CN118218035A - 用于阵列产生的高密度沉积 - Google Patents
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Abstract
本文公开了用于产生高密度细胞阵列的方法。在一些实施例中，所述方法包括：提供包括多个细胞的样本；以及将所述样本中的所述多个细胞引入到微孔阵列的微孔中以产生细胞阵列，其中，所述微孔阵列包括每平方英寸500个或更多个微孔，并且其中，所述细胞阵列的所述微孔中的25％或更多包括单个细胞。所公开的方法可以用于产生高密度合成颗粒阵列和高密度试剂阵列。可以使用流式细胞仪将所述细胞引入到所述微孔中。
Description
分案申请说明
本申请是申请日为2017年4月19日、申请号为201780024706.3(国际申请号为PCT/US2017/028438)的发明申请的分案申请。
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2016年4月22日提交的题为“HIGH DENSITYDEPOSITION FOR ARRAY PRODUCTION(用于阵列产生的高密度沉积)”的美国临时申请号62/326,358；于2016年5月6日提交的题为“AUTOMATED SET-UP FOR CELL SORTING(用于细胞分选的自动化设置)”的美国临时申请号62/333,098；以及于2016年5月9日提交的题为“AUTOMATED SET-UP FOR CELL SORTING(用于细胞分选的自动化设置)”的美国临时申请号62/333,770的优先权，这些相关申请中的每一个的内容都通过引用以其全文结合在此。
发明背景
技术领域
本公开总体上涉及用于产生阵列例如细胞阵列或液滴阵列的高密度沉积领域。
背景技术
已经开发了如流式细胞术等用于将细胞沉积到96孔微量滴定板中的方法和技术。已经开发了如低浓度样本的重力沉积等用于以15％的占用率将单一细胞沉积到微孔(microwell)中的方法和技术。然而，仍然需要能够产生具有高特异性、准确度和占用率的高密度微孔阵列的方法和***。
发明内容
本公开提供了用于产生细胞阵列的方法。在一些实施例中，所述方法包括：提供包括多个细胞的样本；以及将所述样本中的所述多个细胞引入到微孔阵列的微孔中以产生所述细胞阵列，其中，所述微孔阵列包括每平方英寸500个或更多个微孔，并且其中，所述细胞阵列的所述微孔中的25％或更多包括单个细胞。将所述样本中的所述多个细胞引入到所述微孔阵列的所述微孔中包括：将所述样本中的所述多个细胞引入到所述微孔阵列的所述微孔中在多个第一期望位置处。将所述样本中的所述多个细胞引入到所述微孔阵列的所述微孔中在所述多个第一期望位置处包括：将来自所述多个细胞的兴趣细胞引入到所述多个第一期望位置之一处。
在一些实施例中，所述细胞阵列的所述微孔中的50％或更多包括单个细胞。在一些实施例中，所述微孔阵列包括每平方英寸1000个或更多个微孔。所述微孔阵列的所述微孔中的每一个都具有不超过1000纳升或不超过400纳升的体积。所述微孔阵列的所述微孔中的每一个都具有不超过1000微米或不超过400微米的直径。所述微孔阵列的所述微孔中的至少两个彼此间隔开不超过200微米或不超过80微米。
在一些实施例中，将所述多个细胞引入到所述微孔阵列的所述微孔中包括：将所述多个细胞流式细胞术地沉积到所述微孔阵列的所述微孔中。将所述多个细胞流式细胞术地沉积到所述微孔阵列的所述微孔中包括：使用流式细胞仪将单个细胞一次性沉积到所述微孔阵列的所述微孔中。
在一些实施例中，所述方法进一步包括：在将所述多个细胞引入到所述微孔阵列的所述微孔中之前，将试剂引入到所述微孔阵列的所述微孔中的一个或更多个中。在一些实施例中，所述方法进一步包括：将试剂引入到所述细胞阵列的所述微孔中的一个或更多个中。所述试剂包括一个或更多个合成颗粒。引入所述试剂包括：将所述试剂流式细胞术地沉积到所述微孔中。所述一个或更多个合成颗粒包括珠粒。
在一些实施例中，所述方法进一步包括：将合成颗粒引入到所述微孔阵列的所述微孔中在多个第二期望位置处。在一些实施例中，所述方法进一步包括：将兴趣合成颗粒引入到所述微孔阵列的所述微孔中在所述多个第二期望位置之一处，其中，所述合成颗粒中的一个不同于所述合成颗粒中的其他合成颗粒，其中，将合成颗粒引入到所述微孔阵列的所述微孔中的一个或更多个中包括：将所述合成颗粒中的所述一个引入到所述微孔阵列的微孔中在第二期望位置处。将合成颗粒引入到所述微孔阵列的所述微孔中包括：将所述合成颗粒流式细胞术地沉积到所述微孔阵列的所述微孔中。所述一个或更多个合成颗粒包括附有寡核苷酸条形码的磁性珠粒。
在一些实施例中，所述方法进一步包括：将流式细胞仪的分选部件与微孔阵列对齐。
本文公开了用于产生液滴阵列的方法。在一些实施例中，所述方法包括：将多个第一液滴引入到微孔阵列的微孔中以产生第一液滴阵列，其中，所述微孔阵列包括每平方英寸500个或更多个微孔，其中，所述第一液滴阵列的所述微孔中的25％或更多仅包括单个第一液滴。
在一些实施例中，所述第一液滴阵列的所述微孔中的50％或更多仅包括单个第一液滴。在一些实施例中，所述微孔阵列包括每平方英寸1000个或更多个微孔。所述微孔阵列的所述微孔中的每一个都具有不超过1000纳升或不超过400纳升的体积。所述微孔阵列的所述微孔中的每一个都具有不超过1000微米或不超过200微米的直径。
在一些实施例中，所述方法进一步包括：将多个第二液滴引入到所述第一液滴阵列的所述微孔中以产生第二液滴阵列，其中，所述第二液滴阵列的所述微孔中的25％或更多包括单个第一液滴和单个第二液滴。在一些实施例中，所述方法进一步包括：在将所述多个第一液滴引入到所述微孔阵列的所述微孔中之前，将多个第二液滴引入到所述微孔阵列的所述微孔中以产生第二液滴阵列，其中，所述第二液滴阵列中的所述微孔中的25％或更多包括单个第一液滴和单个第二液滴。
在一些实施例中，所述多个第一液滴和所述多个第二液滴中的每一个都分别包括单个细胞或合成颗粒。所述合成颗粒包括附有多个寡核苷酸条形码的珠粒。所述多个寡核苷酸条形码中的每一个都与所述多个寡核苷酸条形码中的至少另一个相同或不同。所述多个第二液滴中的第二液滴进一步包括试剂。引入所述多个第一液滴包括：将所述多个第一液滴流式细胞术地沉积到所述微孔阵列的所述微孔中。将所述多个第一液滴流式细胞术地沉积到所述微孔阵列的所述微孔中包括：使用流式细胞仪将单个第一液滴一次性沉积到所述微孔阵列的所述微孔中。
本文公开了细胞阵列。在一些实施例中，细胞阵列包括微孔阵列，所述微孔阵列包括每平方英寸500个或更多个微孔，其中，所述微孔阵列的所述微孔中的25％或更多包括单个细胞。
在一些实施例中，所述微孔中的50％或更多包括单个细胞。所述微孔阵列包括每平方英寸1000个或更多个微孔。所述微孔阵列的所述微孔中的每一个都具有不超过1000纳升或不超过400纳升的体积。所述微孔阵列的所述微孔中的每一个都具有不超过1000微米或不超过400微米的直径。所述微孔阵列的所述微孔中的至少两个彼此间隔开不超过200微米或不超过80微米。
在一些实施例中，所述微孔阵列的所述微孔中的25％或更多包括单个细胞和合成颗粒。所述合成颗粒包括附有多个寡核苷酸条形码的珠粒。
本文公开了用于对齐第一对齐微孔阵列以产生样本微孔阵列的方法。在一些实施例中，所述方法包括：(a)使用第一成像传感器确定第一参数并且使用第二成像传感器确定第二参数，其中，所述第一成像传感器和所述第二成像传感器大致彼此正交并且被定位在废液接收器皿与第一对齐微孔阵列之间；(b)提供所述第一对齐微孔阵列上、在x方向和y方向上的期望位置；(c)基于所述第一参数和所述第二参数将第一对齐液滴沉积到所述第一对齐微孔阵列的微孔中，其中，所述第一参数与所述x方向上的所述期望位置相关，并且其中，所述第二参数与所述y方向上的所述期望位置相关；(d)确定所述第一对齐液滴在所述第一对齐微孔阵列上的位置与所述期望位置之间的距离；(e)如果所述距离大于预定阈值，则基于所述第一对齐液滴在所述第一对齐微孔阵列上的位置与所述期望位置之间的所述距离调整所述第一参数和所述第二参数；以及(f)重复步骤(b)至(e)，直到所述第一对齐液滴在所述第一对齐微孔阵列上的位置与所述期望位置之间的所述距离不大于所述预定阈值。
确定所述第一对齐液滴在所述第一对齐微孔阵列上的位置与所述期望位置之间的所述距离包括：使用所述第一成像传感器对所述第一对齐微孔阵列和所述第一对齐液滴进行成像以及使用所述第二成像传感器对所述第一对齐阵列和所述第一对齐液滴进行成像。基于所述第一对齐液滴在所述第一对齐微孔阵列上的位置与所述期望位置之间的所述距离调整所述第一参数和所述第二参数包括：基于通过所述第一成像传感器对所述第一对齐微孔阵列和所述第一对齐液滴进行的所述成像和通过所述第二成像传感器对所述第一对齐微孔和所述第一对齐液滴进行的所述成像确定所述第一对齐液滴在所述第一对齐微孔阵列上的位置。
在一些实施例中，将所述第一对齐液滴沉积到所述第一对齐微孔阵列的所述微孔中包括：将所述第一对齐液滴沉积到所述第一对齐微孔阵列的对齐设备中，并且其中，确定所述第一对齐液滴在所述第一对齐微孔阵列上的位置与所述期望位置之间的所述距离包括：使用所述第一成像传感器对所述对齐设备和所述对齐设备上的所述第一对齐液滴进行成像以及使用所述第二成像传感器对所述对齐设备和所述对齐设备上的所述第一对齐液滴进行成像。
在一些实施例中，对齐设备包括多个对齐区域。所述多个对齐区域中的两个对齐区域可以包括大致相等的面积。所述多个对齐区域可以包括多个同心环。所述同心环中的两个同心环可以彼此分离0.1mm。所述同心环中的两个同心环可以彼此分离1mm。
在一些实施例中，所述第一参数与液滴电荷相关。所述第二参数与所述第一对齐液滴在所述第一对齐微孔阵列上在所述y方向上的位置相关。所述第一成像传感器是CCD相机或CMOS相机。所述第二成像传感器是CMOS相机或CCD相机。
在一些实施例中，将所述第一对齐液滴沉积到所述第一对齐微孔阵列的所述微孔中包括：将所述第一对齐液滴流式细胞术地沉积到所述第一对齐微孔阵列的所述微孔中。所述预定阈值与所述第一对齐液滴距所述废液接收器皿的边缘的距离相关。
在一些实施例中，所述方法进一步包括：基于所述第一参数和所述第二参数将样本液滴引入到所述样本微孔阵列的微孔中。在一些实施例中，所述方法可以包括：基于所述第一参数和所述第二参数将多个样本液滴引入到所述样本微孔阵列的微孔中。所述多个样本液滴包括细胞、附有寡核苷酸条形码的颗粒或其任何组合。
在一些实施例中，所述方法进一步包括：在将所述多个样本液滴引入到所述样本阵列的所述微孔中之前，将第二对齐液滴引入到第二对齐微孔阵列的微孔中；以及使用所述第二成像传感器确定所述第二对齐液滴在所述第二对齐微孔阵列上的位置，其中，将所述多个样本液滴引入到所述样本微孔阵列的所述微孔中进一步基于所述第二对齐液滴在所述第二对齐阵列上的位置。
在一些实施例中，提供在所述第一对齐微孔阵列上在所述x方向上的所述期望位置包括：使用所述第一成像传感器确定在所述第一对齐微孔阵列上在所述x方向上的所述期望位置，并且提供在所述第一对齐微孔阵列上在所述y方向上的所述期望位置包括：使用所述第二成像传感器确定在所述样本阵列上在所述y方向上的所述期望位置。
本文还公开了用于产生细胞阵列的***。在一些实施例中，***包括：细胞分选部件，所述细胞分选部件被配置成：将液滴流式细胞术地引入到微孔阵列的微孔中以产生细胞阵列，其中，所述微孔阵列包括每平方英寸500个或更多个微孔；以及控制部件，所述控制部件被配置成：接收在所述微孔阵列上在x方向和y方向上的期望位置；并且使用第一成像传感器确定第一参数并且使用第二成像传感器确定第二参数以便将所述液滴引入到所述微孔阵列的微孔中，其中，所述第一成像传感器和所述第二成像传感器大致彼此正交并且处于废液接收器皿与所述微孔阵列之间，并且其中，所述液滴的位置与所述期望位置之间的距离处于预定阈值内。
在一些实施例中，所述***可以包括所述微孔阵列，其中，所述微孔阵列与所述细胞分选部件成液滴接收关系。
在一些实施例中，所述液滴包括细胞或合成颗粒。所述合成颗粒包括磁性珠粒。所述合成颗粒包括附有寡核苷酸条形码的珠粒。所述微孔阵列的所述微孔中的每一个都具有不超过1000纳升的体积。所述微孔阵列的所述微孔中的每一个都具有不超过1000微米的直径。所述微孔阵列的所述微孔中的至少两个彼此分离不超过200微米。
在一些实施例中，确定所述第一参数和所述第二参数包括：将第一对齐液滴流式细胞术地沉积到第一对齐微孔阵列的微孔上。所述第一参数与液滴电荷相关，并且所述第二参数与第一对齐液滴在所述第一对齐微孔阵列上在所述y方向上的位置相关。所述预定阈值与所述液滴距所述废液接收器皿的边缘的距离相关。
在一些实施例中，所述控制部件进一步被配置成基于所述第一参数和所述第二参数将多个细胞引入到所述微孔阵列的微孔中。所述控制部件进一步被配置成：在将所述多个细胞引入到微孔阵列的微孔中之前，将第二对齐液滴引入到第二对齐微孔阵列的微孔中；以及确定第二对齐液滴在第二对齐微孔阵列上的位置，其中，将所述多个细胞引入到所述细胞阵列的所述微孔中进一步基于所述第二对齐液滴在所述第二对齐微孔阵列上的位置。
在一些实施例中，所述控制部件被配置成：接收在所述微孔阵列上在所述x方向和所述y方向上的所述期望位置；并且使用所述第一成像传感器确定所述第一参数并且使用所述第二成像传感器确定所述第二参数以便将所述液滴引入到所述微孔阵列的所述微孔中，其中，所述第一成像传感器和所述第二成像传感器大致彼此正交并且处于废液接收器皿与所述微孔阵列之间，并且其中，所述液滴的位置和所述期望位置处于预定阈值内。
在一些实施例中，所述控制部件被配置成：接收在所述微孔阵列上在所述x方向和所述y方向上的所述期望位置；并且使用所述第一成像传感器确定所述第一参数并且使用所述第二成像传感器确定所述第二参数以便将所述液滴引入到所述微孔阵列的所述微孔中，其中，所述第一成像传感器和所述第二成像传感器大致彼此正交并且处于废液接收器皿与所述微孔阵列之间，并且其中，所述液滴的位置和所述期望位置处于预定阈值内。
本文公开了用于流动流对齐的***和方法。在一些实施例中，所述***包括：成像传感器，所述成像传感器被配置成捕获流式细胞仪的检测场中的流动流的一个或更多个图像；以及处理器，所述处理器包括可操作地耦合到所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储于其上的用于确定所述流动流的一个或更多个性质且生成与所述流动流的所述一个或更多个性质相对应的数据信号的指令，其中，所述处理器被配置成响应于所述数据信号而自动调整所述流动流的一个或更多个参数。
本文公开了对齐流动流的方法。在一些实施例中，所述方法包括：(a)接收用于将第一对齐液滴沉积到第一对齐微孔阵列上的期望位置的第一参数；(b)使用所述第一参数将第二对齐液滴沉积到第二对齐微孔阵列；(c)使用第一成像传感器确定所述第二对齐液滴在第一检测场中从细胞分选部件到所述第二对齐微孔的路径，其中，所述第一成像传感器被定位在所述细胞分选部件与废液接收器皿之间；以及(d)确定所述第一对齐液滴在所述第一检测场中的路径的第一位置与所述第二液滴在所述第一检测场中的所述路径的相应第一位置之间的第一测量结果。
在一些实施例中，所述方法包括：(e)如果所述第一测量结果大于第一预定阈值，则：基于所述第一测量结果调整所述第一参数；以及重复步骤(b)至(d)。在一些实施例中，其中，接收用于将所述第一对齐液滴沉积到所述第一对齐微孔阵列上的所述第一期望位置的所述第一参数包括：使用所述第一参数将所述第一对齐液滴沉积到所述第一对齐微孔阵列上的所述期望位置；以及使用所述第一成像传感器确定所述第一对齐液滴在所述第一检测场中的所述路径。
在一些实施例中，所述细胞分选部件包括喷嘴。所述喷嘴可以包括孔口。所述细胞分选部件包括偏转板。
在一些实施例中，第一参数可以与x方向上的期望位置相关。第一参数可以与液滴电荷相关。
在一些实施例中，使用所述第一参数将所述第一对齐液滴沉积到所述第一对齐微孔阵列上的所述期望位置包括：使用所述第一参数和第二参数将所述第一对齐液滴沉积到所述第一对齐微孔阵列上的所述期望位置。使用所述第一参数将所述第二对齐液滴沉积到所述第二对齐微孔阵列可以包括：使用所述第一参数和所述第二参数将所述第二对齐液滴沉积到所述第二对齐微孔阵列。
在一些实施例中，第二参数可以与y方向上的期望位置相关。第二参数可以与液滴电荷相关。
在一些实施例中，步骤(b)可以包括：使用第二成像传感器确定所述第一对齐液滴在第二检测场中从所述偏转板到所述第一对齐微孔阵列上的所述期望位置的路径，其中，所述第二成像传感器被定位在所述废液接收器皿与所述偏转板之间。步骤(c)可以包括：使用所述第二成像传感器确定所述第二对齐液滴在所述第二检测场中的路径。步骤(d)可以包括：确定所述第一对齐液滴在所述第二检测场中的所述路径的第二位置与所述第二液滴在所述第二检测场中的所述路径的相应第二位置之间的第二测量结果。步骤(f)可以包括：如果所述第二测量结果大于第二预定阈值，则基于所述第二测量结果调整所述第二参数。
在一些实施例中，第一成像传感器和第二成像传感器大致彼此正交。所述第一成像传感器可以是CCD相机或CMOS相机。所述第二成像传感器可以是CCD相机或CMOS相机。
在一些实施例中，确定所述第一对齐液滴在所述第一检测场中的所述路径可以包括：捕获所述第一对齐液滴在所述第一检测场中的第一对齐图像。确定所述第二对齐液滴在所述第一检测场中的所述路径可以包括：捕获所述第二对齐液滴在所述第一检测场中的第二对齐图像。确定所述第一对齐液滴在所述第一检测场中的所述路径可以包括：确定所述第一对齐图像中沿着所述第一对齐液滴在所述第一检测场中的所述路径的第一通道。所述第一测量结果可以包括所述第二对齐液滴在所述第一检测场中的所述路径的至少一部分是否处于所述第二对齐图像中的相应第一通道内。
在一些实施例中，所述第一通道可以由所述第一对齐图像中的两个条表示，并且其中，所述相应第一通道由所述第二对齐图像中的相应两个条表示。所述第一测量结果可以包括所述第一对齐液滴在所述第一检测场中的所述路径的所述第一位置与所述第二液滴在所述第一检测场中的所述路径的所述相应第一位置之间的第一距离。
在一些实施例中，确定所述第一对齐液滴在所述第二检测场中的所述路径可以包括：捕获所述第一对齐液滴在所述第二检测场中的第三对齐图像。确定所述第二对齐液滴在所述第二检测场中的所述路径可以包括：捕获所述第二对齐液滴在所述第二检测场中的第四对齐图像。确定所述第一对齐液滴在所述第二检测场中的所述路径可以包括：确定所述第三对齐图像中沿着所述第一对齐液滴在所述第二检测场中的所述路径的第二通道。所述第二测量结果可以包括所述第二对齐液滴在所述第一检测场中的所述路径的至少一部分是否处于所述第二对齐图像中的相应第二通道内。
在一些实施例中，所述第二通道可以由所述第三对齐图像中的两个条表示，并且其中，所述相应第二通道由所述第四对齐图像中的相应两个条表示。所述第二测量结果可以包括所述第一对齐液滴在所述第二检测场中的所述路径的所述第二位置与所述第二液滴在所述第一检测场中的所述路径的所述相应第二位置之间的第二距离。
在一些实施例中，将所述第一对齐液滴沉积到所述第一对齐微孔阵列的所述期望位置可以包括：将所述第一对齐液滴流式细胞术地沉积到所述第一对齐微孔阵列的所述期望位置。使用所述第一参数来沉积所述第二液滴可以包括：使用所述第一参数流式细胞术地沉积所述第二。
在一些实施例中，所述方法可以包括：基于所述第一参数将样本液滴引入到所述样本微孔阵列的微孔中。所述方法可以包括：基于所调整的第一参数将多个样本液滴引入到所述样本微孔阵列的多个微孔中。所述多个样本液滴可以包括细胞、附有寡核苷酸条形码的颗粒或其任何组合。
本文公开了用于产生细胞阵列的***。在一些实施例中，所述***包括：细胞分选部件；非暂态存储器，所述非暂态存储器被配置成存储可执行指令；以及与细胞分选部件和非暂态存储器通信的处理器，所述处理器被可执行指令编程用于：(a)接收用于将所述第一对齐液滴沉积到所述第一对齐微孔阵列上的所述期望位置的第一参数；(b)使细胞分选部件使用第一参数将第二对齐液滴沉积到第二对齐微孔阵列；并且(c)使用第一成像传感器确定所述第二对齐液滴在第一检测场中从所述细胞分选部件到所述第二对齐微孔的路径，其中，所述第一成像传感器被定位在所述细胞分选部件与废液接收器皿之间；并且(d)确定所述第一对齐液滴在所述第一检测场中的路径的第一位置与所述第二液滴在所述第一检测场中的所述路径的相应第一位置之间的第一测量结果。
在一些实施例中，所述处理器被编程用于：使所述细胞分选部件使用所述第一参数将液滴引入到微孔阵列的微孔中以产生细胞阵列，其中，所述微孔阵列包括每平方英寸500个或更多个微孔。
在一些实施例中，所述***可以包括所述微孔阵列，其中，所述微孔阵列与所述细胞分选部件成液滴接收关系。所述液滴可以包括细胞或合成颗粒。所述合成颗粒可以包括磁性珠粒。所述合成颗粒可以包括附有寡核苷酸条形码的珠粒。所述微孔阵列的所述微孔中的每一个都可以具有不超过1000纳升的体积。所述微孔阵列的所述微孔中的每一个都可以具有不超过1000微米的直径。所述微孔阵列的所述微孔中的至少两个可以彼此分离不超过200微米。
在一些实施例中，为了确定所述第一参数和所述第二参数，所述处理器被所述可执行指令编程用于将第一对齐液滴流式细胞术地沉积到第一对齐微孔阵列的微孔上。所述第一参数可以与液滴电荷相关，并且所述第二参数与第一对齐液滴在所述第一对齐微孔阵列上在所述y方向上的位置相关。
所述处理器可以被所述可执行指令编程用于：基于所述第一参数和所述第二参数将多个细胞引入到所述微孔阵列的微孔中。所述处理器可以被编程用于：(e)如果所述第一测量结果大于第一预定阈值，则：基于所述第一测量结果调整所述第一参数；并且重复步骤(b)到(d)。在一些实施例中，为了接收用于将所述第一对齐液滴沉积到所述第一对齐微孔阵列上的所述第一期望位置的所述第一参数，所述硬件处理器被所述可执行指令编程用于：使用所述第一参数将所述第一对齐液滴沉积到所述第一对齐微孔阵列上的所述期望位置；并且使用所述第一成像传感器确定所述第一对齐液滴在所述第一检测场中的所述路径。
在一些实施例中，所述细胞分选部件可以包括喷嘴。所述喷嘴可以包括孔口。所述细胞分选部件包括偏转板。
附图说明
图1是液滴阵列的非限制性示例性示意图。
图2是适合于产生高密度液滴阵列的分选设备的非限制性示意图。
图3A和图3B示意性地展示了具有两个用于将对齐微孔阵列对齐的正交相机的非限制性示例性分选设备。
图4A示出了用于流对齐的非限制性示例性分选设备的示意图。图4B和图4C各自示出了偏转流的非限制性示例性图像，其中，两个条表示正确路径。
图5A和图5B是流程图，示出了用于使微孔阵列、例如对齐微孔阵列对齐的非限制性示例性工作流。
图6是用于控制分选设备的细胞分选器计算机***的非限制性示例性框图。
图7A和图7B示出了高密度液滴阵列的产生。
图8示出了不具有流的非限制性示例性照片。
图9示出了在中部(往左边，理想地应当处于中心)具有流的非限制性示例性照片。
图10示出了双通道设置视图的非限制性示例性照片。
图11示出了自动细胞沉积单元(ACDU，Automated Cell Deposition Unit)视图(板分选)的非限制性示例性照片。
图12示出了四通道设置视图的非限制性示例性照片。
图13示出了在校准(接通电压、接通测试分选)期间的视图的非限制性示例性照片，竖线点是未处于通道中的偏转流。
图14示出了将图13所示的移动流调整到通道中的非限制性示例性照片。
图15示出了非限制性示例性照片，所述照片显示，在用户***不同的喷嘴之后，所述流移动到右边并且偏转流也向右移动。
图16示出了图15中的设置的非限制性示例性照片，其中，电压被调整以使偏转流返回到优选通道中。
图17A和图17B示出了非限制性示例性校准板。
图18A到图18C示出了用于校准微孔板的非限制性用户界面。
具体实施方式
在以下详细描述中，参考了形成其一部分的附图。在附图中，类似的符号通常标识类似的组件，除非上下文另外规定。在详细说明书、附图、以及权利要求中所描述的这些说明性实施例并不旨在进行限制。在不脱离本文所呈现的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施例，并且可以进行其他改变。将容易理解的是，如本文总体所述且如附图所示，本公开的方面可以按照各种各样的不同配置进行安排、替换、组合、分离和设计，在本文中明确设想了所有所述配置。
本发明的***、方法和计算机***应用于期望使对流式细胞仪的流动流进行自动化调整以提供快速可靠的***来表征和分选来自生物样本的细胞的各种不同应用中。本公开的实施例应用于期望使对***的人类输入和调整的依赖量最小化的情形，如应用于研究和高吞吐量实验室测试中。本公开还应用于期望提供在细胞分选期间具有如下各项的流式细胞仪的情形：提高的细胞分选准确度、增强的颗粒收集、提供关于部件故障(例如，流动池喷嘴堵塞)的警告的***、减少的能耗、颗粒充电效率、更准确的颗粒充电以及增强的颗粒偏转。在实施例中，本公开减少了在使用流式细胞仪进行样本分析期间对用户输入或手动调整的需要。在某些实施例中，本发明的***提供完全自动化的方案，使得在使用期间对流式细胞仪的调整需要很少(如果有的话)的人类输入。
本公开还应用于可能期望将由生物样本制备的细胞用于研究、实验室测试或用于治疗的应用中。在一些实施例中，本发明的方法和设备可以促进获得由目标流体或组织生物样本制备的单个细胞。例如，本发明的方法和***促进从流体样本或组织样本中获得待用作如癌症等疾病的研究或诊断标本的细胞。同样，本发明的方法和***促进从流体样本或组织样本中获得待用于治疗的细胞。相比于传统流式细胞术***，本公开的方法和设备允许以高效率和低成本从生物样本(例如，器官、组织、组织碎片、流体)中分离和收集细胞。
可以在任何合宜的流式细胞仪***中采用本公开的***和方法。用于分析样本的适当流式细胞仪***和方法包括但不限于以下文献中描述的那些：奥默罗德(Ormerod)(编辑)，《Flow Cytometry：A Practical Approach(流式细胞术：实用方式)》，牛津大学出版社(1997年)；雅罗谢斯基(Jaroszeski)等人(编辑)，《Flow Cytometry Protocols(流式细胞术方案)》，《Methods in Molecular Biology(分子生物学方法)》，第91卷，美国胡马纳出版社(1997年)；《实用流式细胞术(Practical Flow Cytometry)》，第3版，威利-利斯(Wiley-Liss)(1995年)；维尔戈(Virgo)等人(2012年)，《Ann Clin Biochem.(临床生物化学纪事)》，1月，第49卷，第1期，第17到28页；林登(Linden)等人，《Semin Throm Hemost.(血栓与止血研讨会)》，2004年10月，30(5):502-11；艾莉森(Alison)等人，《病理学杂志(JPathol)》，2010年12月，222(4):335-344；以及赫比格(Herbig)等人(2007年)，《治疗药物载体***关键评论(Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.)》，24(3):203-255；；这些文献的公开内容通过引用结合在此。在某些实例中，兴趣流式细胞术***包括BD生物科学(BDBiosciences)FACSCantoTM流式细胞仪、BD生物科学FACSVantageTM、BD生物科学FACSortTM、BD生物科学FACSCountTM、BD生物科学FACScanTM以及BD生物科学FACSCaliburTM***、BD生物科学InfluxTM细胞分选仪、BD生物科学JazzTM细胞分选仪和BD生物科学AriaTM细胞分选仪等。
在某些实施例中，本发明的***是结合了以下美国专利号中描述的流式细胞仪的一个或更多个部件的流式细胞仪***：3,960,449；4,347,935；4,667,830；4,704,891；4,770,992；5,030,002；5,040,890；5,047,321；5,245,318；5,317,162；5,464,581；5,483,469；5,602,039；5,620,842；5,627,040；5,643,796；5,700,692；6,372,506；6,809,804；6,813,017；6,821,740；7,129,505；7,201,875；7,544,326；8,140,300；8,233,146；8,753,573；8,975,595；9,092,034；9,095,494和9,097,640；这些美国专利的公开内容通过引用结合在此。
定义
除非另外定义，否则本文中使用的技术术语和科学术语的含义与本公开所属领域的普通技术人员普遍理解的含义相同。参见例如辛格尔顿(Singleton)等人，《Dictionaryof Microbiology and Molecular Biology(微生物学与分子生物学词典)》第2版，约翰威立(J.Wiley&Sons)(纽约州纽约市，1994年)；萨姆布鲁克(Sambrook)等人，《MolecularCloning,A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册)》，冷泉港出版社(纽约州冷泉港，1989年)。为了本公开的目的，以下术语定义如下。
如本文中所使用的，术语“标记(label或labels)”可以指与样本中的靶标相关联的核酸代码。标记可以是例如核酸标记。标记可以是可完全或部分扩增的标记。标记可以是可完全或部分测序的标记。标记可以是原生核酸的可标识为独特的一部分。标记可以是已知序列。标记可以包括核酸序列的接点(junction)，例如原生序列与非原生序列的接点。如本文中所使用的，术语“标记”可以与术语“索引”、“标签”或“标记-标签”互换使用。标记可以传递信息。例如，在各个实施例中，标记可以用于确定样本的身份、样本的来源、细胞的身份和/或靶标。
如本文中所使用的，术语“固相载体”可以指多个寡核苷酸、例如随机条形码可以附接到其上的离散固体或半固体表面。固相载体可以涵盖可以将核苷酸(例如，共价地或非共价地)固定于其上的由塑料、陶瓷、金属或聚合材料(例如，水凝胶)构成的任何类型的实心、多孔或空心球体、球、轴承、圆柱体或其他类似配置。固相载体可以包括可以是球形的离散颗粒(例如，微球体)或具有非球形或不规则形状的离散颗粒，所述形状如立方体、长方体、角锥形、圆柱形、圆锥形、长方形或圆盘形等。固相载体可以是“珠粒(bead)”。
如本文中所使用的，术语“随机条形码”可以指包括标记的寡核苷酸序列。随机条形码可以是可以用于进行随机条形编码的寡核苷酸序列。随机条形码可以用于量化样本内的靶标。随机条形码可以用于控制在将标记与靶标关联之后可能发生的错误。例如，随机条形码可以用于评估扩增或测序错误。与靶标相关联的随机条形码可以被称为随机条形码靶标(stochastic barcode-target)或随机条形码标记靶标(stochastic barcode-tag-target)。
如本文中所使用的，术语“基板”可以指可以在其上执行本公开的方法的连续固体或半固体表面。基板可以指例如阵列、盒、芯片、设备和载玻片。
本文公开了用于产生高密度阵列的方法、组合物和***、以及通过本文公开的方法、组合物和***产生的高密度阵列，所述高密度阵列包括但不限于液滴阵列、珠粒阵列和细胞阵列。在一些实施例中，高密度阵列的产生可以利用用于将一个或更多个对齐微孔阵列对齐的方法，其中，所述方法可以利用大致彼此正交的两个成像传感器。
液滴阵列
本文公开了用于产生液滴阵列的方法。在一些实施例中，所述方法可以包括：将多个液滴引入到微孔阵列的微孔中以产生液滴阵列。在一些实施例中，液滴可以包括或者可以是一小滴液体、水油液滴或其任何组合。液滴可以包括例如单个细胞、两个或更多个细胞、一个或更多个固相载体、一个或更多个合成颗粒、一种或更多种蛋白质、一种或更多个核酸、一种或更多种脂质、一种或更多种寡糖、一种或更多种酶、一个或更多个小分子或其任何组合。例如，所述多个液滴可以是或者可以包括：包括细胞的多滴液体、包括固相载体的多滴液体、包括合成颗粒的多滴液体或其任何组合。所述多个液滴中的一个或更多个可以包括例如试剂。液滴阵列可以是例如液滴阵列、珠粒阵列或细胞阵列。图1示意性地展示了非限制性示例性微孔阵列102。微孔阵列102可以包括多个微孔，包括微孔104a至104a d、106a至106d以及108a至108d。微孔阵列的密度可以变化。在一些实施例中，微孔阵列的密度可以是每平方英寸500个或更多个微孔。在一些实施例中，微孔阵列的微孔中的25％或更多可以包括单个液滴，例如单个细胞或合成颗粒。在一些实施例中，微孔阵列的微孔中的30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多包括单个液滴，例如单个细胞或合成颗粒。在图1中，六个孔，即孔104a、104d、106b、106c、108e和108d各自包括单个液滴，例如分别为单个细胞110a、110b、110c、110d、110e和110f。
在一些实施例中，本文公开的方法可以用于产生细胞阵列。在一些实施例中，将所述多个液滴引入到微孔阵列的微孔中以产生液滴阵列可以包括：将样本中的多个细胞引入到微孔阵列的微孔中以产生细胞阵列。单个液滴可以包括单个细胞，并且液滴阵列可以是细胞阵列。在一些实施例中，所述方法可以包括：提供所述样本，其中，所述样本包括所述多个细胞。在一些实施例中，所述方法可以包括：提供包括多个细胞的样本；以及将所述样本中的所述多个细胞引入到微孔阵列的微孔中以产生细胞阵列。
在一些实施例中，本文公开的方法可以用于产生合成颗粒阵列。在一些实施例中，将所述多个液滴引入到微孔阵列的微孔中以产生液滴阵列可以包括：将多个合成颗粒引入到微孔阵列的微孔中以产生合成颗粒阵列。单个液滴可以包括合成颗粒，并且液滴阵列可以是合成颗粒阵列。在一些实施例中，所述方法可以包括：提供多个合成颗粒；以及将所述多个合成颗粒引入到微孔阵列的微孔中以产生合成颗粒阵列。
在一些实施例中，所述方法可以包括：将细胞样本中的多个兴趣细胞引入到微孔阵列的微孔中在多个期望位置处，例如第一多个期望微孔。将所述多个兴趣细胞引入到微孔阵列的微孔中在多个期望位置处可以包括：从细胞样本中的非兴趣细胞中流式细胞术地分选出兴趣细胞。在一些实施例中，可以将兴趣细胞中的每一个引入到微孔中在其对应的期望位置处。在一些实施例中，可以基于细胞样本中的兴趣细胞和非兴趣细胞上的细胞表面标志物分选细胞样本中的兴趣细胞和非兴趣细胞。
细胞样本类型可以变化。在一些实施例中，细胞样本可以是或者可以包括临床样本、生物样本、环境样本或其任何组合。例如，细胞样本可以包括来自患者的生物流体、组织和细胞中的一个或更多个。例如，细胞样本可以是或者可以包括血液、尿液、脑脊液、胸膜液、羊膜液、***、唾液、骨髓、活检样本或其任何组合。例如，细胞样本可以是或者可以包括混合癌细胞样本。
如本文中所使用的，术语“兴趣细胞”可以指被研究的细胞。兴趣细胞可以变化。在一些实施例中，兴趣细胞可以具有期望性质。例如，兴趣细胞可以具有兴趣表面标志物或者可以具有对表面标志物的高度表达。在一些实施例中，兴趣细胞可以表达恶性表型。在一些实施例中，兴趣细胞可以是或者可以包括肿瘤细胞，如已经从肿瘤流到血液或其他体液或骨髓中的肿瘤细胞；良性肿瘤细胞；癌细胞；外周血中的癌细胞；甲状腺癌细胞；乳腺癌细胞；循环肿瘤细胞(“CTC”)；白血病细胞；癌症干细胞；处于期望细胞周期阶段(G0/G1、S、G2)的细胞；承载X和Y染色体的***；干细胞；胎儿干细胞或成人干细胞；多能干细胞；血细胞；地中海贫血患者体内的有核红细胞(“NRBC”)；胎儿细胞，如孕妇外周血中的胎儿细胞；母体循环中的胎儿有核红细胞(“FNRBC”)；以及通过CD71、CD8、CD34或CD133表征的细胞；或其任何组合。在一些实施例中，兴趣细胞可以是或者可以包括循环内皮细胞；感染有病毒的细胞，如感染HIV的细胞、转染有兴趣基因的细胞；以及患有自身免疫疾病或自身反应疾病的受试者的外周血中存在的T细胞或B细胞的异常子类型；活化淋巴细胞；抗原呈递细胞，如单核细胞和树突细胞；病原或寄生生物，含有胞内寄生虫的细胞；如尿液等稀释流体中的细胞或微生物；或其任何组合。
兴趣细胞可以是或者可以包括细胞系。细胞系的非限制性示例包括：Jurkat细胞，其是T白血病细胞系；SKBR3，其是已知用于过表达Her2/neu的由腺癌衍生的乳腺癌细胞系；T47D，其是显示出低到中等Her2/neu表达的由导管癌衍生的乳腺癌细胞系；HeLa；或其任何组合。
细胞样本中的兴趣细胞的丰度可以变化。在一些实施例中，细胞样本中的兴趣细胞可以是或大约是细胞样本中的细胞总数的0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.1％、0.5％、1％、10％或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，细胞样本中的兴趣细胞可以是细胞样本中的细胞总数的至少或至多0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.1％、0.5％、1％或10％。在一些实施例中，细胞样本可以具有或大约具有每毫升细胞样本1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、50个、100个、250个、500个、1000个兴趣细胞或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，细胞样本可以具有每毫升细胞样本至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、50个、100个、250个、500个或1000个兴趣细胞。
兴趣细胞的大小可以变化。在一些实施例中，兴趣细胞的直径可以是或大约是1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、11微米、12微米、13微米、14微米、15微米、16微米、17微米、18微米、19微米、20微米、25微米、30微米、35微米、40微米、45微米、50微米、55微米、60微米、65微米、70微米、75微米、80微米、85微米、90微米、95微米、100微米或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，兴趣细胞的直径可以是至少或至多1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、11微米、12微米、13微米、14微米、15微米、16微米、17微米、18微米、19微米、20微米、25微米、30微米、35微米、40微米、45微米、50微米、55微米、60微米、65微米、70微米、75微米、80微米、85微米、90微米、95微米或100微米。
在一些实施例中，所述方法可以包括：将细胞样本中的第一多个兴趣细胞和第二多个兴趣细胞引入到微孔阵列的微孔中在多个期望位置处。对于所述第一多个兴趣细胞和所述第二多个兴趣细胞来说，所述多个期望位置可以是不同的。例如，第一多个期望微孔可以是所述第一多个兴趣细胞的期望位置。例如，第二多个期望微孔可以是所述第二多个兴趣细胞的期望位置。将细胞样本中的所述第一多个兴趣细胞和所述第二多个兴趣细胞引入到微孔阵列的微孔中在所述多个期望位置处可以包括：流式细胞术地分选细胞样本中的所述第一多个兴趣细胞和所述第二多个兴趣细胞。在一些实施例中，可以基于细胞样本中的所述第一多个兴趣细胞和所述第二多个兴趣细胞上的细胞表面标志物分选细胞样本中的所述第一多个兴趣细胞和所述第二多个兴趣细胞。
在一些实施例中，所述方法可以包括：将多个液滴、例如多个第二液滴引入到微孔阵列、例如第一液滴阵列或细胞阵列的微孔中以产生另一液滴阵列、例如第二液滴阵列。例如，所述方法可以包括：在将所述多个第一液滴引入到微孔阵列的微孔中之前，将多个第二液滴引入到微孔阵列的微孔中。例如，所述方法可以包括：在将所述多个第一液滴引入到微孔阵列的微孔中之后将多个第二液滴引入到微孔阵列的微孔中。在一些实施例中，液滴阵列的微孔中的25％或更多可以包括单个第一液滴、例如单个细胞以及单个第二液滴、例如合成颗粒或试剂。在图1中，六个孔，即孔104a、104b、106c、108a、108c和108d各自包括单个第二液滴，例如分别为单个合成珠粒110a、110b、110c、110d、110e或110f。四个孔，即孔104a、106c、108c和108d各自包括单个第一液滴和单个第二液滴。
在一些实施例中，所述方法可以包括：将试剂引入到微孔阵列的一个或更多个微孔中。例如，所述方法可以包括：在将所述多个细胞引入到微孔阵列的微孔中之前，将试剂引入到微孔阵列的一个或更多个微孔中。例如，所述方法可以包括：在将所述多个细胞引入到微孔阵列的微孔中之后将试剂引入到微孔阵列的一个或更多个微孔中。在一些实施例中，微孔阵列的微孔中的25％或更多可以包括单个细胞和试剂。在一些实施例中，微孔阵列的微孔中的30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多可以包括单个细胞和试剂。在一些实施例中，将试剂引入到微孔阵列的一个或更多个微孔中可以包括：将试剂引入到微孔阵列的所述一个或更多个微孔中在多个期望位置处。在一些实施例中，试剂可以包括一个或更多个合成颗粒。
在一些实施例中，所述方法可以包括：将合成颗粒引入到微孔阵列的一个或更多个微孔中。例如，所述方法可以包括：在将所述多个细胞引入到微孔阵列的微孔中之前，将合成颗粒引入到微孔阵列的一个或更多个微孔中。例如，所述方法可以包括：在将所述多个细胞引入到微孔阵列的微孔中之后将合成颗粒引入到微孔阵列的一个或更多个微孔中。在一些实施例中，微孔阵列的微孔中的25％或更多可以包括单个细胞和合成颗粒。在一些实施例中，微孔阵列的微孔中的30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或更多可以包括单个细胞和合成颗粒。
在一些实施例中，所述方法可以包括：将合成颗粒样本中的多个兴趣合成颗粒、例如珠粒引入到微孔阵列的微孔中在多个期望位置处，例如第二多个期望微孔。在一些实施例中，在将多个兴趣细胞引入到微孔阵列的微孔中在多个第一期望位置处之后将所述多个兴趣合成颗粒引入到微孔阵列的微孔中在所述多个期望位置处。在一些实施例中，兴趣合成颗粒可以包括试剂。在一些实施例中，将所述多个兴趣合成颗粒引入到微孔阵列的微孔中在所述多个期望位置处可以包括：从合成颗粒样本中的非兴趣合成颗粒中流式细胞术地分选出兴趣合成颗粒。在一些实施例中，可以基于合成颗粒样本中的兴趣合成颗粒和非兴趣合成颗粒是否含有试剂而对其进行分选。
在一些实施例中，所述方法可以包括：将合成颗粒样本中的第一多个合成颗粒和第二多个合成颗粒引入到微孔阵列的微孔中在多个期望位置处。所述第一多个合成颗粒的所述多个期望位置可以是第一多个期望位置。所述第二多个合成颗粒的所述多个期望位置可以是第二多个期望位置。在一些实施例中，在将一个或更多个多个兴趣细胞引入到微孔阵列的微孔中之后将所述第一多个合成颗粒和所述第二多个合成颗粒引入到微孔阵列的微孔中在所述多个期望位置处。在一些实施例中，所述第一多个合成颗粒可以包括第一试剂。在一些实施例中，所述第二多个合成颗粒可以包括第二试剂。在一些实施例中，将所述第一多个合成颗粒和所述第二多个合成颗粒引入到微孔阵列的微孔中在所述多个期望位置处可以包括：流式细胞术地分选所述第一多个合成颗粒和所述第二多个合成颗粒。在一些实施例中，可以基于合成颗粒样本中的所述第一多个合成颗粒和所述第二多个合成颗粒所包含的试剂、例如第一试剂和第二试剂而对其进行分选。
合成颗粒样本中的合成颗粒可以变化。在一些实施例中，合成颗粒样本中的合成颗粒可以是完全相同的。在一些实施例中，合成颗粒样本中的合成颗粒之一可以不同于合成颗粒样本中的合成颗粒中的其他合成颗粒。例如，合成颗粒样本中完全相同的合成颗粒的百分比可以是或大约是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99.9％、100％或这些值中的任何两个之间的数量或范围。例如，合成颗粒样本中相同的合成颗粒的百分比可以是至少或至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99.9％或100％。在一些实施例中，将合成颗粒引入到微孔阵列的所述一个或更多个微孔中可以包括：将合成颗粒引入到微孔阵列的微孔中在多个期望位置处，例如多个第二期望位置。
合成颗粒
本文描述的方法、组合物和***可以用于沉积合成颗粒以产生合成颗粒的高密度阵列。在一些实施例中，合成颗粒可以是或者可以包括附有寡核苷酸条形码的珠粒，例如磁性珠粒或聚合珠粒。在一些实施例中，合成颗粒可以是或者可以包括附有多个寡核苷酸条形码的珠粒。所述多个寡核苷酸条形码可以是例如多个随机条形码。随机条形码是可以用于随机标记(例如，条形码、标签)靶标的多核苷酸序列。随机条形码可以包括一个或更多个标记。非限制性示例性标记包括通用标记、染色体标记、细胞标记、分子标记、样本标记、板标记、空间标记和预空间标记。给定合成颗粒上的所述多个寡核苷酸条形码可以相同或不同。在一些实施例中，所述多个寡核苷酸条形码中的一个不同于所述多个寡核苷酸条形码中的至少另一个。在一些实施例中，给定合成颗粒上的所述多个寡核苷酸条形码可以具有相同的细胞标记序列。在一些实施例中，给定合成颗粒上的所述多个寡核苷酸条形码中的至少两个可以具有不同的分子标记序列。
珠粒的非限制性示例包括二氧化硅珠粒、二氧化硅状珠粒、硅胶珠粒、可控孔度玻璃珠粒、磁性珠粒、葡聚糖凝胶(Sephadex)/琼脂糖凝胶(Sepharose)珠粒、纤维素珠粒、聚苯乙烯珠粒或其任何组合、链霉亲和素珠粒、琼脂糖珠粒、 微珠粒、抗体缀合珠粒(例如，抗免疫球蛋白微珠粒)、蛋白A缀合珠粒、蛋白G缀合珠粒、蛋白A/G缀合珠粒、蛋白L缀合珠粒、寡(dT)缀合珠粒、抗生物素微珠粒、抗荧光染料微珠粒、BcMagTM羧基封端的磁性珠粒及其任何组合。
珠粒可以包括各种材料，包括但不限于顺磁性材料(例如，镁、钼、锂和钽)、超顺磁性材料(例如，铁氧体(Fe3O4；磁铁矿)纳米颗粒)、铁磁材料(例如，铁、镍、钴、其一些合金以及一些稀土金属化合物)、陶瓷、塑料、玻璃、聚苯乙烯、二氧化硅、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、琼脂糖、水凝胶、聚合物、纤维素、尼龙及其任何组合。在一些实施例中，珠粒(例如，随机标记附接到其上的珠粒)是水凝胶珠粒。在一些实施例中，珠粒包括水凝胶。
在一些实施例中，珠粒可以是使用随机条形码(如来自10X基因学(10X Genomics)(加利福尼亚州圣弗朗西斯科的凝胶珠粒)来官能化的聚合物珠粒，例如可变形珠粒或凝胶珠粒。在一些实施方式中，凝胶珠粒可以包括聚合物基凝胶。凝胶珠粒可以例如通过将一个或更多个聚合物前体包封到液滴中来生成。在聚合物前体暴露于加速剂(例如，四甲基乙二胺(TEMED))时，可以生成凝胶珠粒。
在一些实施例中，聚合物珠粒可以例如在期望条件下溶解、熔化或降解。期望条件可以包括环境条件。期望条件可以使聚合物珠粒以受控方式溶解、熔化或降解。凝胶珠粒可以由于化学刺激、物理刺激、生物刺激、热刺激、磁性刺激、电刺激、光刺激或其任何组合而溶解、熔化或降解。
如寡核苷酸条形码等分析物和/或试剂例如可以偶联/固定到凝胶柱的内表面(例如，可通过寡核苷酸条形码和/或用于生成寡核苷酸条形码的材料的扩散而进入的内部)和/或凝胶柱或本文所述的任何其他微胶囊的外表面。偶联/固定可以通过任何形式的化学键合(例如，共价键、离子键)或物理现象(例如，范德华力、偶极-偶极相互作用等)进行。在一些情况下，试剂到凝胶珠粒或本文所述的任何其他微胶囊的偶联/固定可以如例如通过不稳定部分(例如，通过化学交联剂，包括本文所述的化学交联剂)而逆转。在施加刺激时，不稳定部分可以被裂解并且固定的试剂被释放。在一些情况下，不稳定部分是二硫键。例如，在寡核苷酸条形码通过二硫键固定到凝胶珠粒的情况下，二硫键暴露于还原剂可以裂解二硫键并且将寡核苷酸条形码从珠粒释放。不稳定部分可以被包括作为凝胶珠粒或微胶囊的一部分、作为将试剂或分析物连接到凝胶珠粒或微胶囊的化学接头的一部分和/或作为试剂或分析物的一部分。
在一些实施例中，凝胶珠粒可以包括宽范围的不同聚合物，包括但不限于：聚合物、热敏聚合物、光敏聚合物、磁性聚合物、pH敏感的聚合物、盐敏聚合物、化学敏感聚合物、聚合电解质、多糖、肽、蛋白质和/或塑料。聚合物可以包括但不限于如以下各项等材料：聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(苯乙烯磺酸酯)(PSS)、聚(烯丙基胺)(PAAm)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(乙烯亚胺)(PEI)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDADMAC)、聚(吡咯)(PPy)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVPON)、聚(乙烯基吡啶)(PVP)、聚(甲基丙烯酸)(PMAA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚苯乙烯(PS)、聚(四氢呋喃)(PTHF)、聚(苯二甲醛)(PTHF)、聚(己基紫罗碱)(PHV)、聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚(L-精氨酸)(PARG)、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)。
可以使用多种化学刺激来触发珠粒的破裂或降解。这些化学变化的示例可以包括但不限于珠粒壁的pH介导变化、通过交联键的化学裂解而进行的珠粒壁崩解、所触发的珠粒壁解聚合以及珠粒壁切换反应。还可以使用体积变化来触发珠粒的破裂。
通过各种刺激实现的微胶囊的体积或物理变化还在将胶囊设计成释放试剂方面提供了许多优点。体积或物理变化以宏观尺度发生，其中珠粒破裂是通过刺激诱导的机械物理力的结果。这些过程可以包括但不限于压力诱导的破裂、珠粒壁熔化或珠粒壁的孔隙度变化。
还可以使用生物刺激来触发珠粒的破裂或降解。通常，生物触发物类似于化学触发物，但是许多示例使用生物分子或如酶、肽、糖、脂肪酸、核酸等常见于生命***中的分子。例如，珠粒可以包括具有对通过特异性蛋白酶进行的裂解敏感的肽交联剂的聚合物。更具体地，一个示例可以包括包含有GFLGK肽交联剂的微胶囊。在添加如蛋白酶——组织蛋白酶B等生物触发物时，壳壁的肽交联剂被裂解并且珠粒的内容物被释放。在其他情况下，蛋白酶可以是热活化的。在另一个示例中，珠粒包括包含有纤维素的壳壁。添加水解酶壳聚糖充当纤维素键裂解、壳壁解聚合和其内部内容物释放的生物触发因素。
珠粒还可以被诱导成在施加热刺激时释放其内容物。温度变化可以引起各种珠粒变化。热量变化可以引起珠粒熔化，使得珠粒壁崩解。在其他情况下，热量可以增大珠粒的内部组分的内部压力，使得珠粒破裂或***。在仍其他情况下，热量可以将珠粒变换为缩小的脱水状态。热量还可以作用于珠粒的壁内的热敏聚合物以引起珠粒破裂。
将磁性纳米颗粒包括到微胶囊的珠粒壁可以允许触发珠粒匹配以及将珠粒引导到阵列中。本公开的设备可以包括用于任一目的的磁性珠粒。在一个示例中，将Fe3O4纳米颗粒结合到包含珠粒的聚合电解质中在存在振荡磁场刺激的情况下触发破裂。
珠粒还可以由于电刺激而破裂或降解。类似于之前的节段中描述的磁性颗粒，电敏珠粒可以允许触发珠粒破裂以及如在电场中对齐、电导率或氧化还原反应等其他功能。在一个示例中，包含电敏材料的珠粒在电场中被对齐成使得可以控制内部试剂的释放。在其他示例中，电场可以在珠粒壁本身诱导可以增大孔隙度的氧化还原反应。
还可以使用光刺激来破裂珠粒。多种光触发物是可能的并且可以包括使用如能够吸收特定波长范围的光子的纳米颗粒和发色团等各种分子的***。例如，金属氧化物涂层可以用作胶囊触发物。对涂覆有SiO2的聚合电解质胶囊进行的UV照射可以导致珠粒壁崩解。在又另一个示例中，可以将如偶氮苯基团等可光切换材料结合在珠粒壁中。在施加UV或可见光时，如所述可光切换材料等化学品在吸收光子时经历可逆的顺式到反式异构化。在这方面，结合光子开关产生可能在施加光触发物时崩解或变得更多孔的珠粒壁。
本文公开的一些实施例包括一个或更多个颗粒(例如，珠粒)。所述颗粒中的每一个都可以包括多个寡核苷酸(例如，随机条形码)。所述多个寡核苷酸中的每一个都可以包括分子标记序列、细胞标记序列和靶标结合区(例如，寡dT序列、基因特异性序列、随机多聚体或其组合)。所述多个寡核苷酸中的每一个的细胞标记序列可以相同。不同颗粒上的寡核苷酸的细胞标记序列可以不同，使得可以识别不同颗粒上的寡核苷酸。在不同实施方式中，不同细胞标记序列的数量可以不同。在一些实施例中，细胞标记序列的数量可以是或大约是10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108、109、这些值中的任何两个之间的数量或范围、或更多。在一些实施例中，细胞标记序列的数量可以是至少或至多10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108或109。在一些实施例中，所述多个颗粒中不超过1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个或更多个包括具有相同细胞序列的寡核苷酸。在一些实施例中，包括具有相同细胞序列的寡核苷酸的所述多个颗粒可以是至多0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多。在一些实施例中，所述多个颗粒全都不具有相同的细胞标记序列。
每个颗粒上的所述多个寡核苷酸可以包括不同的分子标记序列。在一些实施例中，分子标记序列的数量可以是或大约是10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108、109或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，分子标记序列的数量可以是至少或至多10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、106、107、108或109。例如，所述多个寡核苷酸中的至少100个包括不同的分子标记序列。作为另一个示例，在单个颗粒中，所述多个寡核苷酸中的至少100个、500个、1000个、5000个、10000个、15000个、20000个、50000或这些值中的任何两个之间的数量或范围或更多包括不同的分子标记序列。一些实施例提供了包括随机条形码的多个颗粒。在一些实施例中，待标记靶标的出现(或拷贝或编号)与不同的分子标记序列的比值可以是至少1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或更多。在一些实施例中，所述多个寡核苷酸中的每一个都进一步包括样本标记、通用标记或两者。颗粒可以是例如纳米颗粒或微颗粒。
珠粒的大小可以变化。例如，珠粒的直径范围可以为0.1微米到50微米。在一些实施例中，珠粒的直径可以是或大约是0.1微米、0.5微米、1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，珠粒的直径可以是至少或至多0.1微米、0.5微米、1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米或50微米。
珠粒的直径可以与基板的孔的直径相关。在一些实施例中，珠粒的直径可以比孔的直径长或短或者大约长或短10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，珠粒的直径可以比孔的直径长或短至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施例中，基板的孔被大小设定成使得那些孔中的一个或更多个各自可以仅容纳一个珠粒。在一些实施例中，所有所述孔都被大小设定成使得所述孔中的每一个都各自仅可以容纳一个珠粒。在一些实施例中，被大小设定成使得那些孔中的每一个都仅可以容纳一个珠粒的孔的百分比可以是或大约是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％、100％或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，被大小设定成使得那些孔中的每一个都仅可以容纳一个珠粒的孔的百分比可以是至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％、100％或这些值中的任何两个之间的数量或范围。
珠粒的直径可以与细胞(例如，由基板的孔包埋的单个细胞)的直径相关。在一些实施例中，珠粒的直径可以比细胞的直径长或短或者大约长或短10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，珠粒的直径可以比细胞的直径长或短至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％或300％。
珠粒可以附接到和/或嵌入在基板中。珠粒可以附接到和/或嵌入在凝胶、水凝胶、聚合物和/或基质中。可以使用存在于珠粒上的随机条形码上的可以充当位置地址的空间标记来标识珠粒在基板(例如，凝胶、基质、支架或聚合物)内的空间位置。
珠粒可以关联于(例如，浸渍有)量子点或荧光染料以使其在一个荧光光通道或更多个光通道中发荧光。珠粒可以与铁氧化物或铬氧化物相关联以使其具有顺磁性或铁磁性。珠粒可以是可识别的。例如，可以使用相机对珠粒进行成像。珠粒可以具有与珠粒相关联的可检测代码。例如，珠粒可以包括随机条形码。珠粒可以例如由于在有机或无机溶液中膨胀而改变大小。珠粒可以是疏水性的。珠粒可以是亲水性的。珠粒可以是生物相容的。
可以使固相载体(例如，珠粒)可视化。固相载体可以包括可视标签(例如，荧光染料)。固相载体(例如，珠粒)可以蚀刻有标识符(例如，编号)。可以通过对珠粒进行成像来使标识符可视化。
固相载体可以指不溶、半溶或不溶材料。在固相载体包括接头、支架、结构单元或附接到其上的其他反应部分时，固相载体可以被称为是“官能化的”，而在固相载体缺少附接到其上的这种反应部分时，固相载体可以是“非官能化的”。固相载体可以以游离在溶液中的方式被采用，如以微量滴定孔格式；以流经格式，如在柱中；或在浸渍片中。
固相载体可以包括膜、纸、塑料、涂层表面、平整表面、玻璃、载玻片、芯片或其任何组合。固相载体可以采用树脂、凝胶、微球体或其他几何构型的形式。固相载体可以包括硅芯片、合成颗粒、纳米颗粒、板和阵列。固相载体可以包括珠粒(例如，硅胶、可控孔度玻璃、磁性珠粒、王氏树脂(Wang resin)、氯甲基树脂(Merrifield resin)、葡聚糖凝胶/琼脂糖凝胶珠粒、纤维素珠粒、聚苯乙烯珠粒等)；毛细管；平坦载体如玻璃纤维过滤器、玻璃表面、金属表面(钢、金银、铝、硅和铜)、玻璃载体、塑料载体、硅载体、芯片、过滤器、膜、微孔板、载玻片等；塑料材料，包括多孔板或膜(例如，由聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚偏氟乙烯)；晶片；梳状物；销或针(例如，适合于组合合成或分析的销阵列)或如晶片(例如，硅晶片)等平整表面的纳升孔或凹坑阵列中的珠粒；具有带有或不带有过滤器底部的凹坑的晶片。
在一些实施例中，本公开的随机条形码可以附接到聚合物基质(例如，凝胶、水凝胶)。聚合物基质可以能够渗透细胞内空间(例如，细胞器周围)。聚合物基质可以能够在整个循环***内泵送。
阵列占用
包括单个液滴或由其组成的液滴阵列例如第一液滴阵列、细胞阵列或合成颗粒阵列的微孔的百分比可以变化。所述百分比可以例如在10％到100％的范围内变化。在一些实施例中，包括单个液滴或由其组成的液滴阵列的微孔的百分比可以是或大约是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、99.9％、100％或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，包括单个液滴或由其组成的液滴阵列的微孔的百分比可以是至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、99.9％或100％。在一些实施例中，液滴阵列的微孔中的25％或更多包括单个液滴，例如单个细胞。
包括单个液滴例如单个第二液滴或由其组成的液滴阵列例如第二液滴阵列、细胞阵列或合成颗粒阵列的微孔的百分比可以变化。所述百分比可以例如在10％到100％的范围内变化。在一些实施例中，包括单个第二液滴或由其组成的液滴阵列的微孔的百分比可以是或大约是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、99.9％、100％或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，包括单个第二液滴或由其组成的液滴阵列的微孔的百分比可以是至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、99.9％或100％。在一些实施例中，液滴阵列的微孔中的25％可以包括单个第二液滴，例如合成颗粒。
包括单个第一液滴例如单个细胞和包括例如合成颗粒或试剂的单个第二液滴或由其组成的液滴阵列例如第二液滴阵列、细胞阵列或合成颗粒阵列的微孔的百分比可以变化。所述百分比的范围可以是10％到100％。在一些实施例中，包括单个第一液滴和单个第二液滴或由其组成的液滴阵列的微孔的百分比可以是或大约是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、99.9％、100％或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，包括单个第一液滴和单个第二液滴或由其组成的液滴阵列的微孔的百分比可以是至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、99.9％或100％。在一些实施例中，液滴阵列的微孔中的25％或更多可以包括单个第一液滴、例如单个细胞以及单个第二液滴、例如合成颗粒或试剂。
基板和微孔阵列
基板可以包括多个微孔，包括图1所示的微孔104a至104d、106a至106d以及108a至108d。在一些实施例中，基板可以是包括多个微孔的微孔阵列102。在一些实施例中，微孔、例如微孔104a到104d、106a到106d或108a到108d可以包括具有限定体积的小反应室。在一些实施例中，微孔可以包埋例如单个细胞或合成颗粒的一个或更多个液滴。在一些实施例中，微孔可以包埋一个或更多个细胞。在一些实施例中，微孔可以仅包埋单个细胞。在一些实施例中，微孔可以包埋一个或更多个固相载体，例如如珠粒等合成颗粒。在一些实施例中，微孔可以仅包埋一个固相载体。在一些实施例中，微孔可以包埋单个细胞和单个固相载体。
微孔形状
微孔阵列例如图1所示的微孔阵列102的微孔可以被制造成各种形状。非限制性示例性孔几何形状可以包括圆柱形、圆锥形、半球形、矩形或多面形(例如，包括若干平坦面的三维几何形状，例如，六角柱、八角柱、倒三棱锥、倒四棱锥、倒五棱锥、倒六棱锥或倒截棱锥)。微孔可以包括组合这些几何形状中的两个或更多个的形状。例如，微孔可以是部分圆柱形的，其中，剩余部分具有倒圆锥的形状。微孔可以包括一个的直径(例如，其大致对应于珠粒的直径)大于另一个的直径(例如，其大致对应于细胞的直径)、通过延伸圆柱体的全长(全深)的竖直通道(即，平行于圆柱体轴线)连接的两个并排圆柱体。微孔的开口的位置可以变化。例如，微孔的开口可以处于基板的上表面处。例如，微孔的开口可以处于基板的下表面处。微孔的封闭端、例如底部的形状可以变化。例如，微孔的封闭端可以是平坦的。例如，微孔的封闭端可以具有弯曲的表面(例如，凸面或凹面)。微孔的形状和/或大小可以基于待捕捉于微孔内的细胞或固相载体的类型来确定。
微孔大小
微孔阵列例如图1所示的微孔阵列102的微孔可以被制造成各种大小。微孔大小可以例如通过微孔的直径112和/或深度来表征。如图1所示，微孔的直径112可以指可以刻入微孔几何形状的平面横截面内的最大圆。在一些实施例中，微孔的直径112的范围可以是待捕捉于微孔内的细胞或固相载体的直径的约1倍到约10倍。在一些实施例中，微孔直径112可以是或大约是待捕捉于微孔内的细胞或固相载体的直径的1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，微孔直径112可以是待捕捉于微孔内的细胞或固相载体的直径的至少或至多1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍。在一些实施例中，微孔直径112可以是待捕捉于微孔内的细胞或固相载体的直径的约2.5倍。
可以按绝对尺寸指定微孔的直径112。微孔的直径范围可以为约1纳米到约1000微米。在一些实施例中，微孔直径112可以是或大约是1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、200微米、300微米、400微米、500微米、600微米、700微米、800微米、900微米、1000微米或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，微孔直径112可以是至少或至多1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、200微米、300微米、400微米、500微米、600微米、700微米、800微米、900微米、1000微米。在一些实施例中，微孔直径112可以是或大约是1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、200微米、300微米、400微米、500微米、600微米、700微米、800微米、900微米、1000微米或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，微孔直径112可以是至少或至多1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、200微米、300微米、400微米、500微米、600微米、700微米、800微米、900微米、1000微米。在一些实施例中，微孔直径可以是约30微米。
微孔的深度也可以变化，例如以提供对液滴例如细胞和固相载体的高效捕捉或者提供对包含于孔内的测定缓冲液和其他试剂的高效交换。直径与深度的比值(即，纵横比)可以被改变成使得一旦细胞和/或固相载体沉淀于微孔之内，它们将不会通过微孔上方的流体移动被取代。在一些实施例中，微孔的深度可以小于珠粒的直径。例如，微孔的深度可以是或大约是珠粒的直径的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、99.9％、100％或这些值中的任何两个之间的数量或范围。例如，微孔的深度可以是珠粒的直径的至少或至多5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、99.9％、100％。在一些实施例中，如珠粒等合成颗粒可以凸出到微孔之外。
微孔的尺寸可以变化，使得微孔具有足够的空间以容纳各种大小的固相载体和细胞，而不会通过微孔上方的流体运动除去。微孔的深度的范围可以是待捕捉于微孔内的细胞或固相载体的直径的约1倍到约10倍。在一些实施例中，微孔深度可以是或大约是待捕捉于微孔内的细胞或固相载体的直径的1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，微孔深度可以是待捕捉于微孔内的细胞或固相载体的直径的至少或至多1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些实施例中，微孔深度可以是待捕捉于微孔内的细胞或固相载体的直径的约2.5倍。
可以按绝对尺寸指定微孔深度。例如，微孔的深度范围可以为约1纳米到约1000微米。在一些实施例中，微孔深度可以是或大约是1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、200微米、300微米、400微米、500微米、600微米、700微米、800微米、900微米、1000微米或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，微孔深度可以是至少或至多1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、200微米、300微米、400微米、500微米、600微米、700微米、800微米、900微米、1000微米。在一些实施例中，微孔深度可以是或大约是1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、200微米、300微米、400微米、500微米、600微米、700微米、800微米、900微米、1000微米或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，微孔深度可以是至少或至多1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、200微米、300微米、400微米、500微米、600微米、700微米、800微米、900微米、1000微米。在一些实施例中，微孔深度可以是约30微米。
微孔的体积可以例如在约1微微升到约1000微升的范围内变化。在一些实施例中，微孔体积可以是或大约是1微微升、2微微升、3微微升、4微微升、5微微升、6微微升、7微微升、8微微升、9微微升、10微微升、20微微升、30微微升、40微微升、50微微升、60微微升、70微微升、80微微升、90微微升、100微微升、200微微升、300微微升、400微微升、500微微升、600微微升、700微微升、800微微升、900微微升、1000微微升或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，微孔体积可以是至少或至多1微微升、2微微升、3微微升、4微微升、5微微升、6微微升、7微微升、8微微升、9微微升、10微微升、20微微升、30微微升、40微微升、50微微升、60微微升、70微微升、80微微升、90微微升、100微微升、200微微升、300微微升、400微微升、500微微升、600微微升、700微微升、800微微升、900微微升或1000微微升。在一些实施例中，微孔体积可以是或大约是1纳升、2纳升、3纳升、4纳升、5纳升、6纳升、7纳升、8纳升、9纳升、10纳升、20纳升、30纳升、40纳升、50纳升、60纳升、70纳升、80纳升、90纳升、100纳升、200纳升、300纳升、400纳升、500纳升、600纳升、700纳升、800纳升、900纳升、1000纳升或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，微孔体积可以是至少或至多1纳升、2纳升、3纳升、4纳升、5纳升、6纳升、7纳升、8纳升、9纳升、10纳升、20纳升、30纳升、40纳升、50纳升、60纳升、70纳升、80纳升、90纳升、100纳升、200纳升、300纳升、400纳升、500纳升、600纳升、700纳升、800纳升、900纳升或1000纳升。在一些实施例中，微孔体积可以是或大约是1微升、2微升、3微升、4微升、5微升、6微升、7微升、8微升、9微升、10微升、20微升、30微升、40微升、50微升、60微升、70微升、80微升、90微升、100微升、200微升、300微升、400微升、500微升、600微升、700微升、800微升、900微升、1000微升或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，微孔体积可以是至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000。在一些实施例中，微孔体积可以是约1微升。
可以通过微孔之间的体积变化来表征微孔的体积。微孔体积的变化系数(表示为百分比)范围可以是约1％到约100％。微孔体积的变化系数可以是或大约是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或这些值中的任何两个之间的数量或范围。微孔体积的变化系数可以是至少或至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施例中，微孔体积的变化系数可以是约2.5％。
微孔的体积与珠粒的表面积(或与随机条形码寡核苷酸可以附接于其上的固相载体的表面积)的比值可以变化，例如范围为约2.5微米到约1520微米。在一些实施例中，所述比值可以是或大约是2.5微米、5微米、10微米、100微米、500微米、750微米、1000微米、1520微米或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，所述比值可以是至少或至多2.5微米、5微米、10微米、100微米、500微米、750微米、1000微米或1520微米。在一些实施例中，所述比值可以是约67.5微米。
微孔安排
微孔阵列例如图1所示的微孔阵列102的微孔可以被安排成一维阵列、二维阵列或三维阵列。可以例如通过堆叠一系列两个或更多个二维阵列、例如通过堆叠包括微孔阵列的两个或更多个基板来实现三维阵列。
微孔之间的模式和间隔可以变化以优化将单个细胞和单个固相载体(例如，珠粒)捕捉到每个孔中的效率以及使阵列的每单位面积孔数量最大化。微孔可以根据各种随机或非随机模式而分布。例如，微孔可以完全随机地分布于阵列基板的表面上，或者微孔可以安排成正方形网格、矩形网格、六边形网格等。
孔之间的中心到中心距离或中心到中心间隔范围可以为约1微米到约1000微米。在一些实施例中，孔之间的中心到中心距离可以是或大约是1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、200微米、300微米、400微米、500微米、600微米、700微米、800微米、900微米、1000微米或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，孔之间的中心到中心距离可以是至少或至多1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、200微米、300微米、400微米、500微米、600微米、700微米、800微米、900或1000微米。在一些实施例中，孔之间的中心到中心距离可以是约4890微米。
微孔的边缘之间的距离或间隔114的范围可以是约1微米到约1000微米。在一些实施例中，孔的边缘之间的距离可以是或大约是1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、200微米、300微米、400微米、500微米、600微米、700微米、800微米、900微米、1000微米或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，孔的边缘之间的距离可以是至少或至多1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、200微米、300微米、400微米、500微米、600微米、700微米、800微米、900或1000微米。在一些实施例中，孔的边缘之间的距离可以是约80微米。
微孔密度
微孔阵列例如图1所示的微孔阵列102可以包括各种密度的微孔，所述密度的范围例如是每平方英寸100个微孔到每平方英寸10000个微孔。在一些实施例中，微孔阵列的密度可以是或大约是每平方英寸100个微孔、每平方英寸200个微孔、每平方英寸300个微孔、每平方英寸400个微孔、每平方英寸500个微孔、每平方英寸600个微孔、每平方英寸700个微孔、每平方英寸800个微孔、每平方英寸900个微孔、每平方英寸1000个微孔、每平方英寸2000个微孔、每平方英寸3000个微孔、每平方英寸4000个微孔、每平方英寸5000个微孔、每平方英寸6000个微孔、每平方英寸7000个微孔、每平方英寸8000个微孔、每平方英寸9000个微孔、每平方英寸10000个微孔、每平方英寸20000个微孔、每平方英寸30000个微孔、每平方英寸40000个微孔、每平方英寸50000个微孔或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，微孔阵列的密度可以是至少或至多每平方英寸100个微孔、每平方英寸200个微孔、每平方英寸300个微孔、每平方英寸400个微孔、每平方英寸500个微孔、每平方英寸600个微孔、每平方英寸700个微孔、每平方英寸800个微孔、每平方英寸900个微孔、每平方英寸1000个微孔、每平方英寸2000个微孔、每平方英寸3000个微孔、每平方英寸4000个微孔、每平方英寸5000个微孔、每平方英寸6000个微孔、每平方英寸7000个微孔、每平方英寸8000个微孔、每平方英寸9000个微孔、每平方英寸10000个微孔、每平方英寸20000个微孔、每平方英寸30000个微孔、每平方英寸40000个微孔、每平方英寸50000个微孔。在一些实施例中，微孔阵列的密度可以是或大约是每平方厘米10个微孔、每平方厘米20个微孔、每平方厘米30个微孔、每平方厘米40个微孔、每平方厘米50个微孔、每平方厘米60个微孔、每平方厘米70个微孔、每平方厘米80个微孔、每平方厘米90个微孔、每平方厘米100个微孔、每平方厘米200个微孔、每平方厘米300个微孔、每平方厘米400个微孔、每平方厘米500个微孔、每平方厘米600个微孔、每平方厘米700个微孔、每平方厘米800个微孔、每平方厘米900个微孔、每平方厘米1000个微孔、每平方厘米2000个微孔、每平方厘米3000个微孔、每平方厘米4000个微孔、每平方厘米5000个微孔、每平方厘米6000个微孔、每平方厘米7000个微孔、每平方厘米8000个微孔、每平方厘米9000个微孔、每平方厘米10000个微孔或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，微孔阵列的密度可以是至少或至多每平方厘米10个微孔、每平方厘米20个微孔、每平方厘米30个微孔、每平方厘米40个微孔、每平方厘米50个微孔、每平方厘米60个微孔、每平方厘米70个微孔、每平方厘米80个微孔、每平方厘米90个微孔、每平方厘米100个微孔、每平方厘米200个微孔、每平方厘米300个微孔、每平方厘米400个微孔、每平方厘米500个微孔、每平方厘米600个微孔、每平方厘米700个微孔、每平方厘米800个微孔、每平方厘米900个微孔、每平方厘米1000个微孔、每平方厘米2000个微孔、每平方厘米3000个微孔、每平方厘米4000个微孔、每平方厘米5000个微孔、每平方厘米6000个微孔、每平方厘米7000个微孔、每平方厘米8000个微孔、每平方厘米9000个微孔、每平方厘米10000个微孔。
微孔阵列中的孔的总数可以基于孔的模式和间隔以及阵列的总体尺寸而变化。阵列中的微孔的数量可以例如在约96到约1000000的范围内变化。在一些实施例中，微阵列中的微孔的数量可以是或大约是96、384、1536、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，微阵列中的微孔的数量可以是至少或至多96、384、1536、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000或100000。在一些实施例中，微孔阵列中的微孔的数量可以为约96。在一些实施例中，微孔的数量可以为约150000。
微孔阵列表面特征
微孔阵列例如图1所示的微孔阵列102可以在微孔之间包括表面特征，所述表面特征被设计成帮助将细胞和固相载体引导到孔中和/或防止细胞和固相载体沉淀在孔之间的表面上。适当表面特征的非限制性示例包括但不限于包绕孔或跨孔之间的表面的圆顶、有脊或有峰表面特征。
基板制造技术
可以使用多种制造技术中的任何制造技术来制造微孔例如图1所示的微孔阵列102。可以使用的制造方法的非限制性示例包括体微加工技术，如光刻和湿法化学蚀刻、等离子蚀刻或深反应性离子蚀刻；微模制和微压印；激光微加工；3D打印或使用可固化材料的其他直接写入制造工艺；以及类似技术。
微孔阵列可以由各种基板材料制造。材料选择可以取决于制造技术选择，并且反之亦然。适当材料的非限制性示例包括熔融石英、玻璃、聚合物(例如，琼脂糖、明胶、水凝胶、聚二甲基硅氧烷(PDMS)弹性体、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚酰亚胺、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、环氧树脂、基于巯基-烯的树脂、金属或金属膜(例如，铝、不锈钢、铜、镍、铬和钛)等。对于制造微孔阵列来说，亲水材料可以是期望的(例如，以增强润湿性并使细胞和其他生物材料的非特异性结合最小化)。还可以使用可以(例如，通过氧等离子体处理或聚乙烯氧化物表面层移植)处理或涂覆的疏水材料来制造微孔阵列。使用多孔的亲水材料来制造微孔阵列可以是期望的以便促进设备中的所包埋气泡的毛细管芯吸/排放。微孔阵列可以由单一材料制造。微孔阵列可以包括已经结合在一起或机械接合的两种或更多种不同材料。
基板形状和大小
可以使用各种形状和大小的基板来制造微孔阵列例如图1所示的微孔阵列102。例如，微孔被制造于其内的基板的形状(或占用面积)可以是正方形、矩形、圆形或不规则形状。微孔阵列例如微孔阵列102的大小可以通过其宽度116、长度118和深度来表征。
孔阵列102的宽度116可以在0.1英寸到10英寸的范围内变化。在一些实施例中，孔阵列102的宽度116可以是或大约是0.1英寸、0.2英寸、0.3英寸、0.4英寸、05英寸、0.6英寸、0.7英寸、0.8英寸、0.9英寸、1英寸、2英寸、3英寸、4英寸、5英寸、6英寸、7英寸、8英寸、9英寸、10英寸或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，孔阵列102的宽度116可以是至少或至多0.1英寸、0.2英寸、0.3英寸、0.4英寸、05英寸、0.6英寸、0.7英寸、0.8英寸、0.9英寸、1英寸、2英寸、3英寸、4英寸、5英寸、6英寸、7英寸、8英寸、9英寸或10英寸。孔阵列102的宽度116可以在0.2厘米到20厘米的范围内变化。在一些实施例中，孔阵列102的宽度116可以是或大约是0.2厘米、0.2厘米、0.3厘米、0.4厘米、05厘米、0.6厘米、0.7厘米、0.8厘米、0.9厘米、1厘米、2厘米、3厘米、4厘米、5厘米、6厘米、7厘米、8厘米、9厘米、10厘米、20厘米或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，孔阵列102的宽度116可以是至少或至多0.2厘米、0.3厘米、0.4厘米、05厘米、0.6厘米、0.7厘米、0.8厘米、0.9厘米、1厘米、2厘米、3厘米、4厘米、5厘米、6厘米、7厘米、8厘米、9厘米、10厘米或20厘米。
孔阵列102的长度118可以在0.1英寸到10英寸的范围内变化。在一些实施例中，孔阵列102的长度118可以是或大约是0.1英寸、0.2英寸、0.3英寸、0.4英寸、05英寸、0.6英寸、0.7英寸、0.8英寸、0.9英寸、1英寸、2英寸、3英寸、4英寸、5英寸、6英寸、7英寸、8英寸、9英寸、10英寸或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，孔阵列102的长度118可以是至少或至多0.1英寸、0.2英寸、0.3英寸、0.4英寸、05英寸、0.6英寸、0.7英寸、0.8英寸、0.9英寸、1英寸、2英寸、3英寸、4英寸、5英寸、6英寸、7英寸、8英寸、9英寸或10英寸。孔阵列102的长度118可以在0.2厘米到20厘米的范围内变化。在一些实施例中，孔阵列102的长度118可以是或大约是0.2厘米、0.2厘米、0.3厘米、0.4厘米、05厘米、0.6厘米、0.7厘米、0.8厘米、0.9厘米、1厘米、2厘米、3厘米、4厘米、5厘米、6厘米、7厘米、8厘米、9厘米、10厘米、20厘米或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，孔阵列102的长度118可以是至少或至多0.2厘米、0.3厘米、0.4厘米、05厘米、0.6厘米、0.7厘米、0.8厘米、0.9厘米、1厘米、2厘米、3厘米、4厘米、5厘米、6厘米、7厘米、8厘米、9厘米、10厘米或20厘米。
在一些实施例中，例如通过微孔阵列的宽度116和长度118限定的微孔阵列的占用面积可以类似于微量滴定板的占用面积。在一些实施例中，微孔阵列基板的占用面积可以类似于标准显微镜载玻片的占用面积。标准显微镜载玻片的占用面积的非限制性示例包括约75mm长×25mm宽(约3”长×约1”宽)和约75mm长×50mm宽(约3”长×2”宽)。
微孔被制造于其内的基板的厚度的范围可以是约0.1mm厚到约10mm厚或更多。微孔阵列基板的厚度可以为或大约为0.1mm、0.5mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm或这些值中的任何两个之间的数量或范围。微孔阵列基板的厚度可以为至少或至多10mm、9mm、8mm、7mm、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.5mm、0.1mm。微孔阵列基板可以为约1mm厚。微孔阵列基板的厚度可以是这些范围内的任何值，例如，微孔阵列基板的厚度可以处于约0.2mm与约9.5mm之间。
微孔阵列表面处理
可以使用各种表面处理和表面修饰来修改微孔阵列表面的性质。示例可以包括但不限于：用于使疏水材料表面更具亲水性的氧等离子体处理；使用湿法或干法蚀刻技术来使玻璃和硅表面光滑或粗糙；将聚氧化乙烯或其他聚合物层例如普朗尼克(pluronic)或牛血清白蛋白吸附或移植到基板表面以使其更具亲水性并且较不易于进行生物分子和细胞的非特异性吸附；使用硅烷反应来将化学反应官能团移植到在其他方面惰性的硅和玻璃表面；等等。可以使用光去保护技术来选择性地活化阵列结构中的特定位置处的化学反应官能团，例如，可以使用在微孔的内壁上选择性地添加如伯胺或羧基等化学反应官能团或选择性地活化微孔的内壁上的如伯胺或羧基等化学反应官能团来将寡核苷酸探针、肽、蛋白质或其他生物分子共价偶联到微孔的壁上。对所利用的表面处理或表面修饰的选择可以取决于期望的表面性质的类型和/或取决于制造微孔阵列的材料的类型。
微孔密封
可以例如在细胞裂解步骤期间密封微孔阵列例如图1所示的微孔阵列102的开口以便防止相邻微孔之间的靶核酸的交叉杂交。可以使用例如夹紧抵靠微孔阵列基板的表面的柔性膜或固体材料片(例如，板或台板)或者适当的珠粒来密封或加盖微孔(或微孔阵列)，其中，珠粒的直径大于微孔的直径。
使用柔性膜或固体材料片形成的密封件可以包括例如无机纳米孔膜(例如，氧化铝)、透析膜、载玻片、盖玻片、弹性体膜(例如，PDMS)或亲水聚合物膜(例如，涂覆有已经与裂解缓冲液水合的琼脂糖薄膜的聚合物膜)。
用于加盖微孔的固相载体(例如，珠粒)可以包括本公开的固相载体(例如，珠粒)中的任何固相载体。在一些实施例中，固相载体是交联的葡聚糖珠粒(例如，葡聚糖凝胶)。交联葡聚糖的范围可以是约10微米到约80微米。在一些实施例中，用于加盖的交联葡聚糖珠粒可以是或大约是10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，用于加盖的交联葡聚糖珠粒可以是至少或至多10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米或80微米。珠粒可以大于微孔的直径。在一些实施例中，珠粒可以比微孔的直径大或大约大10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，珠粒可以比微孔的直径大至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％。
密封件或帽盖可以允许缓冲液进入和离开微孔，同时阻止大分子(例如，核酸)迁移出孔。在一些实施例中，可以阻挡由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、或这些值中的任何两个之间的数量或范围的核苷酸组成或约由所述数量或范围的核苷酸组成的大分子通过密封件或帽盖迁移进入或离开微孔。在一些实施例中，可以阻挡由至少或至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸组成的大分子通过密封件或帽盖迁移进入或离开微孔。
固相载体操纵
固相载体(例如，合成颗粒或珠粒)可以分布于基板当中。固相载体可以分布于基板的孔当中、从基板的孔中移除或以其它方式借助于离心或其他非磁性手段通过包括一个或更多个微孔阵列的设备转运。基板的微孔可以预加载有固相载体。基板的微孔可以固持或可以固持约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个固相载体。基板的微孔可以固持至少或至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个固相载体。在一些实施例中，基板的微孔可以固持一个固相载体。
消耗品
微孔阵列可以是测定***的可消耗部件。微孔阵列可以是可重复使用的。微孔阵列可以被配置成用作用于手动执行测定的独立设备，或者其可以被配置成包括仪器***的提供测定程序的完全或部分自动化的固定或可移除部件。在所公开的方法的一些实施例中，随机条形码的基于珠粒的库可以作为测定程序的一部分而沉积在微孔阵列的孔中。在一些实施例中，珠粒可以预加载到微孔阵列的孔中并且可以作为例如用于执行核酸靶标的随机条形编码和数字计数的试剂盒的一部分而提供给用户。
两个配合的微孔阵列
在一些实施例中，可以提供两个配合的微孔阵列，一个预加载有通过第一磁体固持就位的珠粒，并且另一个供用户用于加载单独的细胞。在将细胞分布到第二微孔阵列中之后，可以将这两个阵列放置成面对面并且移除第一磁体，同时使用第二磁体从第一阵列将珠粒向下吸引到第二阵列的相应微孔中，由此确保珠粒置于第二微孔阵列中的细胞上方并且从而使细胞裂解之后的靶标分子的扩散损失最小化，同时使靶标分子到珠粒上的随机条形码的高效附接最大化。
不具有微孔的基板
在一些实施例中，基板不包括微孔。例如，珠粒可以被组装。例如，珠粒可以自组装。珠粒可以自组装成单层。单层可以处于基板的平坦表面上。单层可以处于基板的弯曲表面上。珠粒单层可以通过如酒精蒸发等任何方法形成。
可以使使用微孔的替代方案对单独的细胞和珠粒进行隔室化，例如，可以将单个固相载体和单个细胞限制在乳剂中的单个液滴内(例如，在液滴数字微流体***中)。
可以将细胞限制在本身包括所述多个拴系随机条形码的多孔珠粒内。可以将单独的细胞和固相载体隔室化在任何类型的容器、微容器、反应室、反应器皿等中。
可以在不使用微孔的情况下执行单一细胞随机条形编码。可以在不使用任何物理容器的情况下执行单一细胞随机条形编码测定。例如，可以通过以下方式执行无物理容器的随机条形编码：将细胞和珠粒彼此靠近地嵌入在聚合物层或凝胶层内，以在不同细胞/珠粒对之间产生扩散屏障。例如，可以在原位、在体内、在完整的实体组织上、在完整的细胞上和/或亚细胞地执行无物理容器的随机条形编码。
流式细胞术沉积
可以将多个单一液滴例如多个第一单一液滴、多个第二单一液滴、多个单一细胞、多个合成颗粒引入到微孔阵列例如图1所示的微孔阵列102的微孔中。在一些实施例中，引入所述多个液滴可以包括：将所述多个液滴流式细胞术地沉积到微孔阵列的微孔中。将所述多个液滴流式细胞术地沉积到微孔阵列的微孔中可以包括：使用流式细胞仪来将单个第一液滴一次性沉积到微孔阵列的微孔中。在一些实施例中，所述方法可以包括：将流式细胞仪的分选部件与微孔阵列对齐。
可以将多个单一细胞引入到微孔阵列的微孔中。在一些实施例中，将所述多个单一细胞引入到微孔阵列的微孔中可以包括：将所述多个细胞流式细胞术地沉积到微孔阵列的微孔中。将所述多个单一细胞流式细胞术地沉积到微孔阵列的微孔中可以包括：使用流式细胞仪来将单个细胞一次性沉积到微孔阵列的微孔中。
可以将如珠粒等多个合成颗粒引入到微孔阵列的微孔中。在一些实施例中，将所述多个合成颗粒引入到微孔阵列的微孔中可以包括：将所述合成颗粒流式细胞术地沉积到微孔阵列的微孔中。将所述多个合成颗粒流式细胞术地沉积到微孔阵列的微孔中可以包括：使用流式细胞仪来将合成颗粒一次性沉积到微孔阵列的微孔中。
可以将试剂引入到微孔阵列的微孔中。在一些实施例中，引入试剂可以包括：将试剂流式细胞术地沉积到微孔中。在一些实施例中，试剂包括如珠粒等合成颗粒，并且将试剂流式细胞术地沉积到微孔中可以包括：使用流式细胞仪来将合成颗粒一次性沉积到微孔阵列的微孔中。
流式细胞仪
流式细胞仪可以用于分析和分选流体样本中的颗粒，如血液样本中的细胞或任何其他类型的生物或化学样本中的兴趣颗粒。流式细胞仪可以包括用于接收如血液样本等流体样本的样本储器以及包含鞘液的鞘液储器。流式细胞仪将流体样本中的颗粒(例如，细胞)作为颗粒流输送到流动池，同时还将鞘液引导到流动池。
在流动池内，可以在细胞流周围形成鞘液以对细胞流施加基本上均匀的速度。流动池可以水动力学地集中所述流内的细胞以穿过流动池中的激光束的中心。细胞与激光束交叉的点通常被称为探询点(interrogation point)。当细胞移动通过探询点时，其使激光散射。激光还激发细胞流中具有荧光性质的组分，如已经添加到流体样本中并且粘附到某些兴趣细胞的荧光标志物或者混合到所述流中的荧光珠粒。流式细胞仪可以包括适当的检测***，所述检测***包括聚焦于交叉点的光电倍增管、光二极管或其他光检测设备。流式细胞仪分析所检测到的光以测量细胞的物理和荧光性质。流式细胞仪可以进一步基于这些所测量的性质来分选细胞。流动流通过喷嘴直径适合于流体***的喷嘴和期望的分选速率离开流动池。
为了通过静电方法分选细胞，期望的细胞可以包含于带电液滴内。为了产生液滴，可以通过如压电元件等声学设备快速振动流动池。可以通过流动流的水动力学性质和喷嘴尺寸估计液滴的体积。为了使液滴带电，流动池可以包括其电势可以快速变化的充电元件。因为细胞流在基本上向下的竖直方向上离开流动池，在液滴形成之后，液滴也在所述方向上传播。液滴无论带电还是不带电都可以收集在被适当引导成收集由偏转板生成的所述一个或更多个流动流的样本收集器皿中。因此，液滴和包含于其中的细胞可以被收集在板下游的适当收集器皿中。
在使用流式细胞仪时，可以手动对齐流动流和收集器皿。可以将如流速和鞘液组成等流体参数与适当的喷嘴直径相匹配。
图2是适合于产生包括高密度细胞阵列和高密度合成颗粒阵列在内的高密度液滴阵列的分选设备200、例如流式细胞仪的非限制性示意图。被称为空气中流(stream-in-air)分选***的图2所示分选设备可以分选细胞和合成颗粒。示出了样本流204中的细胞202a、202b和202c。样本流204在与鞘液206组合之后可以形成组合样本流204’，所述组合样本流可以通过喷嘴210的孔口208。组合样本流204’在离开喷嘴210时可以形成射流212。
分选设备200可以包括流量控制器214，所述流量控制器被配置成监测和调整样本流204和鞘液206的压力和流速。流量控制器212可以被配置成调整喷嘴208的一个或更多个特性，如孔口206的大小。
由激光器218生成的激光束216可以照亮组合样本流204’中的细胞。当由激光器218生成的激光束216与组合样本流204’交叉时，激光束216可以通过例如存在于样本流204中的细胞而散射。例如，当激光束214与细胞202c交叉时，细胞202c可以使激光束216散射。所散射的激光的被称为前向散射光220a的第一部分可以在与样本流204交叉之前在激光束216的方向上传播。所散射的激光的被称为侧向散射光220b的第二部分可以在与激光束216的方向成某个角度的方向上传播。所散射的光可以被一个或更多个检测站、例如检测站222检测以生成多个信号。检测站222可以包括两个成像传感器224a和224b。成像传感器224a可以检测前向散射光220a，并且成像传感器222b可以检测侧向散射光220b。在一些实施例中，成像传感器224a和224b可以容纳在单独的检测站中。
检测分析器226可以处理和分析由检测站222、例如成像传感器224a和224b检测到的所述多个信号以生成样本事件数据点，例如多参数样本事件数据点。样本事件数据点可以包括如最大荧光强度、平均荧光强度和荧光强度变化等信息。
检测分析器226可以被配置成响应于完全相同的前向散射光220a和侧向散射光220b而生成不同的样本事件数据点。例如，可以调整检测时间、检测分辨率或检测区域。通过将检测调整为较不严格的方案，检测站222可以操作的速度可以由于所执行的信息处理的复杂性减小而增大。这可以有利地减少在样本分选期间消耗的电力资源。
基于样本事件数据点的值，在液滴离开喷嘴210之后，偏转控制器228可以被配置成判定射流212中的液滴是否应当带电并且确定电荷的程度。例如，射流212中的液滴可以带正电、带负电或不带电。一些液滴可以包括样本的如通过液滴230示出的细胞，而其他液滴可以不包括样本的如通过液滴232示出的细胞。
液滴可以穿过通过偏转控制器228控制的偏转场234。偏转场234可以包括两个带相反电荷的偏转板236a和236b。偏转板236a和236b可以被配置成将射流212中的带电液滴引导到其对应的收集器皿238a、238b或238c。如所示，收集器皿23ab可以收集带负电的液滴，因为带正电的偏转板236a可以吸引带负电的液滴。类似地，收集器皿238c可以收集带正电的液滴，因为带负电的偏转板236b可以吸引带正电的液滴。每个收集器皿都可以是微孔板或微量滴定板的微孔。
偏转控制器228可以被配置成控制由偏转板236a和236b产生的偏转场234的强度。检测分析器214可以被配置成向偏转控制器236a提供信息以基于样本行为调整偏转场234。例如，偏转场234的强度可以被调整为使得一个或两个偏转板236a和236b具有较高或较低吸引水平。强度可以被精确校正为仅吸引那些兴趣颗粒以增大纯度。可以增大强度以增大产率。
在一些实施例中，流动***200可以基于由检测站222响应于前向散射光220a和侧向散射光220b而生成的样本事件数据点的特性而识别所有兴趣细胞。基于样本事件数据点的特性，流动***200可以使射流212中的液滴在兴趣细胞作为液滴而离开喷嘴210时带电或不带电。流动***200可以使具有兴趣细胞的液滴具有相同的电荷。这允许将兴趣细胞收集在相同的收集器皿中，包括微孔板的相同或不同微孔。
流量控制器214、检测分析器226、偏转控制器228以及流动***200的其他元件可以被配置成将其操作彼此协调。例如，可以通过致动喷嘴210同时还调整偏转场234来调整样本流204和鞘液206的流速。调整流速还可能需要调整检测站222以确保针对新的流速生成样本事件数据点。
将液滴引入到期望位置
使用本文公开的方法、组合物和***，可以将一个或更多个液滴引入到微孔阵列的微孔中在一个或更多个期望位置处例如以产生液滴阵列。在一些实施例中，将多个液滴引入到微孔阵列的微孔中可以包括：将所述多个液滴引入到微孔阵列的微孔中在多个期望位置处。所述多个液滴可以是或者可以包括多个液滴、多个细胞、多个固相载体或多个合成颗粒。在一些实施例中，将样本中的所述多个细胞引入到微孔阵列的微孔中可以包括：将样本中的所述多个细胞引入到微孔阵列的微孔中在多个期望位置处，例如多个第一期望位置。在一些实施例中，将所述多个合成颗粒引入到微孔阵列的微孔中可以包括：将所述多个合成颗粒引入到微孔阵列的微孔中在多个期望位置处，例如多个第二期望位置。
所述多个期望位置可以变化。在一些实施例中，期望位置可以是微孔阵列的微孔。在一些实施例中，期望位置可以处于微孔阵列的微孔内，例如处于微孔的中心处。在一些实施例中，期望位置可以靠近微孔阵列的微孔的中心。在一些实施例中，期望位置可以处于微孔阵列的微孔的边缘。在一些实施例中，期望位置可以靠近微孔阵列的微孔的边缘。
对齐微孔阵列
对齐***
本文公开了用于将对齐微孔阵列例如第一对齐微孔阵列对齐以产生样本微孔阵列例如细胞阵列和合成颗粒阵列的方法。图3A和图3B示意性地展示了具有用于将对齐微孔阵列338a对齐的多个成像传感器例如两个正交对齐成像传感器302a和302b的非限制性示例性分选设备300。在一些实施例中，成像传感器的数量可以变化。例如，成像传感器的数量可以是或大约是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，成像传感器的数量可以变化。例如，成像传感器的数量可以是至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100。
图3A示出了非限制性示例性分选设备300的侧视图。图3B示出了非限制性示例性分选设备300的来自平面340的在图3的方向342上的俯视图。对齐微孔阵列338a可以包括多个微孔例如微孔340a至340d并且可以被定位在分选设备300的台350(也被称为支撑台)上。
在一些实施例中，分选设备300根据要求包括一个或更多个支撑台350，如两个或更多个、如三个或更多个、如四个或更多个并且包括五个或更多个支撑台。例如，支撑台的数量的范围可以为1到10个支撑台，如2到7个支撑台并且包括3到5个支撑台。在某些实施例中，兴趣***包括一个支撑台。在其他实施例中，***包括两个支撑台。在一个示例中，本发明的***包括具有用于从流动流收集液滴的容器的支撑台。在另一示例中，本发明的***包括具有所安装激光器的支撑台。在又另一个示例中，本发明的***包括具有所安装激光器的第一支撑台和具有用于从流动流收集液滴的容器的第二支撑台。
在一些实施例中，支撑台是可移动的。例如，在一个示例中，可以移动支撑台以调整支撑台上的位置收集容器使得其与流动流对齐。在另一个示例中，可以移动支撑台以调整激光器的位置。在一些实施例中，支撑台在两个维度上移动，如在与流动流的轴线正交的X-Y平面中。在其他实例中，支撑结构在三个维度上移动。在支撑台被配置成移动的情况下，支撑台可以连续地或者以不连续的间隔移动。在一些实施例中，支撑台可以以连续运动而移动。在其他实施例中，支撑台以不连续的间隔移动，如例如，以0.01微米或更大增量，如0.05微米或更大、如0.1微米或更大、如0.5微米或更大、如1微米或更大、如10微米或更大、如100微米或更大、如500微米或更大、如1mm或更大、如5mm或更大、如10mm或更大并且包括25mm或更大的增量。
可以采用任何位移方案来移动支撑结构，如使用电动机致动的平移台、导杆平移组件、齿轮传动的平移设备，如采用步进电动机、伺服电动机、无刷电动机、有刷DC电动机、微型步进驱动电动机、高分辨率步进电动机以及其他类型的电动机的那些来移动支撑台。
在一些实施例中，***可以包括可操作地耦合到处理器的一个或更多个支撑台。适当的支撑台可以是被配置成将本发明***的一个或更多个部件固持就位的任何合宜的安装设备，如平面基板、波状外形的安装设备、圆柱形或管状支撑结构、激光器或LED固持器以及其他类型的支撑结构。在一些实施例中，支撑台是用于如激光器或LED等照明设备的底座。在其他实施例中，***包括支撑结构，所述支撑结构用于固持用于从流动流收集颗粒的一个或更多个容器。例如，支撑台可以被配置成将包括但不限于测试管、圆锥管、如微量滴定板(例如，96孔板)等多隔室容器、离心管、培养管、微型管、帽盖、比色皿、瓶子、直线型聚合物容器、其他类型的容器固持就位。
与图2所示的分选设备200类似的分选设备300可以被配置用于分选和沉积细胞和合成颗粒，例如对齐流204中的对齐合成颗粒202a、202b和202c。对齐流204在与鞘液206组合之后可以生成组合对齐流204’，所述组合对齐流可以通过喷嘴210的孔口208。组合对齐流204’在离开喷嘴210时可以形成射流212。分选设备300的流量控制器214可以被配置成监测和调整对齐流204和鞘液206的压力和流速并且调整喷嘴208的一个或更多个特性，如孔口206的大小。
由激光器218生成的激光束216可以通过组合对齐流204’中的对齐合成颗粒例如对齐合成颗粒202c散射。在通过对齐合成颗粒散射之后，激光束216可以产生分别在激光束216的方向上和在与激光束216的方向成某个角度的方向上传播的前向散射光220a和侧向散射光220b。
分选设备可以包括用于通过例如成像传感器222a检测前向散射光220a并且通过例如成像传感器222b检测侧向散射光220b的检测站222。检测分析器226可以处理和分析由成像传感器222a和222b检测到的所述多个信号以生成样本事件数据点，例如多参数样本事件数据点。
基于样本事件数据点的值，在液滴离开喷嘴210之后，偏转控制器228可以被配置成判定射流212中的液滴应当带正电、带负电还是不带电。一些液滴可以包括对齐样本的如通过对齐液滴230a至230d示出的对齐合成颗粒，而其他液滴可以不包括对齐样本的如通过非对齐液滴232a至232d示出的任何对齐合成颗粒。
液滴可以穿过通过偏转控制器228控制的偏转场234。偏转场234可以包括两个带相反电荷的偏转板236a和236b。偏转板236a和236b可以被配置成引导射流212中的带负电的对齐液滴230a至230d，使得对齐微孔阵列238a可以收集包括合成颗粒的带负电的对齐液滴230a至230d。因为射流212中的非对齐液滴232a至232d不包含对齐合成颗粒，所以其不带电并且不被偏转板236a和236b所引导。非对齐液滴232a至232d被收集到废液接收器皿238b中。
这两个对齐成像传感器302a和302b的功能可以变化。在一些实施例中，对齐成像传感器302a可以确定对齐液滴在对齐微孔阵列338a上在x方向上的位置。在一些实施例中，对齐成像传感器302a可以确定对齐液滴在对齐微孔阵列338a上在y方向上的位置。在一些实施例中，对齐成像传感器302a可以确定对齐液滴在对齐微孔阵列338a上在x方向和y方向两者上的位置。在一些实施例中，对齐成像传感器302b可以确定对齐液滴在对齐微孔阵列338a上在y方向上的位置。在一些实施例中，对齐成像传感器302a可以确定对齐液滴在对齐微孔阵列338a上在x方向上的位置。在一些实施例中，对齐成像传感器302a可以确定对齐液滴在对齐微孔阵列338a上在x方向和y方向两者上的位置。
这两个对齐成像传感器302a和302b的定位可以变化。在一些实施例中，对齐成像传感器302a可以定位在偏转场234与台350之间。在一些实施例中，对齐成像传感器302a可以定位在废液接收器皿238a与台350之间。在一些实施例中，对齐成像传感器302a可以定位在废液接收器皿238a与对齐微孔阵列338a之间。在一些实施例中，对齐成像传感器302a可以定位在废液接收器皿238a与偏转场234之间。在一些实施例中，对齐成像传感器302a可以定位在废液接收器皿238a与偏转板236a和236b之间。
这两个对齐成像传感器302a和302b相对于彼此的定位可以变化。在一些实施例中，对齐成像传感器302a和302b可以处于同一平面上，例如，x-y平面。在一些实施例中，对齐成像传感器302a可以处于对齐成像传感器302b上方，例如，对齐成像传感器302a可以处于第一x-y平面上，并且对齐成像传感器302b可以处第二x-y平面上，其中，第一x-y平面进一步远离较靠近偏转场234的台350。在一些实施例中，对齐成像传感器302a可以处于对齐成像传感器302b下方。在一些实施例中，对齐成像传感器302a和302b的竖直定位例如z方向可以重叠。在一些实施例中，对齐成像传感器302a和302b的水平定位例如x方向和y方向可以重叠。
这两个对齐成像传感器302a和302b的相对定向可以变化。在一些实施例中，这两个对齐成像传感器302a和302b可以大致彼此正交。例如，这两个对齐成像传感器302a和302b可以彼此正交。例如，这两个对齐成像传感器302a和302b可以彼此成90°。例如，这两个对齐成像传感器302a和302b可以彼此成90°±δ°。δ可以变化。例如，δ可以是或大约是0.00001°、0.0001°、0.001°、0.01°、0.1°、1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°或这些值中的任何两个之间的数量或范围。例如，δ可以是至少或至多0.00001°、0.0001°、0.001°、0.01°、0.1°、1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°或10°。
在一些实施例中，这两个对齐成像传感器302a和302b可以彼此成某个角度。例如，这两个对齐成像传感器302a和302b之间的角度可以是或大约是0°、10°、20°、30°、40°、50°、60°、70°、80°、90°、100°、110°、120°、130°、140°、150°、160°、170°、180°、190°、200°、220°、230°、240°、250°、260°、270°、280°、290°、300°、310°、320°、330°、340°、350°、360°或这些值中的任何两个之间的数量或范围。例如，所述角度可以是至少或至多0°、10°、20°、30°、40°、50°、60°、70°、80°、90°、100°、110°、120°、130°、140°、150°、160°、170°、180°、190°、200°、220°、230°、240°、250°、260°、270°、280°、290°、300°、310°、320°、330°、340°、350°或360°。
流对齐***
本文公开了自动细胞分选的***和方法。所述***的方面包括基于图像的自动流调整器。基于图像的自动流调整器提供分选设备(例如，细胞分选仪)的(多个)偏转流的自动设置以最小化或消除初始校准(例如，其可以在工厂发生)之后的用户任务。
在一些实施例中，所述***包括：细胞分选部件(其可以包括喷嘴、孔口、偏转板或其任何组合)。所述***可以包括被配置成存储可执行指令的非暂态存储器；以及与细胞分选部件和非暂态存储器通信的处理器，所述处理器被可执行指令编程用于：(a)接收用于将所述第一对齐液滴沉积到所述第一对齐微孔阵列上的所述期望位置的第一参数；(b)使细胞分选部件使用第一参数将第二对齐液滴沉积到第二对齐微孔阵列；并且(c)使用第一成像传感器确定所述第二对齐液滴在第一检测场中从所述细胞分选部件到所述第二对齐微孔的路径，其中，所述第一成像传感器被定位在所述细胞分选部件与废液接收器皿之间；并且(d)确定所述第一对齐液滴在所述第一检测场中的路径的第一位置与所述第二液滴在所述第一检测场中的所述路径的相应第一位置之间的第一测量结果。在一些实施例中，所述处理器被编程用于：使所述细胞分选部件使用所述第一参数将液滴引入到微孔阵列的微孔中以产生细胞阵列。
图4A示出了用于流对齐的非限制性示例性分选设备400的示意图。在一些实施例中，相机(例如，相机302a和302b)拍摄正确路径404中的偏转流402的图像并且然后使用多个平行条408或线(例如，图4B所示的两个平行条)或非平行条408’或线(例如，图4B所示的两个非平行条)创建修改版本406。这两个平行条408可以表示流动流402应当行进的通道410以便得到准确的分选(例如，以便使正确偏转的颗粒230c进入正确的管或孔板338a)。如果所述流402未被正确定位(例如，所述流402未处于由这两个平行条408或非平行条408’表示的通道410中，则仪器可以例如通过调制来改变偏转板上的一个或更多个参数、如增大或减小电压以将所述流移动到正确的路径404中。可以使用任何合宜的方案照亮所述流402以便进行检测，例如，通过采用激光器，所述激光器从左到右照耀以照亮所述流并且移动进入和离开照片以找到最佳截距。
在一些实施例中，可以将每个通道410校准到期望位置(例如，管或微孔位置)。一对条408(例如，平行条)可以对应于落入期望位置中的流动流404的路径。在校准期间，可以执行测试分选以确定通道410和所述一对线408的位置。
偏转板电压
如本文所示，***可以包括可操作地耦合到成像传感器的一个或更多个处理器(例如，图6所示的处理器602)，其中，所述处理器被配置成自动调整一个或更多个流动流，例如如本文所述。在一些实施例中，处理器可以被配置成响应于与流动流的基于所捕获图像确定的一个或更多个性质相对应的数据信号而调整液滴充电电压。在一些实施例中，液滴充电电压增大如0.01V或更多、如0.05V或更多、如0.1V或更多、如0.5V或更多、如1V或更多、如5V或更多、如10V或更多、如15V或更多、如25V或更多、如50V或更多并且包括将液滴充电电压增大75V或更多。例如，液滴充电电压可以增大1％或更多、如5％或更多、如10％或更多、如15％或更多、如25％或更多、如50％或更多、如75％或更多并且包括将液滴充电电压增大90％或更多。在其他实例中，液滴充电电压减小如0.01V或更多、如0.05V或更多、如0.1V或更多、如0.5V或更多、如1V或更多、如5V或更多、如10V或更多、如15V或更多、如25V或更多、如50V或更多并且包括将液滴充电电压减小75V或更多。例如，液滴充电电压可以减小1％或更多、如5％或更多、如10％或更多、如15％或更多、如25％或更多、如50％或更多、如75％或更多并且包括将液滴充电电压减小90％或更多。
在又其他实施例中，处理器可以被配置成响应于与流动流的基于所捕获图像确定的一个或更多个性质相对应的数据信号而调整偏转板电压。在一些实施例中，偏转板电压增大如5V或更多、如10V或更多、如50V或更多、如100V或更多、如250V或更多、如500V或更多、如1000V或更多并且包括将液滴充电电压增大2000V或更多。例如，偏转板电压可以增大1％或更多、如5％或更多、如10％或更多、如15％或更多、如25％或更多、如50％或更多、如75％或更多并且包括将偏转板电压增大90％或更多。在其他实例中，液滴充电电压减小如0.5V或更多、如5V或更多、如10V或更多、如50V或更多、如100V或更多、如250V或更多、如500V或更多、如1000V或更多并且包括将偏转板电压减小2000V或更多。例如，偏转板电压可以减小1％或更多、如5％或更多、如10％或更多、如15％或更多、如25％或更多、如50％或更多、如75％或更多并且包括将偏转板电压减小90％或更多。
在仍其他实施例中，处理器可以被配置成响应于与流动流的基于所捕获图像确定的一个或更多个性质相对应的数据信号而调整液滴驱动频率。在一些实施例中，液滴驱动频率增大如0.01Hz或更多、如0.05Hz或更多、如0.1Hz或更多、如0.25Hz或更多、如0.5Hz或更多、如1Hz或更多、如2.5Hz或更多、如5Hz或更多、如10Hz或更多并且包括25Hz或更多。例如，液滴驱动频率可以增大1％或更多、如5％或更多、如10％或更多、如15％或更多、如25％或更多、如50％或更多、如75％或更多并且包括将液滴驱动频率增大90％或更多。在其他实例中，液滴驱动频率减小如0.01Hz或更多、如0.05Hz或更多、如0.1Hz或更多、如0.25Hz或更多、如0.5Hz或更多、如1Hz或更多、如2.5Hz或更多、如5Hz或更多、如10Hz或更多并且包括25Hz或更多。例如，液滴驱动频率可以减小1％或更多、如5％或更多、如10％或更多、如15％或更多、如25％或更多、如50％或更多、如75％或更多并且包括将液滴频率减小90％或更多。在仍其他实施例中，处理器可以被配置成响应于与流动流的基于所捕获图像确定的一个或更多个性质相对应的数据信号而调整液滴延迟。在一些实施例中，液滴延迟增大如0.01微秒或更多、如0.05微秒或更多、如0.1微秒或更多、如0.3微秒或更多、如0.5微秒或更多、如1微秒或更多、如2.5微秒或更多、如5微秒或更多、如7.5微秒或更多并且包括将液滴延迟增大10微秒或更多。例如，液滴延迟可以增大1％或更多、如5％或更多、如10％或更多、如15％或更多、如25％或更多、如50％或更多、如75％或更多并且包括将液滴延迟增大90％或更多。在其他实例中，液滴频率减小如0.01微秒或更多、如0.05微秒或更多、如0.1微秒或更多、如0.3微秒或更多、如0.5微秒或更多、如1微秒或更多、如2.5微秒或更多、如5微秒或更多、如7.5微秒或更多并且包括将液滴延迟减小10微秒或更多。例如，液滴延迟可以减小1％或更多、如5％或更多、如10％或更多、如15％或更多、如25％或更多、如50％或更多、如75％或更多并且包括将液滴延迟减小90％或更多。
在仍其他实施例中，处理器可以被配置成响应于与流动流的基于所捕获图像确定的一个或更多个性质相对应的数据信号而调整液滴振幅。在一些实施例中，液滴振幅增大如0.01伏特或更多、如0.025伏特或更多、如0.05伏特或更多、如0.1伏特或更多、如0.25伏特或更多、如0.5伏特或更多并且包括将液滴振幅增大1伏特或更多。例如，液滴振幅可以增大1％或更多、如5％或更多、如10％或更多、如15％或更多、如25％或更多、如50％或更多、如75％或更多并且包括将液滴振幅增大90％或更多。在其他实例中，液滴振幅减小如0.01伏特或更多、如0.025伏特或更多、如0.05伏特或更多、如0.075伏特或更多、如0.1伏特或更多、如0.25伏特或更多并且包括将液滴振幅减小1伏特或更多。例如，液滴振幅可以减小1％或更多、如5％或更多、如10％或更多、如15％或更多、如25％或更多、如50％或更多、如75％或更多并且包括将液滴振幅减小90％或更多。
在一些实施例中，处理器可操作地耦合到成像传感器，所述成像传感器捕获流式细胞仪流动流在偏转场中的图像并且基于所捕获图像生成与流动流的物理尺寸相对应的数据信号。在流动流是连续流的情况下，在一些实施例中，处理器被配置成取得所捕获图像并且生成与流动流的宽度相对应的数据信号。在流动流由离散液滴构成的检测场中，在一些实施例中，处理器被配置成生成与液滴直径相对应的数据信号。
微孔阵列对齐方法
本文公开了用于将对齐微孔阵列例如第一对齐微孔阵列对齐以产生样本微孔阵列的方法。在一些实施例中，所述方法可以包括：(a)使用第一成像传感器确定第一参数并且使用第二成像传感器确定第二参数；(b)提供在对齐微孔阵列例如第一对齐阵列上在x方向和y方向上的期望位置；(c)基于所述第一参数和所述第二参数将对齐液滴例如第一对齐液滴沉积到所述对齐微孔阵列的微孔中；(d)确定所述对齐液滴在所述对齐微孔阵列上的位置与所述期望位置之间的距离；(e)如果所述距离大于预定阈值，则基于所述对齐液滴在所述对齐微孔阵列上的位置与所述期望位置之间的所述距离调整所述第一参数和所述第二参数；以及(f)重复步骤(b)到(e)，直到所述对齐液滴在所述对齐微孔阵列上的位置与所述期望位置之间的所述距离不大于所述预定阈值。在一些实施例中，第一成像传感器和第二成像传感器可以大致彼此正交。在一些实施例中，第一成像传感器和第二成像传感器可以定位在废液接收器皿与对齐微孔阵列之间。在一些实施例中，将对齐液滴沉积到对齐微孔阵列的微孔中可以包括：基于期望位置将固持微孔阵列的台例如台350移动到例如期望台位置。
图5A是流程图，示出了用于对齐定位在分选设备的台例如分选设备300的台350上的微孔阵列例如对齐微孔阵列338a的非限制性示例性工作流500a。在一些实施例中，对齐控制器418可以执行工作流500a。在工作流500a在505a处开始之后，在510a处，可以使用第一成像传感器例如成像传感器302a来确定第一参数。在515a处，可以使用第二成像传感器例如成像传感器302b来确定第二参数。在一些实施例中，第一成像传感器和第二成像传感器可以大致彼此正交。在一些实施例中，第一成像传感器和第二成像传感器可以定位在废液接收器皿例如废液接收器皿238a与对齐微孔阵列之间。
在520a处，可以提供在对齐微孔阵列上在x方向和y方向上的期望位置例如对齐微孔阵列338a的微孔340a。在一些实施例中，提供在对齐微孔阵列上在x方向上的期望位置可以包括：使用第一成像传感器来确定在对齐微孔阵列上在x方向上的期望位置，并且提供在对齐微孔阵列上在y方向上的期望位置可以包括：使用第二成像传感器来确定在样本阵列上在y方向上的期望位置。
基于第一参数和第二参数，在525a处，可以指示分选设备300将对齐液滴例如对齐液滴230d沉积到对齐微孔阵列的微孔例如微孔340a中。在一些实施例中，对齐控制器418可以通过与流量控制器214、检测分析器226和偏转控制器228中的一个或更多个通信来指示分选设备300沉积对齐液滴。在一些实施例中，将对齐液滴沉积到对齐微孔阵列的微孔中可以包括：基于期望位置将固持微孔阵列的台例如台350移动到例如期望台位置。
在530a处，可以确定所述对齐液滴在所述对齐微孔阵列上的位置与所述期望位置之间的距离d。在一些实施例中，对齐控制器418可以基于对齐液滴的由第一成像传感器和第二成像传感器捕获的图像来确定距离d。在535a处，如果距离d大于阈值例如预定阈值，则基于距离d调整第一参数和第二参数。
阈值可以变化。在一些实施例中，阈值可以是或大约是1纳米、2纳米、3纳米、4纳米、5纳米、6纳米、7纳米、8纳米、9纳米、10纳米、20纳米、30纳米、40纳米、50纳米、60纳米、70纳米、80纳米、90纳米、100纳米、200纳米、300纳米、400纳米、500纳米、600纳米、700纳米、800纳米、900纳米、1000纳米或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，阈值可以是至少或至多1纳米、2纳米、3纳米、4纳米、5纳米、6纳米、7纳米、8纳米、9纳米、10纳米、20纳米、30纳米、40纳米、50纳米、60纳米、70纳米、80纳米、90纳米、100纳米、200纳米、300纳米、400纳米、500纳米、600纳米、700纳米、800纳米、900纳米或1000纳米。在一些实施例中，阈值可以是或大约是1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、200微米、300微米、400微米、500微米、600微米、700微米、800微米、900微米、1000微米或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，阈值可以是至少或至多1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、200微米、300微米、400微米、500微米、600微米、700微米、800微米、900微米或1000微米。在一些实施例中，阈值可以是或大约是微孔直径的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、99.9％、100％或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，阈值可以是微孔直径的至少或至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、99.9％或100％。在一些实施例中，阈值可以是或大约是微孔的边缘之间的距离或间隔的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、99.9％、100％或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，阈值可以是微孔的边缘之间的距离或间隔的至少或至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、99.9％或100％。
在一些实施例中，将所述第一对齐液滴沉积到所述第一对齐微孔阵列的所述微孔中包括：将所述第一对齐液滴沉积到所述第一对齐微孔阵列的对齐设备中，并且其中，确定所述第一对齐液滴在所述第一对齐微孔阵列上的位置与所述期望位置之间的所述距离包括：使用所述第一成像传感器对所述对齐设备和所述对齐设备上的所述第一对齐液滴进行成像以及使用所述第二成像传感器对所述对齐设备和所述对齐设备上的所述第一对齐液滴进行成像。
在一些实施例中，对齐设备包括多个对齐区域。所述多个对齐区域中的两个对齐区域可以包括大致相等的面积。所述多个对齐区域可以包括多个同心环。所述同心环中的两个同心环可以彼此分离以下距离或约以下距离：0.01mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm或这些值中的任何两个之间的数量或范围。所述同心环中的两个同心环可以彼此分离至少或至多0.01mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm或者更多或更少。
可以重复步骤520a、525a和530a，直到距离d不大于阈值。例如，在520a处，可以提供更新的期望位置例如微孔340b。基于所调整的第一参数和所调整的第二参数和/或新的期望位置，在525a处，可以指示分选设备300将另一个对齐液滴例如对齐液滴230c沉积到对齐微孔阵列的微孔例如微孔340b中。在一些实施例中，可以将所有对齐液滴沉积到对齐微孔阵列的不同微孔中。在一些实施例中，可以将一些或所有对齐液滴沉积到微孔阵列的不同微孔中。在530a处，可以确定最近沉积的对齐液滴在对齐微孔阵列上的位置与更新的期望位置之间的距离d。如果距离d不大于阈值，则工作流500a在545a处结束。
第一参数和第二参数可以与x方向上的期望位置和y方向上的期望位置中的一个或更多个相关。在一些实施例中，第一参数可以与x方向上的期望位置相关，并且第二参数可以与y方向上的期望位置相关。
可以使用多种方法来确定对齐液滴在对齐微孔上的位置与其期望位置之间的距离。在一些实施例中，确定对齐液滴在对齐微孔阵列上的位置与期望位置之间的距离可以包括：使用第一成像传感器来对对齐微孔阵列和对齐液滴进行成像。在一些实施例中，确定对齐液滴在对齐微孔阵列上的位置与期望位置之间的距离可以包括：使用第二成像传感器来对对齐微孔阵列和对齐液滴进行成像。
第一参数和第二参数可以与多个特性相关。在一些实施例中，第一参数可以与液滴电荷相关。在一些实施例中，第一参数可以与x方向相关。在一些实施例中，第一参数可以与y方向相关。在一些实施例中，第一参数可以与x方向和y方向相关。在一些实施例中，第二参数可以与液滴电荷相关。在一些实施例中，第二参数可以与x方向相关。在一些实施例中，第二参数可以与y方向相关。在一些实施例中，第一参数可以与x方向和y方向相关。
可以使用多种方法来调整第一参数和第二参数。在一些实施例中，基于对齐液滴在对齐微孔阵列上的位置与期望位置之间的距离来调整第一参数可以包括：通过借助于第一成像传感器来对对齐微孔阵列和对齐液滴进行成像来确定对齐液滴在对齐微孔阵列上的位置。在一些实施例中，基于对齐液滴在对齐微孔阵列上的位置与期望位置之间的距离来调整第一参数可以包括：通过借助于第一成像传感器和第二成像传感器来对对齐微孔阵列和对齐液滴进行成像来确定对齐液滴在对齐微孔阵列上的位置。在一些实施例中，基于对齐液滴在对齐微孔阵列上的位置与期望位置之间的距离来调整第二参数可以包括：通过借助于第二成像传感器来对对齐微孔阵列和对齐液滴进行成像来确定对齐液滴在对齐微孔阵列上的位置。在一些实施例中，基于对齐液滴在对齐微孔阵列上的位置与期望位置之间的距离来调整第二参数可以包括：通过使用第一成像传感器和第二成像传感器来对对齐微孔阵列和对齐液滴进行成像来确定对齐液滴在对齐微孔阵列上的位置。
可以使用多种方法来将对齐液滴沉积到对齐微孔阵列的一个或更多个微孔中。在一些实施例中，将对齐液滴沉积到对齐微孔阵列的微孔中可以包括：将对齐液滴流式细胞术地沉积到对齐微孔阵列的微孔中。
阈值例如预定阈值可以与多个参数相关。在一些实施例中，阈值可以与对齐液滴距废液接收器皿的边缘的距离相关。在一些实施例中，阈值可以与对齐液滴距废液接收器皿的一个或更多个边缘的距离相关。
本文公开了用于将对齐微孔阵列例如第一对齐微孔阵列对齐以产生样本微孔阵列的方法。在一些实施例中，所述方法可以包括：(a)确定第n参数对(参数x,n；参数y,n)，其中，参数x,1是使用第一成像传感器来确定的，并且参数y,1是使用第二成像传感器来确定的；(a)提供第n期望位置(x期望,n；y期望,n)，其中，x期望,n处于对齐孔阵列上在x方向上，并且y期望,n处于对齐孔阵列上在y方向上；(c)基于第n参数对(参数x,n；参数y,n)将第n对齐液滴沉积到对齐微孔阵列的第n微孔中，其中，参数x,n与x期望相关并且参数y,n与y期望相关；(d)使用用于xn的第一成像传感器和用于yn的第二传感器确定第n对齐液滴在对齐孔阵列上的位置(xn；yn)与期望位置(x期望,n；y期望s,n)之间的距离；(e)如果所述距离大于预定阈值(x阈值；y阈值)，则基于第n对齐液滴在对齐孔阵列上的位置(xn；yn)与期望位置(x期望,n；y期望,n)之间的距离确定第n+1参数对(参数x,n+1；参数y,n+1)；以及(f)重复步骤(b)到(e)，直到第m对齐液滴在对齐孔阵列上的位置(xm；ym)与期望位置(x期望,m；y期望,m)之间的距离处于预定阈值(x阈值；y阈值)内。在一些实施例中，第一成像传感器和第二成像传感器可以大致彼此正交并且可以定位在废液接收器皿与对齐孔阵列之间。在一些实施例中，将第n对齐液滴沉积到对齐微孔阵列的第n微孔中可以包括：基于第n期望位置(x期望,n；y期望,n)将固持对齐微孔阵列的台移动到例如第n期望台位置(x期望台,n；y期望台,n)。
预定阈值可以变化。在一些实施例中，x阈值或y阈值可以是或大约是1纳米、2纳米、3纳米、4纳米、5纳米、6纳米、7纳米、8纳米、9纳米、10纳米、20纳米、30纳米、40纳米、50纳米、60纳米、70纳米、80纳米、90纳米、100纳米、200纳米、300纳米、400纳米、500纳米、600纳米、700纳米、800纳米、900纳米、1000纳米或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，x阈值或y阈值可以是至少或至多1纳米、2纳米、3纳米、4纳米、5纳米、6纳米、7纳米、8纳米、9纳米、10纳米、20纳米、30纳米、40纳米、50纳米、60纳米、70纳米、80纳米、90纳米、100纳米、200纳米、300纳米、400纳米、500纳米、600纳米、700纳米、800纳米、900纳米或1000纳米。在一些实施例中，x阈值或y阈值可以是或大约是1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、200微米、300微米、400微米、500微米、600微米、700微米、800微米、900微米、1000微米或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，x阈值或y阈值可以是至少或至多1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、200微米、300微米、400微米、500微米、600微米、700微米、800微米、900微米或1000微米。在一些实施例中，x阈值或y阈值可以是或大约是微孔直径的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、99.9％、100％或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，x阈值或y阈值可以是微孔直径的至少或至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、99.9％或100％。在一些实施例中，x阈值或y阈值可以是或大约是微孔的边缘之间的距离或间隔的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、99.9％、100％或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，x阈值或y阈值可以是微孔的边缘之间的距离或间隔的至少或至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、99.9％或100％。
图5B是流程图，示出了用于对齐定位在分选设备的台例如分选设备300的台350上的微孔阵列例如对齐微孔阵列338a的非限制性示例性工作流500b。在一些实施例中，对齐控制器418可以执行工作流500b。在工作流500b在505b处开始之后，在520b处，可以提供在对齐微孔阵列上在x方向和y方向上的第n期望位置(x期望,n；y期望,n)例如对齐微孔阵列338a的微孔340a。在一些实施例中，提供在对齐微孔阵列上在x方向上的第n期望位置(x期望,n；y期望,n)可以包括：使用第一成像传感器来确定x期望,n，并且提供在对齐孔阵列上在y方向上的第n期望位置(x期望；y期望)包括：使用第二成像传感器来确定y期望,n。
在步骤522b处，可以使用第一成像传感器例如成像传感器302a和第二成像传感器例如成像传感器302b来确定第n参数对(参数x,n；参数y,n)。在一些实施例中，可以通过第一成像传感器而非第二成像传感器来确定参数x,n。在一些实施例中，可以通过第二成像传感器而非第一成像传感器来确定参数x,n。在一些实施例中，可以通过第一成像传感器和第二成像传感器来确定参数x,n。在一些实施例中，可以通过第一成像传感器而非第二成像传感器来确定参数y,n。在一些实施例中，可以通过第二成像传感器而非第一成像传感器来确定参数y,n。在一些实施例中，可以通过第一成像传感器和第二成像传感器来确定参数y,n。在一些实施例中，第一成像传感器和第二成像传感器可以大致彼此正交。在一些实施例中，第一成像传感器和第二成像传感器可以定位在废液接收器皿例如废液接收器皿238a与对齐微孔阵列之间。
基于第n参数对(参数x,n；参数y,n)，在525b处，可以指示分选设备300将第n对齐液滴例如对齐液滴230d沉积到对齐微孔阵列的微孔例如微孔340a中。在一些实施例中，对齐控制器418可以通过与流量控制器214、检测分析器226和偏转控制器228中的一个或更多个通信来指示分选设备300沉积对齐液滴。在一些实施例中，将第n对齐液滴沉积到对齐微孔阵列的第n微孔中可以包括：基于第n期望位置(x期望,n；y期望,n)将固持对齐微孔阵列的台移动到例如第n期望台位置(x期望台,n；y期望台,n)。
在530b处，可以确定第n对齐液滴在对齐微孔阵列上的位置(xn；yn)与期望位置(x期望,n；y期望,n)之间的第n距离d。在一些实施例中，对齐控制器418可以基于对齐液滴的由第一成像传感器和第二成像传感器捕获的图像来确定距离d。
在535b处，如果第n距离d大于阈值例如预定阈值，则可以重复步骤520b、522b、525b和530b，直到第n距离d不大于阈值。例如，在步骤520b处，可以提供第n+1期望位置(x期望,n+1；y期望,n+1)例如微孔340b。在522b处，可以使用第一成像传感器和第二成像传感器确定第n+1参数对(参数x,n+1；参数y,n+1)。
阈值可以变化。在一些实施例中，阈值可以是或大约是1纳米、2纳米、3纳米、4纳米、5纳米、6纳米、7纳米、8纳米、9纳米、10纳米、20纳米、30纳米、40纳米、50纳米、60纳米、70纳米、80纳米、90纳米、100纳米、200纳米、300纳米、400纳米、500纳米、600纳米、700纳米、800纳米、900纳米、1000纳米或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，阈值可以是至少或至多1纳米、2纳米、3纳米、4纳米、5纳米、6纳米、7纳米、8纳米、9纳米、10纳米、20纳米、30纳米、40纳米、50纳米、60纳米、70纳米、80纳米、90纳米、100纳米、200纳米、300纳米、400纳米、500纳米、600纳米、700纳米、800纳米、900纳米或1000纳米。在一些实施例中，阈值可以是或大约是1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、200微米、300微米、400微米、500微米、600微米、700微米、800微米、900微米、1000微米或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，阈值可以是至少或至多1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、200微米、300微米、400微米、500微米、600微米、700微米、800微米、900微米或1000微米。在一些实施例中，阈值可以是或大约是微孔直径的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、99.9％、100％或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，阈值可以是微孔直径的至少或至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、99.9％或100％。在一些实施例中，阈值可以是或大约是微孔的边缘之间的距离或间隔的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、99.9％、100％或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，阈值可以是微孔的边缘之间的距离或间隔的至少或至多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、99.9％或100％。
基于第n+1参数对(参数x,n+1；参数y,n+1)和/或第n+1期望位置(x期望,n+1；y期望,n+1)，在525b处，可以指示分选设备300将第n+1对齐液滴例如对齐液滴230c沉积到对齐微孔阵列的微孔例如微孔340b中。在530b处，可以确定第n+1对齐液滴在对齐微孔阵列上的位置(xn+1；yn+1)与期望位置(x期望,n+1；y期望,n+1)之间的第n+1距离d。如果第n+1距离d不大于阈值，则工作流500b在545b处结束。
在一些实施例中，沉积第n对齐液滴可以包括：将第n对齐液滴流式细胞术地沉积到对齐微孔阵列的微孔中。
流对齐方法
本公开的方面还包括用于调整流式细胞仪的流动流402的方法。根据某些实施例的方法包括：捕获流式细胞仪的在检测场中的流动流的一个或更多个图像406；确定检测场中的流动流402的一个或更多个性质；生成与流动流402的所述一个或更多个性质相对应的数据信号；以及响应于所述数据信号而调整流式细胞仪的一个或更多个参数。方法还可以包括：响应于源自于所捕获图像的数据信号而自动调整流式细胞仪的一个或更多个参数，例如调整流布置。本发明的方法可以完全自动化，使得响应于与流动流的一个或更多个参数相对应的数据信号而在很少(如果有的话)的用户人为干预或手动输入的情况下进行调整。
在一些实施例中，所述方法包括：(a)接收用于将第一对齐液滴沉积到第一对齐微孔阵列上的期望位置的第一参数；(b)使用所述第一参数将第二对齐液滴沉积到第二对齐微孔阵列；(c)使用第一成像传感器确定所述第二对齐液滴在第一检测场中从细胞分选部件到所述第二对齐微孔的路径，其中，所述第一成像传感器被定位在所述细胞分选部件与废液接收器皿之间；以及(d)确定所述第一对齐液滴在所述第一检测场中的路径的第一位置与所述第二液滴在所述第一检测场中的所述路径的相应第一位置之间的第一测量结果。
在一些实施例中，所述方法包括：(e)如果所述第一测量结果大于第一预定阈值，则：基于所述第一测量结果调整所述第一参数；以及重复步骤(b)至(d)。在一些实施例中，其中，接收用于将所述第一对齐液滴沉积到所述第一对齐微孔阵列上的所述第一期望位置的所述第一参数包括：使用所述第一参数将所述第一对齐液滴沉积到所述第一对齐微孔阵列上的所述期望位置；以及使用所述第一成像传感器确定所述第一对齐液滴在所述第一检测场中的所述路径。
在一些实施例中，第一参数可以与x方向上的期望位置相关。第一参数可以与液滴电荷相关。在一些实施例中，第二参数可以与y方向上的期望位置相关。第二参数可以与液滴电荷相关。
在一些实施例中，使用所述第一参数将所述第一对齐液滴沉积到所述第一对齐微孔阵列上的所述期望位置包括：使用所述第一参数和第二参数将所述第一对齐液滴沉积到所述第一对齐微孔阵列上的所述期望位置。使用所述第一参数将所述第二对齐液滴沉积到所述第二对齐微孔阵列可以包括：使用所述第一参数和所述第二参数将所述第二对齐液滴沉积到所述第二对齐微孔阵列。
在一些实施例中，步骤(b)可以包括：使用第二成像传感器确定所述第一对齐液滴在第二检测场中从所述偏转板到所述第一对齐微孔阵列上的所述期望位置的路径，其中，所述第二成像传感器被定位在所述废液接收器皿与所述偏转板之间。步骤(c)可以包括：使用所述第二成像传感器确定所述第二对齐液滴在所述第二检测场中的路径。步骤(d)可以包括：确定所述第一对齐液滴在所述第二检测场中的所述路径的第二位置与所述第二液滴在所述第二检测场中的所述路径的相应第二位置之间的第二测量结果。步骤(f)可以包括：如果所述第二测量结果大于第二预定阈值，则基于所述第二测量结果调整所述第二参数。在一些实施例中，第一成像传感器和第二成像传感器大致彼此正交。
在一些实施例中，确定所述第一对齐液滴在所述第一检测场中的所述路径可以包括：捕获所述第一对齐液滴在所述第一检测场中的第一对齐图像。确定所述第二对齐液滴在所述第一检测场中的所述路径可以包括：捕获所述第二对齐液滴在所述第一检测场中的第二对齐图像。确定所述第一对齐液滴在所述第一检测场中的所述路径可以包括：确定所述第一对齐图像中沿着所述第一对齐液滴在所述第一检测场中的所述路径的第一通道。所述第一测量结果可以包括所述第二对齐液滴在所述第一检测场中的所述路径的至少一部分是否处于所述第二对齐图像中的相应第一通道内。
在一些实施例中，所述第一通道可以由所述第一对齐图像中的两个条表示，并且其中，所述相应第一通道由所述第二对齐图像中的相应两个条表示。所述第一测量结果可以包括所述第一对齐液滴在所述第一检测场中的所述路径的所述第一位置与所述第二液滴在所述第一检测场中的所述路径的所述相应第一位置之间的第一距离。
在一些实施例中，确定所述第一对齐液滴在所述第二检测场中的所述路径可以包括：捕获所述第一对齐液滴在所述第二检测场中的第三对齐图像。确定所述第二对齐液滴在所述第二检测场中的所述路径可以包括：捕获所述第二对齐液滴在所述第二检测场中的第四对齐图像。确定所述第一对齐液滴在所述第二检测场中的所述路径可以包括：确定所述第三对齐图像中沿着所述第一对齐液滴在所述第二检测场中的所述路径的第二通道。所述第二测量结果可以包括所述第二对齐液滴在所述第一检测场中的所述路径的至少一部分是否处于所述第二对齐图像中的相应第二通道内。
在一些实施例中，所述第二通道可以由所述第三对齐图像中的两个条表示，并且其中，所述相应第二通道由所述第四对齐图像中的相应两个条表示。所述第二测量结果可以包括所述第一对齐液滴在所述第二检测场中的所述路径的所述第二位置与所述第二液滴在所述第一检测场中的所述路径的所述相应第二位置之间的第二距离。
在一些实施例中，将所述第一对齐液滴沉积到所述第一对齐微孔阵列的所述期望位置可以包括：将所述第一对齐液滴流式细胞术地沉积到所述第一对齐微孔阵列的所述期望位置。使用所述第一参数来沉积所述第二液滴可以包括：使用所述第一参数流式细胞术地沉积所述第二。
在一些实施例中，所述方法可以包括：基于所述第一参数将样本液滴引入到所述样本微孔阵列的微孔中。所述方法可以包括：基于所调整的第一参数将多个样本液滴引入到所述样本微孔阵列的多个微孔中。所述多个样本液滴可以包括细胞、附有寡核苷酸条形码的颗粒或其任何组合。
板分选是指将样本液滴输出到可以包含多于一个液滴目的地的任何输出设备上。液滴的大小可以为亚毫米并且液滴可以准确地沉积到多个目的地中。目的地表面可以是范围为小载玻片到384孔容量的各种尺寸的二维表面。
液滴的布置需要高精度，并且因此可以在x方向和y方向两者上校准分选仪输出台电动机以补偿各种机械公差。这种校准是繁琐的、耗时的并且需要重复的步骤以得到高到足以使用所述设备的准确度。
典型的校准由对以下操作的若干迭代组成：将液滴沉积到表面上并且观察其‘着陆’在哪里。然后，用户将x方向和y方向两者上以毫米为单位的必要偏差设置到仪器中并且重复所述过程。这是反复试验的过程，其通常需要若干迭代，直到液滴沉积在期望位置的中心。
可以设计出快得多的技术，而不是简单地猜测对齐输出设备需要的所需x/y偏差。通过使用经校准的目标输出设备和可以进行x/y计算的软件应用，可以使用一次迭代完成校准。
计算机***
在实施例中，处理器包括具有用于执行本发明的方法的步骤(如本文所述)的多条指令的存储器，所述步骤如：使用光源照亮检测场中的流式细胞仪流动流；捕获流动流的一个或更多个图像；基于所捕获图像生成与流动流的一个或更多个性质相对应的数据信号；以及响应于所述数据信号而调整流动流的参数。本发明的***可以包括硬件部件和软件部件两者，其中硬件部件可以采用一个或更多个平台的形式例如采用服务器的形式，使得功能元件即进行***的特定任务(如管理信息的输入和输出、处理信息等)的那些***元件可以通过在代表***的所述一个或更多个计算机平台上并且跨所述一个或更多个计算机平台执行软件应用而得以进行。
图6是用于控制分选设备例如分选设备300的细胞分选仪计算机***600的非限制性示例性框图。如所示，计算机***600可以包括处理器602，所述处理器与存储器604、存储设备66、通信接口608和显示界面610电通信。存储器604可以存储用于将处理器602配置成在计算机***600开机时执行计算机***600的功能的指令。例如，存储在存储器604中的指令可以将处理器602配置成执行流量控制器214、检测分析器226和偏转控制器228的功能。当计算机***600关机时，存储设备606可以存储用于将处理器602配置成执行计算机***600的功能的指令。
在一些实施例中，处理器602包括具有存储于其上的指令的存储器，所述指令用于执行本发明的方法的步骤，所述步骤包括：使用光源照亮检测场中的流式细胞仪流动流；捕获流动流的一个或更多个图像；基于所捕获图像生成与流动流的一个或更多个性质相对应的数据信号；以及响应于所述数据信号而调整流动流的参数。
通信接口608可以促进600与连接到计算机***的其他设备例如分选设备300之间的通信。显示界面610。显示界面610连同用户界面612可以通过例如向用户显示关于样本分选和设备设置的信息来促进分选设备300与其用户之间的交互。
计算机***600可以包括与处理器602电通信的相机接口614和台接口416。相机接口614可以接收由对齐成像传感器302a和302b捕获的图像。基于由对齐成像传感器302a和302b捕获的图像，计算机***600的对齐控制器418可以通过移动可以与台接口416通信的台350来对齐微孔阵列例如对齐微孔阵列338a。
本公开的方面进一步包括用于实践本发明方法的计算机控制的***，其中，所述***进一步包括用于对用于实践本文所描述的方法的***进行完全自动化或部分自动化的一个或更多个计算机。在一些实施例中，***包括具有带有存储于其上的计算机程序的计算机可读存储介质，其中，所述计算机程序当被加载在计算机上时包括：用于捕获流式细胞仪在检测场中的流动流的一个或更多个图像的指令；用于确定流动流在检测场中的空间位置的算法；用于生成与流动流的空间位置相对应的数据信号的算法；以及用于响应于数据信号而调整流式细胞仪的一个或更多个参数的指令。在某些实例中，***包括具有带有存储于其上的计算机程序的计算机可读存储介质，其中，所述计算机程序当被加载在计算机上时包括：用于捕获流式细胞仪在检测场中的流动流的一个或更多个图像的指令；用于确定检测场中的流动流的物理尺寸的算法；用于生成与流动流的物理尺寸相对应的数据信号的算法；以及用于响应于数据信号而调整流式细胞仪的一个或更多个参数的指令。
在实施例中，所述***包括输入模块、处理模块和输出模块。兴趣处理模块可以包括被配置和自动化成调整如上所述的流式细胞仪的一个或更多个参数的一个或更多个处理器。例如，处理模块可以包括被配置和自动化成调整如上所述的流式细胞仪的一个或更多个参数的两个或更多个处理器，如三个或更多个处理器、如四个或更多个处理器并且包括五个或更多个处理器。
在一些实施例中，本发明的***可以包括输入模块，使得可以在实践本发明的方法之前输入关于以下各项的参数或信息：流体样本、鞘液压力、静水压力、流动流电荷、偏转电压、电荷校正值、液滴延迟、液滴驱动频率、液滴振幅和电荷相位、流动池喷嘴孔口、支撑台位置、成像传感器、光源、光调整方案、放大器以及成像传感器的性质、分辨率和灵敏度。
如此处所述，每个处理器都可以包括具有用于执行本发明方法的步骤的多条指令的存储器，所述步骤如：捕获流式细胞仪的在检测场中的流动流的一个或更多个图像；确定检测场中的流动流的一个或更多个性质；生成与流动流的所述一个或更多个性质相对应的数据信号；以及用于响应于数据信号而调整流式细胞仪的一个或更多个参数。在处理器已经执行本发明方法的步骤中的一个或更多个之后，处理器可以被自动化成对流式细胞仪的参数进行调整，如以上所述的调整。
本发明的***可以包括硬件部件和软件部件两者，其中硬件部件可以采用一个或更多个平台的形式例如采用服务器的形式，使得功能元件即进行***的特定任务(如管理信息的输入和输出、处理信息等)的那些***元件可以通过在代表***的所述一个或更多个计算机平台上并且跨所述一个或更多个计算机平台执行软件应用而得以进行。
***可以包括显示器和操作者输入设备。操作者输入设备可以例如是键盘、鼠标等。处理模块包括处理器，所述处理器可访问存储器，所述存储器具有存储于其上的用于执行本发明方法的步骤的指令。处理模块可以包括操作***、图形用户界面(GUI)控制器、***存储器、存储器存储设备和输入输出控制器、高速缓冲存储器、数据备份单元以及许多其他设备。处理器可以是可商购的处理器或处理器可以是可获得或将变为可获得的其他处理器之一。处理器执行操作***并且操作***以众所周知的方式与固件和硬件对接，并且有助于处理器协调和执行可以用各种编程语言来编写的不同计算机程序的功能，如本领域中所已知，所述编程语言如Java、Perl、C++、其他高水平或低水平语言以及其组合。操作***通常与处理器配合来协调和执行计算机的其他部件的功能。操作***还提供调度、输入输出控制、文档和数据管理、存储器管理以及通信控制和相关的服务，所有所述服务都是根据已知的技术。
***存储器可以是任何各种已知的或未来的存储器存储设备。示例包括任何通常可获得的随机存取存储器(RAM)、磁介质如固定硬盘或磁带、读写致密盘等光学介质、闪存存储器设备或其他存储器存储设备。存储器存储设备可以是任何各种已知的或未来的设备，包括致密盘驱动器、磁带驱动器、可移动硬盘驱动器或软盘驱动器。这种类型的存储器存储设备通常从程序存储介质(未示出)中读取和/或写入程序存储介质，如对应地致密盘、磁带、可移动硬盘或软盘。任何这些程序存储介质或现在使用的或以后可能开发出的其他程序存储介质可以被认为是计算机程序产品。如将了解的是，这些程序存储介质通常存储计算机软件程序和/或数据。计算机软件程序(又称为计算机控制逻辑)通常被存储在***存储器和/或结合存储器存储设备使用的程序存储设备中。
在一些实施例中，计算机程序产品被描述包括计算机可使用介质，计算机可使用介质在其中存储有控制逻辑(计算机软件程序，包括程序代码)。当通过计算机的处理器执行时，控制逻辑引起处理器执行在此描述的功能。在其他实施例中，使用例如硬件状态机来主要在硬件中实施一些功能。实施硬件状态机以便执行本文中描述的功能对于相关领域中的技术人员而言将是显而易见的。
存储器可以是其中的处理器可以存储和检索数据的任何适当设备，比如，磁性设备、光学设备或固态存储设备(包括磁盘或光盘或磁带或RAM，或任何其他适当设备，或者固定式或者便携式)。处理器可以包括从携带必要程序代码的计算机可读介质中适当编程的通用数字微处理器。可以通过通信信道来向处理器远程提供编程，或将编程预先保存到计算机程序产品(比如，存储器或使用与存储器相关的那些设备中的任何设备的其他一些便携式或固定式计算机可读存储介质)中。例如，磁盘或光盘可以携带编程，并且可以通过盘写入器/读取器来读取。本文公开的实施例的***还包括例如采用计算机程序产品、算法的形式的用于实践如以上所述的方法的编程。根据本公开的编程可以记录在计算机可读介质例如可以由计算机直接读取和访问的任何介质上。这种介质包括但不限于：磁性存储介质，如软盘、硬盘存储介质和磁带；光学存储介质，如CD-ROM；电存储介质，如RAM和ROM；便携式闪存驱动器；以及这些类别的混合体，如磁性/光学存储介质。
处理器也可以访问通信通道以便与远程位置处的用户通信。远程位置意指用户不直接与***接触并且从外部设备将输入信息转播至输入管理器，外部设备如连接到广域网(“WAN”)、电话网络、卫星网络或任何其他适合的通信通道上的计算机，包括移动电话(即，智能手机)。
在一些实施例中，根据本公开的***可以被配置成包括通信接口。在一些实施例中，通信接口包括用于与网络和/或另一种设备通信的接收器和/或发送器。通信接口可以被配置用于有线或无线通信，包括但不限于射频(RF)通信(例如，射频识别(RFID)、Zigbee通信协议、WiFi、红外、无线通用串行总线(USB)、超宽带(UWB)、通信协议以及蜂窝通信，如码分多址(CDMA)或全球移动通信***(GSM)。
在一个实施例中，通信接口被配置成包括一个或更多个通信端口，例如物理端口或接口如USB端口、RS-232端口或任何其他适合的电连接端口以便允许本发明的***与其他外部设备之间的数据通信，所述外部设备如被配置用于类似互补数据通信的计算机终端(例如，在医师办公室或在医院环境中)。
在一个实施例中，通信接口被配置用于红外通信、通信或任何其他适合的无线通信协议，以便使本发明的***能够与其他设备通信，所述其他设备如计算机终端和/或网络、能通信的移动电话、个人数字助理或任何其他用户可以结合使用的通信设备。
在一个实施例中，通信接口被配置成使用互联网协议(IP)，通过手机网络、短信服务(SMS)、在连接至互联网的局域网(LAN)上无线连接至个人计算机(PC)或在WiFi热点上WiFi连接至互联网来为数据传输提供连接。
在一个实施例中，本发明的***被配置成通过通信接口，例如使用常见标准如802.11或RF协议或IrDA红外协议与服务器设备无线通信。服务器设备可以是另一种便携式设备，如智能手机、个人数字助理(PDA)或笔记本计算机；或更大的设备如台式计算机、电器等。在一些实施例中，服务器设备具有显示器如液晶显示器(LCD)，以及输入设备，如按钮、键盘、鼠标或触屏。
在一些实施例中，通信接口被配置成使用以上描述的通信协议和/或机制中的一种或更多种来与网络或服务器设备自动或半自动地通信数据，数据存储在本发明的***中，例如存储在可选数据存储单元中。
输出控制器可以包括用于任何各种已知的用于向用户呈现信息的显示器设备的控制器，无论是人或机器，无论本地或远程。如果所述显示器设备中之一提供可视信息，则这种信息通常可以被逻辑地和/或物理地组织为图片元素的阵列。图形用户界面(GUI)控制器可以包括用于在所述***与用户之间提供图形输入和输出界面并且用于处理用户输入的多种已知或未来软件程序中的任何软件程序。计算机的功能元件可以经由***总线彼此通信。在替代性实施例中，可以使用网络或其他类型的远程通信来完成所述通信中的一些通信。根据已知的技术，输出管理器还可以在远程位置上例如经过互联网、电话或卫星网络向用户提供由处理模块产生的信息。输出管理器呈现的数据可以根据各种已知技术实施。作为一些示例，数据可以包括SQL文档、HTML文档或XML文档；电子邮件或其他文件；或其他形式的数据。数据可以包括互联网URL地址，这样使得用户可以从远程来源中检索另外的SQL、HTML、XML或其他文件或数据。存在于本发明***中的一个或更多个平台可以是任何类型的已知的计算机平台或未来有待开发出的一种类型计算机平台，虽然它们通常将属于通常称为服务器的一类计算机。然而，所述平台还可以是大型计算机、工作站或其他计算机类型。所述平台可以通过任何已知的或未来类型的电缆敷设或包括无线***的其他通信***来连接，或者经互联网或者以另外的方式。所述平台可以是共处同一位置或所述平台可以是物理上分离的。可能地根据所选计算机平台的类型和/或型号，可以在计算机平台中的任何计算机平台上采用各种操作***。适当的操作***包括Windows NT、Windows XP、Windows 7、Windows 8、iOS、Sun Solaris、Linux、OS/400、Compaq Tru64 Unix、SGI IRIX、Siemens Reliant Unix等。
成像传感器
成像传感器可以是能够捕获光学图像并将其转换成电子数据信号的任何适当设备。非限制性示例性成像传感器包括电荷耦合器件(CCD)、半导体电荷耦合器件(CCD)、有源像素传感器(APS)、互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器和N型金属氧化物半导体(NMOS)图像传感器。在一些实施例中，成像传感器可以是CCD相机。CCD相机可以是电子倍增CCD(EMCCD)相机或增强型CCD(ICCD)相机。在一些实施例中，成像传感器可以是CMOS相机。
***包括被配置成捕获检测场中的流动流的图像的一个或更多个成像传感器。成像传感器可以是能够捕获光学图像并将其转换成电子数据信号的任何适当设备，包括但不限于电荷耦合器件、半导体电荷耦合器件(CCD)、有源像素传感器(APS)、互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器或N型金属氧化物半导体(NMOS)图像传感器。在一些实施例中，成像传感器是CCD相机。例如，相机可以是电子倍增CCD(EMCCD)相机或增强型CCD(ICCD)相机。在其他实施例中，成像传感器是CMOS型相机。
根据被探询的检测场的数量和兴趣流式细胞仪参数，本发明***中的成像传感器的数量可以根据需要而变化。例如，本发明***可以包括一个成像传感器或多个、如两个成像传感器或更多个、如三个成像传感器或更多个、如四个成像传感器或更多个、如五个成像传感器或更多个并且包括十个成像传感器或更多个。在某些实施例中，***包括一个成像传感器。在其他实施例中，***包括两个成像传感器。在***包括多于一个成像传感器的情况下，每个成像传感器可以被定向成相对于另一个(如在X-Y平面中参考的)成范围为10°到90°、如15°到85°、如20°到80°、如25°到75°并且包括30°到60°的角度。在某些实施例中，每个成像传感器都被定向成彼此正交(如在X-Y平面中参考的)。例如，在本发明的***包括两个传感器的情况下，第一成像传感器被定向成与第二成像传感器正交(如在X-Y平面中参考的)。
在本发明的***包括多于一个成像传感器的情况下，每个成像传感器都可以相同或可以是传感器的组合。例如，在本发明的***包括两个成像传感器的情况下，在一些实施例中，第一成像传感器是CCD型设备并且第二成像传感器是CMOS型设备。在其他实施例中，第一成像传感器和第二成像传感器两者都是CCD型设备。在又其他实施例中，第一成像传感器和第二成像传感器两者都是CMOS型设备。
在一些实施例中，成像传感器是静止的，从而在流式细胞仪内保持单个位置。在其他实施例中，成像传感器可以被配置成沿着流动流的路径移动。例如，成像传感器可以被配置成沿着流动流的边在上游和下游移动，从而捕获多个检测场中的图像。例如，***可以包括成像传感器，所述成像传感器被适配成沿着流动流捕获两个或更多个不同检测场中的图像，如3个或更多个检测场、如4个或更多个检测场并且包括5个或更多个检测场。在成像传感器被配置成沿着流动流移动的情况下，成像传感器可以沿着流动流路径连续地或以离散的间隔移动。在一些实施例中，成像传感器是连续位移的。在其他实施例中，成像传感器可以沿着流动流路径以离散的间隔位移，如例如1mm或更大的增量、如2mm或更大的增量并且包括5mm或更大的增量。
在成像传感器被配置成在沿着流动流的路径的不同位置处捕获图像的情况下，成像传感器可以被配置成连续地或以离散的间隔捕获图像。在一些实施例中，兴趣成像传感器被配置成连续地捕获图像。在其他实例中，成像传感器被配置成以离散的间隔进行测量，如以如下间隔捕获流动流的图像：每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒并且包括每1000毫秒或某其他间隔。
在一些实施例中，成像传感器被配置成捕获每个检测场中的流动流的一个或更多个图像。例如，成像传感器可以被配置成捕获每个检测场中的流动流的2个或更多个图像，如3或更多个图像、如4个或更多个图像、如5个或更多个图像、如10个或更多个图像、如15个或更多个图像并且包括25个或更多个图像。在检测场中捕获多个图像的情况下，处理器(如本文所述)可以包括用于将所述多个图像拼接在一起的数字成像处理算法。
根据流动流速度和期望图像分辨率，成像传感器在读出整个传感器时可以具有100ms或更少的曝光时间，如75ms或更少、如50ms或更少、如25ms或更少、如10ms或更少、如5ms或更少、如1ms或更少、如0.1ms或更少、如0.01ms或更少、如0.001ms或更少、如0.0001ms或更少、如0.00001ms或更少并且包括0.000001ms或更少的曝光时间。例如，检测场中捕获流动池喷嘴孔口处的流动流的图像的成像传感器的曝光时间可以具有范围为0.0001ms到10ms，如0.001ms到5ms、如0.01ms到2ms并且包括0.1ms到1ms的曝光时间。检测场中捕获喷嘴孔口下游的流式细胞仪流动流的图像的成像传感器的曝光时间可以具有范围为0.0001ms到10ms，如0.001ms到5ms、如0.01ms到2ms并且包括0.1ms到1ms的曝光时间。
在某些实施例中，本发明***中的成像传感器可以具有1M的有源像素或更多，如1.5M或更多、例如2M或更多、2.5M或更多或者3M或更多。在某些方面中，像素对应于约0.3μm的实际物理尺寸。根据检测场，在一些实施例中，成像传感器具有150mm2或更多、如约150mm2到约175mm2、约175mm2到约200mm2、200mm2到约225mm2、约225mm2到约250mm2、约250mm2到约300mm2、约300mm2到约400mm2、约400mm2到约500mm2、约500mm2到约750mm2、约750mm2到约1000mm2或约1000mm2或更多的传感器区域。
成像传感器可以被定位成与流式细胞仪流动流相距任何适当距离，只要检测场能够捕获流动流的图像即可。例如，成像传感器可以被定位成与流动流相距0.01mm或更多，如与流式细胞仪流动流相距0.05mm或更多、如0.1mm或更多、如0.5mm或更多、如1mm或更多、如2.5mm或更多、如5mm或更多、如10mm或更多、如15mm或更多、如25mm或更多并且包括50mm或更多。
在一些实施例中，成像传感器被定位成与流动流轴线成某个角度。例如，成像传感器可以被定位成与流动流的轴线成某个角度，所述角度的范围为10°到90°、如15°到85°、如20°到80°、如25°到75°并且包括30°到60°。在某些实施例中，成像传感器被定位成与流动流的轴线成90°角。
在一些实施例中，成像传感器还包括光学调整方案。“光学调整”意味着可以根据需要改变通过图像传感器捕获检测场的图像，以便增大或减小所捕获尺寸或以便增强图像的光学分辨率。在一些实施例中，光学调整是被配置成将通过成像传感器捕获的检测场的大小增大如5％或更大、如10％或更大、如25％或更大、如50％或更大并且包括将成像传感器的检测场增大75％或更大的放大方案。在其他实例中，光学调整是被配置成将通过成像传感器捕获的检测场的大小减小如5％或更大、如10％或更大、如25％或更大、如50％或更大并且包括将狭缝成形束的宽度减小75％或更大的缩小方案。在某些实施例中，光学调整是被配置成将所捕获图像的分辨率提高如5％或更大、如10％或更大、如25％或更大、如50％或更大并且包括将所捕获图像的分辨率提高75％或更大的分辨率增强方案。通过成像传感器捕获检测场的图像可以使用任何合宜的光学调整方案进行调整，包括但不限于透镜、反射镜、滤光片及其组合。在一些实施例中，成像传感器包括聚焦透镜。例如，聚焦透镜可以是缩小透镜。在其他实施例中，聚焦透镜是放大透镜。
本公开的成像传感器还可以包括一个或更多个波长分离器。术语“波长分离器”在其常规意义上在本文中用于指用于将多色光分成其分量波长以便进行检测的光学方案。根据某些实施例的波长分离可以包括：选择性地使特定波长或波长范围的多色光穿过或阻挡特定波长或波长范围的多色光。为了分离光波长，可以使透射光穿过任何合宜的波长分离方案，包括但不限于有色玻璃、带通滤波器、干涉滤波器、二向色镜、衍射光栅、单色器及其组合以及其他波长分离方案。根据检测场、光源和被可视化的流动流，***可以包括一个或更多个波长分离器，如两个或更多、如三个或更多个、如四个或更多个、如五个或更多个并且包括10个或更多个波长分离器。在一个示例中，成像传感器包括一个带通滤波器。在另一个示例中，成像传感器包括两个或更多个带通滤波器。在另一个示例中，成像传感器包括两个或更多个带通滤波器和一个衍射光栅。在又另一个示例中，成像传感器包括多个带通滤波器和一个单色器。在某些实施例中，成像传感器包括被配置成轮式滤波器设置的多个带通滤波器和衍射光栅。在成像传感器包括两个或更多个波长分离器的情况下，可以单独或串联利用波长分离器以将多色光分离成分量波长。在一些实施例中，波长分离器被串联安排。在其他实施例中，波长分离器被单独安排，使得使用波长分离器中的每一个进行一项或更多项测量。
在一些实施例中，***包括一个或更多个光学滤波器，如一个或更多个带通滤波器。例如，在一些实施例中，兴趣光学滤波器是具有范围为2nm到100nm、如3nm到95nm、如5nm到95nm、如10nm到90nm、如12nm到85nm、如15nm到80nm的最小带宽的带通滤波器，并且包括具有范围为20nm到50nm的最小带宽的带通滤波器。在其他实例中，光学滤波器是长通滤波器，如例如衰减1600nm或更少、如1550nm或更少、如1500nm或更少、如1450nm或更少、如1400nm或更少、如1350nm或更少、如1300nm或更少、如1000nm或更少、如950nm或更少、如900nm或更少、如850nm或更少、如800nm或更少、如750nm或更少、如700nm或更少、如650nm或更少、如600nm或更少、如550nm或更少、如500nm或更少的光波长的长通滤波器，并且包括衰减450nm或更少的光波长的长通滤波器。在又其他实例中，光学滤波器是短通滤波器，如例如衰减200nm或更多、如250nm或更多、如300nm或更多、如350nm或更多、如400nm或更多、如450nm或更多、如500nm或更多、如550nm或更多的光波长的短通滤波器，并且包括衰减600nm或更多的光波长的短通滤波器。
在一些实施例中，波长分离器是衍射光栅。衍射光栅可以包括但不限于透射、扩散或反射衍射光栅。衍射光栅的适当间隔可以根据光源、检测场和成像传感器以及所存在的其他光学调整方案(例如，聚焦透镜)的配置而在0.01μm到10μm、如0.025μm到7.5μm、如0.5μm到5μm、如0.75μm到4μm、如1μm到3.5μm并且包括1.5μm到3.5μm的范围内变化。
在一些实施例中，每个成像传感器都可操作地耦合到用于照亮检测场中的流动流的一个或更多个光源。在一些实施例中，光源是发射具有宽范围波长的光的宽带光源，如例如跨越50nm或更多、如100nm或更多、如150nm或更多、如200nm或更多、如250nm或更多、如300nm或更多、如350nm或更多、如400nm或更多并且包括跨越500nm或更多。例如，一种适当宽带光源发射具有从200nm到1500nm波长的光。适当宽带光源的另一个示例包括发射具有从400nm到1000nm波长的光的光源。可以采用任何合宜的宽带光源方案，如卤素灯、氘弧灯、氙弧灯、稳定的光纤耦合的宽带光源、具有连续光谱的宽带LED、超辐射发光二极管、半导体发光二极管、宽光谱LED白光源、多LED集成的白光源、以及其他宽带光源或其任何组合。
在一些实施例中，光源是发射特定波长或窄范围波长的窄带光源。在一些实施例中，窄带光源发射具有窄范围波长的光，如例如50nm或更少、如40nm或更少、如30nm或更少、如25nm或更少、如20nm或更少、如15nm或更少、如10nm或更少、如5nm或更少、如2nm或更少并且包括发射特定波长的光(即，单色光)的光源。可以采用任何合宜的窄带光源方案，如窄波长LED、激光二极管或耦合到一个或更多个光学带通滤波器的宽带光源、衍射光栅、单色器或其任何组合。
本发明的***可以根据需要包括一个或更多个光源，如两个或更多个光源、如三个或更多个光源、如四个或更多个光源、如五个或更多个光源并且包括十个或更多个光源。光源可以包括多种类型的光源的组合，例如，在采用两个光源的情况下，第一光源可以是宽带白光源(例如，宽带白光LED)，并且第二光源可以是宽带近红外光源(例如，宽带近IRLED)。在其他实例中，在采用两个光源的情况下，第一光源可以是宽带白光源(例如，宽带白光LED)，并且第二光源可以是窄光谱光源(例如，窄带可见光或近IR LED)。在又其他实例中，光源是各自发射特定波长的多个窄带光源，如两个或更多个LED的阵列、如三个或更多个LED的阵列、如五个或更多个LED的阵列，包括十个或更多个LED的阵列。
在一些实施例中，光源发射波长范围为200nm到1500nm、如250nm到1250nm、如300nm到1000nm、如350nm到900nm并且包括400nm到800nm的光。例如，光源可以包括发射具有200nm到900nm的波长的光的宽带光源。在其他实例中，光源包括发射范围为200nm到900nm的波长的多个窄带光源。例如，光源可以是各自独立地发射具有200nm到900nm之间的波长范围的光的多个窄带LED(1nm到25nm)。在一些实施例中，窄带光源是发射范围为200nm到900nm的光的一个或更多个窄带灯，如窄带镉灯、铯灯、氦灯、汞灯、汞镉灯、钾灯、钠灯、霓虹灯、锌灯或其任何组合。
在某些实施例中，光源是频闪光源，其中使用周期性闪光照亮流动流。根据光源(例如，闪光灯、脉冲激光器)，光频闪的频率可以变化并且可以为0.01kHz或更大、如0.05kHz或更大、如0.1kHz或更大、如0.5kHz或更大、如1kHz或更大、如2.5kHz或更大、如5kHz或更大、如10kHz或更大、如25kHz或更大、如50kHz或更大并且包括100kHz或更大。在这些实施例中，频闪灯可以可操作地耦合至具有调节频闪频率的频率发生器的处理器。在一些实施例中，频率发生器耦合到液滴驱动发生器，使得频闪灯与液滴生成同步。在其他实例中，频闪灯的频率发生器可操作地耦合到所述一个或更多个光学传感器，使得频闪灯的频率与图像捕获频率同步。在某些实例中，适当的频闪光源和频率控制器包括但不限于美国专利号5,700,692和6,372,506中描述的那些频闪光源和频率控制器，这些美国专利的公开内容通过引用结合在此。频闪和脉冲光源还在Sorenson等.Cytometry[细胞术],第14卷,第2期,第115-22页(1993年)；Wheeless等.The Journal of Histochemestry andCytochemistry[组织化学与细胞化学杂志],第24卷,第1期,第265到268页(1976年)中得以描述，这些文献的公开内容通过引用结合在此。
简单介绍
在将对齐微孔阵列对齐之后，可以将样本液滴引入到微孔阵列例如样本微孔阵列中。在一些实施例中，可以将多个样本液滴引入到样本微孔阵列中。在一些实施例中，所述方法可以包括：基于所述第一参数和所述第二参数将样本液滴引入到样本微孔阵列的微孔中。在一些实施例中，所述方法可以包括：基于所述第一参数和所述第二参数将多个样本液滴引入到所述样本微孔阵列的微孔中。在一些实施例中，所述方法可以包括：基于第m对齐液滴的参数(参数x,m；参数y,m)将多个样本液滴引入到样本微孔阵列的微孔中以产生样本微孔阵列。样本珠粒的内容物可以变化。在一些实施例中，样本液滴可以包括细胞、合成颗粒或其任何组合。
细胞类型
可以通过本文所述的方法、组合物和***沉积以产生高密度阵列的细胞类型可以变化。在一些实施例中，细胞是细菌细胞，所述细菌细胞可以是来自革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌的细胞。可以使用所公开的方法、设备和***进行分析的细菌的示例包括但不限于：马杜拉放线菌(Actinomedurae)、衣氏放线菌、炭疽杆菌、蜡样芽胞杆菌、肉毒杆菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、棒状杆菌、粪肠球菌、李斯特菌、诺卡氏菌、痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、变异链球菌、肺炎链球菌等。革兰氏阴性细菌包括但不限于：猫阿菲波菌、拟杆菌、杆菌状巴尔通体、百日咳博代氏杆菌、伯氏疏螺旋体、回归热螺旋体、布鲁氏菌、肉芽肿荚膜杆菌、弯曲杆菌、大肠杆菌、土拉弗朗西斯菌、***加德菌、埃及嗜血杆菌、杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、嗜肺军团菌、肾脏钩端螺旋体、脑膜炎奈瑟氏菌、牙龈卟啉单胞菌、斯氏普罗维登斯菌(Providencia sturti)、绿脓杆菌、沙门肠炎杆菌、伤寒沙门菌、粘质沙雷氏菌、鲍氏志贺氏菌、念珠状链杆菌、酿脓链球菌、***、霍乱弧菌、结肠炎耶尔森杆菌、鼠疫杆菌等。其他细菌可以包括：Myobacteriumavium、麻风杆菌、结核杆菌、韩瑟勒巴通氏菌、鹦鹉热衣原体、沙眼衣原体、贝氏柯克斯体、肺炎支原体、由小株立克次体、普氏立克次体、立氏立克次体、***立克次体、伤寒立克次体、解脲支原体、肺炎双球菌、查菲埃立克体(Ehrlichia chafensis)、屎肠球菌、脑膜炎球菌等。
在一些实施例中，细胞是真菌。可以使用所公开的方法、设备和***进行分析的真菌的非限制性示例包括但不限于：曲霉、环管苔虫科、白色念珠菌、粗球孢子菌、球菌及其组合。
在一些实施例中，细胞是原生动物或其他寄生生物。待使用本公开的方法、设备和***进行分析的寄生生物的示例包括但不限于：结肠小袋纤毛虫、小隐孢子虫、卡耶塔环孢子球虫、脑胞内原虫、痢疾变形虫、微孢子虫、兰氏贾第鞭毛虫、利什曼虫、疟原虫、弓形虫、锥体虫、梯形变形虫、蠕虫(例如，寄生虫)，具体地肠内寄生虫包括但不限于：线虫纲(线虫，例如，鞭虫、钩虫、蛲虫、蛔虫、丝虫等)、绦虫纲(例如，带虫)。
如本文中所使用的，术语“细胞”可以指一个或更多个细胞。在一些实施例中，细胞是正常细胞，例如不同发展阶段中的人类细胞或来自不同器官或组织类型的人类细胞(例如，白细胞、红细胞、血小板、上皮细胞、内皮细胞、神经元、胶质细胞、成纤维细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、配子或来自心脏、肺、脑、肝、肾、脾、胰腺、胸腺、膀胱、胃、结肠、小肠的细胞)。在一些实施例中，细胞可以是未分化的人类干细胞或已经被诱导分化的人类干细胞。在一些实施例中，细胞可以是胎儿人类细胞，例如，从孕有胎儿的母体中获得的胎儿人类细胞。在一些实施例中，细胞可以是罕见细胞。罕见细胞可以是例如循环肿瘤细胞(CTC)、循环上皮细胞、循环内皮细胞、循环子宫内膜细胞、循环干细胞、干细胞、未分化的干细胞、癌症干细胞、骨髓细胞、祖细胞、泡沫细胞、间充质细胞、滋养细胞、免疫***细胞(宿主或移植)、细胞片段、细胞器(例如，线粒体或细胞核)、病原体感染细胞等。
在一些实施例中，细胞是非人类细胞，例如，其他类型的哺乳动物细胞(例如，小鼠、大鼠、猪、狗、牛或马)。在一些实施例中，细胞是其他类型的动物或植物细胞。在其他实施例中，细胞可以是任何原核或真核细胞。
在一些实施例中，从未患有疾病或病症的人获得第一细胞样本，并且从患有疾病或病症的人获得第二细胞样本。在一些实施例中，人是不同的。在一些实施例中，人是相同的，但细胞样本取自不同的时间点。在一些实施例中，人是患者，并且细胞样本是患者样本。疾病或病症可以是癌症、细菌感染、病毒感染、炎性疾病、神经变性疾病、真菌疾病、寄生虫病、遗传性疾病或其任何组合。
在一些实施例中，适合于在当前公开的方法中使用的细胞的大小范围为直径约2微米到约100微米。在一些实施例中，细胞的直径可以是或大约是2微米、5微米、10微米、15微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米或这些值中的任何两个之间的数量或范围。在一些实施例中，细胞的直径可以是至少或至多2微米、5微米、10微米、15微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米或100微米。在一些实施例中，细胞的直径为约10微米。
在一些实施例中，在将细胞与珠粒关联之前对细胞进行分选。例如，可以通过荧光活化细胞分选或磁活化细胞分选或更一般地通过流式细胞术对细胞进行分选。可以根据大小对细胞进行过滤。在一些实施例中，渗余物包含待与珠粒相关联的细胞。在一些实施例中，流过物包含待与珠粒相关联的细胞。
样本可以指多个细胞。样本可以指单层细胞。样本可以指薄切片(例如，组织薄切片)。样本可以指可以一维地置于阵列上的固体或半固体细胞集合。
重新对齐
在使对齐微孔阵列对齐之后并且在将样本液滴引入到微孔阵列例如样本微孔阵列中之前，所述方法可以包括：将附加对齐液滴引入到对齐微孔阵列例如第二对齐微孔阵列中。在一些实施例中，所述方法可以包括：在将所述一个或更多个样本液滴引入到样本阵列的微孔中之前，将对齐液滴例如第二对齐液滴引入到对齐微孔阵列例如第二对齐微孔阵列的微孔中。
在一些实施例中，所述方法可以包括：使用第一成像传感器确定对齐液滴在对齐微孔阵列上的位置，例如第二对齐液滴在第二对齐微孔阵列上的位置。在一些实施例中，所述方法可以包括：使用第二成像传感器确定对齐液滴在对齐微孔阵列上的位置。在一些实施例中，所述方法可以包括：使用第一成像传感器和第二成像传感器确定对齐液滴在对齐微孔阵列上的位置。在一些实施例中，将样本液滴引入到样本微孔阵列的微孔中可以进一步基于第二对齐液滴在第二对齐阵列上的位置。
***
本文公开了用于产生阵列例如细胞阵列、合成颗粒阵列或试剂阵列的***。在一些实施例中，所述***可以包括：细胞分选部件，所述细胞分选部件被配置成：将液滴流式细胞术地引入到微孔阵列的微孔中以产生细胞阵列。在一些实施例中，微孔阵列可以包括每平方英寸500个或更多个微孔。在一些实施例中，确定第一参数和第二参数可以包括：将对齐液滴例如第一对齐液滴流式细胞术地沉积到对齐微孔阵列例如第一对齐微孔阵列的微孔上。在一些实施例中，所述***可以包括所述微孔阵列，其中，所述微孔阵列可以与所述细胞分选部件成液滴接收关系。
在一些实施例中，所述***可以包括控制部件例如对齐控制器418，所述控制部件被配置成：接收在所述微孔阵列上在x方向和y方向上的期望位置；并且使用第一成像传感器确定第一参数并且使用第二成像传感器确定第二参数以便将液滴引入到微孔阵列的微孔中。在一些实施例中，第一成像传感器和第二成像传感器可以大致彼此正交。在一些实施例中，第一成像传感器和第二成像传感器中的一个或两个可以处于废液接收器皿与微孔阵列之间。在一些实施例中，液滴的位置与期望位置之间的距离可以处于阈值例如预定阈值内。
在一些实施例中，所述控制部件可以进一步被配置成基于第一参数和第二参数将多个细胞和/或合成颗粒引入到微孔阵列的微孔中。
在一些实施例中，所述控制部件可以进一步被配置成：在将所述多个细胞引入到微孔阵列的微孔中之前，将第二对齐液滴引入到第二对齐微孔阵列的微孔中；以及确定第二对齐液滴在第二对齐微孔阵列上的位置，其中，将所述多个细胞引入到所述细胞阵列的所述微孔中可以进一步基于所述第二对齐液滴在所述第二对齐微孔阵列上的位置。
在一些实施例中，所述***可以包括处理器例如图6所示的处理器602，其中，所述处理器可以包括可操作地耦合到处理器的存储器例如存储器604，其中，所述存储器可以包括存储于其上的指令。在一些实施例中，所述处理器可以被配置成：接收在所述微孔阵列上在所述x方向和所述y方向上的所述期望位置；并且使用所述第一成像传感器确定所述第一参数并且使用所述第二成像传感器确定所述第二参数以便将所述液滴引入到所述微孔阵列的所述微孔中。在一些实施例中，第一成像传感器和第二成像传感器可以大致彼此正交。在一些实施例中，第一成像传感器和第二成像传感器中的一个或两个可以处于废液接收器皿例如废液接收器皿338b与微孔阵列例如微孔阵列338a之间。在一些实施例中，液滴的位置和期望位置可以处于阈值例如预定阈值内。
在一些实施例中，所述***可以包括处理器，其中，所述处理器可以包括可操作地耦合到所述处理器的存储器，其中，所述存储器可以包括存储于其上的指令，其中，所述指令当被所述处理器执行时可以将所述处理器配置成：接收在所述微孔阵列上在所述x方向和所述y方向上的所述期望位置；并且使用所述第一成像传感器确定所述第一参数并且使用所述第二成像传感器确定所述第二参数以便将所述液滴引入到所述微孔阵列的所述微孔中，其中，所述第一成像传感器和所述第二成像传感器可以大致彼此正交并且可以处于废液接收器皿与所述微孔阵列之间，并且其中，液滴的位置和期望位置可以处于预定阈值内。
示例
以上讨论的实施例的一些方面进一步详细地公开于以下示例中，所述示例不旨在以任何方式限制本公开的范围。
示例1
高密度微孔阵列
此示例展示了产生高密度液滴阵列。
使用改良的BD(新泽西州富兰克林湖)FACSJazzTM细胞分选仪，将4000个单一细胞沉积到1英寸×3英寸的微孔载玻片密度上，如图7A和图7B所示。微孔载玻片上的微孔具有400微米的直径。微孔载玻片上的微孔具有480微米的中心到中心距离或者80微米的边缘到边缘距离。微孔载玻片上的微孔的占用率被调整为大致50％。
这些数据在一起表明可以使用流式细胞仪产生高密度液滴阵列。
示例2
对齐微孔阵列
此示例描述了将微孔阵列对齐，以便可以将样本收集在微孔阵列的每个微孔的中心处。
提供了具有台的流式细胞仪。所述台能够固持微孔阵列。所述台能够在x方向和y方向上移动。x轴和y轴被单独对齐。以如python等编程语言编写了脚本。脚本包括用于首先在制造现场对齐第一微孔阵列并且随后在顾客现场对齐第二微孔阵列的步骤。
x轴在由流式细胞仪产生的带负电液滴的偏转方向上。偏转由通过流式细胞仪的偏转板产生的偏转场引起。限定了也被称为排水管或废液接收器皿的主流收集器的边缘。偏转后置相机在偏转流通过增大液滴电荷而移动远离主流时拍摄偏转流的图像，直到偏转流以某个距离如预定阈值通过排水管边缘。此位置被保存在文件中作为黄金偏转流x坐标以供随后在客户现场使用。
微孔阵列上的A1微孔被对齐为使得偏转流被收集在A1微孔的中心处。针对不同类型的微孔阵列重复此过程，并且针对每种类型的微孔阵列将台的x坐标保存作为台x坐标。在客户现场，每次分选开始时，偏转流被发送到所保存的黄金偏转流x坐标，并且台被发送到所保存的台x坐标以便将样本沉积在微孔阵列的每个微孔的中心处。
y轴垂直于偏转方向。对于y方向上的对齐，流图像由侧置相机保存，并且流的y坐标被保存。在制造现场，对于每种类型的微孔阵列，所述台被移动，直到对齐液滴在y方向上被收集在微孔阵列的A1微孔的中心处。对于每种类型的微孔阵列，台的y坐标被保存为A1微孔的台y坐标。在用户现场，每次分选开始时，通过侧置相机测量偏转流在y轴上的位置，并且例如在指针测微计中计算与所保存的台y坐标的位移。此值用于将台移动远离A1微孔的其原始保存的台位置，以便在y方向上将样本收集在微孔阵列的每个微孔的中心处。因此，对齐过程通过在用户现场处的每次分选开始时对齐微孔阵列补偿了包括喷嘴替换在内的任何流位移。
示例3
流体流对齐
此示例展示了对齐流体流，以便可以将样本收集在微孔阵列的每个微孔的中心处。
在以下附图中，每个通道被校准到管(每对平行条对应于落入管中的流体流)。图8示出了不具有流的非限制性示例性照片。图9示出了在中部(往左边，理想地应当处于中心)具有流的非限制性示例性照片。中部的流对应于非偏转流(例如，待收集在废液器皿中的流)。图10示出了双通道设置视图的非限制性示例性照片。这两个通道对应于被收集的两股流。图11示出了自动细胞沉积单元(ACDU，Automated Cell Deposition Unit)视图(板分选)的非限制性示例性照片。图12示出了四通道设置视图的非限制性示例性照片。
图13示出了校准期间的视图的非限制性示例性照片。在设置偏转电压之后，执行测试分选。竖线点是未处于通道中的偏转流。图14示出了将图13所示的移动流调整到通道中的非限制性示例性照片。图15示出了非限制性示例性照片，所述照片显示，在用户***不同的喷嘴之后，所述流移动到右边并且偏转流也向右移动。图16示出了图15中的设置的非限制性示例性照片，其中，偏转电压被调整以使偏转流返回到优选通道中。
所述数据一起表明可以通过调整流的参数将多股流与多个通道对齐。
示例4
校准细胞仪分选流以将液滴准确地置于收集板目的地内
此示例描述了使用收集板来校准细胞仪分选流，以便可以将样本的液滴准确地置于例如微孔板的微孔中。
可以使对齐设备(例如，高精度机加工模板)产生有目标靶眼。其大小可以与通常装配在仪器中的板设备的大小相同。目标具有一毫米到十毫米的标记物。图17A和图17B示出了校准板。当这被加载到仪器中并且移动到校准位置时，分选器准备好沉积单个液滴。液滴沉积的位置可以由用户检查。此位置然后被图形地输入到软件中。
软件界面通过自动计算x/y偏移校准来辅助用户。在液滴沉积之后，用户可以定位液滴沉积的位置。用户然后使用指针输入图形上的位置。
图18A到图18C示出了用于校准微孔板的非限制性用户界面。图18A展示，软件示出了校准目标的表示。中心处的绿色圆圈是偏移。为了改变偏移，用户点击绿色圆圈并将其拖动到用户看到液滴沉积物的位置。图18B示出，用户已经将圆圈移动到液滴沉积的位置。此时，用户点击按钮“移动到校准位置”。这将计算所需偏移以便步进电机将液滴对齐在中心。在点击所述按钮之后，偏移圆圈移动回到中心，从而指示这是新的。图18C示出，板加载器是经校准的。
在之前描述的实施例中的至少一些中，在一个实施例中使用的一个或更多个元件可以在另一个实施例中互换使用，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员应当理解的是，在不脱离所请求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构做出各种其他省略、添加和修改。所有这种修改和改变旨在落入如通过所附权利要求书限定的主题的范围内。
关于在本文中使用基本上任何复数和/或单数术语，本领域的技术人员可以根据上下文和/或应用的需要将复数翻译成单数和/或将单数翻译成复数。为了清晰起见，本文中可以清晰地阐述各种单数/复数的转换。
本领域的技术人员将理解，一般而言，本文中所使用的术语，尤其是在所附权利要求书中的术语(例如，所附权利要求书的主体)通常旨在是“开放性的”术语(例如，术语“包括”应当被解释为“包括但不限于”，术语“具有”应当被解释为“具有至少”，术语“包括”应当被解释为“包括但不限于”等等)。本领域的普通技术人员另外将认识到的是，如果意指特定数目的一种所引入的权利要求陈述，那么将在所述权利要求中明确陈述这种意图，并且在无这类陈述的存在下，不呈现这种意图。例如，为了帮助理解，以下所附权利要求书可能含有引入性短语“至少一个”和“一个或更多个”来引入权利要求陈述。然而，使用这类短语不应被视为暗示由不定冠词“一个(种)”引入一个权利要求陈述会将含有此类引入的权利要求陈述的任何具体权利要求限制为仅包含一个此类陈述的实施例，即使当同一权利要求包括介绍性短语“一个(种)或更多个(种)”或“至少一个(种)”以及不定冠词诸如“一个(种)”时(例如，“一个(种)”应当解释为“至少一个(种)”或“一个(种)或更多个(种)”)；这对用于引入权利要求陈述的定冠词的使用同样适用。另外，即使明确地陈述一个所引入的权利要求陈述的特定数目，本领域的技术人员将会认识到此陈述应当解释为意味着至少所述陈述的数目(例如，在无其他修饰语的情况下仅陈述“两个陈述”意味着至少两个陈述，或者两个或更多个陈述)。此外，在使用类似于“A、B和C中的至少一项等等”的惯例的情况下，通常，这种构造旨在本领域的技术人员应当理解所述惯例的意义上(例如，“一个***具有A、B和C中的至少一项”将包括但是不限于***具有单独的A、单独的B、单独的C、A与B一起、A与C一起、B与C一起、和/或A、B和C三者一起，等等)。在使用类似于“A、B或C中的至少一项等等”的惯例的情况下，通常，这种构造旨在本领域的技术人员应当理解所述惯例的意义上(例如，“一个***具有A、B或C中的至少一项”将包括但不限于***具有单独的A、单独的B、单独的C、A与B一起、A与C一起、B与C一起、和/或A、B和C三者一起，等等)。本领域的普通技术人员将进一步理解的是无论是在说明书、权利要求书还是附图中，呈现两个或更多个替代性术语的几乎任何分隔性词语和/或短语都应当理解为考虑到了包括这些术语中的一者、这些术语中的任一者或这两个术语的可能性。例如，短语“A或B”应理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
此外，当以马库什(Markush)组的方式描述本公开的多个特征或方面时，在本领域内的技术人员将会认识到还以所述马库什组中任一个单独的成员或多个成员的子组的方式来对本公开进行描述。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，诸如在提供书面说明方面，在本文中公开的所有范围也包括任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围可以容易地被认为是充分地描述所述同一范围并且使得所述范围分成至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为一个非限制性实例，在本文中讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的是，诸如“多至”、“至少”、“大于”、“小于”等所有语言包括所陈述的数字，并且是指可以随后分成如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，一个范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1到3个物品的组是指具有1、2或3个物品的组。类似地，例如，具有1至5个物品的组是指具有1、2、3、4或5个物品的组，等等。
虽然本文已经公开了不同的方面和实施例，但本领域的技术人员应当明白其他的方面和实施例。在本文中公开的各面以及实施例是为了说明的目的，而且并不旨在进行限制，其中真实的范围以及精神是由以下权利要求书指示的。
Claims (47)
1.一种产生细胞阵列的方法，所述方法包括：
提供包括多个细胞的样本；
利用两个大致彼此正交的成像传感器将流式细胞仪的分选部件与所述微孔阵列对齐；以及
将所述样本中的所述多个细胞引入到微孔阵列的微孔中以产生所述细胞阵列，其中，所述微孔阵列包括每平方英寸500个或更多个微孔，并且其中，所述细胞阵列的所述微孔中的25％或更多包括单个细胞，
其中，将所述多个细胞引入到所述微孔阵列的所述微孔中包括：将所述多个细胞流式细胞术地沉积到所述微孔阵列的所述微孔中。
2.如权利要求1所述的方法，其中，将所述样本中的所述多个细胞引入到所述微孔阵列的所述微孔中包括：将所述样本中的所述多个细胞引入到所述微孔阵列的所述微孔中在多个第一期望位置处。
3.如权利要求2所述的方法，其中，将所述样本中的所述多个细胞引入到所述微孔阵列的所述微孔中在所述多个第一期望位置处包括：将来自所述多个细胞的兴趣细胞引入在所述多个第一期望位置之一处。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述细胞阵列的所述微孔中的50％或更多包括单个细胞。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述微孔阵列包括每平方英寸1000个或更多个微孔。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述微孔阵列的所述微孔中的每一个都具有不超过1000纳升的体积。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述微孔阵列的所述微孔中的每一个都具有不超过400纳升的体积。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述微孔阵列的所述微孔中的每一个都具有不超过1000微米的直径。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述微孔阵列的所述微孔中的每一个都具有不超过400微米的直径。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述微孔阵列的所述微孔中的至少两个彼此分离不超过200微米。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述微孔阵列的所述微孔中的至少两个彼此分离不超过80微米。
12.如权利要求1所述的方法，其中，将所述多个细胞流式细胞术地沉积到所述微孔阵列的所述微孔中包括：使用流式细胞仪将单个细胞一次性沉积到所述微孔阵列的所述微孔中。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，进一步包括：在将所述多个细胞引入到所述微孔阵列的所述微孔中之前，将试剂引入到所述微孔阵列的所述微孔中的一个或更多个中。
14.如权利要求1至12中任一项所述的方法，进一步包括：将试剂引入到所述细胞阵列的所述微孔中的一个或更多个中。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中，所述试剂包括一个或更多个合成颗粒。
16.如权利要求13至15中任一项所述的方法，其中，引入所述试剂包括：将所述试剂流式细胞术地沉积到所述微孔中。
17.如权利要求15和16中任一项所述的方法，其中，所述一个或更多个合成颗粒包括珠粒。
18.如权利要求1至12中任一项所述的方法，进一步包括：将合成颗粒引入到所述微孔阵列的所述微孔中在多个第二期望位置处。
19.如权利要求1至12中任一项所述的方法，进一步包括：将兴趣合成颗粒引入到所述微孔阵列的所述微孔中在所述多个期望位置之一处。
20.如权利要求18和19中任一项所述的方法，其中，将合成颗粒引入到所述微孔阵列的所述微孔中包括：将所述合成颗粒流式细胞术地沉积到所述微孔阵列的所述微孔中。
21.如权利要求15至20中任一项所述的方法，其中，所述一个或更多个合成颗粒包括附有寡核苷酸条形码的磁性珠粒。
22.一种产生液滴阵列的方法，所述方法包括：
利用两个大致彼此正交的成像传感器将流式细胞仪的分选部件与所述微孔阵列对齐；以及
将多个第一液滴引入到微孔阵列的微孔中以产生第一液滴阵列，其中，所述微孔阵列包括每平方英寸500个或更多个微孔，其中，所述第一液滴阵列的所述微孔中的25％或更多仅包括单个第一液滴，
其中，引入所述多个第一液滴包括：将所述多个第一液滴流式细胞术地沉积到所述微孔阵列的所述微孔中。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述第一液滴阵列的所述微孔中的50％或更多仅包括单个第一液滴。
24.如权利要求22和23中任一项所述的方法，其中，所述微孔阵列包括每平方英寸1000个或更多个微孔。
25.如权利要求22至24中任一项所述的方法，其中，所述微孔阵列的所述微孔中的每一个都具有不超过1000纳升的体积。
26.如权利要求25所述的方法，其中，所述微孔阵列的所述微孔中的每一个都具有不超过400纳升的体积。
27.如权利要求22至26中任一项所述的方法，其中，所述微孔阵列的所述微孔中的每一个都具有不超过1000微米的直径。
28.如权利要求22至27中任一项所述的方法，其中，所述微孔阵列的所述微孔中的至少两个彼此分离不超过200微米。
29.如权利要求22至28中任一项所述的方法，进一步包括：
将多个第二液滴引入到所述第一液滴阵列的所述微孔中以产生第二液滴阵列，
其中，所述第二液滴阵列的所述微孔中的25％或更多包括单个第一液滴和单个第二液滴。
30.如权利要求22至28中任一项所述的方法，进一步包括：
在将所述多个第一液滴引入到所述微孔阵列的所述微孔中之前，将多个第二液滴引入到所述微孔阵列的所述微孔中以产生第二液滴阵列，
其中，所述第二液滴阵列中的所述微孔中的25％或更多包括单个第一液滴和单个第二液滴。
31.如权利要求29和30中任一项所述的方法，其中，所述多个第一液滴和所述多个第二液滴中的每一个都分别包括单个细胞或合成颗粒。
32.如权利要求31所述的方法，其中，所述合成颗粒包括附有多个寡核苷酸条形码的珠粒。
33.如权利要求32所述的方法，其中，所述多个寡核苷酸条形码中的每一个都与所述多个寡核苷酸条形码中的至少另一个相同或不同。
34.如权利要求31至33中任一项所述的方法，其中，所述多个第二液滴中的第二液滴进一步包括试剂。
35.如权利要求22所述的方法，其中，将所述多个第一液滴流式细胞术地沉积到所述微孔阵列的所述微孔中包括：使用流式细胞仪将单个第一液滴一次性沉积到所述微孔阵列的所述微孔中。
36.一种通过权利要求14至29中任一项产生的细胞阵列。
37.一种通过权利要求1所述的方法产生的细胞阵列，包括：
微孔阵列，所述微孔阵列包括每平方英寸500个或更多个微孔，其中，所述微孔阵列的所述微孔中的25％或更多包括单个细胞以及包含聚合物珠粒的合成颗粒。
38.如权利要求37所述的细胞阵列，其中，所述微孔中的50％或更多包括单个细胞。
39.如权利要求37和38中任一项所述的细胞阵列，其中，所述微孔阵列包括每平方英寸1000个或更多个微孔。
40.如权利要求37至39中任一项所述的细胞阵列，其中，所述微孔阵列的所述微孔中的每一个都具有不超过1000纳升的体积。
41.如权利要求40所述的细胞阵列，其中，所述微孔阵列的所述微孔中的每一个都具有不超过400纳升的体积。
42.如权利要求37至41中任一项所述的细胞阵列，其中，所述微孔阵列的所述微孔中的每一个都具有不超过1000微米的直径。
43.如权利要求42所述的细胞阵列，其中，所述微孔阵列的所述微孔中的每一个都具有不超过400微米的直径。
44.如权利要求37至43中任一项所述的细胞阵列，其中，所述微孔阵列的所述微孔中的至少两个彼此分离不超过200微米。
45.如权利要求44所述的细胞阵列，其中，所述微孔阵列的所述微孔中的至少两个彼此分离不超过80微米。
46.如权利要求37至45中任一项所述的细胞阵列，其中，所述微孔阵列的所述微孔中的25％或更多包括单个细胞和合成颗粒。
47.如权利要求46所述的细胞阵列，其中，所述合成颗粒包括附有多个寡核苷酸条形码的珠粒。
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