TW202045721A - 細胞接著用組合物及細胞接著用基材 - Google Patents

細胞接著用組合物及細胞接著用基材 Download PDF

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Abstract

本發明之一形態之細胞接著用組合物包含兩親媒性化合物及DNA與親水性分子之共軛物，兩親媒性化合物具有能夠與細胞膜非共價鍵結之疏水性基、及親水性基，共軛物之親水性分子之重量平均分子量大於源自兩親媒性化合物之親水性基的親水性分子之重量平均分子量。根據該細胞接著用組合物，可使用具有任意波長之光於任意時點對基材賦予細胞接著能力。

Description

細胞接著用組合物及細胞接著用基材
本發明係關於一種細胞接著用組合物及細胞接著用基材。
作為藉由光來控制基材之細胞接著性之手法，已知有如專利文獻1～3所記載之各種技術。根據該等技術，可藉由對基材照射光而對基材賦予細胞接著能力。 先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：日本專利特開2015-73460 專利文獻2：日本專利特開2009-65945 專利文獻3：日本專利特開2006-8975
[發明所欲解決之問題]
專利文獻1～3所記載之技術中，用於對基材賦予細胞接著能力之光被限定為紫外線(UV，ultraviolet)等具有特定波長之光。UV因損害細胞，故而欠佳。又，通常使用螢光色素來觀察接著於基材之細胞，因此，若用於賦予基材細胞接著能力之光被限定於特定波長，則可用於細胞觀察之螢光色素的選擇範圍變窄。
因此，本發明之目的在於使用具有任意波長之光於任意時點對基材賦予細胞接著能力。 [解決問題之技術手段]
本發明之一形態之細胞接著用組合物包含兩親媒性化合物及DNA與親水性分子之共軛物。兩親媒性化合物具有能夠與細胞膜非共價鍵結之疏水性基、及親水性基。共軛物之親水性分子之重量平均分子量大於源自兩親媒性化合物之親水性基的親水性分子之重量平均分子量。
親水性基可為選自由聚伸烷基二醇、聚甘油、多糖、聚乳酸、聚乙烯醇、聚丙烯酸、及聚丙烯醯胺所組成之群中之親水性分子之殘基。疏水性基可為碳數7～22之脂肪族烴基或具有碳數7～22之脂肪族烴基之磷脂質之殘基。較佳為親水性基係聚乙二醇之殘基。較佳為疏水性基係碳數10～20之脂肪族烴基或具有碳數10～20之脂肪族烴基之磷脂質之殘基。共軛物之親水性分子可為選自由聚伸烷基二醇、聚甘油、多糖、聚乳酸、聚乙烯醇、聚丙烯酸、及聚丙烯醯胺所組成之群中之親水性分子。細胞接著用組合物可對應每1分子之兩親媒性化合物包含1個以上之共軛物。共軛物之親水性分子之重量平均分子量可超過源自兩親媒性化合物之親水性基的親水性分子之重量平均分子量之1倍。
本發明之一形態之細胞接著用基材具備基材、1個以上之兩親媒性化合物、及1個以上之DNA與親水性分子之共軛物。各兩親媒性化合物具有能夠與細胞膜非共價鍵結之疏水性基、及親水性基。各兩親媒性化合物之親水性基及各共軛物之DNA與基材鍵結。共軛物之親水性分子之重量平均分子量大於源自兩親媒性化合物之親水性基的親水性分子之重量平均分子量。
細胞接著用基材可對應每1分子之兩親媒性化合物具備1個以上之共軛物。
本發明之另一形態之細胞接著用基材具備基材及1個以上之兩親媒性化合物與DNA之共軛物。各兩親媒性化合物具有能夠與細胞膜非共價鍵結之疏水性基及與上述DNA鍵結之親水性基。DNA與基材鍵結。
細胞接著用基材可進而具備光反應性物質，即藉由光照射生成活性氧之物質。
本發明之一形態之微流路器件具備內部之至少一部分塗佈有上述細胞接著用組合物之流路。
微流路器件可具備：第一流路；第二流路，其與上述第一流路鄰接；及連接部，其係連接上述第一流路與上述第二流路者，且於上述第一流路側具有能夠捕捉細胞之開口部；上述第一流路之內部可塗佈有上述細胞接著用組合物。
本發明之一形態之將細胞接著於基材上之方法具備如下步驟：利用上述細胞接著用組合物塗佈基材之步驟；使光反應性物質，即藉由光照射生成活性氧之物質接觸基材之步驟；對基材照射光而激發光反應性物質之步驟；及使細胞接觸基材之步驟。 [發明之效果]
根據本發明，可使用具有任意波長之光於任意時點對基材賦予細胞接著能力，又，賦予基材細胞接著能力所需之光照射之時間較短。更具體而言，根據本發明，提供一種可使用具有任意波長之光於任意時點接著任意細胞之基材、及具備該基材之微流路器件、以及可用於製造其等之組合物。又，根據本發明，提供一種可使用具有任意波長之光於任意時點將任意細胞接著於基材之方法。進而，根據本發明，可簡便地獲得任意形狀之細胞圖案。
本發明之一實施形態之細胞接著用組合物包含兩親媒性化合物、及DNA與親水性分子之共軛物。兩親媒性化合物具有能夠與細胞膜非共價鍵結之疏水性基、及親水性基。若使細胞接著用組合物接觸基材，則兩親媒性化合物之親水性基及共軛物之DNA與基材鍵結，可以兩親媒性化合物、及DNA與親水性分子之共軛物塗佈基材。就提高與基材之鍵結性之觀點而言，於兩親媒性化合物之親水性基與共軛物之DNA可鍵結有鍵結性物質。相對於兩親媒性化合物具有細胞接著能力，DNA與親水性分子之共軛物具有掩蓋兩親媒性化合物之細胞接著能力之作用。因此，塗佈有細胞接著用組合物之基材具有潛在性的細胞接著能力。如下文所述，藉由對基材照射光而將共軛物分解，表現出兩親媒性化合物之細胞接著能力，而使基材能夠接著細胞。
親水性基可為選自由聚伸烷基二醇、聚甘油、多糖、聚乳酸、聚乙烯醇、聚丙烯酸、及聚丙烯醯胺所組成之群中之1種以上之親水性分子之殘基。更具體而言，親水性基可為選自由聚乙二醇、聚丙二醇、季戊四醇、甘油、雙甘油、三甘油、四甘油、五甘油、六甘油、七甘油、及八甘油所組成之群中之1種以上之親水性分子之殘基。較佳為親水性基為聚乙二醇之殘基。本說明書中，所謂親水性分子之殘基，係指與從親水性分子去除與其他分子形成共價鍵時所去除之1個以上原子(例如氫)或基所獲得之基。
就提高與基材或鍵結性物質之鍵結性之觀點而言，親水性基亦可具有反應性官能基。反應性官能基只要是公知之反應性官能基，則並無特別限定，例如可為N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)基或順丁烯二醯亞胺基。
親水性基可為具有200以上、400以上、600以上、1000以上、2000以上、3000以上、5000以上、或8000以上之重量平均分子量之親水性分子之殘基。親水性基亦可為具有20000以下、10000以下、8000以下、5000以下、3000以下、2000以下、1000以下或600以下之重量平均分子量之親水性分子之殘基。重量平均分子量例如可使用凝膠滲透層析法(GPC，Gel Permeation Chromatography)求出。
疏水性基只要能夠與細胞膜非共價鍵結則並無特別限定，例如可為碳數7～22之脂肪族烴基或具有碳數7～22之脂肪族烴基之磷脂質之殘基。脂肪族烴基可為飽和或不飽和，可為直鏈或支鏈。脂肪族烴基之碳數可為10～20或11～18。脂肪族烴基例如可為：辛基(C8)、癸基(C10)、十二烷基(C12)、十四烷基(C14)、十六烷基(C16)、十八烷基(C18)、異硬脂基(C18)、二十烷基(C20)、二十二烷基(C22)等飽和脂肪族烴基，亦可為肉豆蔻醯基(C14)、軟脂基(C16)、油烯基(C18)、亞油烯基(C18)、花生四烯基(C20)、芥基(C22)等不飽和脂肪族烴基。磷脂質中之脂肪族烴基之數量可為1個以上或2個以上，較佳為1個或2個。作為磷脂質，例如可列舉：磷脂醯乙醇胺、磷脂醯甘油、及磷脂絲胺酸。磷脂質例如可為1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷脂醯乙醇胺(DSPE)。非共價鍵結可為疏水性相互作用。本說明書中，所謂磷脂質之殘基，係指與從磷脂質去除與其他分子形成共價鍵時所去除之1個以上原子(例如氫)或基所獲得之基。
具體而言，兩親媒性化合物例如可為親水性分子與疏水性分子彼此共價鍵結而成之化合物，上述親水性分子選自由聚伸烷基二醇、聚甘油、多糖、聚乳酸、聚乙烯醇、聚丙烯酸、及聚丙烯醯胺所組成之群，上述疏水性分子選自由碳數7～22之脂肪族烴及具有碳數7～22之脂肪族烴基之磷脂質所組成之群。親水性分子及疏水性分子之詳細情況如上所述。親水性分子可具有上述反應性官能基。作為兩親媒性化合物之具體例，可列舉：聚乙二醇與碳數7～22之脂肪族烴共價鍵結所得之化合物(PEG脂質)、及聚乙二醇與具有碳數7～22之脂肪族烴基之磷脂質共價鍵結所得之化合物(PEG磷脂質)。PEG脂質例如可為油烯基-O-聚乙二醇-丁二醯基-N-羥基-丁二醯亞胺酯。PEG-磷脂質例如可為N-[N'-(3'-順丁烯二醯亞胺-1'-氧代丙基)胺基丙基聚氧乙烯氧代羰基]-1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷脂醯乙醇胺。
DNA只要是可被活性氧分解之DNA則並無特別限定，可使用任何長度及序列之DNA。例如，若為17聚體～30聚體、18聚體～25聚體、或20～22聚體之DNA則容易獲取。DNA可為單鏈亦可為雙鏈。DNA就提高與親水性分子及基材或與鍵結性分子之鍵結性之觀點而言，亦可具有反應性官能基。反應性官能基並無特別限定，例如可從羧基、硫醇基、胺基等公知之反應性官能基中，根據親水性分子及基材或鍵結性分子之種類適當選擇。例如，於鍵結性分子為牛血清白蛋白(BSA，Bovine Serum Albumin)，親水性分子為具有順丁烯二醯亞胺基之PEG之情形時，DNA可具有：藉由交聯劑而與BSA之胺基反應之羧基、及與PEG之順丁烯二醯亞胺基反應之硫醇基。
共軛物之親水性分子可為選自由聚伸烷基二醇、聚甘油、多糖、聚乳酸、聚乙烯醇、聚丙烯酸、及聚丙烯醯胺所組成之群中之1種以上之親水性分子。更具體而言，共軛物之親水性分子可為選自由聚乙二醇、聚丙二醇、季戊四醇、甘油、雙甘油、三甘油、四甘油、五甘油、六甘油、七甘油、及八甘油所組成之群中之1種以上之親水性分子。較佳為共軛物之親水性分子為聚乙二醇。
就提高與DNA之鍵結性之觀點而言，共軛物之親水性分子亦可具有反應性官能基。反應性官能基並無特別限定，例如可為NHS基、順丁烯二醯亞胺基等公知之反應性官能基。
就掩蓋兩親媒性化合物之細胞接著能力之觀點而言，親水性分子之重量平均分子量例如可為：2000以上、5000以上、或10000以上，亦可為80000以下、60000以下、40000以下、30000以下、20000以下、10000以下、或5000以下。
就提高與基材之鍵結性之觀點而言，於兩親媒性化合物之親水性基及共軛物之DNA可偶聯有鍵結性物質。鍵結性物質只要是具有可與基材、兩親媒性化合物之親水性基、及共軛物之DNA鍵結之官能基之物質，則並無特別限定，例如可為BSA、卵白蛋白，膠原蛋白等蛋白質或聚離胺酸等多肽。
細胞接著用組合物可進而包含1種以上之光反應性物質，即1種以上之藉由光照射生成活性氧之物質。光反應性物質只要是藉由光照射生成活性氧之物質則並無特別限定，可選擇能夠由具有所需之波長之光激發之任意光反應性物質。光反應性物質例如可為選自由螢光色素、光敏劑、及光觸媒所組成之群中之1種以上之光反應性物質。光反應性物質較佳為可與DNA鍵結之DNA鍵結性光反應性物質，更佳為DNA鍵結性螢光色素。螢光色素例如可為選自由YOYO(註冊商標)-1、YO-PRO(註冊商標)-1、TOTO(註冊商標)-1、TO-PRO(註冊商標)-1、BOBO(註冊商標)-1、及BO-PRO(註冊商標)-1所組成之群中之DNA鍵結性之螢光色素。作為光敏劑，例如可列舉卟吩姆鈉、他拉泊芬鈉等卟啉衍生物。作為光觸媒，例如可列舉氧化鈦(IV)。就防止對細胞之損害之觀點而言，光反應性物質較佳為由超過380 nm之光所激發之物質。例如，光反應性物質可為由430 nm以上、450 nm以上、或480 nm以上之光所激發之物質。
細胞接著用組合物對應每1分子之兩親媒性化合物可包含1個以上、5個以上、10個以上、15個以上、或20個以上之共軛物。共軛物之親水性分子之重量平均分子量可超過源自兩親媒性化合物之親水性基的親水性分子之重量平均分子量之1倍、或可為其5倍以上、10倍以上、或20倍以上。源自兩親媒性化合物之親水性基的親水性分子之重量平均分子量與共軛物之親水性分子之重量平均分子量之組合例如可為：200～600與2000～5000、1000～5000與10000～60000、或8000～20000與10000～80000。
本發明之一實施形態之細胞接著用基材具備基材、1個以上、較佳為複數個兩親媒性化合物、及1個以上、較佳為複數個DNA與親水性分子之共軛物。基材表面之至少一部分被兩親媒性化合物及共軛物覆蓋，各兩親媒性化合物之親水性基及各共軛物之DNA與基材鍵結。即，基材與兩親媒性化合物係以各要素按基材-親水性基-疏水性基之順序排列之方式鍵結，基材與共軛物係以各要素按基材-DNA-親水性分子之順序排列之方式鍵結。本實施形態之細胞接著用基材可藉由以上述細胞接著用組合物塗佈基材獲得。兩親媒性化合物之詳細情況及DNA與親水性分子之共軛物之詳細情況如上所述。
基材之原材料及形狀較佳為適合接著細胞，但並無特別限定。基材之原材料例如可為玻璃、陶瓷、金屬、或合成樹脂。合成樹脂例如可為聚苯乙烯樹脂、矽酮樹脂、丙烯酸樹脂、聚乙烯樹脂、聚丙烯樹脂、聚碳酸酯樹脂、或環氧樹脂。基材例如可具有平板、膜、粒子、棒或多孔質體之形狀，基材之表面可為平面亦可為曲面。
就提高與兩親媒性化合物之親水性基及共軛物之DNA之鍵結性之觀點而言，基材可為表面塗佈有鍵結性物質之基材。鍵結性物質之詳細情況如上所述。
細胞接著用基材可進而具備光反應性物質，即藉由光照射生成活性氧之物質。具體而言，於共軛物之DNA可鍵結有光反應性物質。光反應性物質之詳細情況如上所述。
細胞接著用基材可對應每1分子之兩親媒性化合物具備1個以上、5個以上、10個以上、15個以上、或20個以上之共軛物。
於基材表面，兩親媒性化合物以親水性基位於靠近基材表面之側，且疏水性基位於遠離基材表面之側之方式配向，共軛物以DNA位於靠近基材表面之側，且親水性分子位於遠離基材表面之側之方式配向。如上所述，共軛物之親水性分子之重量平均分子量大於源自兩親媒性化合物之親水性基的親水性分子之重量平均分子量。因此，於本實施形態之細胞接著用基材之最外部，共軛物之親水性分子露出，兩親媒性化合物之具有細胞接著能力之疏水性基隱藏於共軛物之親水性分子之下。如下文所述，對基材賦予光反應性物質，繼而藉由光使其激發，藉此共軛物之DNA被切斷而使親水性分子解離，因此，兩親媒性化合物之疏水性基於最外部露出。因此，根據本實施形態之細胞接著用基材，可使用具有任意波長之光於任意時點接著任意細胞。進而，根據本實施形態之細胞接著用基材，可簡便地獲得任意之細胞圖案。
本發明之另一實施形態之細胞接著用基材具備基材、及1個以上、較佳為複數個兩親媒性化合物與DNA之共軛物。各兩親媒性化合物具有能夠與細胞膜非共價鍵結之疏水性基及與上述DNA鍵結之親水性基，DNA與基材鍵結。即，基材與共軛物以各要素按基材-DNA-親水性基-疏水性基之順序排列之方式鍵結。
兩親媒性化合物、DNA、及基材之詳細情況如上所述。但，本實施形態中，兩親媒性化合物不與基材或鍵結性物質鍵結，而與DNA鍵結。又，本實施形態中，DNA不與上述親水性分子鍵結，而與親水性基鍵結。
DNA與兩親媒性化合物亦可經由反應性官能基鍵結。反應性官能基並無特別限定，例如可為羧基、硫醇基、胺基、NHS基、順丁烯二醯亞胺基等公知之反應性官能基。
細胞接著用基材可進而具備光反應性物質，即藉由光照射生成活性氧之物質。具體而言，於共軛物之DNA可鍵結有光反應性物質。光反應性物質之詳細情況如上所述。
於基材表面，兩親媒性化合物與DNA之共軛物以DNA位於靠近基材表面之側，且疏水性基位於遠離基材表面之側之方式配向。因此，於本實施形態之細胞接著用基材之最外部，具有細胞接著能力之疏水性基露出，藉此接著細胞。對基材賦予上述光反應性物質，繼而藉由光使其激發，藉此切斷DNA，被接著之細胞與共軛物一同從基材釋放。因此，根據本實施形態之細胞接著用基材，可使用具有任意波長之光於任意時點將接著於基材之任意細胞釋放及回收。進而，根據本實施形態之細胞接著用基材，可簡便地獲得任意之細胞圖案。
於一實施形態中，本發明提供一種微流路器件，其具備內部之至少一部分塗佈有上述細胞接著用組合物之流路。微流路器件通常為具備1個以上微流路之器件，可作為捕捉及解析細胞之機構使用。
圖1中示有本實施形態之微流路器件之一例。圖1(A)所示之微流路器件40具備：流路23、與流路23鄰接之流路24；及連接流路23與流路24之連接部30。流路23、流路24、及連接部30均為設置於基板22之槽，於基板22之形成有槽之側的主表面積層有覆蓋玻璃21。基板22並無特別限定，例如可為矽橡膠(例如二甲基聚矽氧烷)等樹脂製。於基板22為樹脂製之情形時，流路23、流路24、及連接部30可藉由光微影法容易地形成。
於流路23設置有液體之注入口25及26、以及注出口28，於流路24設置有液體之注入口27及注出口29。向注入口25～27注入例如細胞懸浮液、試樣、標準試樣、緩衝液等液體。從注入口25及26導入至流路23之液體從注出口28排出至微流路器件40外，從注入口27導入至流路24之液體從注出口29排出至微流路器件40外。液體例如可使用注射器注入至注入口。注入口之數量可與所使用之液體數目相同，相對於一個流路有至少1個注入口便足夠。因此，可不設置注入口26，亦可於流路23及/或流路24追加1個以上之注入口。同樣地，亦可於流路23及/或流路24追加1個以上之注出口。
圖1(B)中示有連接部30之放大圖。該圖中，於流路23導入有細胞懸浮液。連接部30具有連接流路23與流路24之孔32、及能夠捕捉細胞C之開口部(開口端)31。此處，所謂能夠捕捉細胞C，意為於流路23內之壓力高於流路24內之壓力之條件下，可將存在於流路23內之細胞C保持於流路23側之開口部31。圖1中雖然開口部31形成有凹陷，但開口部31之形狀只要能夠捕捉細胞C則並無特別限定，亦可為平坦。連接部30需為細胞C無法穿過之形狀。因此，孔32之孔徑較佳為充分小於細胞C之直徑。又，雖然圖1中連接部30經由孔32而將流路23與流路24連接，但亦可將孔32替換為狹縫。開口部31只要設置於存在細胞C之流路側即可。圖1中，因於流路23導入有細胞懸浮液，故開口部31只要設置於流路23側即可。於在流路24導入細胞懸浮液之情形時，開口部31只要設置於流路24側即可。
圖2(A)表示將連接部30進而放大之模式圖。該圖中，細胞C藉由從流路23向流路24之方向(圖中箭頭P所示之方向)作用之力而被開口部31捕捉。箭頭P之方向上作用之力係因流路23與流路24之壓力差而產生。圖2(A)中，細胞C不與構成流路23之內壁接著，若消除流路23與流路24之壓力差，則細胞C從開口部31釋放。
流路23之內部經上述細胞接著用組合物塗佈。該圖中，兩親媒性化合物4具備鍵結性物質1、親水性基2、及疏水性基3，共軛物7具備鍵結性物質1、DNA 5a、及親水性分子6。各兩親媒性化合物4之親水性基2與各共軛物7之DNA 5a經由鍵結性物質1而與構成流路23之內壁即流路23之內表面任意地鍵結。再者，如上所述，鍵結性物質1並非必需。又，流路23無需整個內部被塗佈，只要塗佈流路23之內部之至少一部分、具體而言至少塗佈開口部31便足夠。
圖2(B)及(C)表示完成將細胞接著於開口部31之過程。為了使處於圖2(A)所示之狀態之細胞接著於開口部31，首先，對開口部31賦予上述光反應性物質(未圖示)。光反應性物質亦可預先被賦予至開口部31。或者亦可藉由向流路23導入光反應性物質，而對開口部31賦予光反應性物質。光反應性物質較佳為鍵結於DNA 5a。之後，如圖2(B)所示，對開口部31照射光而激發光反應性物質。因光反應性物質之激發所產生之活性氧切斷DNA 5a，而使妨礙疏水性基3與細胞C之細胞膜之非共價鍵結的親水性分子6從流路23之內壁解離。剩餘之DNA片斷5b因較小而無法妨礙疏水性基3與細胞C之鍵結，故疏水性基3與細胞C之細胞膜非共價鍵結，使細胞C接著於開口部31。
本實施形態之微流路器件40中，可使開口部31之細胞接著能力於任意時點顯現。因此，於開口部31捕捉到除目標細胞C以外之其他細胞或夾雜物之情形時，可使流路23與流路24之壓力差逆轉而將其等從開口部31釋放。另一方面，於開口部31捕捉到目標細胞C之情形時，藉由對開口部31照射光，可使細胞C接著於開口部31。一旦將細胞C接著於開口部31，便無需維持流路23與流路24之壓力差。即，根據本實施形態之微流路器件40，可使用具有任意波長之光於任意時點選擇性地且簡便地捕捉及解析細胞。
繼而對使用上述細胞接著用組合物將細胞接著於基材上之方法進行說明。本發明之一實施形態之將細胞接著於基材上之方法具備如下步驟：(a)利用上述細胞接著用組合物塗佈基材之步驟、(b)使上述光反應性物質接觸基材之步驟、(c)對基材照射光而激發光反應性物質之步驟、及(d)使細胞接觸基材之步驟。
步驟a中，藉由利用上述細胞接著用組合物塗佈基材，獲得上述細胞接著用基材。
於步驟a所塗佈之基材並無特別限定，基材之原材料及形狀之例如上所述。作為基材之具體例，例如可列舉：載玻片、培養皿、多孔板、微流路器件之微流路之內壁等。
塗佈之方法並無特別限定，例如可藉由使液體狀之細胞接著用組合物接觸基材上而塗佈基材。使細胞接著用組合物接觸基材上之方法並無特別限定，例如，可將細胞接著用組合物滴至基材，亦可將基材浸漬於細胞接著用組合物。
步驟b中使光反應性物質接觸基材。藉由該步驟，賦予基材光反應性物質。較佳為光反應性物質鍵結於與基材鍵結之共軛物之DNA。光反應性物質之詳細情況如上所述。步驟b可於步驟a之後進行，亦可與步驟a同時進行。換言之，可使光反應性物質接觸塗佈有細胞接著用組合物之基材，亦可使細胞接著用組合物與光反應性物質同時接觸基材。於使細胞接著用組合物與光反應性物質同時接觸基材之情形時，細胞接著用組合物可包含光反應性物質。
步驟c中對基材照射光而激發光反應性物質。所激發之光反應性物質產生活性氧，藉由活性氧切斷共軛物之DNA。因此，藉由該步驟，妨礙細胞接著之親水性分子從共軛物解離，隱藏於親水性分子之下之具有細胞接著能力之兩親媒性化合物之疏水性基於基材表面之最外部露出。
光之波長、照射強度、及照射時間只要可激發光反應性物質則並無特別限定。就防止對細胞之損害之觀點而言，光之波長較佳為超過380 nm。例如，光之波長可為430 nm以上、450 nm以上、或480 nm以上。照射時間例如可為1秒以上、10秒以上、或60秒以上。
步驟c可於步驟b之後進行。
步驟d中，使細胞接觸基材。藉由該步驟，兩親媒性化合物之疏水性基與細胞膜非共價鍵結，使細胞接著於基材。使細胞接觸基材之方法並無特別限定，例如，可將細胞懸浮液滴至基材，亦可將基材浸漬於細胞懸浮液。步驟d可於步驟a之後之任意階段進行。於在步驟b之前進行步驟d之情形時，步驟b(光反應性物質之接觸)及光之照射(步驟c)較佳為於維持使細胞接觸基材之狀態下進行。於與步驟b同時進行步驟d，或於步驟b之後且步驟c之前進行步驟d之情形時，光之照射(步驟c)較佳為於維持使細胞接觸基材之狀態下進行。
根據本實施形態之將細胞接著於基材上之方法，可使用具有任意波長之光，於任意時點且以較短之照射時間將細胞接著於基材。 [實施例]
(準備) 1.  PEG-DNA-BSA之製備 合成於5'末端具有羧基、於3'末端具有硫醇基之20聚體之DNA(序列：TCTATCTGCAGGCGCTCTCC)。將該DNA與BSA分別溶解於pH7.0之10 mM之MOPS-KOH，獲得DNA溶液與BSA溶液。以1：5之莫耳比將BSA溶液與DNA溶液進行混合。向該混合液中以最終濃度成為10 mM之方式混合1-(3-二甲胺丙基)-3-乙基碳二醯亞胺(EDC)，使DNA之5'末端之羧基與BSA之胺基鍵結。使用離心管柱去除剩餘DNA後，以BSA與PEG之莫耳比成為1：10之方式將PEG-順丁烯二醯亞胺(PEG之重量平均分子量：20000)與pH7.0之10 mM MOPS-KOH一同加入，並進行混合。藉由培養30分鐘混合液，使DNA-BSA與PEG鍵結，並以最終濃度1 mM之方式混合DTT(二硫蘇糖醇，dithiothreitol)，藉此使反應停止。
2.  PEG脂質-BSA之製備 將BSA與PEG脂質-NHS分別溶解於pH7.0之10 mM之MOPS-KOH，獲得BSA溶液與PEG脂質溶液。作為PEG脂質-NHS，使用油烯基-O-聚乙二醇-丁二醯基-N-羥基-丁二醯亞胺酯(PEG之重量平均分子量：2000、日油股份有限公司製造之「SUNBRIGHT OE-020CS」)。以1：10之莫耳比將BSA溶液與PEG脂質溶液進行混合，於室溫下培養30分鐘。加入pH6.8之Tris(三(羥甲基)胺基甲烷，Tris(hydroxymethyl)aminomethane)-HCl，使反應停止。
3.  PEG磷脂質-DNA-BSA之製備 使用PEG磷脂質-順丁烯二醯亞胺代替PEG-順丁烯二醯亞胺，與PEG-DNA-BSA之製備同樣地製備PEG磷脂質-DNA-BSA。作為PEG磷脂質-順丁烯二醯亞胺，使用N-[N'-(3'-順丁烯二醯亞胺-1'-氧代丙基)胺基丙基聚氧乙烯氧代羰基]-1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷脂醯乙醇胺(PEG之重量平均分子量：2000、日油股份有限公司製造之「SUNBRIGHT DSPE-020MA」)。
(實施例1) 以BSA濃度整體成為0.5 mg/mL之方式將PEG-DNA-BSA與PEG脂質-BSA以1：5之比率進行混合。將該混合溶液滴至已洗淨之覆蓋玻璃(24 mm×36 mm、t0.17 mm)，獲得表面塗佈有PEG-DNA-BSA與PEG脂質-BSA之基板。
以最終濃度成為10 μM之方式將YOYO-1(最大吸收波長491 nm、最大螢光波長509 nm)加入至緩衝液中，並滴至基板上。之後，使用光圈對特定之圓形區域照射激發光10秒鐘，而對圓形區域賦予細胞接著性。激發後，藉由緩衝液沖洗游離之PEG、螢光色素、經分解之DNA等。
以成為1×105 細胞/mL之濃度之方式使細胞懸浮於不含血清之培養基中。使細胞懸浮液接觸上述基板，10分鐘後，利用包含血清之培養基沖洗剩餘之細胞。將基板上之細胞進行培養，一天後，使用相位差顯微鏡觀察基板上之細胞。細胞於上述圓形區域內接著並延展，形成圓形圖案。
(實施例2) 以BSA濃度整體成為0.5 mg/mL之方式將PEG-DNA-BSA與PEG脂質-BSA以1：5之比率進行混合。將該混合溶液導入至如圖1所示之微流路器件之流路23，以PEG-DNA-BSA與PEG脂質-BSA塗佈流路23之內側。
以成為1×105 細胞/mL之濃度之方式使細胞懸浮於磷酸緩衝生理鹽水(PBS)中。將細胞懸浮液導入至流路23，並將PBS導入至流路24。以流路23內之壓力高於流路24內之壓力之方式調整流速，將所需之細胞保持於開口部31。於開口部31捕捉到除所需之細胞以外之其他細胞或細胞之破碎物之情形時，使壓力差逆轉，將該等從開口部31釋放。
於開口部31捕捉到所需之細胞後，將包含YOYO-1之PBS導入至流路23。對開口部31照射激發光10秒鐘。照射後，將PBS導入至流路23內，沖洗游離之PEG、螢光色素、經分解之DNA等。於開口部31接著有所需之細胞。
(實施例3) 以BSA濃度成為0.5 mg/mL之方式使PEG磷脂質-DNA-BSA懸浮於緩衝液中。將該懸浮液滴至已洗淨之覆蓋玻璃(24 mM×36 mM、t0.17 mM)，獲得表面塗佈有PEG磷脂質-DNA-BSA之基板。
以成為1×105 細胞/mL之濃度之方式使細胞懸浮於不含血清之培養基中。使細胞懸浮液接觸上述基板。確認細胞接著於基板後，利用裝有血清之培養基洗淨基板，培養細胞直至融合。
以最終濃度成為10 μM之方式將YOYO-1加入至培養基中，滴至基板上。之後，使用光圈對特定之圓形區域照射激發光10秒鐘。圓形區域之細胞從基板剝離，而懸浮於培養基中。將培養基中懸浮之細胞進行回收。
1:鍵結性物質 2:親水性基 3:疏水性基 4:兩親媒性化合物 5a:DNA 5b:DNA片斷 6:親水性分子 7:共軛物 21:覆蓋玻璃 22:基板 23:流路 24:流路 25:注入口 26:注入口 27:注入口 28:注出口 29:注出口 30:連接部 31:開口部 32:孔 40:微流路器件 C:細胞 P:方向
圖1(A)、(B)係表示微流路器件之一例之模式圖。 圖2(A)～(C)係表示將細胞接著於基材上之方法之概略的模式圖。
1:鍵結性物質
2:親水性基
3:疏水性基
4:兩親媒性化合物
5a:DNA
5b:DNA片斷
6:親水性分子
7:共軛物
23:流路
24:流路
31:開口部
C:細胞
P:方向

Claims (13)

  1. 一種細胞接著用組合物，其包含兩親媒性化合物及DNA與親水性分子之共軛物， 兩親媒性化合物具有能夠與細胞膜非共價鍵結之疏水性基、及親水性基， 共軛物之親水性分子之重量平均分子量大於源自兩親媒性化合物之親水性基的親水性分子之重量平均分子量。
  2. 如請求項1之組合物，其中親水性基係選自由聚伸烷基二醇、聚甘油、多糖、聚乳酸、聚乙烯醇、聚丙烯酸、及聚丙烯醯胺所組成之群中之親水性分子之殘基， 疏水性基係碳數7～22之脂肪族烴基或具有碳數7～22之脂肪族烴基之磷脂質之殘基。
  3. 如請求項1或2之組合物，其中共軛物之親水性分子係選自由聚伸烷基二醇、聚甘油、多糖、聚乳酸、聚乙烯醇、聚丙烯酸、及聚丙烯醯胺所組成之群中之親水性分子。
  4. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中親水性基係聚乙二醇之殘基，疏水性基係碳數10～20之脂肪族烴基或具有碳數10～20之脂肪族烴基之磷脂質之殘基。
  5. 如請求項1至4中任一項之組合物，其中對應每1分子之兩親媒性化合物包含1個以上之共軛物。
  6. 如請求項1至5中任一項之組合物，其中共軛物之親水性分子之重量平均分子量超過源自兩親媒性化合物之親水性基的親水性分子之重量平均分子量之1倍。
  7. 一種細胞接著用基材，其具備基材、1個以上之兩親媒性化合物、及1個以上之DNA與親水性分子之共軛物， 各兩親媒性化合物具有能夠與細胞膜非共價鍵結之疏水性基、及親水性基， 各兩親媒性化合物之親水性基及各共軛物之DNA與基材鍵結， 共軛物之親水性分子之重量平均分子量大於源自兩親媒性化合物之親水性基的親水性分子之重量平均分子量。
  8. 如請求項7之細胞接著用基材，其中每1分子之兩親媒性化合物具備1個以上之共軛物。
  9. 一種細胞接著用基材，其具備基材及1個以上之兩親媒性化合物與DNA之共軛物， 各兩親媒性化合物具有能夠與細胞膜非共價鍵結之疏水性基及與上述DNA鍵結之親水性基， DNA與基材鍵結。
  10. 如請求項7至9中任一項之細胞接著用基材，其進而具備光反應性物質，即藉由光照射生成活性氧之光反應性物質。
  11. 一種微流路器件，其具備內部之至少一部分塗佈有如請求項1至6中任一項之細胞接著用組合物之流路。
  12. 如請求項11之微流路器件，其具備： 第一流路； 第二流路，其與上述第一流路鄰接；及 連接部，其係連接上述第一流路與上述第二流路者，且於上述第一流路側具有能夠捕捉細胞之開口部； 上述第一流路之內部塗佈有如請求項1至6中任一項之細胞接著用組合物。
  13. 一種將細胞接著於基材上之方法，其具備如下步驟： 利用如請求項1至6中任一項之細胞接著用組合物塗佈基材之步驟； 使光反應性物質，即藉由光照射生成活性氧之光反應性物質接觸基材之步驟； 對基材照射光而激發光反應性物質之步驟；及 使細胞接觸基材之步驟。
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