TW202134429A - Ｔ細胞主細胞庫 - Google Patents

Abstract

本發明係提供含有T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫之T細胞製品之提供系統。

Description

T細胞主細胞庫

本發明係關於T細胞主細胞庫以及T細胞工作細胞庫，以及含有該庫之T細胞製品之提供系統等。

(發明之背景)

近年來作為針對癌症的治療法之免疫細胞治療正受到關注。所謂免疫細胞治療係將在患者體外使其增殖以及活化之免疫細胞投與於患者，使該免疫細胞攻擊癌細胞之治療法。與以往的外科治療、放射線治療、化學治療之三大療法相比，免疫細胞治療具有幾乎無副作用這樣的優點。免疫細胞治療係有各式各樣種類的治療法，但其中，針對現貨型(off-the-shelf)之同種異體系之(Allogenic)T細胞製品寄予許多期待。

已有文獻揭示(例如，非專利文獻1)，作為提供上述同種異體系T細胞製品之系統，係利用iPS細胞的保管(banking)技術(例如，專利文獻1等)或對於iPS細胞之CAR基因的導入技術(例如，專利文獻2等)，將預先使CAR基因導入iPS細胞而製作之iPS細胞進行擴大培養後，將該細胞儲存因而建構具有CAR基因之iPS細胞之主細胞庫，藉由使來自該細 胞庫之iPS細胞分化為T細胞所得到之T細胞，作為同種異體系之T細胞製品而使用之系統。

上述系統中，將CAR基因等外因性之基因導入如同iPS細胞之多能性幹細胞，使該細胞分化為T細胞之過程為必要。因此，滿足於各國當局訂定之GMP(Good Manufacturing Practice)基準之同時，有必要進行該過程中之各段階中的細胞(例如，iPS細胞、T細胞、CAR-T細胞)之維持管理步驟、分化步驟以及培養步驟。例如，由於使用iPS細胞之主細胞庫，用以調製T細胞製品係有必要使iPS細胞分化為T細胞，惟由於iPS細胞具有多分化能力，為了在每批誘導均勻的分化細胞而要求每回以高標準的步驟/品質管理進行，故人為上的、時間上的以及金錢上的成本極高。如此的成本在提供T細胞製品之穩定性方面賦予甚大的影響。尤其在欲提供複數種類之T細胞製品之情形，各個成本或時間形成累積，該影響變得更加深刻。因此，滿足GMP基準之同時，期望供給用以減抑成本製品之系統，並且在使用複數種類之T細胞製品之情形，亦期望可提供以高品質而低成本之該製品的系統。

[先前技術文獻]

[專利文獻]

[專利文獻1]美國公開第2009-0299763號

[專利文獻2]國際公開第2017/088012號

[非專利文獻]

[非專利文獻1]Bob Valamehr (Vice President of Fate Therapeutics) “Generation of off-the-shelf TCR-less CAR T cells from renewable pluripotent cells”, April 14-18, 2018 (AACR Annual Meeting 2018 Press Program)

因此本發明之課題係在於提供可減低人為上的、時間上的以及金錢上的成本，且批次間之差距小而品質高之現貨型(off-the-shelf)之同種異體系(Allogenic)T細胞製品之提供系統。又，本發明之另一課題係在於提供可使用於供應前述系統之T細胞主細胞庫以及T細胞工作細胞庫以及此等的採集品。

本發明者們為了解決上述課題而積極進行研究之結果，推測非專利文獻1等中所述以往之技術專注著眼於iPS細胞主細胞庫之建構方法，係由於與T細胞相比iPS細胞有優異之增殖能力所致。發明者們因而得到發想，認為只要得以藉由將T細胞進行擴大培養而充分地增殖，即可將T細胞或該增殖之T細胞作為主細胞庫使用。亦即，本發明者們得到發想認為並非建構具有CAR基因等外因性基因之iPS細胞之主細胞庫，而藉由建構含有該外因性基因之T細胞主細胞庫，即可由該細胞庫可迅速地提供高品質的T細胞製品。針對本發明者們之已知中，完全未有建構T細胞 主細胞庫這樣的發想而此為全然新穎之發明。本發明者們即基於此等的知見更進一步深入研究之結果遂而完成本發明。

亦即，本發明係提供以下之內容。

[1]一種T細胞製品之提供系統，係包含T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫。

[2]如[1]所述之系統，其中，前述T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫包含源自人工多能性幹細胞之T細胞。

[3]如[1]或[2]所述之系統，其中，前述T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫包含至少1種HLA基因之表現受抑制之T細胞。

[3a]如[1]至[3]中任一項所述之系統，其中，前述T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫包含經導入外因性基因之T細胞。

[3b]如[1]至[3a]中任一項所述之系統，係包含進一步收集T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫，而建構包含2種以上之T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫之T細胞主細胞庫採集品及/或T細胞工作細胞庫採集品之階段。

[3c]如[1]至[3b]中任一項所述之系統，其中，前述T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫之種類係2種以上。

[3d]如[1]至[3c]中任一項所述之系統，係進一步包含選擇T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫之階段。

[4]如[1]至[3d]中任一項所述之系統，係包含將包含外因性基因之核酸導入由前述T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫所準備之T細胞之階段。

[5]如[4]所述之系統，其中，前述外因性基因係CAR基因或外因性之TCR基因。

[6]如[1]至[5]中任一項所述之系統，其中，前述T細胞製品之種類為2種以上。

[6a]如[1]至[6]中任一項所述之系統，係進一步包含選擇T細胞製品之階段。

[7]如[1]至[6a]中任一項所述之系統，係進一步包含擴大培養由前述T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫所準備之T細胞之階段。

[8]如[7]所述之系統，其中，前述擴大培養T細胞之階段，係包含藉由CD30促效劑刺激該細胞之步驟。

[8a]如[7]所述之系統，其中，前述擴大培養T細胞之階段中，係包含在CD30促效劑之存在下培養該細胞之步驟。

[9]如[7]至[8a]中任一項所述之系統，係進一步包含製造包含經前述擴大培養之T細胞的凍結T細胞製品之階段。

[10]如[6]至[9]中任一項所述之系統，係進一步包含收集T細胞製品，並建構包含2種以上T細胞製品之T細胞製品採集品之階段。

[10a]如[1]至[10]中任一項所述之系統，係進一步包含取得被驗者之資訊之階段。

[10b]如[10a]所述之系統，係進一步包含根據被驗者之資訊，選擇適當的T細胞主細胞庫及/或適當的T細胞工作細胞庫之階段。

[10c]如[10a]所述之系統，係進一步包含根據被驗者之資訊，選擇適當的T細胞製品之階段。

[11]如[1]至[10c]中任一項所述之系統，係進一步包含鑑別被驗者之腫瘤所表現之腫瘤特異性抗原或腫瘤關聯抗原之階段。

[12]如[11]所述之系統，係進一步包含由包含2種以上的T細胞製品之T細胞製品採集品，選擇表現出會辨識而結合經鑑別的抗原之CAR或外因性之TCR之T細胞製品之階段。

[13]一種T細胞製品之製造方法，係包含建構T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫之步驟。

[14]如[13]所述之T細胞製品之製造方法，其中，前述T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫係包含源自人工多能性幹細胞之T細胞。

[15]如[13]或[14]所述之T細胞製品之製造方法，其中，前述T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫係包含至少1種HLA基因之表現受抑制之T細胞。

[15a]如[13]至[15]中任一項所述之T細胞製品之製造方法，其中，前述T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫係包含經導入外因性基因之T細胞。

[16]如[13]至[15a]中任一項所述之T細胞製品之製造方法，係進一步包含將包含外因性基因之核酸導入由前述T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫所準備之T細胞之步驟。

[17]如[16]所述之T細胞製品之製造方法，其中，前述外因性基因係CAR基因或外因性之TCR基因。

[18]如[13]至[17]中任一項所述之T細胞製品之製造方法，進一步包含擴大培養T細胞之步驟。

[19]如[18]所述之T細胞製品之製造方法，其中，前述擴大培養T細胞之步驟中，係包含藉由CD30促效劑刺激該細胞之步驟。

[19a]如[18]所述之T細胞製品之製造方法，其中，前述擴大培養T細胞之步驟中，係包含在CD30促效劑之存在下培養該細胞之步驟。

[20]一種T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫。

[21]如[20]所述之T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫，係包含源自人工多能性幹細胞之T細胞。

[22]如[20]或[21]所述之T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫，係包含至少1種HLA基因之表現受抑制之T細胞。

[22a]如[20]至[22]中任一項所述之T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫，係包含經導入外因性基因之T細胞。

[23]一種T細胞主細胞庫採集品及/或T細胞工作細胞庫採集品，係包含2種類以上之[20]至[22a]中任一項所述之T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫。

[24]一種建構T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫之方法，係包含下列步驟：

(I)使不具有嵌合抗原受體(CAR)基因之人工多能性幹細胞分化為CAR-T療法用之T細胞之步驟；

(II)儲存該經分化之T細胞之步驟；以及

(III)進行該經分化之T細胞之特性解析之步驟。

[25]一種建構T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫之方法，係包含下列步驟：

(i)使不具有外因性之T細胞受體(TCR)基因之人工多能性幹細胞分化為TCR-T療法用之T細胞之步驟；

(ii)儲存該經分化之T細胞之步驟；以及

(iii)進行該經分化之T細胞之特性解析之步驟。

[25a]如[24]或[25]所述之方法，其中，前述人工多能性幹細胞係具有外因性基因。

[26]如[24]或[25a]所述之方法，其中，前述人工多能性幹細胞係具有外因性之T細胞受體(TCR)基因。

[27]如[24]至[26]中任一項所述之方法，其中，前述人工多能性幹細胞係缺失至少1種HLA基因。

[27a]如[24]至[26]中任一項所述之方法，其中，前述人工多能性幹細胞係至少1種HLA基因之表現受到抑制者。

[28]如[24]至[27a]中任一項所述之方法，其中，前述T細胞係表現CD8αβ。

[29]一種T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫，係藉由[24]至[28a]中任一項所述之方法所建構。

[30]一種製造表現CAR或外因性之TCR之T細胞製品之方法，係包含下列步驟：

(A)由[29]所述之T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫準備T細胞之步驟；

(B)將CAR基因或外因性之TCR基因導入該經準備之T細胞之步驟；以及

(C)將已導入該CAR基因或外因性之TCR基因之T細胞擴大培養之步驟。

[30a]如[30]所述之方法，係進一步包含(D)將經擴大培養之T細胞凍結之步驟。

[31]如[30]或[30a]所述之方法，其中，前述CAR或外因性之TCR係會辨識而結合腫瘤特異性抗原或腫瘤關聯抗原。

[32]如[30]至[31]中任一項所述之方法，其中，前述步驟(C)係包含將T細胞藉由CD30促效劑而刺激該細胞之步驟。

[32a]如[30]至[31]中任一項所述之T細胞製品之製造方法，其中，前述步驟(C)係包含將T細胞在CD30促效劑之存在下培養該細胞之步驟。

[33]一種T細胞製品，係藉由[30]至[32a]中任一項所述之方法所製造者。

[34]一種包含2種以上T細胞製品之T細胞製品採集品之建構方法，係包含收集[33]所述之T細胞製品之步驟。

[35]一種T細胞製品採集品，係藉由[34]所述之方法所建構者。

[36]一種提供適用於被驗者之T細胞製品之方法，係包含下列步驟：

(x)鑑別被驗者之腫瘤所表現之腫瘤特異性抗原或腫瘤關聯抗原之步驟；以及

(y)由[35]所述之T細胞製品採集品，選擇表現出會辨識而結合該經鑑別之抗原之CAR或外因性之TCR之T細胞製品之步驟。

[37]一種提供適用於被驗者之T細胞製品之方法，係包含下列步驟：

(p)取得被驗者之資訊之步驟；以及

(q)根據該取得之被驗者之資訊，選擇適當的T細胞主細胞庫及/或適當的T細胞工作細胞庫之步驟。

根據本發明可減低人為上的、時間上的以及金錢上的成本，並且提供批次間之差異小而品質高之現貨型(off-the-shelf)之同種異體系的T細胞製品之提供系統以及提供方法。如此的系統以及提供方法於提供複數種類之T細胞製品之情形特別優異。又，可使用於前述系統或方法之提供，亦提供T細胞之主細胞庫以及T細胞工作細胞庫以及此等之採集品。

各別將本說明書中所使用之各種的細胞稱作如下所述，並合併記載各個細胞之概要。

<人工多能性幹細胞(iPSC)>

αβ-iPSC：經導入TCR-α鏈基因(TRA基因)以及TCR-β鏈基因(TRB基因)之iPS細胞

Vγ9Vδ2-iPSC：經導入編碼Vγ9Vδ2TCR G115之TCR-γ鏈基因(TRG基因)以及TCR-δ鏈基因(TRD基因)之iPS細胞

<造血前驅細胞(HPC)>

Vγ9Vδ2-iHPC：經導入編碼Vγ9Vδ2TCR G115之TCR-γ鏈基因(TRG基因)以及TCR-δ鏈基因(TRD基因)之HPC

<T細胞>

iγδTC：由未導入外因性TCR之iPS細胞所分化之T細胞

iαβTC：由αβ-iPSC所分化之T細胞

Vγ9Vδ2-iTC：由Vγ9Vδ2-iPSC所分化之T細胞

Vγ9Vδ2-iHTC：由Vγ9Vδ2-iHPC所分化之T細胞

<導入CAR基因之T細胞>

CD19iαβCARTC：於iαβTC導入編碼抗CD19-CAR之基因所製作之T細胞

BCMAiαβCARTC：於iαβTC導入編碼抗BCMA-CAR之基因所製作之T細胞

CD19-CD30-iαβCARTC：於iαβTC導入編碼包含源自CD30細胞內結構域之抗CD19-CAR之基因所製作之T細胞

<導入CAR基因以及IL-15Rα/IL-15基因之T細胞>

CD19/IL15iαβCARTC：於iαβTC導入編碼抗CD19-CAR之基因以及編碼IL-15Rα/IL-15嵌合蛋白質之基因所製作之T細胞

CD19/IL15iVγ9Vδ2CARTC：於Vγ9Vδ2-iTC導入編碼抗CD19-CAR之基因以及編碼IL-15Rα/IL-15嵌合蛋白質之基因所製作之T細胞

CD19/IL15iγδCARTC：於iγδTC導入編碼抗CD19-CAR之基因以及編碼IL-15Rα/IL-15嵌合蛋白質之基因所製作之T細胞

100:系統

101:T細胞細胞庫建構部

102:T細胞細胞庫

103:核酸導入部

104:擴大培養部

105:凍結T細胞製品製造部

106:凍結T細胞製品

111:T細胞細胞庫採集品建構部

112:T細胞細胞庫採集品

121:T細胞製品採集品建構部

122:T細胞製品採集品

131:T細胞製品

151:被驗者之資訊

152:被驗者資訊取得部

153:抗原鑑別部

154:T細胞細胞庫選擇部

155:T細胞製品選擇部

161:T細胞細胞庫

171:T細胞關聯資訊

200:T細胞製品選擇部

201:處理器

202:記憶體

203:輔助記憶裝置

204:I/F裝置

205:通信裝置

206:驅動裝置

207:匯流排

210:操作裝置

211:顯示裝置

212:記錄媒體

圖1係顯示包含T細胞細胞庫之T細胞製品之提供系統之一例。

圖2係顯示由T細胞細胞庫採集品，提供複數T細胞製品之系統之一例。圖2中「Armored」係意指導入相關於細胞介素及/或趨化介素分泌之外因性基因。

圖3係顯示在iγδTC細胞膜表面上之CD3、γδTCR以及αβTCR之表現。塗有顏色的峰係顯示非抗體染色群之結果，未上色的峰係各別顯示使用各抗原特異的抗體之染色結果。

圖4係顯示在iγδTC細胞膜表面上之TCR-Vδ1鏈以及TCR-V2δ鏈之表現。橫軸和縱軸係各別顯示TCR-Vδ1鏈(Vdelta1)和TCR-Vδ2鏈(Vdelta2)之表現。

圖5係顯示在Vγ9Vδ2-iTC細胞膜表面上之CD3以及γδTCR分子之表現。左圖之橫軸和縱軸係各別顯示CD3和pan-γδTCR之表現。右圖之橫軸和縱軸係各別顯示TCR-Vδ2鏈和TCR-Vγ9鏈之表現。

圖6係顯示在Vγ9Vδ2-iHTC細胞膜表面上之CD3以及γδTCR分子之表現。左圖之橫軸和縱軸係各別顯示CD3和pan-γδTCR之表現。右圖之橫軸和縱軸係各別顯示CD3和TCR-Vγ9鏈之表現。

圖7係表示iγδTC之細胞增殖圖。縱軸係表示細胞數，橫軸係表示由增殖培養開始所經過之日數。箭頭係表示藉由固相化抗CD3促效劑抗體/RetroNectin(註冊商標)以及抗CD30促效劑抗體刺激開始之日。

圖8係表示Vγ9Vδ2-iTC之細胞增殖圖。縱軸係表示細胞數，橫軸係表示由增殖培養開始所經過之日數。箭頭係表示藉由固相化抗CD3促效劑抗體/RetroNectin(註冊商標)刺激開始之日。

圖9係表示因固相化抗CD3促效劑抗體/RetroNectin(註冊商標)刺激之CD19-iαβCARTC之增殖曲線圖。縱軸係表示細胞數，橫軸係表示由上述之刺激開始之日所經過之日數。箭頭係表示藉由固相化抗CD3促效劑抗體/RetroNectin(註冊商標)刺激開始之日。

圖10係表示針對於iαβTC導入編碼抗CD19-CAR基因或編碼抗BCMA-CAR之基因所製作之CART細胞(各別之CD19iαβCARTC(A)以及BCMAiαβCARTC(B))以及iαβTC之CD19陽性Raji細胞(A)或BCMA陽性H929細胞(B)之抗原特異的細胞傷害活性圖。

圖11係表示針對CD19-CD30-iαβCARTC之CD19陽性Raji癌細胞之細胞傷害活性圖。縱軸係表示將2小時後經殺傷之細胞數之比例，橫軸係表示作用細胞(CD19iαβCARTC)和標的細胞(CD19陽性Raji癌細胞)之混合比例。

圖12係表示CD19/IL15iγδCARTC之抗原特異的細胞傷害活性圖。黑點以及白點係表示各別針對CD19陽性Raji癌細胞以及CD19陰性CCRF-CEM癌細胞之細胞傷害活性。縱軸係表示2小時後殘存細胞數之比例，橫 軸係表示作用細胞(CD19/IL15iγδCARTC)和標的細胞(CD19陽性Raji癌細胞或CD19陰性CCRF-CEM癌細胞)之混合比例。

圖13係表示CD19/IL15iVγ9Vδ2CARTC之細胞增殖圖。縱軸係表示細胞數，橫軸係表示由增殖培養開始所經過之日數。箭頭係表示藉由固相化抗CD3促效劑抗體/RetroNectin(註冊商標)刺激開始之日。

圖14係表示因CD19/IL15iγδCARTC所致之人CD19表現Nalm6腫瘤異種移植小鼠之生存日數延長效果圖。

圖15係表示因CD19/IL15iVγ9δ2CARTC所致之人CD19表現Nalm6異種移植小鼠中的生存日數延長效果圖。

圖16係表示包含T細胞細胞庫之T細胞製品之提供系統之一例。

圖17係表示T細胞製品選擇部中所含有硬體構成之一例之圖。

(發明之詳細的說明)

1. T細胞主細胞庫，T細胞工作細胞庫，以及T細胞製品之提供系統

本發明係提供T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫。以下之中，有使用「T細胞細胞庫」之用語作為包含T細胞主細胞庫和T細胞工作細胞庫者。又，在其他之態樣中，本發明係提供包含T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫之T細胞製品之提供系統(以下稱為「本發明之提供系統」。)。

本說明書中，所謂「細胞庫」，係意指依照ICH(International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use)之準則，滿足世界各國之醫藥品當局所設定之品質基準等，經特性解析相同之起始素材(ICH準則Q5D(ICH guideline Q5D))。一般而言，細胞庫係藉由使填充於適當的容器之細胞凍結而建構，惟在上述之點之方面，與單純藉由使細胞凍結所得之凍結儲存有所區別。亦視需要針對細胞庫實施特性解析以外之品質評價用之試驗。細胞庫之建構方法以及經建構之細胞庫之特性解析以及品質評價的試驗項目，係隨著成為細胞庫的對象之細胞生物學的性質(例如，營養要求性)，培養履歴以及試驗之實施可能性而有所不同，惟因基於本領域中具有通常知識者，或本領域中具有通常知識者與管制當局之協議內容等而適當之設定。該等的建構方法與特性解析以及品質評價結果之相關資訊係在各國的製造販賣許可申請中提示給醫藥品當局。所謂「主細胞庫」，係意指將成為全部製造用細胞層原始之種株在一定的培養條件下使其經過最低限度的繼代數進行增殖並分注於複數個安瓿者，而該細胞為T細胞者稱為「T細胞主細胞庫」。又，所謂「工作細胞庫」，係意指使主細胞庫之一個或複數個集結所得之細胞經確認其在充分安定之條件下進一步培養，並分注於複數個安瓿者，而該細胞為T細胞者稱為「T細胞工作細胞庫」(本說明書中，將T細胞主細胞庫以及T細胞工作細胞庫稱為「T細胞細胞庫」。)。根據ICH Q5D，一般而言，特性解析之試驗係針對主細胞庫進行實施，通常，在各工作細胞庫中亦有進行實施一部分之特性解析之試驗。

特性解析之試驗中係主要對於是否未有外來性之感染性因子之混入進行評價。尤其，由於因外來性病毒所致之污染在臨床上的使用上有招致嚴重的事態之可能性，故依據ICH Q5A(R1)而進行評價。就其他之試驗而言，有用以檢出是否因其他細胞株所致交叉污染之同一性試驗。又，有實施核型分析或致腫瘤性試驗之情形。

就品質評價之試驗項目而言，可舉例如使用就T細胞為適當的細胞表現型之確認試驗、純度試驗、源自製造步驟之雜質試驗，以及細胞數或細胞生存率等的含量試驗等。

T細胞細胞庫亦可為T細胞製品之製造及/或提供者自己所建構者，亦可導入因他者所建構者而使用於T細胞製品之製造中。

根據ICH Q5D，由主細胞庫建構工作細胞庫之此種2階段方式細胞庫之思考方式，在持續地進行醫藥品製造方面，就用以供給細胞基材且更實際的方法而言一般上可被接受。

工作細胞庫係源自一個容器或其以上之數的主細胞庫者。工作細胞庫之更新可視需要由主細胞庫進行。關於重新建構之工作細胞庫方面，在ICH Q5D中係記載有必要藉由進行特性解析等，而適當地確認其適格性。

就本發明之一態樣而言，可將T細胞分注於複數個保存容器(無菌小玻璃瓶(vial)等)中，藉由使其凍結儲存而建構T細胞主細胞庫。將此T細胞主細胞庫中的一個容器量之T細胞進行融解，可供於適當之特性解析之試驗。又，可由同一的容器或其他的經融解的一容器將T細胞分注於複數個適當的容器中，藉由凍結儲存而建構T細胞工作細胞庫。

就本發明之一態樣而言，可融解T細胞細胞庫之一個或複數個容器量之T細胞，於T細胞導入包含外因性基因之核酸，藉由擴大培養而製造T細胞製品。

本發明中之所謂「儲存」，係意指將T細胞等細胞所分注(allocate)之複數個容器集中並適當地進行保管，管理溫度等保管條件、出納等。保管該等的容器之場所可為一個處所，亦可為複數個處所。

本發明中之所謂「T細胞」係意指CD3陽性細胞，就本發明中可使用之T細胞而言，可舉例如，屬於CD8陽性細胞之細胞毒性T細胞(CTL)、屬於CD4陽性細胞之協助者T細胞、調節T細胞、作用T細胞、屬於T細胞受體(TCR)γ鏈以及TCRδ鏈陽性細胞之γδT細胞等。又，T細胞亦包含CD4/CD8雙陽性細胞。T細胞中的TCR可為內在性TCR基因之表現所致之TCR，亦可為外因性TCR基因之表現所致之TCR。外因性TCR亦可為後述之TCR的改變體。本發明中所提供之T細胞細胞庫中之T細胞，較佳係細胞毒性T細胞，再佳為表現CD8αβ之CD8αβ陽性細胞毒性T細胞。又，本說明書中，所謂「T細胞製品」，係指將T細胞填充於保存容器(無菌小瓶或輸血袋等)者，或在此等實施適當的外包裝或標籤等者。T細胞製品可為凍結者，亦可為未凍結者，惟由T細胞之安定性的觀點而言在長期間保存之情形以凍結者較佳。本說明書中，將經凍結之T細胞製品有特別稱為「凍結T細胞製品」。本說明書中，若未經特別說明，於「T細胞製品」中係包含未凍結之T細胞製品以及經凍結之T細胞製品(凍結T細胞製品)之兩者。本說明書中，「T細胞製品」中係包含投與於包含人之哺乳動物為對象之臨床試驗用製品和市販用製品之兩者。

如上所述，使用以往的iPS細胞之主細胞庫或工作細胞庫之T細胞製品之提供方法，在人為上的、時間上的以及金錢上的成本極高。尤其在欲提供2種以上T細胞製品之情形，累積了各別的成本及時間而使得該影響變得更加嚴重。另一方面而言若根據本發明之提供系統，為了使用T細胞之主細胞庫或工作細胞庫，尤其在提供2種以上之T細胞製品時，與以往的技術進行比較，人為上的、時間上的以及金錢上的成本可變 得極為減低。因此，以本發明之提供系統所提供之T細胞製品之種類可為1種，在提供2種以上之情形尤其優異。

本說明書中，所謂「陽性」，係意指蛋白質或基因係以在該領域中藉由周知的手法所能檢測出的量表現。蛋白質的檢出係使用抗體之免疫學的測定，例如可利用ELISA、免疫染色、流動式細胞測量術進行。又，在表現於細胞內而細胞表面未顯現之蛋白質(例如轉錄因子或其次單元(subunit)等)之情形，使該蛋白質與報告蛋白質一同表現，可藉由檢出該報告蛋白質而檢出作為對象之蛋白質。基因之檢出例如可利用RT-PCR，生物晶片(例如，微陣列(microarray))、RNAseq等核酸擴增方法及/或核酸檢出方法進行。

本說明書中，所謂「陰性」，係指蛋白質或基因之表現量藉由如上所述全部或任一周知的手法未能達到檢出下限值。蛋白質或基因之表現的檢出下限值得因各手法而相異。

本說明書中，所謂「基因之表現」，係包含由該基因特定之核酸序列合成mRNA者(亦稱為轉錄或mRNA之表現)以及根據該mRNA之資訊而合成蛋白質者(亦稱為轉譯或蛋白質之表現)之兩者，惟若沒有特別限定，「基因之表現」或單純「表現」係意指蛋白質之表現者。

本說明書中，所謂「培養」，係意指將細胞維持於生物體外環境中，使其增殖(成長)且/或使其分化。所謂「進行培養」，係意指在組織外或體外，例如，細胞培養盤、皿或燒瓶中維持細胞，使其增殖(成長)且/或使其分化。

構成T細胞細胞庫之T細胞，可藉由將具有分化為T細胞之分化能之幹細胞分化誘導而進行製造。就如此之幹細胞而言，可舉例如多能性幹細胞(pluripotent stem cell)、多潛能性幹細胞(multipotent stem cell)等。本說明書中，所謂「多能性幹細胞(pluripotent stem cell)」，係指具有可分化為生物體之種種各異之形態或帶有機能之組織或細胞，具有得以分化為三胚葉(內胚葉、中胚葉、外胚葉)之任一系統細胞之能力之幹細胞。就多能性幹細胞而言，只要沒有特別限定，可舉例如，人工多能性幹細胞(本說明書中，亦有稱為「iPS細胞」)、胚性幹細胞(ES細胞)、源自因核移植所得之純株胚之胚性幹細胞(nuclear transfer Embryonic stem cell：ntES細胞)、多能性生殖幹細胞、胚性生殖幹細胞(EG細胞)等。本說明書中，所謂「多潛能性幹細胞(multipotent stem cell)」，係指具有可分化為複數個限定數的系統之細胞之能力之幹細胞。又，就「多潛能性幹細胞(multipotent stem cell)」而言，可舉例如造血幹細胞、齒髓幹細胞、源自口腔黏膜之幹細胞、毛囊細胞、源自培養纖維母細胞或骨髓幹細胞之體性幹細胞等。較佳之多能性幹細胞(pluripotent stem cell)係ES細胞以及iPS細胞，特佳為iPS細胞。上述多能性幹細胞係源自ES細胞或人胚之任意細胞之情形，該細胞可為破壞胚所製作成之細胞，亦可為不破壞胚所製作成之細胞，惟較佳係不破壞胚所製作成之細胞。上述幹細胞較佳係源自哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、犬、猴、猩猩、黑猩猩、人)，源自人者更佳。因此，就本發明中所使用之幹細胞而言最佳係人iPS細胞。

所謂「人工多能性幹細胞(iPS細胞)」，係指於哺乳動物體細胞或未分化幹細胞中，藉由導入特定的因子(核初期化因子)重新編程所 得到之細胞。現今「人工多能性幹細胞(iPS細胞)」中有各式各樣者，亦可使用根據山中等人藉由將Oct3/4‧Sox2‧Klf4‧c-Myc之4因子導入於小鼠纖維母細胞所樹立之iPS細胞(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126：663-676)之外，將同樣的4因子導入於人纖維母細胞所樹立之源自人細胞之iPS細胞(Takahashi K,Yamanaka S.,et al.,Cell,(2007)131：861-872.)、將上述4因子導入後以Nanog之表現作為指標進行選別所樹立之Nanog-iPS細胞(Okita,K.,Ichisaka,T.,and Yamanaka,S.(2007).Nature 448,313-317.)、以不含有c-Myc之方法所製作之iPS細胞(Nakagawa M,Yamanaka S.,et al.,Nature Biotechnology,(2008)26,101-106)、以無病毒法將6因子導入所樹立之iPS細胞(Okita K et al.,Nat.Methods 2011 May；8(5)：409-12,Okita K et al.,Stem Cells.31(3)：458-66.)。又，亦可使用由Thomson等所製作之將OCT3/4‧SOX2‧NANOG‧LIN28之4因子導入所樹立之人工多能性幹細胞(Yu J.,Thomson JA.et al.,Science(2007)318：1917-1920.)、由Daley等所製作之人工多能性幹細胞(Park IH,Daley GQ.et al.,Nature(2007)451：141-146)、由櫻田等所製作之人工多能性幹細胞(日本特開2008-307007號)等。

除此之外，亦可使用經公開之所有的論文(例如，Shi Y.,Ding S.,et al.,Cell Stem Cell,(2008)Vol3,Issue 5,568-574；Kim JB.,Scholer HR.,et al.,Nature,(2008)454,646-650：Huangfu D.,Melton,DA.,et al.,Nature Biotechnology,(2008)26,No 7,795-797)，或專利(例如，日本特開2008-307007號、日本特開2008-283972號、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007/069666、WO2008/118220、WO2008/124133、WO2008/151058、WO2009/006930、WO2009/006997、WO2009/007852)中所記載該領域中 所周知之人工多能性幹細胞之任一者。就人工多能性幹細胞株而言可利用NIH、理研、京都大學等所樹立之各種iPS細胞株。若為人iPS細胞株，可舉例如理研之HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株，京都大學之253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株，再生醫療用iPS細胞儲存(例如Ff-I01s04株、QHJI株等)等。

ES細胞係由人或小鼠等哺乳動物之初期胚(例如胚囊)的內部細胞塊所樹立，為具有多能性和自我複製所致之增殖能力之幹細胞。ES細胞係在小鼠中於1981年所發現(M.J.Evans and M.H.Kaufman(1981),Nature 292：154-156)，其後在人、猴等靈長類中亦有樹立ES細胞株(J.A.Thomson et al.,(1998),Science 282：1145-1147；J.A.Thomson et al.,(1995),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92：7844-7848；J.A.Thomson et al.,(1996),Biol.Reprod.,55：254-259；J.A.Thomson and V.S.Marshall(1998),Curr.Top.Dev.Biol.,38：133-165)。ES細胞係可由對象動物之受精卵的胚囊取出內部細胞塊，藉由將內部細胞塊在纖維母細胞之餵養細胞上培養而樹立。關於人以及猴之ES細胞的樹立和維持之方法，係記載於例如USP5,843,780；Thomson JA,et al.,(1995),Proc Natl.Acad.Sci.U S A.92：7844-7848；Thomson JA,et al.,(1998),Science.282：1145-1147；Suemori H.et al.,(2006),Biochem.Biophys.Res.Commun.,345：926-932；Ueno M.et al.,(2006),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：9554-9559；Suemori H.et al.,(2001),Dev.Dyn.,222：273-279；Kawasaki H.et al.,(2002),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99：1580-1585；Klimanskaya I.et al.,(2006),Nature.444：481-485等。或者，ES細胞亦可僅只使用胚囊期以前之卵裂期的胚之單一***球樹立(Chung Y.et al.,(2008),Cell Stem Cell 2：113-117)，亦可使用停止發育之胚樹立(Zhang X.et al.,(2006),Stem Cells 24：2669-2676.)。就「ES細胞」而言，若為小鼠ES細胞，可利用inGenious targeting laboratory公司、理研(理化學研究所)等所樹立之各種小鼠ES細胞株，若為人ES細胞，可利用威斯康辛大學、NIH、理研、京都大學、國立成育醫療研究中心以及Cellartis公司等所樹立之各種人ES細胞株。例如就人ES細胞株而言，可利用ESI Bio公司所分讓之CHB-1至CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1至HUES28株等，WiCell Research所分讓之H1株、H9株等，理研所分讓之KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。

nt ES細胞係源自藉由核移植技術所製作之純株胚之ES細胞，與源自受精卵之ES細胞幾乎具有相同之特性(Wakayama T.et al.,(2001),Science,292：740-743；S.Wakayama et al.,(2005),Biol.Reprod.,72：932-936；Byrne J.et al.,(2007),Nature,450：497-502)。亦即，由源自藉由將未受精卵的核與體細胞的核置換所得到純株胚的胚囊的內部細胞塊所樹立之ES細胞為nt ES(nuclear transfer ES)細胞。為了nt ES細胞的製作，利用核移植技術(Cibelli J.B.et al.,(1998),Nature Biotechnol.,16：642-646)和ES細胞製作技術(上述)之組合(若山清香等人(2008)，實驗醫學，26卷，5號(增刊)，47至52頁)。在核移植時，於哺乳動物之經除核之未受精卵，注入體細胞的核，以數小時培養可初期化。

多能性生殖幹細胞係源自生殖幹細胞(GS細胞)之多能性幹細胞。此細胞係和ES細胞同樣可分化誘導為各種系列之細胞，例如帶有移植於小鼠胚囊時可作出嵌合小鼠等性質(Kanatsu-Shinohara M.et al.,(2003)Biol.Reprod.,69：612-616；Shinohara K.et al.,(2004),Cell,119：1001-1012)。以包含源自神經膠細胞系之神經營養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF))之培養液可自我複製，又藉由在和ES細胞同樣的培養條件下重複繼代，可得到生殖幹細胞(竹林正則等人(2008)，實驗醫學，26卷，5號(增刊)，41至46頁，羊土社(東京，日本))。

EG細胞係由胎生期之始原生殖細胞所樹立，係帶有和ES細胞同樣的多能性之細胞。可藉由在LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)等物質之存在下培養始原生殖細胞而樹立(Matsui Y.et al.,(1992),Cell,70：841-847；J.L.Resnick et al.,(1992),Nature,359：550-551)。

1-1. T細胞之分化誘導

幹細胞之成為T細胞之分化誘導，只要可分化為T細胞即沒有別限制而可使用周知之方法。在使用多能性幹細胞作為幹細胞之情形，上述成為T細胞之分化誘導係可包含例如，(1)使多能性幹細胞分化為造血前驅細胞之步驟(process)，以及(2)使該造血前驅細胞分化為T細胞之步驟。

(1)使多能性幹細胞分化為造血前驅細胞之步驟

本說明書中，所謂「造血前驅細胞(Hematopoietic Progenitor Cells(HPC))」係指CD34陽性細胞，較佳係CD34/CD43雙陽性(DP)細胞。本發明中，造血前驅細胞和造血幹細胞並沒有區別，若沒有特別限定係表示相同之細胞。

就由多能性幹細胞成為造血前驅細胞之分化方法而言，只要可分化為造血前驅細胞即沒有特別限制，可舉例如國際公開第2013/075222號、國際公開第2016/076415號以及Liu S.et al.,Cytotherapy,17(2015)；344-358等中所記載，在成為造血前驅細胞之誘導培養基中培養多能性幹細胞之方法。

本發明中，成為造血前驅細胞之誘導培養基沒有特別限制特，可將動物細胞培養中所使用之培養基調製作為基礎培養基。就基礎培養基而言，可舉例如杜爾貝寇培養基(例如，IMDM)、伊格爾培養基(例如，DMEM、EMEM、BME、MEM、αMEM)、哈姆培養基(例如，F10培養基、F12培養基)、RPMI培養基(例如，RPMI-1640培養基、RPMI-1630培養基)、MCDB培養基(例如，MCDB104、107、131、151、153培養基)、費雪(Fischer)培養基、199培養基、靈長類ES細胞用培養基(靈長類ES/iPS細胞用培養液，ReproCELL公司)、小鼠ES細胞用培養基(TX-WES培養液，Thrombo X公司)、無血清培養基(mTeSR，Stemcell Technology公司)、ReproFF、StemSpan(註冊商標)SFEM、StemSpan(註冊商標)H3000、StemlineII、ESF-B培養基、ESF-C培養基、CSTI-7培養基、Neurobasal培養基(Thermo Fisher Scientific公司)、StemPro-34培養基、StemFit(註冊商標)(例如，StemFit AK03N,StemFit AK02N)等，惟不限定於此等者。再者，此等的培養基視需要亦可混合等而進行使用，可舉例如DMEM/F12培養基等。

視需要在基礎培養基中亦可含有培養基添加物等，就該培養基添加物而言，可舉例如血清、維生素C類(例如，抗壞血酸)、蛋白素、 胰島素、轉鐵蛋白，硒化合物(例如，亞硒酸鈉)、脂肪酸、微量元素、2-巰基乙醇、硫甘油(例如，α-單硫甘油(MTG))、脂質、胺基酸、L-麩胺酸、L-丙胺醯基-L-麩胺酸(例如，Glutamax(註冊商標))、非必須胺基酸、維生素、增殖因子、低分子化合物、抗生素(例如，青黴素、鏈黴素)、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類、細胞介素等。

本發明中所謂維生素C類，係意指L-抗壞血酸以及其衍生物，所謂L-抗壞血酸衍生物係意指在生體內因酵素反應而成為維生素C者。就本發明中所使用之抗壞血酸衍生物而言，例示有磷酸維生素C(例如：Ascorbic acid 2-phosphate)、抗壞血酸葡糖苷、抗壞血酸乙酯、維生素C酯、抗壞血酸四己癸酸酯、抗壞血酸硬脂酸酯以及抗壞血酸-2磷酸-6十六酸酯。較佳為磷酸維生素C(例如，Ascorbic acid 2-phosphate)，可舉例如磷酸-L-抗壞血酸Na或磷酸-L-抗壞血酸Mg等磷酸-L-抗壞血酸鹽。

於使用維生素C類之情形，維生素C類較佳係每4日、每3日、每2日，或每1日另外添加(補充)，每1日添加者更佳。某實施形態中，該維生素C類係在培養液中添加有相當於5ng/ml至500ng/ml之量(例如，相當於5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml之量)。另一實施形態中，該維生素C類係在培養液中添加有相當於5μg/ml至500μg/ml之量(例如，相當於5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml之量)。

步驟(1)中所使用之培養基亦可進一步添加有由BMP4(Bone morphogenetic protein 4)、VEGF(vascular endothelial growth factor)、SCF(Stem cell factor)、TPO(促血小板生成素)、FLT-3L(Flt3 Ligand)、bFGF(basic fibroblast growth factor)所構成的群選擇之至少1種之細胞介素。再佳係添加BMP4、VEGF以及bFGF之培養，更佳係添加BMP4、VEGF、SCF以及bFGF之培養。

於使用細胞介素之情形，培養基中之濃度係例如BMP4可為5ng/ml至500ng/ml，VEGF可為5ng/ml至500ng/ml，SCF可為5ng/ml至100ng/ml，TPO可為1ng/ml至100ng/ml，FLT-3L可為1ng/ml至100ng/ml，bFGF可為5ng/ml至500ng/ml。

又，前述培養基中亦可添加TGFβ阻礙劑。所謂TGFβ阻礙劑係干涉TGFβ家族之信號傳遞之低分子阻礙劑，包含例如SB431542、SB202190(以上，R.K.Lindemann et al.,Mol.Cancer 2：20(2003))、SB505124(GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908、SD208(Scios)、LY2109761、LY364947、LY580276(Lilly Research Laboratories)等。例如，TGFβ阻礙劑為SB431542之情形，培養基中的濃度係以0.5μM至100μM較佳。

多能性幹細胞之培養亦可為接著培養或懸浮培養。接著培養之情形，亦可使用經被覆細胞外基質成分之培養容器進行，又亦可與餵養細胞共培養。就餵養細胞而言沒有特別限定，可舉例如纖維母細胞(小鼠胎仔纖維母細胞(MEF)、小鼠纖維母細胞(STO)等)。餵養細胞為以本身周知的方法例如以放射線(伽瑪線等)照射或抗癌劑(絲裂黴素C(Mitomycin-C)等)處理等不活化者較佳。就細胞外基質成分而言，可舉例如基質膠(Niwa A,et al.,PLoS One.6(7)：e22261,2011)、明膠、膠原蛋白、彈性蛋白等纖 維性蛋白質；玻尿酸、硫酸軟骨膠等醣胺聚醣或蛋白多醣、纖網蛋白、玻連蛋白、層連結蛋白等細胞接著性蛋白質等。

所謂懸浮培養，係將細胞於培養容器以非接著之狀態培養，若沒有特別限定，可使用未經使其與細胞之接著性提升為目的之人為的處理(例如藉由細胞外基質等之被覆處理)之培養容器，或者，經進行抑制人為的接著之處理(例如藉由聚甲基丙烯酸羥基乙酯(poly-HEMA)或非離子性界面活性多元醇(Pluronic F-127等)之被覆處理)之培養容器而進行。於懸浮培養時使胚樣體(EB)形成進行培養為較佳。

本發明中，造血前驅細胞亦可由以培養多能性幹細胞所得之網狀構造物(亦稱為ES-sac或iPS-sac)調製。在此，所謂「網狀構造物」係指在源自多能性幹細胞之立體的嚢狀(於內部帶有空間者)構造體，以內皮細胞集團等所形成，於內部包含造血前驅細胞之構造體。

培養溫度之條件沒有特別限制，惟例如37℃至42℃左右，37℃至39℃左右較佳。又，關於培養期間，只要為本領域中具有通常知識者同時進行監測造血前驅細胞之數等，即可作適當的決定。只要能得到造血前驅細胞，日數並沒有特別限定，例如至少6日間以上、7日以上、8日以上、9日以上、10日以上、11日以上、12日以上、13日以上、14日以上，較佳為14日。若培養期間長，在造血前驅細胞之製造通常不會發生問題，惟例如較佳為35日以下，再佳為21日以下。又，可以低氧條件培養，本發明之低氧條件可例示如15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%或該等以下之氧濃度。

(2)使造血前驅細胞分化為T細胞之步驟

就由造血前驅細胞成為T細胞之分化方法而言，只要可將造血前驅細胞分化為T細胞即沒有特別限制，可舉例如如同於國際公開第2016/076415號或國際公開第2017/221975號等中所記載，與以由造血前驅細胞誘導T細胞之方法相同之培養條件，培養造血前驅細胞之方法。

本發明中，就成為T細胞之分化誘導培養基而言，沒有特別限制，可將動物細胞培養所使用之培養基作為基礎培養基進行調製。又，視需要於基礎培養基中亦可含有培養基添加物等。就基礎培養基以及培養基添加物而言，可舉例如與上述步驟(1)中所使用者相同者。

步驟(2)中使用維生素C類之情形，維生素C類係可舉例如與步驟(1)中所記載者相同者同樣地進行添加。某實施形態中，培養基中或培養液中的維生素C類之濃度係以5μg/ml至200μg/ml較佳。另一實施形態中，該維生素C類在培養液中係添加相當於5μg/ml至500μg/ml之量(例如相當於5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml之量)。

步驟(2)中，使用p38阻礙劑及/或SDF-1(Stromal cell-derived factor 1)較佳。本發明中所謂「p38阻礙劑」係意指阻礙p38蛋白質(p38MAP激酶)的機能之物質，可舉例如p38之化學的阻礙劑、p38之顯性負向變異體或編碼之核酸等，但不限定於此等。

就本發明中所使用p38之化學的阻礙劑而言，可例示SB203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲磺醯基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)及其衍生物、SB202190(4-(4-氟苯基)-2-(4-羥基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)及其衍生物、SB239063(反式-4-[4-(4-氟苯基)-5-(2-甲氧基-4-嘧啶基)-1H- 咪唑-1-基]環已醇)及其衍生物、SB220025及其衍生物、PD169316、RPR200765A、AMG-548、BIRB-796、SClO-469、SCIO-323、VX-702、FR167653，惟不限定於此等。此等之化合物可為市售者，關於例如SB203580、SB202190、SC239063、SB220025以及PD169316係可由Calbiochem公司購入，關於SClO-469以及SCIO-323係可由Scios公司等購入。就p38之化學的阻礙劑而言以SB203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲磺醯基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)及其衍生物較佳。

本發明中所使用之p38之顯性負向變異體可舉例如使位於p38之DNA結合領域之180位的蘇胺酸點變異為丙胺酸之p38T180A，使人以及小鼠中的p38之182位的酪胺酸點變異為苯基丙胺酸p38Y182F等。p38阻礙劑在培養基中含有約1μM至約50μM之範圍。使用SB203580作為p38阻礙劑之情形在培養基中得含有1μM至50μM、5μM至30μM、10μM至20μM之範圍。

本發明中所使用之SDF-1並非僅止為SDF-1α或其成熟型，亦可為SDF-1β、SDF-1γ、SDF-1δ、SDF-1ε或SDF-1φ等同功型或該等的成熟型，又亦可為此等的為任意比例之混合物等。較佳係使用SDF-1α。此外，SDF-1亦有時稱為CXCL-12或PBSF。

本發明中，SDF-1只要具有作為該趨化介素之活性，其胺基酸序列中亦可有1個或數個胺基酸為缺失、置換、***及/或加成者(將此種的胺基酸經缺失、置換、***及/或加成之SDF-1亦稱為「SDF-1變異體」)。又同樣地，SDF-1或SDF-1變異體中，糖鏈亦可為缺失、置換、***及/或加成者。就上述SDF-1之變異體而言，可舉例如保有至少4個半胱胺酸殘 基(於人SDF-1α之情形，係Cys30、Cys32、Cys55以及Cys71)，且相對於天然體的胺基酸序列而言具有90%以上之同一性者等，惟不限定於此種胺基酸變異者。SDF-1可為哺乳動物之SDF-1，例如人，或亦可為例如猴、羊、牛、馬、豬、犬、貓、兔、大鼠、小鼠等非人之哺乳動物者。例如，就人之SDF-1α而言，可使用於GenBank登錄為登錄編號：NP_954637之蛋白質，就SDF-1β而言，可使用於GenBank登錄為登錄編號：NP_000600之蛋白質。

SDF-1亦可使用市售者，亦可使用由天然所精製而成者，或亦可使用藉由肽合成或基因工學的手法所製造者。SDF-1在培養基中係含有例如約10ng/ml至約100ng/ml之範圍。又，亦可使用具有如同SDF-1之活性之SDF-1代替物以取代SDF-1。就此種的SDF-1代替物而言可例示CXCR4促效劑，亦可將具有CXCR4促效劑活性之低分子化合物等作為取代SDF-1而添加於培養基中。

步驟(2)中所使用之培養基中，亦可將由SCF、TPO(促血小板生成素)、FLT-3L以及IL-7所構成的群所選擇之細胞介素之至少1種，較佳為全部進一步添加於培養液。此等的濃度可為例如，SCF為10ng/ml至100ng/ml，TPO為10ng/ml至200ng/ml，IL-7為1ng/ml至100ng/ml，FLT-3L為1ng/ml至100ng/ml。

步驟(2)中，亦可將造血前驅細胞進行接著培養或懸浮培養，接著培養之情形，亦可被覆培養容器而使用，又亦可與餵養細胞進行共培養。就共培養之餵養細胞而言，可例示如骨髓間質細胞株OP9細胞(可由理研BioResource Center購入)。該OP9細胞較佳係使DLL4或DLL1恆常 地表現之OP9-DL4細胞或OP9-DL1細胞(例如，Holmes R1 and Zuniga-Pflucker JC.Cold Spring Harb Protoc.2009(2))。本發明中使用OP9細胞作為餵養細胞之情形，可藉由另行準備之DLL4或DLL1，或者藉由將DLL4或DLL1與Fc等的融合蛋白質適當地添加於培養基而進行。使用餵養細胞之情形，較佳為適宜交換該餵養細胞而進行培養。餵養細胞之交換，係可藉由將培養中的對象細胞移至事先經播種之餵養細胞上而進行。該交換可每5日、每4日、每3日、或每2日進行。又，懸浮培養胚狀體型而得到造血前驅細胞之情形，使其解離為單細胞後進行接著培養較佳。可與餵養細胞共培養，惟較佳係不使用餵養細胞進行培養。

於接著培養之情形，就被覆培養容器時之被覆劑而言，可舉例如基質膠(Niwa A,et al.,PLos One,6(7)：e22261,2011))、膠原蛋白、明膠、層連結蛋白、硫酸肝素蛋白多醣、RetroNectin(註冊商標)，DLL4或DLL1，或DLL4或DLL1與抗體之Fc區域(以下有稱為Fc。)等的融合蛋白質(例如，DLL4/Fc chimera)、巢蛋白，及/或此等的組合，以RetroNectin以及DLL4與Fc等的融合蛋白質之組合較佳。

步驟(2)中，培養溫度條件沒有特別限制，惟例如約37℃至約42℃左右、約37℃至約39℃左右較佳。又，關於培養期間，本領域中具有通常知識者監測T細胞之數等之同時，可作適當的決定。只要能得到T細胞，日數並沒有特別限定，例如典型的為至少10日間以上、12日以上、14日以上、16日以上、18日以上，或20日以上，較佳為21日。又，較佳為90日以下，再佳為42日以下。

藉由以上之步驟所得到之細胞集團中可含有T細胞，惟步驟(2)可進一步包含有下列步驟(3)。

(3)使T細胞濃縮之步驟

就使T細胞濃縮之方法而言，只要使T細胞濃縮即沒有特限制，可舉例如國際公開第2016/076415號以及國際公開第2017/221975號等所記載，以與由CD4CD8雙陽性T細胞誘導CD8陽性T細胞之步驟同樣的培養條件，培養T細胞之方法。

本說明書中，所謂「濃縮」，係指使細胞的組成物等組成物中特定的構成成分比例增加，所謂「經濃縮」，例如為了說明使用細胞集團之情形，係指細胞的組成物之特定構成成分的量與濃縮前細胞集團中該等構成成分之比例相比有增加之細胞集團。例如，可濃縮細胞集團等組成物之關於標的細胞型，因此，標的細胞型的比例與濃縮前的細胞集團內所存在之標的細胞的比例相比為增加。細胞集團藉由本技術領域所周知的細胞選擇以及選別方法，亦可針對標的細胞型進行濃縮。細胞集團係可以本說明書中所記載特定之培養方法，藉由選別或選擇程序進行濃縮。本發明之特定實施形態中，藉由濃縮標的細胞集團之方法，使細胞集團之關於標的細胞集團至少濃縮10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%。

本說明書中，所謂「細胞集團」係意指相同種類或相異種類2種以上之細胞。「細胞集團」亦意指相同種類或相異種類之細胞一塊(mass)。

本發明中，就T細胞的濃縮所使用之培養基而言，沒有特別限制，惟可調製動物細胞之培養所使用之培養基作為基礎培養基。視需要於基礎培養基亦可含有培養基添加物等。就基礎培養基以及培養基添加物而言，可舉例如與上述步驟(1)中所使用之相同者。

步驟(3)中使用維生素C類之情形，維生素C類可舉例與步驟(1)中所記載之相同者，同樣地進行添加。某實施形態中，培養基中或培養液中的維生素C類之濃度係以5μg/ml至200μg/ml較佳。另一實施形態中，該維生素C類在培養液中添加有相當於5μg/ml至500μg/ml之量(例如相當於5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml之量)。

步驟(3)中使用荷爾蒙之情形，就荷爾蒙而言可舉例如腎上腺皮質素。腎上腺皮質素可例示如葡萄糖皮質素或其衍生物、乙酸皮質酮、氫化皮質酮、乙酸氟可體松、腎上腺皮質酮、去炎松、甲基腎上腺皮質酮、***、倍他米松、貝克每松。較佳係***。腎上腺皮質素為***之情形，培養基中的該濃度係1nM至100nM。

步驟(3)中，培養基中可含有CD3/TCR複合體促效劑。CD3/TCR複合體促效劑只要為可藉由與CD3/TCR複合體進行特異的結合並由CD3/TCR複合體傳遞信號於T細胞內之分子則沒有特別限制。就CD3/TCR複合體促效劑而言，可舉例如CD3促效劑及/或TCR促效劑。就CD3促效劑而言係抗CD3促效劑抗體(亦簡稱為「抗CD3抗體」)或其結合片段，就TCR促效劑而言可舉例如由抗TCR促效劑抗體(亦簡稱為「抗TCR抗體」)或其結合片段、MHC/抗原肽複合體或其多量體以及MHC/ 超級抗原複合體或其多量體所構成的群選擇之至少一個。使用抗CD3抗體之情形，抗CD3抗體係同時包含多株抗體以及單株抗體，較佳係單株抗體。 又，該抗體可為屬於IgG、IgA、IgM、IgD或IgE中任一之免疫球蛋白型者，較佳係IgG。就抗CD3抗體而言，可舉例如由OKT3純株所產生之抗體(OKT3)以及由UCHT1純株所產生之抗體(UCHT1)等，較佳係UCHT1。 抗CD3抗體之培養基中的濃度係例如10ng/ml至1000ng/ml，較佳為50ng/ml至800ng/ml，再佳為250ng/ml至600ng/ml。上述CD3/TCR複合體促效劑亦可使用市售者，亦可使用由天然所精製而成者，或亦可使用藉由肽合成、基因工學的手法或化學的合成法所製造者。例如，OKT3以及UCHT1可由ThermoFisher公司或GeneTex公司等購入。

步驟(3)中使用細胞介素之情形，就細胞介素而言，可舉例如IL-2以及IL-7等。細胞介素為IL-2之情形，培養基中的該濃度係10U/ml至1000U/mL，細胞介素為IL-7之情形，培養基中的該濃度係1ng/ml至1000ng/mL。

步驟(3)中，培養溫度條件沒有特別限定，惟例如約37℃至約42℃左右，約37℃至約39℃左右較佳。又，關於培養期間，本領域中具有通常知識者進行監測T細胞之數等之同時，可作適當的決定。細胞只要濃縮者，日數並沒有特別限定，例如為至少1日以上、2日以上、3日以上、4日以上、5日以上、較佳為6日。又，較佳為28日以下，再佳為14日以下。

構成T細胞細胞庫之T細胞亦可適當調整內因性基因之表現。具體而言，構成T細胞細胞庫之T細胞，由使異體移植之排斥反應減 低之觀點而言，至少1種(例如，1種、2種、3種、6種、9種)之HLA(人白血球型抗原基因)基因之表現受抑制，或使該HLA基因缺失者較佳。因此，本發明之一態樣中，本發明之提供系統係包含至少1種之HLA基因之表現受抑制之T細胞。本說明書中，針對HLA基因之表現之抑制，係指亦包含該基因之缺失者。

就上述HLA基因而言，具體而言可舉例如係由類型I之HLA(亦即HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F以及HLA-G)基因以及類型II之HLA(亦即HLA-DR、HLA-DQ以及HLA-DP)基因所構成的群選擇之1種以上之HLA基因。或者，亦可使上述HLA基因之表現或呈現於細胞表面為重要之基因之表現受到抑制。就如此之基因而言，可舉例如編碼HLA類型1之HLA呈現於細胞表面為重要蛋白質之B2M之B2M基因、編碼類型II之HLA基因之表現為重要蛋白質之CIITA之CIITA基因等。另一方面，由於HLA基因之表現受到抑制，以HLA基因表現受抑制之細胞易於成為自然殺手(NK)細胞的標的而言，為了避免成為該NK細胞之標的，較佳係使CD47基因表現過剩，或僅只使HLA-A基因及HLA-B基因之2基因之表現受到抑制，使NK細胞的攻撃迴避重要之HLA-C基因，與HLA-E基因、HLA-F基因以及HLA-G基因之表現持續(此時，亦可不使類型II之HLA基因之表現受到抑制，惟由免疫適合性之觀點而言，抑制該基因之表現者較佳)。因此，較佳態樣中，作為表現抑制的對象之HLA基因之組合而言，可舉例如(i)HLA-A基因以及HLA-B基因之組合；(ii)HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-DR基因、HLA-DQ基因以及HLA-DP基因之組合；及(iii)HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-C基因、HLA- E基因、HLA-F基因、HLA-G基因、HLA-DR基因、HLA-DQ基因以及HLA-DP基因之組合。上述中將屬於人的主要組織適合基因複合體(MHC)之HLA作為一例進行說明，惟使用人以外之MHC之情形，亦同樣地使至少1種之MCH基因之表現受抑制較佳。

就抑制HLA基因之表現之方法而言，可適當地使用周知之方法，例如可將HLA mRNA、B2M mRNA，及/或CIITA mRNA作為標的之siRNA、shRNA、miRNA、反義寡核苷酸、核糖核酸酵素導入於由多能性細胞成為T細胞之分化階段之細胞(例如，多能性幹細胞、造血前驅細胞(CD34+/CD43+)、ProT細胞(CD4-/CD8-)、CD3+/CD4+/CD8+T細胞、CD3+/CD4-/CD8+T細胞，或其他之細胞(例如，CD3-/CD4+/CD8+細胞等)等)，或者，將編碼該分子之核酸藉由下述之方法導入於該細胞，使HLA基因之表現減弱。或者，藉由編集基因體(例如，CRISPR系統、TALEN、ZFN等)，將細胞內之HLA基因、B2M基因，及/或CIITA基因進行基因剔除。

又，構成T細胞細胞庫之T細胞較佳係將該TCR鏈之表現藉由siRNA，或對於投與T細胞之被驗者為無害之周知的外因性TCR導入等，藉此抑制該T細胞中內在之TCR之表現。在適用藉由前述siRNA的方法之情形，為了迴避針對外因性TCR之siRNA的效果，將編碼該TCR之核酸之鹼基序列，與抑制內在性TCR鏈表現的siRNA作用之RNA所對應之鹼基序列為相異之序列(密碼子變換型序列)者較佳。此等的方法係記載於例如國際公開第2008/153029號。前述之鹼基序列可於編碼天然取得之TCR之核酸導入緘默突變，或可藉由化學地合成人為設計之核酸而製 作。或者，為了避免與內在性TCR鏈之錯誤配對，亦可將編碼導入的TCR之核酸的恆定區域中一部或全部，置換為源自被檢者以外的動物之恆定區域。

又，構成T細胞細胞庫之T細胞亦可導入包含外因性基因之核酸，亦可表現有該外因性基因之產物。

就上述外因性基因而言沒有特別限制，可使用編碼有助於T細胞的機能調控之蛋白質、細胞介素、趨化介素等之外因性基因。就上述外因性基因而言，可舉例如編碼嵌合抗原受體(CAR)之基因(以下亦稱為「CAR基因」。)、編碼外因性T細胞受體(TCR)之基因(以下亦稱為「TCR基因」。)等。由經導入於細胞之基因所表現之上述CAR以及TCR係可辨識並結合抗原及/或該抗原-HLA複合體。本說明書中，所謂編碼TCR之核酸，係意指核酸包含編碼形成TCR之一方的鏈之鹼基序列，及編碼另一方的鏈之鹼基序列。

本說明書中所使用所謂「可結合(capable of binding)」之用語，係「具有結合能力(having an ability to bind)」之意，係指與1個或其以上之其他分子形成非共價結合複合體之能力。用以決定結合能之各式各樣的方法以及測定，在本技術領域中係周知者。結合通常係具有高親和性之結合，以KD值所測定之結合親和性(binding affinity)，較佳係未達1μM，再佳係未達100nM，再更佳係未達10nM，再更佳係未達1nM，又更佳係未達100pM，又更佳係未達10pM，最佳係未達1pM。所謂「KD」或「KD值」這樣的用語，係有關於在本技術領域中周知的平衡解離定數，係表示分子間之結合親和性。KD值越小表示結合親和性越高。

本發明中所使用之TCR中，不只TCR之α鏈和β鏈不只為構成異型二聚體者(亦即αβTCR)，或者TCR之γ鏈和δ鏈構成異型二聚體者(亦即γδTCR)，亦包含構成同型二聚體者。再者，亦可使用恆定區域之一部或全部缺損者，或胺基酸序列經重組者。

又，關於上述之TCR鏈之恆定區域，其來源之細胞毒性T細胞(CTL)純株之TCR鏈之恆定區域中，亦可實施預定的改變。就此改變而言，可舉例如，藉由將CTL純株之TCR恆定區域之特定的胺基酸殘基置換為半胱胺酸殘基，使TCR鏈間之二硫化物結合所致之二聚體表現效率亢進等，惟不限定於此等。

又，上述TCR亦可為改變體，以下中若沒有特別限定，TCR為亦包含該改變體者。就此種的改變體而言，可舉例如經本發明者們所開發，將包含由α鏈、β鏈、γ鏈以及δ鏈所構成的群選擇之TCR鏈之恆定區域的2個多肽組合，所形成之T細胞受體之改變體等。TCR之改變體係指不含有TCRα鏈以及β鏈之互補性決定區域(CDR)，或同一種類的鏈之互補性決定區域(CDR)(較佳係包含該CDR之可變區域的部分或全部)之任一者，以及，不含有恆定區域來源之T細胞受體鏈之互補性決定區域(CDR)，或同一種類的鏈之互補性決定區域(CDR)(較佳係包含該CDR之可變區域的部分或全部)為其特徵。因此，上述改變體中係指不包含天然型或人工型(例如，成為恆定區域和可變區域來源之動物種為相異)之αβTCR、γδTCR，或此等之TCR中進一步經加成胺基酸之TCR改變體。例如，該當於本發明之改變體之至少一方的鏈之多肽，在包含T細胞受體α鏈之恆定區域之情形，該多肽中T細胞受體α鏈之互補性決定區域，較佳係不包 含含有該互補性決定區域之可變區域之部分或全部，惟可包含除了α鏈以及β鏈以外之相異的TCR鏈，例如γ鏈、δ鏈之CDR或可變區域。同樣地，該當於上述改變體之至少一方的鏈之多肽，在包含T細胞受體β鏈之恆定區域之情形，該多肽中T細胞受體β鏈之互補性決定區域，較佳係不包含含有該互補性決定區域之可變區域之部分或全部，惟可包含除了α鏈以及β鏈以外之相異的TCR鏈，例如γ鏈、δ鏈之CDR或可變區域。關於γ鏈以及δ鏈亦相同。

上述之TCR亦可加成有膜移行信號肽(以下亦稱為「信號肽」)。就信號肽而言，可使用源自編碼CD8、Immunoglobulin-H(IGH)、CD4之外，源自具有膜貫通結構域之各種肽之基因之膜移行信號肽及/或，該信號肽之胺基酸序列中1個或數個(例如2個、3個、4個、5個)胺基酸為缺失、置換、***及/或加成之胺基酸序列，或與該信號肽之胺基酸序列具有同一性之胺基酸序列所構成之信號肽。加成有信號肽之情形之結合位置以及信號肽之數沒有特別限定。

本發明中所謂「嵌合抗原受體(CAR)」，係意指含有抗原結合結構域、膜貫通結構域，和細胞內信號傳遞結構域之融合蛋白質。CAR之抗原結合結構域係含有使抗體之可變區域之輕鏈(VL)和重鏈(VH)經由連接子(例如，由G和S所構成之連接子(GS連接子))等的間隔物直列地進行結合之短鏈抗體(scFv)。使CAR表現之T細胞係在scFV領域辨識抗原後，將該辨識信號透過細胞內信號傳遞結構域傳遞於T細胞內。藉由將CAR導入於T細胞中，形成可賦予針對目的抗原之特異性。又，由於CAR可不依存於HLA類型I或類型II而直接辨識抗原分子，因此即使對於HLA類 型I或類型II基因之表現降低之細胞而言，亦可引發高度的免疫反應。就前述CAR為標的之抗原而言，可舉例如與前述TCR為標的之上述抗原相同之抗原。

就CAR之膜貫通結構域而言，可舉例如源自由TCR之α鏈、β鏈或ζ鏈、CD28、CD3ε鏈、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、4-1BB(CD137)以及CD154所構成的群選擇之1種以上蛋白質之膜貫通結構域等，惟不限定於此等。亦可使用源自連結於抗原結合結構域之最初的細胞內信號傳遞結構域之分子之膜貫通結構域，例如，源自連結於抗原結合結構域之最初的細胞內信號傳遞結構域之分子為CD28之情形，膜貫通結構域也亦可源自於CD28。或者亦可使用人為的設計之膜貫通結構域。

就CAR之細胞內信號傳遞結構域而言，可舉例如源自由CD3ζ鏈(TCRζ鏈)、FcRγ鏈、FcRβ鏈、CD3γ鏈、CD3δ鏈、CD3ε鏈、CD5、CD22、CD79a、CD79b以及CD66d所構成的群選擇之1種以上之蛋白質之細胞內結構域，惟不限定於此等。此等之中，源自CD3ζ鏈之細胞內信號傳遞結構域較佳。又，細胞內信號傳遞結構域中，亦可進一步含有共刺激分子之細胞內結構域，就如此之共刺激分子而言，可舉例如由CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴球功能性抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及CD83所構成的群選擇之1種以上的蛋白質之細胞內結構域。藉由選擇使其結合之共刺激分子的種類或數目，可調控CAR活性之強度或持續時間(例如，Mol Ther.2009；17：1453-1464.)。

在CAR之抗原結合結構域和膜貫通結構域之間，或在CAR之細胞內信號傳遞結構域和膜貫通結構域之間，亦可組入間隔物，就該間隔物而言，可使用通常為300胺基酸以下，較佳為10至100胺基酸，最佳為25至50胺基酸所構成之肽。具體而言，可舉例如包含源自IgG1之鉸鏈區域，或免疫球蛋白之CH2CH3區域和CD3一部分之肽等，惟不限定於此等。

就具體的CAR而言，將scFV和CD3ζ鏈經由間隔物結合之第1世代之CAR，為了增強對於T細胞之活性化能，可列舉在第1世代之CAR之scFV和CD3ζ鏈之間，組***源自CD28之膜貫通結構域和細胞內結構域之第2世代CAR，以及，在第2世代之CAR之CD28的細胞內結構域和CD3ζ鏈之間，組***與CD28相異之共刺激分子(4-1BB或OX40)的細胞內結構域之第3世代CAR，惟不限定於此等。

就本發明中所使用之CAR更具體而言，可舉例如包含作為抗原結合結構域之辨識CD19之scFv、作為膜貫通結構域之CD8之膜貫通結構域、作為細胞內信號傳遞結構域之源自CD28之細胞內結構域、源自CD30之細胞內結構域、源自4-1BB之細胞內結構域、源自CD3ζ鏈之細胞內結構域之嵌合抗原受體。細胞內信號傳遞結構域所含有之上述各細胞內結構域之順序沒有特別限制，例如順序為含有源自CD28之細胞內結構域，源自CD30之細胞內結構域或源自4-1BB之細胞內結構域，源自CD3ζ鏈之細胞內結構域。更具體而言，本發明之嵌合抗原受體係由例如，根據序列編號4或5所表示之胺基酸序列，或以序列編號4或5所表示之胺基酸序列之中1或2個以上(較佳為1至100個左右，較佳為1至50個 左右，更佳為1至10個左右，特佳為1至數個(2、3、4或5)個)胺基酸為缺失、置換、***及/或加成之胺基酸序列所構成。

又，就源自CD30之細胞內結構域而言，可舉例如以序列編號7所表示之胺基酸序列之中1或2個以上(較佳為1至100個左右，較佳為1至50個左右，更佳為1至10個左右，特佳為1至數個(2、3、4或5)個)胺基酸為缺失、置換、***及/或加成之胺基酸序列等。如上述之胺基酸序列為缺失、置換、***及/或加成之情形，該缺失、置換、***及/或加成之位置，只要可保持CD30之細胞內結構域的機能者即沒有特別限定。

就上述TCR或CAR為標的之抗原而言，可舉例如腫瘤抗原，惟不限定於此。腫瘤抗原可為腫瘤特異性抗原(TSA)，亦可為腫瘤關聯抗原(TAA)。就如此之腫瘤抗原具體而言，可舉例如MART-1/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪胺酸酶、TRP-1、TRP-2等分化抗原；WT1、Glypican-3、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15等腫瘤特異性多系列抗原；CEA等胎兒抗原；p53、Ras、HER-2/neu等過剩表現之腫瘤基因或突變之腫瘤抑制基因；BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR等起因於染色體轉位之固有腫瘤抗原，以及，由艾司坦氏-巴爾氏病毒抗原EBVA及人類乳突病毒(HPV)抗原E6以及E7等病毒抗原所構成的群選擇之1種以上之抗原。就其他之腫瘤抗原而言，可舉例如TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-鏈蛋白、CDK4，Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2結合蛋白質\親環蛋白C關聯蛋白質、TAAL6、TAG72、TLP以及TPS，惟不限定於此等。

上述之TCR或CAR(以下有時省略稱為「TCR等」。)可藉由周知之方法確認其得以特異地辨識抗原並進行結合，就適當的方法可舉例如四聚體測定法或ELISPOT測定等。藉由進行ELISPOT測定，可確認將TCR等表現於細胞表面之T細胞，辨識該TCR等所致之標的抗原，並將該信號傳遞於細胞內。

再者，本發明者們以前，與上述CAR同時表現含有IL-15以及IL-15Rα之融合蛋白質(以下有時省略為「IL-15/IL-15Rα」。)之細胞中，與僅表現CAR之細胞進行比較，發現細胞傷害活性上昇。因此，由細胞傷害活性之觀點而言，構成T細胞細胞庫之T細胞，較佳係表現有IL-15/IL-15Rα者，進一步表現有上述CAR者再佳。為了得到表現IL-15/IL-15Rα之T細胞，該IL-15/IL-15Rα基因係導入，由多能性細胞分化為T細胞之分化段階之細胞(例如，多能性幹細胞、造血前驅細胞(CD34+/CD43+)、ProT細胞(CD4-/CD8-)、CD3+/CD4+/CD8+T細胞、CD3+/CD4-/CD8+T細胞，或其他之細胞(例如，CD3-/CD4+/CD8+細胞等)等)中。IL-15/IL-15Rα之導入係以編碼此等之核酸之形態導入細胞中者較佳，如此之導入可與進行上述核酸導入階段時以同樣之方式進行。

在因IL-15所致之信號傳遞系中，通常，抗原提示細胞上表現之IL-15Rα和IL-15結合，藉由對於由CD8陽性CD4陰性細胞上之IL-15Rβ共通γ鏈(γc)所構成之IL-15受體進行提示(trans-presentation)IL-15，可維持CD8陽性CD4陰性細胞之細胞傷害活性。因此，表現IL-15/IL-15Rα之T細胞，於該細胞為CD8陽性CD4陰性之情形，可經由IL-15受體於自己之細胞內傳達IL-15信號。或者，表現IL-15/IL-15Rα之T細胞，經由IL-15受體可於其他之CD8陽性CD4陰性細胞內傳達IL-15信號。如以上所述，IL-15/IL-15Rα由於可維持CD8陽性CD4陰性細胞之細胞傷害活性，對於成為CAR之標的之細胞可期待持續性的細胞傷害效果。

IL-15/IL-15Rα可為膜貫通型蛋白質亦可為分泌型蛋白質。關於IL-15Rα，已知由成熟型蛋白質之N末端起1-65胺基酸之IL-15結合結構域，係用以與IL-15結合之負責區域(Wei X.et al.,J.Immunol.,167：277-282,2001)。因此，膜貫通型蛋白質只要係保持IL-15結合結構域，並且保持IL-15Rα之膜貫通結構域之蛋白質即可。另一方面，就分泌型蛋白質而言，保持IL-15結合結構域，並且IL-15Rα之膜貫通結構域缺失之蛋白質(例如為由IL-15Rα之1-65胺基酸殘基、1-85胺基酸殘基，或1-182胺基酸殘基所構成之蛋白質，或為包含與該胺基酸序列為85%以上(例如，90%、95%、97%、98%、99%)相同之胺基酸序列之肽等)者即可。

IL-15/IL-15Rα亦可在IL-15和IL-15Rα之間組入間隔物，就該間隔物而言，通常係可使用300胺基酸以下，較佳係10至100胺基酸，最佳係由20至50胺基酸所構成之肽。具體而言，可舉例如上述之GS連接子等，惟不限定於此等。

就IL-15/IL-15Rα而言，只要為將IL-15和IL-15Rα融合之蛋白質即沒有特別限制，惟具體而言可舉例如由序列編號7所構成之肽。或者，就IL-15/IL-15R而言，只要與IL-15受體結合，可將IL-15信號傳遞於細胞內則沒有制限，例如，可列舉包含與序列編號7所表示之胺基酸序列約90%以上，較佳為約95%以上，再佳為約97%以上，特佳為約98%以上，最佳為約99%以上具有相同性或同一性之胺基酸序列之肽。在此，所謂「相同性」或「同一性」，係意指使用在該技術領域中所周知之數學的演算法使2個胺基酸序列對準之情形，最適當之對準(較佳之情形，該演算法係用以得到最適當之對準而考慮將序列之一方或兩方之空位導入而所得者)中，對於重疊之全胺基酸殘基之同一胺基酸以及類似胺基酸殘基(同一性之情形，為同一胺基酸殘基)之比例(%)。所謂「類似胺基酸」係意指物理化學的性質中類似之胺基酸，可舉例如芳香族胺基酸(Phe、Trp、Tyr)，脂肪族胺基酸(Ala、Leu、Ile、Val)、極性胺基酸(Gln、Asn)、鹼性胺基酸(Lys、Arg、His)、酸性胺基酸(Glu、Asp)、具有羥基之胺基酸(Ser、Thr)、側鏈小之胺基酸(Gly、Ala、Ser、Thr、Met)等分類為同一群組之胺基酸。可預期因如此的類似胺基酸所致之置換不會使蛋白質之表現型帶來變化(亦即為保守的胺基酸置換)。保守的胺基酸置換之具體例在該技術領域中為周知，於各種之文獻中有所記載(例如參照Bowie等，Science,247：1306-1310(1990))。本說明書中之胺基酸序列之相同性或同一性，係使用相同性計算演算法NCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)，可以以下之條件(期待值=10；容許空位；矩陣=BLOSUM62；過濾=OFF)進行計算。

外因性基因之導入可藉由周知之方法進行，導入核酸為DNA的形態之情形，可藉由例如磷酸鈣共沉澱法、PEG法、電穿孔法、顯微注射法、脂質體轉染(Lipofection)法等進行。例如可使用細胞工學別冊8新細胞工學實驗規程，263-267(1995)(秀潤社發行)，Virology，52卷，456(1973)；日藥理誌(Folia Pharmacol.Jpn.)，第119卷(第6號)，345-351(2002)等所述之方法。於使用病毒載體之情形中，可將核酸視需要而與包裝載體一同導入於適當之包裝細胞(例如Plat-E細胞)或互補細胞株(例如293細胞)，回收培養上清中所產生之病毒載體，藉由因應各病毒載體之適當的方法，使該載體感染細胞，因而可導入於細胞。就如此的病毒載體而言，可舉例如反轉錄病毒載體(包含慢病毒載體或偽型載體)、腺病毒載體、腺相關病毒載體、疱疹病毒載體、仙台病毒病毒載體、附加型載體等。又，亦可使用轉位子表現系統(PiggyBac系統)。就質體載體而言，可舉例如動物細胞表現質體(例如pa1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)等。具體而言，使用反轉錄病毒載體作為載體之具體的手段係開示於國際公開第2007/69666號，Cell,126,663-676(2006)以及Cell,131,861-872(2007)等。尤其，於使用反轉錄病毒載體之情形，藉由使用屬於重組纖網蛋白片段之CH-296(TakaraBio公司製)，使得能針對各種細胞進行高效率的基因導入。導入核酸為DNA之形態之情形而使用病毒載體時，可根據導入對象之細胞的種類適宜選擇病毒載體的種類。於對象細胞為T細胞之情形，較佳係使用反轉錄病毒載體，再佳係使用gamma反轉錄病毒載體。於對象細胞為iPS細胞之情形，較佳係使用慢病毒載體。

導入核酸以RNA之形態導入於直接細胞，亦可使其在細胞內表現導入之基因。就RNA之導入方法而言，可使用周知之方法，例如適合使用者為脂質體轉染法或電穿孔法等。又，初期化因子為蛋白質之形態之情形，可藉由例如脂質體轉染、與細胞膜透過性肽(例如源自HIV之TAT以及聚精胺酸)之融合、顯微注射等手法等導入於細胞。

上述之TCR等係以編碼TCR等之核酸之形態導入於細胞。又，包含IL-15以及IL-15Rα之融合蛋白質，亦以編碼該融合蛋白質之核酸之形態導入於細胞。用以抑制該核酸以及上述HLA基因之表現之核酸可為DNA亦可為RNA，或者亦可為DNA/RNA嵌合，惟較佳為DNA。又，該核酸可為雙股，亦可為單股。為雙股之情形時，可為雙股DNA、雙股RNA或DNA：RNA之混合。核酸為RNA之情形，關於RNA之序列，係將T換讀為U。又，只要該核酸係在生體外(in vitro)或細胞中表現多肽，亦可含有天然核酸、修飾核酸、核酸類似物，或該等之混合物。

上述之核酸係可藉由本身周知的方法進行建構。例如，基於習知之TCR或CAR胺基酸序列或核酸序列進行化學地合成DNA鏈，或者藉由將合成之一部分重疊之Oligo DNA短鏈利用PCR法或Gibson Assembly法進行接續，而可建構編碼TCR或CAR之全長或一部分的DNA。用以抑制HLA基因表現之核酸，以及編碼包含IL-15及IL-15Rα之融合蛋白質的核酸，亦可以同樣的方式建構。

上述之核酸係可組入於表現載體。該載體可為組入標的細胞之基因體之載體，亦可為不組入之載體。一實施態樣中，不組入基因體之載體係可在標的細胞之基因體外側複製。載體亦可在標的細胞之基因體之 外側以複數個複製體之方式存在。本發明之其他實施態樣中，載體係組入於標的細胞之基因體。或者，導入之核酸係藉由基因體編集(例如CRISPR系統、TALEN、ZFN等)所使用之相同重組等，亦可組入於基因體。較佳之實施態樣中，載體等核酸係組入於標的細胞之基因體預先決定之位置。

就上述載體中所使用之啟動子而言，可使用例如EF1α啟動子、CAG啟動子、SRα啟動子、SV40啟動子、LTR啟動子、CMV(巨細胞病毒)啟動子、RSV(勞斯肉瘤病毒)啟動子、MoMuLV(莫洛尼鼠白血病病毒)LTR、HSV-TK(單純疱疹病毒胸苷激酶)啟動子、TCR V α基因啟動子、TCR Vβ基因啟動子等。其中，EF1α啟動子、CAG啟動子、MoMuLV LTR、CMV啟動子、SRα啟動子等較佳。

上述之載體係除了上述啟動子之外，依據期望亦可含有轉錄以及轉譯調節序列、核糖體結合部位、強化子、複製起點、多腺核苷酸化訊息、選擇標記基因等。就選擇標記基因而言，可舉例如二氫葉酸還原酵素基因、新黴素抗性基因、嘌呤黴素抗性基因等。

本發明之一實施態樣中，將包含編碼TCRα鏈之核酸和編碼β鏈之核酸之表現載體導入於標的細胞內，可在標的細胞內或細胞表面構成TCR之α鏈和β鏈之異二聚體。此種情形中，亦可將編碼TCRα鏈之核酸和編碼β鏈之核酸分別組入於不同之表現載體，亦可組入於1個表現載體。於組入1個表現載體之情形，此等2種類之核酸係經由可使多順反子(polycistronic)表現之序列進行組入較佳。藉由使用可使多順反子表現之序列，能夠使組入1種表現載體之複數個基因更有效率地表現。就可使多順反子表現之序列而言，可舉例如2A序列(例如，源自***病毒(FMDV) 之2A序列(F2A)、源自馬鼻炎A病毒(ERAV)之2A序列(E2A)，源自豬破傷風病毒(Porcine teschovirus)(PTV-1)之2A序列(P2A)、源自明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus)(TaV)之2A序列(T2A序列)(PLoS ONE 3,e2532,2008,Stem Cells 25,1707,2007)、內部核糖體進入部位(IRES)(U.S.Patent No.4,937,190)等，由均勻的表現量之觀點而言，P2A序列以及T2A序列較佳。於使用包含編碼TCRγ鏈之核酸和編碼δ鏈之核酸的表現載體之情形亦同。

導入於構成T細胞細胞庫之T細胞之外因性基因，可對於由幹細胞(例如，iPS細胞或ES細胞)分化為T細胞之過程中所產生之細胞進行導入。在此，所謂由幹細胞(例如，iPS細胞或ES細胞)分化為T細胞之過程中所產生之細胞中，亦包含幹細胞(例如，iPS細胞或ES細胞)以及T細胞。

本發明之一形態中，導入於構成T細胞細胞庫之T細胞之外因性基因係對於iPS細胞、造血前驅細胞及/或T細胞導入。

又，本發明之一形態中，於構成T細胞細胞庫之前，可視需要藉由後述之「1-5.擴大培養」中所表示之方法，擴大培養於上述所得到之T細胞。

可將由上述方法所得到之T細胞分注複數個保存容器(無菌小瓶等)中，藉由儲存而建構T細胞主細胞庫。該經儲存之T細胞細較佳為使其凍結。可將此T細胞主細胞庫中之一容器量之T細胞視需要進行融解，供給於適宜特性解析之試驗中。又，可將由同一容器或由不同容器準備之T細胞，視需要藉由後述之「1-5.擴大培養」中所表示之方法而擴大培養，將所得 到之T細胞擴大培養並分注於不同的複數個容器，藉由儲存建構T細胞工作細胞庫。該經儲存之T細胞較佳為使其凍結。

因此，本發明之提供系統，亦可包含建構T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫之階段(以下亦稱為「T細胞細胞庫建構階段」。)。以下將構成實行T細胞細胞庫建構階段時之部分稱為「T細胞細胞庫建構部分」。

1-2. T細胞之凍結

如上所述，T細胞細胞庫之T細胞較佳為使其凍結之狀態。T細胞之凍結可藉由周知之方法進行。就此種方法而言，可舉例如將包含T細胞之容器靜置於冷凍櫃(例如，超低溫冷凍櫃)內，或使該細胞與低溫之介質(例如，液體氮等)接觸，藉由保存於冷凍櫃或凍結保存系統(例如，Locator等)而達成，惟不限定於此。凍結溫度典型的為0℃以下，較佳為-20℃以下，再佳為-40℃以下，更佳為-80℃以下。又，就凍結操作中的冷卻速度而言，可舉例如典型的為由4℃起開始冷卻達至-80℃為止為1至5小時，較佳為2至4時間，尤佳為花費約3小時左右之冷卻速度。如此的冷卻速度，可藉由提供以設定於期望之溫度之凍結手段，將包含T細胞之容器直接，或收容於凍結處理容器而達成。凍結處理容器亦可為具有將容器內之溫度之下降速度調控於指定之速度之機能。就如此的凍結處理容器而言，可使用例如BICELL(註冊商標)(Nikon Freezer)等。又，上述冷卻速度可藉由使用能由程式設定等調控冷卻速度之冷凍櫃而達成。就如此之冷凍櫃而言，可使用既知之任意者，例如，程式冷凍櫃(例如，CryoMed(Thermo Fisher)、PDF-2000G(STREX)、KRYO-560-16(ASAHI LIFE SCIENCE))等。

凍結操作係將使群體(colony)進行浸漬之培養液或生理緩衝液等作為凍結保存液使用，於此等中添加凍結保護劑，或亦可將培養液以包含凍結保護劑之凍結保存液實施置換等處理後進行。培養液置換為凍結保存液之情形，可將培養液實質上全部除去後添加凍結保存液，亦可使培養液有一部分殘留而直接添加凍結保存液。凍結保存液亦可使用市售者，可舉例如CryoStor(註冊商標)CS10、STEM-CELLBANKER(註冊商標)(ZENOAQ)。

就凍結保護劑而言，沒有特別限制特，可舉例如二甲基亞碸(DMSO)、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、1,2-丙二醇(1,2-PD)、1,3-丙二醇(1,3-PD)、丁二醇(BG)、異戊二烯二醇(IPG)、二丙二醇(DPG)、甘油等。凍結保護劑可單獨使用，以可組合2種或3種以上使用。又，凍結保護劑亦可與細胞外凍結保護劑組合使用。就細胞外凍結保護劑而言，可舉例如聚乙二醇、羧基甲基纖維素鈉、聚乙烯基吡咯啶酮、羥乙澱粉(HES)、類糊精、白蛋白等。

添加於培養液之凍結保護劑之添加濃度，或凍結保存液中凍結保護劑之濃度，典型而言，相對於培養液或凍結保存液全體為2至20%(v/v)，較佳為5至15%，再佳為8至13%。上述濃度可根據凍結保護劑之種類適當調節，例如，使用DMSO作為凍結保護劑之情形，DMSO之濃度，典型而言，相對於培養液或凍結保存液全體為2至20%(v/v)，較佳為2.5至12.5%，再佳為5至10%。

凍結保存劑係如上述冷凍櫃之具體例中所述。又，就包含T細胞之容器而言可使用凍結保存容器，就凍結保存容器之具體例而言，可舉例如無菌小瓶(例如，玻璃安瓿、聚合物製小玻璃瓶(AT-closed小玻璃瓶)等)等。

1-3. T細胞之準備

本發明中，通常T細胞細胞庫中含有由分注有T細胞而經凍結之一個或複數個容器，於T細胞準備時，係包含下列步驟：由T細胞細胞庫採取一個或複數個容器，融解該T細胞之步驟；視需要洗淨經融解之細胞之步驟；進行前培養使細胞甦醒之步驟；維持培養該細胞之步驟等。上述之各步驟可為同一主體進行，亦可為相異的主體進行。

融解前述T細胞之方法，可藉由周知之方法進行，可舉例如將由T細胞細胞庫採取之包含經凍結之T細胞之容器，使用水浴、培育箱等，使其與比凍結溫度為高的溫度之固態、液狀或氣體狀態之介質(例如，水、培養液)接觸而達成，惟不限定於此。介質的溫度，典型而言係4℃至50℃，較佳為30℃至40℃，再佳為36℃至38℃。又，融解時間典型而言為2分鐘以內，尤佳為藉由在20秒以內細胞可大幅地抑制生存率之減低。融解時間係可為例如使融解手段或浸漬介質之溫度、凍結時培養液或凍結保存液之容量或組成等變化而調節。

細胞之洗淨可藉由周知之方法進行，例如，將細胞懸濁於細胞洗淨液(例如，亦可含有血清或血清成分(血清白蛋白等)之培養液或生理緩衝液等)，離心，廢棄上清，回收沉澱之細胞而達成，惟不限定於此。於洗淨細胞之步驟中，亦可將如此之懸濁、離心、回收之循環進行1次或複數次(例如，2、3、4、5次或其以上)。本發明之一態樣中，洗淨細胞之步 驟，係在由T細胞細胞庫採取之T細胞融解之步驟之後直接進行。作為本發明中可使用之市售之細胞洗淨液之例，可舉例如CELLOTION(日本全藥工業股份有限公司)等。

本發明中，就前述前培養以及維持培養之培養基而言，沒有特別限制，惟可將動物細胞之培養中所使用之培養基作為基礎培養基調製。並亦可視需要於基礎培養基中含有培養基添加物等。就基礎培養基以及培養基添加物而言，可舉例如與在上述1-1.之步驟(1)中所列舉者相同者。

就前培養以及維持培養之培養期間而言，可因應目的適當地進行，例如較佳為進行1日間以上(例如，5、6、7日間)，又，進行10日間以下(例如，7、8、9、10日間)較佳。培養溫度沒有特別限制，惟例如為30℃至40℃，較佳為37℃，在含有CO₂之空氣之存在下進行培養，CO₂濃度較佳為2至5%。

1-4. 對於由T細胞細胞庫準備之T細胞之核酸導入

本發明之提供系統，亦可含有將包含外因性基因之核酸導入於由T細胞細胞庫準備之T細胞之階段(step)(以下亦稱為「核酸導入階段」。)。本說明書中，所謂「包含階段」或「包含步驟」係意指構成包含實行階段或步驟之部分。又，以下中，將構成實行核酸導入階段之部分者，稱為「核酸導入部」。

核酸導入階段中的導入核酸之方法、及包含外因性基因及此之核酸係與如上所述之內容相同。

核酸導入階段中所導入之外因性基因，可為與已導入於構成T細胞細胞庫之T細胞之外因性基因相同者，亦可為與其相異者。

核酸導入部只要為以具備基礎培養基、培養容器、無菌空間，可將包含外因性基因之核酸導入於上述準備之T細胞者所構成者即可。本說明書中，所謂無菌空間，係意指依據潔淨通風室(Clean Chamber)、潔淨工作臺(Clean bench)、無菌室等所定之無菌之內部空間，依據核酸導入部全體所定之無菌之內部空間，以及核酸導入部內部空間之一部分無菌空間，亦包含於該無菌空間中。核酸導入部所具備之裝置、培養基等，可因應該裝置之特性、核酸導入之方法等適當選擇。又，核酸導入部分亦可視需要具備1種以上之培養基添加物、潔淨工作臺、培育箱、細胞培養用生物反應器(Bioreactor)、顯微鏡、離心機、抽風機(Aspirator)、導入用之核酸、編碼基因體編集用蛋白質等之核酸、移液管、試管、緩衝劑(例如，乙酸緩衝液、磷酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、檸檬酸磷酸緩衝液、硼酸緩衝液、酒石酸緩衝液、托立斯(Tris)緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水、Mcllvaine緩衝液)、基因導入輔助劑等，再者，亦可因應核酸導入方法之種類，進一步具備其他的試藥或裝置等。

核酸導入部所具備之上述基礎培養基或培養基添加物之具體例係如上所述之內容。又，就培養容器而言，可舉例如於細胞培養中一般所使用之培養碟(Schale)、燒瓶、塑膠袋、Teflon(註冊商標)袋、皿、培養皿、組織培養用培養皿、多培養皿、微孔盤、微型孔盤、多孔盤、多孔盤、細胞培養玻片、細胞培養瓶、旋轉瓶、試管、托盤、培養袋、培養滾瓶等。此等的培養容器之材質沒有特別限制，惟可舉例如玻璃、聚氯乙烯、乙基纖維素或乙酸纖維素等纖維素系聚合物、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚碸、聚胺甲酸乙酯、聚酯、聚醯胺、聚苯乙烯、聚丙烯、 聚乙烯、聚丁二烯、聚(乙烯-乙酸乙烯酯)共聚物、聚(丁二烯-苯乙烯)共聚物、聚(丁二烯-丙烯腈)共聚物、聚(乙烯-丙烯酸乙酯)共聚物，聚(乙烯-甲基丙烯酸酯)共聚物、聚氯丁二烯、苯乙烯樹脂、氯磺化聚乙烯、乙烯乙酸乙烯酯、丙烯酸系嵌段共聚物等塑膠等。

就上述其他試藥或裝置而言，例如藉由磷酸鈣共沉澱法進行核酸導入之情形，核酸導入部亦可具備1種以上之各種試藥或溶液(例如，CaCl₂以及其溶液、HCl以及其溶液、NaCl以及其溶液、MgCl₂以及其溶液，Na₂HPO₄以及其溶液、KH₂PO₄以及其溶液、NP-40以及其溶液、HEPES以及其溶液、DMSO以及其溶液等)等。例如，使用電穿孔法之情形，核酸導入部亦可具備1種以上之電穿孔器、電極(例如，鉑電極、光析電極、培養碟鉑板電極等)、電穿孔板、小箱(例如，電極用小箱、平板小箱等)等。例如，使用脂質體轉染法之情形，亦可具備1種以上之轉染用試藥(例如，Lipofectamine(invitrogen)、jetPEI(Polyplus-transfection)、XfectTM(Clontech TaKaRa cellartis)、GenomONETM(石原產業株式會社))、Trans IT(Mirus Bio LLC)、RmesFect/RmesFect Stem(OZ BIOSCIENCES)等)等。例如，藉由病毒載體進行核酸導入之情形，核酸導入部亦可具備1種以上之上述中所列舉之各種病毒載體、包裝載體質體、包裝細胞(例如Plat-E細胞)、互補細胞株、生物安全層級2之實驗室等。

1-5. 擴大培養

本發明之提供系統，亦可包含將由T細胞主細胞庫所準備之T細胞或於該T細胞經導入包含外因性基因之核酸之T細胞進行擴大培養之階段 (以下亦稱為「擴大培養階段」。)。以下將實行擴大培養階段所構成之部分稱為「擴大培養部」。

本說明書中，所謂「擴大培養」，係使期望之細胞集團增殖，使細胞數增加為目的而進行培養。細胞數之增加只要可為藉由因細胞之增殖所致之增數超過因死亡所致之減數來達成者即可，不需要增殖細胞集團之全部的細胞。細胞數之增加，與擴大培養開始前進行比較可為1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、300倍、500倍、1,000倍、3,000倍、5,000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍以上。

擴大培養階段亦可藉由周知之方法進行，惟由細胞增殖效率之觀點而言，本發明者們發現，藉由包含因CD30促效劑而刺激T細胞之步驟之方法進行較佳。在CD30促效劑之存在下進行T細胞培養，因CD30促效劑致使T細胞可受到刺激，故藉由包含在CD30促效劑之存在下培養T細胞之步驟之方法進行較佳。因此，本發明之一態樣中，擴大培養階段可包含在CD30促效劑之存在下培養T細胞之步驟。又，在CD30促效劑之存在下進行擴大培養之情形，該培養之培養基中，存在有CD3/TCR複合體促效劑，以及纖網蛋白或其改變體較佳。藉由CD3/TCR複合體促效劑以及CD30促效劑，可分別刺激CD3/TCR複合體以及CD30。

與iPS細胞之增殖能力相比較，以由iPS細胞分化之T細胞之增殖能力低而言，在T細胞階段建構主細胞庫及/或工作細胞庫而供給T細胞以及T細胞製品，使該T細胞以及T細胞製品的量可達到投與於人或多數的人而得到近乎期待之治療效果係有所困難。本發明即為克服此種困難性者。 再者，在擴大培養階段中，使用包含藉由上述之CD30促效劑刺激T細胞之步驟之方法，在T細胞階段建構主細胞庫及/或工作細胞庫，能夠更安定地供給T細胞製品。

本說明書中，所謂「刺激」係意指某種物質結合於各種之受體等而活化其下游之信號路徑。

本發明中，就T細胞之擴大培養階段中所使用之培養基而言，沒有特別限制，惟可將動物細胞培養中所使用之培養基作為基礎培養基調製。亦可視需要於基礎培養基中含有培養基添加物等。就基礎培養基以及培養基添加物而言，可舉例如與上述1-1.步驟(1)中所列舉者相同者。培養可在例如CO₂培養箱中，CO₂濃度為約1至約10%，較佳為約2至約5%之環境下，溫度為30至約40℃，較佳為在約37℃進行。又，關於培養期間，只要為本領域中具有通常知識者監測T細胞之數等之同時，可作適當決定。只要能得到T細胞，日數沒有特別限定，惟例如至少3日以上、5日以上、7日以上、10日以上、14日以上、21日以上，較佳為7日以上15日以下。又30日以下較佳，21日以下再佳。培養期間可為例如3至30日、5至30日、7至30日、10至30日、14至30日、21至30日、3至21日、5至21日、7至21日、10至21日、14至21日、3至15日、5至15日、7至15日、10至15日、14至15日等。

在擴大培養階段使用維生素C類之情形，維生素C類可舉例如與步驟(2-1)中所記載者相同者同樣地進行添加。一實施形態中，培養基中或培養液中的維生素C類之濃度較佳係5μg/ml至200μg/ml。另一實施形態中，該維生素C類在培養液中添加有相當於5μg/ml至500μg/ml 之量(例如，相當於5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml之量)。

在擴大培養階段使用CD3/TCR複合體促效劑之情形，就該階段中所使用之CD3/TCR複合體促效劑而言，可舉例如與上述1-1.之步驟(3)所記載者相同者。又，CD3/TCR複合體促效劑在培養基中之濃度亦與上述1-1.之步驟(3)所述之濃度相同。

在擴大培養階段，培養基中較佳存在有纖網蛋白或其改變體。如此之纖網蛋白只要為可結合於T細胞之分子即沒有特別限制。纖網蛋白之改變體，只要為可結合於T細胞表面之VLA-5以及VLA-4之分子即沒有特別限制，可舉例如RetroNectin。纖網蛋白或其改變體在培養基中不論其存在之態樣為何均可。例如，於培養時可含有於培養基中，亦可在培養容器以固相化之方式存有，較佳係在培養容器以固相化之方式存有。

纖網蛋白或其改變體含有於培養基中之情形，培養基係與含有CD3/TCR複合體促效劑之培養基相同即可。又，血清、添加物等之有無亦與含有CD3/TCR複合體促效劑之培養基相同即可。纖網蛋白或其改變體含有於培養基中之情形，纖網蛋白或其改變體之濃度，就下限而言可為10ng/ml以上，較佳為100ng/ml以上，就上限而言可為10000μg/ml以下，較佳為1000μg/ml以下。

在擴大培養階段中，培養基中亦較佳存在有CD30促效劑。如此之CD30促效劑只要為可藉由與CD30特異性結合，並為可由CD30將信號傳遞於細胞內之分子即沒有特別限制。就CD30促效劑而言，可舉 例如由抗CD30促效劑抗體(亦簡稱為「抗CD30抗體」)或其結合片段以及CD30配體或其結合片段所構成的群選擇之至少一種。

在擴大培養階段使用之CD30促效劑，係與CD3/TCR複合體促效劑相同，只要在培養時以可與CD30接觸之方式存在，不論其存在之態樣為何均可。例如，於培養時可含有於培養基中，亦可在培養容器以固相化之方式存有，較佳係在培養容器以固相化之方式存有。

CD30促效劑含有於培養基之情形，培養基係與含有CD3/TCR複合體促效劑之培養基相同即可。又，血清、添加物等之有無亦與含有CD3/TCR複合體促效劑之培養基相同即可。CD30促效劑含有於培養基中之情形，培養基中的CD30促效劑之濃度，由本領域中具有通常知識者可因應CD30促效劑適當決定。例如，CD30促效劑為抗CD30促效劑抗體或其結合片段之情形，培養基中的抗CD30促效劑抗體或其結合片段之濃度，通常為1ng/ml至10000ng/ml，較佳為30ng/ml至300ng/ml。

又，CD30促效劑在培養容器係以固相化之方式存有之情形，培養容器係與CD3/TCR複合體促效劑為固相化之培養容器相同即可。又，將CD30促效劑固相化於培養容器之方法，亦與CD3/TCR複合體促效劑之固相化方法相同即可。使CD30促效劑固相化於培養容器時CD30促效劑溶液之濃度，就下限而言可為0.1ng/ml以上，較佳為1ng/ml以上，就上限而言可為10000ng/ml以下，較佳為1000ng/ml以下。如此之濃度可為例如0.1至10000ng/ml、1至10000ng/ml、0.1至1000ng/ml、1至1000ng/ml、30ng/ml至300ng/ml等。

在擴大培養階段使用細胞介素之情形，就細胞介素而言，可舉例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21等，此等可僅使用1種，或亦可使用複數種(較佳為使用所有種類)。細胞介素為IL-2之情形，培養基中的該濃度可為10U/ml至1000U/ml或0.01ng/mL至1000000ng/mL，細胞介素IL-7之情形，培養基中的該濃度亦可為0.1ng/ml至1000ng/ml、1ng/ml至500ng/ml、5ng/ml至100ng/ml(例如，10ng/ml)。又，IL-12之培養基中之濃度亦可為0.1ng/ml至1000ng/ml、1ng/ml至500ng/ml、5ng/ml至100ng/ml(例如，50ng/ml)，IL-15之培養基中之濃度亦可為0.1ng/ml至1000ng/ml、1ng/ml至500ng/ml、5ng/ml至100ng/ml(例如，10ng/ml)，IL-18之培養基中之濃度亦可為0.1ng/ml至1000ng/ml、1ng/ml至500ng/ml、5ng/ml至100ng/ml(例如，50ng/ml)，IL-21之培養基中之濃度亦可為0.1ng/ml至1000ng/ml、1ng/ml至500ng/ml、5ng/ml至100ng/ml(例如，20ng/ml)。

在擴大培養階段，作為細胞介素之TNF家族細胞介素亦可進一步含有於培養基。就TNF家族細胞介素而言，可舉例如TNF-α、TNF-β、淋巴毒素α、Fas配體、TRAIL、TWEAK、TL1A、RANK配體、OX40配體、APRIL、AITRL、BAFF、4-1BBL以及CD40配體等，以TL1A較佳。使用TL1A之情形，就該培養基中之濃度而言可為5ng/ml至500ng/ml，較佳為10ng/ml至300ng/ml，再佳為20ng/ml至200ng/ml(例如，50ng/ml)。

又，在擴大培養階段，細胞凋亡抑制劑亦可進一步含有於培養基。就細胞凋亡抑制劑而言，可舉例如蛋白酶抑制劑，可舉例如半胱天 冬酶抑制劑。就半胱天冬酶抑制劑而言，Pan Caspase FMK inhibitor Z-VAD(N-苯甲氧羰基-Val-Ala-Asp(O-Me)氟甲基酮)(以下亦稱為「Z-VAD-FMK」。)較佳，該培養基中之濃度可為1μM至1000μM，較佳為1μM至500μM，再佳為1μM至200μM，特佳為1μM至50μM(例如，10μM)。

本發明中，所得到之T細胞亦可單離使用，亦可直接使用(亦即，含有其他細胞種所得之細胞集團)。單離使用之情形，可將由αTCR、βTCR以及CD3所構成的群選擇之至少一個分子作為指標使用進行單離，該單離之方法可使用本領域中具有通常知識者所周知之方法。可舉例如，使用(視需要使磁性珠等進行結合)αTCR，βTCR以及CD3之抗體，藉由流動式細胞測量術，或藉由磁性細胞分離法進行單離之方法，使用將期望之抗原進行固定化之親和性管柱等進行精製之方法，惟不限定於此等。

又直接使用之情形，亦可使用本領域中具有通常知識者所周知之方法，使T細胞在細胞集團中所佔之比例增加。就使細胞集團所佔之T細胞之比例增加之方法而言，可舉例如Front.Immunol.,5：636(2014)、特表2017-537625、特表2003-529363等中所述之方法，惟不限定於此等。

因此，擴大培養部具備基礎培養基、培養容器，和無菌空間，較佳亦具備CD3促效劑，只要為可將T細胞進行擴大培養之構成者即可。核酸導入部所具備之裝置、培養基等，可因應該裝置之特性、擴大培養之方法等進行適當的選擇。使用CD3促效劑之情形，擴大培養部所具備之培養容器和CD30促效劑，可為固相化有CD30於培養容器之形態。又，擴大培養部分亦可視需要具備1種以上之CD3/TCR複合體促效劑、纖網蛋

白或其改變體、細胞凋亡抑制劑、培養基添加物、潔淨工作臺，培養箱、細胞培養用生物反應器、顯微鏡、離心機、抽風機、移液管、試管、緩衝劑(例如，乙酸緩衝液、磷酸緩衝液，檸檬酸緩衝液、檸檬酸磷酸緩衝液、硼酸緩衝液、酒石酸緩衝液、托立斯緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水、Mcllvaine緩衝液)等，再者，視培養方法之種類亦可進一步具備其他之試藥或裝置等。尤其使用細胞介素作為培養基添加物之情形，適當之細胞介素可舉例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、TNF家族細胞介素等。

擴大培養部所具備之上述基礎培養基、培養基添加物、CD3促效劑、CD3/TCR複合體促效劑、纖網蛋白或其改變體以及細胞凋亡抑制劑之具體例係如上述之內容通。又，就培養容器之具體例而言，可舉例如與1-4.所記載者相同者。將經擴大培養之T細胞填充於適當的保存容器(無菌小瓶或輸血袋等)，並視需要將標籤貼附於該容器，經由將該容器包裝可製造T細胞製品。

1-6. 凍結T細胞製品之製造

本發明之提供系統亦可包含由經前述擴大培養之T細胞製造凍結T細胞製品之階段(以下亦稱為「凍結T細胞製品製造階段」。)。以下將實行凍結T細胞製品製造階段所構成之部分稱為「凍結T細胞製品製造部」。

凍結T細胞製品製造階段可藉由與1-2.同樣之方法進行。

因此，凍結T細胞製品製造部只要為至少具備凍結保存劑、凍結保存容器，和冷凍櫃及/或凍結保存系統(例如：Locator等)，且由經擴大培養之T細胞製造凍結儲存所構成者即可。又，凍結儲存製造部亦可視 需要具備1種以上之低溫介質(例如，液體氮等)、移液管、試管、緩衝劑(例如，乙酸緩衝液、磷酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、檸檬酸磷酸緩衝液、硼酸緩衝液、酒石酸緩衝液、托立斯緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水、Mcllvaine緩衝液)等。

凍結T細胞製品製造部所具備之凍結保存劑、冷凍櫃之具體例係如上述之內容。又，就凍結保存容器之具體例而言，可舉例如冷凍保存用試管(Cryovial)(例如，玻璃安瓶、塑膠試管等)等。

1-7. T細胞製品採集品之建構

本發明之提供系統亦可包含收集T細胞製品收集並建構包含2種以上T細胞製品之T細胞製品採集品之階段(以下亦稱為「T細胞製品採集品建構階段」。)。以下將實行T細胞製品採集品建構階段所構成之部分稱為「T細胞製品採集品建構部」。

構成T細胞製品採集品之T細胞製品亦可為凍結T細胞製品，由T細胞安定性之觀點而言，於長期間保存之情形以凍結T細胞製品較佳。

T細胞製品採集品建構階段可藉由周知之方法進行。就此種之方法而言，可舉例如藉由上述之方法，能夠製造2種以上T細胞製品，再附上可用以區別T細胞製品種類之標籤等，並經由保管進行建構。該建構之T細胞製品採集品中，亦可經由進一步追加不同種類之T細胞製品，可追加採集品之種類。由保管的容易性而言，在同一空間(例如，同一冷凍櫃內、同一房間、同一建築物內、同一地點等)進行保管較佳，亦可在物理上為分離之空間進行保管。T細胞製品種類之區別，只要為可區別種類之 任何方法均可使用，可使用之方式可舉例如，於容器附上標籤等，保存於不同之冷凍櫃或凍結保存系統之情形，於此等之冷凍櫃或凍結保存系統附上標籤等，或使用管理軟體等進行區別等。

因此，T細胞製品採集品建構部只要為至少具備將收集對象之T細胞製品，將以上述之方式所建構之T細胞製品進行收集，且為將包含2種以上之T細胞製品之T細胞製品採集品而建構所構成者即可。又，T細胞製品採集品建構部亦可視需要具備1種以上之標籤、冷凍櫃、凍結保存系統、管理軟體等。冷凍櫃之具體例可為如上述之內容。

1-8. 抗原之鑑別

本發明之提供系統亦可包含鑑別被驗者之腫瘤中所表現之腫瘤特異性抗原或腫瘤關聯抗原(以下簡稱為「抗原」。)之階段(以下簡稱為「抗原鑑別階段」。)。以下將實行抗原鑑別階段所構成之部分稱為「抗原鑑別部」。

抗原鑑別階段亦可藉由周知之方法進行。就如此之方法而言，可舉例如由被驗者採取腫瘤組織片，或含有腫瘤細胞所得之體液(例如，血液、血清、血漿等)等生物體樣品，由該樣品中抽取mRNA，視需要由該mRNA合成cDNA，並使用該核酸，利用數位聚合酶連鎖反應(Digital polymerase chain reaction)(例如，ddPCR)、RT-PCR、生物晶片(例如，微陣列(microarray))、RNAseq等核酸擴增方法及/或核酸檢出方法而進行鑑別。PCR係可將例如腫瘤特異性抗原或腫瘤關聯抗原之mRNA與可擴增之引子組、PCR裝置一同使用而進行。又，使用RNAseq之情形，可使用次世代序列分析儀而進行。

因此，抗原鑑別部只要是構成為可將於被驗者之腫瘤中表現之腫瘤特異性抗原或腫瘤關聯抗原進行鑑別者即可。例如，抗原鑑別部，至少具備上述之引子組和PCR裝置、至少具備上述之生物晶片，或上述之次世代序列分析儀。

就上述次世代序列分析儀而言，可舉例如Illumina公司製之裝置(例如，MiSeq、HiSeq2500)、Thermo Fisher Scientific公司製之裝置(例如：Ion Proton、Ion PGM)、Roche Diagnostic公司製之裝置(例如，GS FLX+、GS Junior)等，惟不限定於此等裝置。

1-9. T細胞製品之選擇

本發明之提供系統中，可由取得被驗者之資訊，並基於該資訊選擇適當之T細胞製品。因此，本發明之提供系統亦可包含被驗者資訊取得之階段及/或選擇適合於被驗者之T細胞製品之階段。以下將實行被驗者資訊取得階段所構成之部分稱為「被驗者資訊取得部」。

就被驗者之資訊而言，沒有特別限制，可舉例如被驗者之基因資訊(例如，HLA基因關聯資訊、異常基因資訊等)、診斷結果、既往病歷、藥劑服用經歴、年齡、性別、血型、身高、體重、被驗者罹患腫瘤時該腫瘤所表現之腫瘤特異性抗原或腫瘤關聯抗原相關資訊等。

本發明之一態樣中，亦可含由包含T細胞製品之T細胞製品採集品選擇表現出會辨識而結合依據被驗者之資訊經鑑別之抗原的CAR或外因性之TCR之T細胞製品之階段(以下亦稱為「T細胞製品選擇階段」。)。以下將實行T細胞製品選擇階段所構成之部分稱為「T細胞製 品選擇部」。T細胞製品選擇階段中的T細胞製品亦可為凍結T細胞製品，由T細胞之安定性之觀點而言為凍結T細胞製品較佳。

由包含T細胞製品之T細胞製品採集品選擇表現出會辨識而結合經鑑別之抗原之CAR或外因性TCR之T細胞製品之階段，於概念上亦包含基於經取得之被驗者資訊選擇適合於被驗者之T細胞製品之階段。被驗者資訊取得部分，可包含抗原鑑別部分。本發明之一態樣中，T細胞製品選擇階段係基於例如所提供之T細胞製品之製造計畫書中所記載之內容等，可選擇包含表現適當的CAR、外因性TCR、細胞介素、趨化介素等之T細胞之T細胞細胞庫。

T細胞製品選擇階段可藉由周知之方法進行。就如此之方法而言，例如，可藉由根據由上述抗原鑑別階段所得到之鑑別結果所顯示之資料(紙媒體或電子數據媒體)，由預先作成之T細胞製品之列表等選擇包含表現出會辨識而結合經鑑別之抗原之CAR或外因性TCR之T細胞之T細胞製品而進行。由抗原鑑別階段確認出複數種類之腫瘤特異性抗原或腫瘤關聯抗原之表現時，可基於表現量最高者，或可由T細胞製品得到最可期待之效果者等之評價基準，選擇包含T細胞之T細胞製品。所選擇之T細胞製品之種類可僅為1種，或亦可為2種以上。此等之階段亦可使用用以選擇上述T細胞製品所設計之軟體。T細胞製品亦可依據醫師或醫療機關等指示(處方箋等)進行選擇。

因此，T細胞製品選擇部只要為可由包含T細胞製品之T細胞製品採集品，選擇至少具備因抗原鑑別階段所致鑑別結果所顯示之資料、表現出會辨識而結合經鑑別之抗原之CAR或外因性TCR之T細胞製品所 構成者即可。又，T細胞製品選擇部分，可視需要至少具備1種以上之T細胞製品之列表、或用以選擇上述T細胞製品所設計之軟體等。

T細胞細胞庫建構部、T細胞細胞庫採集品建構部(後述)、T細胞細胞庫選擇部(後述)、凍結T細胞製品製造部、T細胞製品採集品建構部以及T細胞製品選擇部中，構成T細胞細胞庫以及T細胞製品之T細胞之關聯資訊(以下稱為「T細胞關聯資訊」。)受到管理。就T細胞關聯資訊而言，含有有關該T細胞之製造記錄、特性解析結果、品質評價結果、保存溫度管理記錄、製造計畫等。又，該T細胞為源自iPS細胞T細胞之情形，包含有關該iPS細胞之製造記錄、特性解析結果、品質評價結果、保存溫度記錄、特定之基因資訊等。又，該T細胞為經導入編碼外因性基因之核酸之T細胞之情形，含有該外因性基因之資訊(例如，該外因性基因所編碼之蛋白質以及細胞介素等的種類等)等。T細胞細胞庫選擇部以及T細胞製品選擇部中，基於屬於提供對象之T細胞製品之製造計畫書中所記載之內容等，可分別選擇T細胞細胞庫以及T細胞製品。T細胞細胞庫選擇部以及T細胞製品選擇部中，亦可進一步基於被驗者資訊取得部所取得之被驗者之資訊各別地選擇適當的T細胞細胞庫以及T細胞製品。因此，T細胞細胞庫選擇部以及T細胞製品選擇部，於僅只有T細胞細胞庫及/或T細胞製品之1種之情形亦可使用。

將本發明之一態樣參照圖16並同時進行說明。此外，本說明書以及圖式中，關於實質上具有同一機能構成之構成要素，由於賦予相同之符號因而省略重複之說明。

如圖16中所示，T細胞製品提供系統100係用以提供T細胞製品131，由T細胞細胞庫102準備T細胞。T細胞細胞庫102亦可藉由T細胞細胞庫建構部101建構。又，於2種以上之T細胞細胞庫建構之情形，亦可藉由T細胞細胞庫採集品建構部111收集此等而建構T細胞細胞庫採集品112。

準備之T細胞亦可視需要於核酸導入部103導入所期望之外因性基因。該T細胞亦可視需要進一步於擴大培養部104擴大培養。該T細胞亦可視需要進一步於凍結T細胞製品製造部105進行凍結成為凍結T細胞製品106。2種以上之凍結T細胞製品經製造之情形，亦可藉由T細胞製品採集品建構部121收集此等而建構T細胞製品採集品122。

又，於T細胞細胞庫選擇部154以及T細胞製品選擇部155，基於T細胞關聯資訊171，可選擇適當的T細胞細胞庫以及T細胞製品作為各別提供之T細胞製品131。如此之T細胞關聯資訊係於T細胞細胞庫建構部101、T細胞細胞庫採集品建構部111、T細胞細胞庫選擇部154、T細胞製品採集品建構部121以及T細胞製品選擇部155受到管理。

又，為了提供更適合於被驗者之治療及/或預防之T細胞製品，可在被驗者資訊取得部152取得被驗者之資訊151，並基於該被驗者之資訊藉由T細胞製品選擇部155選擇適當的T細胞製品131。T細胞製品131在T細胞製品為1種之情形係與T細胞製品106相同，當由T細胞製品採集品122進行選擇時，該T細胞製品採集品122中亦可含有1種或複數種之T細胞製品。被驗者資訊取得部可包含抗原鑑別部153。亦可基於在被驗者資訊取得部152所取得之資訊，由T細胞細胞庫選擇部154選擇適當的T 細胞細胞庫161。T細胞細胞庫161在T細胞細胞庫為1種之情形係與T細胞細胞庫102相同，當由T細胞細胞庫採集品112進行選擇時，該T細胞細胞庫採集品112亦可為含有1種或複數種之T細胞細胞庫。可由T細胞細胞庫161準備T細胞，與上述同樣的方式提供T細胞製品。

其次，說明關於被驗者資訊取得部、T細胞細胞庫建構部、T細胞細胞庫選擇部及/或T細胞製品選擇部可含有之硬體之構成。由於T細胞細胞庫選擇部和T細胞製品選擇部具有相同之硬體構成，在此，說明針對T細胞製品選擇部可含有之硬體構成。

圖17係表示T細胞製品選擇部200可含有之硬體構成之一例示圖。如圖17中所示，T細胞製品選擇部200係具有處理器201、記憶體202、輔助記憶裝置203、I/F(Interface)裝置204、通信裝置205、驅動裝置206。此外，T細胞製品選擇部200之各硬體係經由匯流排207相互地進行接續。

處理器201係具有CPU(Central Processing Unit)、GPU(Graphics Processing Unit)等各種演算裝置。處理器201係實行將輔助記憶裝置203上所安裝之各種軟體等之程式於記憶體202上讀取。

記憶體202係具有ROM(Read Only Memory)、RAM(Random Access Memory)等主記憶裝置。處理器201和記憶體202形成所謂之電腦，處理器201由於實行在記憶體202上讀取之各種軟體等程式，而實現該電腦之各種機能。

輔助記憶裝置203係將各種軟體等之程式，或各種軟體等之程式藉由處理器201實行時所使用之各種資訊(例如，T細胞關聯資訊、被驗者之資訊等)以及數據進行儲存。

I/F裝置204係接續操作裝置210以及顯示裝置211，和T細胞製品選擇部200之接續裝置。I/F裝置204係將針對T細胞製品選擇部200之各種指示，經由操作裝置210接收。又，I/F裝置204係將由T細胞製品選擇部200之處理結果，經由顯示裝置211輸出。

通信裝置205係用以經由網路而與其他之裝置通信之通信裝置。

驅動裝置206係用以設置記錄媒體212之裝置。在此所謂記錄媒體212係包含如CD-ROM、軟性磁碟、磁光碟等將資訊以光學的、電性的或磁性的方式記錄之媒體。又，記錄媒體212亦可包含如ROM、快閃記憶體等將資訊以電性的方式記錄之半導體記憶體等。

此外，於輔助記憶裝置203所安裝之各種軟體等之程式，係由例如經配置之記錄媒體212設置於驅動裝置206，於該記錄媒體212所記錄之各種軟體等之程式藉由驅動裝置206讀取而安裝。或者，於輔助記憶裝置203所安裝之各種軟體等之程式，亦可經由通信裝置205由網路下載而安裝。

1-10. T細胞製品之用途

藉由本發明之提供系統所提供之T細胞製品，由於可顯示針對例如癌細胞、癌幹細胞、腫瘤細胞等之細胞傷害活性，故可使用於用以針對癌或腫瘤之預防或治療，而投與至被驗者。本說明書中，被驗者係意指治療試驗等中投與T細胞製品之哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、倉鼠、兔、貓、犬、牛、羊、猴、人)等，惟較佳之被驗者為人。

藉由上述T細胞製品所進行預防或治療之癌或腫瘤係例如“Daniel Baumhoer et al.,Am J.Clin Pathol,2008,129,899-906”等中所記載。具體而言，可舉例如肝臟癌(例如，肝細胞癌)、卵巢癌(例如，卵巢 亮細胞腺癌)、小兒癌、肺癌(例如，扁平上皮癌、肺小細胞癌)、睪丸癌(例如，非精細胞胚細胞腫瘤)、軟部腫瘤(例如，脂肪肉腫、惡性纖維性組織球腫)、子宮癌(例如，子宮頸部上皮內腫瘤、子宮頸部扁平上皮癌)、黑色素瘤、腎上腺腫瘤(例如，腎上腺腫)、神經性腫瘤(例如，神經鞘瘤)、胃癌(例如，胃的腺癌)、腎臟癌(例如，Grawitz氏瘤)、乳癌(例如，浸潤性小葉性癌、黏液性癌)、甲狀腺癌(例如，髓樣癌)、喉頭癌(例如，扁平上皮癌)、膀胱癌(例如，浸潤性移行上皮細胞癌)等，惟不限定於此等。

上述T細胞製品中所含有之T細胞，亦可在投與至對象前使用適當的培養基及/或刺激分子進行培養及/或刺激。就刺激分子而言，可舉例如細胞介素類、適當的蛋白質、其他成分等，惟不限定於此等。就細胞介素類而言，可例示例如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IFN-γ等，較佳係可使用IL-2。就IL-2之培養基中之濃度而言，沒有特別限定，惟可舉例如適當的為0.01至1×10⁵U/mL，再適當的為1至1×10⁴U/mL。又，就適當之蛋白質而言，可例示例如CD3配體、CD28配體、抗CD3抗體、抗CD30抗體、抗IL-4抗體。又，除此之外，亦可添加凝集蛋白等淋巴球刺激因子。再者，培養基中亦可添加血清或血漿。此等添加於培養基中之添加量沒有特別限定，惟可例示0體積%至20體積%，又可因應培養階段而變更所使用之血清或血漿的量。例如，亦可階段性地減少血清或血漿濃度之使用。就血清或血漿之來源而言，可為源自自己或非源自自己之任一種，惟以安全性之觀點而言，源自自己者較佳。

上述T細胞以非經口的方式投與至對象而使用較佳。就非經口的投與方法而言，可舉例如靜脈內、動脈內、肌肉內、腹腔內，以及 皮下投與等方法。投與量可因應對象之狀態、體重、年齡等進行適當的選擇，通常就細胞數而言，對於體重60kg之對象，每1次通常以投與1×10⁶至1×10¹⁰個之方式進行，較佳係投與1×10⁷至1×10⁹個，再佳係投與5×10⁷至5×10⁸個。又，可以一次性進行投與，亦可經歷多次進行投與。

2. T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫之建構方法

本發明係提供建構上述之T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫之方法(以下亦稱為「本發明之細胞庫建構方法」。)。本發明之一態樣中，上述外因性基因為CAR基因之情形，本發明之細胞庫建構方法係包含下述步驟：(I)使不具有CAR基因之人工多能性幹細胞，分化為CAR-T療法用T細胞之步驟；(II)將該分化T細胞進行儲存之步驟；以及(III)進行該經分化之T細胞之特性解析之步驟。通常係以上述步驟(II)和(III)這樣的順序進行，然亦可在步驟(III)之後進行步驟(II)。又，在另一態樣中，上述外因性基因為TCR基因之情形，本發明之細胞庫建構方法亦可包含下述步驟：(i)使不具有外因性TCR基因之人工多能性幹細胞分化為TCR-T療法用之T細胞之步驟；(ii)將該經分化之T細胞進行儲存之步驟；以及(iii)進行該經分化之T細胞之特性解析之步驟。通常係以上述步驟(ii)和(iii)這樣的順序進行，然亦可在步驟(iii)之後進行步驟(ii)。上述之各步驟可由同一主體進行，亦可由相異之主體進行。

又，本發明之另一態樣中係提供藉由本發明之細胞庫建構方法所建構之T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫(以下亦稱為「本發明之T細胞細胞庫」。)。

2-1. 由不具有CAR基因或外因性TCR基因之人工多能性幹細胞分化誘導成為T細胞

上述2.之步驟(I)以及(i)，可使用不具有CAR基因及/或外因性TCR基因之人工多能性幹細胞，並藉由上述1-1.之步驟(1)以及(2)所述之方法進行。所謂步驟(I)中的CAR-T療法用，係意指在T細胞中表現之CAR所致之治療或預防用途，雖排除藉由在T細胞中表現之外因性TCR以及內在性TCR進行治療或預防，但該T細胞可含有為了非為治療或預防目的之其他目的，例如如上述1-1.中所記載之為了壓抑內在性TCR基因之表現之目的以及效率良好地製造均勻的T細胞之目的而導入之外因性的TCR基因等。同樣而言，所謂步驟(i)中的TCR-T療法用，係意指在T細胞中表現之外因性TCR所致之治療或預防用途，雖排除藉由在T細胞中表現之CAR以及內在性TCR進行治療或預防，但該T細胞可含有為了非為治療或預防目的之其他目的，例如如上述1-1.中所記載之為了壓抑內在性TCR基因之表現之目的等而導入之外因性TCR基因。

關於上述步驟(I)以及(i)中的CAR以及TCR之說明、TCR或CAR作為標的之抗原之具體例、T細胞等各用語之定義等，如上述1.以及1-1.所述之內容。又，於上述步驟進行分化誘導所得之T細胞之具體例係如上述1.中所記載之內容。如此之T細胞較佳係細胞毒性T細胞，再佳係表現CD8αβ之CD8αβ陽性細胞毒性T細胞。

2-2. 分化之T細胞之儲存

上述2.之步驟(III)以及(iii)係可使用上述2-1.中所得之T細胞，藉由上述1-1.以及1-2.中所記載之方法進行。

關於本發明之細胞庫建構方法以及本發明之T細胞細胞庫中所使用之人工多能性幹細胞，可藉由上述1-1.中所記載之方法樹立。又，前述人工多能性幹細胞或上述2.之步驟(II)以及(ii)中所使用之T細胞，係與上述1-1.中所記載之細胞同樣為可抑制至少1種HLA基因之表現者較佳。具體的HLA基因或組合、該基因之表現抑制之定義或抑制方法等係如上述1-1.中所記載之內容。

2-3. T細胞之特性解析

上述2.之步驟(III)以及(iii)中的特性解析之試驗項目，係根據成為細胞庫對象之細胞之生物學的性質(例如，營養要求性)、培養履歴以及試驗之實施可能性而改變，惟根據本領域中具有通常知識者，或基於本領域中具有通常知識者和管制當局之協議內容等適當地設定。關於該等的建構方法以及特性解析以及品質評價結果之資訊，係於各國製造販賣許可申請時提示給醫藥品當局。T細胞細胞庫之特性解析係主要對於是否未有外來性感染性因子之混入進行評價。尤其，由於因外來性病毒所致之污染於臨床上的使用中有招致嚴重事態之可能性，故依據ICH Q5A(R1)徹底地進行評價。就其他之試驗而言，有進行用以檢出因其它之細胞株所致之交叉污染之同一性試驗。又，亦有實施核型分析或致腫瘤性試驗之情形。

就品質評價之試驗項目而言，可舉例如使用適當的細胞表現型T細胞之確認試驗、純度試驗、來自製造步驟之雜質之試驗，以及細胞數或細胞生存率等之含量試驗等。

2-4. T細胞細胞庫採集品之建構

本發明之提供系統，亦可包含收集T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫，建構含有2種以上T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫之T細胞主細胞庫採集品及/或T細胞工作細胞庫採集品(以下亦稱為「T細胞細胞庫採集品」。)之階段(以下亦稱為「T細胞細胞庫採集品建構階段」。)。本說明書中，將實行T細胞細胞庫採集品建構階段所構成之部分稱為「T細胞細胞庫採集品建構部」。

用以提供1或2種以上T細胞製品之T細胞細胞庫有不足之可能性之情形，或因應投與對象之特性認為使用由其他種類之T細胞細胞庫而來之T細胞製品較適當之情形，可於既存T細胞細胞庫之外追加另外建構之T細胞細胞庫。因此，藉由收集複數T細胞細胞庫而建構T細胞細胞庫採集品，可提供更佳安定且堅實之T細胞製品之提供系統。

T細胞細胞庫採集品建構階段亦可藉由周知之方法進行。就如此之方法而言，例如，藉由上述本發明之細胞庫建構方法，可製造2種以上之T細胞細胞庫，再附以可供區別T細胞細胞庫種類之標籤等，並進行保管而建構。亦可經由進一步追加相異種類之T細胞細胞庫於該建構之T細胞細胞庫採集品，追加採集品之種類。由保管之容易性而言，保管於同一空間(例如，同一冷凍櫃內、同一房間內、同一建築物內、同一地點等)較佳，亦可在物理上為分離之空間中進行保管。T細胞細胞庫之種類之區別，只要為可區別種類之任何方法均可使用，可使用之方式可舉例如，於凍結保存容器附以標籤等，保存於不同之冷凍櫃或凍結保存系統之情形，於此等之冷凍櫃或凍結保存系統附以標籤等，或使用管理軟體等進行區別等。

因此，T細胞細胞庫採集品建構部只要為至少具備將收集對象之T細胞細胞庫，將以上述之方式所建構之T細胞細胞庫收集，且為將含有2種類以上之T細胞細胞庫建構T細胞細胞庫採集品所構成者即可。又，T細胞細胞庫採集品建構亦可視需要具備1種以上之標籤、冷凍櫃、凍結保存系統、管理軟體等。冷凍櫃之具體例可為如上述之內容。T細胞細胞庫採集品之建構可由與建構T細胞細胞庫之主體為同一主體進行，亦可由相異之主體進行。T細胞細胞庫採集品亦可包含相異主體所建構之T細胞細胞庫。

2-4-1. T細胞細胞庫之選擇

本發明之提供系統亦可包含用以製造提供T細胞製品之T細胞細胞庫，由含有T細胞細胞庫之T細胞細胞庫採集品進行選擇之階段(以下亦稱為「T細胞細胞庫選擇階段」。)。本說明書中，將實行T細胞細胞庫選擇階段所構成之部分稱為「T細胞細胞庫選擇部」。

T細胞細胞庫選擇階段可藉由周知之方法進行。就如此之方法而言，可舉例如，基於所提供之T細胞製品之製造計畫書之記載內容等，可選擇包含表現適當的T細胞受體之T細胞之T細胞細胞庫。

又，本發明之一態樣中，可取得被驗者之資訊，並基於該資訊選擇適當之T細胞細胞庫。因此，本發明之提供系統亦可包含被驗者資訊取得之階段(以下亦稱為「被驗者資訊取得階段」。)及/或選擇適合於被驗者之T細胞製品之階段。以下將實行被驗者資訊取得階段所構成之部分稱為「被驗者資訊取得部」。

就被驗者之資訊而言，沒有特別限制，可舉例如被驗者之基因資訊(例如，HLA基因關聯資訊、異常基因資訊等)、診斷結果、既往病歷、藥劑服用經歴、年齡、性別、血型、身高、體重、被驗者罹患腫瘤時該腫瘤所表現之腫瘤特異性抗原或腫瘤關聯抗原相關資訊等。

3. 製造T細胞製品之方法

又另一態樣中，本發明係提供製造T細胞製品之方法(以下亦稱為「本發明之T細胞製品之製法」。)，該方法係包含下述之步驟：(A)由本發明之T細胞細胞庫，準備T細胞之步驟；(B)將CAR基因或外因性TCR基因導入於該準備之T細胞之步驟；以及(C)將經導入該CAR基因或外因性TCR基因之T細胞擴大培養之步驟。本發明之T細胞製品之製法亦可進一步包含(D)將該經擴大培養之T細胞凍結之步驟。又，本發明亦提供藉由本發明之T細胞製品之製法所製造之T細胞製品(以下亦稱為「本發明之T細胞製品」。)。上述之各步驟可由同一主體進行，亦可由相異之主體進行。

3-1. T細胞之準備

上述3.之步驟(A)可使用本發明之T細胞細胞庫，藉由上述1-3.所述之方法進行。

3-2. 核酸之導入

上述3.之步驟(B)可使用以上述3-1.之方法所準備之T細胞，藉由上述1-4.所述之方法進行。又，步驟(B)中所使用之T細胞較佳係表現IL-15/IL-15Rα。關於核酸之種類、對於CAR、TCR以及IL-15/IL-15Rα之說明、各用語之定義、作為TCR或CAR標的之抗原之具體例等，係如上述1-1.所述之內容。因此，一態樣中，本發明之凍結儲存之製法中所使用之T 細胞，或本發明之T細胞凍結儲存中所含有之T細胞，係使前述CAR或外因性TCR可辨識而結合上述1-1.之腫瘤特異性抗原或腫瘤關聯抗原作為其特徵。

3-3. 擴大培養

上述3.之步驟(C)可使用以上述3-2.之方法經導入核酸之T細胞，藉由上述1-5.所述之方法進行。擴大培養之方法、擴大培養中所使用之化合物之具體例、該化合物之培養基中之濃度、各用語之定義等係如上述1-5.中所記載之內容。因此，一態樣中，本發明之凍結儲存之製法可包含前述T細胞於CD30促效劑之存在下培養該細胞之步驟。

3-4. T細胞之凍結

上述3.之步驟(D)係可以使用上述3-3.之方法所擴大培養之T細胞，藉由上述1-2.所述之方法進行。

4. T細胞製品採集品之建構方法

另一態樣中，本發明亦可進一步提供包含2種類以上T細胞製品之T細胞製品採集品之建構方法(以下亦稱為「本發明之T細胞製品採集品建構方法」。)，該方法係可包含收集本發明之T細胞製品之步驟。又，本發明亦提供藉由本發明之T細胞製品採集品建構方法所建構之T細胞製品採集品(以下亦稱為「本發明之T細胞製品採集品」。)。構成本發明T細胞製品採集品之T細胞製品可為凍結T細胞製品，由T細胞之安定性之觀點而言為凍結T細胞製品較佳。

本發明之T細胞製品之收集步驟係可使用本發明之T細胞製品，藉由上述1-7.所述之方法進行。T細胞製品採集品中所含有之T細 胞製品可由與建構T細胞製品採集品之主體為同一主體製造，亦可由相異之主體製造。因此，T細胞製品採集品亦可含有由相異主體製造之T細胞製品。

5. T細胞製品之製造方法

本發明亦提供T細胞製品之製造方法(以下亦稱為「本發明之T細胞製品之製法」。)，該方法可包含建構T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫之步驟。

T細胞、T細胞製品、主細胞庫、工作細胞庫等具體例或用語之定義，係如上述1-1.所述之內容。又，上述多能性幹細胞、T細胞、T細胞製品、主細胞庫以及工作細胞庫亦可藉由例如上述1.以及2.所述之方法等進行製造/建構。又，本發明之T細胞製品之製法可包含(a)使多能性幹細胞分化為T細胞之步驟；(b)將該經分化之T細胞儲存之步驟；(c)進行該經分化之T細胞之特性解析之步驟；(d)由該細胞之儲存，準備T細胞之步驟；(e)將包含外因性基因之核酸導入於T細胞之步驟；及/或(f)擴大培養T細胞之步驟。又，本發明之T細胞製品之製法中所使用之T細胞，係可為抑制至少1種HLA基因之表現之T細胞。具體的HLA基因或組合、該基因之表現抑制之定義或抑制方法等係如上述1-1.中所記載之內容。上述之各步驟可由同一主體進行，亦可由相異之主體進行。

上述5.之步驟(a)可使用上述1-1.所述之多能性幹細胞，藉由上述1-1.之步驟(1)以及(2)所述之方法進行。上述多能性幹細胞較佳為人工多能性幹細胞，再佳為人類人工多能性幹細胞。關於本發明之細胞庫建構方法以及本發明之T細胞細胞庫中所使用之人工多能性幹細胞，可藉由 上述1-1.中所記載之方法進行樹立。上述5.之步驟(b)可使用由上述步驟(1)所分化之T細胞，藉由上述1-1.以及1-2.所述之方法進行。上述5.之步驟(c)可使用由上述步驟(1)所分化之T細胞，藉由上述2-2.所述之方法進行。上述步驟(d)可使用由上述步驟(c)所製造之細胞儲存，藉由上述1-3.所述之方法進行。

上述5.之步驟(e)可使用由前述步驟(a)所分化之T細胞、由前述步驟(b)所儲存之細胞、由前述步驟(c)進行特性解析之T細胞，或由前述步驟(d)所準備之T細胞，藉由上述1-4.所述之方法進行。又，步驟(e)中所使用之T細胞，較佳係表現IL-15/IL-15Rα。關於核酸之種類、關於CAR、TCR以及IL-15/IL-15Rα之說明、各用語之定義、關於TCR或CAR作為標的之抗原之具體例等，如上述1-1.所述之內容。因此，一態樣中，於本發明之凍結儲存之製法中所使用之T細胞、或本發明之T細胞凍結儲存中所含有之T細胞，係使前述CAR或外因性TCR可辨識而結合上述1-1.之腫瘤特異性抗原或腫瘤關聯抗原作為其特徵。

上述5.之步驟(f)可使用藉由前述步驟(e)導入核酸之T細胞，藉由上述1-5.所述之方法進行。擴大培養之方法、擴大培養中所使用之化合物之具體例、該化合物之培養基中之濃度、各用語之定義等，係如上述1-5.中所記載之內容。因此，一態樣中，本發明之T細胞製品之製法可包含由前述T細胞於CD30促效劑之存在下培養該細胞，刺激T細胞之步驟。

6. T細胞製品之提供方法

再者，本發明係提供將適合之T細胞製品提供於被驗者之方法(以下亦稱為「本發明之提供方法」。)。為了將適合之T細胞製品提供於被驗者，藉由本發明取得被驗者之資訊，可基於該資訊選擇適當之T細胞細胞庫及/或適當之T細胞製品。因此，本發明之提供方法係包含(p)取得被驗者之資訊之步驟；以及(q)基於該取得之被驗者之資訊選擇適當的T細胞細胞庫及/或適當的T細胞製品之步驟。使用經選擇之T細胞細胞庫，提供於上述5.中的步驟(e)及/或步驟(f)，可製造T細胞製品並提供於被驗者。又，本發明之提供方法，於被驗者罹患有腫瘤之情形，可取得該腫瘤中所表現之腫瘤特異性抗原或腫瘤關聯抗原之相關資訊，並基於此可選擇適當之T細胞製品。因此，本發明之提供方法係包含：(x)鑑別被驗者之腫瘤中所表現之腫瘤特異性抗原或腫瘤關聯抗原之步驟；以及(y)由本發明之T細胞製品採集品選擇表現出會辨識而結合該經鑑別之抗原之CAR或外因性TCR之T細胞製品之步驟。(x)對被驗者之腫瘤中所表現之腫瘤特異性抗原或腫瘤關聯抗原進行鑑別之步驟，以及(y)由本發明之T細胞製品採集品選擇表現出會辨識而結合該經鑑別之抗原之CAR或外因性TCR之T細胞製品之步驟，係於概念上包含：(p)取得被驗者之資訊之步驟，以及(q)基於該取得之被驗者之資訊選擇適當的T細胞製品之步驟。T細胞、T細胞製品、被驗者等用語之種類或定義，係如上述1-1.至1-10.所述之內容。上述之各步驟可由同一主體進行，亦可由相異之主體進行。

上述6.之步驟(x)可使用源自被驗者之生物體樣品，藉由上述1-8.所述之方法進行。源自被驗者之生物體樣品之具體例，係如上述1-8.中所記載之內容。

上述6.之步驟(y)可基於前述步驟(x)之鑑別結果，藉由上述1-9.所述之方法進行。關於CAR以及TCR之說明或定義、腫瘤特異性抗原以及腫瘤關聯抗原之具體例、評價基準之具體例等，如上述1-1、1-9.所述之內容。

藉由因本發明之提供方法所提供之T細胞製品進行預防或治療之癌或腫瘤之具體例，係如上述1-10.所述之內容。又，上述T細胞製品中所含有之T細胞之培養及/或刺激方法、投與路徑、投與量、被驗者種類等亦如上述1-1-10.所述之內容。

將本發明藉由以下之實施例進一步具體說明，惟本發明之範圍不限定於此等實施例。

[實施例]

[實施例1]

1. iPS細胞之準備

iPS細胞係使用由京都大學iPS細胞研究所(CiRA)所供與之iPS細胞(Ff-I01s04株：源自正常人末梢血單核球)。iPS細胞培養係依據CiRA所配置之規程「無餵養細胞之人iPS細胞之培養」進行。

2. 對於iPS細胞之T細胞受體(TCR)基因之導入

2-1. WT1-TCR基因之導入

將愛媛大學大學院醫學研究科安川正貴教授所供與之源自TAK1、編碼HLA-A*24：02拘束性WT1特異的TCR之TRB基因和TRA基因，及以P2A序列連繫之基因(WT1-TCR)導入於iPS細胞。對於iPS細胞之基因導入，係由於對於由理化學研究所所供與之CS-UbC-RfA-IRES2-hKO1慢 病毒載體組入，使iPS細胞感染而進行。以下將經導入WT1-TCR基因之iPS細胞稱為「WT1αβ-iPSC」。

2-2. Vγ9Vδ2-TCR基因之導入

將編碼源自G115γδT純株之Vγ9Vδ2 T細胞受體之TRG基因和TRD基因、以P2A序列連繫之基因(Vγ9Vδ2TCR G115)導入於iPS細胞。Vγ9Vδ2TCR G115係編碼由N端以表1之順序排列之方式將經設計之多肽(序列編號1)，屬於經人工合成之寡去氧核糖核酸(Oligo DNA)。

[表1]

由pLVSIN-CMV Neo(Clontech公司)除去編碼新黴素抗性基因之序列，使用CMV啟動子經置換為人泛蛋白啟動子之pLVSIN-Ub製作慢病毒載體。編碼上述中經合成之Vγ9Vδ2TCR G115之人工Oligo DNA組入於pLVSIN-Ub慢病毒載體之多選殖位點(multi-cloning site)。使用此質體和Clontech公司之Lenti-XTM 293T細胞株以及Lenti-XTMPackaging Single Shots(VSV-G)製作慢病毒載體。藉由使所製作之慢病毒載體，感染於[實施例1]之1.中所準備之iPS細胞，將Vγ9Vδ2-TCR基因導入於iPS細胞。以下亦將Vγ9Vδ2TCR G115基因所導入之iPS細胞稱為「Vγ9Vδ2-iPSC」。

[實施例2]

1. 成為iPS細胞之造血前驅細胞(HPC)之分化

分化為iPS細胞之造血前驅細胞(HPC)之分化，係依據周知之方法(例如Cell Reports 2(2012)1722-1735或國際公開第2017/221975號中所記載之方法)使用使其經分化之懸浮細胞集團。具體而言，係將[實施例1]之1.、[實施例1]之2-1.以及[實施例1]之2-2.中所得之iPS細胞、WT1αβ-iPSC以及Vγ9Vδ2-iPSC以3 x 10⁵cells/well之方式播種於分別經超低接著處理之6孔盤，於EB培養基(於StemPro34添加10μg/ml人胰島素、5.5μg/ml人轉鐵蛋白、5ng/ml亞硒酸鈉、2mM L-麩胺酸、45mM α-單硫甘油，以及50μg/ml抗壞血酸2-磷酸酯(Ascorbic acid 2-phosphate))加入10ng/ml BMP4、50ng/ml bFGF、15ng/ml VEGF、2μM SB431542，於低氧條件下(5% O₂)進行培養5日。接著，添加50ng/ml SCF、30ng/ml TPO、10ng/ml Flt3L進一步培養5至9日，而得到懸浮細胞集團。此外，於培養期間中每2日或3日進行培養基交換。將含有HPC之上述懸浮細胞集團使用表2之抗體組進行染色。將進行上述染色之細胞集團，提供於藉由FACSAria所進行之選別。

[表2]

2. 於HPC導入Vγ9Vδ2-TCR基因

對於[實施例2]之1.中所得之細胞分畫，將編碼源自G115γδT純株之Vγ9Vδ2 T細胞受體之TRG基因和TRD基因，導入以P2A序列連繫之基因(Vγ9Vδ2TCR G115)。基因之導入係藉由與[實施例1]之2-2.同樣之方法進行。以下將於HPC中經導入Vγ9Vδ2TCR G115基因之HPC稱為「Vγ9Vδ2-iHPC」。

[實施例3]

1. 成為HPC之T細胞之分化

將[實施例2]之1.中所得之細胞分畫以及[實施例2]之2.中所得之Vγ9Vδ2-iHPC依據周知之方法(例如Journal of Leukocyte Biology 96(2016)1165-1175或國際公開第2017/221975號中所記載之方法)，使其分化為淋巴球系細胞。具體而言，係將造血前驅細胞集團，以2000cells/well之方式，於被覆有Recombinant h-DLL4/Fc chimera(SinoBiological)和Retronectin(寶生物有限公司)之48-孔盤以2000cells/well播種，於5%CO₂、37℃條件下培養。培養期間中每2日或3日進行培養基交換。此外，使用培養基中經添加15% FBS和2mM L-麩胺酸、100U/ml青黴素、 100ng/ml鏈黴素、55μM 2-巰基乙醇、50μg/ml抗壞血酸2-磷酸酯、10μg/ml人胰島素、5.5μg/ml人轉鐵蛋白、5ng/ml亞硒酸鈉、50ng/ml SCF，50ng/ml IL-7、50ng/ml Flt3L、100ng/ml TPO、15μM SB203580、30ng/ml SDF-1α之αMEM培養基。培養開始起第7日以及第14日繼代於有相同被覆之48-孔盤。於培養開始第21日回收全部之細胞，將存有CD45(+)、CD3(+)分畫藉由流式細胞儀進行確認。將所得之細胞播種於24-孔盤，於5%CO₂、37℃條件下培養。就培養基而言，係使用含有下述各物質之αMEM培養基：15% FBS和2mM L-麩胺酸、100U/ml青黴素、100ng/ml鏈黴素、50ng/ml抗壞血酸2-磷酸酯、10μg/ml人胰島素、5.5μg/ml人轉鐵蛋白，5ng/mL亞硒酸鈉，500ng/mL抗CD3抗體(UCHT1或OKT3株)，10nM***(富士製藥工業股份有限公司：10171-H02H)，100U/ml IL-2，10ng/mL IL-7。於培養開始第27日(Day41)。以下，分別將由[實施例1]之1.中所得之iPS細胞分化之T細胞稱為「iγδTC」、將由[實施例1]之2-1.中所得之WT1αβ-iPSC分化之T細胞稱為「iWT1αβTC」、將由[實施例1]之2-2.中所得之Vγ9Vδ2-iPSC分化之T細胞稱為「Vγ9Vδ2-iTC」、將由[實施例]之2.中所得之Vγ9Vδ2-iHPC分化之T細胞稱為「Vγ9Vδ2-iHTC」。

關於iγδTC係使用表3之抗體組進行染色(圖3以及4)。

[表3]

關於iγδTC，將細胞膜表面上之CD3、VδTCR、αβTCR、TCR-Vδ1鏈、以及TCR-Vδ2鏈之表現以流式細胞儀測定(圖3以及4)。

關於Vγ9Vδ2-iTC(圖5)以及Vγ9Vδ2-iHTC(圖6)，將細胞膜表面上之CD3、VδTCR、TCR-Vδ1鏈以及TCR-Vδ2鏈之表現以流式細胞儀測定。

[實施例4]

T細胞之擴大培養

1. iγδTC之擴大培養

1-1. 擴大培養

將[實施例3]中所得之iγδTC，以於含有15% FBS之α-MEM培養基中加入有表4之細胞介素之培養基以2,000,000cells/mL之方式進行懸濁，播種於經固相化之抗CD3抗體(UCHT1)和RetroNectin盤，在5% CO₂/37℃下進行培養3日。於培養第3日由盤回收細胞，使用Nucleocounter(註冊商標)NC-200(ChemoMetec)計測細胞數之同時，以於含有15% FBS之α-MEM培養基中加入有表5之細胞介素之培養基適量地進行懸濁，添加於未固相化之G-Rex(註冊商標)6孔盤(WILSONWOLF)，在5%CO₂/37℃下 進行培養。於之後培養第5、6、7、8、9、10、11、14日中任4至6次，由盤回收一部分之細胞並使用Nucleocounter(註冊商標)NC-200計測細胞數。抗CD3抗體以及RetroNectin之培養盤之固相化係以以下之方法進行。以必要之濃度經溶解於PBS之抗CD3抗體(UCHT1，最終濃度3000ng/mL)以及RetroNectin(最終濃度150μg/mL)添加於盤後，在4℃下靜置一晚。

1-2. 增殖率

將[實施例4]之1-1.擴大培養重複5次時之iγδTC細胞數之增殖率表示於圖7。iγδTC係至少能以10¹¹倍以上擴大培養，可作為構成T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫之T細胞使用。

[表4]

[表5]

2. Vγ9Vδ2-iTC之擴大培養

2-1. 擴大培養

將[實施例3]中所得之Vγ9Vδ2-iTC，以於含有15% FBS之α-MEM培養基中加入有表6細胞介素之培養基以2,000,000cells/mL之方式進行懸濁，播種於經固相化之抗CD3抗體(OKT3)和RetroNectin盤，在5% CO₂/37℃下進行培養3日。於培養第3日由盤回收細胞，以於含有15% FBS之α-MEM培養基中加入有表5之細胞介素之培養基適量地懸濁，添加於未固相化之G-Rex(註冊商標)6孔盤(WILSONWOLF)，在5%CO₂/37℃下進行培養。於之後培養第5、6、7、8、9、10、11、14日中任4至6次，由盤回收一部分之細胞並使用Nucleocounter(註冊商標)NC-200計測細胞數。抗CD3抗體以及RetroNectin培養盤之固相化係以[實施例4]之1-1.之方法實施。

2-2. 增殖率

將[實施例4]之2-1.擴大培養重複5次時之Vγ9Vδ2-iTC細胞數之增殖率表示於圖8。Vγ9Vδ2-iTC係至少能以10¹²倍以上擴大培養，可作為構成T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫之T細胞使用。

[表6]

3. WT1αβ-iTC之擴大培養

3-1. 擴大培養

將[實施例3]中所得之iWT1αβTC，以於含有15% FBS之α-MEM培養基中加入有表6細胞介素之培養基以2,000,000cells/mL之方式進行懸濁，播種於經固相化之抗CD3抗體(OKT3)和RetroNectin盤，在5% CO₂/37℃下進行培養3日。於培養第3日由盤回收細胞，使用Nucleocounter(註冊商標)NC-200(ChemoMetec)計測細胞數之同時，以於 含有15% FBS之α-MEM培養基中加入有表5細胞介素之培養基適量地懸濁，添加於未固相化之G-Rex(註冊商標)6孔盤(WILSONWOLF)，在5% CO₂/37℃下進行培養。於之後培養第5、6、7、8、9、10、11、14日中任4至6次，由盤回收一部分之細胞並使用Nucleocounter(註冊商標)NC-200計測細胞數。抗CD3抗體以及RetroNectin培養盤之固相化係以以下之方法進行。以必要之濃度溶解於PBS之抗CD3抗體(OKT3，最終濃度3000ng/mL)以及RetroNectin(最終濃度150μg/mL)添加於盤後，在4℃下靜置一晚。

3-2. 增殖率

將[實施例4]之3-1.擴大培養重複4次時之iWT1αβTC細胞數之增殖率表示於圖9。iWT1αβTC係至少能以10¹⁰倍以上擴大培養，可作為構成T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫之T細胞使用。

[實施例5]

1. T細胞主細胞庫之建構

將[實施例4]中所得之T細胞培養液置換為包含凍結保護劑之凍結保存液(CryoStor CS10)，分注於複數之保存容器(無菌小瓶(聚合物製小瓶(AT-closed vial)))。藉由將含有該T細胞之容器靜置於冷凍櫃內使T細胞凍結。就冷凍櫃而言，係使用屬於程式冷凍櫃之CryoMed(Thermo Fisher)。經由將此進行儲存而建構凍結之T細胞主細胞庫。

2. T細胞工作細胞庫之建構

由[實施例5]之1.經凍結之T細胞主細胞庫採取含有T細胞之容器。將該容器浸於約37℃之水浴約15秒而將T細胞進行融解。將融解所得之 T細胞以加入表5之細胞介素之培養基適量地懸濁，添加於6孔盤，在5%CO₂/37℃下進行培養。培養1日至3日後，以[實施例4]之方法，將T細胞擴大培養後，和上述同樣的方式進行凍結，經由儲存而建構T細胞工作細胞庫。

3. 特性解析和品質評價

與[實施例5]之2.同樣的方式由T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫採取一容器，融解T細胞。針對所得之T細胞進行特性解析和品質評價。

4. T細胞細胞庫採集品之建構

將[實施例5]之1.中所得之複數種類之T細胞主細胞庫收集，附以使T細胞主細胞庫之種類可供區別之標籤等，經由進行保管而建構T細胞主細胞庫採集品。

[實施例6]

1. T細胞之準備

與[實施例5]之2.同樣的方式由T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫採取一容器，融解T細胞。將融解所得之T細胞以加入有表5之細胞介素之培養基適量地懸濁，添加於6孔盤，在5%CO₂/37℃下進行培養。培養1日至3日後，以於含有15% FBS之α-MEM培養基中加入有表4或表6細胞介素之培養基以2,000,000cells/mL之方式進行懸濁，播種於經固相化之抗CD3抗體(UCHT1或OKT3)和RetroNectin盤，在5%CO₂/37℃下進行培養3日。於培養第3日由盤將細胞進行回收，使用Nucleocounter(註冊商標)NC-200(ChemoMetec)計測細胞數之同時，以於含有15% FBS之α-MEM培養基中加入有表5之細胞介素之培養基適量地懸濁，添加於 未固相化之細胞培養燒瓶(25cm²或75cm²)，在5%CO₂/37℃下進行培養1日而準備T細胞。

2. 對於T細胞之核酸導入

2-1. 抗CD19-CAR基因之導入

就編碼抗CD19-CAR之基因而言，係編碼由N端起以表7之順序排列所設計之多肽(序列編號2)之人工合成之Oligo DNA。

[表7]

將上述中經合成之人工Oligo DNA組入於pMEI-5反轉錄病毒載體之多選殖位點。病毒載體製作係委託UNITECH公司。使搭載編碼所製作之抗CD19-CAR基因之反轉錄病毒載體，感染於[實施例3]所製作之iWT1αβTC，製作源自iPS細胞之抗CD19-CART細胞(以下亦稱為「CD19iWT1αβCARTC」。)。

2-2. 抗BCMA-CAR基因之導入

就編碼抗BCMA-CAR之基因而言，係編碼由N端起以表8之順序排列所設計之多肽(序列編號3)之人工合成Oligo DNA。

[表8]

將上述中經合成之人工Oligo DNA組入於pMEI-5反轉錄病毒載體之多選殖位點。病毒載體製作係委託UNITECH公司。使搭載編碼所製作之抗BCMA-CAR之反轉錄病毒載體，感染於[實施例3]所製作之iWT1αβTC，製作源自iPS細胞之抗BCMA-CART細胞(以下亦稱為「BMCAiWT1αβCARTC」。)。

2-3. 含有源自CD30細胞內結構域之抗CD19-CAR基因之導入

就包含源自CD30細胞內結構域之抗CD19-CAR基因而言，係編碼由N端起以表9之順序排列所設計之多肽(序列編號4)之人工合成之Oligo DNA。

[表9]

將上述中經合成之人工Oligo DNA組入於pMY反轉錄病毒載體之多選殖位點。使用反轉錄病毒載體產生用之FLYRD18細胞製作病毒載體。使搭載編碼所製作之包含源自CD30細胞內結構域之抗CD19-CAR基因之反轉錄病毒載體，感染於[實施例1]之3.所製作之WT1αβ-iTC，製作包含源自CD30細胞內結構域之iPS細胞來源的抗CD19-CART細胞(以下亦稱為「「CD19-CD30-iWT1αβCARTC」)。

2-4. 抗CD19-CAR基因之導入

就編碼抗CD19-CAR進行基因之基因而言，係編碼由N端起以表10之順序排列所設計之多肽(序列編號5)之人工合成之Oligo DNA。

[表10]

將上述中經合成之人工Oligo DNA組入於pMY反轉錄病毒載體之選殖隆位點。使用反轉錄病毒載體產生用之FLYRD18細胞製作病毒載體。使搭載編碼所製作之抗CD19-CAR基因之反轉錄病毒載體，感染於[實施例3]所製作之iγδTC，製作源自iPS細胞之抗CD19-CART細胞(以下亦稱為「CD19iγδCARTC」。)。

[實施例7]

1. T細胞之細胞傷害活性等

1-1. CD19iWT1αβCARTC以及BMCAiWT1αβCARTC之細胞傷害活性

[實施例6]之2-1.以及2-2.所得之CD19iWT1αβCARTC以及BMCAiWT1αβCARTC，各別針對CD19陽性Raji癌細胞以及BCMA陽性H929癌細胞評價細胞傷害活性。CD19iWT1αβCARTC或iWT1αβTC以相對於Raji細胞為16倍之比例混合，以於2小時後標的細胞死亡為基 準，評價CD19iWT1αβCARTC之細胞傷害活性。又BCMAiWT1αβCARTC或iWT1αβTC以相對於H929細胞為16倍之比例混合，以於2時間後之標的細胞死亡為基準，評價BCMAiWT1αβCARTC之細胞傷害活性。CD19iWT1αβCARTC以及BMCAiWT1αβCARTC係具有針對各別CD19陽性Raji癌細胞以及BCMA陽性H929癌細胞之細胞傷害活性，顯示出可製造相同由iWT1αβTC而來之2種CART(圖10)。

1-2. CD19-CD30-iWT1αβCARTC之細胞傷害活性

將[實施例6]之2-3.中所得之CD19-CD30-iWT1αβCARTC之相對於CD19陽性Raji癌細胞評價細胞傷害活性。CD19-CD30-iWT1αβCARTC以相對於Raji細胞為0.5、1、2、4、8、16倍之比例混合，2時間後之標的細胞死亡為基準，評價CD19-CD30-iWT1αβCARTC之細胞傷害活性。CD19-CD30-iWT1αβCARTC對於CD19陽性Raji癌細胞係具有細胞傷害活性，顯示出可製造相同由iWT1αβTC而來之相異之CART(圖11)。

1-3. CD19iγδCARTC之細胞傷害活性

評價[實施例6]之2-4.中所得之CD19iγδCARTC之細胞傷害活性。將CD19陽性Raji細胞以及CD19陰性CCRF-CEN細胞作為標的細胞，將CD19iγδCARTC以相對於標的細胞為0.5、1、2、4、8、16倍之比例混合，2時間後之標的細胞死亡為基準，評價CD19iγδCARTC之細胞傷害活性。CD19iγδCARTC對於CD19陽性Raji細胞係具有細胞傷害活性，然而對於CD19陰性CCRF-CEN細胞卻不具備細胞傷害活性，顯示出具有抗原特異性的細胞傷害活性(圖12)。

[實施例8]

1.抗CD19-CAR基因以及IL-15Rα/IL-15基因之導入

就IL-15Rα/IL-15基因而言，係編碼由N端起以表11之順序排列所設計之多肽(序列編號7)之人工合成之Oligo DNA。

[表11]

將上述中經合成之人工Oligo DNA組入於pMY反轉錄病毒載體之多選殖位點。使用反轉錄病毒載體產生用之FLYRD18細胞製作病毒載體。使搭載編碼所製作之IL-15Rα/IL-15基因之反轉錄病毒載體以及搭載[實施例6]之2-4.所製作之抗CD19-CAR基因之反轉錄病毒載體，感染於[實施例3]所製作之iγδTC以及Vγ9Vδ2-iTC，各別製作CD19/IL15iγδCARTC以及CD19/IL15iVγ9Vδ2CARTC。

[實施例9]1.T細胞製品

1-1. T細胞之擴大培養(CD19/IL15iVγ9Vδ2CARTC)

將[實施例8]中所得之CD19/IL15iVγ9Vδ2CARTC，以於含有15% FBS之α-MEM培養基中加人有表6之細胞介素之培養基以2,000,000cells/mL之方式進行懸濁，播種於經固相化之抗CD3抗體(UCHT1)和RetroNectin盤，在5% CO₂/37℃下進行培養3日。於培養第3日由盤回收細胞，使用Nucleocounter(註冊商標)NC-200(ChemoMetec)計測細胞 數之同時，以於含有15% FBS之α-MEM培養基中加入有表5之細胞介素之培養基適量地懸濁，添加於未固相化之G-Rex(註冊商標)6孔盤(WILSONWOLF)，在5%CO₂/37℃下進行培養。於之後培養第5、6、7、8、9、10、11、14日中任4至6次，由盤回收一部分之細胞並使用Nucleocounter(註冊商標)NC-200計測細胞數。抗CD3抗體以及RetroNectin培養盤之固相化係以以下之方法進行。以必要之濃度溶解於PBS之抗CD3抗體(UCHT1，最終濃度3000ng/mL)以及RetroNectin(最終濃度150μg/mL)添加於盤後，在4℃下靜置一晚。

1-2. 增殖率

將[實施例9]之1-1.擴大培養重複3次時之CD19/IL15iVγ9Vδ2CARTC細胞數之增殖率表示於圖13。CD19/IL15iVγ9Vδ2CARTC係至少能以10⁹倍以上擴大培養。

以此方式可提供由T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫而來，可擴大培養CAR-T細胞並大量製造T細胞製品(例如，CAR-T細胞製品)。將經擴大培養之各種T細胞填充於適當之保存容器(無菌小瓶或輸血袋等)，將標籤附於該容器並包裝該容器，而製造T細胞製品。

1-3. T細胞製品之凍結

含有經擴大培養之各種T細胞之容器以與[實施例5]之1.相同樣之方式進行凍結，製造凍結T細胞製品。

1-4. T細胞製品採集品之建構

藉由將上述中所得之凍結T細胞製品附以可區別該等的種類區別之標籤並保管，建構T細胞製品採集品。

[實施例10]

1. 抗原之鑑別

由被驗者採取腫瘤組織片或腫瘤細胞中所含有之體液(例如，血液、血清、血漿等)等生物體樣品，由該樣品中抽取mRNA，視需要由該mRNA合成cDNA，並使用該cDNA，利用數位聚合酶連鎖反應(例如，ddPCR)、RT-PCR、生物晶片(例如，微陣列(microarray))、RNAseq等核酸增寬方法及/或核酸檢出方法進行鑑別。

2. T細胞製品之選擇

基於由[實施例10]之1.之鑑別結果所顯示之資料(紙媒體或電子數據媒體)，由預先做成之T細胞製品之列表等選擇包含表現出會辨識而結合經鑑別之抗原之CAR或外因性TCR之T細胞之T細胞製品。

[實施例11]

1.由CD19/IL15iγδCARTC所致之生存日數延長效果

對於NOD/Shi-scid,IL-2RγKO(NOG)小鼠(實驗動物中央研究所，雌性，7-8週齡)將5x10⁵個Nalm6細胞(ATCC)進行尾靜脈移植而製作Nalm6異種移植小鼠。移植後第4日，將CD19/IL15iγδCARTC(5x10⁶個(cells))懸濁於0.1mL HBSS-緩衝液之懸濁液或等量HBSS-緩衝液尾靜脈投與後，確認生存日數。關於將CD19陽性Nalm6癌細胞經尾靜脈移植之小鼠相對於對照投與群為3週間以內全例死亡，於CD19/IL15iγδCARTC投與群中，至少至6週後全例仍生存(圖14)。

2. CD19/IL15iVγ9Vδ2CARTC之抗腫瘤效果

對於NOD/Shi-scid,IL-2RγKO(NOG)小鼠(實驗動物中央研究所，雌性，7-8週齡)將5x10⁵個螢光素酶表現Nalm6細胞(ATCC)進行尾靜脈移植而製作螢光素酶表現Nalm6異種移植小鼠。移植後第4日，將[實施例6]之1-2.中所得之CD19/IL15iVγ9Vδ2CARTC(10⁷個(cells))懸濁於0.2mL HBSS-緩衝液之懸濁液或等量HBSS-緩衝液尾靜脈投與後，確認生存日數。關於將CD19陽性Nalm6癌細胞進行尾靜脈移植之小鼠相對於對照投與群為3週間以內全例死亡，CD19/IL15iγδCARTC投與群中，至少至6週後全例仍生存(圖15)。

[產業上之利用可能性]

藉由本發明可提供人為上的、時間上的以及金錢上的成本低減，並且提供批次間差異小且高品質之現貨型(off-the-shelf)之同種異體系的T細胞製品(尤其複數種之CAR-T細胞製品)之提供系統，如此進行所提供之T細胞製品，對於癌或腫瘤等疾患之預防或治療為有用者。

本申請案，係基於在日本提出申請之特願2019-212718(申請日：2019年11月25日)，在此將該等的內容全部引用於本說明書。

<110> 國立大學法人京都大學(KYOTO UNIVERSITY) 日商武田藥品工業股份有限公司(TAKEDA PHARMACEUTICAL COMPANY LIMITED)

<120> T細胞主細胞庫

<130> 093085

<140> TW 109141143

<141> 2020-09-30

<150> JP 2019-212718

<151> 2019-11-25

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 629

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Vgamma9 Vdelta2 TCR

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(315)

<223> T細胞受體gamma

<220>

<221> 信號

<222> (316)..(337)

<223> P2A

<220>

<221> 肽

<222> (338)..(629)

<223> T細胞受體delta

<400> 1

<210> 2

<211> 544

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19-CAR(CD8-CD28-4-1BB-CD3z)

<220>

<221> 信號

<222> (1)..(22)

<223> 免疫球蛋白重鏈之前導序列

<220>

<221> 肽

<222> (23)..(126)

<223> CD19抗體輕鏈可變區

<220>

<221> 肽

<222> (127)..(141)

<223> 肽連結子

<220>

<221> 肽

<222> (142)..(261)

<223> CD19抗體重鏈可變區

<220>

<221> 肽

<222> (262)..(344)

<223> CD8衍生序列

<220>

<221> 肽

<222> (345)..(385)

<223> CD28細胞內結構域區

<220>

<221> 肽

<222> (386)..(432)

<223> 4-1BB細胞內結構域區

<220>

<221> 肽

<222> (433)..(544)

<223> CD3 zeta細胞內結構域區

<400> 2

<210> 3

<211> 551

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCMA-CAR(CD8-CD28-4-1BB-CD3z)

<220>

<221> 信號

<222> (1)..(19)

<223> 免疫球蛋白重鏈之前導序列

<220>

<221> 肽

<222> (20)..(130)

<223> BCMA抗體輕鏈可變區

<220>

<221> 肽

<222> (131)..(148)

<223> 肽連結子

<220>

<221> 肽

<222> (149)..(265)

<223> BCMA抗體重鏈可變區

<220>

<221> 肽

<222> (266)..(351)

<223> CD8衍生序列

<220>

<221> 肽

<222> (352)..(392)

<223> CD28細胞內結構域區

<220>

<221> 肽

<222> (393)..(439)

<223> 4-1BB細胞內結構域區

<220>

<221> 肽

<222> (440)..(551)

<223> CD3 zeta細胞內結構域區

<400> 3

<210> 4

<211> 584

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19-CAR(CD8-CD28-CD30-CD3z)

<220>

<221> 信號

<222> (1)..(22)

<223> 免疫球蛋白重鏈之前導序列

<220>

<221> 肽

<222> (23)..(126)

<223> CD19抗體輕鏈可變區

<220>

<221> 肽

<222> (127)..(141)

<223> 肽連結子

<220>

<221> 肽

<222> (142)..(261)

<223> CD19抗體重鏈可變區

<220>

<221> 肽

<222> (262)..(344)

<223> CD8衍生序列

<220>

<221> 肽

<222> (345)..(385)

<223> CD28細胞內結構域區

<220>

<221> 肽

<222> (386)..(472)

<223> CD30細胞內結構域區

<220>

<221> 肽

<222> (473)..(584)

<223> CD3 zeta細胞內結構域區

<400> 4

<210> 5

<211> 503

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19-CAR(CD8-4-1BB-CD3z)

<220>

<221> 信號

<222> (1)..(22)

<223> 免疫球蛋白重鏈之前導序列

<220>

<221> 肽

<222> (23)..(126)

<223> CD19抗體輕鏈可變區

<220>

<221> 肽

<222> (127)..(141)

<223> 肽連結子

<220>

<221> 肽

<222> (142)..(261)

<223> CD19抗體重鏈可變區

<220>

<221> 肽

<222> (262)..(344)

<223> CD8衍生序列

<220>

<221> 肽

<222> (345)..(391)

<223> 4-1BB細胞內結構域區

<220>

<221> 肽

<222> (392)..(503)

<223> CD3 zeta細胞內結構域區

<400> 5

<210> 6

<211> 87

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

<210> 7

<211> 400

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> 信號

<222> (1)..(23)

<223> 人IL-2前導序列

<220>

<221> 肽

<222> (24)..(137)

<223> 人IL-15

<220>

<221> 肽

<222> (138)..(161)

<223> 肽連結子

<220>

<221> 肽

<222> (162)..(400)

<223> 人IL-15Ra

<400> 7

Claims (36)

1. 一種T細胞製品之提供系統，係包含T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫。
2. 如請求項1所述之提供系統，其中，前述T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫包含源自人工多能性幹細胞之T細胞。
3. 如請求項1或2所述之提供系統，其中，前述T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫包含至少1種HLA基因之表現受抑制之T細胞。
4. 如請求項1至3中任一項所述之提供系統，係包含將包含外因性基因之核酸導入由前述T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫所準備之T細胞之階段。
5. 如請求項4所述之提供系統，其中，前述外因性基因係CAR基因或外因性之TCR基因。
6. 如請求項1至5中任一項所述之提供系統，其中，前述T細胞製品之種類為2種以上。
7. 如請求項1至6中任一項所述之提供系統，係進一步包含將由前述T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫所準備之T細胞擴大培養之階段。
8. 如請求項7所述之提供系統，其中，前述擴大培養T細胞之階段，係包含藉由CD30促效劑刺激該細胞之步驟。
9. 如請求項7或8所述之提供系統，係進一步包含製造包含前述經擴大培養之T細胞的凍結T細胞製品之階段。
10. 如請求項6至9中任一項所述之提供系統，係進一步包含收集T細胞製品，並建構包含2種以上T細胞製品之T細胞製品採集品之階段。
11. 如請求項1至10中任一項所述之提供系統，係進一步包含鑑別被驗者之腫瘤中所表現之腫瘤特異性抗原或腫瘤關聯抗原之階段。
12. 如請求項11所述之提供系統，係進一步包含由包含2種以上的T細胞製品之T細胞製品採集品選擇表現出會辨識而結合經鑑別的抗原之CAR或外因性之TCR之T細胞製品之階段。
13. 一種T細胞製品之製造方法，係包含建構T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫之步驟。
14. 如請求項13所述之T細胞製品之製造方法，其中，前述T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫係包含源自人工多能性幹細胞之T細胞。
15. 如請求項13或14所述之T細胞製品之製造方法，其中，前述T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫係包含至少1種HLA基因之表現受抑制之T細胞。
16. 如請求項13至15中任一項所述之T細胞製品之製造方法，係進一步包含將包含有外因性基因之核酸導入由前述T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫所準備之T細胞之步驟。
17. 如請求項16所述之T細胞製品之製造方法，其中，前述外因性基因係CAR基因或外因性之TCR基因。
18. 如請求項13至17中任一項所述之T細胞製品之製造方法，係進一步包含擴大培養T細胞之步驟。
19. 如請求項18所述之T細胞製品之製造方法，其中，前述擴大培養T細胞之步驟中，係包含藉由CD30促效劑刺激該細胞之步驟。
20. 一種T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫。
21. 如請求項20所述之T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫，係包含源自人工多能性幹細胞之T細胞。
22. 如請求項20或21所述之T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫，係包含至少1種HLA基因之表現受抑制之T細胞。
23. 一種T細胞主細胞庫採集品及/或T細胞工作細胞庫採集品，係包含2種以上之請求項20至22中任一項所述之T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫。
24. 一種建構T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫之方法，係包含下列步驟：

    (1)使不具有嵌合抗原受體(CAR)基因之人工多能性幹細胞分化為CAR-T療法用之T細胞之步驟；

    (2)儲存該經分化之T細胞之步驟；以及

    (3)進行該經分化之T細胞之特性解析之步驟。
25. 一種建構T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫之方法，係包含下列步驟：

    (1)使不具有外因性之T細胞受體(TCR)基因之人工多能性幹細胞分化為TCR-T療法用之T細胞之步驟；

    (2)儲存該經分化之T細胞之步驟；以及

    (3)進行該經分化之T細胞之特性解析之步驟。
26. 如請求項24所述之方法，其中，前述人工多能性幹細胞係具有外因性之T細胞受體(TCR)基因。
27. 如請求項24至26中任一項所述之方法，其中，前述人工多能性幹細胞係缺失至少1種HLA基因。
28. 如請求項24至27中任一項所述之方法，其中，前述T細胞係表現CD8αβ。
29. 一種T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫，係藉由如請求項24至28中任一項所述之方法所建構者。
30. 一種製造表現CAR或外因性之TCR之T細胞製品之方法，係包含下列步驟：

    (1)由如請求項29所述之T細胞主細胞庫及/或T細胞工作細胞庫準備T細胞之步驟；

    (2)將CAR基因或外因性之TCR基因導入該經準備之T細胞之步驟；以及

    (3)將經導入該CAR基因或外因性之TCR基因之T細胞擴大培養之步驟。
31. 如請求項30所述之方法，其中，前述CAR或外因性之TCR會辨識而結合腫瘤特異性抗原或腫瘤關聯抗原。
32. 如請求項30或31所述之方法，其中，前述步驟(3)係包含藉由CD30促效劑而刺激T細胞之步驟。
33. 一種T細胞製品，係藉由如請求項30至32中任一項所述之方法所製造者。
34. 一種含有2種以上T細胞製品之T細胞製品採集品之建構方法，係包含收集如請求項33所述之T細胞製品之步驟。
35. 一種T細胞製品採集品，係藉由如請求項34所述之建構方法所建構者。
36. 一種提供適用於被驗者之T細胞製品之方法，係包含下列步驟：

    (1)鑑別被驗者之腫瘤中所表現之腫瘤特異性抗原或腫瘤關聯抗原之步驟；以及

    (2)由如請求項35所述之T細胞製品採集品選擇表現出會辨識而結合該經鑑別之抗原之CAR或外因性之TCR之T細胞製品之步驟。

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