TW202027761A - 功能化孔盤、其製備方法及用途 - Google Patents

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Abstract

在生物科學及相關領域中，其可適用於修飾設備、裝置及材料之接觸生物材料，諸如生物分子及生物微物體之表面。本文中描述表面修飾及表面功能化試劑、其製備及用於以可控制及可再現性方式修飾孔盤內之孔的表面以活化淋巴球，包括(但不限於) T淋巴球之方法。

Description

功能化孔盤、其製備方法及用途
免疫療法為成功治療癌症提供潛在有效的方法。抗原呈現樹突狀細胞所致的T淋巴球活化為製備靶向腫瘤之細胞毒性T淋巴球供用於免疫療法的一個態樣。樹突狀細胞所致的活化可藉由使用更能再現且更易表徵的技術改良。本發明之一些實施例包括經組態以活化T淋巴球的孔盤之經修飾表面、使用此類經修飾表面活化T淋巴球之相關方法，及含此類活化T淋巴球之組合物。
在第一態樣中，提供一種孔盤，其包括具有為反應性部分呈現共價功能化區或活化部分呈現共價功能化區之第一區域的表面，其中反應性部分為疊氮基部分、生物素部分或抗生蛋白鏈菌素部分且活化部分為淋巴球活化部分。第一區域之面積可為至少0.5 mm2 (例如，約0.5 mm2 至約50 mm2 、約1.0 mm2 至約40 mm2 、約2 mm2 至約35 mm2 、約3 mm2 至約30 mm2 或約4 mm2 至約25 mm2 )。第一區域可為實質上圓形且具有約0.5 mm至約4.0 mm (例如，約1.0 mm至約3.5 mm或約1.5 mm至約3.0 mm)之直徑。第一區域之密度可為至少50個各別反應性部分或活化部分/平方微米。反應性部分或活化部分可經由連接子，諸如有機連接子共價連接至表面。連接子可具有5個至約20個主鏈原子、約10個至約40個主鏈原子或約15個至約50個主鏈原子，該等主鏈原子選自碳、矽、氮及氧。孔盤之表面可進一步包括第二區域，該第二區域為包括表面阻斷配位體之共價修飾區。視情況，第二區域可包圍第一區域。在一些實施例中，表面阻斷配位體中之每一者可包括親水性或帶負電荷部分。在一些實施例中，表面阻斷配位體中之每一者可包括聚乙二醇(PEG)部分。孔盤之表面可包括玻璃或聚苯乙烯。在一些變化形式中，孔盤之表面可包括聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、環烯烴共聚物或三聚氰胺。
在一些變化形式中，反應性部分可為抗生蛋白鏈菌素，且抗生蛋白鏈菌素官能基共價附著於孔盤表面之第一區域。在其他變化形式中，反應性部分可為抗生蛋白鏈菌素，且抗生蛋白鏈菌素官能基非共價地附著於生物素部分，該生物素部分自身共價附著於孔盤表面之第一區域。
在一些變化形式中，第一區域可為活化部分呈現共價功能化區，其包括複數個特異性結合的初始活化分子配位體及複數個特異性結合的共活化分子配位體。表面之第一區域上之初始活化分子配位體與共活化分子配位體之比率可為約1:10至約2:1 (例如，約1:5至約2:1、約1:2至約2:1、約1:10至約1:1、約1:5至約1:1、約1:1至約2:1或約1:2至約1:1)。在一些實施例中，複數個特異性結合的初始活化分子配位體中之各配位體可包括經組態以結合至T細胞之T細胞受體(TCR)的主要組織相容複合體(MHC)分子。MHC分子可為I類或II類分子且可進一步包括抗原肽。抗原肽可為腫瘤相關抗原、病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原或原蟲抗原。在一些變化形式中，複數個特異性結合的共活化分子配位體中之各配位體可包括T細胞受體(TCR)共活化分子或輔助TCR活化分子。複數個共活化分子配位體中之TCR共活化分子與輔助TCR活化分子之比率為約100:1至約1:100 (例如，約20:1至約1:20、或約3:1至約1:3)。在一些變化形式中，TCR共活化分子可包括CD28結合蛋白(例如，CD80分子或抗CD28抗體)或其片段，該片段保留對CD28之結合能力。在一些變化形式中，輔助TCR活化分子可包括CD2結合蛋白(例如，CD58分子或抗CD2抗體)或其片段，該片段保留對CD2之結合活性。
在第一區域中，複數個特異性結合的初始活化分子配位體之密度可為至少約1 × 102 個分子/平方微米，且視情況在第一區域中，密度為約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米。在第一區域中，複數個特異性結合的共活化分子配位體之密度為至少1 × 102 個分子/平方微米，且視情況在第一區域中，密度為約1 × 103 至約1 × 105 個分子/平方微米。
在另一態樣中，提供一種孔盤，其中孔盤之一或多個孔(例如，所有孔)中之每一者包括表面及其第一區域，其中第一區域為反應性部分呈現共價功能化區或活化部分呈現共價功能化區，類似於如上文或本文中其他地方所描述之具有表面及第一區域的任何孔盤。一或多個孔中之每一者的第一區域可位於對應孔之底表面上。各第一區域之面積可小於約50% (例如，小於約40%、小於約30%、小於約25%、小於約20%、小於約15%、小於約10%、小於約5%或小於約2%)之對應孔之底表面面積。在一些實施例中，一或多個孔中之每一者進一步包含第二區域，該第二區域為包括表面阻斷配位體之共價修飾區。各第二區域可視情況包圍對應孔之第一區域。第二區域之表面阻斷配位體(在存在時)中之每一者可包括親水性或帶負電荷部分。在一些實施例中，表面阻斷配位體可包括聚乙二醇(PEG)部分。
在另一態樣中，提供包括表面之孔盤，該表面具有疊氮基呈現共價功能化區。疊氮基呈現共價功能化區可涵蓋部分或整個孔盤表面，或可分佈於較小而非整個孔盤表面上。在一些變化形式中，孔盤之一或多個孔可包括具有疊氮基呈現共價功能化區之表面。一或多個孔中之每一者之疊氮基呈現共價功能化區可涵蓋對應孔之整個表面(亦即內表面)或可位於對應孔之底表面上。孔盤的表面或孔盤之一或多個孔之表面可包含玻璃或聚合物，該聚合物可為任何適合類型之聚合物。
在一些實施例中，疊氮基呈現共價功能化區之面積可為至少0.5 mm2 (例如，至少1 mm2 、至少10 mm2 、至少100 mm2 、至少1000 mm2 、至少10,000 mm2 、至少100,000 mm2 或由前述終點中之兩者限定的任何範圍)。疊氮基呈現共價功能化區之密度可為至少50個疊氮基/平方微米。在一些實施例中，可經由具有至少5個主鏈原子之連接子連接共價連接至表面之疊氮基官能基，該等主鏈原子選自碳、矽、氮及氧。舉例而言，疊氮基官能基可經由連接子之一系列5個至約20個主鏈原子、或約10個至約40個主鏈原子、或約5個、7個、9個、10個、11個、13個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、90個、100個、200個鍵長度或其間的任何數目之主鏈原子共價連接至表面。
在另一態樣中，提供一種包括表面之孔盤，該表面包括生物素呈現共價功能化區，且可涵蓋孔盤表面的部分及/或可分佈於較小而非整個孔盤表面上。在一些實施例中，孔盤之一或多個孔可包括具有生物素呈現共價功能化區之表面。在一些實施例中，一或多個孔之生物素呈現共價功能化區可位於對應孔之底表面上。孔盤之表面或孔盤之一或多個孔之表面可包含玻璃或聚合物，該聚合物可為任何適合類型之聚合物。
在一些變化形式中，生物素呈現共價功能化區之面積可為至少0.5 mm2 (例如，至少1.0 mm2 、至少2.0 mm2 、至少3.0 mm2 、至少4.0 mm2 、至少5.0 mm2 、至少6.0 mm2 、至少7.0 mm2 、至少8.0 mm2 、至少9.0 mm2 、至少10.0 mm2 、至少15 mm2 、至少20 mm2 、至少25 mm2 或至少50 mm2 ，或由前述終點中之兩者限定的任何範圍)。在一些實施例中，生物素呈現共價功能化區可具有小於100 mm2 之面積。在一些實施例中，生物素呈現共價功能化區之密度可為至少50個生物素官能基/平方微米。在一些變化形式中，生物素呈現共價功能化區可包括經由具有至少10個主鏈原子之連接子共價連接至表面之生物素官能基，該等主鏈原子選自碳、矽、氮及氧。舉例而言，連接子可具有約5個至約200個主鏈原子或約10個至約40個主鏈原子，該等主鏈原子選自碳、矽、氮及氧，或其間的任何數目之主鏈原子。
在一些實施例中，生物素呈現共價功能化區之面積可為約小於2%至約小於約50%之一或多個孔中之每一者之底部的面積。在一些實施例中，生物素呈現共價功能化區可具有0.5至4.0 mm (例如，約1.0 mm至約3.5 mm)之尺寸。在各種實施例中，生物素呈現共價功能化區可為實質上圓形且具有0.5至4.0 mm (例如，約1.0 mm至約3.5 mm)之直徑。
在一些實施例中，孔盤或一或多個孔中之每一者之表面進一步可包括第二共價修飾區，該第二共價修飾區包括表面阻斷配位體。在一些實施例中，表面阻斷配位體中之每一者可包括親水性或帶負電荷部分。在一些實施例中，表面阻斷配位體可包括聚乙二醇(PEG)部分。在一些實施例中，第二共價修飾區進一步可包括提供部分刺激黏附性之至少一種配位體。
在另一態樣中，提供包括表面之孔盤，該表面具有抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區。抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區可涵蓋部分孔盤表面，或可分佈於較小而非整個孔盤表面上。在一些變化形式中，孔盤之一或多個孔可包括具有抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之表面。在一些實施例中，一或多個孔之抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區可位於對應孔之底表面上。孔盤之表面或孔盤之一或多個孔之表面可包含玻璃或聚合物，該聚合物可為任何適合類型之聚合物。
在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素官能基可共價附著於孔盤或孔盤之一或多個孔之表面的共價功能化區。抗生蛋白鏈菌素官能基可經由具有約5個至約200個主鏈原子、或約10個至約50個主鏈原子或其間的任何數目之主鏈原子的連接子共價連接至表面，該等主鏈原子選自碳、矽、氮及氧。當抗生蛋白鏈菌素自身共價連接至表面時，鍵可經由偶合至如本文所述之表面之任何疊氮基呈現共價功能化區之疊氮基官能基。在一些其他實施例中，抗生蛋白鏈菌素官能基可非共價地附著於生物素部分，該生物素部分自身共價附著於孔盤或孔盤之一或多個孔之表面的共價功能化區，如先前所提及。
抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之面積可為至少0.5 mm2 (例如，至少1.0 mm2 、至少2.0 mm2 、至少3.0 mm2 、至少4.0 mm2 、至少5.0 mm2 、至少6.0 mm2 、至少7.0 mm2 、至少8.0 mm2 、至少9.0 mm2 、至少10.0 mm2 、至少15 mm2 、至少20 mm2 、至少25 mm2 或至少50 mm2 ，或由前述終點中之兩者限定的任何範圍)。在一些實施例中，生物素呈現共價功能化區可具有小於100 mm2 之面積。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之密度可為至少50個抗生蛋白鏈菌素官能基/平方微米。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之面積可為小於約2%至小於約50%之一或多個孔中之每一者之底表面面積或其間的任何面積。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之尺寸可為0.5至4.0 mm (例如，約1.0 mm至約3.5 mm)。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區可為實質上圓形且具有0.5至4.0 mm (例如，約1.0 mm至約3.5 mm)之直徑。
在一些實施例中，孔盤或一或多個孔中之每一者之表面進一步可包括第二共價修飾區，該第二共價修飾區包括表面阻斷配位體。在一些實施例中，表面阻斷配位體中之每一者可包括親水性或帶負電荷部分。在一些實施例中，表面阻斷配位體可包括聚乙二醇(PEG)部分。在一些實施例中，第二共價修飾區進一步可包括提供部分刺激黏附性之至少一種配位體。
在另一態樣中，提供一種包括表面之孔盤，該表面包括孔盤之抗原呈現共價功能化區以活化T細胞。抗原呈現共價功能化區可涵蓋部分孔盤表面，或可分佈於較小而非整個孔盤表面上。在一些實施例中，孔盤之一或多個孔可包括具有抗原呈現共價功能化區之表面。在一些實施例中，一或多個孔之抗原呈現共價功能化區可位於對應孔之底表面上。
抗原呈現共價功能化區可包括複數個特異性結合的初始活化分子配位體及複數個特異性結合的共活化分子配位體。共價功能化區上之初始活化分子配位體與共活化分子配位體之比率可為約1:10至約2:1、約1:5至約2:1、約1:2至約2:1、約1:10至約1:1、約1:5至約1:1、約1:1至約2:1或約1:2至約1:1。在一些變化形式中，複數個特異性結合的初始活化分子配位體各自可包括經組態以與T細胞之T細胞受體結合的主要組織相容複合體(MHC)分子(例如，I類或II類)。在一些實施例中，MHC分子可包括I類MHC蛋白序列及β微球蛋白蛋白序列。可經由蛋白序列之C端連接將MHC分子之蛋白序列連接至抗原呈現合成表面。在一些實施例中，包括MHC分子之複數個初始活化分子中之每一者進一步可包括抗原肽，諸如腫瘤相關抗原肽、病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原或原蟲抗原。在一些實施例中，抗原肽為腫瘤相關抗原肽，其可為SLC45A2、TCL1、VCX3A、MART1或NYESO1。
在一些變化形式中，複數個特異性結合的共活化分子配位體各自可包括T細胞受體(TCR)共活化分子或輔助TCR活化分子。複數個共活化分子配位體中之TCR共活化分子與輔助TCR活化分子之比率可為約100:1至約1:100、約20:1至約1:20或約3:1至約1:3。在一些實施例中，TCR共活化分子可包括CD28結合蛋白或其片段，該片段保留對於CD28之結合能力。CD28結合蛋白可為CD80分子或其片段，其中該片段保留對於CD28之結合活性；抗CD28抗體或其片段，該片段保留對於CD28之結合活性。在一些實施例中，輔助TCR活化分子可包括CD2結合蛋白或其保留對於CD2之結合活性的片段。CD2結合蛋白可為CD58分子或其片段，其中該片段保留與CD2之結合活性；或抗CD2抗體或其片段，其中該片段保留與CD2之結合活性。在一些實施例中，複數個特異性結合的初始活化分子配位體及複數個特異性結合的共活化分子配位體可特異性結合至孔盤之抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之抗生蛋白鏈菌素官能基，該孔盤類似於本文中描述之具有包括抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之表面的任何孔盤。
在一些實施例中，在抗原呈現共價功能化區中，複數個特異性結合的初始活化分子配位體之密度可為至少約1 × 102 個分子/平方微米或約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米。在一些實施例中，在抗原呈現共價功能化區之抗原呈現合成表面上，複數個特異性結合的共活化分子配位體之密度可為約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米或約1 × 103 至約1 × 105 個分子/平方微米。
在另一態樣中，提供一種活化T淋巴球(T細胞)之方法，其中該方法包括使複數個T細胞與孔盤表面之抗原呈現共價功能化區接觸，進而將複數個T細胞中之至少一部分轉化為活化T細胞。抗原呈現共價功能化區可包括各自包括主要組織相容(MHC)分子(例如，I類或II類)之複數個初始活化分子配位體，該主要組織相容分子經組態以結合至T細胞之T細胞受體(TCR)，且另外，複數個初始活化分子配位體中之每一者可連接至表面。抗原呈現共價功能化區可進一步包括複數個共活化分子配位體，該複數個共活化分子配位體各自包括T細胞受體(TCR)共活化分子或輔助TCR活化分子且共活化分子配位體中之每一者可連接至表面。複數個T細胞可與表面之抗原呈現共價功能化區接觸培養，進而將複數個T細胞中之至少一部分轉化為活化T細胞。T細胞可包括CD8+ T細胞。
抗原呈現共價功能化區可為孔盤表面之第一區域，該孔盤類似於如上文或本文中其他地方所描述之具有活化部分呈現共價功能化區的任何孔盤。
在一些變化形式中，複數個共活化分子配位體可包括TCR共活化分子及輔助TCR活化分子。複數個共活化分子配位體中之TCR共活化分子與輔助TCR活化分子之比率可為約100:1至約1:100、約20:1至約1:20或約3:1至約1:3。
複數個MHC分子中之各分子可包括I類MHC蛋白序列、β微球蛋白蛋白序列及抗原肽。在一些變化形式中，經由C端連接將MHC分子之蛋白序列連接至表面之抗原呈現共價功能化區。MHC分子可包括生物素部分且可經由與抗生蛋白鏈菌素之非共價相互作用而附著至表面之抗原呈現共價功能化區。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素自身共價鍵結至表面之抗原呈現共價功能化區。在其他實施例中，抗生蛋白鏈菌素可與表面之抗原呈現共價功能化區非共價締合。當抗生蛋白鏈菌素與生物素部分非共價締合時，生物素部分可共價鍵結至表面之抗原呈現共價功能化區。
在一些變化形式中，抗原肽可為腫瘤相關抗原、病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原或原蟲抗原。在一些實施例中，抗原肽可為腫瘤相關抗原。在一些變化形式中，腫瘤相關抗原可為SLC45A2、TCL1、VCX3A、MART1或NYESO1。
在一些變化形式中，可將複數個共活化分子配位體中之每一者連接至表面之抗原呈現共價功能化區。
在一些變化形式中，T細胞受體(TCR)共活化分子可包括CD28結合蛋白或其保留對於CD28之結合能力的片段；CD80分子或其片段，其中該片段保留對於CD28之結合活性；或抗CD28抗體或其片段，其中該片段保留對於CD28之結合活性。
在一些變化形式中，輔助TCR活化分子可包括CD2結合蛋白或其片段，該片段保留對於CD2之結合能力。輔助TCR活化分子可包括CD58分子或其片段，其中該片段保留與CD2之結合活性；或抗CD2抗體或其片段，其中該片段保留與CD2之結合活性。
在表面之抗原呈現共價功能化區中，複數個特異性結合的初始活化分子配位體之密度可為至少約1 × 102 個分子/平方微米。在一些實施例中，在表面之抗原呈現共價功能化區中，複數個特異性結合的初始活化分子配位體之密度可為約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米。在表面之抗原呈現共價功能化區中，複數個特異性結合的共活化分子配位體之密度可為至少1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米。在一些實施例中，在表面之抗原呈現共價功能化區中，複數個特異性結合的共活化分子配位體可具有約1 × 103 至約1 × 105 個分子/平方微米。表面之抗原呈現共價功能化區中之初始活化分子配位體與共活化分子配位體之比率可為約1:10至約2:1、約1:5至約2:1、約1:2至約2:1、約1:10至約1:1、約1:5至約1:1、約1:1至約2:1或視情況約1:2至約1:1。在一些變化形式中，複數個共活化分子配位體之TCR共活化分子與輔助TCR活化分子之比率可為約3:1至約1:3。在一些實施例中，複數個共活化分子配位體之TCR共活化分子與輔助TCR活化分子的比率可為約2:1至約1:2。在一些實施例中，複數個共活化分子配位體之TCR共活化分子與輔助TCR活化分子的比率可為約1:1。
在一些實施例中，該方法可進一步包括使複數個T細胞與複數個黏附性刺激分子配位體接觸。複數個黏附性刺激分子配位體可包括ICAM分子。
在一些變化形式中，該方法可進一步包括使複數個T細胞與複數個生長刺激性分子配位體接觸。在一些實施例中，生長刺激性分子配位體中之每一者可包括生長因子受體配位體。生長因子受體配位體可包括IL-21或其片段。
在一些變化形式中，可在至少一天之第一培養時段之後執行使複數個T細胞與複數個生長刺激性分子配位體接觸。與抗原呈現合成表面接觸培養可執行約四天至約七天的時段。
在一些變化形式中，活化T細胞可為CD45RO+。在一些變化形式中，活化T細胞為CD28陽性。
在一些變化形式中，抗原呈現功能化區之面積可為小於約25%、小於約15%、小於約10%、小於約5%或小於約2%之孔盤之孔的底表面面積。
在另一態樣中，提供一種活化淋巴球之方法，該方法包括使複數個淋巴球與孔盤表面之活化部分呈現共價功能化區接觸，其中活化部分呈現共價功能化區包括連接至表面之複數個初始活化分子配位體；及連接至表面之複數個共活化分子配位體；且培養複數個淋巴球進而將複數個淋巴球中之至少一部分轉化為活化淋巴球。淋巴球可包括B細胞、T細胞或NK細胞。
活化部分呈現共價功能化區可為孔盤表面之第一區域，該孔盤類似於如本文所述之包括活化部分呈現共價功能化區的任何孔盤。包括表面之活化部分呈現共價功能化區之孔盤可藉由產生如本文所述之具有包括淋巴球活化共價功能化區之表面的孔盤之任何方法來產生。
在一些變化形式中，初始活化分子配位體可包括CD3結合分子或MHC分子。在一些實施例中，複數個MHC分子可各自包括I類MHC蛋白序列及β微球蛋白蛋白序列。MHC分子可進一步包括抗原肽。在一些變化形式中，CD3結合蛋白可為抗體或其保留結合親和力之片段。
在一些變化形式中，複數個共活化分子配位體可包括TCR共活化分子及輔助TCR活化分子。在一些變化形式中，複數個共活化分子配位體可包括CD2結合分子及/或CD28結合分子。在一些變化形式中，其中存在超過一種類型之共活化分子配位體，不同共活化分子配位體的比率可為約20:1至約1:20，或約3:1至約1:3。
在一些變化形式中，在表面之活化部分呈現共價功能化區中，複數個特異性結合的初始活化分子配位體之密度可為至少約1 × 102 個分子/平方微米或約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米。在一些變化形式中，在表面之活化部分呈現共價功能化區中，複數個特異性結合的共活化分子配位體之密度可為約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米或約1 × 103 至約1 × 105 個分子/平方微米。活化部分呈現共價功能化區中之初始活化分子配位體與共活化分子配位體之比率為約1:10至約2:1、約1:5至約2:1、約1:2至約2:1、約1:10至約1:1、約1:5至約1:1、約1:1至約2:1或約1:2至約1:1。
在一些變化形式中，活化部分呈現功能化區之面積可小於約25%、小於約15%、小於約10%、小於約5%或小於約2%之孔盤之孔的底表面面積。
在另一態樣中，提供一種用於製備包括具有活化部分呈現共價功能化區之表面之孔盤的套組，其中該套組包括包含表面之孔盤，該表面包括反應性部分呈現共價功能化區，其中該反應性部分為疊氮基部分、生物素部分或抗生蛋白鏈菌素部分。套組可包括活化劑。在一些變化形式中，套組可進一步包括表面功能化劑。在一些變化形式中，包括具有活化部分呈現共價功能化區之表面的孔盤可為如本文所述之具有疊氮基呈現、生物素呈現或抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區的任何孔盤。
在一些變化形式中，套組可包括表面功能化劑，其中表面功能化劑可為經組態以與反應性部分反應的含生物素之試劑或含抗生蛋白鏈菌素之試劑。在一些實施例中，套組可進一步包括含生物素之試劑及含抗生蛋白鏈菌素之試劑兩者。
在一些變化形式中，活化試劑可包括初始活化劑，其包括經組態以與T細胞之T細胞受體結合且經組態以結合至抗生蛋白鏈菌素之結合位點或複數個CD3結合分子的複數個主要組織相容複合體(MHC)分子(例如，I類或II類)。
在一些變化形式中，套組可進一步包括共活化劑，該共活化劑包括各自經組態以結合抗生蛋白鏈菌素之結合位點的複數個共活化分子，且其中該等共活化分子中之每一者包括CD2結合分子或CD28結合分子。
相關申請之交叉參考
本申請案主張2018年9月21日申請的標題為「FUNCTIONALIZED WELL PLATE, METHODS OF PREPARATION AND USE THEREOF」之美國臨時申請案第62/734,924號；及2019年8月29日申請的標題為「FUNCTIONALIZED WELL PLATE, METHODS OF PREPARATION AND USE THEREOF」之美國臨時申請案第62/893,712號之權益，該等揭示案中之每一者以全文引用之方式併入本文中。
本說明書描述本發明之例示性實施例及應用。然而，本發明不限於此等例示性實施例及應用或例示性實施例及應用的運作方式或描述於本文中。此外，圖式可以展示簡化視圖或部分視圖，且圖中元件之尺寸可以放大或以其他方式不依比例。另外，當術語「位於…上」、「附著至」、「連接至」、「耦合至」或類似詞語在本文中使用時，一個元件(例如材料、層、基板等)可「位於另一元件上」、「附著至」、「連接至」或「耦合至」另一元件，不論該一個元件是否直接位於該另一元件上、附著至、連接至或耦合至另一元件，或該一元件與該另一元件之間存在一或多個中間元件。另外，除非上下文另有指明，否則方向(例如高於、低於、頂部、底部、側面、向上、向下、下方、上方、上層、下層、水平、垂直、「x」、「y」、「z」等)在提供時，為相對的且僅為了舉例及容易說明及論述，而非為了限制而提供。另外，在提及元件清單(例如元件a、b、c)的情況下，此類提及意欲包括任一所列元件本身、少於全部之所列元件之任何組合，及/或全部所列元件之組合。除非上下文另有指明，否則術語「或」係以包括性意義使用，亦即，等效於「及/或」。應注意，如本說明書及申請專利範圍中所用，除非明確地且肯定地限於一個指示物，否則單數形式「一(a/an)」與「該」及任何詞之任何單數使用形式包括複數個指示物。如本文所用，術語「包含」、「包括」及其語法變化形式意欲具有非限制性，因此清單中之各項的敍述不排除可以取代或添加至所列項中的其他類似項。本說明書中之章節劃分僅為了容易審閱且不限制所論述之元件之任何組合。在以引入方式併入之材料與本文所提供之明確描述內容之間存在任何抵觸或衝突的情況下，以明確描述的內容為準。
在微流體特徵尺寸描述為具有寬度或面積的情況下，尺寸典型地相對於x軸及/或y軸尺寸描述，兩個尺寸均處於與微流體裝置之基板及/或蓋板平行的平面內。微流體特徵的高度可以相對於z軸方向描述，z軸方向垂直於與微流體裝置之基板及/或蓋板平行的平面。在一些情況下，微流體特徵(諸如渠道或通道)的橫截面積可以參照x軸/z軸、y軸/z軸，或x軸/y軸面積。
出於本說明書及所附申請專利範圍之目的，除非另外指明，否則表示量、百分比或比例之所有數值，及說明書及申請專利範圍中使用之其他數值應理解為在所有情況下藉由術語「大約」修飾，程度為其尚未如此修飾。「約」指示實質上不影響所述主題之特性的變化程度，例如在10%、5%、2%或1%內。因此，除非有相反指示，否則以下說明書及所附申請專利範圍中所闡述之數值參數為可視設法獲得之所需特性而變化的近似值。至少且不試圖將均等論之應用限於申請專利範圍之範疇，各數值參數至少應考慮所報導之有效數位之個數且藉由應用普通捨入技術來解釋。
如本文所用，「實質上」意謂足以達成預期目的。術語「實質上」因此允許相對於絕對或完全狀態、維度、量測值、結果或其類似者發生微小、不顯著(諸如該領域中之一般技術者所預期)但對總體效能影響不明顯的變化。當相對於數值或可以數值表示之參數或特徵使用時，「實質上」意謂在百分之十內。
術語「多者(ones)」意謂超過一者。
如本文所用，術語「複數個」可為2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個。
如本文所使用，術語「安置」包涵在其意指「定位」內。
如本文所用，術語「細胞」可與術語「生物細胞」互換使用。生物細胞之非限制性實例包括真核細胞、植物細胞、動物細胞(諸如哺乳動物細胞、爬行動物細胞、禽類細胞、魚細胞或其類似細胞)、原核細胞、細菌細胞、真菌細胞、原蟲細胞或其類似細胞；自組織(諸如肌肉、軟骨、脂肪、皮膚、肝臟、肺、神經組織及其類似組織)中解離的細胞；免疫細胞，諸如T細胞、B細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞及其類似細胞；胚(例如接合子)、卵母細胞、卵、***細胞、融合瘤、經培養細胞、來自細胞株之細胞、癌細胞、感染細胞、經轉染及/或經轉化細胞、報導子細胞及其類似細胞。哺乳動物細胞可來自例如人類、小鼠、大鼠、馬、山羊、綿羊、乳牛、靈長類動物或其類似物。
若生物細胞群落中能夠再生的所有活細胞為來源於單一母細胞的子細胞，則該群落為「純系」。在某些實施例中，純系群落中的所有子細胞來源於單一母細胞的不超過10次***。在其他實施例中，純系群落中的所有子細胞來源於單一母細胞的不超過14次***。在其他實施例中，純系群落中的所有子細胞來源於單一母細胞的不超過17次***。在其他實施例中，純系群落中的所有子細胞來源於單一母細胞的不超過20次***。術語「純系細胞」係指相同純系群落的細胞。
如本文所用，生物細胞「群落」係指2個或更多個細胞(例如約2個至約20個、約4個至約40個、約6個至約60個、約8個至約80個、約10個至約100個、約20個至約200個、約40個至約400個、約60個至約600個、約80個至約800個、約100個至約1000個，或超過1000個細胞)。
如本文所用，術語「維持細胞」係指提供包含流體與氣體組分兩者，及視情況提供保持細胞存活及/或擴增所必需之條件的表面的環境。
如本文所用，當提及細胞時，術語「擴增」係指細胞數目增加。
如本文所用，「合成表面」係指支撐結構與氣體/液體介質之間的界面，其中該合成表面係藉由非生物製程製備。合成表面可連接有生物學來源之材料，例如如本文所述之初始及共活化分子，以提供抗原呈現合成表面，其限制條件為合成表面不由生物學生物體表現。典型地，支撐結構為固體，諸如珠粒、晶圓或微流體裝置之基板、蓋板或電路材料之非表面暴露部分，且並未圍封生物細胞核或細胞器。
如本文所用，「孔盤」為用於培養生物細胞之裝置。孔盤可包括複數個孔(例如，其間的2、6、12、24、96、384個或任何數目之孔)。替代地，孔盤可包括單一孔，且因此術語「孔盤」可涵蓋傳統培養盤(例如，圓形培養盤)及培養燒瓶。孔盤可包括適用於遮蓋或加帽孔盤之一或多個孔的蓋板或蓋帽。
如本文所用，「抗生蛋白鏈菌素」通常係指以高親和力結合於生物素且與抗生蛋白鏈菌素蛋白質共享結構性及/或蛋白質序列同源性之任何蛋白質，該抗生蛋白鏈菌素蛋白質最初分離自細菌鏈黴菌(Streptomyces avidinii )。因而，術語「抗生蛋白鏈菌素」涵蓋保留結合於生物素之鏈黴菌抗生蛋白鏈菌素之經突變版本及/或片段，及與保留結合於生物素之鏈黴菌抗生蛋白鏈菌素(例如，抗生素蛋白)同源之蛋白質之生物素結合突變版本及/或片段。抗生蛋白鏈菌素典型地為四聚結構，但術語「抗生蛋白鏈菌素」亦涵蓋非四聚形式。
如本文所用，「共活化」係指生物大分子、其片段或其合成或經修飾版本與T細胞之間的結合相互作用(除原代T細胞受體/抗原:MHC結合相互作用以外)，其增強富有成效的免疫反應以使T細胞活化。共活化相互作用為抗原非特異性相互作用，例如能夠參與胞內信號傳導之T細胞表面蛋白質(諸如CD28、CD2、ICOS等)與其促效劑之間的相互作用。如本文所用，「共活化(Co-activation/ co-activating)」分別等於術語共刺激(co-stimulation/ co-stimulating)。
如本文所用，「TCR共活化分子」為結合於T細胞上之一或多個共受體之生物大分子、其片段或其合成或經修飾版本，該一或多個共受體活化放大及/或完成由TCR之抗原特異性結合所引起的反應之遠端信號傳導分子。在一個實例中，諸如轉錄因子核因子κB (NF kB)及活化T細胞之核因子(NFAT)之信號傳導分子係藉由TCR共活化分子活化的。TCR共活化分子可為例如CD28受體之促效劑，其經由磷酸肌醇3激酶(PI3K)/Akt路徑傳導信號。參見圖2。
如本文所用，「高CD28」或「CD28(高)」係指T細胞中之較高CD28表面表現的表型。熟習此項技術者熟悉高CD28表型及鑑別高CD28 T細胞的適當方式。除非另外指明，否則高CD28 T細胞包括滿足以下準則中之任一者的T細胞。在一些技術方案中，高CD28 T細胞為比靜默CD8+ T細胞表現更高CD28含量之T細胞。高CD28 T細胞亦可表現比不相關的非抗原特異性T細胞更高的CD28含量。在一些技術方案中，高CD28 T細胞為其中可藉由FACS量測之表面CD28含量等於或大於可藉由FACS量測之存在於循環記憶T細胞上之表面CD28含量的群體。在一些技術方案中，高CD28 T細胞之表面CD28含量等於或大於存在於來自相同樣本或個體之循環記憶T細胞上之表面CD28含量。表面CD28表現可藉由FACS測定且存在於循環記憶T細胞上之表面CD28均值(例如幾何平均值)或中值含量可用於判定給定T細胞是否為高CD28。在一些技術方案中，高CD28 T細胞為一種T細胞，其表現比來自相同樣本或個體之初始CD8 T細胞之典型表現量顯著更高水準的CD28，例如高於初始T細胞之75%、80%、85%、87.5%、90%、92.5%或95%。初始CD8 T細胞可藉由已知方法(例如流式細胞量測術)經識別且表徵為表現可偵測CD28及最小或無CD45RO之CD8+細胞。
如本文所用，「TCR輔助活化分子」刺激放大抗原特異性TCR相互作用且不同於TCR共活化分子之信號傳導分子類別。舉例而言，TCR近端信號傳導複合物磷酸化所引起的TCR近端信號傳導為TCR輔助活化分子可藉以發揮作用的一種路徑。TCR輔助活化分子可為例如CD2受體之促效劑。參見圖4。
如本文所用，「活化T細胞」為已經歷抗原(或其後代)且能夠建立對於彼抗原之抗原特異性反應之T細胞。活化T細胞對於CD28、CD45RO、CD127及CD197中之至少一者通常呈陽性。
如本文所用，「抗體」係指免疫球蛋白(Ig)且包括多株及單株抗體兩者；靈長類化(例如，人類化)；鼠類；小鼠-人類；小鼠-靈長類；及嵌合；且可為完整分子、其片段(諸如scFv、Fv、Fd、Fab、Fab'及F(ab)'2片段)或完整分子及/或片段之多聚體或聚集體；且可天然存在或例如藉由免疫接種、合成或基因工程改造來產生。如本文所用，「抗體片段」係指來源於抗體或與抗體有關的片段，其結合抗原且在一些實施例中可例如藉由併入半乳糖殘基而經衍生以展現便於清除及攝入之結構特徵。此包括例如F(ab)、F(ab)'2、scFv、輕鏈可變區(VL)、重鏈可變區(VH)及其組合。
癌症免疫療法為一種有前景的開發療法，但在一些實施例中，需要與療法之個體相容之特異性活化T淋巴球。然而，當前使用抗原呈現樹突狀細胞活化T淋巴球出現若干不利的態樣。樹突狀細胞必須獲自供體源，此限制了處理量。對於各T淋巴球活化序列，樹突狀細胞必須為成熟的，此需要提前約7天。亦需要輻射樹突狀細胞，此限制可執行此類處理之場所。
在用於活化T淋巴球之孔盤之一或多個孔內，藉由抗原呈現合成表面代替使用自體性抗原呈現樹突狀細胞可獲得更高再現性以刺激且擴張T淋巴球以用於治療學上相關群體。孔盤之抗原呈現合成表面可經工程改造以抗原特異性活化T淋巴球，提供具有所需表型之活化T淋巴球群體之更可控地及/或可表徵地及/或可再現地及/或更快速地發展以用於治療癌症。孔盤之一或多個孔的抗原呈現合成表面亦可允許更加控制及選擇T細胞活化，包括在活化後更精確靶向所需T細胞表型，例如富集特定形式之記憶T細胞。另外，孔盤之一或多個孔的抗原呈現合成表面亦可比使用自體性抗原呈現樹突狀細胞更大程度地利用規模經濟及/或提供再現性。因而，此技術可使得可供需要之患者使用的細胞療法數目更大及/或時間更少。更快速地提供適用於細胞療法的T細胞對於患晚期疾病之患者可為尤其重要的。本文中描述孔盤之一或多個孔之此類抗原呈現合成表面的結構及其製備方法及用途。在一些實施例中，孔盤之一或多個孔之抗原呈現合成表面包含初始活化配位體以及TCR共活化分子及/或輔助TCR活化分子，其一起用於活化T細胞。本文亦揭示可進一步改良功效的此等組分之表面密度範圍及一者與另一者之比率。在一些實施例中，孔盤之一或多個孔之抗原呈現合成表面及其製備方法及用途提供前述優勢中之一或多者。
另外，除T淋巴球以外之淋巴球可藉由接觸如本文所述之孔盤內的經恰當製備的淋巴球活化共價功能化表面而經活化。可使用本文中描述之孔盤之活化表面來活化及/或擴增B淋巴球及NK細胞以用於任何目的，通常包括免疫療法及細胞產生。
為在孔盤之孔內提供淋巴球活化合成表面，具有用於此類活化之限定區域的可控的共價功能化孔盤已由申請人發現並進行描述。
因此，提供一種孔盤，其包括具有為反應性部分呈現共價功能化區或活化部分呈現共價功能化區之第一區域，其中反應性部分為疊氮基部分、生物素部分或抗生蛋白鏈菌素部分且活化部分為淋巴球活化部分。第一區域之面積可為至少0.5 mm2 (例如，至少0.6 mm2 、至少0.7 mm2 、至少0.8 mm2 、至少0.9 mm2 、至少1.0 mm2 、至少1.1 mm2 、至少1.2 mm2 、至少1.3 mm2 、至少1.4 mm2 、至少1.5 mm2 、至少1.6 mm2 、至少1.7 mm2 、至少1.8 mm2 、至少1.9 mm2 、至少2.0 mm2 、至少2.5 mm2 、至少3.0 mm2 、至少3.5 mm2 、至少4.0 mm2 、至少4.5 mm2 、至少5.0 mm2 、至少6.0 mm2 、至少7.0 mm2 、至少8.0 mm2 、至少9.0 mm2 、至少10 mm2 、至少15 mm2 、至少20 mm2 、至少25 mm2 、至少30 mm2 、至少35 mm2 、至少40 mm2 、至少45 mm2 、至少50 mm2 、至少75 mm2 、至少100 mm2 、至少150 mm2 、至少200 mm2 、至少250 mm2 、至少300 mm2 、至少400 mm2 、至少500 mm2 、至少600 mm2 、至少700 mm2 、至少800 mm2 、至少900 mm2 、至少1000 mm2 或更大)。在一些實施例中，諸如其中所呈現反應性部分為生物素部分或抗生蛋白鏈菌素部分之區域或第一區域為活化部分呈現共價功能化區，第一區域將通常具有小於100 mm2 、小於75 mm2 或小於50 mm2 之面積。在其他實施例中，諸如其中反應性部分為疊氮基部分之彼等區域，第一區域之面積可超出1000 mm2 ，例如第一區域之面積可為至少2,000 mm2 、至少3,000 mm2 、至少4,000 mm2 、至少5,000 mm2 、至少6,000 mm2 、至少7,000 mm2 、至少8,000 mm2 、至少9,000 mm2 、至少10,000 mm2 、20,000 mm2 、至少30,000 mm2 、至少40,000 mm2 、至少50,000 mm2 、至少60,000 mm2 、至少70,000 mm2 、至少80,000 mm2 、至少90,000 mm2 、至少100,000 mm2 或更大。在一些變化形式中，第一區域之尺寸可為約0.5 mm至約4.0 mm (例如，約1.0 mm至約3.5 mm、或約1.5 mm至約3.0 mm)。第一區域可為實質上圓形且具有約0.5 mm至約4.0 mm (例如，約1 mm至約3.5 mm或約1.5 mm至約3.0 mm)之直徑。
孔盤之表面可進一步包括第二區域，該第二區域為包括表面阻斷配位體之共價修飾區。視情況，第二區域可包圍第一區域。在一些實施例中，表面阻斷配位體中之每一者可包括親水性或帶負電荷部分(例如，甲酸酯基團)。在一些實施例中，表面阻斷配位體中之每一者可包括聚乙二醇(PEG)部分。
孔盤之表面可包括玻璃或聚苯乙烯。在一些變化形式中，孔盤之表面可包括聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、環烯烴共聚物或三聚氰胺。
第一區域之密度可為至少50個各別反應性部分或活化部分/平方微米，例如約50個反應性部分或活化部分/平方微米至約8 × 105 個反應性部分或活化部分/平方微米、約1 × 102 個反應性部分或活化部分/平方微米至約8 × 105 個反應性部分或活化部分/平方微米；約50個反應性部分或活化部分/平方微米至約5 × 105 個反應性部分或活化部分/平方微米；約1 × 102 個反應性部分或活化部分/平方微米至約1 × 105 個反應性部分或活化部分/平方微米；約50個反應性部分或活化部分/平方微米至約5 × 104 個反應性部分或活化部分/平方微米；約1 ×102 個反應性部分或活化部分/平方微米至約1 × 104 個反應性部分或活化部分/平方微米；約1 × 102 個反應性部分或活化部分/平方微米至約5 × 103 個反應性部分或活化部分/平方微米；約1 × 102 個反應性部分或活化部分/平方微米至約1 × 103 個反應性部分或活化部分/平方微米；約50個反應性部分或活化部分/平方微米至約5 × 102 個反應性部分或活化部分/平方微米；約50個反應性部分或活化部分/平方微米至約1 × 102 個反應性部分或活化部分/平方微米；或該等反應性部分或活化部分數目/平方微米其間的任何值。包括相應反應性部分或活化部分之第一區域可經由連接子共價連接至表面，該連接子具有5個至約20個主鏈原子、約10個至約40個主鏈原子、約15個至約50個主鏈原子或超過50個主鏈原子，其中主鏈原子選自碳、矽、氮及氧。因此，例如可經由連接子之一系列約5個、7個、9個、10個、11個、13個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、90個、100個、200個鍵長度或其間的任何數目之鍵長度將反應性部分或活化部分共價連接至表面。
在一些變化形式中，反應性部分可為抗生蛋白鏈菌素，且抗生蛋白鏈菌素官能基共價附著於孔盤表面之第一區域。在其他變化形式中，反應性部分可為抗生蛋白鏈菌素，且抗生蛋白鏈菌素官能基非共價地附著於生物素部分，該生物素部分自身共價附著於孔盤之表面的第一區域。
在一些變化形式中，第一區域可為活化部分呈現共價功能化區，其包括複數個特異性結合的初始活化分子配位體及複數個特異性結合的共活化分子配位體。表面之第一區域上之初始活化分子配位體與共活化分子配位體之比率為約1:10至約2:1、約1:5至約2:1、約1:2至約2:1、約1:10至約1:1、約1:5至約1:1、約1:1至約2:1或約1:2至約1:1。
在一些實施例中，複數個特異性結合的初始活化分子配位體之各配位體可包括經組態以結合至T細胞之T細胞受體(TCR)的主要組織相容複合體(MHC)分子(例如，I類或II類)。MHC分子可包括I類MHC蛋白序列及β微球蛋白蛋白序列。在一些變化形式中，MHC分子可經由C端鍵連接至活化部分呈現共價功能化區。
MHC分子可進一步包括抗原肽。抗原肽可為腫瘤相關抗原、病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原或原蟲抗原。在一些變化形式中，抗原肽可為腫瘤相關抗原。在一些實施例中，腫瘤相關抗原可為SLC45A2、TCL1、VCX3A、MART1或NYESO1。
在一些變化形式中，複數個特異性結合的共活化分子配位體中之各配位體可包括T細胞受體(TCR)共活化分子或輔助TCR活化分子。複數個共活化分子配位體之TCR共活化分子與輔助TCR活化分子之比率為約100:1至約1:100。在一些實施例中，複數個共活化分子配位體之TCR共活化分子與輔助TCR活化分子的比率可為100:1至90:1、90:1至80:1、80:1至70:1、70:1至60:1、60:1至50:1、50:1至40:1、40:1至30:1、30:1至20:1、20:1至10:1、10:1至1:1、3:1至1:3；1:1至1:10、1:10至1:20、1:20至1:30、1:30至1:40、1:40至1:50、1:50至1:60、1:60至1:70、1:70至1:80、1:80至1:90或1:90至1:100，其中前述值中之每一者由「約」修飾。在其他實施例中，複數個特異性結合的共活化分子配位體之TCR共活化分子與輔助TCR活化分子的比率可為約20:1至約1:20或約3:1至約1:3。
在一些變化形式中，TCR共活化分子可包括CD28結合蛋白或其片段，該片段保留對於CD28之結合能力。在一些實施例中，CD28結合蛋白或其片段可進一步包括位點特異性C端生物素部分。在一些實施例中，TCR共活化分子可包括CD80分子或其片段，其中該片段保留對於CD28之結合活性。在一些其他實施例中，TCR共活化分子可包括抗CD28抗體或其片段，其中該片段保留對於CD28之結合活性。
在一些變化形式中，輔助TCR活化分子可包括CD2結合蛋白或其保留對於CD2之結合活性的片段。在一些實施例中，CD2結合蛋白或其片段進一步包括位點特異性C端生物素部分。在一些實施例中，輔助TCR活化分子可包括CD58分子或其片段，其中該片段保留與CD2之結合活性。在一些其他實施例中，輔助TCR活化分子可包括抗CD2抗體或其片段，其中該片段保留與CD2之結合活性。
在一些變化形式中，複數個特異性結合的初始活化分子配位體及複數個特異性結合的共活化分子配位體可特異性結合至孔盤之抗生蛋白鏈菌素呈現第一區域之抗生蛋白鏈菌素官能基。
在第一區域中，複數個特異性結合的初始活化分子配位體之密度可為至少約1 × 102 個分子/平方微米，且視情況在第一區域中，密度為約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米。在第一區域中，複數個特異性結合的共活化分子配位體之密度為至少1 × 102 個分子/平方微米或約1 × 103 至約1 × 105 個分子/平方微米。
在一些變化形式中，提供一種孔盤，其中孔盤之一或多個孔中之每一者包括表面及其第一區域，其中第一區域為反應性部分呈現共價功能化區或活化部分呈現共價功能化區，類似於如本文中所描述之具有表面及第一區域的任何孔盤。一或多個孔中之每一者的第一區域可位於對應孔之底表面上。各第一區域之面積可小於約50%、小於約25%、小於約15%、小於約10%、小於約5%或小於約2%之對應孔之底表面面積。在一些實施例中，當第一區域之面積小於該等孔之底表面整個底表面面積時，則反應性部分不為疊氮基部分。在一些實施例中，表面阻斷配位體中之每一者可包括親水性或帶負電荷部分。在一些實施例中，表面阻斷配位體可包括聚乙二醇(PEG)部分。
如上文所描述，具有包括反應性部分呈現共價功能化區(例如疊氮基呈現或炔基呈現部分)之表面之孔盤可用作可集中獲得之功能化形式，其可以多種不同方式修飾以結合多種共價配位體搭配物分子用於不同類別之微型物體之多種生物學及化學轉化，該等類別包括(但不限於)生物細胞及其片段，且該孔盤用於活化淋巴球細胞以獲得具有可控制、選擇表型之所需群體之方法，包括(但不限於)本文所描述之方法。如本文所用，疊氮基呈現係指共價附著配位體之表面之共價功能化區，其中配位體在與配位體之表面結合第二末端相對的配位體之第一末端處或附近具有疊氮基官能基。與表面結合末端相對之末端處或附近的疊氮基實質上可用於與可與疊氮基反應之反應對部分反應，諸如(但不限於)炔烴、環狀應變炔、氯化α酮基及其類似物。如本文中所提及之共價功能化表面包括已耦合共價連接分子(例如，配位體)之任何種類之玻璃或聚合物表面，如下文詳細描述。經共價功能化之表面區可為整個表面、表面之一部分或表面之選定部分，如下文更完整描述。
其他適用可控制地共價功能化孔盤亦已經申請人發現且在本文中描述。可將生物素或抗生蛋白鏈菌素引入至孔盤之疊氮基呈現共價功能化表面中，特定言之引入至孔盤之一或多個孔內，產生孔盤之表面的一或多個生物素呈現共價功能化區或孔盤之表面的一或多個抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區。在一個配置中，經由包括反應性基團之連接子將抗生蛋白鏈菌素自身共價連接至孔盤之表面，該反應性基團經組態以與孔盤之疊氮基呈現共價功能化表面的疊氮基官能基反應。在另一配置中，抗生蛋白鏈菌素部分非共價地附著於生物素部分，其中經由包括反應性基團之連接子將生物素部分自身共價連接至表面，該反應性基團經組態以與孔盤之疊氮基呈現功能化表面的疊氮基官能基反應。在任一情況下，將抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區引入至表面，其中類似於疊氮基部分，抗生蛋白鏈菌素部分經共價連接至表面使得抗生蛋白鏈菌素之結合位點中之至少一者可用於結合生物分子配位體以用於如本文所述的活化淋巴球之方法。
孔盤表面之抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區可用於多種應用，但一種重要(但非限制性)用途為用於活化淋巴球，包括(但不限於)抗原特異性活化T細胞。申請人已發現限制存在於孔盤之孔內之抗生蛋白鏈菌素配位體之密度的能力及/或限制存在抗生蛋白鏈菌素配位體之區域的大小及/或選擇存在抗生蛋白鏈菌素配位體之區域之位置的能力對於有效且高效地活化T細胞而言可為至關重要的。不希望受理論所束縛，存在於孔盤之孔的功能化表面上之高密度的抗生蛋白鏈菌素部分可准許高濃度之MHC複合物(呈遞抗原)及共刺激配位體結合至各抗生蛋白鏈菌素上可獲得的多個結合位點，從而提供高刺激性抗原呈現合成表面。此高刺激性抗原呈現合成表面可實際上過度刺激T細胞，朝向耗竭或病理表型推動經過度活化細胞且提供較低數目之抗原特異性細胞，該等細胞在生理學上能夠經擴增至有效細胞產品中。替代地或另外，具有較大初始及二級(或共活化)活化配位體區之孔同樣亦可過度刺激淋巴球，且使得經活化淋巴球具有非所需表型，諸如耗竭性T細胞及其類似物。將淋巴球活化配位體之面積限定至孔盤之孔的較小區域可有利地提供可轉移淋巴球之面積，進而預防病理表型產生。此外，藉由用於本文中所描述之孔盤的經限制活化區，其可適用於一些實施例，使用圓形底部孔利用重力以將細胞引入孔內之活化區中。
類似地，具有諸如經修飾以呈現一或多種活化物種(諸如細胞表面標記物，諸如CD2、CD4、CD8、CD28及其類似物；抗原呈現物種，諸如肽裝載MHC分子、細胞介素、細胞黏附配位體及生長刺激性分子)之孔之整個底部或含細胞區域的較大區域或不受控表面積之孔可誘發與待活化且在一些實施例中待擴增細胞之覆蓋活化接觸，其可導致下調所需細胞表面標記物及其他內部信號傳導路徑，又引起非所需細胞群諸如(但不限於)耗竭或非擴增活化T細胞。
因此，申請人描述具有可控制、經限定且有限接觸區之功能化孔盤及功能化孔盤內之孔的特定區域內之抗生蛋白鏈菌素部分的接觸密度。此等受限區域/濃度之抗生蛋白鏈菌素部分隨後可用於引入活化物種以有效且高效活化淋巴球，其可包括(但不限於)對於用於個體之免疫療法之細胞產品具有抗原特異性及所需表型的T細胞。提出藉由限制具有活化配位體之區域面積呈現細胞可在接收刺激性信號後移動離開活化區域，維持刺激而不過度活化。此外，自身不准許附著活化分子物種之表面阻斷配位體可用於限制抗生蛋白鏈菌素官能基之密度或物理位置(且因此活化向其中引入之配位體)且提供有助於細胞維護、擴增及便攜性之支撐表面修飾，而不需添加至刺激性信號傳導。下文更完整地描述用於活化孔盤之表面的限制區域之特異性及可控引入。
可藉由檢閱圖1A至1C及隨附描述理解將表面之共價功能化區可控且靈活地引入於孔盤內。如圖1A中所展示，提供孔盤110。孔盤可為玻璃或聚合物(例如塑膠聚合物)，或可包含玻璃或聚合物表面。孔盤110可包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、環烯烴共聚物或三聚氰胺e聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、環烯烴共聚物、三聚氰胺及其類似物。孔盤110在孔盤內可具有16個、48個、96個、384個或更多孔。孔盤110可在功能化之前經處理或清潔以移除雜質且將複數個反應性官能基引入表面處。處理/清潔可包括電漿清潔，其可如本文所述或以如此項技術中已知的電漿清潔之任何適合之變化形式執行。替代地或另外，孔盤110之表面可經強清潔性溶液處理，以實現將反應性官能基(諸如氧化物)類似引入於孔盤之表面上。
可經處理或清潔之孔盤110可與試劑103反應，其提供可合成獲得之處理，包括孔盤之表面處之反應性部分用於進一步加工。可容易引入之通常適用的反應性部分包括(但不限於)疊氮化物或炔烴，其中之每一者可與點擊化學(Click chemistry)試劑組中分類之試劑進一步反應，以提供對於孔盤表面之多種表面修飾。然而，如此項技術中已知的其他化學偶合，例如鈴木甲硼烷型偶合(Suzuki borane-type coupling)反應、邁克爾反應(Michael reactions)及其類似反應亦可用於將表面功能化劑或表面阻斷劑偶合至適當反應性表面及其他反應性部分，諸如羧基、共軛羧基，且可使用其他活化部分。本發明不限於使用點擊化學及各別試劑對來引入經修飾表面及支撐於其上之活化物種，但為簡單起見，本文中詳細描述疊氮基部分之引入。
微流裝置之內表面上或可應用於修飾孔盤之孔的珠粒(諸如玻璃或聚合性珠粒)之表面上執行之化學反應之其他實例描述於2017年5月26日申請的PCT/US2017/034832 (Lowe等人)及2018年7月20日申請的PCT/US2018/043146 (Beemiller等人)中，該等揭示案中之每一者以全文引用之方式併入本文中。
一種用於表面之初始功能化之極適用的試劑103類別包括疊氮基取代之三烷氧基矽氧烷，其中三烷氧基矽氧烷與孔盤110之清潔表面的表面暴露部分(例如，氧化物)反應。矽氧烷可具有將疊氮基反應性部分連接至矽氧烷之連接子，其包括烴、取代烴或環氧烷鏈。可在溶液中或在氣態情況下執行反應，且在一些變化形式中，在真空下在具有揮發的疊氮基取代之三烷氧基矽氧烷的情況下執行疊氮基取代之三烷氧基矽氧烷之反應。由於不同聚合性孔盤對不同高溫具有耐受性，因此特異性疊氮基-三烷氧基矽氧烷之選擇取決於孔盤之材料。連接子之長度判定何種溫度必須用於使疊氮基-三烷氧基矽氧烷揮發，且作用於所引入修飾反應性表面之本質。藉由分子之三烷氧基矽氧烷部分與孔盤表面上之表面暴露部分(諸如氧化物部分)之反應將疊氮基取代之配位體引入至表面。反應可在溶液中執行，或可在疊氮基取代之三烷氧基矽氧烷經揮發以與表面暴露部分反應之條件下執行。與疊氮基取代之三烷氧基矽氧烷反應的孔盤之面積可為整個孔盤，可經遮蔽以限制與孔盤之一部分的反應(例如，經遮蔽使得孔盤之僅一或多個孔可反應)或其任何變化形式。在一些其他實施例中，僅孔盤之孔(或更多孔)之底部區域可為孔盤之疊氮基呈現共價功能化區。如本文中所提及，底表面位於形成孔之殼體之壁上，其中底表面相對於孔盤中之孔的頂部處之開口安置。在一些實施例中，疊氮基呈現共價功能化區並不位於形成孔之殼體的側壁上，其中側壁鄰接孔盤中之孔的開口。在一些其他實施例中，疊氮基呈現共價功能化區並不位於形成孔之殼體的側壁上，其中側壁實質上垂直於孔之頂部處的開口。
在一些變化形式中，疊氮基呈現共價功能化區之面積可為至少0.5 mm2 (例如，至少0.6 mm2 、至少0.7 mm2 、至少0.8 mm2 、至少0.9 mm2 、至少1.0 mm2 、至少1.1 mm2 、至少1.2 mm2 、至少1.3 mm2 、至少1.4 mm2 、至少1.5 mm2 、至少1.6 mm2 、至少1.7 mm2 、至少1.8 mm2 、至少1.9 mm2 、至少2.0 mm2 、至少3.0 mm2 、至少4.0 mm2 、至少5.0 mm2 、至少6.0 mm2 、至少7.0 mm2 、至少8.0 mm2 、至少9.0 mm2 、至少10 mm2 、至少15 mm2 、至少20 mm2 、至少25 mm2 、至少30 mm2 、至少35 mm2 、至少40 mm2 、至少45 mm2 、至少50 mm2 、至少75 mm2 、至少100 mm2 、至少150 mm2 、至少200 mm2 、至少250 mm2 、至少300 mm2 、至少400 mm2 、至少500 mm2 、至少600 mm2 、至少700 mm2 、至少800 mm2 、至少900 mm2 、至少1000 mm2 )。
疊氮基呈現共價功能化區之密度可為至少50個疊氮基/平方微米(例如，約50個疊氮基/平方微米至約2 × 107 個疊氮基/平方微米、約1 × 102 個疊氮基/平方微米至約1 × 107 個疊氮基/平方微米；約50個疊氮基/平方微米至約5 × 106 個疊氮基/平方微米；約1 × 102 個疊氮基/平方微米至約1 × 106 個疊氮基/平方微米；約1 × 102 個疊氮基/平方微米至約5 × 105 個疊氮基/平方微米；約1 × 102 個疊氮基/平方微米至約1 × 105 個疊氮基/平方微米；約1 × 102 個疊氮基/平方微米至約5 × 104 個疊氮基/平方微米；約50個疊氮基/平方微米至約5 × 104 個疊氮基/平方微米；約1 × 102 個疊氮基/平方微米至約5 × 103 個疊氮基/平方微米；約50個疊氮基/平方微米至約5 × 102 個疊氮基/平方微米；或該等疊氮基數目/平方微米其間的任何值)。
連接子之長度可為以下鍵長度，其可為5個、7個、9個、10個、11個、13個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、90個、100個、200個鍵長度或其間的任何數目的鍵長度。在一些實施例中，疊氮基呈現共價功能化區包含經由一系列約5個鍵長度至20個鍵長度或約10個鍵長度至約40個鍵長度共價連接至表面的疊氮基官能基。在一些實施例中，將疊氮基官能基連接至表面之連接子的原子可選自碳、矽、氮、硫及氧。在一些實施例中，連接子之原子可選自碳、矽及氧。在一些變化形式中，連接子具有約七個至約十七個主鏈原子，該等主鏈原子可選自碳、矽及氧。在一些實施例中，連接子為線性連接子且連接子僅具有一個附著至疊氮基部分之第一末端及一個結合至表面之第二末端。在其他實施例中，連接子為分支鏈連接子且分支鏈連接子可具有一個附著至表面之第二末端及複數個第一末端，該等第一末端各自附著至疊氮基部分，例如疊氮基功能化之刷狀聚合物。在各種實施例中，該表面之疊氮基呈現表面結合配位體在孔盤之表面上形成單層。在一些實施例中，疊氮基呈現表面結合配位體形成自組裝單層，其距孔盤之表面之厚度可為約10埃(angstrom)、約20埃、約30埃、約40埃、約50埃、約70埃至約100埃或其間的任何值。
在一些變化形式中，將疊氮基部分連接至三烷氧基矽氧烷之連接子具有約20個、約18個、約16個、約14個、約12個、約10個、約9個、約8個、約7個、約6個、約5個或約4個原子長之主鏈長度。在一些實施例中，主鏈為約7個原子長且為烴鏈。儘管玻璃孔盤可通常耐受顯著升高的反應條件，但其他聚合性孔盤在暴露於極高溫後可能變形或以其他方式變得不可用。已經發現有效地修飾聚合物孔盤(諸如聚苯乙烯或聚碳酸酯)之方法為使用長度為七個碳原子之疊氮基取代之三烷氧基矽氧烷。如圖1A中所展示，表面功能化劑103可因此為7-疊氮基庚基-三甲氧基矽烷(特別與聚合性孔盤一起使用)，以產生功能化孔盤115，在表面處呈現功能化配位體105。在使用7-疊氮基庚基-三甲氧基矽烷之特定情況下，配位體105為經由矽氧烷部分共價附著至表面之疊氮基庚基配位體。
提供孔盤之表面的抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之途徑 . 共價功能化孔盤表面115 (在一個特定實例中，疊氮基呈現共價功能化孔盤表面)可經修飾以呈現抗生蛋白鏈菌素部分。可以若干方式中之一者獲得此修飾。
孔盤之表面的生物素呈現共價功能化區 . 產生孔盤之表面的抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之一種方法為經由與孔盤之表面共價結合的生物素基團。疊氮基功能化孔盤115可與含有生物素連接炔之試劑(諸如含二環辛炔基之點擊試劑)反應。在圖1A中，作為一個實例，可使用包括生物素之二苯并環辛炔基(DBCO)點擊試劑DBCO試劑107，其中生物素部分由連接子連接至DBCO部分，除其他以外，該連接子包括烷基、環氧烷或可裂解烷基或環氧烷主鏈。連接子之主鏈長度可為至少4個原子、至少8個原子、至少12個原子、至少16個原子、至少20個原子、至少50個原子或至少100個原子或更多，該等原子可為碳、氧、氮或硫。試劑107之DBCO部分與疊氮基配位體105之反應產生含共價結合的生物素之配位體109，以產生孔盤之表面的生物素呈現共價功能化區120。
在孔盤之表面的生物素呈現共價功能化區之一些變化形式中，孔盤115之疊氮基功能化表面可首先與表面阻斷劑117反應，以產生孔盤之表面的疊氮基呈現共價功能化區130。表面阻斷劑117可具有經組態以與經清潔/經製備表面之剩餘表面暴露部分反應之反應性部分，在疊氮基功能化步驟中，其並未結合試劑103。表面阻斷劑117包括一個反應性官能基，諸如三烷氧基矽氧烷，其經組態以與藉由清潔引入之表面暴露部分反應。然而，表面阻斷劑117並不包括經組態以與以下中之任一者反應之官能基：含生物素之試劑、抗生蛋白鏈菌素、含抗生蛋白鏈菌素之試劑或淋巴球活化劑。表面阻斷劑117可類似於下文更完整描述之任何適合之阻斷劑。
可執行將共價結合的生物素引入至表面130，用於上文所描述之表面115與DBCO連接生物素部分107之反應，其僅與疊氮化物配位體105之疊氮化物官能基反應以產生已共價連接生物素配位體109及表面阻斷配位體119之孔盤表面之生物素呈現共價修飾區135。
在展示於圖1B中之又一替代例中，孔盤115之疊氮基呈現共價功能化表面可與含生物素之DBCO試劑107及表面阻斷DBCO劑121之混合物反應，該表面阻斷DBCO試劑具有表面阻斷部分及經組態以與表面115之疊氮基部分反應的DBCO部分。下文更完整地描述可為任何適合之表面阻斷DBCO劑之表面阻斷部分。此反應之產物為孔盤之表面的生物素呈現共價修飾區145，其具有含生物素之配位體109及表面阻斷配位體123兩者。混合表面上之配位體之比例可經修飾呈任何適合之比例，以將每單位面積之生物素部分之密度「調節」至所需量。生物素配位體與表面阻斷配位體之比例可為約3:1；約2:1；約1:1；約1:2；約1:3；約1:4；約1:5；約1:6；約1:8；約1:10或更多。表面阻斷配位體123之表面阻斷部分之化學性質亦可改變以提供用於選定淋巴球活化的經優化表面。
對於生物素呈現共價功能化區135、145，表面阻斷劑117及表面阻斷DBCO劑121可包括超過一種類型之表面阻斷部分。舉例而言，可使用具有不同鏈長、帶電部分及/或親水性特徵之試劑混合物。
生物素呈現共價功能化區120、135、145之面積可為至少0.5 mm2 、例如至少0.6 mm2 、至少0.7 mm2 、至少0.8 mm2 、至少0.9 mm2 、至少1.0 mm2 、至少1.1 mm2 、至少1.2 mm2 、至少1.3 mm2 、至少1.4 mm2 、至少1.5 mm2 、至少1.6 mm2 、至少1.7 mm2 、至少1.8 mm2 、至少1.9 mm2 、至少2.0 mm2 、至少3.0 mm2 、至少4.0 mm2 、至少5.0 mm2 、至少6.0 mm2 、至少7.0 mm2 、至少8.0 mm2 、至少9.0 mm2 、至少10 mm2 、至少15 mm2 、至少20 mm2 、至少25 mm2 、至少30 mm2 、至少35 mm2 、至少40 mm2 、至少45 mm2 、至少50 mm2 、至少75 mm2 、至少100 mm2 、至少150 mm2 、至少200 mm2 、至少250 mm2 、至少300 mm2 、至少400 mm2 、至少500 mm2 、至少600 mm2 、至少700 mm2 、至少800 mm2 、至少900 mm2 、至少1000 mm2 。
生物素呈現共價功能化區120、135、145之密度可為至少50個生物素官能基/平方微米(例如，約50個生物素基團/平方微米至約5 × 106 個生物素基團/平方微米、約1 × 102 個生物素基團/平方微米至約1 × 106 個生物素基團/平方微米；約1 × 102 個生物素基團/平方微米至約5 × 105 個生物素基團/平方微米；約1 × 102 個生物素基團/平方微米至約1 × 105 個生物素基團/平方微米；約1 × 102 個生物素基團/平方微米至約5 × 104 個生物素基團/平方微米；約1 × 102 個生物素基團/平方微米至約1 × 104 個生物素基團/平方微米；約1 × 102 個生物素基團/平方微米至約5 × 103 個生物素基團/平方微米；約1 × 102 個生物素基團/平方微米至約1 × 103 個生物素基團/平方微米；約50個生物素基團/平方微米至約5 × 102 個生物素基團/平方微米；約50個生物素基團/平方微米至約1 × 102 個生物素基團/平方微米；或該等生物素基團數目/平方微米其間的任何值)。
生物素呈現共價功能化區包含經由連接子共價連接至表面之生物素官能基，該連接子經由一系列約5個、7個、9個、10個、11個、13個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、90個、100個、200個鍵長度之連接子或其間的任何數目之鍵長度共價連接至該表面。在一些實施例中，將生物素官能基連接至表面之連接子的原子可選自碳、矽、氮、硫及氧。在一些實施例中，連接子之原子選自碳、矽及氧。在一些實施例中，將生物素連接至DBCO部分之連接子可具有約10個至40個主鏈原子，該等主鏈原子選自碳、矽、氮及氧。在一些實施例中，連接子為線性連接子且連接子僅具有一個附著至生物素部分之第一末端及一個結合至表面之第二末端。在一些實施例中，連接子為實質線性連接子，其中該實質線性連接子可包括或間雜有環狀部分，諸如***基或經取代***基部分。諸如***基或經取代***基之環狀部分可為實質線性連接子之部分，其經由點擊偶合引入以引入共價結合的生物素。在其他實施例中，連接子為分支鏈連接子且該分支鏈連接子可具有一個結合至表面之第二末端及複數個各自附著有生物素部分(例如生物素呈現功能化刷狀聚合物)之第一末端，該連接子可包括環狀基團，諸如***基及/或經取代***基基團。在一些其他實施例中，將生物素部分連接至表面之連接子可進一步包括二硫化物部分或可光裂解部分。在各種實施例中，生物素呈現共價功能化表面之配位體在區域120、135、145之表面上形成單層。在一些實施例中，生物素呈現表面結合配位體形成自組裝單層，其距孔盤之表面的厚度可為約10埃至約100埃或其間的任何值。
孔盤之表面的生物素呈現共價功能化區120、135、145可立刻經進一步修飾或可經儲存以便後續使用。儘管圖1A、1B展示表面之生物素呈現共價功能化區120、135、145進一步轉化為孔盤之表面的抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區，但本發明不限於此。對於生物素之任何適合之結合對可結合至孔盤之表面的生物素呈現共價功能化區120。
孔盤之表面的抗生蛋白鏈菌素呈現功能化區 . 如圖1A及1B中所展示，生物素呈現共價功能化區120、135、140中之任一者可將抗生蛋白鏈菌素偶合至其上之生物素部分。具有四個結合位點且示意性地展示為結構111之可為天然抗生蛋白鏈菌素或具有與生物素之結合親和力的經修飾抗生蛋白鏈菌素之抗生蛋白鏈菌素隨後可與區域120、135、145之含有生物素之配位體109反應，在抗生蛋白鏈菌素之四個可獲得位點中之一者處結合，產生各別抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區125、140、150，具有抗生蛋白鏈菌素配位體113。抗生蛋白鏈菌素可視為自身非共價地結合，但經由自身共價結合至表面之生物素結合至表面，進而形成孔盤之表面的抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區。生物素/抗生蛋白鏈菌素結合對之強度(解離常數Kd 為約10-14 mol/L)可視為強度上相等於共價鍵，因此允許與表面之較強關聯。
如上文所提及，抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區140、150分別包括表面阻斷配位體119及123，進而允許活化表面之選擇性設計。
將抗生蛋白鏈菌素直接偶合至表面之 疊氮基呈現共價功能化區 . 展示於圖1C中，在又一替代例中，可利用具有疊氮基官能基配位體105之疊氮化物呈現共價功能化表面115直接地產生孔盤之表面的抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區。在一個步驟中，抗生蛋白鏈菌可藉由與具有共價連接至炔基部分之抗生蛋白鏈菌素分子之點擊化學試劑(諸如試劑127)反應而共價結合至表面115，其中DBCO部分經由連接子而共價連接至抗生蛋白鏈菌素四聚分子(具有四個結合位點)。將DBCO連接至抗生蛋白鏈菌素之連接子可為氧化烯基、烷基或可裂解氧化烯基或烷基線性部分。連接子可具有10個至50個主鏈原子，該等主鏈原子選自碳、矽、氮及氧。(例如，抗生蛋白鏈菌素官能基可經由一系列約5個、7個、9個、10個、11個、13個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、90個、100個、200個鍵長度之連接子或其間的任何數目之鍵長度而共價連接至表面)。在一些實施例中，將抗生蛋白鏈菌素官能基連接至表面之連接子的原子可選自碳、矽、氮、硫及氧。在一些實施例中，連接子之原子選自碳、矽及氧。在一些實施例中，連接子為線性連接子且連接子僅具有一個附著至抗生蛋白鏈菌素之第一末端及一個直接地或間接地結合至表面之第二末端。在一些實施例中，連接子為實質線性連接子且連接子僅具有一個附著至抗生蛋白鏈菌素部分之第一末端及一個直接地或間接地結合至表面之第二末端，其中實質線性連接子可包括或間雜有環狀部分，諸如***基或經取代***基部分。諸如***基或經取代***基之環狀部分可為實質線性連接子之部分，其經由點擊偶合引入以引入共價結合的抗生蛋白鏈菌素。在其他實施例中，連接子為分支鏈連接子且分支鏈連接子可具有一個直接地或間接地結合至表面之第二末端及複數個各自結合至抗生蛋白鏈菌素部分(例如抗生蛋白鏈菌素功能化刷狀聚合物)之第一末端，該分支鏈連接子可包括環狀基團，諸如***基及/或經取代***基。在其他變化形式中，抗生蛋白鏈菌素可在抗生蛋白鏈菌素分子之超過一個點處共價附著於表面。在一些其他實施例中，將抗生蛋白鏈菌素部分連接至表面之連接子可進一步包括二硫化物部分或可光裂解部分。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素呈現表面結合配位體形成層，該層距孔盤之表面的厚度為約10埃至約100埃，或其間的任何值。
如圖1C中所展示之此單步途徑亦可使用抗生蛋白鏈菌素連接之DBCO單擊試劑127及類似於表面阻斷劑121之表面阻斷劑之混合物，其中該表面阻斷劑可具有如上文所述之任何組成。可以任何所需比率採用抗生蛋白鏈菌素DBCO試劑127及表面阻斷劑121之混合物以在經修飾表面155上提供選定密度/分佈之抗生蛋白鏈菌素部分(未展示混合物)。抗生蛋白鏈菌素配位體與表面阻斷配位體之比例可為約3:1；約2:1；約1:1；約1:2；約1:3；約1:4；約1:5；約1:6；約1:8；約1:10或更多。
在又一替代例中，儘管已使用DBCO點擊試劑論述先前範例，但可以等效於圖1A至1C中所展示的途徑之對應途徑使用非環狀炔連接生物素、表面阻斷劑及抗生蛋白鏈菌素連接劑引入所有相同表面。在一些變化形式中，使用炔連接之點擊試劑以與疊氮基配位體105在銅催化劑下反應可有助於充分減緩點擊反應，以獲得更精確界定之修飾區域，如下文更詳細論述。
類似於本文中所描述之任何區域，抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之密度可為至少50個抗生蛋白鏈菌素官能基/平方微米(例如，約50個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約8 × 105 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米、約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約8 × 105 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約50個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約5 × 105 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約1 × 105 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約50個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約5 × 104 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約1 × 104 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約5 × 103 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約1 × 103 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約50個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約5 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約50個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；或該等抗生蛋白鏈菌素基團數目/平方微米其間的任何值)。
類似於本文中描述之任何，抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之面積可為至少0.5 mm2 、例如至少0.6 mm2 、至少0.7 mm2 、至少0.8 mm2 、至少0.9 mm2 、至少1.0 mm2 、至少1.1 mm2 、至少1.2 mm2 、至少1.3 mm2 、至少1.4 mm2 、至少1.5 mm2 、至少1.6 mm2 、至少1.7 mm2 、至少1.8 mm2 、至少1.9 mm2 、至少2.0 mm2 、至少3.0 mm2 、至少4.0 mm2 、至少5.0 mm2 、至少6.0 mm2 、至少7.0 mm2 、至少8.0 mm2 、至少9.0 mm2 、至少10 mm2 、至少15 mm2 、至少20 mm2 、至少25 mm2 、至少30 mm2 、至少35 mm2 、至少40 mm2 、至少45 mm2 、至少50 mm2 、至少75 mm2 、至少100 mm2 、至少150 mm2 、至少200 mm2 、至少250 mm2 、至少300 mm2 、至少400 mm2 、至少500 mm2 、至少600 mm2 、至少700 mm2 、至少800 mm2 、至少900 mm2 、至少1000 mm2 。
可能需要使用藉由上述製備途徑獲得之對照來選擇抗生蛋白鏈菌素部分之密度以提供足夠數目之結合位點(具有至多四個可獲得結合位點之抗生蛋白鏈菌素)以結合表面之活化區內的一或多種不同活化分子，同時提供可存在活化分子之密度上限。不希望受理論所束縛，藉由超過本文所描述之最高密度的刺激配位體密度來過度刺激淋巴球係可能的，其可將淋巴球驅動至不太理想之生理狀態，例如耗竭表型或非特異性活化表型。
選擇性地引入共價功能化區 . 如所提及，申請人已發現在可獲取淋巴球之體積內形成受限之活化區，提供極大改良的活化表型。因此，可在孔盤之表面的規定區域內執行能夠結合淋巴球活化配位體之共價功能化表面的引入。在一些實施例中，孔盤之一或多個表面可具有引入的疊氮基呈現共價功能化區。一或多個表面可為孔盤之一或多個孔，且另外底表面可為孔盤之一或多個孔之底表面。如本文中所提及，底表面位於形成孔之殼體之壁上，其中底表面相對於孔盤中之孔的頂部處之開口安置。在一些實施例中，疊氮基呈現共價功能化區並不位於形成孔之殼體的側壁上，其中側壁鄰接孔盤中之孔的開口。
然而，在各種實施例中，孔盤之所有表面可具有引入的疊氮基呈現共價功能化表面，尤其在疊氮基連接之三烷氧基矽氧烷隨著接觸孔盤之表面的揮發試劑與表面暴露部分反應而反應時。如所提及，在採用遮蔽任何適合之類型時，並非所有表面可經反應以形成疊氮基呈現共價功能化表面。舉例而言，可遮蔽孔盤之上部及下部側，使得僅孔中之一或多者內部的表面反應，以形成疊氮基呈現共價功能化區。替代地，僅孔盤之選定孔可反應以具有疊氮基呈現共價功能化區，其在孔內部之所有表面上延伸，包括底部及側壁。在又一變化形式中，僅孔盤之一或多個孔之底表面可反應以在孔盤之一或多個孔之底部內具有疊氮基呈現共價功能化區。
此等表面中之任一者之疊氮基呈現共價功能化區之面積可為至少0.5 mm2 (例如，至少0.6 mm2 、至少0.7mm2 、至少0.8 mm2 、至少0.9 mm2 、至少1.0 mm2 、至少1.1 mm2 、至少1.2 mm2 、至少1.3 mm2 、至少1.4 mm2 、至少1.5 mm2 、至少1.6 mm2 、至少1.7 mm2 、至少1.8 mm2 、至少1.9 mm2 、至少2.0 mm2 、至少3.0 mm2 、至少4.0 mm2 、至少5.0 mm2 、至少6.0 mm2 、至少7.0 mm2 、至少8.0 mm2 、至少9.0 mm2 、至少10 mm2 、至少15 mm2 、至少20 mm2 、至少25 mm2 、至少30 mm2 、至少35 mm2 、至少40 mm2 、至少45 mm2 、至少50 mm2 、至少75 mm2 、至少100 mm2 、至少150 mm2 、至少200 mm2 、至少250 mm2 、至少300 mm2 、至少400 mm2 、至少500 mm2 、至少600 mm2 、至少700 mm2 、至少800 mm2 、至少900 mm2 、至少1000 mm2 )。此外，疊氮基呈現共價功能化區之密度為至少50個疊氮基/平方微米，例如約50個疊氮基/平方微米至約2 × 107 個疊氮基/平方微米、約1 × 102 個疊氮基/平方微米至約1 × 107 個疊氮基/平方微米；約50個疊氮基/平方微米至約5 × 106 個疊氮基/平方微米；約1 × 102 個疊氮基/平方微米至約1 × 106 個疊氮基/平方微米；約1 × 102 個疊氮基/平方微米至約5 × 105 個疊氮基/平方微米；約1 × 102 個疊氮基/平方微米至約1 × 105 個疊氮基/平方微米；約1 × 102 個疊氮基/平方微米至約5 × 104 個疊氮基/平方微米；約50個疊氮基/平方微米至約5 × 104 個疊氮基/平方微米；約1 × 102 個疊氮基/平方微米至約5 × 103 個疊氮基/平方微米；約50個疊氮基/平方微米至約5 × 102 個疊氮基/平方微米；或該等疊氮基數目/平方微米其間的任何值。
類似地，可將孔盤之表面的生物素呈現共價功能化區引入至孔盤之所有表面上方或孔盤之表面的選定及/或限制區域處。在一些實施例中，至少在孔盤之一或多個孔之表面上具有疊氮基呈現共價功能化區的孔盤在一或多個孔之至少一個表面內具有生物素呈現共價功能化區。特定言之，藉由僅將生物素連接之點擊試劑107添加至孔之底部的期望部分內之區域中，類似於區域120之生物素呈現共價功能化區可形成於孔盤之一或多個孔的底部之一部分上，其中底表面相對於孔盤中之孔之頂部處的開口安置。在一些實施例中，生物素呈現共價功能化區並不位於形成孔之殼體的側壁上，其中側壁鄰接孔盤中之孔的開口。在一些實施例中，此可為炔點擊試劑而非DBCO點擊試劑，且銅催化點擊反應經執行以獲得區域之選定邊界。
孔盤之表面的生物素呈現共價功能化區之面積可為至少0.5 mm2 (例如，至少0.6 mm2 、至少0.7 mm2 、至少0.8 mm2 、至少0.9 mm2 、至少1.0 mm2 、至少1.1 mm2 、至少1.2 mm2 、至少1.3 mm2 、至少1.4 mm2 、至少1.5 mm2 、至少1.6 mm2 、至少1.7 mm2 、至少1.8 mm2 、至少1.9 mm2 、至少2.0 mm2 、至少3.0 mm2 、至少4.0 mm2 、至少5.0 mm2 、至少6.0 mm2 、至少7.0 mm2 、至少8.0 mm2 、至少9.0 mm2 、至少10 mm2 、至少15 mm2 、至少20 mm2 、至少25 mm2 、至少30 mm2 、至少35 mm2 、至少40 mm2 、至少45 mm2 、至少50 mm2 、至少75 mm2 、至少100 mm2 、至少150 mm2 、至少200 mm2 、至少250 mm2 、至少300 mm2 、至少400 mm2 、至少500 mm2 、至少600 mm2 、至少700 mm2 、至少800 mm2 、至少900 mm2 、至少1000 mm2 )。生物素呈現共價功能化區之面積可小於約25%、小於約15%、小於約10%、小於約5%、或小於約2%之孔盤之一或多個孔中之每一者的底部面積。替代地，此關係可規定為生物素呈現共價功能化區之面積具有小於約35mm2 、約20 mm2 、約12 mm2 、約5 mm2 、小於約2 mm2 、小於約1 mm2 或小於約0.5 mm2 之面積。生物素呈現共價功能化區可具有0.5至2.0 mm (例如，約1 mm)之尺寸。生物素呈現共價功能化區可具有任何所需形狀：圓形、橢圓形、不規則型、矩形、正方形或多邊形。在一些實施例中，生物素呈現共價功能化區可為實質上圓形且具有0.5至2.0 mm (例如，約1 mm)之直徑。
此外，孔盤之表面可包括複數個生物素呈現共價功能化區。另外，可將含生物素之試劑偶合至孔盤之一或多個孔之表面的反應性部分，其中該複數個生物素呈現共價功能化區可聚集在孔盤之孔的底部上。複數個生物素呈現共價功能化區中之每一者的面積可小於約5%之一或多個孔之底部面積。複數個生物素呈現共價功能化區之總面積可小於約50%或約25%之至少一個孔之底部面積。
一或多個生物素呈現共價功能化區之密度可為至少50個生物素官能基/平方微米(例如，約50個生物素基團/平方微米至約5 × 106 個生物素基團/平方微米、約1 × 102 個生物素基團/平方微米至約1 × 106 個生物素基團/平方微米；約1 × 102 個生物素基團/平方微米至約5 × 105 個生物素基團/平方微米；約1 × 102 個生物素基團/平方微米至約1 × 105 個生物素基團/平方微米；約1 × 102 個生物素基團/平方微米至約5 × 104 個生物素基團/平方微米；約1 × 102 個生物素基團/平方微米至約1 × 104 個生物素基團/平方微米；約1 × 102 個生物素基團/平方微米至約5 × 103 個生物素基團/平方微米；約1 × 102 個生物素基團/平方微米至約1 × 103 個生物素基團/平方微米；約50個生物素基團/平方微米至約5 × 102 個生物素基團/平方微米；約50個生物素基團/平方微米至約1 × 102 個生物素基團/平方微米；或該等生物素基團數目/平方微米其間的任何值)。
孔盤之表面的抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區可類似地形成於選定區，無論經由點擊或銅介導的點擊反應直接地偶合至如對於圖1C之區域155所展示疊氮基部分；或經由結合至如對於圖1A及1B之區域125、140、150所展示之生物素呈現共價功能化區的生物素部分偶合。在任何情況下，抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區可形成於孔盤之一或多個孔內之表面上。另外，抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區可形成於孔之底部的僅期望部分之表面上，其中底表面相對於孔盤中之孔之頂部處的開口安置。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區並不位於形成孔之殼體的側壁上，其中側壁鄰接於孔盤中之孔的開口。
抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之面積可為至少0.5 mm2 (例如，至少0.6 mm2 、至少0.7 mm2 、至少0.8 mm2 、至少0.9 mm2 、至少1.0 mm2 、至少1.1 mm2 、至少1.2 mm2 、至少1.3 mm2 、至少1.4 mm2 、至少1.5 mm2 、至少1.6 mm2 、至少1.7 mm2 、至少1.8 mm2 、至少1.9 mm2 、至少2.0 mm2 、至少3.0 mm2 、至少4.0 mm2 、至少5.0 mm2 、至少6.0 mm2 、至少7.0 mm2 、至少8.0 mm2 、至少9.0 mm2 、至少10 mm2 、至少15 mm2 、至少20 mm2 、至少25 mm2 、至少30 mm2 、至少35 mm2 、至少40 mm2 、至少45 mm2 、至少50 mm2 、至少75 mm2 、至少100 mm2 、至少150 mm2 、至少200 mm2 、至少250 mm2 、至少300 mm2 、至少400 mm2 、至少500 mm2 、至少600 mm2 、至少700 mm2 、至少800 mm2 、至少900 mm2 、至少1000 mm2 )。抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之密度可為至少50個抗生蛋白鏈菌素官能基/平方微米(例如，約50個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約8 × 105 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米、約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約8 × 105 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約50個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約5 × 105 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約1 × 105 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約50個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約5 × 104 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約1 × 104 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約5 × 103 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約1 × 103 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約50個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約5 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約50個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；或該等抗生蛋白鏈菌素基團數目/平方微米其間的任何值)。
抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之面積可小於約50%之一或多個孔中之每一者之底表面面積。抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區的面積可小於約25%、小於約15%、小於約10%、小於約5%、或小於約2%之一或多個孔中之每一者之底部面積。替代地，此關係可規定為抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之面積可具有小於約35 mm2 、約20 mm2 、約12 mm2 、約5 mm2 、小於約2 mm2 或小於約1 mm2 之面積。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區可具有0.5至2.0 mm (例如，約1 mm)之尺寸。
抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區可具有任何所需形狀：圓形、橢圓形、不規則型、矩形、正方形或多邊形。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區可為實質上圓形且具有0.5至2.0 mm (例如，約1 mm)之直徑。在一些實施例中，一或多個抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區可為實質上圓形且可具有0.5至2.0 mm (例如，約1 mm)之直徑。
此外，孔盤之表面可包括複數個抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區。另外，含有抗生蛋白鏈菌素之試劑可偶合至孔盤之一或多個孔之表面的反應性部分或抗生蛋白鏈菌素可結合至表面之生物素呈現共價功能化區的生物素部分，其中複數個抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區可聚集於孔盤之孔的底部上。複數個抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區中之每一者的面積可小於約5%之一或多個孔之底部面積。複數個抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之總面積可小於約50%或約25%之至少一個孔之底部面積。
表面阻斷修飾區域 . 在一些實施例中，孔盤或一或多個孔中之每一者之表面進一步包含另一(例如，第二)共價修飾區，該共價修飾區包含表面阻斷配位體。如圖1D中所展示，表面160具有類似於區域125之含有抗生蛋白鏈菌素配位體113之抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區165，經由藉由生物素基配位體109'，繼之以結合於生物素部分之抗生蛋白鏈菌素進行初始共價功能化。包圍抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區165之第二區域167可藉由使反應性部分(在此情況下，疊氮基呈現配位體105的疊氮基部分)與表面阻斷DBCO試劑121反應而經進一步修飾具有表面阻斷配位體。表面阻斷配位體可具有如本文所述之任何表面阻斷部分(例如，含有親水性或帶負電荷部分及/或聚乙二醇(PEG)部分)。所得表面170具有由第二區域177包圍之抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區175，該第二區域具有含表面阻斷配位體123之經修飾表面177。表面阻斷配位體可為單一類型之表面阻斷配位體或可為表面阻斷配位體之混合物。表面阻斷配位體123之類型/混合物之選擇可為淋巴球細胞培養提供優化支持。儘管圖1D中說明具有抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區165之表面160，但具有共價功能化區120、125、135、140、145、150、155之類似表面可具有含呈現配位體(例如疊氮基呈現配位體105)之反應性部分的類似包圍第二區域，且可經類似修飾以將表面阻斷配位體123引入於各別包圍第二區域中。在一些實施例中，表面修飾區域(諸如區域177)並不重疊生物素呈現共價功能化區120、135、145或抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區125、135、145、155。
在一些實施例中，第二共價修飾區可進一步包括提供部分刺激黏附性之至少一種配位體。舉例而言，可將附著至DBCO點擊偶合劑之肽序列引入至區域177中。肽序列可包括RGD (Arg-Gly-Asp)基元，其可藉由提供機械黏附性而在培養期間刺激淋巴球。任何其他黏附性刺激部分可經調適且類似地引入。可在引入抗生蛋白鏈菌素呈現區165後且在引入形成表面阻斷區177之表面阻斷配位體123之前、同時或之後引入黏附性刺激部分。
具有包括淋巴球活化共價功能化區之表面之孔盤 . 如上文所提及，申請人已發現使用孔盤之活化表面(其中活化限於表面之區域)提供更可控且更高效的淋巴球活化。淋巴球可為任何適合之淋巴球，包括(但不限於) T細胞、自然殺手T (NKT)細胞或B細胞。如圖1D中所展示，活化部分可經引入且結合至表面之抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區。關於表面170展示活化部分之引入，但本發明不限於此。併入共價功能化區(類似於區域125、140、150、155)之任何表面可具有經引入活化部分，以形成淋巴球活化共價功能化區，類似於表面180之區域185。在一些實施例中，阻斷配位體修飾區177及淋巴球活化共價功能化區185覆蓋孔盤之整個表面。在一些實施例中，阻斷配位體修飾區177及淋巴球活化共價功能化區185為表面之非重疊區域。可將淋巴球活化共價功能化區185引入至孔盤之一或多個孔中之每一者內的表面上。在一些變化形式中，可將淋巴球活化共價功能化區185引入一或多個孔中之每一者的底表面上。在一些實施例中，淋巴球活化共價功能化區僅安置在對應孔之底表面上。淋巴球活化共價功能化區可具有小於約50%之一或多個孔之底部面積的面積。淋巴球活化共價功能化區之面積小於約50%、小於約25%、小於約15%、小於約10%、小於約5%、小於約2%或小於約1%之一或多個孔之底部面積。淋巴球活化共價功能化區之面積具有小於約35 mm2 、約20 mm2 、約12 mm2 、約5 mm2 、小於約2 mm2 或小於約1mm2 之面積。在一些實施例中，淋巴球活化共價功能化區之尺寸為1 mm。淋巴球活化共價功能化區可具有任何所需形狀：圓形、橢圓形、不規則型、矩形、正方形或多邊形。在一些實施例中，淋巴球活化共價功能化區可為實質上圓形且具有0.5至2.0 mm (例如，約1 mm)之直徑。在一些實施例中，一或多個淋巴球活化共價功能化區可為實質上圓形且可具有0.5至2.0 mm (例如，約1 mm)之直徑。
在一些變化形式中，活化分子131各自包含活化部分(例如分子131之「P」)及結合部分(諸如生物素)，該結合部分可結合抗生蛋白鏈菌素之結合位點且形成淋巴球活化共價功能化區185。結合的第一活化分子複合體137可稱為特異性結合的活化分子配位體。在一些變化形式中，可能存在僅一個種類之活化分子。在其他變化形式中，可能存在第一活化分子131 (其可為初始活化分子)以及其他類型之活化分子133。活化分子133可為額外活化分子、共活化分子、輔助活化分子或二級活化分子。第一活化分子與第二活化分子之比率可為用於活化淋巴球之任何適合之比率，諸如10:1；8:1；6:1；5:1；3:1；2:1；1:1；1:2；1:3；1:5；1:6；1:8；1:10或更多。
在一些變化形式中，第一活化分子131可為(但不限於)分化結合分子之細胞表面團簇、免疫球蛋白結合分子、T細胞受體分子活化分子、TNF受體超家族結合分子、趨化因子受體結合分子、生長因子分子或黏附促進分子。在一些變化形式中，第一活化分子可包括MHC分子(例如，I類或II類)、保留分化結合活性之細胞表面團簇的蛋白質或其片段、保留T細胞受體結合活性之蛋白質或其片段、保留TNF受體超家族結合活性之蛋白質或其片段、保留趨化因子受體結合活性之蛋白質或其片段、保留生長刺激性活性之蛋白質或其片段或保留黏附促進活性之蛋白質或其片段。蛋白質可為抗體或其片段，其可保留對於特定目標之結合活性。
在淋巴球活化共價功能化區中，特異性結合的第一活化分子配位體之密度可為至少約1 × 102 個分子/平方微米、約5 × 102 個分子/平方微米、約1 × 103 個分子/平方微米、約5 × 103 個分子/平方微米、約1 × 104 個分子/平方微米、約5 × 104 個分子/平方微米、約1 × 105 個分子/平方微米或約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米。
在一些變化形式中，第二活化分子133各自包括活化部分(例如「S」)及結合部分，其中結合部分結合抗生蛋白鏈菌素之結合位點；可經引入至淋巴球活化區185中，在淋巴球活化共價功能化區185中提供特異性結合的第二活化分子配位體139。除其他以外，複數個第二活化分子可包括(但不限於) T細胞受體(TCR)共活化分子、細胞表面免疫球蛋白結合分子、生長因子分子、黏附促進分子。第二活化分子133可為一個種類之第二活化分子或第二活化分子133可為超過一種不同分子之混合物，其可以視為適用於活化淋巴球之任何比率使用。
在一些變化形式中，在淋巴球活化共價功能化區中，特異性結合的第二活化分子配位體139之密度可為約1 × 102 個分子/平方微米、約5 × 102 個分子/平方微米、約1 × 103 個分子/平方微米、約5 × 103 個分子/平方微米、約1 × 104 個分子/平方微米、約5 × 104 個分子/平方微米、約1 × 105 個分子/平方微米、約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米或約1 × 103 至約1× 105 個分子/平方微米。
在一些變化形式中，具有包括淋巴球活化區之表面的孔盤可在一或多個孔中之每一者中具有複數個淋巴球活化共價功能化區。複數個淋巴球活化共價功能化區中之每一者之面積可小於約5%之一或多個孔之底部面積。在一些實施例中，複數個淋巴球活化共價功能化區之總面積小於約50%、約25%或約10%之一或多個孔之底部面積。
分子配位體 . 任何適合之淋巴球活化配位體可包括於本文中描述的孔盤之表面的淋巴球活化區中。活化配位體可為分化結合分子之細胞表面團簇、T細胞受體分子活化分子、TNF受體超家族結合分子、趨化因子受體結合分子、生長因子分子或黏附促進分子。此等分子之一些非限制性實例包括CD2、CD3、CD19、CD20、CD27、CD28、CD30、CD40、CD48、CD58、CD70、CD83、CD137、CD122、CD155、CD226結合分子及其類似物。此等結合分子可包括其重組配位體。特定言之，CD2、CD28結合分子可能適用於活化抗原特異性T細胞。CD3、CD137或CD40配位體可能適用於T細胞之活化擴增。CD19及CD20結合分子可能適用於活化嵌合抗原受體(CAR) T細胞。活化分子可為此等分子之促效抗體，諸如抗CD2、抗CD3、抗CD27、抗CD28、抗CD30、抗CD40、抗CD58、抗CD48、抗CD122、抗CD137及其類似物。
趨化因子受體配位體可用於活化淋巴球，諸如屬於CCL家族之淋巴球，諸如CCL21或CCL19。可誘導T細胞共刺激分子為免疫檢查點蛋白且CD278或ICOS (可誘導T細胞共刺激分子)結合分子或促效劑抗體可用於本文中描述之活化呈現區中。A型肝炎病毒細胞受體1 (HAVcr-1)亦稱為T細胞免疫球蛋白且黏蛋白結構域1 (TIM-1)為在人體內由HAVCR1 基因編碼之蛋白質。抗TIM1或TIM4配位體可用於活化T細胞。
亦稱為TNFRSF25之淋巴球相關死亡受體(LARD)之DR3屬於TNF受體超家族(TNFRSF)。其結合分子或其促效抗體可用於活化T細胞及NKT細胞。
信號傳導淋巴球活化分子(SLAM)家族成員1 (亦稱為CD150)為表現於T細胞、B細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞上之自配位體細胞表面糖蛋白。CD150在T細胞與抗原呈現細胞(APC)之間的黏附性及信號傳導中發揮至關重要的作用。CD150為稱為SLAM家族之造血幹細胞上之糖蛋白受體的生長家族之原型成員，其包括CD229、CD84、CD244、SF2000/Ly108、SF2001及19A(CRACC)。促效抗體可用於活化淋巴球，特別係T細胞及B細胞。
GITR(糖皮質激素誘發TNFR家族相關基因)為TNFR超家族(TNFRSF)之成員。抗GITR或GITR配位體可用於活化T細胞。OX40 (CD134)及其結合配偶體OX40L (CD252)為TNFR/TNF超家族之成員且表現於活化CD4及CD8 T細胞以及大量其他淋巴及非淋巴細胞上。OX40及OX40L亦調節來自T細胞、抗原呈現細胞、NK細胞及NKT細胞之細胞介素產生，且調節細胞介素受體信號傳導，且其抗體或配位體可用於活化T細胞或NK細胞。
CD137為腫瘤壞死因子(TNF)受體家族之成員。其替代名稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員9 (TNFRSF9)、4-1BB且由淋巴球活化(ILA)誘發。抗41BB或41BB-L可用於活化區域中以活化淋巴球。亦稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員14 (TNFRSF14)之疱疹病毒侵入介體(HVEM)為TNF受體超家族之人類細胞表面受體。
諸如IL7及/或IL15之細胞介素可引入淋巴球活化區內或可引入包圍淋巴球活化區之經修飾表面內。
為擴增NK細胞或NK CAR細胞，可將自然殺手受體結合分子(諸如NKG2D配位體)引入淋巴球活化區內。
如上文所提及，可使用免疫球蛋白結合分子，諸如MHC分子。MHC可為I類MHC。在一些其他實施例中，MHC可為II類MHC，以活化T細胞之不同次型。
亦如上文所提及，可使用生長因子配位體或黏附促進配位體。
具有抗原呈現共價功能化區之孔盤 . 在一些變化形式中，具有淋巴球活化共價功能化區之孔盤可為用於活化T細胞(T細胞)之孔盤之抗原呈現共價功能化區，且可具有含淋巴球活化共價功能化區或如上文所描述之區域的孔盤之特徵中之任一者。亦即，孔板之一或多個孔中之每一者可具有含抗原呈現共價功能化區之表面。一或多個孔中之每一者之抗原呈現共價功能化區可位於對應孔之底表面上。另外，一或多個孔中之每一者之抗原呈現共價功能化區可僅經安置在一或多個孔之底表面上。在一些實施例中，抗原呈現共價功能化區可能未安置於一或多個孔之側壁上。在一些實施例中，孔盤之一或多個孔中之每一者可具有僅安置在一或多個孔之底表面上的複數個抗原呈現共價功能化區。
抗原呈現共價功能化區可包括特異性結合的初始活化分子配位體137 (「第一活化分子配位體)且特定言之結合的共活化分子配位體139 (「第二活化分子配位體)，其中初始活化分子131中之每一者具有初始活化部分(「P)及可結合於抗生蛋白鏈菌素呈現功能化區125、140、150、155、170之抗生蛋白鏈菌素之結合位點的結合部分(例如，生物素)及其類似物。可以本文中描述之比率中之任一者，諸如約1:1至約2:1；約1:1；或約3:1至約1:3將初始活化分子配位體137及共活化分子配位體139安置於抗原呈現共價功能化區內。
在一些變化形式中，特異性結合的初始活化分子配位體137各自包含經組態以結合至T細胞之T細胞受體的主要組織相容複合體(MHC)分子。MHC分子可包括I類MHC蛋白序列、β微球蛋白蛋白序列及抗原肽。在一些變化形式中，可經由蛋白質序列之C端連接，例如藉由位點特異性生物素標記之C端BirA標籤將MHC分子之蛋白質序列連接至抗原呈現合成表面。
在抗原呈現共價功能化區(類似於185)中，特異性結合的初始活化分子配位體137之密度可為至少約1 × 102 個分子/平方微米、約5 × 102 個分子/平方微米、約1 × 103 個分子/平方微米、約5 × 103 個分子/平方微米、約1 × 104 個分子/平方微米、約5 × 104 個分子/平方微米、約1 × 105 個分子/平方微米或約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米。
如可藉由熟習技術者測定，包括MHC分子之初始活化分子可進一步包括腫瘤相關抗原肽，其可為任何適合之腫瘤相關抗原肽。腫瘤相關抗原肽可與初始活化分子配位體(例如MHC分子)非共價關聯。腫瘤相關抗原肽可藉由初始活化分子配位體(例如，MHC分子)在可引發T淋巴球活化之定向上呈現。腫瘤相關抗原可為肽。
腫瘤相關抗原之一些非限制性實例包括黑色素瘤的MART1 (肽序列ELAGIGILTV)、涉及黑色素瘤及一些癌瘤的NYES01 (肽序列SLL WITQV)、SLC45A2、TCL1及VCX3A，但本發明不限於此。腫瘤抗原之額外實例包括包含來自表現於腫瘤細胞之表面上的蛋白質之胺基酸序列區段之肽，諸如CD19、CD20、CLL-1、TRP-2、LAGE-1、HER2、EphA2、FOLR1、MAGE-A1、間皮素、SOX2、PSM、CA125、T抗原等。肽可能來自腫瘤相關抗原之胞外域，若抗原以高於衍生腫瘤細胞之健康細胞類型上之含量表現於腫瘤細胞上，則該抗原被視為腫瘤相關的，識別此腫瘤相關抗原之T細胞為特異性T細胞，任何腫瘤相關抗原可用於本文中描述之抗原呈現表面中，在一些實施例中，腫瘤相關抗原為新抗原肽，例如由腫瘤細胞中之突變體基因編碼。關於新抗原肽之詳細論述，參見例如US2011/0293637。在一些實施例中，腫瘤相關抗原可為SLC45A2、TCL1、VCX3A、MART1或NYESO1。
在其他變化形式中，抗原肽可為病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原或原蟲抗原。
特異性結合的共活化分子配位體133 (例如，第二活化分子配位體)可各自包括T細胞受體(TCR)共活化部分(「S」)；或輔助TCR活化部分(「S」)。複數個共活化分子配位體之TCR共活化分子與輔助TCR活化分子之比率可為約100:1至約1:100。在一些實施例中，複數個共活化分子配位體之TCR共活化分子與輔助TCR活化分子之比率可為100:1至90:1、90:1至80:1、80:1至70:1、70:1至60:1、60:1至50:1、50:1至40:1、40:1至30:1、30:1至20:1、20:1至10:1、10:1至1:1、3:1至1:3；1:1至1:10、1:10至1:20、1:20至1:30、1:30至1:40、1:40至1:50、1:50至1:60、1:60至1:70、1:70至1:80、1:80至1:90或1:90至1:100，其中前述值中之每一者由「約」修飾。在一些實施例中，複數個共活化分子配位體之TCR共活化分子與輔助TCR活化分子之比率可為約20:1至約1:20或約3:1至約1:3。
在一些實施例中，TCR共活化分子可包括CD28結合蛋白或其片段，該片段保留對於CD28之結合能力。CD28結合蛋白或其片段可進一步包括位點特異性C端生物素部分。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)共活化分子可包括CD80分子或其片段，其中該片段保留對於CD28之結合活性。在一些其他實施例中，T細胞受體(TCR)共活化分子可包括抗CD28抗體或其片段。
在一些變化形式中，輔助TCR活化分子可包括CD2結合蛋白或其片段，其中該片段保留對於CD2之結合活性。CD2結合蛋白或其片段可進一步包括位點特異性C端生物素部分。在其他變化形式中，輔助TCR活化分子可包括CD58分子或其片段，其中該片段保留與CD2之結合活性。在一些實施例中，輔助TCR活化分子可包括抗CD2抗體或其片段。在抗原呈現共價功能化區中之抗原呈現合成表面上，特異性結合的共活化分子配位體之密度可為至少約1 × 102 個分子/平方微米、約5 × 102 個分子/平方微米、約1 × 103 個分子/平方微米、約5 × 103 個分子/平方微米、約1 × 104 個分子/平方微米、約5 × 104 個分子/平方微米、約1 × 105 個分子/平方微米或約1 × 103 至約1 × 105 個分子/平方微米。
可裂解連接子 . 在一些實施例中，可裂解連接子可包括於連接活化配位體之連接子、共價連接之抗生蛋白鏈菌素、生物素或疊氮基部分中。可裂解連接子可包括二硫化物部分或可包括諸如經取代硝苄基連接子之可光裂解部分，該可光裂解部分可由約365 nm之UV光輻射裂解。此等連接子可用於在所需使用階段後移除表面結合配位體或可用於需要遮罩或光遮罩之方法中，該等方法用於將期望分子配位體位點選擇性引入僅未如此遮蔽/光遮蔽之區域中。位點選擇性引入分子配位體後，遮蔽配位體可在存在硫醇(二硫化物)的情況下在鹼性條件下或藉由光裂解自表面釋出。
表面阻斷劑及由其形成的配位體 . 用於本文中描述之表面的表面阻斷劑可具有兩種類型。第一類型包括表面阻斷劑，諸如圖1A之表面阻斷劑117，其可具有經組態以與經清潔/製備表面110之剩餘反應性部分反應的反應性部分，諸如天然存在或藉由清潔或其他氧化步驟引入之氧化物官能基。表面阻斷劑117包括一個經組態以與表面暴露部分(例如氧化物)反應之反應性官能基(諸如三烷氧基矽氧烷)，且不含有將與含生物素之試劑、抗生蛋白鏈菌素或含抗生蛋白鏈菌素之試劑中之任一者反應(例如干擾)之其他官能基。
第二類別之表面阻斷劑可類似於表面阻斷DBCO試劑121，其經組態以與初始功能化表面115之反應性官能基(諸如疊氮化物或炔烴)反應。因此，第二類別之表面阻斷試劑具有一個經組態以與如圖1A及1B中所展示之配位體105反應的反應性部分，諸如炔(包括環狀應變炔烴，諸如DBCO)。
無論表面阻斷劑為何種類別，表面阻斷劑之反應性部分具有連接部分，其可為附著至反應性部分之環氧烷、烷基或經取代環氧烷或烷基線性部分。視情況，連接部分具有線性結構。
在與表面反應後將保持未結合的表面阻斷劑之終端部分可為親水性部分、兩親媒性部分、兩性離子部分或帶負電荷部分。在一些實施例中，封端基團包含終端羥基。在一些實施例中，封端基團包含終端羧基，在一些實施例中，封端基團包含終端兩性離子基團。複數個表面阻斷配位體可具有全部相同的終端表面阻斷基團或可具有終端表面封端基團之混合物，在不受理論束縛之情況下，表面阻斷配位體之終端表面封端基團以及親水性連接子可與水分子相互作用。在液態培養基中，包圍經修飾表面以產生總體更高親水性表面。此增強的親水性質可以使經修飾表面與生物學微物體之間的接觸呈現更高相容性且更類似於天然細胞間相互作用及/或活體內細胞-胞外流體環境。
表面阻斷劑/配位體之連接部分可包含例如聚合物。聚合物可以包括含有伸烷基醚部分的聚合物。多種含伸烷基醚聚合物可適用於本文中描述之表面上。一種類別之含伸烷基醚聚合物為聚乙二醇(PEG Mw ＜100,000Da)，其在此項技術中已知為生物相容性的，在一些實施例中，PEG可具有約88Da、100Da、132Da、176Da、200Da、220Da、264Da、308Da、3520a、396Da、440Da、500Da、600Da、700Da、800Da、900Da、1000Da、1500Da、2000Da、5000Da、10,000Da或20,000Da之Mw，或可具有屬於由前述值中之任兩者限定的範圍內之Mw，在一些實施例中，PEG聚合物具有約3、4、5、10、15、25個單位或其間的任何值之聚乙烯部分重複。在一些實施例中，PEG可為經羧基取代之PEG部分。在一些實施例中，PEG為經羥基取代之PEG部分，在一些實施例中，複數個表面阻斷配位體中之每一者可具有連接部分，該連接部分之長度與該複數個表面阻斷配位體中之其他配位體之連接部分的長度相同。在其他實施例中，複數個表面封端配位體之連接部分可具有不同的長度。在一些實施例中，對於複數個表面阻斷配位體中之每一者而言，表面阻斷基團及連接部分之長度可為相同的。
替代地，表面阻斷基團及連接部分之長度可在複數個表面阻斷配位體內變化且可包括2個、3個或4個不同表面封端基團及/或2個、3個、4個或更多不同長度，在任何組合中選擇，大體而言，表面阻斷配位體具有足夠短以免空間位阻活化配位體之結合及/或功能的長度及/或結構。舉例而言，在一些實施例中，表面阻斷配位體之長度等於或小於結合至表面之其他連接子(例如，連接偶合基團或活化配位體之連接子)之長度，在一些實施例中，表面阻斷配位體之長度小於結合至表面之其他連接子(例如，連接活化配位體/分子之連接子)之長度約1或更大埃(例如，約2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100或更大埃)。在一些實施例中，表面阻斷配位體之長度小於結合至表面之其他連接部分之長度約1至約100埃(例如，約2至約75、約3至約50、約4至約40或約5至約30埃)。當表面阻斷配位體具有與結合至表面之其他連接部分之長度相同或略小之連接部分長度時，所得表面可在孔盤之孔內提供更高生物相容性表面，或可防止生物學微物體之非所需附著，進而預防非所需附著或生物積垢，同時為活化分子結合至該表面提供完全通路。
在一些變化形式中，表面阻斷劑117或121可具有環氧烷、烷基或經取代環氧烷或附著至三烷氧基矽氧烷之烷基部分。環氧烷、烷基或經取代環氧烷或烷基部分可為線性部分且可具有至少4個原子、至少8個原子、至少12個原子、至少16個原子、至少20個原子、至少50個原子或至少100個原子或更多之線性主鏈長度，該等原子可為碳、氧、氮或硫。製備方法
孔盤之表面的反應性部分呈現區 . 製備包括具有反應性部分(例如，疊氮基呈現或炔基呈現)共價功能化區之表面的孔盤包括使孔盤表面的一部分之表面暴露部分(例如，氧化物部分)與含疊氮基偶合劑接觸；且形成孔盤之反應性部分呈現共價功能化區。孔盤之表面包含以下、由以下組成或基本由以下組成：玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、環烯共聚物或三聚氰胺。可在使表面之部分的表面暴露部分與含疊氮基偶合劑接觸之前執行電漿清潔孔盤之表面。在偶合反應期間，含反應性部分之偶合劑可在氣相中或在液相中接觸表面暴露部分。含反應性部分之偶合劑可包括具有碳主鏈為5個至9個碳之連接子。在一些實施例中，連接子可具有7個碳之碳主鏈。
反應性部分呈現(例如，疊氮基呈現)共價功能化區之密度可為至少50個疊氮基/平方微米(例如，約50個疊氮基/平方微米至約2 × 107 個疊氮基/平方微米、約1 × 102 個疊氮基/平方微米至約1 × 107 個疊氮基/平方微米；約50個疊氮基/平方微米至約5 × 106 個疊氮基/平方微米；約1 × 102 個疊氮基/平方微米至約1 × 106 個疊氮基/平方微米；約1 × 102 個疊氮基/平方微米至約5 × 105 個疊氮基/平方微米；約1 × 102 個疊氮基/平方微米至約1 × 105 個疊氮基/平方微米；約1 × 102 個疊氮基/平方微米至約5 × 104 個疊氮基/平方微米；約50個疊氮基/平方微米至約5 × 104 個疊氮基/平方微米；約1 × 102 個疊氮基/平方微米至約5 × 103 個疊氮基/平方微米；約50個疊氮基/平方微米至約5 × 102 個疊氮基/平方微米；或該等疊氮基數目/平方微米其間的任何值)。
接觸表面可包括使孔盤之一或多個孔中之每一者的表面與含反應性部分(例如，含疊氮基)之偶合劑接觸，在該一或多個孔中之每一者中形成具有反應性部分呈現共價功能化區之表面。接觸可包括使對應孔之底表面與含反應性部分之偶合劑接觸，進而在一或多個孔中之每一者的底表面上形成反應性部分呈現共價功能化區。在其他實施例中，可接觸孔盤之所有表面，且反應性部分呈現區可延伸至孔盤之所有表面。
在一些實施例中，接觸一或多個孔中之每一者的底表面可包括僅接觸底表面，進而僅在一或多個孔中之每一者的底表面上形成反應性部分(例如，疊氮基)呈現共價功能化區。
製備孔盤之表面的生物素呈現共價功能化區 .製備包含具有生物素呈現共價功能化區之表面的孔盤包括使孔盤之表面的一部分與包括連接至反應性基團之生物素部分的試劑接觸，其中反應性基團經組態以與表面之反應性(例如，疊氮基或炔基)部分反應，進而形成孔盤之生物素呈現功能化區。方法可進一步包括使孔盤之表面與包括連接至反應性基團之表面阻斷配位體的試劑接觸，其中反應性基團經組態以與表面之反應性(例如，疊氮基或炔基)部分反應，進而提供表面之阻斷配位體修飾區。阻斷配位體修飾區及生物素呈現區可覆蓋整個表面。在一些變化形式中，阻斷配位體修飾區及生物素呈現區可為表面之非重疊區域。
使孔盤之表面的部分與具有連接至反應性基團之生物素部分的試劑接觸可包括接觸孔盤之一或多個孔中之每一者內的表面。接觸一或多個孔中之每一者可進一步包括使對應孔之底表面處之一或多個孔中之每一者與包括連接至反應性基團之生物素部分的試劑接觸，進而在對應孔之底表面上產生生物素呈現共價功能化區。在一些實施例中，反應性部分(例如，疊氮基部分)經安置於孔盤之一或多個孔內，且視情況可僅安置於一或多個孔內。
在一些實施例中，生物素呈現共價功能化區可僅形成於對應孔之底表面上。生物素呈現共價功能化區之密度可為至少50個生物素官能基/平方微米(例如，約50個生物素基團/平方微米至約5 × 106 個生物素基團/平方微米、約1 × 102 個生物素基團/平方微米至約1 × 106 個生物素基團/平方微米；約1 × 102 個生物素基團/平方微米至約5 × 105 個生物素基團/平方微米；約1 × 102 個生物素基團/平方微米至約1 × 105 個生物素基團/平方微米；約1 × 102 個生物素基團/平方微米至約5 × 104 個生物素基團/平方微米；約1 × 102 個生物素基團/平方微米至約1 × 104 個生物素基團/平方微米；約1 × 102 個生物素基團/平方微米至約5 × 103 個生物素基團/平方微米；約1 × 102 個生物素基團/平方微米至約1 × 103 個生物素基團/平方微米；約50個生物素基團/平方微米至約5 × 102 個生物素基團/平方微米；約50個生物素基團/平方微米至約1 × 102 個生物素基團/平方微米；或該等生物素基團數目/平方微米其間的任何值)。
生物素呈現共價功能化區之面積可小於約50%之至少一個孔之底部面積。在一些實施例中，生物素呈現共價功能化區之面積可小於約25%、小於約15%、小於約10%、小於約5%、小於約2%或小於約1%之至少一個孔的底部面積。生物素呈現共價功能化區之面積具有小於約35 mm2 、約20 mm2 、約12 mm2 、約5 mm2 、小於約2 mm2 或小於約1mm2 之面積。在一些實施例中，生物素呈現共價功能化區之尺寸可為1 mm。生物素呈現共價功能化區可為實質上圓形且可具有約1 mm之直徑。
方法可進一步包括使一或多個孔中之每一者之底部的複數個區域與含生物素試劑接觸以在一或多個孔中之每一者中產生複數個生物素呈現區。
在一些實施例中，包括連接至反應性基團之生物素部分的試劑可為銅依賴性點擊偶合劑。在含生物素之銅依賴性點擊偶合劑與反應性部分(例如，疊氮基部分)之反應後，可使孔盤之表面與含硫醇試劑或銅螯合劑接觸，以停止銅依賴性試劑之更進一步反應。在已停用銅依賴性點擊偶合劑後，隨後表面可經包含表面阻斷配位體之試劑處理以准許清晰地分開區域，如圖6A中所展示，其中經螢光標記之結合對標記之共價功能化區193、共價功能化區195及共價功能化區197展示精確控制試劑沈積於具有約1.0mm至多約3-4 mm之直徑的孔處(參見圖6B)。
表面阻斷配位體中之每一者可為如本文所述之任何表面阻斷配位體，且可使用任何適合之表面阻斷配位體之混合物。在一些實施例中，表面阻斷配位體可包括親水性或帶負電荷部分。在一些變化形式中，表面阻斷配位體可包括聚乙二醇(PEG)部分。
在一些實施例中，方法可進一步包括使一或多個孔中之每一者的一或多個表面與包含配位體之試劑接觸，該配位體經組態以提供黏附性刺激。此可典型地在引入生物素呈現區後執行。在各種實施例中，將提供黏附性刺激之配位體引入至生物素呈現區外部的表面之部分中。
製備孔盤之表面的抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區 . 一種製備包含具有抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之表面之孔盤的方法包括使孔盤之表面的一部分與包括連接至反應性基團之抗生蛋白鏈菌素官能基的試劑或包括連接至反應性基團之生物素部分的試劑接觸，其中反應性基團經組態以與表面之反應性部分(例如，疊氮基或炔基部分)反應，且當試劑包括連接至反應性基團之生物素部分時，接著使表面之部分與抗生蛋白鏈菌素接觸，進而形成孔盤之抗生蛋白鏈菌素呈現功能化區。該方法可進一步包括使孔盤之表面與包括連接至反應性基團之表面阻斷配位體的試劑接觸，其中反應性基團經組態以與表面之反應性部分(例如，疊氮基或炔基)反應，以形成表面之阻斷配位體修飾區。當使用包括連接至反應性基團之生物素部分的試劑時，引入抗生蛋白鏈菌素在引入生物素呈現表面之後，其中抗生蛋白鏈菌素結合於生物素部分。
在一些實施例中，阻斷配位體修飾區及抗生蛋白鏈菌素呈現區可覆蓋整個表面。在各種實施例中，阻斷配位體修飾區及抗生蛋白鏈菌素呈現區可為表面之非重疊區。孔盤之表面的部分與試劑接觸可進一步包括接觸孔盤之一或多個孔中之每一者內的表面。
在一些其他實施例中，接觸可包括使對應孔之底表面處之一或多個孔中之每一者與包括連接至反應性基團之抗生蛋白鏈菌素部分的試劑或與包括連接至反應性基團之生物素部分的試劑接觸。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區可僅形成於對應孔之底表面上。
抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之密度可為至少50個抗生蛋白鏈菌素官能基/平方微米，例如約50個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約8 × 105 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米、約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約8 × 105 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約50個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約5 × 105 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約1 × 105 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約50個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約5 × 104 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約1 × 104 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約5 × 103 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約1 × 103 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約50個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約5 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約50個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；或該等抗生蛋白鏈菌素基團數目/平方微米其間的任何值。
在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之面積可小於約50%之至少一個孔之底部面積。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之面積可小於約25%、小於約15%、小於約10%、小於約5%、小於約2%或小於約1%之至少一個孔的底部面積。抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之面積具有小於約35 mm2 、約20 mm2 、約12 mm2 、約5 mm2 、小於約2 mm2 或小於約1mm2 之面積。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之尺寸可為1 mm。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區可為實質上圓形且具有1 mm之直徑。
在一些實施例中，接觸可包括使一或多個孔中之每一者的底部之複數個區域與包含連接至反應性基團之抗生蛋白鏈菌素部分的試劑或與包含連接至反應性基團之生物素部分的試劑接觸(繼之以與抗生蛋白鏈菌素反應，以與剛引入之生物素部分結合)，以在一或多個孔中之每一者中產生複數個抗生蛋白鏈菌素呈現區。
在一些實施例中，包含連接至反應性基團之抗生蛋白鏈菌素部分的試劑或包含連接至反應性基團之生物素部分的試劑可為銅依賴性點擊偶合劑，且反應之後可使孔盤之表面與含硫醇試劑或銅螯合劑接觸以使任何銅依賴性點擊偶合劑失活。此可包括處理已執行銅依賴性點擊偶合反應之一或多個孔中之每一者。隨後，可執行引入表面阻斷配位體之反應，其包括使表面與包含表面阻斷配位體之試劑接觸。
表面阻斷配位體中之每一者可為如本文所述之任何表面阻斷配位體，且可使用任何適合之表面阻斷配位體之混合物。在一些實施例中，表面阻斷配位體可包括親水性或帶負電荷部分。在一些變化形式中，表面阻斷配位體可包括聚乙二醇(PEG)部分。
在一些實施例中，方法可進一步包括使一或多個孔中之每一者的一或多個表面與包含配位體之試劑接觸，該配位體經組態以提供黏附性刺激。此典型地在引入抗生蛋白鏈菌素呈現區之後執行。在各種實施例中，將提供黏附性刺激之配位體引入至抗生蛋白鏈菌素呈現區外部的表面之部分中。
製備孔盤之表面的抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區 . 製備包含具有抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之表面之孔盤的另一方法包括在表面上形成反應性部分呈現(例如，疊氮基或炔基)共價功能化表面，其中表面之反應性部分呈現共價修飾配位體進一步包含UV不穩定連接部分，但另外如上所述進行。隨後，表面與包括連接至反應性基團之抗生蛋白鏈菌素部分的試劑或包含連接至反應性基團之生物素部分的試劑接觸，其中反應性基團經組態以與反應性部分呈現表面之反應性部分反應，進而形成抗生蛋白鏈菌素呈現功能化區或生物素呈現功能化表面，且另外其中當試劑包含連接至反應性基團之生物素部分時，接著使孔盤之部分與抗生蛋白鏈菌素接觸。隨後表面經由遮罩而暴露於UV照明，該遮罩經組態以暴露表面之一部分外部的所有表面。此裂解抗生蛋白鏈菌素或生物素修飾表面配位體之UV不穩定連接子，任何位置抗生蛋白鏈菌素或生物素修飾表面配位體之UV不穩定連接子暴露於UV照明，進而形成孔盤之抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區。
在一些實施例中，形成反應性部分呈現共價修飾表面包括使含反應性部分(例如，疊氮基或炔基)之偶合劑與孔盤之表面的表面暴露(例如，氧化物)部分反應，其中含反應性部分之偶合劑額外包括UV不穩定連接部分。可在使表面之氧化物部分與含反應性部分之偶合劑接觸之前電漿清潔孔盤之表面。
使孔盤之表面與包括連接至反應性基團之抗生蛋白鏈菌素部分的試劑或包括生物素部分之試劑接觸可包括接觸孔盤之一或多個孔中之每一者內的表面。
一或多個孔中之每一者可在對應孔之底表面處與包括連接至反應性基團之抗生蛋白鏈菌素部分的試劑或與包括連接至反應性基團之生物素部分的試劑接觸，進而在對應孔之底表面上產生抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區可僅形成於對應孔之底表面上。抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之密度為至少50個抗生蛋白鏈菌素官能基/平方微米，例如約50個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約8 × 105 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米、約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約8 × 105 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約50個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約5 × 105 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約1 × 105 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約50個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約5 × 104 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約1 × 104 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約5 × 103 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約1 × 103 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約50個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約5 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；約50個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米至約1 × 102 個抗生蛋白鏈菌素基團/平方微米；或該等抗生蛋白鏈菌素基團數目/平方微米其間的任何值。
製備包含具有淋巴球活化共價功能化區之表面的孔盤 .製備孔盤之表面的淋巴球活化共價功能化區之方法包括使孔盤之抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區與各自包括結合部分之複數個初始活化分子接觸，其中初始活化分子之結合部分經組態以結合抗生蛋白鏈菌素之結合位點，進而提供淋巴球活化共價功能化區。方法可進一步包括使孔盤之表面與包括連接至反應性基團之表面阻斷配位體之試劑接觸，其中反應性基團經組態以與表面之反應性部分反應，產生表面之阻斷配位體修飾區。阻斷配位體修飾區及淋巴球活化共價功能化區可覆蓋整個表面。在一些實施例中，阻斷配位體修飾區及淋巴球活化共價功能化區可為表面之非重疊區域。
孔盤之一或多個孔中之每一者內的抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區表面可與複數個初始活化分子接觸。在一些實施例中，接觸一或多個孔中之每一者可進一步包括使對應孔之底表面處之一或多個孔中之每一者與複數個初始活化分子接觸，在對應孔之底表面上產生淋巴球活化共價功能化區。
在一些實施例中，淋巴球活化共價功能化區可僅形成於對應孔之底表面上。視情況，淋巴球活化共價功能化區可能不形成於一或多個孔之側壁上。
如此引入之淋巴球活化共價功能化區之面積可小於約50%之一或多個孔之底部面積。在一些實施例中，淋巴球活化共價功能化區之面積可小於約25%、小於約15%、小於約10%、小於約5%、小於約2%或小於約1%之一或多個孔之底部面積。
在一些實施例中，淋巴球活化共價功能化區之面積具有小於約35mm2 、約20 mm2 、約12 mm2 、約5 mm2 、小於約2 mm2 或小於約1mm2 之面積。淋巴球活化共價功能化區之尺寸可為1 mm。在各種實施例中，淋巴球活化共價功能化區可為實質上圓形且具有1 mm之直徑。
在一些實施例中，可藉由使各孔內之超過一個位置處的孔盤之抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區與初始活化分子接觸來引入一或多個孔中之每一者中之複數個淋巴球活化共價功能化區。複數個淋巴球活化共價功能化區中之每一者之面積可小於約5%之一或多個孔之底部面積。在一些實施例中，複數個淋巴球活化共價功能化區之總面積可小於約50%、約25%或約10%之一或多個孔之底部面積。
在一些實施例中，待活化之淋巴球可為T細胞、自然殺手T (NKT)細胞或B細胞。在各種實施例中，第一活化分子可為如本文所述的任何適合之活化分子。在一些實施例中，第一活化分子可為分化結合分子之細胞表面團簇、細胞表面免疫球蛋白結合分子、T細胞受體分子活化分子、TNF受體超家族結合分子、趨化因子受體結合分子、生長因子分子或黏附促進分子。在一些實施例中，複數個第一活化分子包含MHC分子、保留分化結合活性之細胞表面團簇的蛋白質或其片段、保留T細胞受體結合活性之蛋白質或其片段、保留TNF受體超家族結合活性之蛋白質或其片段、保留趨化因子受體結合活性之蛋白質或其片段、保留生長刺激性活性之蛋白質或其片段或保留黏附促進活性之蛋白質或其片段。在各種實施例中，複數個第一活化分子包含保留分化結合活性之細胞表面團簇的蛋白質或其片段、保留生長刺激性活性的蛋白質或其片段或保留黏附促進活性的蛋白質或其片段。
在淋巴球活化共價功能化區中，複數個特異性結合的第一活化分子配位體之密度可為至少約1 × 102 個分子/平方微米、約5 × 102 個分子/平方微米、約1 × 103 個分子/平方微米、約5 × 103 個分子/平方微米、約1 × 104 個分子/平方微米、約5 × 104 個分子/平方微米、約1 × 105 個分子/平方微米或約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米。
方法可進一步包括使孔盤之抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區與各自包括結合部分之複數個第二活化分子接觸，其中第二活化分子之結合部分經組態以結合抗生蛋白鏈菌素之結合位點，進而在淋巴球活化共價功能化區中提供複數個特異性結合的第二活化分子配位體。
第二活化分子可為T細胞受體(TCR)共活化分子、細胞表面免疫球蛋白結合分子、TNF受體超家族結合分子、趨化因子受體結合分子、生長因子分子或黏附促進分子。在淋巴球活化共價功能化區中，複數個特異性結合的共活化分子配位體之密度可為至少約1 × 102 個分子/平方微米、約5 × 102 個分子/平方微米、約1 × 103 個分子/平方微米、約5 × 103 個分子/平方微米、約1 × 104 個分子/平方微米、約5 × 104 個分子/平方微米、約1 × 105 個分子/平方微米或約1 × 103 至約1 × 105 個分子/平方微米。
方法可進一步包括使孔盤之表面與包括連接至反應性基團之表面阻斷配位體的試劑接觸，其中反應性基團經組態以與表面之反應性部分反應，進而提供表面之阻斷配位體修飾區。在一些實施例中，阻斷配位體修飾區及抗原呈現共價功能化區可覆蓋整個表面。在一些實施例中，阻斷配位體修飾區及淋巴球活化共價功能化區可為表面之非重疊區域。
表面阻斷配位體中之每一者可為如本文所述的任何適合之表面阻斷配位體。在一些實施例中，表面阻斷配位體可包括親水性或帶負電荷部分。在一些實施例中，表面阻斷配位體可包括聚乙二醇(PEG)部分。
製備包含具有淋巴球活化共價功能化區之表面的孔盤 . 一種製備包含表面之孔盤之方法，該表面具有用於活化T細胞之孔盤的抗原呈現共價功能化區，該方法包括使孔盤之抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區與複數個初始活化分子接觸，該複數個初始活化分子各自包括經組態以結合於T細胞之T細胞受體之主要組織相容複合體(MHC)分子及結合部分，其中複數個初始活化分子之結合部分經組態以結合抗生蛋白鏈菌素之結合位點；且接觸複數個共活化分子，該複數個共活化分子各自包括：T細胞受體(TCR)共活化分子或輔助TCR活化分子，其中共活化分子各自進一步包括經組態以結合抗生蛋白鏈菌素之結合位點的結合部分，以及孔盤之抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之第二複數個結合部分，進而提供孔盤之抗原呈現共價功能化區之複數個特異性結合的初始活化分子配位體及複數個特異性結合的共活化分子配位體。
方法可進一步包括使孔盤之表面與包括連接至反應性基團之表面阻斷配位體的試劑接觸，其中反應性基團經組態以與表面之反應性部分反應，進而提供表面之阻斷配位體修飾區。阻斷配位體修飾區及抗原呈現共價功能化區可覆蓋整個表面。在一些實施例中，阻斷配位體修飾區及抗原呈現共價功能化區可為表面之非重疊區域。
使孔盤之抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區與複數個初始活化分子及複數個共活化分子接觸可包括接觸孔盤之一或多個孔中之每一者內的表面。在一些實施例中，接觸一或多個孔中之每一者可進一步包括使對應孔之底表面處的一或多個孔中之每一者與複數個初始活化分子及複數個共活化分子接觸，進而在對應孔之底表面上產生抗原呈現共價功能化區。在一些實施例中，抗原呈現共價功能化區可僅形成於對應孔之底表面上。
在一些實施例中，抗原呈現共價功能化區之面積可小於約50%之一或多個孔之底部面積。在一些實施例中，抗原呈現共價功能化區之面積小於約25%、小於約15%、小於約10%、小於約5%、小於約2%或小於約1%之一或多個孔之底部面積。
在一些實施例中，抗原呈現共價功能化區之面積可具有小於約35mm2 、約20 mm2 、約12 mm2 、約5 mm2 、小於約2 mm2 或小於約1mm2 之面積。在一些實施例中，抗原呈現共價功能化區之尺寸可為1 mm。在一些實施例中，抗原呈現共價功能化區可為實質上圓形且具有1 mm之直徑。
使孔盤之抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區與複數個初始活化分子及複數個共活化分子接觸可進一步包括接觸孔盤之一或多個孔中之每一者內的複數個抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區，進而在一或多個孔中之每一者中產生複數個抗原呈現共價功能化區。在一些實施例中，複數個抗原呈現共價功能化區中之每一者的面積可小於約5%之一或多個孔之底部面積，且另外其中複數個抗原呈現共價功能化區之總面積小於約50%、約25%或約10%之一或多個孔之底部面積。
在一些實施例中，MHC分子包括I類MHC蛋白序列及β微球蛋白蛋白序列。在一些實施例中，包括MHC分子之複數個初始活化分子中之每一者可進一步包括抗原肽。抗原肽可為腫瘤相關抗原、病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原、原蟲抗原或其類似物。在一些實施例中，腫瘤相關抗原可為SLC45A2、TCL1、VCX3A、MART1或NYESO1。
在一些實施例中，可經由蛋白序列之C端連接將MHC分子之蛋白序列連接至表面。舉例而言，MHC蛋白序列可包括C端BirA標籤。BirA標籤准許位點特異性生物素標記。在一些實施例中，MHC分子可包括生物素部分且經由與抗生蛋白鏈菌素之非共價相互作用而附著至表面。在各種實施例中，抗生蛋白鏈菌素自身共價鍵結於表面。在一些實施例中，可經由一系列約5個、7個、9個、10個、11個、13個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、90個、100個、200個鍵長度或其間的任何數目之鍵長度將抗生蛋白鏈菌素鍵結至表面。
在各種實施例中，抗生蛋白鏈菌素可與表面非共價締合。抗生蛋白鏈菌素可與生物素部分非共價締合，且生物素部分可共價鍵結於表面。在各種實施例中，可經由約5個、7個、9個、10個、11個、13個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、95個、100個、200個鍵長度或其間的任何數目之鍵長度藉由連接子將生物素部分連接至表面。
初始活化分子與共活化分子之比率可為約1:1至約2:1；約1:1；或約3:1至約1:3。
在一些實施例中，複數個共活化分子配位體之TCR共活化分子與輔助TCR活化分子之比率可為約100:1至約1:100。在一些實施例中，複數個共活化分子配位體之TCR共活化分子與輔助TCR活化分子之比率可為100:1至90:1、90:1至80:1、80:1至70:1、70:1至60:1、60:1至50:1、50:1至40:1、40:1至30:1、30:1至20:1、20:1至10:1、10:1至1:1、3:1至1:3；1:1至1:10、1:10至1:20、1:20至1:30、1:30至1:40、1:40至1:50、1:50至1:60、1:60至1:70、1:70至1:80、1:80至1:90或1:90至1:100，其中前述值中之每一者由「約」修飾。在一些實施例中，複數個共活化分子配位體之TCR共活化分子與輔助TCR活化分子之比率可為約20:1至約1:20或約3:1至約1:3。
在抗原呈現共價功能化區中，複數個特異性結合的初始活化分子配位體之密度可為至少約1 × 102 個分子/平方微米、約5 × 102 個分子/平方微米、約1 × 103 個分子/平方微米、約5 × 103 個分子/平方微米、約1 × 104 個分子/平方微米、約5 × 104 個分子/平方微米、約1 × 105 個分子/平方微米或約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米。
在抗原呈現共價功能化區之抗原呈現合成表面上，複數個特異性結合的共活化分子配位體之密度可為至少約1 × 102 個分子/平方微米、約5 × 102 個分子/平方微米、約1 × 103 個分子/平方微米、約5 × 103 個分子/平方微米、約1 × 104 個分子/平方微米、約5 × 104 個分子/平方微米、約1 × 105 個分子/平方微米或約1 × 103 至約1 × 105 個分子/平方微米。
在一些實施例中，T細胞受體(TCR)共活化分子可包括CD28結合蛋白或其片段，該片段保留對於CD28之結合能力。CD28結合蛋白或其片段進一步可包括位點特異性C端生物素部分。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)共活化分子可包括CD80分子或其片段，其中該片段保留對於CD28之結合活性。在一些實施例中，T細胞受體(TCR)共活化分子可包括抗CD28抗體或其片段。
在一些實施例中，輔助TCR活化分子可包括CD2結合蛋白。CD2結合蛋白或其片段可進一步包括位點特異性C端生物素部分。在一些實施例中，輔助TCR活化分子可包括CD58分子或其片段，其中該片段保留與CD2之結合活性。在一些實施例中，輔助TCR活化分子可包括抗CD2抗體或其片段。
表面阻斷配位體中之每一者可為如本文所述的任何適合之表面阻斷配位體。在一些實施例中，表面阻斷配位體可包括親水性或帶負電荷部分。在一些實施例中，表面阻斷配位體可包括聚乙二醇(PEG)部分。
點擊化學及試劑 . 共價鍵可藉由使炔烴(諸如非環狀炔烴)與疊氮化物反應而形成。舉例而言，可執行「點擊」環化反應，該反應係藉由銅(I)鹽催化。當銅(I)鹽用於催化反應時，反應混合物可視情況包括可增強反應速率或程度的其他試劑。當炔烴(例如表面修飾試劑或功能化表面之炔烴)為環辛炔時，與對應功能化表面之疊氮化物或表面修飾劑發生的「點擊」環化反應可以不含銅。「點擊」環化反應可進而用於將表面修飾配位體偶合至功能化表面，以形成共價修飾表面。
銅催化劑.可使用任何適合之銅(I)催化劑，在一些實施例中，碘化銅(I)、氯化銅(I)、溴化銅(I)或另一銅(I)鹽。在其他實施例中，銅(II)鹽可以與諸如抗壞血酸鹽之還原劑組合使用，以原位產生銅(I)物種。硫酸銅或乙酸銅為適合銅(II)鹽之非限制性實例。在其他實施例中，諸如抗壞血酸鹽之還原劑可與銅(I)鹽組合存在，以確保在反應過程期間有足夠的銅(!)物種。銅金屬可用於在亦產生Cu(II)物種之氧化還原反應中提供Cu(l)物種，可使用銅之配位複合物，諸如[CuBr(PPh3 )3 ]、銅之矽鎢酸鹽複合物、[Cu(CH3 CN)4 ]PF6或(EtO)3 P CuI，在又其他實施例中，氧化矽負載之銅催化劑、銅奈米簇或氧化銅/亞銅奈米粒子可用作催化劑。
其他反應增強劑.如上所述，諸如抗壞血酸鈉之還原劑可用於准許在整個反應中維持銅(I)物種，即使並未自反應中嚴密排除氧，其他輔助配位體可包括於反應混合物中，以穩定銅(I)物種。可使用含***基之配位體，包括(但不限於)參(苯甲基~1 H-1 ,2,3-***-4-基)甲胺(TBTA)或3[參(3-羥丙基***基甲基)胺(THPTA)。可用於促進反應之另一類輔助配位體為磺化紅菲繞啉(sulfonated bathophenanthroline)，其亦可溶於水，且可在排除氧氣時使用。使用方法
使用孔盤之表面的抗原呈現共價功能化區活化 T 淋巴球 . 一種活化T淋巴球(T細胞)的方法包括使複數個T細胞與孔盤之一或多個孔之表面的抗原呈現共價功能化區接觸，其中抗原呈現共價功能化區包括：複數個初始活化分子配位體，其各自包括經組態以結合於T細胞之T細胞受體的主要組織相容(MHC)分子(例如，I類或II類)，其中複數個初始活化分子配位體中之每一者連接至一或多個孔之表面；及複數個共活化分子配位體，其各自包括T細胞受體(TCR)共活化分子或輔助TCR活化分子，其中共活化分子配位體中之每一者連接至一或多個孔之表面；且與表面之抗原呈現共價功能化區接觸培養複數個T細胞，進而將複數個T細胞中之至少一部分轉化為活化T細胞。在一些實施例中，與抗原呈現共價功能化表面接觸置放之T細胞可包括CD8+ T細胞。
在一些實施例中，孔盤之一或多個孔之表面的抗原呈現共價功能化區為具有任何特徵組合之如本文所述之任何抗原呈現共價功能化區。
在一些實施例中，複數個共活化分子配位體可包括TCR共活化分子及輔助TCR活化分子。複數個共活化分子配位體之TCR共活化分子與輔助TCR活化分子之比率可為約100:1至約1:100。複數個共活化分子配位體之TCR共活化分子與輔助TCR活化分子之比率可為100:1至90:1、90:1至80:1、80:1至70:1、70:1至60:1、60:1至50:1、50:1至40:1、40:1至30:1、30:1至20:1、20:1至10:1、10:1至1:1、3:1至1:3；1:1至1:10、1:10至1:20、1:20至1:30、1:30至1:40、1:40至1:50、1:50至1:60、1:60至1:70、1:70至1:80、1:80至1:90或1:90至1:100，其中前述值中之每一者由「約」修飾。在各種實施例中，複數個共活化分子配位體之TCR共活化分子與輔助TCR活化分子之比率可為約20:1至約1:20或約3:1至約1:3。
在一些實施例中，複數個MHC分子各自可包括I類MHC蛋白序列及β微球蛋白蛋白序列。在一些實施例中，可經由蛋白序列之C端連接將MHC分子之蛋白序列連接至表面之抗原呈現共價功能化區。在一些實施例中，MHC分子可進一步包括抗原肽。在一些實施例中，抗原肽為腫瘤相關抗原、病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原、原蟲抗原或其類似物。在一些實施例中，腫瘤相關抗原為SLC45A2、TCL1、VCX3A、MART1或NYESO1。在各種實施例中，MHC分子可包括生物素部分且經由與抗生蛋白鏈菌素之非共價相互作用而附著至表面之抗原呈現共價功能化區。
在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素可自身共價鍵結於表面之抗原呈現共價功能化區。可經由一系列約5個、7個、9個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、95個、100個、200個鍵長度或其間的任何數目之鍵長度將抗生蛋白鏈菌素鍵結至表面。在其他實施例中，抗生蛋白鏈菌素可與表面之抗原呈現共價功能化區非共價締合。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素可與生物素部分非共價締合，且生物素共價鍵結於表面之抗原呈現共價功能化區。可經由一系列2個約5個、7個、9個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、95個、100個、200個鍵長度或其間的任何數目之鍵長度將生物素部分藉由連接子連接至表面。
在一些實施例中，可將複數個共活化分子配位體中之每一者連接至表面之抗原呈現共價功能化區。
在一些實施例中，T細胞受體(TCR)共活化分子可包括CD28結合蛋白或其片段，該片段保留對於CD28之結合能力。CD28結合蛋白或其片段可進一步包括位點特異性C端生物素部分。在一些其他實施例中，T細胞受體(TCR)共活化分子可包括CD80分子或其片段，其中該片段保留對於CD28之結合活性。T細胞受體(TCR)共活化分子可包括抗CD28抗體或其片段。
在各種實施例中，輔助TCR活化分子可包括CD2結合蛋白。CD2結合蛋白或其片段進一步可包括位點特異性C端生物素部分。在各種實施例中，輔助TCR活化分子可包括CD58分子或其片段，其中該片段保留與CD2之結合活性。輔助TCR活化分子可包括抗CD2抗體或其片段。
在表面之抗原呈現共價功能化區中，特異性結合的初始活化分子配位體之密度可為至少約1 × 102 個分子/平方微米、約5 × 102 個分子/平方微米、約1 × 103 個分子/平方微米、約5 × 103 個分子/平方微米、約1 × 104 個分子/平方微米、約5 × 104 個分子/平方微米、約1 × 105 個分子/平方微米或約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米。在表面之抗原呈現共價功能化區中，特異性結合的共活化分子配位體之密度可為至少約1 × 102 個分子/平方微米、約5 × 102 個分子/平方微米、約1 × 103 個分子/平方微米、約5 × 103 個分子/平方微米、約1 × 104 個分子/平方微米、約5 × 104 個分子/平方微米、約1 × 105 個分子/平方微米或約1 × 103 至約1 × 105 個分子/平方微米。在一些實施例中，共價修飾表面上之初始活化分子配位體與共活化分子配位體之比率可為約1:10至約2:1、約1:5至約2:1、約1:2至約2:1、約1:10至約1:1、約1:5至約1:1、約1:1至約2:1或約1:2至約1:1。在一些實施例中，複數個共活化分子配位體之TCR共活化分子與輔助TCR活化分子之比率可為約3:1至約1:3。在一些實施例中，複數個共活化分子配位體之TCR共活化分子與輔助TCR活化分子之比率可為約2:1至約1:2。在其他實施例中，複數個共活化分子配位體之TCR共活化分子與輔助TCR活化分子之比率可為約1:1。
方法可進一步包括使複數個T細胞與包括ICAM分子之複數個黏附性刺激分子配位體接觸，其中複數個黏附性刺激分子配位體中之每一者附著至孔盤之表面的抗原呈現共價功能化區外部之區域。在一些實施例中，複數個黏附性刺激分子配位體可共價附著於孔盤之表面的抗原呈現共價功能化區外部之區域。
在一些實施例中，方法可進一步包括使複數個T細胞與複數個生長刺激性分子配位體接觸。生長刺激性分子配位體中之每一者可包括生長因子受體配位體。在一些實施例中，生長因子受體配位體可包括IL-21或其片段。
在一些實施例中，可在至少一天之第一培養時段之後執行使複數個T細胞與複數個生長刺激性分子配位體接觸。與抗原呈現合成表面接觸培養T細胞可執行約四天至約七天的時段。
在一些實施例中，方法進一步包括完成接觸表面之抗原呈現共價功能化區的第一活化時段；且與表面之抗原呈現共價功能化區接觸培養複數個活化T細胞持續第二培養時段，進而提供擴增的複數個活化T細胞。可在第二培養時段期間添加第二複數個生長刺激性分子配位體。可添加複數個IL-2分子及複數個IL-7分子以接觸活化T細胞持續第二培養時段之剩餘時間。在一些實施例中，對於第二培養，可執行與表面之抗原呈現共價功能化區接觸培養持續約四天至約七天的時段。
方法可進一步包括完成與表面之抗原呈現共價功能化區接觸之第二活化時段；且與表面之抗原呈現共價功能化區接觸培養擴增的複數個活化T細胞持續第三培養時段，進而提供複數個高度活化T細胞。可在第三培養時段期間添加第三複數個生長刺激性分子配位體。在一些實施例中，可添加複數個IL-2分子及複數個IL-7分子以接觸活化T細胞持續第三培養時段之剩餘時間。可執行與表面之抗原呈現共價功能化區接觸培養持續約四天至約七天的第三時段。
表型及產物 . 在一些實施例中，活化的T淋巴球包括CD8+ T淋巴球，諸如初始CD8+ T淋巴球。在一些實施例中，活化的T淋巴球可經富集用於CD8+ T淋巴球，諸如初始CD8+ T淋巴球，替代地，在一些實施例中，活化的T淋巴球可包括CD4+ T淋巴球，諸如初始CD4+ T淋巴球。在一些實施例中，活化的T淋巴球經富集用於CD4+ T淋巴球，諸如初始CD4+ T淋巴球，例如若需要對ll類限制抗原具有特異性之T細胞，則可使用CD4+ T淋巴球。
在一些實施例中，方法產生為CD45RO+的活化T淋巴球。在一些實施例中，方法產生為CD28陽性的活化T淋巴球。在一些實施例中，方法產生為CD28+CD45RO+的活化T淋巴球。在一些實施例中，方法產生為CD197+的活化T淋巴球。在一些實施例中，方法產生為CD127+的活化T淋巴球。在一些實施例中，方法產生對CD28、CD45RO、CD 127及CD 197，或前述標記物中之三者的至少任何組合，或前述標記物中之兩者的至少任何組合呈陽性的活化T淋巴球。具有前述表型中之任一者之活化T淋巴球可以進一步為CD8+。在一些實施例中，為CD28+之前述表型中之任一者包含高CD28表型。
在一些實施例中，方法產生包含抗原特異性T細胞之T細胞群，其中至少65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或98%之抗原特異性T細胞為CD45RO+/高CD28細胞，其中前述值中之每一者可由「約」修飾。
替代地或另外，在一些實施例中，方法產生T細胞群，其中至少1%、1.5%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%之T細胞為抗原特異性T細胞；或其中1%-2%、2%-3%、3%-4%、4%-5%、5%-6%、6%-7%、7%-8%、8%-9%、9%-10%、10%-11%或11%-12%之T細胞為抗原特異性T細胞，其中前述值中之每一者可由「約」修飾。可在接觸抗原呈現表面及視情況其他擴增步驟後(亦即，在富集或分離具有特定表型之產物T細胞之前/不富集或分離具有特定表型之產物T細胞)在該方法之「粗」產物上測定T細胞群之含量。抗原特異性及/或T細胞標記物表型之判定可排除死亡細胞。在一些實施例中，方法提供T細胞群，其中為抗原特異性之T細胞部分相對於起始群體而增大。
使用由本文中描述之方法活化的細胞治療個體 . 一種治療需要治療癌症之個體之方法包括自個體獲得複數個T淋巴球(T細胞)；使複數個T細胞與包括抗原呈現共價功能化區之孔盤之表面接觸，其中抗原呈現共價功能化區包括經組態以結合於複數個T細胞中之每一者之T細胞受體的複數個主要組織相容複合體(MHC)分子(例如，I類或II類)，其中MHC分子包括對個體之癌症具有特異性之抗原；產生複數個活化T細胞，其中活化經組態以對於個體之癌症為特異性的；將複數個特異性活化T細胞與未活化細胞分離；及將複數個抗原特異性活化T細胞引入至個體體內。
具有包括抗原呈現共價功能化區之表面的孔盤可為包括如本文所述之任何抗原呈現共價功能化區之孔盤且可具有特徵之任何組合。具有包括抗原呈現共價功能化區之表面之孔盤可藉由本文中描述之任何方法且以步驟之任何組合產生。
一種治療需要治療癌症之個體之方法包括自個體獲得複數個T淋巴球(T細胞)；藉由類似於本文中描述之任何方法的方法產生複數個活化T細胞，其中活化經組態以對於個體之癌症為特異性的；將複數個特異性活化T細胞與未活化細胞分離；及將複數個抗原特異性活化T細胞引入至個體體內。
亦提供複數個特異性活化T淋巴球用於製造供治療需要治療癌症之個體之藥劑的用途，其中複數個特異性活化T淋巴球係藉由本文所述之方法產生。亦提供複數個特異性活化淋巴球用於製造供治療需要治療癌症之個體之藥劑的用途，其中複數個特異性活化淋巴球係藉由本文所述之方法產生。亦提供複數個特異性活化淋巴球用於製造供治療需要治療蛋白質缺乏病症或免疫病症之個體之藥劑的用途，其中複數個特異性活化淋巴球係藉由本文所述之方法產生。
在一些實施例中，將複數個特異性活化淋巴球分離可進一步包括偵測特異性活化淋巴球之表面生物標記。
在一些實施例中，特異性活化淋巴球為自體性(亦即來源於待投與該特異性活化淋巴球之個體)，且可使用本文中所述之活化表面及方法快速擴增。
在各種實施例中，該等方法或複數個特異性活化T淋巴球或特異性活化T淋巴球群之製備可進一步包括快速擴增活化T淋巴球以提供擴增的活化T淋巴球群。在一些實施例中，可在將特異性活化T淋巴球與非活化T淋巴球分離後執行快速擴增。可使用本文所述或此項技術中已知之快速擴增方法實現產生充足的T淋巴球含量。參見例如下文實例；Riddell, US 5,827,642；Riddell等人, 美國專利第6,040,177號，及Yee及LI, PCT專利申請公開案第WO2009/045308 A2號。
T細胞治療人類個體的用途(例如用於授受細胞療法)為此項技術中已知的。根據本文所述方法製備的T細胞可用於此類方法中。舉例而言，使用腫瘤浸潤性淋巴球(包括MART-1抗原特異性T細胞)之授受細胞療法已在臨床中測試(Powell等人, Blood 105:241-250, 2005)。另外，投與藉由抗CD3單株抗體及IL-2共活化之T細胞描述於Chang等人, J. Clinical Oncology 21:884-890, 2003中。用於治療癌症之T細胞投與之額外實例及/或論述提供於Dudley等人 Science 298:850-854, 2002；Roszkowski等人, Cancer Res 65(4): 1570-76, 2005；Cooper等人 Blood 101: 1637-44, 2003；Yee, 美國專利申請公開案第2006/0269973號；Yee及Li, PCI專利申請公開案第WO2009/045308 A2號；Gruenberg等人，美國專利申請公開案第2003/0170238號；Rosenberg, 美國專利第4,690,915號；及Alajez等人, Blood 105:4583-89, 2005中。
對於NK細胞或NK CAR細胞之醫療用途之關注已增大，且針對廣泛範圍的血液及實體腫瘤研究此等細胞類型，如EBioMedicine 39:1-2, 2019中所述。
B淋巴球近來已經報導用作經工程改造B細胞，用於遞送治療蛋白以用於廣泛範圍的應用，包括蛋白質缺乏病症，諸如血友病及其他免疫療法。
在一些實施例中，細胞係藉由以下調配：首先自如本文中描述的活化方法中所使用的培養基中採集該等細胞，且接著在適合於投與的培養基及容器系統(「醫藥學上可接受之獲取器(earner)」)中以治療有效量洗滌並濃縮該等細胞。適合之輸注培養基可為任何等張性培養基調配物，典型地標準生理鹽水、Normosoi R (Abbott)或Plasma-Lyte A (Baxter)，且亦可利用含5%右旋糖之水或林格氏乳酸酯(Ringer's lactate)。輸注培養基可補充有人類血清白蛋白。
在一些實施例中，組合物中之細胞數目為至少109 或至少1010 個細胞，在一些實施例中，單一劑量可包含至少1000萬、1億、10億或100億個細胞，所投與之細胞數目為跡象特異性、患者特異性(例如，患者的大小)，且亦將隨所投與細胞之純度及表型而變化，細胞數目將視既定為將包含該等細胞之類型的組合物之最終用途而定，舉例而言，若需要對特定抗原具有特異性之細胞，則該群體將含有大於70%，通常大於80%、85%及90-95%之此類細胞。對於本文提供的用途而言，細胞的體積通常為一公升或更小，可為500 mL或更小，甚至250 mL或100 mL或更小。因此，所需細胞之密度可大於106 個細胞/毫升、大於107 個細胞/毫升、或108 個細胞/毫升或更大。臨床上相關數目之免疫細胞可分成多次輸注，其累積量等於或超過109 、1010 或1011 個細胞。
在一些實施例中，本文所述或根據本文所述之方法製備的T淋巴球可用於向個體賦予針對腫瘤或癌症細胞的免疫力。「免疫性」意謂相對於已活化淋巴球之抗原而減輕與癌細胞或腫瘤相關聯之一或多種身體症狀，可藉由輸注投與細胞，其中每一次輸注在至少106 至1010 個細胞/平方公尺範圍內，例如在至少107 至109 個細胞/平方公尺範圍內。可在時間範圍內藉由單一輸注或藉由多次輸注投與細胞。然而，由於預期不同個體的反應不同，因此所輸注細胞的類型及量以及輸注次數及給與多次輸注之時間範圍係由主治醫師判定且且可藉由檢查來判定。
在將細胞轉移回至患者體內後，可採用方法以藉由用細胞介素治療患者而維持患者存活率，該等細胞介素可包括IL-21及IL-2 (Bear等人, Cancer Immunol. lmmunother.50\2.69-74, 2001；及Schultze等人, Br. J. Haematol. 113:455-60, 2001)，在另一實施例中，在向患者投與之前，在存在IL-21的情況下培養細胞。參見例如Yee, 美國專利申請公開案第2006/0269973號，IL-21可將包含活化T細胞之群體中之T細胞頻率增大至足夠高以用於擴增及過繼轉移而不需進一步抗原特異性T細胞富集之水準，因此，此步驟可進一步減少治療之時間及/或免除需要進一步選擇及/或選殖。套組
用於製備具有包括抗原呈現共價功能化區之表面之孔盤的套組 .用於製備包含具有抗原呈現共價功能化區之表面之孔盤的套組包括具有包括生物素呈現共價功能化區之表面的孔盤；及包含抗生蛋白鏈菌素之表面功能化劑。在一些實施例中，具有包括生物素呈現共價功能化區之表面的孔盤可為如本文所述之具有包括生物素呈現共價功能化區之表面的任何孔盤且具有特徵之任何組合。
在一些實施例中，套組可進一步包括第一活化劑，該第一活化劑包括經組態以與T細胞之T細胞受體結合的複數個主要組織相容複合體(MHC)分子(例如，I類或II類)，且另外其中MHC分子經組態以結合於抗生蛋白鏈菌素之結合位點。在一些實施例中，複數個MHC分子中之每一者可進一步包括至少一個生物素官能基。
在一些實施例中，套組可進一步包括一試劑，該試劑包括各自經組態以結合抗生蛋白鏈菌素之結合位點之共活化分子，且其中共活化分子中之每一者可為T細胞受體(TCR)共活化分子或輔助TCR活化分子。在一些實施例中，複數個共活化分子可包括T細胞受體(TCR)共活化分子及輔助TCR活化分子。在一些實施例中，含有包括共活化分子之試劑之容器可含有約20:1至約1:20比率之TCR共活化分子及輔助TCR活化分子。在一些實施例中，TCR共活化分子可為CD28受體之促效劑。在一些實施例中，輔助TCR活化分子為CD2受體之促效劑。
在一些實施例中，套組可進一步包括包含連接至反應性基團之表面阻斷部分的表面阻斷劑，該反應性基團經組態以與疊氮基部分反應。在一些實施例中，表面阻斷部分可包括親水性或帶負電荷部分。在一些實施例中，表面阻斷劑可包括聚乙二醇(PEG)部分。
在一些實施例中，套組可進一步包括一試劑，該試劑包括生長刺激性分子，其中各生長刺激性分子包括生長因子受體配位體。在一些實施例中，生長因子受體配位體可包括IL-21或其片段。在一些實施例中，套組可進一步包括包含IL-7或IL-2之第二生長刺激性分子。
用於製備孔盤之套組 . 在其他變化形式中，用於製備包括具有抗原呈現共價功能化區之表面之孔盤的套組包括包含表面之孔盤，該表面包含疊氮基呈現共價功能化區；及第一表面功能化劑。在一些實施例中，包含具有疊氮基呈現共價功能化區之表面的孔盤可為包括表面之任何孔盤，該表面具有類似於本文所述之任一者的疊氮基呈現共價功能化區。
在一些實施例中，第一表面功能化劑可包括包含連接至反應性基團之生物素部分之試劑，其中反應性基團經組態以與表面之疊氮基部分反應。在一些實施例中，套組可進一步包括包含抗生蛋白鏈菌素之第二表面功能化劑，該抗生蛋白鏈菌素經組態以與生物素部分結合。
在一些實施例中，第一功能化劑包含連接至反應性基團之抗生蛋白鏈菌素部分，其中反應性基團經組態以與疊氮基部分反應。
在一些實施例中，套組可進一步包括包含連接至反應性基團之表面阻斷部分的表面阻斷劑，該反應性基團經組態以與疊氮基部分反應。在一些實施例中，表面阻斷部分可包括親水性或帶負電荷部分。在一些實施例中，表面阻斷劑可包括聚乙二醇(PEG)部分。
在一些實施例中，套組可進一步包括第一活化劑，該第一活化劑包括經組態以與T細胞之T細胞受體結合的複數個主要組織相容複合體(MHC)分子(例如，I類或II類)，且另外其中MHC分子經組態以結合於抗生蛋白鏈菌素之結合位點。在一些實施例中，複數個MHC分子中之每一者可進一步包括至少一個生物素官能基。
在一些實施例中，套組可進一步包括一試劑，該試劑包括各自經組態以結合抗生蛋白鏈菌素之結合位點之共活化分子，且其中共活化分子中之每一者可為T細胞受體(TCR)共活化分子或輔助TCR活化分子。在一些實施例中，複數個共活化分子可包括T細胞受體(TCR)共活化分子及輔助TCR活化分子。在一些實施例中，含有包括共活化分子之試劑之容器可含有約20:1至約1:20比率之TCR共活化分子及輔助TCR活化分子。在一些實施例中，TCR共活化分子可為CD28受體之促效劑。在一些實施例中，輔助TCR活化分子為CD2受體之促效劑。
在一些實施例中，套組可進一步包括一試劑，該試劑包括生長刺激性分子，其中各生長刺激性分子包括生長因子受體配位體。在一些實施例中，生長因子受體配位體可包括IL-21或其片段。在一些實施例中，套組可進一步包括包含IL-7或IL-2之第二生長刺激性分子。
用於製備孔盤之套組 . 用於製備孔盤(包含具有用於抗原特異性活化T淋巴球(T細胞)之抗原呈現共價功能化區之表面)的套組包括孔盤，其包括具有抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區的表面；及第一活化劑，其包含經組態以與T細胞之T細胞受體結合的複數個主要組織相容複合體(MHC)分子(例如，I類或II類)，且另外其中MHC分子經組態以結合於抗生蛋白鏈菌素之結合位點。在一些實施例中，包括具有抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之表面的孔盤可類似於如本文所述的包括具有抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之表面的任何孔盤，且可具有特徵之任何組合。
在一些實施例中，複數個MHC分子中之每一者可進一步包括至少一個生物素官能基。
在一些實施例中，套組可進一步包括一試劑，該試劑包括各自具有經組態以結合抗生蛋白鏈菌素之結合位點之結合部分的複數個共活化分子，且其中共活化分子中之每一者包括T細胞受體(TCR)共活化分子或輔助TCR活化分子。
在一些實施例中，套組可進一步包括一試劑，該試劑包括各自經組態以結合抗生蛋白鏈菌素之結合位點之共活化分子，且其中共活化分子中之每一者可為T細胞受體(TCR)共活化分子或輔助TCR活化分子。在一些實施例中，複數個共活化分子可包括T細胞受體(TCR)共活化分子及輔助TCR活化分子。在一些實施例中，含有包括共活化分子之試劑之容器可含有約20:1至約1:20比率之TCR共活化分子及輔助TCR活化分子。在一些實施例中，TCR共活化分子可為CD28受體之促效劑。在一些實施例中，輔助TCR活化分子為CD2受體之促效劑。
在一些實施例中，套組可進一步包括包含連接至反應性基團之表面阻斷部分的表面阻斷劑，該反應性基團經組態以與疊氮基部分反應。在一些實施例中，表面阻斷部分可包括親水性或帶負電荷部分。在一些實施例中，表面阻斷劑可包括聚乙二醇(PEG)部分。
在一些實施例中，套組可進一步包括一試劑，該試劑包括生長刺激性分子，其中各生長刺激性分子包括生長因子受體配位體。在一些實施例中，生長因子受體配位體可包括IL-21或其片段。在一些實施例中，套組可進一步包括包含IL-7或IL-2之第二生長刺激性分子。 實例
實驗 1. 製備孔盤.將聚苯乙烯孔盤(Falcon 96孔圓底、Falcon 96孔平底、Falcon 6孔平底、Costar 96孔V底)置放於氧電漿清潔器(Nordson March AP-300)中，該氧電漿清潔器經抽真空至50毫托(mtorr)且在440 sccm下用氧氣淨化至190毫托壓力。盤經100 W電漿處理60秒。
實驗 2. 盤之化學氣相沈積(CVD).內部合成7-疊氮基庚基-三甲氧基矽烷。三個20 mL鋁盤經填充有300 mg矽烷且三者經填充有333 mg MgSO4 (H2 O)7 。將各試劑之一個盤置放於真空烘箱中之三個擱板中之每一者上。將孔盤及參考樣本置放於每一擱板上。烘箱經密封且抽真空至250毫托。將溫度升高至75℃且進行CVD隔夜(約18小時)。CVD製程之後，烘箱經淨化且移除孔盤及樣本。
實驗 3 .藉由二苯甲基環辛炔基(DBCO)-聚乙二醇13 (PEG13)-抗生蛋白鏈菌素(SAV)處理疊氮基修飾之孔盤，提供具有受限功能化區之功能化孔盤。如2018年7月20日申請的PCT/US2018/043146中所描述合成5 µM DBCO-PEG13-抗生蛋白鏈菌素(SAV)溶液，該揭示內容以全文引用之方式併入本文中。DBCO-PEG13-SAV為具有經由共價附著於抗生蛋白鏈菌素之聚乙二醇連接子(十三個PEG單元)連接之二苯并環辛炔基偶合部分的無銅點擊試劑，且以PBS/0.02%疊氮化鈉製備，以提供共價結合至如圖1B中示意性展示之孔盤的SAV。以介於250nL至50uL範圍內的體積將DBCO-PEG13-SAV溶液添加至孔中以僅接觸孔之底部，且並不接觸各孔之側壁。在30分鐘培育後，用200 uL PBS/疊氮化物將孔洗滌兩次，隨後經抽吸。接著，將1.5 mM DBCO-PEG 5K (Creative PEGWorks，目錄號PLS-9979)於PBS/疊氮化物中之溶液添加至該等孔中以完全地填充該等孔。DBCO-PEG-5k表面阻斷劑，一種含分子量為5000Da之聚乙二醇表面阻斷配位體之無銅點擊試劑，與孔之底部的抗生蛋白鏈菌素修飾之受限區外部存在之剩餘疊氮化物官能基反應。
實驗 4 .使用淋巴球活化共價功能化孔盤製備活化T細胞.
製備孔盤：共價功能化孔盤經製備用於活化改變初始及共活化配位體之比率的T細胞。類似地如實驗5中所述製備之抗生蛋白鏈菌素功能化孔盤不同在於將生物素-抗生蛋白鏈菌素功能化應用於各孔之底部而不需充分限制區域(例如，功能化面積延伸至孔之底表面之實質上面積)。
活化配位體功能化：生物素共軛之抗CD3(初始刺激)、抗CD28及抗CD2 (協同刺激)之儲備溶液係以100 ug/mL製備且以不同比率混合於PBS中(圖3A)。最終總抗體濃度為50 ug/mL。將50 ul各活化配位體溶液添加至個別孔且使其在室溫下結合保留30分鐘。隨後，用PBS將微量盤孔洗滌一次，接著保留在4℃下直至用於刺激T細胞。
製備用於刺激之T細胞：使用商購的人類T細胞富集套組(EasySepTM , StemCell Technologies, 目錄號19051)自PBMC富集CD3+ T細胞。在具有10%人類AB血清(CorningTM , Fisher目錄號MT35060CI)、2mM GlutaMAXTM (Thermo Fisher, 目錄號35050061)、50uM 2-巰基乙醇(Thermo Fisher, 目錄號31350010)以及25ng/mL IL-7及10ng/mL IL-15 (R&D Systems, 目錄號207-IL/CF；247-ILB-005)之200 ul T細胞培養基(Advanced RPMI  1640, GibcoTM , Thermo Fisher, 目錄號12-633-012)中，將200,000個CD3+ T細胞接種至活化盤之各孔。包括對照條件(條件12)，其中藉由1:1比率之抗CD3與抗CD28塗佈珠粒(Thermo Fisher, 目錄號11161D)活化T細胞。細胞經培養4天，此時將來自各孔之50 ul細胞轉移至新的未經處理圓底96孔微量盤(Corning, 目錄號3879)中，且添加150 ul新製T細胞培養基。在第4天時，亦自各孔中收集50 ul樣本以測定各孔中之T細胞數目。在第7天時，自各孔中移除100 ul細胞且以100 uL T細胞培養基置換。在第10天時，自各孔中移除100 ul培養基，使細胞保持完整且以100 ul T細胞培養基置換。在第11天時，自各孔中收集200 ul樣本以測定各孔中之T細胞數目，且評估T細胞上之CD28及CD27之表面表現。如圖3B、3C及3D中所展示(提供均值及範圍)，可改變初始刺激配位體(CD3)與共刺激配位體之比率以在第4天(圖3B)及第11天(圖3C)提供有效T細胞擴增，且CD27及CD28之共表現(圖3D)。此實驗證實淋巴球活化可通常取決於附著至功能化孔盤之孔的活化配位體實現，且可實現與使用CD3/CD28標記之珠粒(圖3A之條件12)觀測之水準類似的活化及擴增水準。
實驗 5. 製備孔盤之抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化孔.如圖1B中所展示，執行藉由DBCO-PEG4 -生物素/DBCO-PEG5 -酸處理疊氮基修飾之孔盤(如實驗1及2中製備)。10% DBCO-PEG4 -生物素(Broadpharm, 目錄號BP-22295)溶液，一種經由共價附著於生物素之聚乙二醇連接子(四個PEG單元)連接之無銅點擊二苯并環辛炔基偶合部分，例如經製備為含0.2 mM生物素之點擊試劑溶液，其亦包括1.8 mM DBCO-PEG5 -酸(Broadpharm, 目錄號BP-24056)，一種經由共價附著於甲酸部分之聚乙二醇連接子(五個PEG單元)連接之無銅點擊二苯并環辛炔基偶合部分，以PBS/0.02%疊氮化鈉製備。PEG5-酸點擊試劑充當表面阻斷配位體。可使用其他比率以改變引入至孔之底部中之生物素部分的密度。以介於250 nL至50 µL範圍內的體積將此溶液添加至孔中，其在孔之底部的各別更高區域中提供共價連接之生物素部分。在30分鐘培育後，用200 uL PBS/疊氮化物將孔洗滌兩次，隨後抽吸。製備2微莫耳抗生蛋白鏈菌素溶液且添加至孔中。抗生蛋白鏈菌素非共價地附著於生物素，該生物素自身共價附著於孔之表面，如同圖1A。使用不同體積之含所使用生物素之點擊試劑，獲得不同大小的含抗生蛋白鏈菌素之區域。在15分鐘培育後，將1.5 mM DBCO-PEG 5K (Broadpharm 目錄號BP-22461)於PBS/疊氮化物中之溶液添加至孔中以填充該等孔且與仍存在於該孔內之剩餘疊氮基反應性部分反應，藉由抗生蛋白鏈菌素及PEG5 -甲酸部分之組合修飾區域外部。
實驗 6. 製備區域受限的抗原呈現T淋巴球活化孔盤。標準聚苯乙烯組織培養(經電漿處理之)微量盤(Corning)經功能化以使用化學氣相沈積呈現疊氮化物，如實驗1及2中所描述。使用自動化液體搬運機器人(OpenTrons)將1 uL液滴之含2微莫耳DBCO共軛抗生蛋白鏈菌素之PBS (SAV共價附著於表面，如同圖1B)置放於功能化96孔圓底微量盤孔之中心中，在孔之底部上提供約1 mm直徑之抗生蛋白鏈菌素功能化區域。未將抗生蛋白鏈菌素引入至孔之壁中。點樣液滴經乾燥至生物安全櫃(Biosafety Cabinet)中之微量盤表面上。為鈍化剩餘疊氮基，孔經填充有1.5 mM DBCO-PEG3,000溶液，且將PEG3000表面阻斷配位體引入至孔之底部上之抗生蛋白鏈菌素修飾區外部的孔之剩餘部分中。在室溫下，使此溶液接觸該等孔15分鐘。隨後，用PBS將孔沖洗一次，以移除未反應的DBCO-PEG3,000。
為將T細胞活化配位體結合至表面，生物素共軛肽-HLA (初始刺激)、抗CD28及抗CD2 (協同刺激)之混合物以不同濃度混合於緩衝液(具有2 mM EDTA及0.5%牛血清白蛋白之PBS)中。對於肽-HLA，當添加至微量盤時，製備四份三倍連續稀釋液。對於抗CD28及抗CD2，製備四份九倍連續稀釋液。(參見圖4A)對於此實驗，抗CD28:抗CD2之比率為1:1，但其他比率可成功地用於刺激T細胞。肽-HLA及抗體之連續稀釋液經進一步稀釋成16個試管之緩衝液，使得肽-HLA之最終濃度介於7.5 ug/mL至0.28 ug/mL，且協同刺激抗體之最終濃度在15 ug/mL至0.02 ug/mL之間變化(總抗體濃度)，如圖4A中所展示。將40 uL各活化配位體溶液添加至6個孔中且使其在室溫下結合30分鐘。隨後，用PBS將微量盤孔洗滌一次，且接著保持在4℃下直至用於刺激T細胞。
為藉由微量盤活化T細胞，使用商購的CD8+ T細胞分離套組自PBMC富集CD8+ T細胞 (StemCell Technologies)。在具有30 ng/mL IL-21 (R&D Systems)之200 uL T細胞培養基(具有10%人類AB血清、2 mM GlutaMAX (ThermoFisher)、50 uM 2-巰基乙醇(Thermo Fisher)之高級RPMI (Thermo Fisher))中，將對於CD8+ T細胞富集之200,000個細胞接種至活化盤之各孔中。在培育箱中培養細胞48小時，隨後將具有150 ng/mL IL-21之50 uL T細胞培養基添加至各孔中，且繼續培養。5天後，自各孔中移除50 uL培養基，且將細胞轉移至如上所述製備的新的活化孔盤。將具有150 ng/mL IL-21之50 uL T細胞添加至各孔中且繼續培養。次日，自各孔移除50 uL培養基且將具有10 ng/mL IL-7及50 IU/mL IL-2之50 uL T細胞添加至各孔。次日，再次自各孔移除50 uL培養基且將具有150 ng/mL IL-21之50 uL T細胞培養基添加至各孔。培養繼續5天，此時自各孔收集樣本以測定各孔中之抗原特異性T細胞之數目，且評估抗原特異性T細胞上之CD28及CD127之表面表現。如圖4A、4B及4C中所展示，可改變初始刺激配位體(MHC)與協同刺激配位體之比率以提供有效抗原特異性活化(圖4A)、CD127表現(圖4B)及CD28表現(圖4C)。
實驗 7 .抗原特異性活化孔內之T淋巴球，該等孔在孔之底表面上具有抗原呈現共價功能化表面。如同實驗1及2，96孔圓底經組織培養處理的微孔盤(Corning)經功能化以將疊氮基呈現共價功能化表面引入於各孔之底表面上。藉由將0.05 mL 0.5 mM硫酸銅、0.1 mM抗壞血酸鈉及5 mM炔烴-PEG4-生物素添加至孔之底部以將生物素呈現共價功能化表面引入至各孔之底部中，此功能化各孔之整個底表面。
為鈍化剩餘疊氮化物且將孔之生物素功能化區限制至沈積功能化混合物之最初點樣受限區，將0.2 mL鈍化溶液(含5 mM DBCO-PEG4-甲酸之PBS)添加至各孔中。在室溫下進行此鈍化反應30分鐘。移除鈍化溶液，且在繼續進行之前，用0.2 mL PBS將孔洗滌一次。隨後，藉由將0.05 mL含0.25 mg/mL抗生蛋白鏈菌素之PBS添加至具有生物素呈現共價功能化區之各孔中來引入抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區。在室溫下30分鐘後，藉由抽吸移除抗生蛋白鏈菌素溶液，且用0.2 mL PBS將孔沖洗兩次。
將抗原呈現共價功能化活化區引入孔之底表面上：將0.05 mL含0.83微克/毫升MART1 pHLA (具有用於位點特異性生物素化之C端BirA標籤之抗原肽裝載位點特異性生物素化單體MHC分子，其中MHC分子包括預裝載至MHC中之MART1抗原肽)溶液之PBS-BSA添加至具有抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之各孔中。在30分鐘後，藉由抽吸移除pHLA混合物，且將0.05 mL協同刺激功能化混合物添加至各孔。協同刺激功能化混合物由以下組成：呈2.5微克/毫升的生物素化抗CD28及呈2.5微克/毫升的生物素化抗CD2。在室溫下30分鐘後，藉由抽吸移除協同刺激功能化混合物，且具有抗原呈現共價功能化區之孔用0.2 mL PBS-BSA沖洗兩次。此在各處理孔之底部處提供T細胞活化區，其中抗原呈現配位體及共刺激配位體(抗CD28、抗CD2)經呈現用於T細胞活化。
隨後將含有用於活化之抗原呈現區之表面的孔內之抗原特異性T細胞擴增與合成抗原呈現珠粒(如2018年7月20日申請的PCT/US2018/043146中所描述製備，全部揭示內容以全文引用之方式併入本文中)之擴增進行比較。使用EasySep™人類CD8+ T細胞分離套組(StemCell Technologies)根據製造商的建議程序將CD8+ T細胞與外周血液單核細胞分離。將富集的CD8+ T細胞以1e6/mL再懸浮於具有30奈克/毫升之IL-21的生長培養基(R&D Systems)中。生長培養基由補充有10%人類AB血清(Corning CellGro)加上GlutaMax (Thermo Fisher)及50微莫耳β巰基乙醇(Thermo Fisher)之高級RPMI 1640培養基(Thermo Fisher)組成。
CD8+ T細胞隨後***成兩個樣本用於具有抗原呈現區或合成抗原呈現珠粒之孔內之刺激。對於珠粒刺激，以1:1比率將MART1特異性合成抗原呈現珠粒添加至細胞中。將200,000個細胞接種至標準96孔圓底組織培養微量盤之各孔。對於抗原呈現共價功能化區刺激，如上所述製備之微量盤之MART1-特異性抗原呈現共價功能化孔之每孔經接種200,000個細胞。隨後將盤在標準5% CO2，37℃培育箱中培育兩天。培養兩天後，在生長培養基中，IL-21經稀釋至150奈克/毫升。將培養基中稀釋之50微升IL-21添加至各孔，且將盤返回至培育箱中用於額外培養。
在總計七天培養後，細胞藉由孔之MART1特異性合成抗原呈現活化珠粒或抗原呈現共價功能化區再刺激。對於基於珠粒之再刺激，自盤之各孔移除0.05培養基。在新製培養基中，IL-21經稀釋至150 ng/mL且以4e6珠粒/毫升之最終密度將合成抗原呈現活化珠粒添加至IL-21/培養基混合物中。將50微升此IL-21/珠粒/培養基混合物添加至各孔中，使得將額外2e5珠粒添加至各孔中。
對於具有含抗原呈現共價功能化區再刺激的表面之孔中之再刺激，自盤之各孔移除50微升培養基。藉由重複吸移使孔中之細胞再懸浮且將剩餘體積轉移至如上所述製備的具有其內包括抗原呈現共價功能化區之孔的新製孔盤中。在新製生長培養基中，IL-21經稀釋至150 ng/mL，且將50微升此IL-21/生長培養基混合物添加至新製孔盤之各孔中，該新製孔盤具有含抗原呈現共價功能化區之表面。
次日，自培育箱移除兩組孔盤，且再次自各孔移除50微升培養基。IL-2 (R&D Systems)於新製培養基中稀釋至50個單位/毫升。以12.5 ng/mL之最終濃度將IL-7 (R&D Systems)添加至含有IL-2之此培養基中。將50微升此IL-2/IL-7/培養基混合物添加至各孔，且將兩組孔盤返回至培育箱。
次日，自培育箱移除兩組孔盤，且再次自各孔移除50微升培養基。IL-21於新製培養基中稀釋至150奈克/毫升。將50微升此IL-21/培養基混合物添加至各孔，且將孔返回至培育箱。
在培養細胞額外5天後，分析細胞之抗原特異性T細胞擴增及記憶前驅體表面標記物(CD28及CD127)之表現。
結果：類似於裝載有合成抗原呈現珠粒之孔，具有包括抗原呈現共價功能化活化區之表面的孔通常能夠擴增MART1特異性T細胞(圖5A)，如相較於抗原呈現區活化520之結果的基於珠粒之活化510的FACs結果所展示。包括抗原呈現共價功能化區之幾乎所有孔產生較高數目之抗原特異性T細胞，其中相較於由合成抗原呈現珠粒提供之細胞產物530，藉由抗原呈現區產生之細胞540之抗原特異性T細胞之總數目約為兩倍更低(圖5B)。然而，當檢測到記憶前驅體表型標記物CD28及CD127之表現時，相較於針對藉由使用合成抗原呈現珠粒產生之抗原特異性T細胞所見的表現量(分別為圖5C之550 (CD28表現)及圖5D之570 (CD127表現))，觀測到使用具有抗原呈現活化區之孔產生的抗原特異性T細胞上之此等標記物之表現減小(分別為圖5C之560 (CD28表現)及圖5D之580 (CD127表現))。此表明儘管具有抗原呈現活化區之孔可支持抗原特異性T細胞擴增，但該等細胞更區別於使用合成抗原呈現珠粒擴增之細胞。此等結果進一步表明限制具有抗原呈現活化區之合成抗原呈現珠粒孔中之刺激面積可有利於一些細胞活化，諸如抗原特異性T細胞刺激。
實驗 8 .共價功能化區大小控制.為製備具有含淋巴球活化區(在此情況下，特別係用於活化T細胞抗原之抗原呈現共價功能化區)之孔，在標準組織培養微孔盤之底表面上具有不同受限面積的孔盤，如實驗1及2中所述，首先藉由7-疊氮基庚基三甲基矽烷功能化標準96孔圓底組織培養微孔盤(Corning)。隨後在水中製備由0.5 mM硫酸銅、0.1 mM抗壞血酸鈉及5 mM炔烴-PEG4-生物素組成之微量盤功能化混合物。使用自動化液體搬運機器人(OpenTrons)將0.25、0.5、1、2、4及8微升液滴之功能化混合物遞送至經塗佈微量盤之孔的中心。將微量盤保持在室溫下45分鐘，以准許炔烴生物素與微量盤反應。為鈍化剩餘疊氮化物且將孔之生物素功能化區限制至沈積功能化混合物之最初點樣受限區，將0.2 mL鈍化溶液(含5 mM DBCO-PEG4-甲酸之PBS)添加至各孔中。在室溫下進行此鈍化反應30分鐘。移除鈍化溶液，且在繼續進行之前，用0.2 mL PBS將孔洗滌一次。
為量測形成於孔之底部處的生物素呈現共價功能化區的各面積，隨後在室溫下藉由0.05 mL含與Alexa Fluor 488 (ThermoFisher 目錄號S11223)共軛之0.01 mg/mL抗生蛋白鏈菌素之PBS將孔染色30分鐘。洗滌掉抗生蛋白鏈菌素染色溶液，且藉由已經校準載片校準之反相螢光顯微鏡(EVOS, ThermoFisher)對點進行成像。隨後藉由沿若干方向在斑點之影像兩端以ImageJ形成線且求長度之平均值來量測所得圓形點之面積。隨後使用將環之半徑與其面積相關聯之公式來計算點之面積。
結果 . 增大功能化混合物之體積使得所得功能化區之大小整體增大(圖6A)。為量化功能化滴液體積與功能化面積之間的關係，量測0.25、0.5、1或2微升液滴之螢光光點面積。隨後計算光點面積對比滴液體積之線性擬合(圖6B)。隨後，此擬合用於估計使用4微升及8微升液滴製備之功能化區之面積。各共價功能化區之此等直接量測面積及間接量測面積用於以下實驗。
實驗 9. 製備具有用於活化之受限區域(限制於孔之底表面的中心區域)之抗生蛋白鏈菌素功能化孔盤。如上文實驗1及2中所述，藉由CVD首先用7-疊氮基庚基三甲基矽烷塗佈標準96孔圓底組織培養微量盤(Corning)。隨後在水中製備由0.5 mM硫酸銅、0.1 mM抗壞血酸鈉及5 mM炔烴-PEG4-生物素(Click Chemistry Tools, 目錄號TAT105-100)組成之微量盤功能化混合物。使用自動化液體搬運機器人(OpenTrons)將1.00微升液滴之微量盤功能化混合物遞送至經塗佈微量盤之孔的中心。基於實驗8，圖6B之結果，此在各孔之底部處產生約2 mm直徑光點。將微量盤保持在室溫下45分鐘以准許炔烴-PEG4-生物素試劑之炔烴官能基與微量盤反應。為鈍化剩餘疊氮化物且將孔之生物素功能化區限制至初始約2 mm直徑光點，將0.2 mL鈍化溶液(含5 mM DBCO-PEG4-甲酸(Sigma Aldrich, 目錄號759902-5mg)之PBS)添加至各孔中。在室溫下進行此鈍化反應30分鐘。移除鈍化溶液，且在繼續進行之前，用0.2 mL PBS將孔洗滌兩次。
為製備用於結合生物素共軛肽-HLA (pHLA，初始刺激)及協同刺激抗體之孔，將0.05 mL 0.25 mg/mL抗生蛋白鏈菌素添加至各孔中且在室溫下培育30分鐘。藉由用0.2 mL PBS將各孔洗滌兩次來移除過量抗生蛋白鏈菌素。
實驗 10. 具有T細胞活化物種之區域受限抗生蛋白鏈菌素呈現孔盤之功能化.為將pHLA (具有用於位點特異性生物素化之C端BirA標籤，具有預裝載至MHC中之MART1抗原肽的抗原肽裝載位點特異性生物素化單體MHC分子)裝載至各孔中之抗生蛋白鏈菌素呈現功能化點上，將生物素化pHLA於具有0.1% BSA之PBS中之0.05 mL 0.83微克/毫升溶液添加各抗生蛋白鏈菌素功能化孔中。在室溫下30分鐘後，移除pHLA溶液，且將生物素化抗CD28 (Biolegend, 目錄號302904，呈2.5微克/毫升)及生物素化抗CD2 (Biolegend, 目錄號23002040，呈2.5微克/毫升)於具有0.1% BSA之PBS中之5微克/毫升(總抗體)溶液添加至各孔中。30分鐘後，藉由用0.2 mL PBS-BSA將各孔洗滌兩次來移除功能化劑。各處理孔包括抗原呈現共價功能化活化區，受限於最初點樣面積。在製備功能化微孔板之同一天刺激T細胞並儲存於4℃下直至接種細胞。
實驗 11. 與標準孔盤內存在合成抗原呈現活化珠粒的情況下之刺激及擴增相比較的具有受限活化區之功能化孔盤之孔中之T細胞抗原特異性刺激及擴增.使用EasySep™人類CD8+ T細胞分離套組(StemCell Technologies)根據製造商的建議程序將CD8+ T細胞與外周血液單核細胞分離。將富集的CD8+ T細胞以1e6/mL再懸浮於具有30奈克/毫升之IL-21之生長培養基(R&D Systems)中。生長培養基由補充有10%人類AB血清(Corning CellGro)加上GlutaMax (Thermo Fisher)及50微莫耳β巰基乙醇(Thermo Fisher)之高級RPMI 1640培養基(Thermo Fisher)組成。
隨後CD8+ T細胞***成兩個樣本用於藉由標準孔盤內或實驗10之區域受限抗原呈現活化孔盤內之抗原呈現活化珠粒刺激。對於抗原呈現活化珠粒刺激，以1:1比率將MART1抗原呈現活化珠粒(如2018年7月20日申請的PCT/US2018/043146中所述來製備，全部揭示內容以全文引用之方式併入本文中)添加至細胞中。將200,000個細胞接種至標準96孔圓底組織培養微量盤之各孔。對於區域受限抗原呈現活化孔盤刺激，如實驗10中所述製備之區域受限抗原呈現活化孔盤之每孔經接種200,000個細胞。隨後將盤在標準5% CO2 ，37℃培育箱中培育兩天。培養兩天後，在生長培養基中，IL-21經稀釋至150奈克/毫升。將培養基中稀釋之五十微升IL-21經添加至各孔，且將盤返回至培育箱中用於額外培養。
在總計七天培養後，細胞經再刺激。對於抗原呈現活化珠粒再刺激，自盤之各孔移除50微升培養基。在新製培養基中，IL-21經稀釋至150 ng/mL且以4e6珠粒/毫升之最終密度將抗原呈現活化珠粒添加至IL-21/培養基混合物中。將50微升此IL-21/珠粒/培養基混合物添加至各孔中，使得將額外2e5抗原呈現活化珠粒至各孔中。
對於區域受限抗原呈現活化孔盤再刺激，自盤之各孔移除50微升培養基。藉由重複吸移使孔中之細胞再懸浮且將剩餘體積(約0.2毫升/孔)轉移至新製備的區域受限抗原呈現活化孔盤，該孔盤如實驗9中所述來製備。在新製生長培養基中，IL-21經稀釋至150 ng/mL，且將50微升此IL-21/生長培養基混合物添加至新製備的區域受限抗原呈現活化孔盤之各孔中。
次日，自培育箱移除盤，且再次自每一孔移除50微升培養基。IL-2 (R&D Systems)於新製培養基中稀釋至50個單位/毫升。以12.5 ng/mL之最終濃度將IL-7 (R&D Systems)添加至含有IL-2之此培養基中。將50微升此IL-2/IL-7/培養基混合物添加至兩組孔盤之每一孔中，且將孔盤返回至培育箱。
次日，自培育箱移除盤，且再次自每一孔移除50微升培養基。IL-21於新製培養基中稀釋至150奈克/毫升。將50微升此IL-21/培養基混合物添加至兩個孔盤之各孔中，且將孔盤返回至培育箱。
培養細胞額外5天後，分析來自每組區域受限抗原呈現活化孔盤及抗原呈現活化珠粒孔盤之細胞的抗原特異性T細胞擴增及記憶前驅體表面標記物(CD28及CD127)之表現。
表徵 . 在兩輪刺激後，自抗原呈現活化珠粒及區域受限抗原呈現活化孔盤之各孔收集50微升樣品。用洗滌緩衝液(PBS+2%胎牛血清+5 mM EDTA)將細胞洗滌一次。隨後藉由抗CD4 (Brilliant VioletTM 510, BioLegend目錄號300545)、CD8 (PerCP-Cy5.5, BioLegend目錄號344709)、CD28 (FITC, BioLeend目錄號302906)、CD45RO (APC, BioLegend目錄號304210)、CD127 (BV420, BioLegend 目錄號351309)之抗體以及標記抗原特異性T細胞之四聚體試劑(pMHC四聚體, PE)之混合物對細胞進行染色。在室溫下在暗處對細胞進行染色30分鐘且接著用洗滌緩衝液洗滌一次。細胞經再懸浮於具有0.01 mL CountBrightTM 珠粒(ThermoFisher目錄號C36950)之0.15 mL洗滌緩衝液/孔中。隨後在具有高輸送量樣本(BD Biosciences)之FACSCelesta流式細胞儀(Becton Dickinson and 公司)上分析細胞群。根據製造商建議協定根據樣本中收集的細胞及CountBright珠粒之數目來計算樣本中之總細胞計數。在FlowJo (FlowJo)中分析流式細胞量測樣本以測定抗原特異性T細胞頻率及記憶前驅體標記物(CD27、CD28、CD62L及CD127)之表現。
在FlowJo (FlowJo)流式細胞量測術分析軟體程式中分析流式細胞量測樣本之抗原特異性T細胞頻率。此分析指示區域受限抗原呈現活化孔盤始終產生較高數目之抗原特異性T細胞(圖6B)。流動式細胞量測分析指示相對於使用抗原呈現活化珠粒之活化，區域受限抗原呈現活化孔盤產生相等數目之抗原特異性T細胞(圖7A)。圖7C展示區域受限活化孔中每孔產生之抗原陽性T細胞數目相較於每孔使用抗原呈現活化珠粒產生之抗原陽性T細胞數目的圖形比較。此外，當分析抗原特異性T細胞之CD127表現及高水準之CD28時，吾等觀測到區域受限抗原呈現活化孔盤產生表現記憶前驅體T細胞之此等標記物之相等或更高分率之抗原特異性T細胞(圖7D)。因此，區域受限抗原呈現活化孔盤中之刺激為高產性的且產生具有良好中心記憶表型之活化T細胞(例如，指示記憶前驅體T細胞)，且等效於使用合成抗原呈現活化珠粒的活化。
實驗 12. 抗原呈現功能化區域面積與細胞產物產量及表型之比較.製備具有含用於活化T細胞之抗原呈現共價功能化區之孔的孔盤，該等孔經製備具有介於約1平方毫米至約23平方毫米範圍內的面積。如圖8A中所展示，產生六個不同大小的區域：1 mm2 ；1.7 mm2 ；3.3 mm2 ；5.5 mm2 ；11.5 mm2 及23 mm2 (圖8A之各圖解圖式上之標記標識區域的大小)。以類似於實驗8中所述之方法的方式，藉由將不同體積之0.5 mM硫酸銅、0.1 mM抗壞血酸鈉及5 mM炔烴-PEG4-生物素沈積至如同實驗1及2製備之具有疊氮基呈現共價功能化表面的圓底96孔微量盤之孔中來控制共價功能化區的大小。在如上所述(實驗8及9)鈍化剩餘疊氮基部分後，如實驗8及9中所述，抗生蛋白鏈菌素結合至生物素呈現共價功能化區。初始活化分子pHLA (具有用於位點特異性生物素化之C端BirA標籤，具有預裝載至MHC中之MART1抗原肽的抗原肽裝載位點特異性生物素化單體MHC分子)及共活化分子(協同刺激抗體生物素化抗CD28及生物素化抗CD2)結合至孔中之每一者的底表面上之所得抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區，以在該等孔中之每一者的底表面上產生抗原呈現共價功能化區，如實驗10中所述。
具有不同大小之抗原呈現共價功能化活化區之孔內的T細胞活化及擴增.如上文實驗11中所述，抗原特異性T細胞經活化且擴增。當在第二輪刺激中需要孔盤之表面的第二新製抗原呈現共價功能化區時，為孔盤之各孔匹配相同大小之活化區。完成兩輪刺激後，自各孔收集0.05 mL細胞樣本，且測定抗原特異性T細胞之頻率以及抗原特異性T細胞中CD28及CD127之表現。
結果.如圖8A至8D中所展示，針對面積為約或剛超過1 mm2 之孔之抗原呈現活化區，見到刺激及擴增。然而，抗原特異性T細胞之產量通常隨著抗原呈現區之面積自約1 mm2 (1.29%細胞產物為抗原特異性)增大至23 mm2 (34.8%細胞產物為抗原特異性且CD8較高。應注意低於流式細胞量測術閘控截止值之群體為抗原特異性但相對於選定閘控臨限值具有下調CD8)而增大，其中如圖8B中所展示，所產生得抗原特異性T細胞的量相對於活化面積(抗原呈現區)通常為線性的。與抗原呈現區之面積無關，抗原特異性T細胞中之CD28表現始終較高(圖8C)。然而，隨著抗原呈現區之面積增大，抗原特異性T細胞之CD127表現增大，從而指示更大抗原呈現區面積更佳地支持CD127+ T細胞之擴增(圖8D)。此指示面積為約5-30 mm2 之抗原呈現共價功能化區提供保持記憶前驅體標記物CD127之高表現量的抗原特異性T細胞的優化擴增。如實驗7中所述及圖5A至5D中所展示，此結果與不限制抗原呈現活化/刺激之面積產生的T細胞之表型形成鮮明對比。
當構件或元件在本文中被稱作「在另一構件或元件上」時，其可直接在其他構件或元件上或亦可存在中間構件及/或元件。對比而言，當構件或元件被稱作「直接在另一構件或元件上方」時，不存在中間構件或元件。亦將理解，當構件或元件被稱為「連接」、「附著」或「耦接」至另一構件或元件時，其可能直接地連接、附著或耦接至另一構件或元件或可存在中間構件或元件。相比之下，當構件或元件被稱為「直接地連接」、「直接地附著」或「直接地耦接」至另一構件或元件時，不存在中間構件或元件。儘管相對於一個實施例描述或展示，但如此描述或展示之構件及元件可應用於其他實施例。熟習此項技術者亦將瞭解，提及「鄰接」另一構件安置的結構或構件可具有與鄰接構件重疊或位於其之下的部分。
本文中所使用之術語僅為了描述特定實施例，且並不意欲限制本發明。舉例而言，如本文中所用，除非上下文另外明確指示，否則單數形式「一(a/an)」及「該(the)」意欲同樣包括複數形式。應進一步理解，術語「包含(comprises/comprising)」在用於本說明書中時，指明所陳述之構件、步驟、操作、元件及/或組件之存在，但不排除一或多個其他構件、步驟、操作、元件、組件及/或其群組之存在或添加。如本文所使用，術語「及/或」包括相關聯所列項目中之一或多者的任一者及所有組合，且可縮寫為「/」。
為易於描述，本文中可使用空間相對術語，諸如「在…下」、「低於」、「下部」、「在…上方」、「上部」及類似者來描述如圖式中說明之一個元件或構件與另一元件或構件之關係。應理解，空間相對術語意欲涵蓋在使用或操作中之裝置除圖中所描繪之定向以外的不同定向。舉例而言，若圖中之裝置經翻轉，則描述為在其他元件或構件「下」或「下方」之元件可接著定向於其他元件或構件「上方」。因此，例示性術語「在…下」可涵蓋在…上方及在…下的定向兩者。裝置可以其他方式定向(旋轉90度或處於其他定向)，且本文中所使用的空間相對描述詞可相應地進行解釋。類似地，除非另外特別指示，否則本文中所使用的術語「向上」、「朝下」、「豎直」、「水平」及其類似者僅用於解釋之目的。
儘管本文中可使用術語「第一」及「第二」描述不同構件/元件(包括步驟)，但除非上下文另外指示，否則此等構件/元件不應受此等術語限制。此等術語可用於將一個構件/元件與另一構件/元件區分開來。因此，在不背離本發明之教示的情況下，下文論述之第一構件/元件可稱為第二構件/元件，且類似地下文論述之第二構件/元件可稱為第一構件/元件。
在整個說明書及隨附申請專利範圍中，除非本文另有指明，否則字詞「包含(comprise)」及其變化形式，諸如「包含(comprises/comprising)」意謂各個組件可共同地應用於方法及製品(例如，包括裝置之組合物及設備以及方法)。舉例而言，術語「包含」應理解為暗示包括任何指明的元件或步驟，而非排除任何其他元件或步驟。
如本文說明書及申請專利範圍中所用(包括如實例中所用)，且除非另外明確指明，否則所有數字可讀作如同以字詞「約」或「大致」開頭，即使該術語並未明確地呈現。當描述程度及/或位置時，可使用片語「約」或「大致」以指示所描述值及/或位置在值及/或位置之合理的預期範圍內。舉例而言，數值可具有為+/-0.1%之規定值(或值範圍)、+/-1%之規定值(或值範圍)、+/-2%之規定值(或值範圍)、+/-5%之規定值(或值範圍)、+/-10%之規定值(或值範圍)等之值。本文所列舉之任何數值範圍意欲包括其中包含之所有子範圍。
儘管上文描述不同說明性實施例，但在不背離如申請專利範圍所述之本發明之範疇的情況下，可對各種實施例進行多種改變中之任一者。舉例而言，在替代實施例中，可經常改變執行不同的所描述方法步驟之順序，且在其他替代實施例中，可完全跳過一或多個方法步驟。不同裝置及系統實施例之視情況存在之構件可包括在一些實施例中且並不在其他實施例中。因此，前述描述出於例示性目的而主要地提供且不應解釋為限制如申請專利範圍中所闡述的本發明之範疇。
舉例而言且並不限制，本文中包括之實例及說明展示主題可經實踐之特定實施例。如所提及，可利用其他實施例且自本文中導出其他實施例，使得可在不脫離本發明之範疇的情況下作出結構及邏輯的替代及改變。本發明主題之此等實施例在本文中可個別地或集體地由術語「本發明」提及，此僅僅出於方便起見且不意欲將本申請案之範疇自願地限於任何單一發明或發明性概念(在事實上揭示多於一個概念之情況下)。因此，儘管本文中已說明且描述特定實施例，但應瞭解，經計算以實現相同目的之任何配置皆可替代所示之特定實施例。本發明意欲涵蓋各種實施例之任何及所有調適或變化。上述實施例及本文中未具體描述之其他實施例的組合對於熟習此項技術者在審閱上述描述之後將為顯而易見的。本發明之一些實施例之清單 .
1.一種孔盤，其包括具有第一區域之表面，該第一區域為反應性部分呈現共價功能化區或活化部分呈現共價功能化區，其中該反應性部分為疊氮基部分、生物素部分或抗生蛋白鏈菌素部分且該活化部分為淋巴球活化部分。
2.如實施例1之孔盤，其中該第一區域之面積為至少0.5 mm2 。在某些特定實施例中，該第一區域之面積為至少0.6 mm2 、至少0.7 mm2 、至少0.8 mm2 、至少0.9 mm2 、至少1.0 mm2 、至少1.1 mm2 、至少1.2 mm2 、至少1.3 mm2 、至少1.4 mm2 、至少1.5 mm2 、至少1.6 mm2 、至少1.7 mm2 、至少1.8 mm2 、至少1.9 mm2 、至少2.0 mm2 、至少2.5 mm2 、至少3.0 mm2 、至少3.5 mm2 、至少4.0 mm2 、至少4.5 mm2 、至少5.0 mm2 、至少6.0 mm2 、至少7.0 mm2 、至少8.0 mm2 、至少9.0 mm2 、至少10 mm2 、至少15 mm2 、至少20 mm2 、至少25 mm2 、至少30 mm2 或由前述終點中之兩者形成之任何範圍。在其他特定實施例中，該第一區域之面積為約0.5 mm2 至約50 mm2 、約1.0 mm2 至約40 mm2 、約2 mm2 至約35 mm2 、約3 mm2 至約30 mm2 或約4 mm2 至約25 mm2 。
3.如實施例1或2之孔盤，其中該第一區域之尺寸為約0.5至約4.0 mm (例如，約1.0 mm至約3.5 mm，或約1.5 mm至約3.0 mm)。
4.如實施例1至3中任一項之孔盤，其中該第一區域為實質上圓形且具有約0.5 mm至4.0 mm (例如，約1.0 mm至約3.5 mm，或約1.5 mm至約3.0 mm)之直徑。
5.如實施例1至4中任一項之孔盤，其中該孔盤之該表面進一步包括第二區域，該第二區域為包括表面阻斷配位體之共價修飾區，且視情況其中該第二區域包圍該第一區域。
6.如實施例1至5中任一項之孔盤，其中該孔盤之該表面包括玻璃或聚苯乙烯。
7.如實施例1至5中任一項之孔盤，其中該孔盤之該表面包括聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、環烯烴共聚物或三聚氰胺。
8.如實施例1至7中任一項之孔盤，其中該第一區域之密度為至少50個各別反應性部分或活化部分/平方微米。
9.如實施例1至8中任一項之孔盤，其中該第一區域包括經由連接子共價連接至該表面之各別反應性部分或活化部分，該連接子具有5個至約20個主鏈原子、約10個至約40個主鏈原子或約15個至約50個主鏈原子，該等主鏈原子選自碳、矽、氮及氧。替代地，可經由連接子之一系列約5個、7個、9個、10個、11個、13個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、90個、100個、200個鍵長度或其間的任何數目之鍵長度將該反應性部分或活化部分共價連接至該表面。
10.如實施例1至9中任一項之孔盤，其中該反應性部分為抗生蛋白鏈菌素，且該抗生蛋白鏈菌素官能基共價附著於該孔盤之該表面的該第一區域。
11.如實施例1至9中任一項之孔盤，其中該反應性部分為抗生蛋白鏈菌素，且該抗生蛋白鏈菌素官能基非共價地附著於生物素部分，該生物素部分自身共價附著於該孔盤之該表面的該第一區域。
12.如實施例1至11中任一項之孔盤，其中該第一區域為活化部分呈現共價功能化區，其包括複數個特異性結合的初始活化分子配位體及複數個特異性結合的共活化分子配位體。
13.如實施例12之孔盤，其中該表面之該第一區域上之該初始活化分子配位體與該共活化分子配位體之比率為約1:10至約2:1、約1:5至約2:1、約1:2至約2:1、約1:10至約1:1、約1:5至約1:1、約1:1至約2:1或約1:2至約1:1。
14.如實施例12或13之孔盤，其中該複數個特異性結合的初始活化分子配位體中之各配位體包括經組態以結合於T細胞之T細胞受體(TCR)的主要組織相容複合體(MHC)分子(例如，I類或II類)。
15.如實施例14之孔盤，其中該MHC分子包括I類MHC蛋白序列及β微球蛋白蛋白序列。
16.如實施例14或15之孔盤，其中該複數個特異性結合的初始活化分子配位體中之各配位體包括MHC分子，該MHC分子進一步包括抗原肽。
17.如實施例16之孔盤，其中該抗原肽為腫瘤相關抗原、病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原或原蟲抗原。
18.如實施例17之孔盤，其中該抗原肽為腫瘤相關抗原，且視情況其中該腫瘤相關抗原為SLC45A2、TCL1、VCX3A、MART1或NYESO1。
19.如實施例14至18中任一項之孔盤，其中該MHC分子經由C端鍵連接至該活化部分呈現共價功能化區。
20.如實施例12至19中任一項之孔盤，其中該複數個特異性結合的共活化分子配位體中之各配位體包括T細胞受體(TCR)共活化分子或輔助TCR活化分子。
21.如實施例20之孔盤，其中該複數個共活化分子配位體之該等TCR共活化分子與該等輔助TCR活化分子之比率為約100:1至約1:100。
22.如實施例20或21之孔盤，其中該複數個共活化分子配位體之該等TCR共活化分子與該等輔助TCR活化分子之比率為100:1至90:1、90:1至80:1、80:1至70:1、70:1至60:1、60:1至50:1、50:1至40:1、40:1至30:1、30:1至20:1、20:1至10:1、10:1至1:1、3:1至1:3；1:1至1:10、1:10至1:20、1:20至1:30、1:30至1:40、1:40至1:50、1:50至1:60、1:60至1:70、1:70至1:80、1:80至1:90或1:90至1:100，其中前述值中之每一者由「約」修飾。
23.如實施例20至22中任一項之孔盤，其中該複數個特異性結合的共活化分子配位體之該等TCR共活化分子與該等輔助TCR活化分子之比率為約20:1至約1:20或約3:1至約1:3。
24.如實施例20至23中任一項之孔盤，其中該等TCR共活化分子包括CD28結合蛋白或其保留對於CD28之結合能力的片段，且視情況，其中該CD28結合蛋白或該其片段進一步包括位點特異性C端生物素部分。
25.如實施例20至24中任一項之孔盤，其中該等TCR共活化分子包括CD80分子或其片段，其中該片段保留對於CD28之結合活性。
26.如實施例20至25中任一項之孔盤，其中該等TCR共活化分子包括抗CD28抗體或其片段，其中該片段保留對於CD28之結合活性。
27.如實施例20至26中任一項之孔盤，其中該輔助TCR活化分子包括CD2結合蛋白或其保留對CD2之結合活性的片段，且視情況其中該CD2結合蛋白或該其片段進一步包括位點特異性C端生物素部分。
28.如實施例20至27中任一項之孔盤，其中該輔助TCR活化分子包括CD58分子或其片段，其中該片段保留與CD2之結合活性。
29.如實施例20至28中任一項之孔盤，其中該輔助TCR活化分子包括抗CD2抗體或其片段，其中該片段保留與CD2之結合活性。
30.如實施例12至29中任一項之孔盤，其中該複數個特異性結合的初始活化分子配位體及該複數個特異性結合的共活化分子配位體特異性結合於該孔盤之抗生蛋白鏈菌素呈現第一區域之抗生蛋白鏈菌素官能基。
31.如實施例12至30中任一項之孔盤，其中在該第一區域中，該複數個特異性結合的初始活化分子配位體之密度為至少約1 × 102 個分子/平方微米，且視情況在該第一區域中，密度為約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米。
32.如實施例12至31中任一項之孔盤，其中在該第一區域中，該複數個特異性結合的共活化分子配位體之密度為至少1 × 102 個分子/平方微米或約1 × 103 至約1 × 105 個分子/平方微米。
33.一種孔盤，其中該孔盤之一或多個孔中之每一者包括如實施例1至32中任一項之孔盤之該表面及該其第一區域(亦即，該表面可為單一孔之內表面且該孔盤可具有一或多個此類表面)。
34.如實施例33之孔盤，其中該一或多個孔中之每一者的該第一區域位於該對應孔之底表面上。
35.如實施例32之孔盤，其中各第一區域之面積可小於約50%、小於約25%、小於約15%、小於約10%、小於約5%或小於約2%之該對應孔之該底表面的面積。
36.如實施例5至35中任一項之孔盤，其中該等表面阻斷配位體中之每一者包括親水性或帶負電荷部分。
37.如實施例36之孔盤，其中該等表面阻斷配位體包括聚乙二醇(PEG)部分。
38.一種活化T淋巴球(T細胞)之方法，其包括使複數個T細胞與孔盤之表面的抗原呈現共價功能化區接觸，其中該抗原呈現共價功能化區包括：複數個初始活化分子配位體，其各自包括經組態以結合至T細胞之T細胞受體(TCR)的主要組織相容複合體(MHC)分子(例如，I類或II類)，其中該複數個初始活化分子配位體中之每一者連接至該表面；及複數個共活化分子配位體，其各自包括T細胞受體(TCR)共活化分子或輔助TCR活化分子，其中該等共活化分子配位體中之每一者連接至該表面；且與該表面之該抗原呈現共價功能化區接觸培養該複數個T細胞，進而將該複數個T細胞中之至少一部分轉化為活化T細胞。
39.如實施例38之方法，其中該等T細胞包括CD8+ T細胞。
40.如實施例38或39之方法，其中該抗原呈現共價功能化區為如實施例12至33中任一項之孔盤之表面的第一區域。
41.如實施例38至40中任一項之方法，其中該複數個共活化分子配位體包括TCR共活化分子及輔助TCR活化分子。
42.如實施例38至41中任一項之方法，其中該複數個共活化分子配位體之該等TCR共活化分子與該等輔助TCR活化分子之比率為約100:1至約1:100。
43.如實施例38至42中任一項之方法，其中該複數個共活化分子配位體之該等TCR共活化分子與該等輔助TCR活化分子之比率為100:1至90:1、90:1至80:1、80:1至70:1、70:1至60:1、60:1至50:1、50:1至40:1、40:1至30:1、30:1至20:1、20:1至10:1、10:1至1:1、3:1至1:3；1:1至1:10、1:10至1:20、1:20至1:30、1:30至1:40、1:40至1:50、1:50至1:60、1:60至1:70、1:70至1:80、1:80至1:90或1:90至1:100，其中前述值中之每一者由「約」修飾。
44.如實施例38至43中任一項之方法，其中該複數個共活化分子配位體之該等TCR共活化分子與該等輔助TCR活化分子之比率為約20:1至約1:20或約3:1至約1:3。
45.如實施例38至44中任一項之方法，其中該複數個MHC分子中之各分子包括I類MHC蛋白序列、β巨球蛋白及抗原肽。
46.如實施例45之方法，其中該MHC分子之該蛋白序列經由該蛋白序列之C端連接而連接至該表面之該抗原呈現共價功能化區。
47.如實施例38至46中任一項之方法，其中該MHC分子包括生物素部分且經由與抗生蛋白鏈菌素之非共價相互作用而附著至該表面之該抗原呈現共價功能化區。
48.如實施例47之方法，其中該抗生蛋白鏈菌素自身共價鍵結至該表面之該抗原呈現共價功能化區。
49.如實施例48之方法，其中該抗生蛋白鏈菌素經由一系列約5個、7個、9個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、95個、100個、200個鍵長度或其間的任何數目之鍵長度鍵結至該表面。
50.如實施例47之方法，其中該抗生蛋白鏈菌素與該表面之該抗原呈現共價功能化區非共價締合。
51.如實施例47或50之方法，其中該抗生蛋白鏈菌素與生物素部分非共價締合，且該生物素部分共價鍵結於該表面之該抗原呈現共價功能化區。
52.如實施例51之方法，其中經由一系列約5個、7個、9個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、95個、100個、200個鍵長度或其間的任何數目之鍵長度藉由連接子將該生物素連接至該表面。
53.如實施例39至52中任一項之方法，其中該抗原肽為腫瘤相關抗原、病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原或原蟲抗原。
54.如實施例53之方法，其中該抗原肽為腫瘤相關抗原，且視情況其中該腫瘤相關抗原為SLC45A2、TCL1、VCX3A、MART1或NYESO1。
55.如實施例38至54中任一項之方法，其中該複數個共活化分子配位體中之每一者連接至該表面之該抗原呈現共價功能化區。
56.如實施例38至55中任一項之方法，其中該T細胞受體(TCR)共活化分子包括CD28結合蛋白或其保留對於CD28之結合能力的片段。
57.如實施例56之方法，其中該CD28結合蛋白或該其片段進一步包括位點特異性C端生物素部分。
58.如實施例38至57中任一項之方法，其中該T細胞受體(TCR)共活化分子包括CD80分子或其片段，其中該片段保留對於CD28之結合活性。
59.如實施例38至58中任一項之方法，其中該T細胞受體(TCR)共活化分子包括抗CD28抗體或其片段，其中該片段保留對於CD28之結合活性。
60.如實施例38至59中任一項之方法，其中該輔助TCR活化分子包括CD2結合蛋白或其保留對於CD2之結合能力的片段。
61.如實施例60之方法，其中該CD2結合蛋白或該其片段進一步包括位點特異性C端生物素部分。
62.如實施例38至61中任一項之方法，其中該輔助TCR活化分子包括CD58分子或其片段，其中該片段保留與CD2之結合活性。
63.如實施例38至62中任一項之方法，其中該輔助TCR活化分子包括抗CD2抗體或其片段，其中該片段保留與CD2之結合活性。
64.如實施例38至63中任一項之方法，其中在該表面之該抗原呈現共價功能化區中，該複數個特異性結合的初始活化分子配位體之密度為至少約1 × 102 個分子/平方微米，或視情況在該表面之該抗原呈現共價功能化區中，密度為約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米。
65.如實施例38至64中任一項之方法，其中在該表面之該抗原呈現共價功能化區中，該複數個特異性結合的共活化分子配位體之密度為至少1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米，或視情況在該表面之該抗原呈現共價功能化區中，密度為約1 × 103 至約1×105 個分子/平方微米。
66.如實施例38至65中任一項之方法，其中該表面之該抗原呈現共價功能化區中之該等初始活化分子配位體與該等共活化分子配位體之比率為約1:10至約2:1、約1:5至約2:1、約1:2至約2:1、約1:10至約1:1、約1:5至約1:1、約1:1至約2:1或視情況，約1:2至約1:1。
67.如實施例38至66中任一項之方法，其中該複數個共活化分子配位體之該等TCR共活化分子與該等輔助TCR活化分子之比率為約3:1至約1:3。
68.如實施例38至67中任一項之方法，其中該複數個共活化分子配位體之該等TCR共活化分子與該等輔助TCR活化分子之比率為約2:1至約1:2。
69.如實施例38至68中任一項之方法，其中該複數個共活化分子配位體之該等TCR共活化分子與該等輔助TCR活化分子之比率為約1:1。
70.如實施例39至69中任一項之方法，其進一步包括使該複數個T細胞與複數個黏附性刺激分子配位體接觸，且視情況其中該複數個黏附性刺激分子配位體包括ICAM分子。
71.如實施例70之方法，其中該複數個黏附性刺激分子配位體共價附著於該孔盤之該表面的該抗原呈現共價功能化區外部的區域。
72.如實施例38至71中任一項之方法，其進一步包括使該複數個T細胞與複數個生長刺激性分子配位體接觸。
73.如實施例72之方法，其中該等生長刺激性分子配位體中之每一者包括生長因子受體配位體。
74.如實施例73之方法，其中該生長因子受體配位體包括IL-21或其片段。
75.如實施例72至74中任一項之方法，其中在至少一天之第一培養時段之後執行與該複數個生長刺激性分子配位體接觸。
76.如實施例38至75中任一項之方法，其中與該抗原呈現合成表面接觸培養係執行約四天至約七天的時段。
77.如實施例38至76中任一項之方法，其進一步包括：完成與該表面之該抗原呈現共價功能化區接觸之第一活化時段；且與該表面之該抗原呈現共價功能化區接觸培養該複數個活化T細胞持續第二培養時段，進而提供擴增的複數個活化T細胞。
78.如實施例77之方法，其進一步包括在該第二培養時段期間添加第二複數個生長刺激性分子配位體。
79.如實施例77或78之方法，其中添加複數個IL-2分子及複數個IL-7分子以接觸該活化T細胞持續該第二培養時段之剩餘時間。
80.如實施例76至79中任一項之方法，其中與該表面之該抗原呈現共價功能化區接觸培養係執行約四天至約七天的時段。
81.如實施例77至80中任一項之方法，其進一步包括：完成與該表面之該抗原呈現共價功能化區接觸之第二活化時段；且與該表面之該抗原呈現共價功能化區接觸培養該擴增的複數個活化T細胞持續第三培養時段，進而提供複數個高度活化的T細胞。
82.如實施例81之方法，其進一步包括在該第三培養時段期間添加第三複數個生長刺激性分子配位體。
83.如實施例81或82之方法，其中添加複數個IL-2分子及複數個IL-7分子以接觸該等活化T細胞持續該第三培養時段之剩餘時間。
84.如實施例81至83中任一項之方法，其中與該表面之該抗原呈現共價功能化區接觸的該培養係執行持續約四天至約七天之第三時段。
85.如實施例38至84中任一項之方法，其中該活化T細胞為CD45RO+。
86.如實施例38至85中任一項之方法，其中該活化T細胞為CD28陽性。
87.如實施例38至86中任一項之方法，其中該抗原呈現功能化區之面積小於約50%、小於約25%、小於約15%、小於約10%、小於約5%或小於約2%之該孔盤之孔的底表面面積。
88.一種活化淋巴球之方法，其包括使複數個淋巴球與孔盤之表面的活化部分呈現共價功能化區接觸，其中該活化部分呈現共價功能化區包括連接至該表面之複數個初始活化分子配位體；及連接至該表面之複數個共活化分子配位體；且培養該複數個淋巴球，進而將該複數個淋巴球中之至少一部分轉化為活化淋巴球。
89.如實施例88之方法，其中該等淋巴球包括B細胞、T細胞或NK細胞。
90.如實施例88或89之方法，其中該活化部分呈現共價功能化區為如實施例1至13中任一項之孔盤之表面的第一區域。
91.如實施例88至90中任一項之方法，其中該等初始活化分子配位體包括CD3結合分子或MHC分子(例如，I類MHC或II類MHC)。
92.如實施例91之方法，其中該複數個MHC分子各自包括I類MHC蛋白序列及β微球蛋白蛋白序列。
93.如實施例91或92之方法，其中該MHC分子進一步包括抗原肽。
94.如實施例93之方法，其中該CD3結合蛋白為抗體或其保留結合親和力之片段。
95.如實施例88至94中任一項之方法，其中該複數個共活化分子配位體包括TCR共活化分子及輔助TCR活化分子。
96.如實施例88至95中任一項之方法，其中該複數個共活化分子配位體包括CD2結合分子及/或CD28結合分子。
97.如實施例95或96之方法，其中存在超過一種類型之共活化分子配位體，不同共活化分子配位體的比率為約20:1至約1:20，或約3:1至約1:3。
98.如實施例88至97中任一項之方法，其中在該表面之該活化部分呈現共價功能化區中，該複數個特異性結合的初始活化分子配位體之密度為至少約1 × 102 個分子/平方微米或約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米。
99.如實施例88至98中任一項之方法，其中在該表面之該活化部分呈現共價功能化區中，該複數個特異性結合的共活化分子配位體之密度為至少1 × 102 個分子/平方微米或約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米、或約1 × 103 至約1 × 105 個分子/平方微米。
100.如實施例88至99中任一項之方法，其中該活化部分呈現共價功能化區中之該等初始活化分子配位體與該等共活化分子配位體之比率為約1:10至約2:1、約1:5至約2:1、約1:2至約2:1、約1:10至約1:1、約1:5至約1:1、約1:1至約2:1或約1:2至約1:1。
101.如實施例88至100中任一項之方法，其進一步包括使該複數個淋巴球與複數個生長刺激性分子配位體接觸。
102.如實施例101之方法，其中該等生長刺激性分子配位體中之每一者包括生長因子受體配位體。
103.如實施例102之方法，其中該生長因子受體配位體包括IL-21或其片段。
104.如實施例101至103中任一項之方法，其中在至少一天之第一培養時段之後執行與該複數個生長刺激性分子配位體接觸。
105.如實施例88至104中任一項之方法，其中與該活化部分呈現共價功能化區接觸培養係執行約四天至約七天時段。
106.如實施例89至107中任一項之方法，其中該活化部分呈現功能化區之面積小於約25%、小於約15%、小於約10%、小於約5%或小於約2%之該孔盤之孔的底表面面積。
107.一種用於製備孔盤之套組，該孔盤包括具有活化部分呈現共價功能化區之表面，該套組包括：包括包含反應性部分呈現共價功能化區之表面的孔盤，其中該反應性部分為疊氮基部分、生物素部分或抗生蛋白鏈菌素部分；及活化劑；及視情況，表面功能化劑。
108.如實施例107之套組，其中該套組包括該表面功能化劑，且其中該表面功能化劑為經組態以與該反應性部分反應的含有生物素之試劑或含有抗生蛋白鏈菌素之試劑。
109.如實施例108之套組，其中該套組進一步包括含生物素之試劑及含抗生蛋白鏈菌素之試劑兩者。
110.如實施例107至109中任一項之套組，其中包括包含該反應性部分呈現共價功能化區之該表面的該孔盤為如實施例1至11中任一項之孔盤、如實施例31至33中任一項之孔盤或如實施例33至37中任一項之具有反應性部分呈現共價功能化區之孔盤。
111.如實施例107至110中任一項之套組，其中該活化劑包括初始活化劑，該初始活化劑包括複數個主要組織相容複合體(MHC)分子(例如，I類或II類)，該複數個主要組織相容複合體分子經組態以與該T細胞之T細胞受體結合且經組態以結合於抗生蛋白鏈菌素之結合位點或複數個CD3結合分子。
112.如實施例107至111中任一項之套組，其進一步包括共活化劑，該共活化劑包括各自經組態以結合抗生蛋白鏈菌素之結合位點的複數個共活化分子，且其中該等共活化分子中之每一者包括T細胞受體(TCR)共活化分子或輔助TCR活化分子。
113.如實施例112之套組，其中該複數個共活化分子包括T細胞受體(TCR)共活化分子及輔助TCR活化分子。
114.如實施例107至113中任一項之套組，其進一步包括共活化劑，該共活化劑包括各自經組態以結合抗生蛋白鏈菌素之結合位點的複數個共活化分子，且其中該等共活化分子中之每一者包括CD2結合分子或CD28結合分子。
115.如實施例107至114中任一項之套組，其進一步包括包含生長刺激性分子的試劑，其中各生長刺激性分子包括生長因子受體配位體。
116.如實施例115之方法，其中該生長因子受體配位體包括IL-21或其片段。
117.如實施例115或116之套組，其進一步包括第二生長刺激性分子，該第二生長刺激性分子包括IL-7或IL-2。
118.一種孔盤，其包括具有疊氮基呈現共價功能化區之表面。
119.如實施例118之孔盤，其中該孔盤之一或多個孔中之每一者包括具有疊氮基呈現共價功能化區之表面(亦即內表面)。
120.如實施例119之孔盤，其中該一或多個孔中之每一者的該疊氮基呈現共價功能化區位於該對應孔之底表面上。
121.如實施例118至120中任一項之孔盤，其中該孔盤之該表面或該孔盤之該一或多個孔的該表面包括玻璃或聚苯乙烯。
122.如實施例118至121中任一項之孔盤，其中該孔盤或一或多個孔之該表面包括聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、環烯烴共聚物或三聚氰胺。
123.如實施例118至122中任一項之孔盤，其中該疊氮基呈現共價功能化區之面積為至少0.5 mm2 。在某些特定實施例中，疊氮基呈現共價功能化區之面積為至少1.0 mm2 、至少2.0 mm2 、至少3.0 mm2 、至少4.0 mm2 、至少5.0 mm2 、至少6.0 mm2 、至少7.0 mm2 、至少8.0 mm2 、至少9.0 mm2 、至少10 mm2 、至少15 mm2 、至少20 mm2 、至少25 mm2 、至少30 mm2 、至少35 mm2 、至少40 mm2 、至少45 mm2 、至少50 mm2 、至少75 mm2 、至少100 mm2 、至少150 mm2 、至少200 mm2 、至少250 mm2 、至少300 mm2 、至少400 mm2 、至少500 mm2 、至少600 mm2 、至少700 mm2 、至少800 mm2 、至少900 mm2 、至少1,000 mm2 、至少2,000 mm2 、至少3,000 mm2 、至少4,000 mm2 、至少5,000 mm2 、至少6,000 mm2 、至少7,000 mm2 、至少8,000 mm2 、至少9,000 mm2 、至少10,000 mm2 、至少20,000 mm2 、至少30,000 mm2 、至少40,000 mm2 、至少50,000 mm2 、至少60,000 mm2 、至少70,000 mm2 、至少80,000 mm2 、至少90,000 mm2 、至少100,000 mm2 或更大(例如，孔盤之孔或兩個或更多個孔中之每一者之實質上全部內表面)。
124.如實施例118至123中任一項之孔盤，其中該疊氮基呈現共價功能化區之密度為至少50個疊氮基/平方微米。
125.如實施例118至124中任一項之孔盤，其中該疊氮基呈現共價功能化區包括經由具有五個或更多個主鏈原子之連接子共價連接至該表面之疊氮基官能基，該等主鏈原子選自碳、矽、氮及氧。在特定實施例中，連接子可具有5個至約20個主鏈原子、或約10個至約40個主鏈原子、或一系列約5個、7個、9個、10個、11個、13個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、90個、100個、200個鍵長度、其間的任何數目之鍵長度。
126.一種孔盤，其包括包含生物素呈現共價功能化區之表面。在某些實施例中，該表面包括複數個生物素呈現共價功能化區。
127.如實施例126之孔盤，其中該孔盤之一或多個孔中之每一者包括具有一個(或多個)生物素呈現共價功能化區之表面(亦即內表面)。
128.如實施例127之孔盤，其中該一或多個孔中之每一者的該等生物素呈現共價功能化區位於該對應孔之底表面上。
129.如實施例126至128中任一項之孔盤，其中該孔盤之該表面或該一或多個孔之該表面包括玻璃或聚苯乙烯。
130.如實施例126至129中任一項之孔盤，其中該孔盤之該表面或該一或多個孔之該表面包括聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、環烯烴共聚物或三聚氰胺。
131.如實施例126至130中任一項之孔盤，其中各生物素呈現共價功能化區之面積為至少0.5 mm2 。在某些特定實施例中，各生物素呈現共價功能化區之面積為至少1.0 mm2 、至少2.0 mm2 、至少3.0 mm2 、至少4.0 mm2 、至少5.0 mm2 、至少6.0 mm2 、至少7.0 mm2 、至少8.0 mm2 、至少9.0 mm2 、至少10 mm2 、至少15 mm2 、至少20 mm2 、至少25 mm2 、至少30 mm2 、至少35 mm2 、至少40 mm2 、至少45 mm2 或至少50 mm2 。在某些特定實施例中，各生物素呈現共價功能化區之面積不超過100 mm2 。
132.如實施例126至131中任一項之孔盤，其中各生物素呈現共價功能化區之密度為至少50個生物素官能基/平方微米。
133.如實施例126至132中任一項之孔盤，其中各生物素呈現共價功能化區包括經由連接子共價連接至該表面之生物素官能基，該連接子具有十個或更多個選自碳、矽、氮及氧之主鏈原子。在特定實施例中，連接子可具有約10個至約40個主鏈原子，或一系列約5個、7個、9個、10個、11個、13個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、90個、100個、200個鍵長度，其間的任何數目之鍵長度。
134.如實施例126至133中任一項之孔盤，其中各生物素呈現共價功能化區之面積小於約50%、小於約25%、小於約15%、小於約10%、小於約5%或小於約2%之該一或多個孔中之每一者之底表面面積。
135.如實施例126至134中任一項之孔盤，其中各生物素呈現共價功能化區之尺寸為0.5至4.0 mm (例如，約1.0 mm至約3.5 mm，或約1.5 mm至約3.0 mm)。
136.如實施例126至135中任一項之孔盤，其中各生物素呈現共價功能化區為實質上圓形且具有0.5至4.0 mm (例如，約1.0 mm至約3.5 mm或約1.5 mm至約3.0 mm)之直徑。
137.一種孔盤，其包括包含抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之表面。在某些實施例中，該表面包括複數個抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區。
138.如實施例137之孔盤，其中該孔盤之一或多個孔中之每一者包括具有一個(或多個)抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之表面(亦即內表面)。
139.如實施例138之孔盤，其中該一或多個孔中之每一者的該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區位於該對應孔之底表面上。
140.如實施例137至139中任一項之孔盤，其中該孔盤或一或多個孔之該表面包括玻璃或聚苯乙烯。
141.如實施例137至140中任一項之孔盤，其中該孔盤或一或多個孔之該表面包括聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、環烯烴共聚物或三聚氰胺。
142.如實施例137至141中任一項之孔盤，其中各抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之面積為至少0.5 mm2 。在某些特定實施例中，各抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之面積為至少1.0 mm2 、至少2.0 mm2 、至少3.0 mm2 、至少4.0 mm2 、至少5.0 mm2 、至少6.0 mm2 、至少7.0 mm2 、至少8.0 mm2 、至少9.0 mm2 、至少10 mm2 、至少15 mm2 、至少20 mm2 、至少25 mm2 、至少30 mm2 、至少35 mm2 、至少40 mm2 、至少45 mm2 或至少50 mm2 。在某些特定實施例中，各抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之面積不超過100 mm2 。
143.如實施例137至142中任一項之孔盤，其中各抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之密度為至少50個抗生蛋白鏈菌素官能基/平方微米。
144.如實施例137至143中任一項之孔盤，其中各抗生蛋白鏈菌素官能基共價附著於該孔盤或該孔盤之該一或多個孔的該表面之該共價功能化區。
145.如實施例137至144中任一項之孔盤，其中各抗生蛋白鏈菌素官能基非共價地附著於生物素部分，該生物素部分自身共價附著於該孔盤或該孔盤之該一或多個孔的該表面之該共價功能化區。
146.如實施例138至145中任一項之孔盤，其中各抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之面積小於約50%之該一或多個孔中之每一者之底表面面積。
147.如實施例138至146中任一項之孔盤，其中各抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之面積小於約25%、小於約15%、小於約10%、小於約5%或小於約2%之該一或多個孔中之每一者之底部面積。
148.如實施例137至147中任一項之孔盤，其中各抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之尺寸為0.5至4.0 mm (例如，約1.0 mm至約3.5 mm，或約1.5 mm至約3.0 mm)。
149.如實施例137至148中任一項之孔盤，其中各抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區為實質上圓形且具有0.5至4.0 mm (例如，約1.0 mm至約3.5 mm或約1.5 mm至約3.0 mm)之直徑。
150.如實施例126至149中任一項之孔盤，其中該孔盤之該表面包括複數個生物素呈現或抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區。
151.如實施例150之孔盤，其中該複數個生物素呈現或抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區聚集在該孔盤之孔的底部上。
152.如實施例151之孔盤，其中該複數個生物素呈現或抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區中之每一者之面積小於約5%、小於約2%、或小於約1%之該一或多個孔中之每一者之該底部面積，且另外其中該複數個區域之總面積小於約50%或小於約25%之該一或多個孔中之每一者之該底部面積。
153.如實施例137至152中任一項之孔盤，其中該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區包括經由連接子共價連接至該表面之抗生蛋白鏈菌素官能基，該連接子具有十個或更多個選自碳、矽、氮及氧之主鏈原子。在特定實施例中，連接子可具有約10個至約50個主鏈原子，或一系列約5個、7個、9個、10個、11個、13個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、90個、100個、200個鍵長度，其間的任何數目之鍵長度。
154.如實施例126至153中任一項之孔盤，其中該孔盤或該一或多個孔中之每一者之該表面進一步包括第二共價修飾區，該第二共價修飾區包括表面阻斷配位體。
155.如實施例154之孔盤，其中該等表面阻斷配位體中之每一者包括親水性或帶負電荷部分。
156.如實施例154或155之孔盤，其中該等表面阻斷配位體包括聚乙二醇(PEG)部分。
157.如實施例154至156中任一項之孔盤，其中該第二共價修飾區進一步包括提供部分刺激黏附性之至少一個配位體。
158.如實施例137至157中任一項之孔盤，其中該抗生蛋白鏈菌素官能基共價或非共價地附著於如實施例122至129中任一項之表面之共價功能化區。
159.一種孔盤，其包括一表面，該表面包括用於活化T細胞的該孔盤之抗原呈現共價功能化區。
160.如實施例159之孔盤，其中該孔盤之一或多個孔中之每一者包括具有抗原呈現共價功能化區之表面。
161.如實施例159或160之孔盤，其中該一或多個孔中之每一者之該抗原呈現共價功能化區位於該對應孔的底表面上。
162.如實施例159至161中任一項之孔盤，其中該抗原呈現共價功能化區包括複數個特異性結合的初始活化分子配位體及複數個特異性結合的共活化分子配位體。
163.如實施例162之孔盤，其中該複數個特異性結合的初始活化分子配位體各自包括經組態以結合於該T細胞之T細胞受體的主要組織相容複合體(MHC)分子(例如，I類或II類)。
164.如實施例163之孔盤，其中該MHC分子包括I類蛋白序列及β微球蛋白蛋白序列。
165.如實施例163或164之孔盤，其中包括MHC分子之該複數個初始活化分子中之每一者進一步包括抗原肽，及視情況腫瘤相關抗原、病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原或原蟲抗原。
166.如實施例165之孔盤，其中該抗原肽為腫瘤相關抗原，且視情況該腫瘤相關抗原為SLC45A2、TCL1、VCX3A、MART1或NYESO1。
167.如實施例163至166中任一項之孔盤，其中該MHC分子之該蛋白質序列經由該蛋白質序列之C端連接而連接至該抗原呈現合成表面。
168.如實施例162至167中任一項之孔盤，其中該複數個特異性結合的共活化分子配位體各自包括T細胞受體(TCR)共活化分子或輔助TCR活化分子。
169.如實施例168之孔盤，其中該複數個共活化分子配位體之該等TCR共活化分子與該等輔助TCR活化分子之比率為約100:1至約1:100。
170.如實施例168至169中任一項之孔盤，其中該複數個共活化分子配位體之該等TCR共活化分子與該等輔助TCR活化分子之比率為100:1至90:1、90:1至80:1、80:1至70:1、70:1至60:1、60:1至50:1、50:1至40:1、40:1至30:1、30:1至20:1、20:1至10:1、10:1至1:1、3:1至1:3；1:1至1:10、1:10至1:20、1:20至1:30、1:30至1:40、1:40至1:50、1:50至1:60、1:60至1:70、1:70至1:80、1:80至1:90或1:90至1:100，其中前述值中之每一者由「約」修飾。
171.如實施例168至170中任一項之孔盤，其中該複數個特異性結合的共活化分子配位體之該等TCR共活化分子與該等輔助TCR活化分子之比率為約20:1至約1:20或約3:1至約1:3。
172.如實施例168至171中任一項之孔盤，其中該等TCR共活化分子包括CD28結合蛋白或其片段，該片段保留與CD28之結合能力。
173.如實施例172之孔盤，其中該CD28結合蛋白或該其片段進一步包括位點特異性C端生物素部分。
174.如實施例168至173中任一項之孔盤，其中該等T細胞受體(TCR)共活化分子包括CD80分子或其片段，其中該片段保留對於CD28之結合活性。
175.如實施例168至174中任一項之孔盤，其中該T細胞受體(TCR)共活化分子包括抗CD28抗體或其片段。
176.如實施例168至175中任一項之孔盤，其中該輔助TCR活化分子包括CD2結合蛋白。
177.如實施例176之孔盤，其中該CD2結合蛋白或該其片段進一步包括位點特異性C端生物素部分。
178.如實施例168至179中任一項之孔盤，其中該輔助TCR活化分子包括CD58分子或其片段，其中該片段保留與CD2之結合活性。
179.如實施例168至178中任一項之孔盤，其中該輔助TCR活化分子包括抗CD2抗體或其片段。
180.如實施例166至179中任一項之孔盤，其中該複數個特異性結合的初始活化分子配位體及複數個特異性結合的共活化分子配位體特異性結合至如實施例1至11、實施例31至33中任一項或如實施例137至159中任一項之孔盤的抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之抗生蛋白鏈菌素官能基。
181.如實施例166至180中任一項之孔盤，其中在該抗原呈現共價功能化區中，該複數個特異性結合的初始活化分子配位體之密度為至少約1 × 102 個分子/平方微米或約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米。
182.如實施例166至181中任一項之孔盤，其中在該抗原呈現共價功能化區中，該複數個特異性結合的共活化分子配位體之密度為約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米或約1 × 103 至約1 × 105 個分子/平方微米。
183.一種製備包括具有疊氮基呈現共價功能化區之表面之孔盤的方法，該方法包括： 使該孔盤之該表面的一部分之氧化物部分與含疊氮基偶合劑接觸；且 形成該孔盤之該疊氮基呈現共價功能化區。
184.如實施例183之方法，其中該方法進一步包括在該表面之部分的該氧化物部分與該含疊氮基偶合劑之該接觸之前電漿清潔該孔盤之該表面。
185.如實施例183或184之方法，其中在發生該接觸時，該含疊氮基偶合劑以氣相形式存在。
186.如實施例183至185中任一項之方法，其中該含疊氮基偶合劑包括具有5個至9個碳之碳主鏈的連接子。
187.如實施例186之方法，其中該連接子具有7個碳之碳主鏈。
188.如實施例183至187中任一項之方法，其中該孔盤之該表面包括(或由以下組成或基本上由以下組成)玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、環烯烴共聚物或三聚氰胺。
189.如實施例183至188中任一項之方法，其中該疊氮基呈現共價功能化區之密度為至少50個疊氮基/平方微米。
190.如實施例183至189中任一項之方法，其中使該孔盤之該表面的該部分之氧化物部分與含疊氮基偶合劑接觸包括使該孔盤之一或多個孔中之每一者的表面與該含疊氮基偶合劑接觸，進而在該一或多個孔中之每一者中形成具有疊氮基呈現共價功能化區的表面。
191.如實施例190之方法，其中接觸該一或多個孔之該表面包括使該對應孔之底表面與該含疊氮基偶合劑接觸，進而在該一或多個孔中之每一者之該底表面上形成疊氮基呈現共價功能化區。
192.如實施例191之方法，其中接觸該一或多個孔中之每一者之該底表面包括僅接觸該底表面，進而僅在該一或多個孔中之每一者的該底表面上形成疊氮基呈現共價功能化區。
193.一種製備包括具有生物素呈現共價功能化區之表面之孔盤的方法，該方法包括： 使該孔盤之該表面的一部分與包括連接至反應性基團之生物素部分之試劑接觸，其中該反應性基團經組態以與該表面之反應性部分反應，進而形成該孔盤之生物素呈現功能化區，且 使該孔盤之該表面與包括連接至反應性基團之表面阻斷配位體之試劑接觸，其中該反應性基團經組態以與該表面之反應性部分反應，進而提供該表面之阻斷配位體修飾區。
194.如實施例193之方法，其中該阻斷配位體修飾區及該生物素呈現區覆蓋該整個表面，且視情況其中該阻斷配位體修飾區及該生物素呈現區為該表面之非重疊區域。
195.如實施例193或194之方法，其中使該孔盤之該表面的該部分與包括連接至該反應性基團之該生物素部分之該試劑接觸包括接觸該孔盤之一或多個孔中之每一者內的表面。
196.如實施例195之方法，其中接觸該一或多個孔中之每一者進一步包括使該對應孔之底表面處之該一或多個孔中之每一者與包括連接至該反應性基團之該生物素部分之該試劑接觸，進而在該對應孔之該底表面上產生該生物素呈現共價功能化區。
197.如實施例196之方法，其中該生物素呈現共價功能化區僅形成於該對應孔之該底表面上。
198.如實施例193至197中任一項之方法，其中該生物素呈現共價功能化區之密度為至少50個生物素官能基/平方微米。
199.如實施例193至198中任一項之方法，其中該生物素呈現共價功能化區之面積小於約50%之該一或多個孔中之每一者之該底部面積。
200.如實施例193至199中任一項之方法，其中該生物素呈現共價功能化區之面積小於約25%、小於約15%、小於約10%、小於約5%、小於約2%或小於約1%之該一或多個孔中之每一者之該底部面積。
201.如實施例193至200中任一項之方法，其中該生物素呈現共價功能化區之面積具有小於約35mm2 、約20 mm2 、約12 mm2 、約5 mm2 、小於約2 mm2 或小於約1mm2 之面積。
202.如實施例193至201中任一項之方法，其中該生物素呈現共價功能化區之尺寸為1 mm。
203.如實施例193至202中任一項之方法，其中該生物素呈現共價功能化區為實質上圓形且具有1 mm之直徑。
204.如實施例196至203中任一項之方法，其進一步包括使該一或多個孔中之每一者之該底部的複數個區域與包括連接至該反應性基團之該生物素部分的該試劑接觸，進而在該一或多個孔中之每一者中產生複數個生物素呈現區。
205.如實施例193至204中任一項之方法，其中包括連接至該反應性基團之該生物素部分的該試劑為銅依賴性點擊偶合劑。
206.如實施例205之方法，其進一步包括在該表面之該部分與該銅依賴性點擊偶合劑接觸之後且在使該表面與包括表面阻斷配位體之該試劑接觸之前，使該孔盤之該表面與含硫醇試劑或銅螯合劑接觸。
207.如實施例193至206中任一項之方法，其中該等表面阻斷配位體中之每一者包括親水性或帶負電荷部分。
208.如實施例193至207中任一項之方法，其中該等表面阻斷配位體包括聚乙二醇(PEG)部分。
209.如實施例196至208中任一項之方法，其進一步包括使該一或多個孔中之每一者的一或多個表面與包括經組態以提供黏附性刺激之配位體的試劑接觸，其中該接觸係在使該一或多個孔中之每一者之該表面與包括連接至該反應性基團之該生物素部分之該試劑接觸後執行，進而將經組態以提供黏附性刺激之配位體安置在該一或多個孔之該生物素呈現區外部。
210.如實施例193至209中任一項之方法，其中該等反應性部分安置於該孔盤之一或多個孔內。
211.如實施例193至210中任一項之方法，其中該表面之該等反應性部分包括疊氮基或炔基反應性部分。
212.如實施例1937至2104中任一項之方法，其中該孔盤包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、環烯烴共聚物或三聚氰胺。
213.一種製備包括具有抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之表面之孔盤的方法，該方法包括使該孔盤之該表面的一部分與包括連接至反應性基團之抗生蛋白鏈菌素官能基的試劑或包括連接至反應性基團之生物素部分的試劑接觸，其中該反應性基團經組態以與該表面之反應性部分反應，且在該試劑包括連接至該反應性基團之該生物素部分時，接著使該表面之該部分與抗生蛋白鏈菌素接觸，進而形成該孔盤之抗生蛋白鏈菌素呈現功能化區，且使該孔盤之該表面與包括連接至反應性基團之表面阻斷配位體的試劑接觸，其中該反應性基團經組態以與該表面之反應性部分反應，進而提供該表面之阻斷配位體修飾區。
214.如實施例213之方法，其中該阻斷配位體修飾區及該抗生蛋白鏈菌素呈現區覆蓋該整個表面，且視情況其中該阻斷配位體修飾區及該抗生蛋白鏈菌素呈現區為該表面之非重疊區域。
215.如實施例213或214之方法，其中使該孔盤之該表面之該部分與包括連接至該反應性基團之抗生蛋白鏈菌素部分的該試劑或包括該生物素部分之該試劑接觸包括接觸該孔盤之一或多個孔中之每一者內的表面。
216.如實施例215之方法，其中接觸該一或多個孔中之每一者進一步包括使該對應孔之底表面處的該一或多個孔中之每一者與包括連接至該反應性基團之該抗生蛋白鏈菌素部分的該試劑或與包括連接至該反應性基團之該生物素部分的該試劑接觸，進而在該對應孔之該底表面上產生該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區。
217.如實施例216之方法，其中該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區僅形成於該對應孔之該底表面上。
218.如實施例213至217中任一項之方法，其中該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之密度為至少50個抗生蛋白鏈菌素官能基/平方微米。
219.如實施例213至218中任一項之方法，其中該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之面積小於約50%之該一或多個孔中之每一者之該底部面積。
220.如實施例213至219中任一項之方法，其中該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之面積小於約25%、小於約15%、小於約10%、小於約5%、小於約2%或小於約1%之該一或多個孔中之每一者之該底部面積。
221.如實施例213至220中任一項之方法，其中該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之面積具有小於約35mm2 、約20 mm2 、約12 mm2 、約5 mm2 、小於約2 mm2 或小於約1mm2 之面積。
222. 如實施例213至221中任一項之方法，其中該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之尺寸為1 mm。
223.如實施例213至222中任一項之方法，其中該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區為實質上圓形且具有1 mm之直徑。
224.如實施例213至223中任一項之方法，其進一步包括使該一或多個孔中之每一者之該底部的複數個區域與包括連接至該反應性基團之該抗生蛋白鏈菌素部分的該試劑或與包括連接至該反應性基團之該生物素部分的該試劑接觸，進而在該一或多個孔中之每一者中產生複數個抗生蛋白鏈菌素呈現區。
225.如實施例213至224中任一項之方法，其中包括連接至該反應性基團之該抗生蛋白鏈菌素部分的該試劑或包括連接至該反應性基團之該生物素部分之該試劑為銅依賴性點擊偶合劑。
226.如實施例225之方法，其進一步包括在使該表面之該部分與該銅依賴性點擊偶合劑接觸之後且在使該表面與包括表面阻斷配位體之該試劑接觸之前，使該孔盤之該表面與含硫醇試劑或銅螯合劑接觸。
227.如實施例213至226中任一項之方法，其中該等表面阻斷配位體中之每一者包括親水性或帶負電荷部分。
228.如實施例213至227中任一項之方法，其中該等表面阻斷配位體包括聚乙二醇(PEG)部分。
229.如實施例215至228中任一項之方法，其進一步包括使該一或多個孔中之每一者的一或多個表面與包括經組態以提供黏附性刺激之配位體的試劑接觸，其中該接觸係在使該一或多個孔中之每一者之該表面與包括連接至該反應性基團之該抗生蛋白鏈菌素部分之該試劑或與包括該生物素部分之該試劑接觸後執行，進而將經組態以提供黏附性刺激之配位體安置在該一或多個孔之該抗生蛋白鏈菌素呈現區外部。
230.如實施例213至229中任一項之方法，其中該等反應性部分安置於該孔盤之一或多個孔內。
231.如實施例213至230中任一項之方法，其中該表面之該等反應性部分包括疊氮基或炔基反應性部分。
232.如實施例213至231中任一項之方法，其中該孔盤包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、環烯烴共聚物或三聚氰胺。
233.一種製備包括具有抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之表面的孔盤之方法，該方法包括在該表面上形成反應性部分呈現共價功能化表面；使該表面與包括連接至反應性基團之抗生蛋白鏈菌素部分的試劑或包括連接至反應性基團之生物素部分的試劑接觸，其中該反應性基團經組態以與該反應性部分呈現表面之該等反應性部分反應，進而形成抗生蛋白鏈菌素呈現功能化區或生物素呈現功能化表面，其中在該試劑包括連接至該反應性基團之該生物素部分時，接著使該孔盤之該部分與抗生蛋白鏈菌素接觸，且另外其中該表面之該反應性部分呈現共價功能化配位體或該生物素呈現功能化表面包括UV不穩定連接部分；經由經組態以暴露該表面之一部分外部的所有表面的遮罩使該表面暴露於UV照明；且裂解經暴露抗生蛋白鏈菌素或生物素修飾表面配位體之該等UV不穩定連接子，進而形成該孔盤之抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區。
234.如實施例233之方法，其中形成該反應性部分呈現共價功能化表面包括使含反應性部分偶合劑與該孔盤之該表面的氧化物部分反應，其中該含反應性部分偶合劑進一步包括該UV不穩定連接部分。
235.如實施例233或234之方法，其中該方法進一步包括在使該表面之該等氧化物部分與該含反應性部分偶合劑接觸之前電漿清潔該孔盤之該表面。
236.如實施例233至235中任一項之方法，其中使該孔盤之該表面與包括連接至該反應性基團之該抗生蛋白鏈菌素部分的該試劑或包括該生物素部分之該試劑接觸包括接觸該孔盤之一或多個孔中之每一者內的表面。
237.如實施例236之方法，其中接觸該一或多個孔中之每一者進一步包括使該對應孔之底表面處的該一或多個孔中之每一者與包括連接至該反應性基團之該抗生蛋白鏈菌素部分的該試劑或與包括連接至該反應性基團之該生物素部分的該試劑接觸，進而在該對應孔之該底表面上產生該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區。
238.如實施例237之方法，其中該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區僅形成於該對應孔之該底表面上。
239.如實施例233至238中任一項之方法，其中該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之密度為至少50個抗生蛋白鏈菌素官能基/平方微米。
240.如實施例233至239中任一項之方法，其中該表面之該等反應性部分包括疊氮基部分或炔基部分。
241.如實施例236至240中任一項之方法，其中形成該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區包括僅在該孔盤之該一或多個孔的該底部上形成該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區。
242.一種製備包括具有用於活化T細胞之抗原呈現共價功能化區之表面的孔盤之方法，該方法包括使該孔盤之抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區與複數個初始活化分子接觸，該複數個初始活化分子各自包括經組態以結合於該T細胞之T細胞受體的主要組織相容複合體(MHC) I類分子及結合部分，其中該複數個初始活化分子之該等結合部分經組態以結合抗生蛋白鏈菌素之結合位點；且接觸複數個共活化分子，該複數個共活化分子各自包括T細胞受體(TCR)共活化分子；或輔助TCR活化分子，其中該等共活化分子各自進一步包括經組態以結合抗生蛋白鏈菌素之結合位點的結合部分，以及該孔盤之該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之第二複數個結合部分，進而提供該孔盤之抗原呈現共價功能化區之複數個特異性結合的初始活化分子配位體及複數個特異性結合的共活化分子配位體。
243.如實施例242之方法，其進一步包括使該孔盤之該表面與包括連接至反應性基團之表面阻斷配位體的試劑接觸，其中該反應性基團經組態以與該表面之反應性部分反應，進而提供該表面之阻斷配位體修飾區。
244.如實施例243之方法，其中該阻斷配位體修飾區及該抗原呈現共價功能化區覆蓋該整個表面，且視情況其中該阻斷配位體修飾區及該抗原呈現共價功能化區為該表面之非重疊區域。
245.如實施例242至244中任一項之方法，其中使該孔盤之該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區與該複數個初始活化分子及該複數個共活化分子接觸包括接觸該孔盤之一或多個孔中之每一者內的表面。
246.如實施例245之方法，其中接觸該一或多個孔中之每一者進一步包括使該對應孔之底表面處的該一或多個孔中之每一者與該複數個初始活化分子及該複數個共活化分子接觸，進而在該對應孔之該底表面上產生該抗原呈現共價功能化區。
247.如實施例246之方法，其中該抗原呈現共價功能化區僅形成於該對應孔之該底表面上。
248.如實施例242至247中任一項之方法，其中該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之密度為至少50個抗生蛋白鏈菌素官能基/平方微米。
249.如實施例245至248中任一項之方法，其中該抗原呈現共價功能化區之面積小於約50%之該一或多個孔中之該底部面積。
250.如實施例245至248中任一項之方法，其中該抗原呈現共價功能化區之面積小於約25%、小於約15%、小於約10%、小於約5%、小於約2%或小於約1%之該一或多個孔之該底部面積。
251.如實施例242至250中任一項之方法，其中該抗原呈現共價功能化區之面積具有小於約35mm2 、約20 mm2 、約12 mm2 、約5 mm2 、小於約2 mm2 或小於約1mm2 之面積。
252.如實施例242至251中任一項之方法，其中該抗原呈現共價功能化區之尺寸為1 mm。
253.如實施例242至252中任一項之方法，其中該抗原呈現共價功能化區為實質上圓形且具有1 mm之直徑。
254.如實施例245至253中任一項之方法，其中使該孔盤之該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區與該複數個初始活化分子及該複數個共活化分子接觸進一步包括接觸該孔盤之一或多個孔中之每一者內的複數個抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區，進而在該一或多個孔中之每一者中產生複數個抗原呈現共價功能化區。
255.如實施例254中之孔盤，其中該複數個抗原呈現共價功能化區中之每一者之面積小於約5%之該一或多個孔之該底部面積，且另外其中該複數個抗原呈現共價功能化區之總面積小於約50%、約25%、或約10%之該一或多個孔之該底部面積。
256.如實施例242至255中任一項之方法，其中該表面之該等反應性部分為疊氮基或炔基反應性部分。
257.如實施例242至254中任一項之方法，其中該孔盤包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、環烯烴共聚物或三聚氰胺。
258.如實施例242至257中任一項之方法，其中該MHC分子包括蛋白序列及β微球蛋白。
259.如實施例242至258中任一項之方法，其中包括MHC分子之該複數個初始活化分子中之每一者進一步包括腫瘤相關抗原。
260.如實施例259之方法，其中該腫瘤相關抗原為SLC45A2、TCL1、VCX3A、MART1或NYESO1。
261.如實施例242至260中任一項之方法，其中該MHC分子之該蛋白序列經由該蛋白序列之C端連接而連接至該表面。
262.如實施例242至261中任一項之方法，其中該MHC分子包括生物素部分且經由與抗生蛋白鏈菌素之非共價相互作用而附著至該表面。
263.如實施例242至262中任一項之方法，其中該抗生蛋白鏈菌素自身共價鍵結至該表面。
264.如實施例242至263中任一項之方法，其中該抗生蛋白鏈菌素經由一系列約5個、7個、9個、10個、11個、13個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、90個、100個、200個鍵長度或其間的任何數目之鍵長度鍵結至該表面。
265.如實施例242至264中任一項之方法，其中該抗生蛋白鏈菌素與該表面非共價締合。
266.如實施例265之方法，其中該抗生蛋白鏈菌素與生物素部分非共價締合，且該生物素部分共價鍵結至該表面。
267.如實施例262之方法，其中該生物素經由約5個、7個、9個、10個、11個、13個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、95個、100個、200個鍵長度或其間的任何數目之鍵長度藉由連接子連接至該表面。
268.如實施例242至267中任一項之方法，其中該抗原呈現共價功能化區中之該等初始活化分子配位體與該等共活化分子配位體之比率為約1:10至約2:1、約1:5至約2:1、約1:2至約2:1、約1:10至約1:1、約1:5至約1:1、約1:1至約2:1或約1:2至約1:1。
269.如實施例242至268中任一項之方法，其中該複數個共活化分子配位體之該等TCR共活化分子與該等輔助TCR活化分子之比率為約100:1至約1:100。
270.如實施例242至269中任一項之方法，其中該複數個共活化分子配位體之該等TCR共活化分子與該等輔助TCR活化分子之比率為100:1至90:1、90:1至80:1、80:1至70:1、70:1至60:1、60:1至50:1、50:1至40:1、40:1至30:1、30:1至20:1、20:1至10:1、10:1至1:1、3:1至1:3；1:1至1:10、1:10至1:20、1:20至1:30、1:30至1:40、1:40至1:50、1:50至1:60、1:60至1:70、1:70至1:80、1:80至1:90或1:90至1:100，其中前述值中之每一者由「約」修飾。
271.如實施例242至270中任一項之方法，其中該複數個共活化分子配位體之該等TCR共活化分子與該等輔助TCR活化分子之比率為約20:1至約1:20或約3:1至約1:3。
272.如實施例242至271中任一項之方法，其中在該抗原呈現共價功能化區中，該複數個特異性結合的初始活化分子配位體之密度為至少約1 × 102 個分子/平方微米或約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米。
273.如實施例242至272中任一項之孔盤，其中在該抗原呈現共價功能化區之該抗原呈現合成表面上，該複數個特異性結合的共活化分子配位體之密度為約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米或約1 × 103 至約1 × 105 個分子/平方微米。
274.如實施例242至273中任一項之方法，其中該T細胞受體(TCR)共活化分子包括CD28結合蛋白或其保留對於CD28之結合能力的片段。
275.如實施例274之方法，其中該CD28結合蛋白或該其片段進一步包括位點特異性C端生物素部分。
276.如實施例242至273中任一項之方法，其中該T細胞受體(TCR)共活化分子包括CD80分子或其片段，其中該片段保留對於CD28之結合活性。
277.如實施例242至273中任一項之方法，其中該T細胞受體(TCR)共活化分子包括抗CD28抗體或其片段。
278.如實施例242至277中任一項之方法，其中該輔助TCR活化分子包括CD2結合蛋白。
279.如實施例278之方法，其中該CD2結合蛋白或該其片段進一步包括位點特異性C端生物素部分。
280.如實施例242至277中任一項之方法，其中該輔助TCR活化分子包括CD58分子或其片段，其中該片段保留與CD2之結合活性。
281.如實施例242至277中任一項之方法，其中該輔助TCR活化分子包括抗CD2抗體或其片段。
282.如實施例242至281中任一項之方法，其中該等表面阻斷配位體中之每一者包括親水性或帶負電荷部分。
283.如實施例242至282中任一項之方法，其中該等表面阻斷配位體包括聚乙二醇(PEG)部分。
284.一種製備包括具有淋巴球活化共價功能化區之表面的孔盤之方法，該方法包括使該孔盤之抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區與各自包括結合部分之複數個第一活化分子接觸，其中該等第一活化分子之該等結合部分經組態以結合抗生蛋白鏈菌素之結合位點，進而提供該淋巴球活化共價功能化區。
285.如實施例284之方法，其進一步包括使該孔盤之該表面與包括連接至反應性基團之表面阻斷配位體的試劑接觸，其中該反應性基團經組態以與該表面之反應性部分反應，進而提供該表面之阻斷配位體修飾區。
286.如實施例285之方法，其中該阻斷配位體修飾區及該淋巴球活化共價功能化區覆蓋該整個表面，且視情況其中該阻斷配位體修飾區及該淋巴球活化共價功能化區為該表面之非重疊區域。
287.如實施例284至286中任一項之方法，其中使該孔盤之該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區與該複數個第一活化分子接觸包括接觸該孔盤之一或多個孔中之每一者內的表面。
288.如實施例287之方法，其中接觸該一或多個孔中之每一者進一步包括使該對應孔之底表面處的該一或多個孔中之每一者與該複數個第一活化分子接觸，進而在該對應孔之該底表面上產生該淋巴球活化共價功能化區。
289.如實施例288之方法，其中該淋巴球活化共價功能化區僅形成於該對應孔之該底表面上。
290.如實施例284至287中任一項之方法，其中該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之密度為至少50個抗生蛋白鏈菌素官能基/平方微米。
291.如實施例287至290中任一項之方法，其中該淋巴球活化共價功能化區之面積小於約50%之該一或多個孔之該底部面積。
292.如實施例287至291中任一項之方法，其中該淋巴球活化共價功能化區之面積小於約25%、小於約15%、小於約10%、小於約5%、小於約2%或小於約1%之該一或多個孔之該底部面積。
293.如實施例284至292中任一項之方法，其中該淋巴球活化共價功能化區之面積具有小於約35mm2 、約20 mm2 、約12 mm2 、約5 mm2 、小於約2 mm2 或小於約1mm2 之面積。
294.如實施例284至293中任一項之方法，其中該淋巴球活化共價功能化區之尺寸為1 mm。
295.如實施例284至294中任一項之方法，其中該淋巴球活化共價功能化區為實質上圓形且具有1 mm之直徑。
296.如實施例284至295中任一項之方法，其中使該孔盤之該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區與該複數個第一活化分子接觸進一步包括使複數個抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區與該孔盤之一或多個孔中之每一者內的該複數個第一活化分子接觸，進而在該一或多個孔中之每一者中產生複數個淋巴球活化共價功能化區。
297.如實施例296中之孔盤，其中該複數個淋巴球活化共價功能化區中之每一者之面積為小於約5%之該一或多個孔之該底部面積，且另外其中該複數個淋巴球活化共價功能化區之總面積小於約50%、約25%或約10%之該一或多個孔之該底部面積。
298.如實施例284至297中任一項之方法，其中該表面之該等反應性部分為疊氮基或炔基反應性部分。
299.如實施例284至298中任一項之方法，其中該孔盤包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、環烯烴共聚物或三聚氰胺。
300.如實施例284至299中任一項之方法，其中該淋巴球為T細胞、自然殺手T (NKT)細胞或B細胞。
301.如實施例284至300中任一項之方法，其中該複數個第一活化分子為分化結合分子之細胞表面團簇、細胞表面免疫球蛋白結合分子、T細胞受體分子活化分子、TNF受體超家族結合分子、趨化因子受體結合分子、生長因子分子或黏附促進分子。
302.如實施例301之方法，其中該複數個第一活化分子包括MHC分子、保留分化結合活性之細胞表面團簇之蛋白質或其片段、保留細胞表面免疫球蛋白結合能力之蛋白質或其片段、保留T細胞受體結合活性之蛋白質或其片段、保留TNF受體超家族結合活性之蛋白質或其片段、保留趨化因子受體結合活性之蛋白質或其片段、保留生長刺激性活性之蛋白質或其片段或保留黏附促進活性之蛋白質或其片段。
303.如實施例301或302之方法，其中該複數個第一活化分子包括保留分化結合活性之細胞表面團簇之蛋白質或其片段、保留生長刺激性活性之蛋白質或其片段或保留黏附促進活性之蛋白質或其片段。
304.如實施例284至303中任一項之方法，其中在該淋巴球活化共價功能化區中，該複數個特異性結合的第一活化分子配位體之密度為至少約1 × 102 個分子/平方微米或約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米。
305.如實施例284至304中任一項之方法，其進一步包括使該孔盤之該抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區與各自包括結合部分之複數個第二活化分子接觸，其中該等第二活化分子之該等結合部分經組態以結合抗生蛋白鏈菌素之結合位點，進而在該淋巴球活化共價功能化區中提供複數個特異性結合的第二活化分子配位體。
306.如實施例305之方法，其中該複數個第二活化分子為T細胞受體(TCR)共活化分子、細胞表面免疫球蛋白結合分子、生長因子分子、黏附促進分子。
307.如實施例304或305之孔盤，其中在該淋巴球活化共價功能化區中，該複數個特異性結合的共活化分子配位體之密度為約1 × 102 至約1 × 105 個分子/平方微米或約1 × 103 至約1 × 105 個分子/平方微米。
308.如實施例284至307中任一項之方法，其中該淋巴球活化共價功能化區中之該等初始活化分子配位體與該等共活化分子配位體之比率為約1:10至約2:1、約1:5至約2:1、約1:2至約2:1、約1:10至約1:1、約1:5至約1:1、約1:1至約2:1或約1:2至約1:1。
309.如實施例285至308中任一項之方法，其中該阻斷配位體修飾區及該抗原呈現共價功能化區覆蓋該整個表面，且視情況其中該阻斷配位體修飾區及該淋巴球活化共價功能化區為該表面之非重疊區域。
310.如實施例285至309中任一項之方法，其中該等表面阻斷配位體中之每一者包括親水性或帶負電荷部分。
311.如實施例285至310中任一項之方法，其中該等表面阻斷配位體包括聚乙二醇(PEG)部分。
312.一種用於製備包括具有抗原呈現共價功能化區之表面的孔盤之套組，該套組包括孔盤，該孔盤包括包含生物素呈現共價功能化區之表面；及表面功能化劑，其包括抗生蛋白鏈菌素。
313.如實施例312之套組，其中包括包含該生物素呈現共價功能化區之該表面之該孔盤為如實施例1至11中任一項(其中該反應性部分為生物素)或如實施例31至33中任一項(其中該反應性部分為生物素)或如實施例126至136中任一項之孔盤。
314.如實施例312或313之套組，其進一步包括第一活化劑，該第一活化劑包括經組態以與該T細胞之T細胞受體結合的複數個主要組織相容複合體(MHC) I分子，且另外其中該等MHC分子經組態以結合至抗生蛋白鏈菌素之結合位點。
315.如實施例312至314中任一項之套組，其中該複數個MHC分子中之每一者進一步包括至少一個生物素官能基。
316.如實施例312至315中任一項之套組，其進一步包括試劑，該試劑包括各自經組態以結合抗生蛋白鏈菌素之結合位點的複數個共活化分子，且其中該等共活化分子中之每一者包括T細胞受體(TCR)共活化分子或輔助TCR活化分子。
317.如實施例316之套組，其中該複數個共活化分子包括T細胞受體(TCR)共活化分子及輔助TCR活化分子。
318.如實施例317之套組，其中含有包括該複數個共活化分子之該試劑的容器含有約20:1至約1:20比率之該等TCR共活化分子及該等輔助TCR活化分子。
319.如實施例312至318中任一項之套組，其中該等TCR共活化分子為CD28受體之促效劑。
320.如實施例312至319中任一項之套組，其中該等輔助TCR活化分子為CD2受體之促效劑。
321.如實施例312至320中任一項之套組，其進一步包括包含生長刺激性分子的試劑，其中各生長刺激性分子包括生長因子受體配位體。
322.如實施例321之套組，其中該生長因子受體配位體包括IL-21或其片段。
323.如實施例321或322之套組，其進一步包括第二生長刺激性分子，該第二生長刺激性分子包括IL-7或IL-2。
324.一種用於製備包括具有抗原呈現共價功能化區之表面的孔盤之套組，該套組包括：包括包含疊氮基呈現共價功能化區之表面之孔盤；及第一表面功能化劑。
325.如實施例324之套組，其中包括具有該疊氮基呈現共價功能化區之該表面的該孔盤為如實施例1至11中任一項(其中該反應性部分為疊氮基)、如實施例31至33中任一項(其中該反應性部分為疊氮基)或如實施例122至129中任一項之孔盤。
326.如實施例324或325之套組，其中該第一表面功能化劑包括包含連接至反應性基團之生物素部分之試劑，其中該反應性基團經組態以與該表面之該等疊氮基部分反應。
327.如實施例326之套組，其進一步包括第二表面功能化劑，該第二表面功能化劑包括抗生蛋白鏈菌素。
328.如實施例326或327之套組，其中該第一功能化劑包括連接至反應性基團之抗生蛋白鏈菌素部分，其中該反應性基團經組態以與疊氮基部分反應。
329.如實施例324至328中任一項之套組，其進一步包括包含表面阻斷部分之表面阻斷劑，該表面阻斷部分連接至經組態以與該等疊氮基部分反應之反應性基團。
330.如實施例329之套組，其中該表面阻斷部分包括親水性或帶負電荷部分。
331.如實施例329或330之套組，其中該表面阻斷劑包括聚乙二醇(PEG)部分。
332.如實施例324至331中任一項之套組，其進一步包括第一活化劑，該第一活化劑包括經組態以與該T細胞之T細胞受體結合的複數個主要組織相容複合體(MHC) I分子，且另外其中該等MHC分子經組態以結合至抗生蛋白鏈菌素之結合位點。
333.如實施例332之套組，其中該複數個MHC分子中之每一者進一步包括至少一個生物素官能基。
334.如實施例324至333中任一項之套組，其進一步包括包含複數個共活化分子之試劑，該複數個共活化分子各自具有經組態以結合抗生蛋白鏈菌素之結合位點之結合部分，且其中該等共活化分子中之每一者包括T細胞受體(TCR)共活化分子或輔助TCR活化分子。
335.如實施例334之套組，其中該複數個共活化分子包括T細胞受體(TCR)共活化分子及輔助TCR活化分子。
336.如實施例335之套組，其中含有包括該複數個共活化分子之該試劑的容器含有約20:1至約1:20比率之該等TCR共活化分子及該等輔助TCR活化分子。
337.如實施例324至336中任一項之套組，其中該等TCR共活化分子為CD28受體之促效劑。
338.如實施例324至337中任一項之套組，其中該等輔助TCR活化分子為CD2受體之促效劑。
339.如實施例324至338中任一項之套組，其進一步包括包含生長刺激性分子的試劑，其中各生長刺激性分子包括生長因子受體配位體。
340.如實施例339之套組，其中該生長因子受體配位體包括IL-21或其片段。
341.如實施例339或340之套組，其進一步包括第二生長刺激性分子，該第二生長刺激性分子包括IL-7或IL-2。
342.一種用於製備包括具有用於抗原特異性活化T淋巴球(T細胞)之抗原呈現共價功能化區之表面的孔盤之套組，該套組包括孔盤，該孔盤包括具有抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之表面；及第一活化劑，該第一活化劑包括經組態以與T細胞之T細胞受體結合的複數個主要組織相容複合體(MHC) I分子，且另外其中該等MHC分子經組態以結合至抗生蛋白鏈菌素之結合位點。
343.如實施例342之套組，其中該孔盤為如實施例1至38中任一項(其中該反應性部分為抗生蛋白鏈菌素)或如實施例141至162中任一項之包括具有抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之表面的孔盤。
344.如實施例343之套組，其中該複數個MHC分子中之每一者進一步包括至少一個生物素官能基。
345.如實施例342至344中任一項之套組，其進一步包括包含複數個共活化分子之試劑，該複數個共活化分子各自具有經組態以結合抗生蛋白鏈菌素之結合位點之結合部分，且其中該等共活化分子中之每一者包括T細胞受體(TCR)共活化分子或輔助TCR活化分子。
346.如實施例345之套組，其中該複數個共活化分子包括T細胞受體(TCR)共活化分子及輔助TCR活化分子。
347.如實施例346之套組，其中含有包括該複數個共活化分子之該試劑的容器含有約20:1至約1:20比率之該等TCR共活化分子及該等輔助TCR活化分子。
348.如實施例342至347中任一項之套組，其中該等TCR共活化分子為CD28受體之促效劑。
349.如實施例342至348中任一項之套組，其中該等輔助TCR活化分子為CD2受體之促效劑。
350.如實施例342至349中任一項之套組，其進一步包括包含生長刺激性分子的試劑，其中各生長刺激性分子包括生長因子受體配位體。
351.如實施例350之套組，其中該生長因子受體配位體包括IL-21或其片段。
352.如實施例350或351之套組，其進一步包括第二生長刺激性分子，該第二生長刺激性分子包括IL-7或IL-2。
353.一種治療需要治療癌症之個體之方法；該方法包括自該個體獲得複數個T淋巴球(T細胞)；使該複數個T細胞與包括抗原呈現共價功能化區之孔盤之表面接觸，其中該抗原呈現共價功能化區包括經組態以結合於該複數個T細胞中之每一者之T細胞受體的複數個主要組織相容複合體(MHC) I分子，其中該等MHC分子包括對該個體之該癌症具有特異性之抗原；產生複數個活化T細胞，其中該活化經組態以對於該個體之該癌症為特異性的；將該複數個特異性活化T細胞與未活化細胞分離；及將該複數個抗原特異性活化T細胞引入至該個體體內。
354.如實施例353之方法，其中包括具有該抗原呈現共價功能化區之該表面之該孔盤為如實施例12至38中任一項之孔盤，其中該淋巴球活化部分包括初始及共活化部分，或如實施例159至182中任一項之孔盤。
355.如實施例353或354之方法，其中包括具有該抗原呈現共價功能化區之該表面之該孔盤係藉由如實施例242至283中任一項之方法產生。
356.一種治療需要治療癌症之個體之方法；該方法包括自該個體獲得複數個T淋巴球(T細胞)；藉由如實施例38至87中任一項之方法產生複數個活化T細胞，其中該活化經組態以對於該個體之該癌症為特異性的；將該複數個特異性活化T細胞與未活化細胞分離；及將該複數個抗原特異性活化T細胞引入至該個體體內。
103:初始功能化試劑(例如，含疊氮基試劑) 105:功能化配位體(例如，疊氮基庚基) 107:含生物素之點擊試劑/DBCO連接生物素部分 109:含生物素之配位體 109':含生物素之配位體 110:孔盤 111:抗生蛋白鏈菌素 113:呈現抗生蛋白鏈菌素之配位體 115:初始功能化表面 117:表面阻斷劑 119:表面阻斷配位體 120:生物素呈現共價功能區 121:表面阻斷DBCO試劑 123:表面阻斷配位體 125:抗生蛋白鏈菌素呈現功能化區 127:抗生蛋白鏈菌素共價連接之DBCO試劑 129:抗生蛋白鏈菌素四聚分子(具有四個結合位點) 130:疊氮基呈現共價功能化區 131:包括活化部分及結合部分之活化分子 133:包括共活化分子、輔助活化分子或二級活化分子之額外活化分子 135:生物素呈現共價功能化區 137:初始(或第一)活化分子配位體 139:第二或共活化分子配位體 140:抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區 145:生物素呈現共價功能化區 150:抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區 155:抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區 160:具有抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區之表面 165:表面160之抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區 167:表面160之具有疊氮基部分的第二區域 170:具有抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區及含表面阻斷配位體之第二區域的表面 175:表面170之抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區 177:表面170之具有表面阻斷配位體的第二區域 180:具有含活化及共活化(第一及第二)配位體之第一區域及含表面阻斷配位體之第二區域的表面 185:表面180之具有第一及第二(初始及共活化)配位體的區域 193:尺寸受控的共價功能化區 195:尺寸受控的共價功能化區 197:尺寸受控的共價功能化區 510:基於珠粒之活化 520:抗原呈現區活化 530:細胞產物 540:細胞 550:CD28表現 560:CD28表現 570:CD127表現 580:CD127表現
圖1A至1C為根據本發明之一些實施例的用於將抗生蛋白鏈菌素結合部分引入至疊氮基功能化孔盤中之孔表面的可替代途徑之示意性圖示。
圖1D為根據本發明之一些實施例的用於引入具有抗生蛋白鏈菌素呈現共價連接配位體之表面的限制區且後續引入活化配位體用於活化淋巴球之示意性圖示。
圖2為根據本發明之一些實施例的用於T細胞活化之活化途徑的示意性圖示。
圖3A至3D為根據本發明之一些實施例活化的T細胞之細胞群特徵的圖示。
圖4A為表示用於多變量T細胞活化實驗之實驗條件的表。
圖4B至4C為由如圖4A中設計之多變量T細胞活化實驗產生的觀測細胞表面標記物之示意性圖示。
圖5A至5D為根據本發明之一些實施例活化的T細胞之細胞群特徵的圖示。
圖6A為根據本發明之實施例中之一些的孔盤表面之不同大小的抗生蛋白鏈菌素呈現區的攝影圖。螢光標記區193、195、197說明對於大小及邊界之精密控制。
圖6B為根據本發明之一些實施例引入之抗生蛋白鏈菌素呈現共價功能化區的量測及計算面積之圖示。
圖7A至7D為根據本發明之一些實施例活化的T細胞之細胞群特徵的圖示。
圖8A至8D為根據本發明之一些實施例活化的T細胞之細胞群特徵的圖示。
193:尺寸受控的共價功能化區
195:尺寸受控的共價功能化區
197:尺寸受控的共價功能化區

Claims (65)

  1. 一種孔盤，其包含具有第一區域之表面，該第一區域為反應性部分呈現共價功能化區或活化部分呈現共價功能化區，其中該反應性部分為疊氮基部分、生物素部分或抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)部分且該活化部分為淋巴球活化部分。
  2. 如請求項1之孔盤，其中該第一區域之面積為0.5 mm2 至50 mm2 。
  3. 如請求項1之孔盤，其中該第一區域之尺寸為0.5 mm至4.0 mm。
  4. 如請求項1之孔盤，其中該第一區域為實質上圓形且具有0.5 mm至4.0 mm之直徑。
  5. 如請求項1之孔盤，其中該孔盤之該表面進一步包含第二區域，該第二區域為包含表面阻斷配位體之共價修飾區，其中該第二區域包圍該第一區域。
  6. 如請求項1至5中任一項之孔盤，其中該孔盤之該表面包含玻璃或聚苯乙烯。
  7. 如請求項1至5中任一項之孔盤，其中該孔盤之該表面包含聚丙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、環烯烴共聚物或三聚氰胺。
  8. 如請求項1至5中任一項之孔盤，其中該第一區域之密度為至少50個各別反應性部分或活化部分/平方微米。
  9. 如請求項1至5中任一項之孔盤，其中該第一區域包含經由連接子共價連接至該表面之各別反應性部分或活化部分，該連接子具有5個至20個主鏈原子、10個至40個主鏈原子或15個至50個主鏈原子，該等主鏈原子選自碳、矽、氮及氧。
  10. 如請求項1至5中任一項之孔盤，其中該反應性部分為抗生蛋白鏈菌素，且該抗生蛋白鏈菌素官能基共價附著於該孔盤之該表面的該第一區域。
  11. 如請求項1至5中任一項之孔盤，其中該反應性部分為抗生蛋白鏈菌素且該抗生蛋白鏈菌素官能基非共價地附著於生物素部分，該生物素部分自身共價附著於該孔盤之該表面的該第一區域。
  12. 如請求項1至5中任一項之孔盤，其中該第一區域為活化部分呈現共價功能化區，其包含複數個特異性結合的初始活化分子配位體及複數個特異性結合的共活化分子配位體。
  13. 如請求項12之孔盤，其中該表面之該第一區域上之該初始活化分子配位體與該共活化分子配位體的比率為1:5至2:1，或1:2至1:1。
  14. 如請求項12之孔盤，其中該複數個特異性結合的初始活化分子配位體中之各配位體包含經組態以結合至T細胞之T細胞受體(TCR)的主要組織相容複合體(MHC)分子。
  15. 如請求項14之孔盤，其中該MHC分子包含I類MHC蛋白序列及β微球蛋白蛋白序列。
  16. 如請求項14之孔盤，其中該複數個特異性結合的初始活化分子配位體中之各配位體包含MHC分子，該MHC分子進一步包含抗原肽。
  17. 如請求項16之孔盤，其中該抗原肽為腫瘤相關抗原、病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原或原蟲抗原。
  18. 如請求項17之孔盤，其中該抗原肽為腫瘤相關抗原，且視情況其中該腫瘤相關抗原為SLC45A2、TCL1、VCX3A、MART1或NYESO1。
  19. 如請求項14之孔盤，其中該MHC分子經由C端鍵連接至該活化部分呈現共價功能化區。
  20. 如請求項12之孔盤，其中該複數個特異性結合的共活化分子配位體中之各配位體包含T細胞受體(TCR)共活化分子或輔助TCR活化分子。
  21. 如請求項20之孔盤，其中該複數個特異性結合的共活化分子配位體之該等TCR共活化分子與該等輔助TCR活化分子之比率為3:1至1:3。
  22. 如請求項20之孔盤，其中該等TCR共活化分子包含CD28結合蛋白或其保留對於CD28之結合能力的片段，且視情況，其中該CD28結合蛋白或該其片段進一步包含位點特異性C端生物素部分。
  23. 如請求項20之孔盤，其中該等TCR共活化分子包含CD80分子或其片段，其中該片段保留對於CD28之結合活性。
  24. 如請求項20之孔盤，其中該等TCR共活化分子包含抗CD28抗體或其片段，其中該片段保留對於CD28之結合活性。
  25. 如請求項20之孔盤，其中該輔助TCR活化分子包含CD2結合蛋白或其保留對於CD2之結合活性的片段，且視情況，其中該CD2結合蛋白或該其片段進一步包含位點特異性C端生物素部分。
  26. 如請求項20之孔盤，其中該輔助TCR活化分子包括CD58分子或其片段，其中該片段保留與CD2之結合活性。
  27. 如請求項20之孔盤，其中該輔助TCR活化分子包括抗CD2抗體或其片段，其中該片段保留與CD2之結合活性。
  28. 如請求項12之孔盤，其中該複數個特異性結合的初始活化分子配位體及該複數個特異性結合的共活化分子配位體特異性結合至該孔盤之抗生蛋白鏈菌素呈現第一區域之抗生蛋白鏈菌素官能基。
  29. 如請求項12之孔盤，其中在該第一區域中，該複數個特異性結合的初始活化分子配位體之密度為至少1 × 102 個分子/平方微米，且視情況在該第一區域中，密度為1 × 102 至1 × 105 個分子/平方微米。
  30. 如請求項12之孔盤，其中在該第一區域中，該複數個特異性結合的共活化分子配位體之密度為至少1 × 102 個分子/平方微米，且視情況在該第一區域中，密度為1 × 103 至1 × 105 個分子/平方微米。
  31. 一種孔盤，其中該孔盤之一或多個孔中之每一者包含如請求項1至5中任一項之孔盤之表面及其第一區域。
  32. 如請求項31之孔盤，其中該一或多個孔中之每一者之該第一區域位於該對應孔的底表面上。
  33. 如請求項32之孔盤，其中各第一區域之面積小於約25%之該對應孔之該底表面的面積。
  34. 一種活化T淋巴球(T細胞)的方法，其包含： 使複數個T細胞與孔盤表面的抗原呈現共價功能化區接觸，其中該抗原呈現共價功能化區包含：複數個初始活化分子配位體，其各自包括經組態以結合至T細胞之T細胞受體(TCR)的主要組織相容(MHC)分子，其中該複數個初始活化分子配位體中之每一者連接至該表面；及複數個共活化分子配位體，其各自包括T細胞受體(TCR)共活化分子或輔助TCR活化分子，其中該等共活化分子配位體中之每一者連接至該表面；且培養與該表面之該抗原呈現共價功能化區接觸的該複數個T細胞，進而將該複數個T細胞中之至少一部分轉化為活化T細胞。
  35. 如請求項34之方法，其中該等T細胞包含CD8+ T細胞。
  36. 如請求項34之方法，其中該抗原呈現共價功能化區為如請求項12至30中任一項之孔盤表面的第一區域。
  37. 如請求項34或35之方法，其中該複數個共活化分子配位體包含TCR共活化分子及輔助TCR活化分子。
  38. 如請求項37之方法，其中該複數個共活化分子配位體之該等TCR共活化分子與該等輔助TCR活化分子之比率為3:1至1:3。
  39. 如請求項34或35之方法，該複數個MHC分子中之各分子包含I類MHC蛋白序列、β微球蛋白蛋白序列及抗原肽。
  40. 如請求項39之方法，其中該抗原肽為腫瘤相關抗原、病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原或原蟲抗原。
  41. 如請求項40之方法，其中該抗原肽為腫瘤相關抗原，且視情況其中該腫瘤相關抗原為SLC45A2、TCL1、VCX3A、MART1或NYESO1。
  42. 如請求項34或35之方法，其中該T細胞受體(TCR)共活化分子包括CD28結合蛋白或其保留對於CD28之結合能力的片段。
  43. 如請求項34或35之方法，其中該T細胞受體(TCR)共活化分子包括CD80分子或其片段，其中該片段保留對於CD28之結合活性；或其中該T細胞受體(TCR)共活化分子包括抗CD28抗體或其片段，其中該片段保留對於CD28之結合活性。
  44. 如請求項34或35之方法，其中該輔助TCR活化分子包括CD2結合蛋白或其保留對於CD2之結合能力的片段。
  45. 如請求項34或35之方法，其中該輔助TCR活化分子包括CD58分子或其片段，其中該片段保留與CD2之結合活性；或其中該輔助TCR活化分子包括抗CD2抗體或其片段，其中該片段保留與CD2之結合活性。
  46. 如請求項34或35之方法，其中在該表面之該抗原呈現共價功能化區中，該複數個特異性結合的初始活化分子配位體之密度為至少1 × 102 個分子/平方微米，或視情況在該表面之該抗原呈現共價功能化區中，密度為1 × 102 至1 × 105 個分子/平方微米。
  47. 如請求項34或35之方法，其中在該表面之該抗原呈現共價功能化區中，該複數個特異性結合的共活化分子配位體之密度為至少1 × 102 個分子/平方微米，或視情況在該表面之該抗原呈現共價功能化區中，密度為1 × 103 至1 × 105 個分子/平方微米。
  48. 如請求項34或35之方法，其中該表面之該抗原呈現共價功能化區中之該等初始活化分子配位體與該等共活化分子配位體之比率為1:5至2:1，或視情況1:2至1:1。
  49. 如請求項34或35之方法，其中該複數個共活化分子配位體之該等TCR共活化分子與該等輔助TCR活化分子之比率為3:1至1:3。
  50. 如請求項34或35之方法，其進一步包括使該複數個T細胞與複數個黏附性刺激分子配位體接觸，且視情況其中該複數個黏附性刺激分子配位體包括ICAM分子。
  51. 如請求項34或35之方法，其進一步包含使該複數個T細胞與複數個生長刺激性分子配位體接觸。
  52. 如請求項72之方法，其中該等生長刺激性分子配位體中之每一者包括生長因子受體配位體。
  53. 如請求項73之方法，其中該生長因子受體配位體包括IL-21或其片段。
  54. 如請求項51之方法，其中在至少一天之第一培養時段之後執行與該複數個生長刺激性分子配位體接觸。
  55. 如請求項34或35之方法，其中與該抗原呈現合成表面接觸之培養係執行約四天至約七天的時段。
  56. 如請求項34或35之方法，其中該活化T細胞為CD45RO+及/或CD28陽性。
  57. 如請求項34或35之方法，其中該抗原呈現功能化區之面積小於約25%之該孔盤之孔之底表面的面積。
  58. 一種活化淋巴球的方法，其包含： 使複數個淋巴球與孔盤表面之活化部分呈現共價功能化區接觸，其中該活化部分呈現共價功能化區包含連接至該表面之複數個初始活化分子配位體；及連接至該表面之複數個共活化分子配位體；且培養該複數個淋巴球，進而將該複數個淋巴球中之至少一部分轉化為活化淋巴球。
  59. 如請求項58之方法，其中該等淋巴球包含B細胞、T細胞或NK細胞。
  60. 如請求項58或59之方法，其中該活化部分呈現共價功能化區為如請求項1至13中任一項之孔盤表面的第一區域。
  61. 如請求項58或59之方法，其中該活化部分呈現功能化區之面積為小於25%之該孔盤之孔之底表面的面積。
  62. 一種用於製備孔盤之套組，該孔盤包含具有活化部分呈現共價功能化區之表面，該套組包含： 孔盤，其包含表面，該表面包含反應性部分呈現共價功能化區，其中該反應性部分為疊氮基部分、生物素部分或抗生蛋白鏈菌素部分；及 活化劑；及 視情況，表面功能化劑。
  63. 如請求項62之套組，其中該套組包含該表面功能化劑，且其中該表面功能化劑為經組態以與該反應性部分反應的含有生物素之試劑或含有抗生蛋白鏈菌素之試劑。
  64. 如請求項62或63之套組，其中該活化劑包含初始活化劑，該初始活化劑包含經組態以與該T細胞之T細胞受體結合且經組態以結合至抗生蛋白鏈菌素之結合位點或複數個CD3結合分子的複數個主要組織相容複合體(MHC)分子。
  65. 如請求項64之套組，其進一步包含共活化劑，該共活化劑包含複數個共活化分子，該複數個共活化分子各自經組態以結合抗生蛋白鏈菌素之結合位點，且其中該等共活化分子中之每一者包含CD2結合分子或CD28結合分子。
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