 분해 효소를 타겟으로 하여 베타-아밀로이드의 농도를 줄이는 연구가 진행되어 왔으나, 베타-아밀로이드의 생성 기전을 타겟으로 하는 치료 물질들은 알츠하이머병에 대한 치료 효과가 미미한 실정이다.

또한, 능동 및 수동 면역 치료법이 동물 실험에서 치료 효과가 밝히진 후 알츠하이머 환자를 대상으로 하는 연구에서 알츠하이머 동물 모델에 항원인 Aβ 42를 이용하여 능동 면역을 유도했을 때 Aβ 플라크가 감소되고 모리스 수중 미로(Morris water maze) 실험에서 기억력 향상을 보였다. 그러나 합성 Aβ 펩타이드인 AN1792/QS-21을 이용하여 알츠하이머 환자를 대상으로 한 임상 2상 시험에서 6%의 환자가 뇌수막염을 보여 임상 시험이 중단되었다. 최근에 시행된 임상 시험에서도 Aβ 플라크가 감소하였으나 진행성 신경세포 퇴화를 개선하지는 못하였다.

파킨슨병(parkinson's disease, PD)은 알츠하이머병과 더불어 노년기에 나타나는 대표적인 신경 퇴행성 질환의 하나로 65세 인구에서 약 1% 정도가 발병하며 나이가 들수록 그 발병률이 증가하는 것으로 알려져 있다. 파킨슨병은 운동성 장애를 나타내는데, 안정시 떨림증(tremor), 경직(rigidity), 운동완서(bradykinesia), 자세의 불안정(postural instability) 등이 대표적인 증상이다. 또한, 파킨슨병은 미세아교세포증(microgliosis), 성상교세포증(astrogliosis), 도파민성 뉴런의 진행적인 퇴화, 도파민성 뉴런에서 루이 소체(Lewy bodies)의 존재, 및 뇌흑질 치밀부(substantia nigra pars compacta)에서 알파-시누클레인(α-synuclein)이 축적되는 특징을 가진다.

파킨슨병의 정확한 원인은 아직까지 명확하게 알려지지 않았으나, 농약 등과 같은 신경독소들에 의한 환경적 요인, 유전적 요인, 미토콘드리아의 기능 장애, 노화 등이 관련되어 있는 것으로 파악되며, 특히, 활성화된 미세아교세포 및 신경염증이 이러한 신경 퇴행성 질환 발병에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다.

현재 파킨슨병의 증상을 경감시키는 약물이 엘-도파(L-dopa) 제제, 도파민 수용체 작용제, 항콜린 약제, 엘데프릴(Eldepryl) 등 다수 존재하나, 이들 약물들 대부분은 원인적인 치료가 아니라 증상을 조절하는 역할을 할 뿐, 병의 진행을 막을 수 있는 약물은 아직까지 보고된 바 없다.

또한, 상기 약물들은 지속적인 복용을 필요로 하기에, 이러한 약물의 만성적인 사용은 심신을 약화시키는 부작용을 초래할 위험성이 크다. 예를 들어, 항콜린 약제들은 자율 신경계 이상이나 정신 기능의 이상 등이 나타날 수 있어 고령의 환자들에게 지속적으로 투여하는 것에 한계가 있다. 엘-도파 제제의 경우, 장기간 동안의 복용에 따라 점차적으로 효과가 떨어지고, 몸이 뒤틀리거나 손, 발이 저절로 움직이는 이상 운동이 생기는 등의 부작용이 발생하게 된다. 기타, 고주파를 이용한 신경자극술 즉, 고주파 파괴술 또는 심부 뇌자극술 등의 수술 치료도 행해지고 있으나, 침습적인 수술을 필요로 하고 많은 비용이 소모되는 문제점이 있다.

따라서 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 등의 질환의 예방 또는 치료를 위해, 보다 효과적인 새로운 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2018-0138555호 (2018.12.31. 공개)

본 발명의 목적은 신경염증 질환을 근본적으로 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 신경염증 질환의 예방 또는 치료를 위해 상기 조성물을 피하 투여하는 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 신경염증 질환을 예방 또는 개선하기 위한 건강기능식품 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 신경염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 PLA2(phospholipase A2) 함량이 50 내지 85%인 봉독 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 신경염증 질환 예방 또는 치료용 피하 투여용 약학 조성물은 PLA2(phospholipase A2) 함량이 50 내지 85%인 봉독 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 신경염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상기 PLA2 함량이 50 내지 85%인 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물 및 STAT3 억제제 또는 NF-κB 억제제에서 선택되는 하나 이상의 억제제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학 조성물을 신경염증 질환 예방 또는 치료를 위해 피하 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 신경염증 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은 PLA2(phospholipase A2) 함량이 50 내지 85%인 봉독 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 신경염증 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은 상기 PLA2 함량이 50 내지 85%인 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품 조성물 및 STAT3 억제제 또는 NF-κB 억제제에서 선택되는 하나 이상의 억제제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물은 50 내지 85%의 PLA2(phospholipase A2)를 함유한 봉독 추출물을 유효성분으로 함유함으로써, 신경 독성에 의한 운동 기능 저하를 개선시키고, Th1 및 Th17의 분극 감소 및 TH-양성 도파민성 신경세포 증가를 통해 신경보호 효과를 가질 수 있으며, 전염증성 사이토카인의 발현을 감소시키고, 조절 T 세포를 활성화하여 신경염증 반응을 조절함으로써 보다 우수한 신경염증 완화 효과를 가질 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 피하 투여하거나 STAT3 억제제 또는 NF-κB 억제제와 병용함으로써 신경염증 질환의 예방 또는 치료 효과를 더욱 향상시킬 수 있어, 보다 효과적으로 신경염증 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1은 PLA2(Phospholipase A2) 함유량에 따른 효능 평가를 위해, 마우스에 MPTP(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridinehydrochloride, 20mg/kg)를 복강 주사한 후, 6일 동안 Sigma PLA2, crude Bee Venom, PLA2 31% 함유 봉독 추출물(PLA2 31%), PLA2 53% 함유 봉독 추출물(PLA2 53%), 및 PLA2 78% 함유 봉독 추출물(PLA2 78%)을 각각 0.5mg/kg 씩 피하 주사하는 동물 실험 스케줄을 나타낸 것이다.
도 2는 폴 테스트(pole test)에 의한 행동 실험을 측정한 그래프로, MPTP가 주사된 마우스가 아래쪽을 향하여 완전히 돌아선 시간(T-turn, 좌) 및 마우스가 바닥까지 도달하는 데 걸리는 총 시간(T-LA, 우) 값에 대해 봉독 추출물 내 PLA2 함유량의 영향을 나타낸다. 오차 막대(error bar)는 평균±SEM을 나타내고, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001로, MPTP 주입 마우스의 흑질(subtantia nigra, SN)과 유의한 차이를 의미한다.
도 3은 MPTP가 주사된 마우스에서 조절 T 세포(Treg)의 분화에 대한 봉독 추출물 내 PLA2 함유량의 영향을 나타낸 것으로, 비장 세포에서 Treg 분화는 CD4, CD25 및 Foxp3을 발현하는 세포를 유세포 분석법으로 측정함으로써 확인하였다. 오차 막대는 평균±SEM을 나타내고, Student’s t-test에 의해 유의성이 결정되었으며, *P < 0.05로 MPTP 주입 마우스와 유의한 차이를 의미한다.
도 4는 MPTP가 주사된 마우스에서 Th1/17 세포의 분화에 대한 봉독 추출물 내 PLA2 함유량의 영향을 나타낸 것으로, 비장 세포에서 Th1/17 세포 분화는 (A) Th1 (CD4+IFN-γ+) 및 (B) Th17 (CD4+IL-17A+)를 발현하는 세포를 유세포 분석법으로 측정함으로써 확인하였다. 오차 막대는 평균±SEM을 나타내고, *P < 0.05, **P < 0.01로, MPTP 주입 마우스와 유의한 차이를 의미한다.
도 5는 PLA2 함유량이 상이한 봉독 추출물을 처리한 군의 흑질(SN) 조직 시료로부터 티로신 하이드록시아제(tyrosine hydroxylase; TH)를 확인하기 위해 면역조직화학염색을 수행한 것으로, 뇌 조직은 도파민성 신경 세포에 대한 손상 분석을 위해 TH로 염색하였으며, SN에서 TH-양성 뉴런의 수는 반 정량적인 척도를 사용하여 정량화하였다. 무작위로 선택된 모든 조직학적 이미지를 스코어링 하였고, 이 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 대표값으로, 평균±SEM으로 나타내었으며, 스케일 바(Scale bars)는 5.0 μm 이다. **P < 0.01, ***P < 0.001로, MPTP 군과 유의한 차이를 의미한다.
도 6은 미세아교세포(microglial cells)에서 LPS로 유도된 아밀로이드 생성 및 신경염증에 대한 봉독 추출물의 효과를 나타낸 것으로, 6A는 bvPLA2(PLA2) 처리에 따른 아밀로이드 전구체 단백질(Amyloid precursor protein, APP), 베타-세크레타제 1(Beta-secretase 1, BACE1), 베타-아밀로이드(β-Amyloid, Aβ)의 웨스턴 블롯 분석 결과, 6B는 bvPLA2 처리에 따른 β-세크레타제 활성 분석 결과 그래프, 6C는 bvPLA2 처리에 따른 iNOS, COX-2 및 IBA-1의 웨스턴 블롯 분석 결과, 6D는 NF-κB 서브 유닛의 웨스턴 블롯 분석 결과 및 6E는 bvPLA2 처리에 따른 전염증성 사이토카인의 qRT-PCR 분석 결과이다.
도 7은 봉독 추출물 및 NF-κB 억제제 (Bay 11-7802)의 병용 효과를 확인한 것으로, 7A는 iNOS, COX-2의 염증성 단백질에서의 효과, 7B는 NF-κB 신호 전달 경로(signaling pathway) 관련 인자에 대한 효과 및 7C는 전염증성 사이토카인에서의 효과를 나타낸다.
도 8은 인비보(in vivo) 실험의 개략적인 절차이다.
도 9는 LPS-유도 마우스의 기억력 개선에 대한 봉독 추출물의 효과에 관한 것으로, 9A 및 9B는 모리스 수중 미로 실험의 결과 그래프, 9C는 프로브 테스트 결과 그래프 및 9D는 수동 회피 실험 결과 그래프를 나타낸다.
도 10은 LPS-유도 마우스의 뇌 조직에서 아밀로이드증 감소에 대한 봉독 추출물의 효과에 관한 것으로, 10A는 bvPLA2 처리에 따른 β-아밀로이드 생성 변화 그래프, 10B는 bvPLA2 처리에 따른 β-세크레타제 활성 분석 결과 그래프 및 10C는 bvPLA2 처리에 따른 APP, BACE1, β-아밀로이드(Aβ)의 웨스턴 블롯 분석 결과이다.
도 11은 LPS-유도 마우스의 뇌의 신경염증에 대한 봉독 추출물의 효과에 관한 것으로, 11A는 GFAP 및 IBA-1의 반응성 세포의 수의 변화를 나타낸 것이고, 11B는 iNOS 및 COX-2의 반응성 세포의 수의 변화를 나타낸 것이다.
도 12는 LPS-유도 마우스의 뇌 조직의 염증 반응 및 전염증성 사이토카인에 대한 봉독 추출물의 효과에 관한 것으로, 12A는 bvPLA2 처리에 따른 iNOS, COX-2, GFAP 및 IBA-1의 웨스턴 블롯 분석 결과, 12B는 bvPLA2 처리에 따른 NF-κB 서브유닛 등의 웨스턴 블롯 분석 결과 및 12C는 bvPLA2 처리에 따른 전염증성 사이토카인의 발현량 변화 그래프이다.
도 13은 LPS-유도 마우스의 뇌 조직의 조절 T 세포(Treg)에 대한 봉독 추출물의 효과에 관한 것으로, 13A 및 13B는 Treg 마커인 Foxp3의 면역조직화학 결과, 13C는 qRT-PCR에 따른 Foxp3 발현량을 나타낸 것이다.
도 14는 봉독 추출물의 투여 경로에 따른 LPS-유도 마우스의 기억력 개선 효과에 관한 것으로, 14A 내지 14D는 투여 경로에 따른 행동 실험의 결과이고, 14E는 투여 경로에 따른 아밀로이드증 변화를 비교한 것이다.
도 15는 Tg2576 마우스에서 유전적으로 유도된 기억 손상에 대한 봉독 추출물의 효과에 관한 것으로, 15A는 bvPLA2 투여에 따른 실험 절차를 개략적으로 나타낸 것이고, 15B 내지 15D는 bvPLA2 처리에 따른 행동 실험 결과를 나타낸 것이다. 각 값은 10마리 마우스의 평균±SEM을 나타내고, *p < 0.05로 대조군과 유의한 차이를 의미한다.
도 16은 β-아밀로이드(Aβ) 축적에 대한 봉독 추출물의 억제 효과 및 Aβ 생성과 관련된 인자에 관한 것으로, 16A는 티오플라빈 S 염색(Thioflavin S staining) 결과, 16B는 APP 및 BACE1의 웨스턴 블롯 결과, 16C 및 16D는 Aβ_1-42 및 Aβ_1-40의 레벨을 ELISA로 평가한 결과 및 16E는 β-세크레타제 활성 분석 결과로, 각 값은 10마리 마우스의 평균±SEM을 나타내고, **p < 0.01로, 대조군과 유의한 차이를 의미한다. 16F는 BV-2 미세아교세포에서의 Aβ_1-42 레벨을 ELISA로 평가한 결과, 16G는 BV-2 세포에서 β-세크레타제 활성 분석 결과로 각 값은 3마리 마우스의 평균±SEM을 나타낸다. 16H는 BV-2 세포에서 APP 및 BACE1의 웨스턴 블롯 결과로, ##p < 0.05, ###p < 0.001로 대조군과 유의한 차이를 의미하고, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001로, LPS군과 유의한 차이를 의미한다.
도 17은 Tg2576 마우스에서 유전적으로 유도된 신경 염증에 대한 봉독 추출물의 억제 효과에 관한 것으로, 17A는 해마에서 GFAP, IBA-1, iNOS 및 COX-2의 면역 염색, 17B는 상기 면역 염색의 양성 세포 수 정량화, 17C는 iNOS, COX-2, GFAP 및 IBA-1의 웨스턴 블로팅 결과이며, 17D는 이의 발현 수준을 qRT-PCR로 평가한 결과이다. 각 값은 10마리 마우스의 평균±SEM을 나타내고, *p < 0.05, **p < 0.01로, 대조군과 유의한 차이를 의미한다.
도 18은 BV-2 세포에서 LPS-유도된 신경 염증에 대한 봉독 추출물의 억제 효과에 관한 것으로, 18A는 세포 생존율 분석 결과, 18B는 산화질소 분석, 18C는 iNOS, COX-2 및 IBA-1의 웨스턴 블롯 결과, 18D는 전염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 qRT-PCR로 평가한 결과이다. 각 값은 3개의 다른 실험의 평균±SEM을 나타낸다. #p < 0.05, ###p < 0.001로, 대조군과 유의한 차이를 의미하고, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001로 LPS군과 유의한 차이를 의미한다.
도 19는 STAT3 활성화에 대한 봉독 추출물의 억제 효과에 관한 것으로, 19A는 STAT3 및 미토겐-활성 단백질 카나아제(mitogen-activated protein kinases, MAPK) 신호 전달 경로와 관련된 인자의 수준을 Tg2576 마우스의 뇌에서 웨스턴 블로팅한 결과로, *p < 0.05, **p < 0.01로 대조군과 유의한 차이를 의미한다. 19B는 BV-2 세포에서의 웨스턴 블로팅 결과, 19C는 루시퍼라제(luciferase) 활성 분석 결과로 각 값은 3개의 다른 실험의 평균±SEM을 나타낸다. 19D는 STAT3의 수준을 웨스턴 블롯 분석한 결과이다.
도 20은 봉독 추출물의 STAT3의 링커 도메인(Linker Domain, LD) 직접 결합에 관한 것으로, 20A는 bvPLA2 및 STAT3의 도킹 모델로 확대된 이미지에서 자주색 부분은 bvPLA2를 의미하고 녹색 부분은 STAT3를 의미한다. 20B는 STAT3 재조합 단백질의 여러 형태의 개략도 도메인 구조이고, 20C는 풀다운 분석 수행 결과, 20D는 LPS-유도된 STAT3 루시퍼라제 활성 분석 결과, 20E는 STAT3의 여러 돌연변이 형태로 형질 감염된 BV-2 세포에서 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β 및 IL-6)의 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR로 평가한 결과이다. 각 값은 3개의 다른 실험의 평균±SEM을 나타낸다. ##p < 0.01, ###p < 0.001로, 대조군과 유의한 차이를 의미하고, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001로 LPS 처리된 wild type 군과 유의한 차이를 의미한다.
도 21은 BV-2 세포에서 봉독 추출물 및 STAT3 억제제의 병용 효과에 관한 것으로, 21A는 BV-2 세포에서 Aβ_1-42의 수준을 ELISA 로 평가한 결과, 21B는 BV-2 세포에서 β-세크레타제의 활성 분석 결과, 21C는 BV-2 세포에서 APP 및 BACE1의 웨스턴 블롯 분석 결과, 21D는 BV-2 세포에서 iNOS 및 COX-2의 웨스턴 블롯 분석 결과, 21E는 bvPLA2 또는 Stattic으로 처리된 BV-2 세포에서 전염증성 사이토카인 (TNF-α, IL-1β 및 IL-6)의 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR에 의해 평가한 것이다. 각 값은 3개의 다른 실험의 평균±SEM을 나타낸다. ###p < 0.001로, 대조군과 유의한 차이를 의미하고, *p < 0.05로 bvPLA2 처리군과 유의한 차이를 의미한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명자는 봉독 원물로부터 정제된 다양한 농도의 PLA2(phospholipase A2)가 함유된 봉독 추출물 중 특정 농도의 PLA2가 함유된 봉독 추출물에서 파킨슨병 및 알츠하이머병 동물 모델의 치료 효능이 향상됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 명세서에서, "예방"이란, 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물의 투여에 의해 신경염증 질환, 또는 상기 질환의 적어도 하나 이상의 증상의 발생을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 재발을 예방하거나 방지하기 위해 상기 질병에 차도가 있는 대상의 치료를 포함한다.

본 명세서에서, "치료"란, 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 신경염증 질환, 또는 상기 질환의 적어도 하나 이상의 증상을 완화, 감소, 또는 소멸시키는 등 그 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서, "개선"이란, 본 발명에 따른 건강기능식품 조성물의 섭취에 의해 신경염증 질환, 또는 상기 질환의 적어도 하나 이상의 증상을 완화, 감소, 또는 소멸시키는 등 그 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서, "약학 조성물"이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물로, 본 발명의 목적상 신경염증 질환, 또는 상기 질환의 적어도 하나 이상의 증상을 예방하거나 또는 치료하기 위해 투여되는 것을 의미한다.

본 명세서에서, "건강기능식품"이란, 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 포함하며, 영양 공급 외에도 본 발명의 목적상 신경염증 질환의 예방, 생체 방어, 면역, 회복 등의 생체 조절 기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료 효과가 높은 식품을 의미한다.

본 명세서에서, "추출물"이란, 추출 방법, 추출 용매, 추출된 성분 또는 추출물의 형태를 불문하고 천연물의 성분을 뽑아냄으로써 얻어진 물질을 의미하는 것으로, 천연물의 성분을 뽑아내어 얻어진 물질을 추출 후 다른 방법으로 가공 또는 처리하여 얻어질 수 있는 물질을 모두 포함할 수 있다.

본 발명은 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 명세서에서, "봉독(bee venom, BV)"이란, 꿀벌(Apis mellifera)의 복부에서 생성되는 산성 및 염기성 분비물의 혼합물로서 무색의 쓴 액체 형태를 띠며, 그 주된 성분은 펩타이드인 멜리틴(melittin), 아파민(apamin) 및 비만세포 탈과립화(mast cell degranulating, MCD) 펩타이드 및 효소인 포스포리파아제 A2(phospholipase A2; PLA2) 등이며, 이외 여러 가지 미량의 성분을 포함하나, 꿀벌로부터 한정되는 것은 아니다.

상기 봉독 추출물은 PLA2(phospholipase A2) 함량이 50 내지 85%인 봉독 추출물일 수 있고, 바람직하게는 PLA2 함량이 70 내지 80%, 보다 바람직하게는 PLA2 함량이 78%인 봉독 추출물일 수 있다.

상기 봉독 추출물은 봉독으로부터 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출하여 제조될 수 있고, 시중에서 이용 가능한 것을 구입하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 봉독 추출물은 신경 독성에 의한 운동 기능 저하를 개선시킬 수 있고, Th1 및 Th17의 분극을 감소시키고 TH-양성 도파민성 신경세포를 증가시켜 신경 보호의 효과를 가질 수 있다. 상기 봉독 추출물은 전염증성 사이토카인의 발현을 감소시키고, 조절 T 세포를 활성화하여 신경염증 반응을 조절함으로써 신경염증 완화 효과를 가질 수 있다. 또한, 상기 봉독 추출물은 베타-세크레타제(β-secretase)의 활성을 감소시킴으로써, 베타-아밀로이드(β-Amyloid, Aβ)의 축적을 억제시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, PLA2 함량이 31%, 53% 또는 78%인 봉독 추출물을 투여한 파킨슨병 동물 모델에서 운동 기능 저하 개선 효과, 신경 보호 효과 등이 나타났고, 특히, PLA2 78%의 봉독 추출물에서 상기 효과가 가장 큰 것으로 확인되었다. 보다 상세한 것은 하기 실시예에서 후술될 것이다.

본 발명은 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 피하 투여용 약학 조성물을 제공한다.

상기 봉독 추출물은 PLA2(phospholipase A2) 함량이 50 내지 85%인 봉독 추출물일 수 있고, 바람직하게는 PLA2 함량이 70 내지 80%, 보다 바람직하게는 PLA2 함량이 78%인 봉독 추출물일 수 있다.

상기 봉독 추출물은 피하 경로로 투여될 수 있고, 3.75 mg/kg 이상 7.5 mg/kg 미만의 함량으로 피하 투여될 수 있다.

본 발명은 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 상기 약학 조성물 및 STAT3 억제제 또는 NF-κB 억제제에서 선택되는 하나 이상의 억제제를 포함하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 약학 조성물은 STAT3 또는 NF-κB의 활성을 억제하는 억제제와 병용함으로써, 상기 봉독 추출물에 따른 신경염증 완화 효과, 아밀로이드 축적 저해 효과 등을 더욱 향상시킬 수 있다.

상기 STAT3 억제제는 Stattic, STA-21, S31-201, S31-M2001, S31-1757, 커큐민-프롤린(Curcumin-proline), 크립토탄시논(Cryptotanshinone), HIC 1, PD153035, TG101209, PP2, Sophoraflavanone G 등에서 선택될 수 있고, 상기 NF-κB 억제제는 Bay 11-7802, PDTC, MG-132, MG-115, MLN-4924, JSH-23, PGE2, LY 294002 등에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 신경염증 질환은 알츠하이머병, 혈관성 치매, 전두측두엽 치매, 알콜성 치매, 파킨슨 및 뇌졸중으로 이루어진 군에서 선택되는 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, "신경염증 질환"이란, 신경교세포에 의해 매개되는 중추신경계에서의 염증 질환들로, 바람직하게는 '뇌신경염증질환'을 의미할 수 있고, 상기 신경염증의 영향으로 발생하는 신경 퇴행성 질환(퇴행성 뇌질환), 염증성 뇌질환, 대사 합병증 등을 모두 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 약학 조성물은 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 적절한 담체와 배합될 수 있고, 필요에 따라, 부형제, 희석제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 결합제, 붕해제, 용제 등을 더 포함하여 제조될 수 있다. 본 명세서에서, "약학적으로 허용가능한"이란, 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 것을 의미한다. 상기 적절한 담체 등은 본 발명에 따른 봉독 추출물의 활성 및 특성을 저해하지 않는 것으로, 투여 형태 및 제형에 따라 달리 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 어떠한 제형으로도 적용될 수 있고, 보다 상세하게는 통상의 방법에 따라 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 비경구형 제형으로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 복강 또는 피하 투여를 위한 주사제 제형으로 제형화할 수 있다.

상기 경구형 제형 중 고형 제형은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 형태로, 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 솔비톨, 만니톨, 셀룰로오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있고, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 포함될 수 있다. 또한, 캡술제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 경구형 제형 중 액상 제형은 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 비경구 제형은 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 이에 제한되지 않고, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제를 모두 사용 가능하다.

또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 치료 효능의 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D₃ 등을 더 첨가할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 본 명세서에서, "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다.

상기 약학 조성물의 유효 용량 수준은 사용 목적, 환자의 연령, 성별, 체중 및 건강 상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 달리 결정될 수 있다. 예를 들어, 일정하지는 않지만 일반적으로 0.001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 신경염증 질환이 발생할 수 있는 임의의 동물에 투여할 수 있고, 상기 동물은 예를 들어, 인간 및 영장류뿐만 아니라 소, 돼지, 말, 개 등의 가축 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여 경로로 투여될 수 있고, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 투여 방법은 특히 한정할 필요 없이, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피부 도포, 호흡기내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracere-broventricular) 주사 등의 통상적인 방법으로 투여될 수 있다.

바람직하게는 피하 경로로 투여될 수 있으며, 이 때, 상기 봉독 추출물은 3.75 mg/kg 이상 7.5 mg/kg 미만의 함량으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 신경염증 질환 예방 또는 치료를 위하여 단독으로 사용될 수 있고, 수술 또는 다른 약물 치료 등과 병용하여 사용될 수 있다.

본 발명은 상기 약학 조성물을 신경염증 질환 예방 또는 치료를 위해 피하 투여하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 봉독 추출물을 복강 경로 또는 피하 경로로 투여한 경우, 피하 경로로 투여하였을 때 파킨슨병 또는 알츠하이머병 등의 신경염증 질환의 치료 효과가 더 높은 것을 확인할 수 있었다. 보다 상세한 것은 하기 실시예에서 후술될 것이다.

본 발명은 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

상기 봉독 추출물은 PLA2(phospholipase A2) 함량이 50 내지 85%인 봉독 추출물일 수 있고, 바람직하게는 PLA2 함량이 70 내지 80%, 보다 바람직하게는 PLA2 함량이 78%인 봉독 추출물일 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물 및 STAT3 억제제 또는 NF-κB 억제제에서 선택되는 하나 이상의 억제제를 포함하는 신경염증 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 건강기능식품은 신경염증 질환의 예방 또는 개선 목적으로, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 상기 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 상기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가될 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 건강기능식품은 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 음료 및 각종 드링크, 과실 및 그의 가공식품(과일통조림, 잼 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(햄, 베이컨 등), 빵류 및 면류, 쿠키 및 스낵류, 유제품(버터, 치즈 등) 등이 가능하며, 통상적인 의미에서의 기능성 식품을 모두 포함할 수 있다. 또한 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 식품학적으로 허용 가능한 식품 첨가제(식품 첨가물) 및 적절한 기타 보조 성분을 더 포함하여 제조될 수 있다. 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정할 수 있다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.

상기 기타 보조 성분은 예를 들어, 향미제, 천연 탄수화물, 감미제, 비타민, 전해질, 착색제, 펙트산, 알긴산, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 특히, 상기 천연 탄수화물로는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 사용할 수 있으며, 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 봉독 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 상기 봉독 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 상기 봉독 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 상기 봉독 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 상기 봉독 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품에 함유된 상기 봉독 추출물의 유효 용량은 신경염증 질환 예방 또는 개선 등 그 사용 목적에 따라 적절하게 조절될 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물은 식품을 원료로 하여 일반 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 신경염증 질환 예방 또는 개선을 위한 보조제로 섭취될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 봉독(Bee Venom) 추출물 내 PLA2(Phospholipase A2) 함유량에 따른 농도별 설치류 단회투여 독성평가

1. 독성평가 방법 : [C57BL/6N WT + PLA2]

- 동물 모델 : wild type, 7주령, 수컷 C57BL/6N 마우스 (대한바이오링크에서 구입)

- 약물 종류 : PLA2 함유량이 100%인 봉독 추출물 (100% PLA2), PLA2 함유량이 80%인 봉독 추출물 (80% PLA2), PLA2 함유량이 50%인 봉독 추출물 (50% PLA2), PLA2 함유량이 30%인 봉독 추출물 (30% PLA2)

- 투여 경로 : 피하 주사(Subcutaneous injection, SC)

- 투여 용량 : 15mg/kg, 7.5mg/kg, 3.75mg/kg 1회/1일

- 관찰 기간 및 내용 : 투약 후 3일 간 매일 사망 유무 관찰

- 그룹 : 하기 각 그룹 당 5마리 씩 총 65마리

a. Control (saline, WT) h. 50% PLA2 (15mg/kg)

b. 100% PLA2 (15mg/kg) i. 50% PLA2 (7.5mg/kg)

c. 100% PLA2 (7.5mg/kg) j. 50% PLA2 (3.75mg/kg)

d. 100% PLA2 (3.75mg/kg) k. 30% PLA2 (15mg/kg)

e. 80% PLA2 (15mg/kg) l. 30% PLA2 (7.5mg/kg)

f. 80% PLA2 (7.5mg/kg) m. 30% PLA2 (3.75mg/kg)

g. 80% PLA2 (3.75mg/kg)

2. 평가 결과

하기 표 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 독성평가의 결과이다.

PLA2 contents (% in bee venom extract)	농도	Mouse 생존률(n/5)
100%	15 mg/kg	0/5
	7.5 mg/kg	0/5
	3.75 mg/kg	1/5
80%	15 mg/kg	0/5
	7.5 mg/kg	1/5
	3.75 mg/kg	5/5
50%	15 mg/kg	0/5
	7.5 mg/kg	5/5
	3.75 mg/kg	5/5
30%	15 mg/kg	1/5
	7.5 mg/kg	5/5
	3.75 mg/kg	5/5
1×PBS (0 mg/kg)		5/5

표 1을 참조하면, PLA2 30% 함유 봉독 추출물과 PLA2 50% 함유 봉독 추출물의 개략의 치사량(Approximate lethal dose: ALD)은 15mg/kg, PLA2 80% 함유 봉독 추출물의 개략의 치사량은 7.5mg/kg, PLA2 100% 함유 봉독 추출물의 개략의 치사량은 3.75mg/kg 정도임을 확인할 수 있다.

<실시예 2> 파킨슨병(Parkinson’s disease, PD) 동물 모델에서 봉독 추출물 내 PLA2 성분의 함유량에 따른 치료 효과 평가

본 실시예는 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘 하이드로클로라이드(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine hydrochloride, MPTP)로 유도된 파킨슨병 동물 모델에서 봉독 추출물 내 PLA2 성분의 함유량에 따른 효능을 평가하기 위해 수행되었다.

1. 시험물질

1) 시험물질

- 명칭 : crude Bee Venom (사양꿀벌 봉독 추출물) / PLA2 31% 함유 봉독 추출물 (PLA2 31%) / PLA2 53% 함유 봉독 추출물 (PLA2 53%) / PLA2 78% 함유 봉독 추출물 (PLA2 78%)

- 외관 : 흰색 분말 (White powder)

- 입수량 : 15mg / 11.1mg / 10.3mg / 19.9mg

- 보관조건 : 냉동 (-20℃)

- 공급원 : 이니스트에스티㈜

2) 대조물질

- 명칭 : Bee Venom Phospholipase A2 (Sigma PLA2, Sigma code #: P9279)

- 외관 : 동결 건조 분말 (Lyophilized powder)

- 입수량 : 1mg

- 보관조건 : 냉동 (-20℃)

- 공급원 : 시그마 (Sigma, St. Louis, MO, USA)

3) 야기용 물질

- 명칭 : MPTP (1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine hydrochloride)

- 외관 : 흰색 분말

- 입수량 : 100mg

- 보관조건 : 실온

- 공급원: 시그마 (Sigma, St. Louis, MO, USA)

2. 재료 및 방법

1) 시험계

실험을 수행하는데 있어 마우스는 크기가 작고 다루기가 쉬워서 동물 실험에 용이하고, 마우스를 사용하여도 충분한 조직 결과와 실험 결과를 얻을 수 있기에, 대한바이오링크 (충청북도 음성군 삼성면 덕호로 277)로부터 공급받은 7주령 수컷 C57BL/6J 마우스를 시험에 이용하였다. 이 계통의 마우스는 종양학, 면역학, 독성학 연구에 널리 사용되고 있다.

- 입수일: 2018년 03월 02일

- 입수 시 성별, 동물 수 및 체중 범위: 수컷 43마리, 20-25g

- 투여 개시 시 체중 범위: 20-25g

- 사용 동물 수: 수컷 43마리

2) 사육 환경

(1) 환경 조건 및 사육 방법

SPF(Specific Pathogen Free) 환경에서 사육되었으며, 22±1℃의 온도, 상대습도 55±15%, 환기 횟수 10-20회/hr, 조명시간 12시간(오전 7시 점등-오후 7시 소등) 및 조도 150-300 Lux로 조절하였다. 모든 실험은 경희대학교 동물실험윤리위원회의 승인 (KHUASP(SE)-17-149) 에 따라 진행되었다.

(2) 사료 및 물

사료는 실험동물용 고형사료를 오리엔트 바이오로부터 공급받아 자유롭게 섭취하게 하며, 물은 상하수도를 미세여과기로 소독한 후, 물병을 이용하여 자유롭게 섭취하도록 하였다.

3) 시험군의 구성 및 투여량 설정

(1) 시험군 구성

- 대조군 (control 군)

- MPTP 군 (no treat 군)

- Sigma PLA2 군 (0.5mg/kg)

- crude Bee Venom 군 (0.5mg/kg)

- PLA2 31% 군 (PLA2 31% 함유 봉독 추출물, 0.5mg/kg)

- PLA2 53% 군 (PLA2 53% 함유 봉독 추출물, 0.5mg/kg)

- PLA2 78% 군 (PLA2 78% 함유 봉독 추출물, 0.5mg/kg)

(2) 투여량 설정

MPTP 군은 20mg/kg씩 하루에 2시간 간격으로 4번 복강 내(intraperitoneal, IP) 경로로 4번 주사하였다.

Sigma PLA2 군, crude Bee Venom 군, PLA2 31% 군, PLA2 53% 군 및 PLA2 78% 군은 0.5mg/kg씩 6일 동안 하루에 한 번 피하(subcutaneous, SC) 경로로 주사하였다.

(3) 군 분리

동물의 군 분리는 다음과 같이 실시하였다. 동물들은 MPTP 주사 후 다음 날 오전에 행동 실험(Pole test) 교육을 하고, 그 결과를 가지고 각 군에 최대한 균등하게 분포되도록 무작위법으로 분배하여 시험군의 구성 표에 지정된 수가 되도록 하였다.

(4) 식별

개체 식별은 유성 팬으로 꼬리에 표시하여 구분하였다. 사육 상자에는 시험번호, 시험책임자명, 시험담당자명, 비상연락처 등을 기재한 개체 식별 카드를 부착하였다.

(5) 투여 시험물질의 조제

MPTP 100mg을 1×free base saline buffer에 녹여 2.5mg/mL의 농도로 조제하였다. 상기 농도 값은 투여 농도 20mg/kg을 마우스 한 마리 당 복강 내 투여(IP)로 200μL 주사할 때를 계산한 결과 값이다.

Sigma PLA2, crude Bee Venom, PLA2 31% 함유 봉독 추출물(PLA2 31%), PLA2 53% 함유 봉독 추출물(PLA2 53%) 및 PLA2 78% 함유 봉독 추출물(PLA2 78%)도 1×free base saline buffer에 녹여 1mg/mL의 농도로 조제한 후, 투여 농도 0.5mg/kg로 희석하여 실험동물에게 피하(SC) 경로로 투여하였다.

4) 시험 방법

(1) 동물 실험

MPTP로 파킨슨병을 유도하는 경우, 마우스는 MPTP-HCl(20mg/kg free base in saline)을 2시간 간격으로 4번 복강 내 투여하였다. 마지막 MPTP 주사 후 12시간 뒤에, MPTP를 맞은 마우스에 Sigma PLA2, crude Bee Venom, PLA2 31%, PLA2 53% 및 PLA2 78% (각 0.5mg/kg)를 피하 경로로 6일 간 주사하였다 (도 1). 일부 마우스에는 대조군으로서 비히클(vehicle)만을 주사하였다. MPTP 주사 후 마우스의 치사율은 각 군에서 약 0-30% 미만이었다. 각 군 간에는 큰 차이가 없었다.

(2) 폴 테스트(pole test)에 의한 행동 실험 측정

거즈가 감겨있는 나무 기둥(길이 50cm, 직경 0.8cm)의 맨 꼭대기에 마우스가 위쪽을 향하게 놓고 (마우스는 기둥의 바닥까지 내려갈 수 있다), 마우스가 아래쪽을 향하여 완전히 돌아선 시간 (T-turn)과 마우스가 바닥까지 도달하는데 걸리는 총 시간 (locomotion activity time, T-LA)을 기록하였으며, 제한 시간은 30초로 정하였다. 각 마우스 당 5번 검사하였고, 가장 잘 나온 세 개의 측정값의 평균을 계산하였다. 마우스가 바닥으로 점프하거나 미끄러지는 경우는 제외하였다.

(3) Th1, Th17 및 Treg 개체수의 유세포 분석

도움 T 세포의 서브셋(T-helper cell subsets)의 유세포 분석을 fluorescein isothiocyanate(FITC)-conjugated anti-mouse CD4, phycoerythrin(PE)-conjugated anti-mouse CD25, Alexa Fluor 647 anti-mouse/rat Foxp3, PE-conjugated anti-mouse IFN-γ 및 PerCP-Cyanine5.5-conjugated anti-mouse/rat IL-17A 항체를 사용하여 수행하였다.

조절 T 세포(Treg)를 염색하기 위해 2×10⁶cells/mL 농도의 비장 세포를 채취하고, PBS 완충액으로 2번 세척한 후 염색 완충액(staining buffer)에 희석한 FITC-conjugated anti-CD4와 PE-labeled anti-CD25 항체로 4℃의 어둠 속에서 30분 동안 염색하였다. 이어서 세포를 PBS로 2회 세척하고 고정/투과 완충액(fixation/permeabilization buffer)에 4℃의 어둠 속에서 1시간 동안 고정시켰다. 연속해서, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 4℃의 어둠 속에서 밤새 Alexa Fluor 647 anti-Foxp3 항체로 염색하였다. 세척 후, 세포를 1% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 고정시키고 4℃의 어둠 속에 보관한 후 검출을 수행하였다.

세포 내 사이토카인(cytokine) 염색을 위해, 2×10⁶cells/mL 농도의 비장 세포를 50ng/mL의 포볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate, PMA)와 1,000ng/mL의 이오노마이신(ionomycin)으로 1시간 동안 자극시킨 다음, GolgiStop을 넣고 4시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 수집하고, PBS로 2회 세척한 후 염색 완충액에 희석한 FITC-labeled anti-CD4 항체로 4℃의 어둠 속에서 30분 동안 염색하였다. PBS로 세척한 후, 세포를 I.C 고정 완충액에 실온의 어둠 속에서 30분 동안 고정시켰다. PBS로 세척한 후, 세포를 4℃의 어둠 속에서 밤새 PE-conjugated anti-IFN-γ와 PerCP-Cyanine5.5-conjugated anti-IL-17A 항체로 염색하였다. PBS로 세척한 후, 세포를 1% 파라포름알데히드에 고정시키고 4℃의 어둠 속에 보관하고 그 후에 검출을 수행하였다. 샘플을 FACS Calibur 유세포 계측기로 분석한 후 Flowjo 소프트웨어를 사용하여 그래픽 및 표 형식으로 데이터를 생성하였다.

(4) 조직 처리 및 면역조직화학염색(Immunohistochemistry, IHC)

마우스를 이소플루란(isoflurane, Forane 용액; 중외 제약, 서울)으로 마취시키고 심장 끝에 PBS를 주입하여 관류(perfusion)한 다음, 0.1M 인산 완충액(phosphate buffer)에 용해시킨 4% 파라포름알데히드를 관류하여 고정시켰다.

고정시킨 마우스의 뇌를 해부하고, 4℃에서 이틀 동안 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 후, 30% 수크로오스(sucrose) 용액으로 옮겨 뇌가 가라앉을 때까지 4℃에 보관하였다. 조직을 OCT 화합물로 고정시키고 조직 절편기(sliding microtome)를 사용하여 저온 유지 장치에서 30μm 두께의 관상 절편으로 연속적으로 잘라내었다. 연속되는 6개의 모든 조직을 모아서 면역조직화학염색을 실시하였다.

1차 항체로 티로신 하이드록시아제(tyrosine hydroxylase, TH; 1:1000)를 붙였다. PBS로 세척한 후, 조직을 바이오티닐화된 2차 항체를 붙이고 아비딘-비오틴 복합 키트(avidin-biotin complex kit, Vectastain ABC 키트)로 처리하였다. 이어서 반응 물질로서 0.1M 인산 완충액에 용해되어 있는 0.05% 디아미노벤지딘-HCl(diaminobenzidine-HCl, DAB)과 0.003% 하이드로젠 퍼옥사이드(hydrogen peroxide)로 조직을 발색시켰다. 이어서, 발색된 조직을 슬라이드 글라스(slide glass)와 커버 글라스(cover glass)로 마운팅(mounting)하고 광학 현미경으로 분석하였다.

(5) 입체적 세포 수 세기

뇌의 흑질(subtantia nigra, SN) 부분에서 TH 양성 도파민성 뉴런의 총 수에 대한 객관적인 입체적 평가는 Olympus CAST (computer-assisted stereotype toolbox) 시스템 버전 2.1.4에서 광학 분별기 방법을 사용하여 수행되었다.

세포 수를 세기 위해 조직의 치밀부(pars compacta)의 머리끝에서부터 그물부(pars reticulate)의 꼬리 끝까지 (전후, bregma로부터 -2.06mm ~ -4.16mm) SN 부위 전체가 포함되었다. 실제 계산은 100× 배율 (Oil objective)을 사용하여 수행되었다. 총 세포 수는 광학 분별기(optical fractionator) 방정식에 따라 계산되었다. 각 표본의 모든 조직에 대해 300 포인트 이상 분석하였다.

(6) 통계학적 분석

모든 실험 결과에 대한 유의성 차이 분석은 Graphpad Prism software (Version 5, CA, USA) 에서 평균값을 분산 분석한 후, 다중 비교를 할 땐, one-way Anova, Newman-Kelus test에 따라 P-value가 0.05보다 작을 때 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다고 판단하였다. 단일 비교를 할 땐, two-tailed Student's t-test 에 따라 P-value가 0.05보다 작을 때 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다고 판단하였다. 모든 실험은 맹검법으로 수행되었으며 동일한 조건 하에서 독립적으로 반복되었다.

3. 결과

1) MPTP로 유발된 신경 독성(neurotoxicity)에서 운동 기능에 대한 봉독 추출물 내 PLA2의 함유량에 따른 효과 확인

MPTP로 유발된 신경 독성에서 봉독 추출물 내 PLA2의 함유량에 따른 효과를 평가하기 위해, 마우스에 MPTP를 투여하고 마지막 MPTP 주사 후 12시간 후부터 6일 동안 하루에 한번 Sigma PLA2, crude Bee Venom, PLA2 31% (PLA2 31% 함유 봉독 추출물), PLA2 53% (PLA2 53% 함유 봉독 추출물), PLA2 78% (PLA2 78% 함유 봉독 추출물) 또는 생리 식염수를 피하 경로로 투여하였다.

로코모터(locomotor) 활동, 행동 평가(rotarod test), 앞발적응보행검사 (forepaw adjusting step), 폴 테스트(pole test) 등을 포함한 다양한 행동 테스트들이 파킨슨병(PD) 마우스 모델들에 일반적으로 사용되고 있어, 본 실시예에서는 PD 관련 운동 장애에 대한 봉독 추출물의 신경 보호 효과를 MPTP 유발 마우스 모델의 폴 테스트에 의해 평가하였다.

그 결과, 도 2와 같이, MPTP만을 투여한 군은 다른 대조군과 비교하였을 때 T-turn과 T-LA의 시간이 상당히 연장되었으나, PLA2 31%, PLA2 53%, PLA2 78% 투여군은 sigma PLA2를 투여한 군만큼 T-turn과 T-LA의 시간이 상당히 단축되어 개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 특히, PLA2 78%를 투여한 군이 가장 효과가 큰 것으로 나타났다. 반면, MPTP 군과 crude Bee Venom 군 간의 T-turn과 T-LA 시간에는 큰 차이가 없는 것으로 나타났다.

2) MPTP로 유도된 PD 마우스에서 Treg 세포 수에 대한 봉독 추출물 내 PLA2의 함유량에 따른 영향 확인

이전 연구에서, PD 환자들은 대조군에 비해 Treg 세포의 비율이 감소하였고, PD 환자로부터 작용 T (effector T) 세포 기능을 억제하는 능력의 저하가 관찰되었다. 이에, Treg 세포의 비율에 대한 bvPLA2 성분의 함유량에 따른 영향을 유세포 분석(flow cytometric analysis)으로 평가하였다.

그 결과, 도 3과 같이, 대조군과 MPTP 군 간에 CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg 세포의 수는 유의한 차이는 발견되지 않았다. 그러나 대조군에 비해 Sigma PLA2와 PLA2 78%를 투여한 군에서는 Treg 세포의 수가 70% 이상 증가한 것을 확인할 수 있었고, PLA2 31%와 PLA2 53%를 투여한 군에서도 Treg 세포의 수가 약간 증가한 것으로 나타났다. 반면, crude Bee Venom을 투여한 군에서는 Treg 세포의 수에 유의한 차이가 유발되지 않았다.

3) MPTP로 유도된 PD 마우스에서 Th1 및 Th17 세포 수에 대한 봉독 추출물 내 PLA2의 함유량에 따른 효과 확인

이어서, T-helper 세포 표현형에 대한 봉독 추출물 내 PLA2의 함유량에 따른 효과를 확인하였다. IFN-γ 및 IL-17A로 표현한 것은 Th1 그리고 Th17 세포의 대체로 한 것이며, 유세포 분석으로 이 세포들의 분포를 확인하였다.

그 결과, 도 4와 같이, Th1의 수는 증가하였고, MPTP 군에서 Th1/Th2 균형이 Th1 쪽으로 이동되어, Th1 유형의 반응이 향상되었음을 확인할 수 있다. Th17 세포 또한 MPTP 군에서 증가함을 확인할 수 있었다. 반면, MPTP 군에 비해 Sigma PLA2와 PLA2 78%를 투여한 군에서 분극화된 Th1과 Th17 세포의 IFN-γ와 IL-17A 발현이 감소하는 것으로 나타났다.

4) 봉독 추출물 내 PLA2의 함유량이 MPTP 신경 독성에 대한 SN의 도파민성 신경세포에 미치는 영향 확인

도파민성 신경세포에 대한 봉독 추출물 내 PLA2의 함유량에 따른 보호 효과를 평가하기 위해, TH(tyrosine hydroxylase)-양성 신경세포의 수를 측정하였다.

그 결과, 도 5과 같이, MPTP 군은 대조군에 비해 TH-양성 신경세포의 수가 3배 정도 감소한 것으로 나타났다. MPTP와 봉독 추출물을 처리 후 TH-면역 염색된 선조체에서 살아남은 도파민성 신경세포를 분석한 결과, Sigma PLA2와 PLA2 78%를 피하 경로로 투여한 군에서는 SN 안의 살아남은 TH-양성 신경세포의 수가 증가한 것을 확인할 수 있었고, PLA2 31%와 PLA2 53%를 투여한 군에서도 TH-양성 신경세포의 수가 중간 정도 증가한 것을 확인할 수 있었다. 반면, crude Bee Venom을 투여한 군에서는 SN 안의 도파민성 신경세포가 현저하게 감소한 것으로 나타났다.

4. 결론

본 실시예에서는 파킨슨병(PD) 동물 모델에서 봉독 추출물 내 PLA2의 함유량에 따른 최대의 효능을 조사하였다. 이전 연구결과에서, PD 병적 측면의 일시적인 진행을 예방하기 위한 봉독 추출물 투여의 최선의 경로가 피하(Subcutaneous, SC) 라는 사실을 확인하였고, 봉독 추출물을 피하 경로로 주사했을 때 MPTP에 의해 유도된 PD 마우스 모델에서 신경염증 반응을 조절함으로써 도파민성 신경세포가 보호되었다.

PD의 병적 측면을 개선하기 위해 봉독 추출물 내 PLA2 성분의 최적 함유량을 확인한 본 실시예에 따르면, PLA2 성분이 78% 함유된 약물로 치료하였을 때, MPTP 독성 모델에서 sigma PLA2와 비슷한 수준의 향상된 운동 기능, Th1 및 Th17 분극 감소, TH-양성 도파민성 신경세포 증가를 포함하는 최상의 신경 보호 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

따라서 MPTP로 유도된 PD 마우스 모델에서 신경 손상을 예방하기 위한 최적의 PLA2 성분 함유량인 PLA2 78% 함유 봉독 추출물(PLA2 78%)이 함유된 약물은 봉독 추출물 내 PLA2 함유량이 31% 또는 53% 인 약물보다 가장 효과가 좋은 것으로 보여지며, PLA2 78% 약물의 피하 투여 경로는 PD 환자의 치료에 잠재적인 응용이 가능할 것이라고 판단된다.

<실시예 3> 알츠하이머병(Alzheimer's Disease, AD) 동물 모델에서 봉독 추출물 내 PLA2 성분의 함유량에 따른 치료 효과 평가

1. 실험 방법

1) 재료

bvPLA2 (PLA2 75~85% 함유 봉독 추출물)는 이니스트에스티(INISTst Co., LTD, Gyeonggi-do, Republic of Korea)로부터 공급받았고, 인산 완충 식염수(phosphate-buffered saline, PBS; 최종 농도 1mg/mL)에 용해시킨 후, 사용할 때까지 -20℃에서 보관되었다.

LPS는 Sigma (serotype 0111:B4; Sigma, St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였고 LPS (최종 농도 1mg/mL)를 PBS에 용해시킨 후, 이의 분취량은 사용할 때까지 -20℃에서 보관되었다.

Aβ_1-42는 Tocris Bioscience (rat; Bristol, United Kingdom)로부터 구입하였고, Aβ_1-42 (최종 농도 200μM)를 0.1% 암모니아에 용해시킨 후, -70℃에서 보관되었다.

2) 수중 미로 실험 (Water maze test)

수중 미로 실험은 기억력 실험에 일반적으로 사용되는 방법에 따라 수행되었다. 미로 실험은 SMART-CS (Panlab, Barcelona, Spain) 프로그램 및 장비에 의해 수행되었다. 원형 플라스틱 풀 (높이: 35cm, 지름: 100cm)은 22-25℃로 유지된 스킴 밀크(skim milk)로 불투명하게 제조된 물로 채웠다. 탈출 플랫폼 (높이: 14.5cm, 지름: 4.5cm)은 수면 아래 1-1.5cm에 잠겨있다. 시험 테스트는 단일 플랫폼 두 개의 회전 시작 위치에서 수행되었다. 시험 테스트 후에, 마우스는 120초 동안 플랫폼에서 머무른 후 그들의 케이지로 보내졌다. 각 마우스의 탈출 지연 시간(escape latency) 및 탈출 거리(escape distance)는 SMART-LD program (Panlab, Barcelona, Spain)에 연결된 풀의 중앙 위 카메라로 모니터링 되었다.

3) 프로브 테스트 (Probe test)

기억 유지 능력을 테스트하기 위해, 수중 미로 실험 24시간 후 프로브 테스트가 수행되었다. 수중 미로 실험에서 사용된 풀에서 플랫폼을 제거하고, 마우스가 자유롭게 수영하도록 하였다. SMART-LD program (Panlab, Barcelona, Spain)을 이용하여 60초 동안 각 마우스의 수영 패턴을 모니터링하고 기록하였다. 보유한 공간 기억력은 타겟 사분면(target quadrant) 영역에서 소요된 시간에 의해 계산되었다.

4) 수동 회피 실험 (Passive avoidance performance test)

수동 회피 실험은 일반적으로 기억력 테스트를 위한 간단한 실험으로 알려져 있다. 수동 회피 반응은 8mm 간격의 3.175mm 스테인리스 스틸 막대의 격자 바닥이 있는 작은 게이트를 통해 서로 인접한 밝은 구획(illuminated compartment) 및 어두운 구획(dark compartment)(각각 20.3×15.9×21.3cm)으로 나눠진“step-through”장치 (Med Associates Inc., Vermont, USA)를 이용하여 결정되었다.

첫째 날, 마우스는 훈련 시험을 위해 어두운 구획으로부터 멀리 떨어진 밝은 구획에 두었다. 마우스가 어두운 구획으로 완전히 이동하면, 전기 충격(0.45mA, 3s duration)이 발생되었다. 그 후, 마우스는 그들의 케이지로 되돌려 보내졌다. 훈련 시험 1일 후, 마우스를 밝은 구획에 두고 “retention”으로 정의된 어두운 구획으로 들어가는 머무름 시간을 측정하였다. 마우스가 어두운 구획으로 들어간 시간을 기록하고 단계별 머무름 시간을 통해 설명하였다. 기억력 시험은 3분의 마감 시간제한을 설정하였다.

5) 뇌 조직의 수집 및 보존

행동 실험 후, 마우스는 CO₂ 흡입을 통한 마취하에, 헤파린이 포함된 PBS를 관류시켰다. 뇌에서 두개골(skull)을 즉시 제거한 후, 해마(hippocampus) 영역만을 분리하여 생화학 분석 때까지 -80℃에서 보관하였다.

6) 티오플라빈 S 염색 (Thioflavin S staining)

30% 수크로오스 용액으로 옮겨진 후, 뇌는 동결조직절편기(cryostat microtome, Leica CM 1850; Leica Microsystems, Seoul, Korea)를 이용하여 20μm 절편으로 절단되었다. 증류수로 5분 동안 세척한 뒤, 뇌 절편은 젤라틴-코팅된 슬라이드로 옮겨 1% 티오플라빈 S (Sigma, St Louis, MO, USA)가 포함된 50% 에탄올에 8분 동안 두었다. 이어서, 뇌 절편을 증류수로 세척한 다음, 50, 70, 90 및 100%의 에탄올 각 등급에서 2분 동안 탈수시켰다. 그 후 절편은 마운팅 매체 (mounting medium, Fluoromount™ Aqueous Mounting Medium; Sigma, St. Louis, MO, USA)로 마운팅되었다. 티오플라빈 S 염색은 형광 현미경 (Axio Observer A1; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) (×50 및 ×200)을 이용하여 확인하였다.

7) β-세크레타제(β-secretase) 활성 분석

마우스 뇌에서의 β-세크레타제 활성은 상업적으로 이용 가능한 β-세크레타제 활성 분석 키트 (Abcam, Inc., Cambridge, MA, USA)를 사용하여 결정하였다. 가용화된 막을 β-세크라타제 추출 완충액을 사용하여 뇌 조직으로부터 추출하였고, 아이스에서 1시간 동안 인큐베이션 하였으며, 4℃에서 10분간 5000×g로 원심분리하여 상등액을 수집하였다.

총 50μL의 시료 (총 단백질 100μg) 또는 공 시료(blank)(β-세크레타제 추출 완충액 50μL)를 각 웰 (96-well plate)에 첨가한 다음, 50μL의 2×반응 완충액(reaction buffer) 및 2μL의 β-세크레타제 기질을 37℃의 암실에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 형광 분광계 (Gemini EM; Molecular Devices, CA, USA)를 사용하여 각각 335 및 495nm의 여기 및 방출 파장에서 형광을 판독하였다.

8) β-아밀로이드(Aβ)의 측정

뇌 조직의 용해물은 프로테아제 억제제가 포함된 단백질 추출 완충액을 통해 수득되었다. Aβ_1-42 및 Aβ_1-40 레벨은 각각 특이적 마우스 β-아밀로이드 펩타이드 1-42 효소-연결된 면역 흡착 분석(ELISA) 키트 (CSB-E10787m; CUSABIO, Houston, USA) 및 마우스 β-아밀로이드 펩타이드 1-40 ELISA 키트 (CSB-E08300m; CUSABIO, Houston, USA)를 사용하여 결정되었다.

단백질은 단백질 추출 완충액 (PRO-PREP; Intron Biotechnology, Kyungki-do, Korea)을 이용하여 뇌 조직으로부터 추출되었고, 아이스(ice)에서 1시간 동안 인큐베이션 되었으며, 4℃에서 15분 동안 13,000×g로 원심분리되었다. 간략하게, 100μL의 시료는 예비 코팅된 플레이트에 첨가되어 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션 되었다. 결합되지 않은 물질을 제거한 후, Aβ에 특이적인 비오틴-접합(biotin-conjugated) 항체를 웰에 첨가하였다. 세척 후에, 아비딘-접합(avidin-conjugated) 홀스레디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)가 웰에 첨가되었다. 결합되지 않은 아비딘-효소 시약을 제거하기 위해 세척한 후, 기질 용액을 웰에 첨가하고 초기 단계에서 결합된 Aβ의 양에 비례하여 발색시켰다. 발색을 멈추고 색의 강도를 측정하였다.

9) 면역조직화학염색 (Immunohistochemical staining)

30% 수크로오스 용액으로 옮겨진 후, 뇌는 동결조직절편기(cryostat microtome, Leica CM 1850; Leica Microsystems, Seoul, Korea)를 이용하여 20μm 절편으로 절단되었다. 각각 10분 동안 PBS (pH 7.4)에서 두 번 세척된 후, 시료는 항원 회복(antigen retrieval) 및 내인성 퍼옥시다제(endogenous peroxidase)의 차단을 위해, 3% 하이드로젠 퍼옥사이드(hydrogen peroxide) 및 1% 트리톤-X(Triton-X)가 함유된 PBS로 30분 동안 인큐베이션 되었고, 추가적으로 각각 10분씩 두 번 PBS로 세척되었다.

뇌 절편은 1시간 동안 3% 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA) 용액에서 블락되고, 신경교 섬유질 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP; 1:300; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA), 유도성 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase. iNOS; 1:300; Abcam, Inc., Cambridge, MA, USA), 이온화된 칼슘 결합 어댑터 분자 1(ionized calcium binding adaptor molecule 1, IBA-1; 1:300; Abcam, Inc., Cambridge, MA, USA) 및 사이클로옥시게나제 2(cyclooxygenase 2, COX-2; 1:300, Novus Biologicals, Inc., CO, USA)로 4℃에서 밤새 인큐베이션 되었다.

1차 항체로 인큐베이션한 후, 뇌 절편은 각각 10분씩 PBS로 세 차례 세척되었다. 세척 후, 뇌 절편은 biotinylated goat anti-rabbit, goat anti-mouse, 또는 donkey anti-goat IgG-horseradish peroxidase (HRP) 2차 항체 (1:500; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA)로 1-2시간 동안 실온에서 인큐베이션 되었다. 뇌 절편은 각각 10분씩 PBS로 세 차례 세척되었고, 최대 10분 동안 크로모겐 디아미노벤지딘(chromogen diaminobenzidine, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) 반응에 의해 시각화되었다.

최종적으로, 뇌 절편은 에탄올에서 탈수되고, 자일렌(xylene)에서 제거되며, Permount (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA)로 마운팅되어 광학 현미경 (Microscope Axio Imager. A2; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany; ×50 및 ×200)으로 평가되었다.

10) 웨스턴 블롯 분석 (Western blot analysis)

타겟 단백질을 검출하기 위해, iNOS, IBA-1, GFAP, APP 및 BACE1 (1:1000; Abcam, Inc., Cambridge, UK), COX-2 (1:1000; Novus Biologicals, Inc., CO, USA), c-준 N-말단 인산화효소(c-Jun N-terminal kinase, JNK), 세포외 신호-조절 인산화효소(extracellular signal-regulated kinase, ERK) 1/2, p-p38 및 p38 (1:000; Cell signaling Technology, Inc., MA, USA), p-STAT3, STAT3, p-ERK1/2, p-JNK, 및 β-actin (1:200; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA)에 대한 특이적 항체를 사용하였다.

블롯은 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입한 anti-mouse, anti-rabbit 및 anti-goat와 같은 대응되는 컨쥬게이트된 2차 항체와 함께 인큐베이션 되었다. 면역반응성 단백질은 강화된 화학발광 웨스턴 블로팅 검출 시스템(enhanced chemiluminescence Western blotting detection system)으로 검출되었다.

11) 사이토카인(cytokines) 레벨 측정

전염증성(pro-inflammatory) 및 항염증성(anti-inflammatory) 사이토카인 레벨은 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)으로 측정되었다. 총 RNA는 해마 조직으로부터 RiboEX (Geneall biotechnology, Seoul, Korea)를 사용하여 추출하였고, cDNA는 고-용량 cDNA 역전사 키트 (High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit; Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 합성하였다.

qRT-PCR은 커스텀 설계된 프라이머를 위한 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에서 수행되었고, β-actin은 HiPi Real-Time PCR SYBR green master mix (ELPIS biotech, Daejeon, Korea)를 이용하여 하우스-키핑 컨트롤(house-keeping control)로 사용되었다.

94℃에서 3분의 초기 변성 단계, 94℃에서 30초의 변성 단계, 60℃에서 30초의 어닐링(annealing) 단계 및 72℃에서 1분의 연장 단계로 구성된 사이클링 조건은 40 사이클로 이어졌다. 타겟 유전자 발현에 대해 수득된 값은 β-actin으로 표준화하고 대조군 시료에서 발현에 대해 정량화하였다.

각 시료는 하기 표 2의 프라이머로 수행되었다.

factor	forward/reverse	primer
β-actin	forward	5′- GGCTGTATTCCCCTCCATCG - 3′
	reverse	5′- CCAGTTGGTAACAATGCCATGT - 3′
TNF-α	forward	5′- TCTTCTCATTCCTGCTTGTGG - 3′
	reverse	5′- CACTTGGTGGTTTGCTACGA - 3'
IL-1β	forward	5′- CCTTCCAGGATGAGGACATGA - 3'
	reverse	5′- TGAGTCACAGAGGATGGGCTC - 3′
IL-6	forward	5′- GAGGATACCACTCCCAACAGACC - 3′
	reverse	5′- AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA - 3′
IL-10	forward	5′- TCTGAGCCACTCACATCTGC - 3′
	reverse	5′- TCAGGGGAACTGCTAGTGCT - 3′
IL-4	forward	5′- GGTCTCAACCCCCAGCTAGT - 3′
	reverse	5′- GCCGATGATCTCTCTCAAGTGAT - 3′
TGF-β	forward	5′- CTCCCGTGGCTTCTAGTGC - 3′
	reverse	5′- GCCTTAGTTTGGACAGGATCTG - 3′

12) BV-2 미세아교세포(microglial cells) 배양

미세아교세포 BV-2를 배양하여 LPS (1μg/mL) 또는 Aβ_1-42 (2.5μM) 및 PBS에 용해된 bvPLA2의 다양한 농도 (0.01, 0.1, 1μg/mL)를 동시에 처리하였다. 세포는 24시간 후에 수득하여 세포 생존율(Cell viability), 산화질소(Nitric Oxide) 농도 및 전염증성 사이토카인의 레벨을 측정하였다.

13) 세포 생존율(Cell viability) 분석

BV-2 세포는 96 웰 플레이트에 플레이팅된 후, 24시간 동안 bvPLA2 (0-1μg/mL)로 처리되었다. 처리 후, MTT 용액[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide] (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)에 의해 세포 생존율이 측정되었다. 세포 배지의 1/10 용량의 MTT 용액을 각 웰에 첨가하고, 혼합물을 CO₂ 인큐베이터에서 2시간 동안 인큐베이션한 후 제거하였다. 세포로부터 상기 혼합물을 제거한 후, 배지의 동일 용량만큼 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)를 첨가하였다. 이어서, 마이크로 플레이트 흡광도 리더기로 570nm의 파장에서 각 웰의 흡광도를 판독하였다.

14) 산화질소(Nitric oxide) 분석

BV-2 세포는 96-웰 플레이트에서 성장된 후, 24시간 동안 다양한 농도의 bvPLA2 (0.01, 0.1, 1μg/mL)의 부재 또는 존재에서 LPS (1μg/mL)와 함께 또는 없이 배양되었다. 산화질소 검출 키트(NO detection kit, Intron Biotechnology, Kyungki-do, Korea)에 의해 상등액의 아질산염(nitrite) 농도가 분석되었다. 520nm의 흡광도는 마이크로 플레이트 흡광도 리더기에 의해 측정되었고, 일련의 공지된 농도의 아질산나트륨이 표준으로 사용되었다.

15) 풀다운 분석 (Pull-down assay)

bvPLA2를 에폭시-활성화된 세파로오스 4B(Epoxy-activated Sepharose 4B; GE Healthcare Korea, Seoul, Korea)로 접합시켰다.

간단히 설명하면, bvPLA2 1mg를 커플링 완충액(coupling buffer; 0.1M NaHCO₃ 및 0.5M NaCl, pH 11.0)의 1mL에 용해시켰다. 에폭시-활성화된 세파로오스 4B 비즈(beads) 0.1g을 팽윤시키고 소결된 유리 필터에서 1mM HCl로 세척한 다음, 커플링 완충액으로 세척하였다. 에폭시-활성화된 세파로오스 4B 비즈를 bvPLA2 함유된 커플링 완충액에 첨가하여 4℃에서 밤새 회전시켰다. 대조군 비접합 세파로오스 4B 비즈는 bvPLA2 없이 상기와 같이 제조되었다.

세척 후, 비점유 결합 부위를 블로킹 완충액(blocking buffer; 0.1M Tris-HCl, pH 8.0)로 실온에서 3시간 동안 블락시켰다. bvPLA2-접합 세파로오스 4B는 3주기의 교체 pH 세척 완충액(buffer 1: 0.1M acetate 및 0.5M NaCl, pH 4.0; buffer 2: 0.1M Tris-HCl 및 0.5M NaCl, pH 8.0)으로 세척되었다. 이후, bvPLA2-접합 비즈는 결합 완충액(binding buffer; 0.05M Tris-HCl 및 0.15M NaCl, pH 7.5)으로 평형화되었다.

bvPLA2 및 STAT3의 결합을 입증하기 위해, STAT3 단백질을 STAT3 DNA로 형질주입을 통해 과발현시켰다. BV-2 세포는 제조사의 프로토콜에 따라 Opti-MEM에서 Lipofectamine® 3000 (Invitrogen, Waltham, MA, USA)을 이용하여 STAT3 DNA (700 ng/per well of a six well plate)로 형질주입되었다. BV-2 세포 용해물 (1mg of protein)은 bvPLA2-접합 세파로오스 4B 또는 비접합 세파로오스 4B와 혼합되어 4℃에서 밤새 배양되었다. 이 후 비즈는 TBST로 세 차례 세척되었다.

결합 단백질은 소듐 도데실설페이트(sodium dodecylsulfate, SDS) 로딩 완충액으로 용리되고, SDS/폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 이용하여 분리한 다음, STAT3에 대한 항체 (1:200, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)로 면역 블로팅하였다.

16) 루시퍼라제(Luciferase) 분석

BV-2 세포는 12 웰 플레이트(8×10⁴ cells/well)에 플레이팅되고, 24시간 동안, 제조사의 사양 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 따라 Opti-MEM에서 Lipofectamine 3000을 사용하여 STAT3-Luc (Stratagene, La Jolla, CA, USA) 플라스미드로 일시적으로 형질주입되었다. 형질주입된 세포는 24시간 동안, 1μg/mL의 LPS 및 0.01, 0.1 및 1μg/mL의 bvPLA2로 처리되었다. 루시퍼라제 활성은 제조사의 사양 (WinGlow, Bad Wildbad, Germany)에 따라, Dual-Luciferase® Reporter Assay System kit (Promega, Madison, WI, USA) 및 발광측정기(luminomete)를 이용하여 측정되었다.

17) 도킹 실험(Docking experiment)

STAT3를 이용한 bvPLA2의 도킹 연구는 Autodock VINA (Trott and Olson, 2010)를 사용하여 수행되었다. STAT3 [PDB: 3CWG] 및 bvPLA2 [PDB: 1POC]의 3차원 구조는 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank)로부터 검색되었으며, Autodock-Tools를 이용하여 추가로 준비되었다. 그리드 박스(grid box)는 STAT3 모노머(monomer)를 중심으로 하고, 그리드 박스의 크기는 전체 모노머를 포함하도록 조정되었다. 도킹 실험은 16, 24, 32, 40, 및 60의 다양한 디폴트 소진 값(default exhaustiveness values)에서 수행되었다. 최상의 바인딩 모델에 대한 분자 그래픽은 Discovery Studio Visualizer 2.0.을 사용하여 생성되었다.

18) 통계 분석

데이터는 GraphPad Prism software (Version 4.03; GraphPad software, Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 분석하였다. 데이터는 평균±SEM으로 나타내었다. 모든 데이터의 차이는 one-way analysis of variance (ANOVA)로 평가되었다. student’s t-test에서 P 값이 통계적 유의성을 나타내었을 때, 그 차이는 Dunnett’s test에 의해 평가되었다. p < 0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

2. in vitro 에서의 봉독 추출물의 효과

1) 신경염증(neuroinflammation) 및 아밀로이드 생성(amyloidogenesis)에서의 bvPLA2 효과 확인

bvPLA2의 처리로 인한 미세아교세포(BV-2 cells)에서의 아밀로이드 전구체 단백질(Amyloid precursor protein, APP), 베타-세크레타제 1(Beta-secretase 1, BACE1), 베타-아밀로이드(β-Amyloid, Aβ)의 발현 수준 변화를 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 그 결과, 도 6A와 같이, LPS 처리로 인해 세포 내 APP, BACE1, β-Amyloid(Aβ)의 수준이 증가하였고, bvPLA2 처리 시 농도 의존적으로 그 수준이 감소하는 것으로 나타났다.

활성화된 β-세크레타제로 인하여 β-아밀로이드가 생성되기 때문에, β-세크레타제 활성 분석(β-secretase activity assay)을 진행하였다. 그 결과, 도 6B와 같이, LPS로 인해 증가한 β-세크레타제 활성이 bvPLA2 처리 시 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났다.

iNOS, COX-2와 같은 염증성 단백질(inflammatory protein)과 활성화된 미세아교세포의 마커인 IBA-1의 수준을 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 그 결과, 도 6C와 같이, LPS 처리 시 iNOS, COX-2 및 IBA-1의 발현 수준이 증가하였고, bvPLA2 처리 시 농도 의존적으로 iNOS, COX-2 및 IBA-1의 발현 수준이 감소하는 것으로 나타났다.

bvPLA2가 NF-κB의 전좌(translocation) 억제에 영향을 주는지 확인하기 위하여, BV-2 세포의 핵에서의 NF-κB 서브 유닛의 수준을 웨스턴 블롯으로 측정하였다. 그 결과, 도 6D와 같이, p65, p50 모두 LPS 처리 시 핵에서의 발현 수준이 증가하였으나, bvPLA2 처리 시 농도 의존적으로 그 발현 수준이 감소하는 것으로 나타났다.

또한, bvPLA2가 염증 반응을 촉진하는 전염증성 사이토카인 감소에 영향을 주는지 확인하기 위하여, qRT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 도 6E와 같이, 전염증성 사이토카인 중 신경세포에 많이 분포하고 있는 TNF-α, IL-1β, IL-6의 레벨이 LPS 처리로 인해 급격하게 증가하였고, bvPLA2 처리 시 농도 의존적으로 TNF-α, IL-1β, IL-6의 레벨이 모두 감소하는 것으로 나타났다.

이를 통해, bvPLA2는 β-세크레타제 활성 저하와 APP, BACE1의 세포 내 레벨을 낮춰 미세아교세포 내의 β-아밀로이드 축적 저해 효과를 가짐을 확인할 수 있고, iNOS, COX-2의 세포 내 레벨을 감소시키고 전염증성 사이토카인의 발현 수준을 감소시켜 신경염증 완화 효과 또한 가짐을 확인할 수 있다.

2) 봉독 추출물의 신경염증에서의 병용(combination) 효과 확인

봉독 추출물과 NF-κB 억제제의 신경염증에서의 병용 효과를 확인하기 위하여, BV-2 세포에 LPS (1μg/mL), bvPLA2 (100ng/mL)를 처리하여 웨스턴 블롯과 qRT-PCR을 수행하였다.

먼저, 웨스턴 블롯으로 신경염증과 관련이 있는 iNOS, COX-2의 레벨을 측정한 결과, 도 7A와 같이, bvPLA2와 NF-κB 억제제인 Bay 11-7802를 개별적으로 처리하였을 경우에 iNOS와 COX-2 모두 감소하였으며, bvPLA2와 NF-κB 억제제 Bay 11-7802를 함께 세포에 처리하였을 경우에는 iNOS와 COX-2의 레벨이 더 많이 감소하는 것으로 나타났다.

NF-κB 신호 전달 경로(signaling pathway)와 관련된 p-IκBα의 세포 내 레벨과 세포핵 내에서의 p65, p50의 레벨을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과, 도 7B와 같이, bvPLA2와 NF-κB 억제제(Bay 11-7802)를 개별적으로 세포에 처리하였을 때 모두 LPS 처리로 인한 p-IκBα, p65, p50의 증가가 완화되었으며, bvPLA2, NF-κB 억제제(Bay 11-7802)를 함께 처리하였을 때, p-IκBα, p65, p50의 레벨이 더욱 감소하는 것으로 나타났다.

BV-2 세포에서 LPS 처리로 인한 전염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 증가에 bvPLA2와 NF-κB 억제제가 어떠한 영향을 끼치는지 조사하기 위하여 qRT-PCR로 세포 내 발현량을 측정하였다. 그 결과, 도 7C와 같이, bvPLA2, NF-κB 억제제(Bay 11-7802)를 개별적으로 처리하였을 때, LPS로 인해 증가한 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현량이 감소한 것을 확인할 수 있으며, 이 둘을 함께 처리하였을 때는 전염증성 사이토카인의 발현량이 개별적으로 처리한 것보다 더욱 감소하여 대조군의 수준까지 감소한 것으로 나타났다.

따라서 미세아교세포(BV-2 cells)에서 bvPLA2의 신경염증 완화 효과는 NF-κB 억제제(Bay 11-7802)와 함께하였을 때, 더욱 큰 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.

3. 알츠하이머 동물 모델에서 봉독 추출물의 효과 - LPS 유도 신경염증 마우스

1) 봉독 추출물의 기억력 완화 효과 확인

본 실시예에서의 알츠하이머 동물 모델은 LPS를 주사하여 신경성 염증을 유도한 마우스로, 기억력 감퇴나 β-아밀로이드 축적 등이 알츠하이머 환자와 비슷한 양상을 보인다.

bvPLA2가 알츠하이머 치료에 효과가 있을지 조사하기 위해 일주일 동안 LPS를 250μg/kg의 용량으로 복강 내 주사(Intraperitoneal injection)하여 알츠하이머를 유도하였고, 동시에 일주일에 3번 bvPLA2를 복강 내 주사로 투여하였다 (도 8). 각각의 주사는 동시에 투여하지 않고 2시간 이상의 일정한 시간 간격을 두고 투여하였으며, LPS와 bvPLA2의 투여와 함께 알츠하이머의 대표적 증상인 기억력 감퇴 정도를 측정하기 위해 유도 및 투여 동안 행동 실험을 진행하였다.

학습능력과 공간기억능력을 평가하는 데에 많이 사용되는 행동 실험인 모리스 수중 미로 실험(Morris water maze)을 6일 동안 하루에 2번씩 진행하였다. 그 결과, 도 9A 및 도 9B와 같이, 6일 차에 대조군은 평균 24.64초에 352.61cm를 움직여서 플랫폼(platform)을 찾았지만, LPS 군은 평균 37초에 502.79cm를 움직여서 플랫폼을 찾는 것으로 나타났다. 반면에, bvPLA2를 2mg/kg을 투여한 군에서는 평균 26.14초에 229.97cm를 움직여서 플랫폼을 찾는 것으로 나타났다.

즉, LPS 군이 대조군보다 플랫폼을 찾는데 더 오랜 시간이 걸리고 움직인 거리가 먼 것으로 보아 학습능력과 공간기억능력이 저하되었다고 볼 수 있다. 반면에, bvPLA2 투여군은 농도 의존적으로 플랫폼을 찾는 데에 걸린 시간(escape latency)과 거리(escape distance)가 감소하는 것으로 보아 bvPLA2의 투여가 LPS 처리로 인한 마우스의 학습능력과 공간기억능력의 저하를 완화시키는 것을 확인할 수 있다.

모리스 수중 미로가 끝난 다음 날에 기억유지 능력을 평가하기 위하여 프로브 테스트(probe test)를 진행하였다. 그 결과, 도 9C와 같이, 대조군은 60초 동안 타겟에 평균 24.83% 머물렀으나, LPS 군은 같은 시간 동안 타겟에 평균 17.79%로, 머무름 시간이 감소하였다. 반면에, bvPLA2 0.02, 0.2 및 2mg/kg을 투여한 군에서는 각각 평균 23.44%, 25.33% 및 27.29%로, 머무름 시간이 LPS 군보다 증가한 것으로 나타났다.

마지막 행동 실험으로 얼마나 오래 기억하고 있는지를 시험하기 위해 수동 회피 실험(passive avoidance test)을 진행하였다. 그 결과, 도 9D와 같이, 모든 군에서 훈련 시험(training trial)에서는 밝은 구획에서 어두운 구획으로 이동하는 데에 걸리는 시간의 차이가 나지 않았지만, 다음 날 시험할 때에는 대조군이 평균 69.63초 동안 머물렀고, LPS 군은 평균 18.45초 머물렀다. 반면에, bvPLA2 0.2와 2mg/kg을 투여한 군에서 각각 평균 46.92와 67.59초로 밝은 구획에서 머무르는 시간이 LPS 군보다 많이 증가한 것으로 나타났다.

따라서 상기의 알츠하이머 동물 모델에서의 행동 실험 결과들로 미루어 볼 때, bvPLA2는 알츠하이머의 대표적 증상인 학습능력, 공간기억능력, 기억유지능력 및 기억력의 저하를 완화시키는 것을 확인할 수 있다.

2) 봉독 추출물의 아밀로이드증(amyloidosis) 감소 효과 확인

봉독 추출물이 아밀로이드증(amyloidosis)에 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 마우스의 뇌 조직에서의 β-아밀로이드(Aβ) 생성을 ELISA로 측정하였다. 그 결과, 도 10A와 같이, LPS 군에서 대조군보다 β-아밀로이드가 평균적으로 약 1.6배 더 축적되었고, bvPLA2 투여군은 농도 의존적으로 β-아밀로이드의 축적이 감소하는 것으로 나타났다.

β-아밀로이드(Aβ)는 아밀로이드 전구체 단백질(APP)을 분해하는 β-세크레타제(β-secretase)로 인해 생성되기 때문에, β-세크레타제의 활성을 측정하는 베타-세크레타제 활성 분석(β-secretase activity assay)을 진행하였다. 그 결과, 도 10B와 같이, LPS 군에서 대조군보다 β-세크레타제의 활성이 증가하였으며, bvPLA2 처리로 인해 농도 의존적으로 β-세크레타제의 활성이 감소하는 것으로 나타났다.

또한, 마우스의 뇌 조직에서 bvPLA2의 처리로 인한 APP, BACE1, β-아밀로이드(Aβ)의 레벨 변화를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과, 도 10C와 같이, LPS 군에서는 APP, BACE1, Aβ 레벨이 급격히 증가하였으나, bvPLA2 투여군에서는 농도 의존적으로 그 레벨이 감소하는 것으로 나타났다.

이를 통해, bvPLA2가 β-아밀로이드 축적에 영향을 주는 β-세크레타제의 활성을 감소시킴으로써, APP, BACE1, Aβ의 레벨을 감소시켜 알츠하이머 증상을 완화시키는 것을 확인할 수 있다.

3) 봉독 추출물의 신경염증 완화 효과 확인

LPS로 알츠하이머를 유도한 마우스의 뇌 조직에서 신경염증의 변화에 봉독 추출물이 어떠한 영향을 끼치는지를 확인하기 위해, 염증성 단백질의 발현 정도와 성상교세포(astrocytes)와 미세아교세포(microglial cells)의 활성을 면역조직화학의 방법으로 확인하였다.

그 결과, 도 11A와 같이, LPS 군에서 대조군보다 GFAP-반응성 세포(GFAP-reactive cell) 및 IBA-1-반응성 세포(IBA-1-reactive cell)의 수가 증가하는 것으로 나타났고, 이는 성상교세포와 미세아교세포가 활성화(activation) 되어 신경 퇴행성 질병을 진행하게 한다고 볼 수 있다. 반면에, bvPLA2를 투여한 군에서는 GFAP-반응성 세포와 IBA-1-반응성 세포의 수가 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타나, bvPLA2가 알츠하이머와 같은 신경 퇴행성 질병의 발병을 저해시킴을 확인할 수 있다.

또한, 도 11B와 같이, LPS 군에서 대조군보다 iNOS-반응성 세포 및 COX-2-반응성 세포의 수가 증가하는 것으로 나타나, 이에 LPS로 인하여 뇌 조직에 염증이 생겼음을 알 수 있다. 반면에, bvPLA2를 처리한 마우스의 뇌 조직에서 iNOS-반응성 세포와 COX-2-반응성 세포가 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타나, bvPLA2가 신경염증 반응의 완화에 도움을 주는 것을 확인할 수 있다.

4) 신경염증 변화에 대한 봉독 추출물의 영향 확인

LPS로 알츠하이머를 유도한 마우스의 뇌 조직에서 신경염증의 변화에 봉독 추출물이 어떠한 영향을 끼치는지를 알아보기 위해, 염증성 단백질의 발현 정도와 성상교세포 및 미세아교세포의 활성을 웨스턴 블롯으로 확인하였다.

그 결과, 도 12A와 같이, LPS 군에서 대조군보다 iNOS와 COX-2의 발현량이 많이 증가하는 것으로 나타나, LPS로 인하여 뇌 조직에 염증이 생겼음을 확인할 수 있다. 반면, bvPLA2를 처리한 마우스의 뇌 조직에서 iNOS와 COX-2의 발현량이 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타나, bvPLA2가 신경염증 반응의 완화에 도움을 주는 것을 확인할 수 있다.

또한, LPS 군에서 대조군보다 GFAP(성상교세포 활성화 마커)와 IBA-1(미세아교세포 활성화 마커)의 발현이 증가하였으며, 이를 통해 성상교세포와 미세아교세포의 활성화로 인해 신경 퇴행성 질병이 진행되는 것으로 판단할 수 있다. 반면, bvPLA2를 투여한 군에서는 GFAP와 IBA-1의 발현이 감소하는 것으로 나타나, bvPLA2가 알츠하이머와 같은 신경 퇴행성 질병의 발병을 저해시키는 것으로 판단할 수 있다.

bvPLA2가 마우스의 뇌 조직에서 NF-κB의 전좌(translocation) 억제에 영향을 주는지 확인하기 위해, 해마(hippocampus) 부분의 핵(nuclear)에서의 NF-κB 서브유닛(subunit)인 p50 및 p65의 레벨과 세포질(cytosol)에서의 p-IκBα의 레벨을 웨스턴 블롯으로 측정하였다.

그 결과, 도 12B와 같이, p65 및 p50 모두 LPS 군에서 핵에서의 레벨이 증가하였으며, bvPLA2 투여 시 농도 의존적으로 그 레벨이 감소하는 것으로 나타났다. 또한, p-IκBα의 경우에도 LPS 군에서 그 레벨이 증가하였으며, bvPLA2 투여 시 농도 의존적으로 그 레벨이 감소하는 것으로 나타났다.

마우스의 뇌 조직에서 염증 반응을 촉진하는 전염증성 사이토카인의 발현량 감소에 bvPLA2가 영향을 끼치는지 조사하기 위하여, TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현량을 ELISA를 통해 측정하여 비교하였다.

그 결과, 도 12C와 같이, TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현량이 LPS 군에서 대조군보다 급격하게 증가하는 것으로 나타났으며, bvPLA2 처리 시 농도 의존적으로 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 레벨이 모두 상당히 감소하는 것으로 나타났다.

이러한 결과들을 종합해 볼 때, bvPLA2의 투여가 LPS로 유도된 알츠하이머 마우스 모델에서의 신경염증 완화에 도움을 주는 것으로 판단할 수 있다.

5) Treg (regulatory T cell)에 대한 봉독 추출물의 효과 확인

LPS로 알츠하이머를 유도한 마우스의 뇌 조직에서 염증 반응을 억제하는 조절 T 세포(regulatory T cell)에 봉독 추출물이 어떠한 영향을 끼치는지를 알아보기 위해, Treg의 마커인 Foxp3의 정도를 면역조직화학, qRT-PCR 및 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 13A 및 도 13B와 같이, LPS 군에서 대조군보다 Foxp3-반응성 세포의 수가 감소한 것으로 나타나, LPS로 인한 염증이 생겼음을 확인할 수 있다. 또한, bvPLA2를 처리한 마우스의 뇌 조직에서 Foxp3-반응성 세포의 수가 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타나, bvPLA2가 Treg를 활성화하여 신경염증의 완화에 도움을 주는 것으로 확인할 수 있다.

마우스의 뇌 조직에서 Foxp3 발현량에 bvPLA2가 영향을 끼치는지 조사하기 위하여 qRT-PCR을 진행한 결과, 도 13C와 같이, Foxp3 발현량이 LPS 군에서 대조군보다 감소하였으며, bvPLA2 처리 시 농도 의존적으로 Foxp3 발현량이 대조군 수준으로 다시 회복하는 것으로 나타났다.

마우스의 뇌 조직에서 Foxp3 레벨의 변화가 있는지를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯을 진행한 결과, 도 13D와 같이, Foxp3 발현량이 bvPLA2 처리 시 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났다.

이를 통해, bvPLA2가 조절 T 세포를 활성화하여 알츠하이머로 인한 신경염증 증세의 완화시키는 것으로 판단할 수 있다.

6) 봉독 추출물의 투여 경로에 따른 기억력 완화 및 β-아밀로이드(Aβ) 축적 저해 효과의 비교

봉독 추출물의 투여 경로에 따른 기억력 완화 및 β-아밀로이드 축적 저해 효과를 비교하기 위하여, 일주일 동안 LPS를 250μg/kg의 용량으로 매일 복강 주사하여 알츠하이머를 유도하였고, 동시에 일주일에 3번 bvPLA2를 0.2mg/kg의 용량으로 복강 주사 또는 피하 주사의 방법으로 투여하였다 (도 8). 각각의 주사는 동시에 투여하지 않고 2시간 이상의 일정한 시간 간격을 두고 투여하였으며, LPS와 bvPLA2의 투여와 함께 알츠하이머의 대표적 증상인 기억력 감퇴 정도를 측정하기 위해 유도 및 투여 동안 행동 실험을 진행하였다.

학습능력과 공간기억능력을 평가하는 데에 많이 사용되는 행동 실험인 모리스 수중 미로를 6일 동안 하루에 2번씩 진행한 결과, 도 14A 및 도 14B와 같이, 6일 차에 대조군은 평균 24.64초에 352.61cm를 움직여서 플랫폼을 찾았으나, LPS 군은 평균 37초에 502.79cm를 움직여서 플랫폼을 찾았다. 반면에, bvPLA2를 0.2mg/kg을 복강 주사로 투여한 군에서는 평균 28.94초에 404.9cm, 피하 주사로 투여한 군에서는 평균 22.08초에 319.6cm를 움직여서 플랫폼을 찾는 것으로 나타났다.

따라서 피하 주사(0.2mg/kg)로 bvPLA2를 투여하였을 때, 마우스의 학습능력과 공간기억능력의 저하 완화 효과가 복강 주사로 투여하였을 때보다 큰 것으로 확인할 수 있다.

모리스 수중 미로가 끝난 다음 날에 기억 유지 능력을 평가하기 위하여 프로브 테스트를 진행한 결과, 도 14C와 같이, 대조군은 60초 동안 타겟에 평균 24.83% 머물렀으나, LPS 군은 같은 시간 동안 타겟에 평균 17.79%로 머무름 시간이 감소하였다. 반면에, bvPLA2 0.2mg/kg을 복강 주사로 투여한 군에서는 평균 25.33%, 피하 주사로 투여한 군에서는 26.22%로, 피하 주사로 투여한 군에서 복강 주사로 투여한 군에 비해 머무름 시간이 증가한 것을 확인할 수 있었다.

마지막 행동 실험으로 얼마나 오래 기억하고 있는지를 시험하기 위해 수동 회피 실험을 진행한 결과, 도 14D와 같이, 모든 군에서 training trial에서는 밝은 구획에서 어두운 구획으로 이동하는 데에 걸리는 시간의 차이가 나지 않았지만, 다음 날 시험할 때에는 대조군이 평균 69.63초 동안 머물렀고, LPS 군은 평균 18.45초 머물렀다. 반면에, bvPLA2 0.2mg/kg을 복강 주사로 투여한 군에서 평균 46.92초, 피하 주사로 투여한 군에서는 평균 38.03초로, 복강 주사로 투여한 군에서 밝은 구획에 머무르는 시간이 더 긴 것으로 확인되었다.

따라서 상기의 알츠하이머 동물 모델에서의 행동 실험 결과들을 미루어 볼 때, bvPLA2는 피하 주사로 투여하였을 때, 동일 용량의 복강 주사 투여 방법보다 알츠하이머의 대표적 증상인 학습능력, 공간기억능력, 기억유지능력 및 기억력의 저하 완화 효과가 더 큰 것을 확인할 수 있다.

또한, bvPLA2의 투여 방법의 차이가 아밀로이드증(Amyloidosis)에서 효과의 차이를 나타내는지 보기 위하여, 마우스의 뇌 조직에서의 β-아밀로이드 생성을 ELISA로 측정하였다. 그 결과, 도 14E와 같이, 대조군보다 LPS 군에서 β-아밀로이드의 수준이 크게 증가하였으며, bvPLA2 처리 시 감소한 것을 확인할 수 있었다.

특히, 복강 주사로 투여한 군보다 피하 주사로 투여한 군의 β-아밀로이드 수준이 더 낮은 것으로 나타났으며, 피하 주사로 bvPLA2를 투여하였을 때 대조군과 비슷한 수준으로 감소한 것을 확인할 수 있었다.

4. 알츠하이머병 동물 모델에서의 봉독 추출물의 효과 - Tg2576 마우스

1) 실험 동물 선정 및 처리

본 실시예에 사용된 알츠하이머 동물 모델은 알츠하이머 마우스 모델로 널리 사용되는 치매유발 형질전환 Tg2576 마우스(swAPP; 조기 발현형 가족성 알츠하이머병(early-onset familial Alzheimer’s Disease)을 가진 스웨덴 가족에서 발견된 이중 돌연변이(K670N/M671L)를 포함한 마우스)이며, 이는 연령에 의존적인 β-아밀로이드(Aβ)의 증가, 아밀로이드 판의 생성을 보인다. Tg2576 마우스 뇌의 아밀로이드 축적은 시냅토파이신(synaptophysin)의 단백질 발현 감소, 신경 시냅스 형성, 세포골격 형성, 대사에 관련된 단백질들의 유전자 발현의 감소를 보이는 특성을 갖는다.

Aβ 주입(infusion) 모델은 마우스의 뇌 한쪽 반구에 Aβ 주입 펌프를 주입하여 14일 동안 뇌 내 Aβ의 농도가 300 pmol을 유지하도록 하여 신경퇴화와 학습 및 기억의 손상을 동반한 뇌기능 손상을 유도하는 마우스 모델이다. 이는 Tg2576이 사람 APP 695(swAPP) 유전자를 발현하여 뇌 내 아밀로이드 축적을 일으킨다는 점에서 대체가 가능하며, Aβ infusion 모델이 단순히 Aβ로 인한 신경 독성으로 뇌기능 손상을 일으키는 것에 반해, Tg2576 마우스는 유전자로 인한 복합적인 기전으로 인하여 뇌기능 손상을 일으키므로 알츠하이머 치료제 개발에 더욱 적합하다.

또한, swAPP/PS2 마우스는 Tg2576 마우스 모델과 같은 swAPP 유전자를 포함하며 돌연변이형 PS2 유전자를 발현하는 모델로서 유전적으로 아밀로이드 축적이 일어나 알츠하이머 병 마우스 모델로 쓰이는 마우스이다. 이는 선천적으로 아밀로이드 축적이 일어나 알츠하이머성 치매 증상을 나타낸다는 것에서 Tg2576으로 대체가 가능하기에, 본 실시예에서는 Tg2576 마우스를 알츠하이머 동물 모델로 선정하였다.

12개월령 Tg2576 마우스를 식품의약품안전처의 인도적 동물 관리 및 사용 지침에 따라 관리하고 다루었다. 스웨덴 이중 돌연변이(hAPP; HuAPP695; K670 N/M671 L)를 갖는 인간 APP695를 보유한 Tg2576 마우스는 Taconic Farms (Germantown, NY, USA)으로부터 구입하였고, 균주는 충북대학교의 동물 실험실에서 유지되었다. Tg2576 마우스는 각 그룹 당 10 마리씩 대조군 및 bvPLA2 (1mg/kg) 처리군의 두 그룹으로 무작위로 나누어졌다.

bvPLA2는 4주 동안 주당 2회씩 복강 내 투여되었고, 대조군 마우스는 대안으로 동일 용량의 비히클(vehicle)이 투여되었다. 학습 및 기억 능력의 행동 실험은 수중 미로, 프로브 및 수동 회피 실험을 이용하여 평가되었다. 마우스는 CO₂ 질식에 의해 행동 실험 후 희생되었다.

2) 봉독 추출물의 Tg2576 마우스에서 유전적으로 유도된 기억 장애 완화 효과 확인

본 실시예에 이용된 AD(Alzheimer's Disease) 마우스 모델인 Tg2576 마우스는 스웨덴에서 가족성 AD에서 발견된 돌연변이로 인간 APP를 과발현한다. Tg2576 마우스는 최대 6개월까지 Aβ를 빠르게 생산한 다음, 9 내지 12개월 사이에 Aβ 플라크(plaques) 생성을 시작한다. 13개월에 Aβ 플라크의 레벨이 급격히 축적되고 마우스는 인지 능력 손상과 같은 AD의 증상을 보인다.

Tg2576 AD 마우스 모델에서 봉독 추출물의 기억력 개선 효과를 확인하기 위해, 마우스에 4주 동안 주 2회씩 bvPLA2 (1mg/kg)를 복강 내 주사로 투여하였다 (도 15A). 투여 4주 후, 학습 능력 및 공간기억능력을 평가하기 위해 모리스 수중 미로, 프로브 및 수동 회피 실험을 연속적으로 수행하였다. 탈출 지연 시간 및 거리는 기억력 개선에서 bvPLA2의 영향을 결정하기 위해 측정되었다.

그 결과, 도 15B 및 도 15C와 같이, 6일 차 대조군의 평균 탈출 지연 시간 및 수영 거리는 각각 약 29.71±4.189초 및 346.1±71.43cm로 나타났다. 반면에, bvPLA2 투여군의 평균 탈출 지연 시간 및 거리는 각각 19.36±2.790초 및 186.8±28.48cm로 대조군과 비교하여 현저히 감소한 것으로 나타났다.

모리스 수중 미로가 끝난 다음 날에 기억 유지 능력을 평가하기 위하여 프로브 테스트를 진행하였다. 그 결과, 도 15D와 같이, 타겟 사분면에서의 평균 머무름 시간은 대조군 (12.31±3.355%)에 비해 bvPLA2 투여군 (30.54±4.992%)에서 유의하게 증가하는 것으로 나타났다.

프로브 테스트 2일 후에 수동 회피 실험을 진행한 결과, 도 15E와 같이, 대조군은 밝은 구획에서 36.17±8.310초의 평균 step through 머무른 시간이 나타났고, bvPLA2 투여군은 107.5±20.90초로, 대조군에 비해 유의하게 증가한 값을 나타내었다.

3) 봉독 추출물의 Aβ 축적 억제 효과 확인

Aβ 축적은 AD의 원인으로 가장 잘 알려져 있다. 이에, Tg2576 마우스의 뇌에서 유전적으로 유도된 Aβ 축적에 봉독 추출물이 미치는 영향을 확인하기 위해 티오플라빈 S 염색(Thioflavin S staining)을 수행하였다. 티오플라빈 S 염색은 주로 Aβ 플라크에서 발견되는 Aβ의 β-시트 구조(β-sheet-rich structures) 염색에 사용된다. 그 결과, 도 16A와 같이, 대조군과 비교하여 bvPLA2 투여군에서 Aβ 플라크의 축적이 상당히 감소하는 것으로 나타났다.

Aβ 생산에 관여하는 APP 및 BACE1의 레벨은 Tg2576 마우스 뇌의 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 검출하였다. 그 결과, 도 16B와 같이, 대조군과 비교하여 bvPLA2 투여군에서 APP 및 BACE1의 발현 레벨이 감소하는 것으로 나타났다.

ELISA는 Tg2576 마우스 뇌에서 Aβ_1-42 레벨 및 Aβ_1-40 레벨을 정량적으로 측정하기 위해 수행되었다. 그 결과, 도 16C와 같이, 대조군의 Aβ_1-42 레벨은 뇌에서 3039±116.8pg/mg의 단백질, bvPLA2 투여군은 2236±244.9pg/mg의 단백질로 나타났다. 또한, 도 16D와 같이, 대조군의 Aβ_1-40 레벨은 뇌에서 2182±168.6pg/mg, bvPLA2 투여군은 1593±53.25pg/mg인 것으로 나타났다. 두 군의 상기 아밀로이드 레벨을 비교하면, bvPLA2 투여는 Tg2576 마우스의 뇌에서 Aβ 레벨을 유의적으로 감소시킴을 확인할 수 있다.

bvPLA2에 의해 아밀로이드 생성이 어떻게 감소되는지를 확인하기 위해, 뇌에서 β-세크레타제 활성을 분석하였다. 그 결과, 도 16E와 같이, bvPLA2 투여로 β-세크레타제 활성이 유의하게 감소됨을 확인하였다.

bvPLA2의 BV-2 세포에서 세포 생존율에 대한 영향은 MTT 분석에 의해 결정되었다 (도 18A). bvPLA2 (0.01, 0.1, 1μg/mL) 처리된 군은 대조군과 비교하여 세포 생존율에 대한 유의한 변화는 없었기에, bvPLA2는 BV-2 세포에서 1μg/mL 까지는 독성이 없는 것으로 판단된다.

in vitro에서 아밀로이드 생성(amyloidogenesis)에 대한 bvPLA2의 영향을 조사하기 위하여, BV-2 세포에 LPS 및 다양한 농도의 bvPLA2 (0.01, 0.1, 1μg/mL)를 24시간 동안 처리하였다. BV-2 세포에서의 Aβ_1-42 레벨은 ELISA에 의해 결정되었다.

그 결과, 도 16F와 같이, 대조군에서 Aβ_1-42 레벨은 144.9±3.587pg/mg로 나타났고, LPS 군에서는 356.5±6.030pg/mg로 상당히 증가된 것으로 나타났다. 그러나, bvPLA2 처리군에서는 농도 의존적으로 감소하여 bvPLA2 1μg/mL 처리군에서 273.7±23.33pg/mg 까지 감소하는 것으로 나타났다.

도 16G를 참조하면, β-세크레타제 활성 또한 대조군에 비해 LPS 군에서 상당히 증가하였으나, bvPLA2 처리에 의해 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

APP 및 BACE1의 발현 수준은 웨스턴 블롯 분석으로 측정되었다. 그 결과, 도 16H와 같이, APP 및 BACE1의 발현은 대조군과 비교하여 LPS 군에서 상당히 증가한 반면, bvPLA2 처리군에서 감소하는 것으로 나타났다.

4) Tg2576 마우스 뇌에서의 신경염증에 대한 봉독 추출물의 효과 확인

AD의 또 다른 특징은 성상교세포 및 미세아교세포의 활성화(즉, 신경염증)이다. 마우스 뇌에서 신경염증 관련 단백질의 발현 수준을 조사하기 위하여 면역조직화학 및 웨스텐 블롯을 수행하였다.

그 결과, 도 17A 및 17B와 같이, 각각 반응성 성상교세포와 활성화된 미세아교세포의 마커인 GFAP 및 IBA-1의 수는 대조군과 비교하여 bvPLA2 투여된 마우스에서 감소하는 것으로 나타났으며, 염증성 단백질인 iNOS 및 COX-2의 수도 bvPLA2 투여군에서 감소되었다.

또한, 도 17C와 같이, iNOS 및 COX-2의 발현 수준이 bvPLA2 투여된 Tg2576 마우스의 뇌에서 감소되었고, GFAP 및 IBA-1의 발현 수준 또한 bvPLA2 투여군의 뇌에서 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다.

전염증성 사이토카인의 생성은 염증 발생의 마커로 잘 알려져 있으며, 항염증성 사이토카인의 생성은 염증의 감소를 나타낸다. 이에, 전염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 생성 수준을 결정하기 위해 qRT-PCR를 수행하였다.

그 결과, 도 17D와 같이, TNF-α, IL-1β 및 IL-6와 같은 전염증성 사이토카인의 mRNA 수준이 대조군과 비교하여 bvPLA2 투여군의 뇌에서 감소되는 것으로 나타났다. 대신, IL-4 및 TGF-β와 같은 항염증성 사이토카인의 mRNA 수준은 대조군과 비교하여 bvPLA2 투여군에서 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다. 그러나 항염증성 사이토카인인 IL-10의 발현 수준은 bvPLA2 투여군 마우스의 뇌에서 감소되었다.

5) BV-2 미세아교세포에서의 신경염증에 대한 봉독 추출물의 효과 확인

미세아교세포에서 bvPLA2의 항염증 효과는 산화질소 농도 및 염증 관련 단백질, 전염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 발현 수준을 통해 조사되었다.

활성화된 대식세포(macrophage)에서는 산화질소(Nitric oxide, NO)가 분비되며, bvPLA2의 처리로 인해 BV-2 세포에서의 신경염증의 완화 정도를 확인하기 위해 산화질소 분석(Nitric oxide assay)을 수행한 결과, 도 18B와 같이, 산화질소 농도는 LPS 군과 비교하여 bvPLA2 처리군에서 14.92±2.154 %까지 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다.

도 18C를 참조하면, iNOS, COX-2 및 IBA-1의 발현은 LPS 군에 비해 bvPLA2 처리군에서 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 것으로 나타났으며, 도 18D를 참조하면, TNF-α, IL-1β 및 IL-6와 같은 전염증성 사이토카인의 발현 수준은 LPS 군에서 상당히 증가하였고, bvPLA2 처리군에서 농도 의존적으로 감소하였으며, 반면, IL-4 및 TGF-β와 같은 항염증성 사이토카인의 발현 수준은 LPS 군에서 상당히 감소되었으나, bvPLA2 처리군에서 농도 의존적으로 회복되는 것을 확인할 수 있었다.

도면에 도시되지 않았지만, bvPLA2가 Aβ 유도된 신경염증의 억제 효과를 가지는지 여부를 확인하기 위해 웨스턴 블롯 분석 및 qRT-PCR을 수행한 결과, iNOS, COX-2, 및 p-STAT3의 발현은 Aβ 처리군과 비교하여 bvPLA2 처리군에서 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다. 전염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β 및 IL-6)의 수준은 Aβ 처리에 의해 상당히 증가하였고 bvPLA2 처리군에서 농도 의존적으로 감소하였다. 이를 통해, bvPLA2가 BV-2 세포에서 LPS 또는 Aβ에 의해 유도된 염증 반응에 대한 억제 효과를 가짐을 확인할 수 있다.

6) bvPLA2 및 STAT3의 결합을 통한 STAT3 활성화에 대한 봉독 추출물의 억제 효과 확인

bvPLA2의 항신경염증 효과에 어떤 신호 전달 경로가 관여하는지 조사하기 위해, 염증과 관련성이 높은 STAT3 및 미토겐-활성 단백질 인산화효소(mitogen-activated protein kinases, MAPK) 신호 전달 경로와 관련된 인자의 수준을 Tg2576 마우스의 뇌에서 웨스턴 블로팅을 이용하여 확인하였다.

그 결과, 도 19A와 같이, bvPLA2 투여군에서 p-STAT3의 수준이 유의하게 감소하였고, MAPK 신호에서 p-ERK의 수준만이 유의하게 감소하는 것으로 나타났다.

이를 통해, bvPLA2는 STAT3 신호 전달 경로와 밀접한 관련이 있는 것으로 볼 수 있어, LPS (1μg/mL)에 의해 활성화된 BV-2 세포에 bvPLA2 (0.01, 0.1, 1μg/mL)를 처리하여 p-STAT3의 수준을 평가하였다.

도 19B를 참조하면, 웨스턴 블롯 분석에서 대조군과 비교하여 LPS 처리에 의해 p-STAT3의 수준이 상당히 증가하였으나, 농도 의존적으로 bvPLA2 처리에 의해 감소하는 것으로 나타났다. 특히, bvPLA2 1μg/mL 처리된 경우, p-STAT3의 수준은 대조군과 유사한 수준으로 감소되었다.

STAT3 프로모터(promotor)에 대한 번역 활성(translational activity)에서 bvPLA2의 효과를 확인하기 위해 루시퍼라제(luciferase) 활성 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 19C와 같이, BV-2 세포에서 bvPLA2는 STAT3 루시퍼라제 활성을 농도 의존적으로 감소시킴을 확인할 수 있었다.

bvPLA2의 효과가 STAT3에 결합하는 것과 관련이 있는지 결정하기 위해, 풀 다운 분석(pull-down assay) 및 bvPLA2와 STAT3 사이의 도킹 실험(docking experiment)을 수행하였다. 세파로오스 4B 비즈(Sepharose 4B beads) 및 bvPLA2-접합 세파로오스 4B 비즈(bvPLA2-conjugated Sepharose 4B beads)에서 STAT3를 과발현하는 BV-2 세포로부터 전체 세포 용해물을 인큐베이션한 다음, anti-STAT3 항체로 면역 블로팅에 의해 검출하였다.

그 결과, 도 19D와 같이, STAT3 단백질 수준은 bvPLA2-접합 세파로오스 4B 비즈에서 더 높은 것으로 나타났고, 이를 통해, bvPLA2가 STAT3에 직접 결합할 수 있음을 확인할 수 있다.

7) STAT3의 LD(linker domain)에 직접 결합하는 봉독 추출물

bvPLA2가 STAT3에 결합하는 부위를 확인하기 위해, bvPLA2 및 STAT3 사이의 계산 분자 도킹 모델링을 수행하였다. 그 결과, 도 20A와 같이, bvPLA2가 STAT3의 여러 아미노산, 특히, STAT3의 링커 도메인(linker domain, LD)(Thr500, Asp502, Gln503, Glu506, Ser509, Trp510, Ser513, Lys517, Arg518, Leu520, 및 Ile522로 구성된 바인딩 포켓 내부)에 직접 결합하는 것으로 나타났다.

STAT3의 어느 도메인이 bvPLA2와 상호작용하는지 알아내기 위해, wild type, DNA 결합 도메인(DNA binding domain, DBD)-null 및 LD-null과 같은 여러 돌연변이 형태에서 STAT3를 이용하여 풀다운 분석, 루시퍼라제 활성 분식 및 qRT-PCR을 수행하였다 (도 20B).

bvPLA2 및 STAT3의 LD 사이의 상호작용을 확인하기 위해, bvPLA2-접합 세파로오스 4B 비즈(bvPLA2-Sepharose 4B beads)와 wild type(WT)-STAT3, DBD-null STAT3 및 LD-null STAT3로 형질주입된 세포 용해물을 사용하여 풀다운 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 20C와 같이, bvPLA2-접합 세파로오스 4B 비즈는 WT-STAT3 및 DBD-null STAT3를 풀다운 시켰으나, LD-null STAT3는 풀다운되지 못하였다.

도 20D를 참조하면, STAT3의 루시퍼라제 활성은 WT-STAT3, DBD-null STAT3, 또는 LD-null STAT3로 형질주입된 BV-2 세포 모두에서 LPS 처리에 의해 유의하게 증가하였고, bvPLA2는 LD-null STAT3 벡터(vector)를 제외한 WT-STAT3 벡터 또는 DBD-null STAT3 벡터의 BV-2 세포에서 STAT3 루시퍼라제 활성을 감소시키는 것으로 나타났다.

WT-STAT3, DBD-null STAT3 또는 LD-null STAT3로 형질주입된 BV-2 세포에서 bvPLA2의 항염증 효과가 다른지 여부를 확인하기 위해, qRT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 도 20E와 같이, WT-STAT3 또는 DBD-null STAT3로 형질주입된 BV-2 세포에서는 bvPLA2에 의해 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 수준이 감소하는 것으로 나타났으나, LD-null STAT3로 형질주입된 BV-2 세포에서는 상기 사이토카인의 수준이 bvPLA2 처리에 의해 거의 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. 이를 통해, bvPLA2는 STAT3의 LD에 결합함으로써 STAT3의 활성화를 억제할 수 있음을 확인할 수 있다.

8) 아밀로이드 생성 및 신경염증에 대한 봉독 추출물 및 STAT3 억제제의 시너지 효과 확인

아밀로이드 생성 및 신경염증에서 STAT3 억제제 (Stattic) 및 봉독 추출물의 억제 효과를 BV-2 세포에서 테스트하였다. in vitro에서 아밀로이드 생성 및 신경염증에 대해 bvPLA2 및 Stattic의 병용 효과를 결정하기 위해, BV-2 미세아교세포에 LPS (1μg/mL), Stattic (1μM), 또는 bvPLA2 (1μg/mL)를 24시간 동안 처리하였다.

BV-2 세포의 Aβ_1-42 레벨에 대해서는 ELISA에 의해 측정되었다. 도 21A를 참조하면, Aβ 레벨이 Stattic 처리군은 264.2±4.384pg/mg이고, bvPLA2 처리군에서는 273.7±23.33pg/mg인 것으로 나타났다. 이러한 레벨은 Stattic 및 bvPLA2의 병용 처리한 군에서 199.4±20.39pg/mg의 단백질로 유의하게 감소되었다.

도 21B를 참조하면, Aβ 생성에 직접 작용하는 β-세크레타제 활성은 대조군과 비교하여 LPS 처리로 상당히 증가되었고, Stattic 또는 bvPLA2의 처리로 감소하였으며, Stattic 및 bvPLA2의 병용 처리에 의해 유의하게 감소된 것으로 나타났다.

게다가, 도 21C와 같이, BV-2 세포에서 LPS 처리에 의해 Aβ 및 BACE1의 증가된 발현 수준은 bvPLA2 처리에 의해 감소되었으나, 병용 처리하였을 때 더 크게 감소됨을 웨스턴 블롯에 의해 확인할 수 있었다.

신경염증에 대한 Stattic 및 bvPLA2의 병용 효과를 조사하기 위해, BV-2 세포에서 염증성 단백질 및 전염증성 사이토카인의 수준을 평가하였다. 그 결과, 도 21D와 같이, LPS 처리에 의해 증가된 iNOS 및 COX-2와 같은 염증성 단백질의 세포 내 수준이 bvPLA2 또는 Stattic에 의해 감소되었고, 둘을 함께 사용하였을 때 더 많이 감소되는 것으로 나타났다.

또한, 도 21E와 같이, LPS 처리에 의해 증가된 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현 수준은 bvPLA2 또는 Stattic의 처리에 의해 감소되었고, 이를 함께 처리하였을 때, Stattic 또는 bvPLA2를 단일 처리한 때 보다 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 수준이 유의하게 더 감소하는 것으로 나타났다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (13)

1. PLA2(phospholipase A2) 함량이 50 내지 85%인 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 봉독 추출물은,
   신경 독성에 의한 운동 기능 저하를 개선시키는 것을 특징으로 하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 봉독 추출물은,
   Th1 및 Th17의 분극을 감소시키고 TH(tyrosine hydroxylase)-양성 도파민성 신경세포를 증가시켜 신경보호 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 봉독 추출물은,
   베타-아밀로이드(β-amyloid)의 축적을 감소시키는 것을 특징으로 하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 조성물은,
   피하 경로로 투여되는 것을 특징으로 하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
6. 제 5 항에 있어서,
   상기 봉독 추출물은,
   3.75 mg/kg 이상 7.5 mg/kg 미만의 함량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
7. 제 1 항에 있어서,
   상기 신경염증 질환은,
   알츠하이머병, 혈관성 치매, 전두측두엽 치매, 알콜성 치매, 파킨슨 및 뇌졸중으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
8. PLA2(phospholipase A2) 함량이 50 내지 85%인 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 피하 투여용 약학 조성물.
9. 제 8 항에 있어서,
   상기 봉독 추출물은,
   3.75 mg/kg 이상 7.5 mg/kg 미만의 함량으로 피하 투여되는 것을 특징으로 하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 피하 투여용 약학 조성물.
10. 제 1 항에 따른 조성물 및 STAT3 억제제 또는 NF-κB 억제제에서 선택되는 하나 이상의 억제제를 포함하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 신경염증 질환 예방 또는 치료를 위해 피하 투여하는 방법.
12. PLA2(phospholipase A2) 함량이 50 내지 85%인 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
13. 제 12 항에 따른 조성물 및 STAT3 억제제 또는 NF-κB 억제제에서 선택되는 하나 이상의 억제제를 포함하는 신경염증 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.

Images