TW202021988A - 抗血管新生融合蛋白及其用途 - Google Patents
抗血管新生融合蛋白及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- TW202021988A TW202021988A TW108129526A TW108129526A TW202021988A TW 202021988 A TW202021988 A TW 202021988A TW 108129526 A TW108129526 A TW 108129526A TW 108129526 A TW108129526 A TW 108129526A TW 202021988 A TW202021988 A TW 202021988A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- fusion protein
- fragment
- vegf
- ecd
- bifunctional fusion
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
- C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Abstract
本發明提供一種雙功能融合蛋白,其為同時靶向血管內皮生長因子(VEGF)及血管生成素(ANG)的(AT)a-Fc-(VT)b,其中AT是ANG結合模體;VT是VEGF結合模體;Fc是IgG的N端;a及b的每一者是1至10的整數。該雙功能融合蛋白含有兩種或多種人類蛋白且全部為人類序列的結構域,因此預期其為非免疫原性的,並且可能用於治療人類靶向血管新生相關疾病。
Description
本申請案主張在2018年8月17日提出申請之美國臨時申請案第62/719,377號的權益及優先權,該臨時申請案係以全文引用方式併入本文中。
本發明係與一種抗血管新生融合蛋白有關,該融合蛋白係雙功能融合蛋白。
血管新生,即藉由從先前存在的血管出芽長成血管,對於固態腫瘤成長及腫瘤轉移來說是不可或缺的。產生新的血管涉及多步驟過程,包含起始血管膜溶解、內皮細胞遷移及增生以及新血管形成。抑制任一這些步驟會抑制新血管形成,並因此影響腫瘤生長及轉移產生。事實上,根據估計,消除單個內皮細胞可抑制腫瘤細胞生長。根據報導,抗血管新生療法可為癌症治療提供有希望的機制。
血管內皮生長因子(VEGF)在血管新生過程中扮演了重要的角色。在老年黃斑部退化(AMD)或腫瘤生長等疾病中,主要是藉由此重要生長因子的過度表現引起新血管形成[Connolly等人(1989)J Clinic Invest
84(5):1470-8;Ferrara等人(1989)Biochem Biophys Res Commun
161(2):851-8; Ferrara等人(1989)Nat Med
4(3):336-40]。VEGF家族包含若干成員,例如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及胎盤生長因子(PGF)。VEGF-A為VEGF家族的原型成員,也是最廣為研究的成員。已顯示VEGF-A會刺激內皮細胞行有絲***、促進細胞存活及增殖、誘導細胞遷移及增加微血管通透性。已證明藉由利用抗體、VEGF陷阱(traps)或VEGF受體(VEGFR)激酶抑制劑阻斷VEGF以靶向血管新生過程,在臨床前及臨床上能有效治療癌症及AMD症[Major等人(1997)J Pharmacol Exp. Ther
283(1):402-10;Willett等人(2004)Nat Med
10(2):145-7;Papadopoulos等人(2012)Angiogenesis
15(2): 171-85;Aiello等人(1995)Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92(23):10457-61]。舉例來說,在VEGF阻斷劑中,Eylea(阿柏西普)為靶向VEGF-A、VEGF-B及PGF的改造嵌合Fc融合蛋白,其含有VEGFR1細胞外Ig結構域2(ECD,D2)、VEGFR2細胞外Ig結構域3(ECD,D3)及IgG1 Fc片段,目前已獲FDA批准用於治療AMD及轉移性結腸直腸癌[Holash等人(2002)Proc. Natl. Acad. Sci. USA
99(17):11393-8]。
血管生成素(ANG)為血管生長因子的一家族,也顯示在血管新生中扮演了重要的角色[Alves等人(2010)BMC Infect Dis
10:143-52]。其中,已證明ANG1及ANG2藉由ANG-TIE信號傳遞路徑在發育及腫瘤誘導的血管新生過程中參與了血管穩定性及退化的平衡[Augustin等人(2009)Nat Rev Mol Cell Biol
10(3):165-77]。ANG1及ANG2以類似的親和力與TIE2結合[Suri等人(1996)Cell
87(7):1171-80;Maisonpierre等人(1997)Science
277:55–60]。TIE2細胞外結構域(ECD)含有三個EGF樣模組,其側翼有兩個免疫球蛋白(Ig)樣結構域及第三免疫球蛋白樣結構域,接著有三個第三型纖維黏連蛋白(FNIII)重複序列。 結構及功能分析顯示ANG結合位點位於Ig樣子結構域的N端對,然而,與整個TIE2 ECD相比,其顯示了較低的結合活性[Lin等人(1997)J Clin Invest
100:2072–2078]。 最近的研究表明了ANG1為促效劑,藉由將介於內皮細胞與其周圍支持細胞及細胞外基質之間的相互作用最大化以促進血管穩定。另一方面,發現到ANG2是環境依賴拮抗劑,促進血管新生出芽或血管退化[Maisonpierre等人(1997)Science
277:55–60]。循環ANG2濃度已經確定為預測許多人類癌症(包含轉移性黑色素瘤、結腸直腸癌(CRC)及慢性淋巴細胞性白血病)不良預後的因子[Eklund等人(2013)Exp Cell Res
319(9):1271-80]。據報導,升高的ANG2會引起內皮細胞不穩定,其導致血管退化、缺氧及ANG2、VEGF兩者增加表現,這些共同誘導腫瘤中強烈的血管新生[Holash等人(1999)Science
284(5422): 1994-8]。
然而,期望開發出一種在治療血管新生相關疾病中抑制血管新生的新方法。
因此,本發明提供一種融合蛋白,其抑制ANG-TIE信號傳遞路徑及VEGF-VEGFR信號傳遞路徑,其中該融合蛋白含有一ANG抑制結構域及一VEGF抑制結構域,從而藉由阻斷ANG、VEGF或其受體之間的相互作用以在抑制血管新生方面提供顯著改善的功效。
在一方面,本發明提供一種雙功能融合蛋白,其包含與一連接子融合的一或多個含有片段的ANG結合模體及一或多個含有片段的VEGF結合模體,從而藉由阻斷ANG、VEGF或其受體之間的相互作用以在抑制血管新生方面提供顯著改善的功效。
在本發明的一具體實施例中,該雙功能融合蛋白包含與一連接子融合的(1)一或多個含有ANG結合模體的片段及(2)一或多個含有VEGF結合模體的片段。
在本發明的一實例中,該含有ANG結合模體的片段是一片段抗原結合(Fab)片段,且含有VEGF結合模體的片段是一單鏈抗體(ScFv)。
在本發明的一具體實施例中,該雙功能融合蛋白是同時靶向血管內皮生長因子(VEGF)及血管生成素(ANGs)的 (AT)a-Fc-(VT)b,其提供了顯著改善的抗血管新生功效,其中AT是一ANG結合模體,VT是一VEGF結合模體;Fc是一連接子;a及b的每一者是1至10的整數。
在本發明的一具體實施例中,ANG結合模體是由Tie2細胞外結構域(ECD)胺基酸23-448殘基所組成的片段。
在本發明的一具體實施例中,該VEGF結合模體是VEGFR1 ECD D2、VEGFR2 ECD D3或含有兩者的嵌合結構域。在一較佳的具體實施例中,該VEGF結合模體是含有VEGFR1 ECD D2及VEGFR2 ECD D3的嵌合結構域。
在本發明的一具體實施例中,該連接子是IgG1 Fc片段、短彈性GS連接子或其組合。
在本發明的一具體實施例中,該雙功能蛋白是融合蛋白(AT)-Fc-(VT),其中AT是一含有Tie2 ECD胺基酸23-448殘基的AT片段,Fc是一IgG Fc片段,且VT是一含有含VEGFR1 D2及VEGFR2 D3的嵌合結構域的VT片段。
在本發明的一實例中,該AT片段與IgG Fc片段融合,接著在該AT-Fc片段的C端以一短彈性GS連接子與該VT連接。
在一特定的具體實施例中,該雙功能融合蛋白是由一含有ANG抑制結構域的片段抗原結合(Fab)及一具有VEGF抑制結構域的單鏈抗體(ScFv)所構築。較佳地,該Fab是抗-Ang2 Fab,且該ScFv是由Lucentis(蘭尼單抗)Vh及Vk所組成的融合片段。
在一具體實施例中,該Fc片段是一野生型或一任何人類免疫球蛋白同型、亞型或同種異型的變體。
在另一方面,本發明提供一種醫藥組合物,其包含本文中揭示的該融合蛋白及醫藥上可接受的載體。
根據本發明,醫藥組合物是用於防止或治療血管新生相關疾病,例如老年性黃斑部退化(AMD)症或原發癌或轉移癌。
在又另一方面,本發明提供一種能夠與血管生成素結合的融合蛋白,其含有與IgG1 Fc片段融合的Tie2 ECD胺基酸23至448殘基。
在又另一方面,本發明提供一種針對VEGF的融合蛋白,其包含在其C端與IgG1 Fc片段融合的一含有VEGFR1 D2及VEGFR2 D3的嵌合模體。
應理解的是,前述一般性描述及下述實施方式兩者為例示、說明且不限制本發明。
除非另外定義,否則本文中使用的科學及技術術語具有與由所屬技術領域中具有通常知識者通常理解的含義。
如本文所使用的,「抗體」乙詞為由一或多種實質上由免疫球蛋白基因編碼的多肽所組成的蛋白。典型的抗體為四聚物,其由兩對相同的多肽鏈所構成,每一對具有一條「輕」鏈及一條「重」鏈。
本文中使用的「抗體可變區」乙詞是指抗體可變鏈的N端區,其包含主要負責抗原識別的胺基酸殘基。所屬技術領域中具有通常知識者能容易地識別抗體可變區並決定賦予抗原識別所需的最小尺寸。抗體可變區可為單鏈抗體,例如單鏈Fv抗體(ScFv),其中可變重鏈區及可變輕鏈區連接在一起(直接連接或藉由肽連接子連接)以形成連續多肽。ScFv抗體可經化學合成或可從包括直接連接或藉由肽編碼連接子連接的VH
-及VL
-編碼序列的核酸表現。
本發明提供了一種雙功能融合蛋白,其抑制血管生成素(ANG)-TIE信號傳遞路徑及血管內皮生長因子(VEGF)-血管內皮生長因子受體(VEGFR)信號傳遞路徑。在本發明中,該融合蛋白含有ANG抑制結構域及VEGF抑制結構域,從而藉由阻斷ANG、VEGF或其受體之間的相互作用以在抑制血管新生方面提供顯著改善的功效。
在本發明中,於血管新生過程中扮演重要角色的VEGF及ANG兩者,用於構築IgG Fc融合阻斷劑。首先,產生分別具有ANG及VEGF結合活性的AT-Fc及Fc-VT蛋白,並因產生AT-Fc-VT雙功能蛋白以提供雙功能融合蛋白(具有ANG及VEGF結合活性)。這些AT-Fc及Fc-VT蛋白顯示能以高親和力與其各自的配體結合,且還分別在基於細胞的分析(cell-based assay)中提供抗-ANG及抗-VEGF的功能。在本發明中,該Fc融合蛋白含有人類蛋白且全部為人類來源的結構域,並預期其為非免疫原性的,因此其具潛力進一步開發作為治療血管新生相關疾病的治療劑。
在本發明中,可使用任何具有阻斷VEGF活性的模體、肽、蛋白或片段,例如抗-VEGF抗體、VEGF陷阱或VEGF受體(VEGFR)細胞外Ig結構域,諸如D1-D7,具體而言是VEGFR1細胞外Ig結構域2(ECD,D2)、VEGFR2細胞外Ig結構域3(ECD,D3)。
在本發明中,可使用任何與血管生成素(ANG)結合的模體、肽、蛋白或片段,例如與TIE2結合的ANG1及ANG2。TIE2 ECD含有三個EGF樣模組,其側翼有兩個免疫球蛋白(Ig)樣結構域及第三Ig樣結構域,接著有三個第三型纖維黏連蛋白(FNIII)重複。ANG結合位點位於Ig樣子結構域的N-末端對。
由於在各種各樣的癌細胞類型中上調VEGF及ANG2,會阻斷ANG-TIE相互作用(在有/無VEGF阻斷劑的情況中),因此本發明產生了針對ANG2及VEGF的雙功能融合蛋白,以用於治療癌症及老年性黃斑部退化(AMD)症。
在各種具體實施例中,血管新生相關疾病可為老年性黃斑部退化(AMD)症或原發癌及轉移癌。
老年性黃斑部退化(AMD)症是一種疾病,其使得閱讀、縫紉及駕駛等「直視(straight-ahead)」活動所需的敏銳中央視力模糊。一般來說,AMD會影響黃斑(眼睛的一部份)。
原發癌及轉移性癌可能是乳癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、口咽癌、下咽癌、食道癌、胃癌、胰臟癌、肝癌、膽囊及膽管癌、小腸癌、泌尿道癌(包括腎、膀胱及泌尿道上皮)、女性生殖道癌(包括子宮頸癌、子宮癌及卵巢癌,以及絨毛膜癌及妊娠滋養細胞疾病)、男性生殖道癌(包括攝護腺癌、儲精囊癌,睪丸癌及生殖細胞腫瘤)、內分泌腺癌(包括甲狀腺癌、腎上腺癌、及腦下垂體腺癌)、及皮膚癌,以及血管瘤、黑色素瘤、肉瘤(包括由骨骼及軟組織引起的那些及卡波西氏肉瘤)、腦、神經、眼及腦膜的腫瘤(包括星狀細胞瘤、神經膠瘤、神經膠母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、神經瘤、神經母細胞瘤、神經鞘瘤及腦膜瘤)、由造血惡性疾病引起的腫瘤、急性白血病、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、B細胞淋巴瘤、勃氏(Burkitt's)淋巴瘤、慢性骨髓細胞性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、髮樣細胞白血病、霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤、造血惡性疾病、卡波西氏肉瘤、惡性淋巴瘤、惡性組織細胞增生、惡性黑色素瘤、多發性骨髓瘤、腫瘤伴生症候群/惡性高血鈣症或固態腫瘤。
在本發明的一具體實施例中,使用具有Tie2 ECD胺基酸23至448殘基的片段(SEQ ID NO:1)在C端產生具有IgG1 Fc片段(SEQ ID NO:2)的AT-Fc蛋白,以改造AT-Fc蛋白。
在本發明的另一具體實施例中,含有VEGFR1 D2及VEGFR2 D3嵌合模體的片段(SEQ ID NO: 3)在IgG1 Fc片段(SEQ ID NO: 2)的C-末端融合,以構築具有短柔性GS連接子(SEQ ID NO:4)在其之間的Fc-VT蛋白,該連接子確保正確的折疊並使空間位阻最小化。
在又一具體實施例中,藉由融合改造AT-Fc-VT融合蛋白以獲得在AT-Fc的C端含有VEGFR1 ECD D2及VEGFR2 ECD D3(SEQ ID NO:3)的結構域,也包括介於AT-FC及VT蛋白之間的GS連接子(SEQ ID NO:4)。
在一特定具體實施例中,該雙功能蛋白Tc350-253經改造並表現為雙硫鍵連接的Tc350-Tc253蛋白,其中藉由以下構築Tc350:在抗-Ang2-片段抗原結合(Fab)重鏈(HC)(SEQ ID NO:7)的C端融合Lucentis可變重鏈結構域(Vh)(SEQ ID NO:5)及可變κ結構域(Vk)(SEQ ID NO: 6),其之間有短彈性GS連接子(SEQ ID NO:4),且Tc253經構築以具有抗-Ang2- Fab輕鏈(LC)片段(SEQ ID NO:8)。
在進一步的具體實施例中,以一信號肽(SEQ ID NO:9)引導本發明描述的所有融合蛋白以用於表現蛋白的分泌。
AT-Fc、Fc-VT、AT-Fc-VT及Tc350的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13所示。
在本發明中,上述AT-Fc及/或Fc-VT蛋白由HEK29細胞瞬時表現,且透過蛋白G層析純化自轉染的細胞培養上清液。發現到在單步純化過程中獲得純度高於90%的產物,且所有融合蛋白適當地形成及表現。
根據本發明,藉由在ANG蛋白的C端融合VEGF結合模體,以產生同時靶向VEGF及ANGs的雙功能融合蛋白AT-Fc-VT。如結果所示,根據本發明的AT-Fc-VT融合蛋白在抑制VEGF-依賴性HUVEC細胞增殖、細胞遷移、管形成及與ANG2蛋白結合方面提供了雙功能功效,其分別與Fc-VT或AT-Fc蛋白相當。
根據本發明,該雙功能蛋白Tc350-253對VEGF及/或ANG2誘導的血管新生相關表型提供了有利功效。具體而言,該雙功能蛋白Tc350-253意外地改善了雷射誘導的脈絡膜新生血管,已廣泛用於老年性黃斑部退化(AMD)滲出型的研究。
選擇術語定義如下,以便可更容易地理解本揭示。
如本文所用,「融合蛋白」乙詞是指藉由兩種或多種結合蛋白或模體或編碼不同基因的肽/胺基酸片段所產生的蛋白,其基因的轉譯產生了衍生自每種原始蛋白的多功能特性的單個或多個多肽。融合蛋白可包括與抗體共軛的蛋白、與不同抗體共軛的抗體或與Fab片段共軛的抗體。
AT或VT片段每一者為抗體,或者為體內半衰期長的抗體片段。
如本文所用,「連接子」乙詞是指胺基酸殘基或片段,或包含兩個或多個藉由肽鍵連接的胺基酸殘基的多肽,其用於連接兩個肽、多肽或蛋白。連接子可為Fc片段,其為野生型的免疫球蛋白Fc區或人類免疫球蛋白同型、亞型或其同種異型的變體。
「Fc區」乙詞定義抗體的免疫球蛋白重鏈的C端區。Fc區可為天然序列Fc區或變體Fc區。
如本文所用,「醫藥組合物」乙詞是指包含根據本發明融合蛋白的組合物或配方,其可藉由將根據本發明融合蛋白與任選的醫藥可接受的載體(包括溶劑、分散介質、等滲劑及其類似物)混合來製備。載體可為液體、半固體或固體載體。在一些具體實施例中,載體可為水、鹽溶液或其他緩衝液(諸如血清白蛋白及明膠)、碳水化合物(諸如單醣、雙糖及其他碳水化合物,包括葡萄糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇、山梨糖醇或糊精)、凝膠、脂質、脂質體、樹脂、多孔基質、黏合劑、填充劑、塗料、穩定劑、防腐劑、抗氧化劑(包括抗壞血酸及甲硫胺酸)、螯合劑(諸如EDTA)、成鹽抗衡離子(諸如鈉)、非離子界面活性劑[諸如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)]或其組合。
在一些具體實施例中,醫藥組合物進一步包含一種額外的治療劑,用以防止或治療所述待治療的疾病或病症。舉例來說,額外藥劑可為治療劑、化學治療劑;顯像劑、細胞毒劑、血管新生抑制劑、激酶抑制劑、共刺激分子阻斷劑(包括但不限於抗-B7.1、抗-B7.2、CTLA4-Ig、抗-CD20)、黏附分子阻斷劑(包括但不限於抗-LFA-1抗體、抗-E/L選擇蛋白抗體、小分子抑製劑)及抗-細胞激素抗體或其功能片段(包括但不限於抗-IL-18、抗TNF及抗IL-6/細胞激素受體抗體)。
藉由以下實施例進一步說明本發明,不應將其理解為進一步的限制。
實施例
實施例
1
:血管新生阻斷劑的表現及純化
TIE2 ECD胺基酸23至448殘基用作ANG結合模體,且具有VEGFR1 D2和VEGFR2 D3的嵌合結構域用作VEGF結合陷阱。相應的DNA經合成並在C端與IgG1 Fc片段融合以用於ANG阻斷劑(AT-Fc)(圖1A);或在N-末端與IgG1 Fc片段融合以用於VEGF阻斷劑(Fc-VT)(圖1B),其之間有短彈性GS連接子。為了構築雙功能AT-Fc-VT表現載體,AT-Fc依序在C端與GS連接子及VEGF模體融合(圖3)。在CMV啟動子的控制下,將這些融合構築體選殖至pCI-neo(Promega,Inc.)表現載體中介於EcoR I及Not I限制位址之間。載體含有新黴素抗性基因(Neomycin resistant gene)及胺芐青黴素抗性基因(Ampicillin resistant gene),以用於哺乳動物細胞選擇及大腸桿菌增殖。所有融合構築體在N端含有信號肽,以用於分泌可溶融合蛋白。這些表現構築體用以瞬時轉染50 ml的HEK293細胞(密度1x106
cell/ml)。轉染96小時後收獲培養基,並透過蛋白G層析來純化融合蛋白。
如圖2及圖4中所示,每次轉染得到了純度高於90%的約3 mg的融合蛋白。
為了構築雙功能蛋白Tc350-253表現載體(圖3),將抗-Ang2 Fab HC依序地與Lucentis Vh及Lucentis Vk融合,其兩者藉由GS連接子分開。Tc350-253蛋白在HEK293細胞瞬時表現,並透過鎳親和力層析自轉染的細胞培養上清液中純化。在還原或非還原的條件下對純化的蛋白(5 μg/lane)進行凝膠分析。Tc350-253雙功能蛋白以約75 kD的分子量適當地表現,並獲得高於90%的純度(圖5)。
實施例
2
:血管新生阻斷劑的體外結合
以1x PBS將整夜配體預塗覆孔(100 ng /well)洗滌3次,並以400 ul在PBS的5%脫脂乳阻隔2小時。阻隔後,由30 nM連續稀釋3倍的100 ul的純化蛋白以一式兩份加入每一個相應的孔,並在振盪器上於室溫中培養1小時。結合後,以PBST(含有0.1% Tween-20的1x PBS)將孔洗滌3次,接著將100 ul的1:2500稀釋的山羊抗-人類IgG Fc HRP共軛物(Jackson ImmunoResearch Inc.)加入每一個孔並在振盪器上再培養1小時。最終洗滌後,加入TMB試劑(Invitrogen, Inc.),並測量在450 nm處的OD吸收。使用Prism 4由S形曲線(sigmoidal curve)擬合來分析數據。以類似分析來評估AT-Fc、Fc-VT及AT-Fc-VT與ANG或VEGF的結合。
如圖6所示,計算出的AT-Fc對ANG1及ANG2的EC50
分別為4.26 nM及2.01 nM。本文中收集的結果表明了可溶細胞外結構域(胺基酸殘基23-448)在血管生成素結合方面具有功能活性,且可藉由競爭血管生成素來調節膜結合形式的活性。
如圖7所示,Fc-VT在VEGF-A結合評估中具有抗-VEGF功效。針對VEGF-A,計算的EC50為0.33 nM。如收集的結果所示,C端定位的VEGFR1 D2及VEGFR2 D3嵌合VEGF陷阱具有高親和力的功能,且可中和VEGF的生物活性。
如圖8及圖9所示,評估了純化的AT-Fc-VT雙功能融合蛋白對ANG2及VEGF的結合活性,結果表明了AT-Fc-VT融合蛋白能與ANG2及VEGF-A結合,其EC50
分別為2.57 nM及0.35 nM,且相較AT-Fc對ANG2及Fc-VT對VEGF,其提供顯著改善的結合活性。
總言之,AT-Fc-VT融合蛋白經證實具有藉由抑制配體結合及受體活化來調節ANG-TIE及VEGF-VEGFR傳遞路徑的雙功能。
實施例
3
:藉由血管新生阻斷劑來抑制
VEGF-
依賴性
HUVEC
細胞增殖分析
Fc-VT及AT-Fc-VT用以抑制基於細胞的分析中的VEGF活性。人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC細胞;Lonza,Inc.)用於證明VEGF-依賴性細胞增殖,其可為VEGF阻斷劑所抑制。在實驗中,將HUVEC細胞維持在具有2 % FBS的內皮細胞生長培養基(Lonza,Inc.)中。在37°C中將50ml 1nM VEGF-A(R&D systems, Inc.)及各種濃度的Fc-VT或AT-Fc-VT加入膠原蛋白預塗覆孔的每一個孔並維持1小時,接著將50 ml(1 x 105
cells/ml)在Medium-199(10% FBS,Hyclone,Inc.)中的HUVEC加入每一個孔中。於37°C、5% CO2中培養72小時後,藉由加入10 ml MTS檢測試劑(Promega Inc.)到每一個孔中來分析細胞生長,接著測量在450/650 nm處的OD吸收。
如圖10所示,AT-Fc-VT對VEGF-依賴性HUVEC細胞增殖分析的50%抑制活性(IC50
)為0.26 nM,其類似於本實施例中Fc-VT(0.20 nM)的抑制活性。
實施例
4
:藉由血管新生阻斷劑來抑制內皮細胞管形成
AT-Fc及AT-Fc-VT用以決定管形成分析中的抗-ANG2活性。人類臍靜脈內皮細胞用以證明Ang2-依賴性細胞管形成,其可藉由AT-Fc或AT-Fc-VT與Ang2的結合來抑制。將HUVEC維持在具有2% FBS的內皮細胞生長培養基(Lonza,Inc.)中。在分析之前,將HUVEC細胞在不含血清的基礎培養基中培養2小時,接著以胰蛋白酶消化並重新懸浮於1%的血清(105
cells/ml)中。每一個基質膠預塗覆孔接種1.5x104
個細胞及各種濃度的具有/不具有AT-Fc或AT-Fc-VT的200 ng/ml Ang2。在37°C中培養18小時後,從每個孔取3個非重疊影像重複三次(9個影像/樣品)來記錄管形成。利用ImagePro軟體(Media Cybernetics Inc.)來計算管長。
如圖11所示,AT-Fc-VT對管形成的50%抑制活性(IC50
)為2.45 nM,小於本實施例中AT-Fc的抑制活性(3.68 nM)。
實施例
5
:雙功能融合蛋白
AT-Fc-VT
顯著地抑制
VEGF-
誘導的內皮細胞遷移
利用HUVEC在轉孔平盤(transwell plate;8-μm孔徑,Costar)上來評估雙功能蛋白AT-Fc-VT對VEGF-誘導趨化性的抑制功效。將具有M199無血清培養基的HUVEC細胞(1x105
)置於上孔。將配體人類VEGF(0.2 μg/ml)與Eylea(2 μg/ml)或AT-Fc-VT(2 μg/ml)在10% FBS M199培養基中混合,並置於下孔。將轉孔平盤在5%培養箱中培養24小時,以容許上孔的細胞轉移至底部腔室。接著固定膜嵌入皿並以1%結晶紫染色。透過顯微鏡觀察黏附到膜嵌入皿下表面的細胞,並利用ImageJ軟體從一式三份嵌入皿上的五個代表性區域來計算平均遷移細胞數。
吾人檢驗了AT-Fc-VT蛋白對於內皮細胞對VEGF刺激的生理反應的影響。將HUVEC細胞加入上部腔室,並分別暴露於具有載體的VEGF、具有Eylea的VEGF、具有AT-Fc-VT的VEGF。24小時後,對遷移到膜的下部腔室細胞進行計數。VEGF顯著地增加HUVEC細胞的遷移。然而,血管新生阻斷劑AT-Fc-VT顯著地抑制VEGF誘導的遷移(圖12)。
實施例
6
:雙功能融合蛋白
AT-Fc-VT
抑制
VEGF-
誘導的
HUVEC
細胞管形成
為了研究雙功能血管新生阻斷劑AT-Fc-VT在血管新生的功能,在人類臍靜脈內皮細胞中進行體外基質膠管形成分析。將HUVEC細胞在不含血清的基礎培養基中培養 2小時,接著以細胞分離試劑(accutase)進行胰蛋白酶消化。在37°C中,將4x103
個HUVEC細胞接種4.5小時到含有包含AT-Fc-VT(100 μg/ml)或Eylea(100 μg/ml)的VEGF (1 μg/ml) 的基質膠預塗覆孔。藉由Image J血管新生系統(5個影像/樣品)對內皮網絡形成定量。
在VEGF處理下,當HUVEC細胞培養在基質膠中4.5小時,其會展示原代血管網絡。然而,雙功能蛋白AT-Fc-VT顯著地干擾管狀結構的形成(圖13)。
實施例
7
:雙功能蛋白
Tc350-253
抑制
ANG2-
誘導的
HUVEC
細胞管形成
將HUVEC細胞在不含血清的基礎培養基中培養 2小時。在37°C中,將4x103
個HUVEC細胞接種到含有包含Tc350-253(50 μg/ml)或Tc293-240(50 μg/ml)的ANG2(0.5 μg/ml)的基質膠預塗覆孔4.5小時。藉由Image J血管新生系統(5個影像/樣品)對內皮網絡形成定量。
較高濃度的ANG2與人類濕性老年性黃斑部退化(AMD)及癌症進展(包括血管新生、轉移及發炎)中的疾病嚴重程度相關。吾人生產一創新設計,以共同靶向VEGF及Ang2。為了解決雙功能蛋白在血管新生的功能而進行體外基質膠管形成分析。結果表明了雙功能蛋白Tc350-253或Tc293-240抑制ANG2-誘導的HUVEC細胞管在體外形成(圖14)。
實施例
8
:雙功能蛋白
AT-Fc-VT
及
Tc350-253
抑制
VEGF-
誘導的
HUVEC
細胞侵入
根據製造商的說明,藉由基質膠基底膜基質(Matrigel Basement Membrane Matrix;BD Biosciences,San Diego,CA,USA)預塗覆轉孔嵌入皿來進行侵入分析。將具有Medium-199的HUVEC細胞(2x105
)置於上孔。將配體人類VEGF(0.2 μg/ml)分別與下部腔室的Eylea(2 μg/ml)、AT-Fc-VT(2 μg/ml)或Tc350-253(2 μg/ml)混合。將轉孔平盤在5%培養箱中培養24小時,以容許上孔的細胞轉移至底部腔室。接著固定膜嵌入皿並以1%結晶紫染色。透過顯微鏡觀察黏附到膜嵌入皿下表面的細胞,並利用ImageJ軟體計算平均遷移細胞數。
利用博登細胞移形器(boyden chamber)侵入分析,AT-Fc-VT及Tc350-253的雙功能蛋白用以決定抗-VEGF活性。與遷移研究結果類似,血管新生阻斷劑AT-Fc-VT及Tc350-253抑制由VEGF誘導的侵入能力(圖15)。
實施例
9
:雙功能蛋白
Tc350-253
抑制
VEGF/ANG2-
誘導的
HUVEC
細胞管形成
將HUVEC細胞在不含血清的基礎培養基中培養2小時,接著以細胞分離試劑進行胰蛋白酶消化。在37°C中,將4x103
個HUVEC細胞分別接種4.5小時到含有包含Eylea(50 μg/ml)、Tc350-253(50 μg/ml)或其他抗-Ang2抗體(50 μg/ml)的VEGF(0.5 μg/ml)/ANG2(0.5 μg/ml)的基質膠預塗覆孔。藉由Image J血管新生系統(5個影像/樣品)對內皮網絡形成定量。
為了研究雙靶向蛋白Tc350-253在血管新生的功能,在人類臍靜脈內皮細胞中進行體外基質膠管形成分析。雙功能血管新生阻斷劑Tc350-253顯著地干擾管狀結構的形成(圖16)。在此分析中,雙功能蛋白Tc350-253的生物活性較Eylea或抗-Ang2抗體(Nesvacumab及Tc252-253)佳。
實施例
10
:雙功能蛋白
AT-Fc-VT
及
Tc350-253
抑制雷射誘導的脈絡膜新生血管(
CNV
)小鼠模型中的新生血管
雷射誘導CNV用於濕性AMD的動物模型,以評估血管新生阻斷劑的活性。以鹽酸***麻醉小鼠(100 mg/kg 體重)以及以1%托平卡胺(tropicamide)擴張瞳孔後,在每一個視網膜以532 nm二極體雷射光凝產生3處灼傷。在視網膜後極的9、12及3點鐘位置產生灼傷。雷射時氣泡產生(表明布魯赫氏膜(Bruch’s membrane)破裂)是獲得CNV的重要因素。
在雷射誘導的CNV模型中,第1天(n=5/組)會在雄性C57BL/6小鼠的右眼玻璃體內注射載體對照組Eylea(40 μg)、AT-Fc-VT (40 μg)或Tc350-253(40 μg)。在第0、7、14及21天,藉由螢光素血管造影及光學同調斷層攝影檢驗視網膜血管新生。對於螢光素血管造影,靜脈注射10%的螢光素鈉,且立即捕捉連續影像(每10秒一次,持續10分鐘)。注射的螢光素鈉在24小時後完全排出體外。利用Micron III視網膜成像顯微鏡(Phoenix Research Laboratories,San Ramon,CA,USA)捕捉影像,以決定CNV形成的程度。對於OCT分析,以公式V= 4 /3πabc計算橢球體積,其中a(寬度)、b(深度)及c(長度)是橢球的水平面或垂直面的半徑。
VEGF及ANG-2顯示與病理性血管及血管通透性密切相關,其為眼部新生血管疾病的特點。吾人藉由雷射誘導的脈絡膜新生血管小鼠模型來測試雙功能蛋白AT-Fc-VT或Tc350-253對血管新生的影響。利用基底螢光素血管造影(FFA)分析,其顯示雙功能蛋白AT-Fc-VT及Tc350-253在此模型中顯著地抑制新生血管(圖17)。藉由光學同調斷層攝影(OCT)對作為橢球的雷射-CNV損傷定量,也顯示了在雙功能蛋白AT-Fc-VT或Tc350-253處理後,損傷體積顯著減小(圖17)。
雖然已經以較佳具體實施例揭示本發明,然而其並不意欲限制本發明。在不脫離本發明精神及範圍情況下,可允許任何所屬技術領域中具有通常知識者對本發明進行修改與潤飾。因此,本發明的保護範圍應以後附申請專利範圍所界定者為準。
無
當結合附圖閱讀時,將更好地理解前述發明內容及下述本發明的實施方式。出於說明本發明的目的,圖式顯示了目前較佳的具體實施例。
在圖式中:
圖1A及圖1B分別顯示了AT-Fc及Fc-VT蛋白的結構圖,其中AT-Fc蛋白包含具有Tie2 ECD胺基酸23-448殘基的合成核苷酸序列,其含有與IgG Fc的N端融合以構築AT-Fc蛋白的表現載體的三個Ig樣結構域及三個EGF樣重複;且VT-Fc 蛋白包含由VEGFR1 ECD D2及VEGFR2 ECD D3所組成的嵌合VEGF結合模體,其經合成並與IgG FC
的C端融合,其之間有GS連接子以產生Fc-VT蛋白的表現載體。
圖2A及圖2B分別顯示了AT-Fc蛋白及Fc-VT蛋白的PAGE分析,其中AT-Fc及Fc-VT表現載體分別用於轉染HEK293細胞,其經表現,接著利用蛋白G層析自細胞培養上清液純化。在還原或非還原的條件下對純化的蛋白(3 μg/lane)進行凝膠分析。圖2A及圖2B顯示了AT-Fc及Fc-VT蛋白的結果,其適當地經二聚化並分別具有160 kD及130 kD的分子量,且藉由單步蛋白G層析獲得高於90%的純度,以純化兩種融合蛋白。Lane 1:非還原;Lane 2:還原。
圖3顯示了提供改善抗血管新生活性的AT-Fc-VT及Tc350-253雙功能融合蛋白的結構圖。
圖4顯示了純化的AT-Fc-VT雙功能融合蛋白,其中AT-Fc-VT表現載體用以轉染HEK293細胞。利用蛋白G層析由細胞培養上清液純化經表現的可溶AT-Fc-VT融合蛋白。接著,在凝膠分析之前還原或非還原純化的蛋白質(3 μg/lane)。結果表明了融合蛋白經適當地二聚化並具有約250 kD的分子量,且藉由單步蛋白G層析可獲得高於90%的純度。Lane 1:非還原;Lane 2:還原。
圖5顯示了純化的Tc350-253雙功能融合蛋白。Tc350-253蛋白由HEK293細胞瞬時表現,並透過鎳親和力層析自轉染的細胞培養上清液純化。在還原或非還原的條件下對純化的蛋白(5 μg/lane)進行凝膠分析。Tc350-253雙功能蛋白以約75 kD的分子量經適當地表現,並獲得高於90%的純度。NR:非還原;R:還原。
圖6顯示了直接ELISA分析中AT-Fc蛋白對ANG1及ANG2的結合活性。首先,將配體預塗覆孔與各種濃度的純化AT-Fc蛋白培養。接著,以HRP共軛山羊抗-人類IgG Fc特異性抗體檢測結合蛋白並繪製OD450
讀數;結果表明了AT-Fc與ANG1及ANG2結合,EC50
分別為4.26 nM及2.01 nM。
圖7顯示了Fc-VT蛋白對VEGF-A的結合活性。首先,將VEGF-A預塗覆孔與各種濃度的純化Fc-VT蛋白培養。以HRP共軛山羊抗-人類IgG Fc特異性抗體檢測洗滌後的結合蛋白並繪製OD450
讀數;結果表明了Fc-VT與VEGF-A 結合,EC50
為0.33 nM。
圖8及9分別顯示了純化的AT-Fc-VT融合蛋白對ANG2及VEGF-A的直接配體結合活性。首先,將配體預塗覆孔與各種濃度的純化AT-Fc-VT蛋白培養。接著,以HRP共軛山羊抗-人類IgG Fc特異性抗體檢測結合蛋白並繪製OD450
讀數。結果表明了AT-Fc-VT能與ANG2及VEGF-A結合,EC50
分別為2.57 nM及0.35 nM,這與AT-Fc(0.28 nM)或Fc-VT(0.46 nM)的結合活性相當。
圖10顯示了融合蛋白對VEGF-依賴性HUVEC細胞生長分析的抑制功效。使用人類臍靜脈內皮細胞,藉由融合蛋白、Fc-VT及AT-Fc-VT與VEGF的結合來證明VEGF-依賴性細胞生長抑制。在實驗中,將HUVEC維持在具有2% FBS的內皮細胞生長培養基(Lonza,Inc.)中。在37°C中,將96孔平底微量滴定盤的每一個孔塗覆膠原蛋白,接著與50μl 1 nM的VEGF-A(R&D systems,Inc.)及各種濃度的融合蛋白(Fc-VT或AT-Fc-VT)培養1小時,然後將50 μl(1x105
cells/ml)在Medium-199(10% FBS,Hyclone,Inc.)中的HUVEC加入。於37°C、5% CO2中培養72小時後,藉由加入10 μl的MTS檢測試劑(Promega Inc.)到每一個孔中來分析細胞增殖,接著測量在450/650 nm處的OD吸收。結果表明了,Fc-VT及AT-Fc-VT兩者對VEFG具有類似的抑制活性,其與Fc-VT相比(0.27 nM對0.20 nM)相當。在本研究中,還包括正控制組(VEGFR1 ECD D2及VEGFR2 ECD D3),其在C端與IgG1 Fc片段融合,並顯示IC50
為0.19 nM。
圖11顯示了可溶ANG2結合分析。純化的融合蛋白(AT-Fc及AT-Fc-VT)用以檢驗本分析中的ANG2結合活性。在4°C中,將100 μl的AT-Fc或AT-Fc-VT(1 μg/ml)融合蛋白塗覆在96孔ELISA盤(Nunc)上整夜。經塗覆的孔以1%BSA的PBS在室溫(RT)中阻隔1小時。將從100 nM開始的三倍連續稀釋的AT-Fc或AT-Fc-VT與等體積的500 pM重組ANG2(PeproTech)在室溫中培養2小時,接著轉移至塗覆有蛋白的96孔。培養後,將樣品轉移至各孔並在室溫中培養1小時。以洗滌緩衝液(Abcam)將盤洗滌三次,並與生物素化的抗-ANG2抗體(Abcam)在室溫中培養1小時。洗滌後,將盤與鏈黴親和素-HRP(Abcam)在室溫中培養45分鐘。最終洗滌後,加入四甲基聯苯胺(TMB),並利用讀盤器測量在450 nm處的吸收度。利用Prism(GraphPad)分析數據以計算抑制百分比。
圖12顯示了藉由雙功能融合蛋白抑制VEGF-誘導的內皮細胞遷移。
圖13顯示了藉由雙功能融合蛋白抑制VEGF-誘導的內皮細胞管形成。
圖14顯示了藉由雙功能蛋白Tc350-253抑制ANG2-誘導的內皮細胞管形成。
圖15顯示了藉由雙功能血管新生阻斷劑抑制VEGF-誘導的內皮細胞侵入。
圖16顯示了藉由雙功能蛋白Tc350-253抑制VEGF/ANG2-誘導的內皮細胞管形成。
圖17顯示了藉由雙功能蛋白抑制小鼠中雷射誘導的脈絡膜新生血管(CNV)。
Claims (26)
- 一種雙功能融合蛋白,其抑制血管生成素(ANG)-TIE信號傳遞路徑及血管內皮生長因子(VEGF)-血管內皮生長因子受體(VEGFR)信號傳遞路徑,其中該融合蛋白含有ANG抑制結構域及VEGF抑制結構域,從而藉由阻斷ANG、VEGF或其受體之間的相互作用以在抑制血管新生方面提供顯著改善的功效。
- 如請求項1之雙功能融合蛋白,其包含與連接子融合的(1)一或多個含有ANG結合模體的片段,及(2)一或多個含有VEGF結合模體的片段。
- 如請求項2之雙功能融合蛋白,其中該含有ANG結合模體的片段係片段抗原結合(Fab)片段,且該含有VEGF結合模體的片段係單鏈抗體(ScFv)。
- 如請求項3之雙功能融合蛋白,其中該Fab片段係抗-Ang2 Fab,且該ScFv係由Lucentis Vh及Vk所組成的融合片段。
- 如請求項4之雙功能融合蛋白,其具有SEQ ID NO: 13所示的胺基酸序列。
- 如請求項1之雙功能融合蛋白,其係同時靶向血管內皮生長因子(VEGF)及血管生成素(ANGs)的(AT)a-Fc-(VT)b,提供了顯著改善的抗血管新生功效,其中AT係一ANG結合模體,VT係一VEGF結合模體;Fc係一連接子;a及b的每一者係1至10的整數。
- 如請求項6之雙功能融合蛋白,其中該ANG結合模體係由Tie2 ECD胺基酸23-448殘基所組成的片段。
- 如請求項7之雙功能融合蛋白,其中該ANG Tie2 ECD胺基酸23-448殘基具有SEQ ID NO: 1所示的胺基酸序列。
- 如請求項6之雙功能融合蛋白,其中該VEGF結合模體係VEGFR1 ECD D2、VEGFR2 ECD D3或含有VEGFR1 ECD D2及VEGFR2 ECD D3的嵌合結構域。
- 如請求項9之雙功能融合蛋白,其中該VEGF結合模體係含有VEGFR1 ECD D2及VEGFR2 ECD D3的嵌合結構域。
- 如請求項10之雙功能融合蛋白,其中該含有VEGFR1 ECD D2及VEGFR2 ECD D3的嵌合結構域具有SEQ ID NO: 3所示的胺基酸序列。
- 如請求項6之雙功能融合蛋白,其中該連接子係一IgG1 Fc片段、一短彈性GS連接子或其組合。
- 如請求項12之雙功能融合蛋白,其中該IgG1 Fc片段具有SEQ ID NO: 2所示的胺基酸序列。
- 如請求項12之雙功能融合蛋白,其中該短彈性GS連接子具有SEQ ID NO: 4所示的胺基酸序列。
- 如請求項6之雙功能融合蛋白,其中AT係一含有Tie2 ECD胺基酸23-448殘基的AT片段,Fc係一IgG Fc片段,且VT係一含有含VEGFR1 D2及VEGFR2 D3的嵌合結構域的VT片段。
- 如請求項15之雙功能融合蛋白,其中該AT片段與該IgG Fc片段融合,接著在該AT-Fc片段的C端以一短彈性GS連接子與該VT連接。
- 如請求項6之雙功能融合蛋白,其中該連接子係一Fc片段,其係野生型的免疫球蛋白Fc區或人類免疫球蛋白同型、亞型或其同種異型的變體。
- 如請求項6之雙功能融合蛋白,其中該AT或VT片段的每一者係抗體,或者係體內半衰期長的抗體片段。
- 如請求項6之雙功能融合蛋白,其係具有SEQ ID NO: 12所示的胺基酸序列的AT-Fc-VT。
- 一種能夠與血管生成素結合的融合蛋白,其含有與IgG1 Fc片段融合的Tie2 ECD胺基酸23-448殘基。
- 如請求項20之融合蛋白,其具有SEQ ID NO: 10所示的胺基酸序列。
- 一種針對VEGF的融合蛋白,其包含在其C端與一IgG1 Fc片段融合的一含有VEGFR1 D2及VEGFR2 D3的嵌合模體。
- 如請求項22之針對VEGF的融合蛋白,其具有SEQ ID NO: 11所示的胺基酸序列。
- 一種醫藥組合物,其包含請求項1之雙功能融合蛋白及醫藥可上接受的載體。
- 如請求項24之醫藥組合物,其係用於防止或治療老年性黃斑部退化(AMD)症。
- 如請求項24之醫藥組合物,其係用於治療原發癌或轉移癌。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201862719377P | 2018-08-17 | 2018-08-17 | |
US62/719,377 | 2018-08-17 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW202021988A true TW202021988A (zh) | 2020-06-16 |
Family
ID=69523726
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW108129526A TW202021988A (zh) | 2018-08-17 | 2019-08-19 | 抗血管新生融合蛋白及其用途 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11518819B2 (zh) |
EP (1) | EP3836959A4 (zh) |
JP (1) | JP7249060B2 (zh) |
CN (1) | CN112912104A (zh) |
TW (1) | TW202021988A (zh) |
WO (1) | WO2020037309A1 (zh) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9840553B2 (en) | 2014-06-28 | 2017-12-12 | Kodiak Sciences Inc. | Dual PDGF/VEGF antagonists |
KR20180104635A (ko) | 2015-12-30 | 2018-09-21 | 코디악 사이언시스 인코포레이티드 | 항체 및 이의 접합체 |
CN114786731A (zh) | 2019-10-10 | 2022-07-22 | 科达制药股份有限公司 | 治疗眼部病症的方法 |
US20220389120A1 (en) * | 2021-06-03 | 2022-12-08 | Gensun Biopharma Inc. | Multispecific antagonists |
WO2023028004A1 (en) * | 2021-08-23 | 2023-03-02 | Avirmax, Inc. | Compositions and methods for transgene expression |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5595756A (en) * | 1993-12-22 | 1997-01-21 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents |
US20050239088A1 (en) * | 2003-05-16 | 2005-10-27 | Shepard H M | Intron fusion proteins, and methods of identifying and using same |
US10259860B2 (en) * | 2007-02-27 | 2019-04-16 | Aprogen Inc. | Fusion proteins binding to VEGF and angiopoietin |
US8268314B2 (en) * | 2008-10-08 | 2012-09-18 | Hoffmann-La Roche Inc. | Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies |
CA2857168C (en) * | 2011-12-01 | 2020-10-27 | Protevobio, Inc. | Protein inhibitors to complement and vegf pathways and methods of use thereof |
JP6154900B2 (ja) * | 2012-07-13 | 2017-06-28 | ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト | 二重特異性抗vegf/抗ang−2抗体及び眼血管疾患の処置におけるそれらの使用 |
CA2911087A1 (en) | 2013-04-30 | 2014-11-06 | Harish Shandilya | Novel cloning, expression & purification method for the preparation of ranibizumab |
KR102060187B1 (ko) * | 2013-07-19 | 2019-12-27 | 삼성전자주식회사 | Vegf-c, vegf-d 및/또는 안지오포이에틴-2를 동시에 저해하는 융합 폴리펩타이드 및 이의 용도 |
US20160144025A1 (en) * | 2014-11-25 | 2016-05-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and formulations for treating vascular eye diseases |
KR20170117107A (ko) * | 2015-03-11 | 2017-10-20 | 올제네시스 바이오테라퓨틱스 아이엔씨. | Vegf 및 pdgf의 리간드 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질 |
BR112017027567A2 (pt) | 2015-06-28 | 2018-09-04 | Allgenesis Biotherapeutics Inc. | proteínas de fusão para inibir a angiogênese |
US10894823B2 (en) * | 2016-03-24 | 2021-01-19 | Gensun Biopharma Inc. | Trispecific inhibitors for cancer treatment |
WO2017197199A1 (en) * | 2016-05-13 | 2017-11-16 | Askgene Pharma Inc. | Novel angiopoietin 2, vegf dual antagonists |
CN107602702A (zh) * | 2017-09-22 | 2018-01-19 | 生标(上海)医疗器械科技有限公司 | 一种同时靶向人p185和血管内皮生长因子的抗体及其应用 |
-
2019
- 2019-08-19 CN CN201980050190.9A patent/CN112912104A/zh active Pending
- 2019-08-19 EP EP19849871.9A patent/EP3836959A4/en active Pending
- 2019-08-19 TW TW108129526A patent/TW202021988A/zh unknown
- 2019-08-19 JP JP2021507950A patent/JP7249060B2/ja active Active
- 2019-08-19 US US16/544,648 patent/US11518819B2/en active Active
- 2019-08-19 WO PCT/US2019/046996 patent/WO2020037309A1/en unknown
-
2021
- 2021-12-14 US US17/550,694 patent/US20220169750A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2021534186A (ja) | 2021-12-09 |
EP3836959A1 (en) | 2021-06-23 |
US20220169750A1 (en) | 2022-06-02 |
WO2020037309A1 (en) | 2020-02-20 |
CN112912104A (zh) | 2021-06-04 |
US11518819B2 (en) | 2022-12-06 |
EP3836959A4 (en) | 2022-05-11 |
JP7249060B2 (ja) | 2023-03-30 |
US20200055958A1 (en) | 2020-02-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7249060B2 (ja) | 抗血管新生融合タンパク質およびその使用 | |
JP6910380B2 (ja) | 活性化可能な結合ポリペプチドおよびその同定方法ならびに使用 | |
US11746148B2 (en) | Antibody molecules comprising a single-domain antigen-binding site and Fab fragments | |
US20170348416A1 (en) | TfR SELECTIVE BINDING COMPOUNDS AND RELATED METHODS | |
JP7348249B2 (ja) | Vegf-grabタンパク質と薬物の結合体及びその用途 | |
WO2019062642A1 (zh) | 靶向pd-1或pd-l1且靶向vegf家族的双靶向融合蛋白及其用途 | |
US9856462B2 (en) | Method of treating eye disease using glycosylated VEGF decoy receptor fusion protein | |
CN102203258A (zh) | TGF-β拮抗剂多靶点结合蛋白 | |
CA2913126C (en) | Anti-vegf antibody and pharmaceutical composition for prevention, diagnosis or treatment of cancer or angiogenesis-related disease containing the same | |
JP2022523524A (ja) | Cd137およびgpc3に特異的な新規融合タンパク質 | |
WO2020143720A1 (zh) | 阻断血管内皮细胞生长且活化t细胞的多靶向融合蛋白和包含其的药物组合物 | |
JP2021511786A (ja) | 標的療法のためのチェックポイント遮断を組み合わせる二官能性タンパク質 | |
CN105263510A (zh) | 冠毛素调节剂 | |
EP2793927B1 (en) | Serum amyloid p-antibody fusion proteins | |
KR20190135478A (ko) | 항 gpr20 항체 | |
JP2021533203A (ja) | Cd137とpd−l1に特異的な新規融合タンパク質 | |
AU2021446021A1 (en) | Anti-bcam antibody or antigen-binding fragment thereof | |
Chakrabarti | Functionality determination and characterization of an angiogenesis-inhibiting fusion protein | |
WO2023137395A1 (en) | Vegf and tie2-binding fusion protein and uses thereof |