TW201942360A - 新穎啟動子及使用該啟動子製造l-胺基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係有關新穎啟動子及使用該啟動子製造L-胺基酸的方法,更具體地,有關具有啟動子活性的新穎多核苷酸、包含該多核苷酸的載體及棒狀桿菌屬微生物、使用該微生物製造L-胺基酸及醱酵組成物的方法以及醱酵組成物。
Description
本發明係有關新穎啟動子及使用該啟動子製造L-胺基酸的方法,更具體地,有關具有啟動子活性的新穎多核苷酸、包含該多核苷酸的載體及棒狀桿菌屬微生物、使用該微生物製造L-胺基酸及醱酵組成物的方法以及醱酵組成物。
L-胺基酸是蛋白質的基本構建塊,以及作為醫藥原料、食品添加劑、動物飼料、營養補充劑、農藥、殺菌劑等的重要材料。其中,L-麩胺酸是經由醱酵而產生的代表性胺基酸,具有獨特的風味(鮮味(umami taste)),因此是重要的胺基酸,廣泛應用於食品界以及醫藥領域及其他動物飼料領域。此外,甘胺酸因其甜味而主要用作食品工業中的增味劑,並與天然增味劑一起使用以加強風味。再者,甘胺酸也因其抗氧化活性、緩衝作用等,而在醫藥方面,使用於輸注液、制酸劑、多胺基酸製劑及營養補充劑。
典型的胺基酸製造方法包含使用短桿菌屬或棒狀桿菌屬微生物(Amino Acid Fermentation,Gakkai Shuppan Center:195-215,1986)或使用大腸桿菌或芽胞桿菌屬、鏈黴菌屬、青黴菌屬、克雷白氏菌屬、伊文氏桿菌屬、泛菌屬 (Pantoea)等微生物的醱酵方法(US Patent Nos.3,220,929及6,682,912)。此外,也用合成方法諸如一氯乙酸法、Strecker法等,經由工業方法而製造此種胺基酸。
此外,還進行各種有效製造胺基酸的研究;例如,致力於開發微生物或醱酵製程技術,以高效率製造胺基酸。特別是,開發針對目標材料的探討方法,諸如提高編碼棒狀桿菌屬菌株中胺基酸生合成相關酶之基因的表達,或刪除胺基酸生合成不需要的基因(Korean Patent Nos.10-0924065及1208480)。除這些方法之外,還使用去除不涉及胺基酸製造的基因的方法及去除那些製造胺基酸的功能尚不明確的基因的方法。然而,目前仍然越來越需要研究有效地製造高產量胺基酸的方法。
在此背景下,本發明者等人致力於開發能夠同時製造多種胺基酸的方法,因此,他們開發了具有本發明所述啟動子活性的新穎多核苷酸,並發現該新穎多核苷酸可在保持該菌株之麩胺酸產量的同時提高甘胺酸產量,從而完成本發明。
本發明的目的是提供具有啟動子活性的多核苷酸,其中,在SEQ ID NO:1的核苷酸序列中,第53個及第55個核苷酸經T取代;或第53個及第55個核苷酸經T取代及第60個核苷酸經G取代。
本發明的另一個目的是提供包括多核苷酸的載體;及編碼可操作地連接該多核苷酸之目標蛋白質的基因。
本發明的又另一個目的是提供包括多核苷酸的棒狀桿菌屬微生物;及編碼可操作地連接該多核苷酸之目標蛋白質的基因。
本發明的又另一個目的是提供製造目標物質的方法,包括:在培養基中培養棒狀桿菌屬微生物;從培養基中回收目標物質。
本發明的又另一個目的是提供製備醱酵組成物的方法,包括經由在培養基中培養棒狀桿菌屬微生物而進行醱酵。
本發明的又另一個目的是提供經由上述方法而製備的醱酵組成物。
在下文中,將詳細說明本發明。同時,本發明所揭露之各說明及具體例可應用於其他說明及具體例。即,本發明所揭露之各種元素之所有組合均在本發明的範圍內。此外,以下所揭露之特定說明不應解釋為限制本發明的範圍。
為達到上述目的,本發明的一方面提供具有啟動子活性的多核苷酸,其中,在SEQ ID NO:1的核苷酸序列中,第53個及第55個核苷酸經T取代;或第53個及第55個核苷酸經T取代及第60個核苷酸經G取代。
如本文所使用,術語"SEQ ID NO:2的核苷酸序列"可指磷酸核糖基-ATP焦磷酸酶(HisE)基因啟動子序列的一部分。
特別是,術語"磷酸核糖基-ATP焦磷酸酶"是指參與組胺酸合成路徑的酶,其中從5-磷酸核糖1-二磷酸鹽(5-phospho-alpha-D-ribose 1-diphosphate)合成L-組胺酸,在本發明中可互換稱為"HisE"。組胺酸合成路徑總共由9個步驟組成,分別參與9種酶(HisG-HisE-HisI-HisA-HisH-HisB-HisC-HisN-HisD),其中HisE參與ATP磷酸核糖基轉移酶(HisG)之後的第二步驟,係與第一步驟相關。
如本文所使用,術語"啟動子"是指編碼區上游的非轉譯核苷酸序列,該序列包含聚合酶結合域,並具有將啟動子的目標基因轉錄為mRNA的轉 錄起始活性,即,聚合酶結合的DNA結合域,以啟動基因的轉錄,並且可以位於mRNA轉錄起始區的5'-區。特別是,啟動子的目標基因可以是編碼磷酸核糖基-ATP焦磷酸酶的基因,但不限於此。
本發明中,具有啟動子活性的多核苷酸包含由SEQ ID NO:2或3所組成的多核苷酸序列,可與術語"多核苷酸"、"本發明核苷酸序列"、"本發明多核苷酸"、"hisEG啟動子"等互換。此外,這些術語可在本發明中使用。
本發明多核苷酸是其中SEQ ID NO:1的核苷酸序列,即,基因hisEG的啟動子序列,被修飾的多核苷酸,及具體地,這種修飾可以是其中在SEQ ID NO:1的核苷酸序列中,第53個及第55個核苷酸經T取代;或第53個及第55個核苷酸經T取代及第60個核苷酸經G取代的修飾。據此,該多核苷酸可以是由SEQ ID NO:2或3的核苷酸序列所組成的多核苷酸。
特別地,術語"修飾"是指基因上或非基因上穩定的表型變化,在本發明中可與術語"突變"互換地提及。
具體地,相對於不包含多核苷酸修飾的多核苷酸之活性,多核苷酸可具有經修飾(增加或減少)的啟動子活性。據此,可操作地連接多核苷酸的目標基因的表達及經由目標基因編碼的蛋白質的活性可加以調節(增加或減少),此外,可調節目標基因以外的其他基因的表達。
為了本發明的目的,多核苷酸可以是增強hisE基因表達的多核苷酸。此外,hisE及hisG基因係由操縱子所組成,因此,多核苷酸可進一步具有增強hisG基因表達的目的。
此外,多核苷酸可以是增加甘胺酸產量的多核苷酸。
特別是,術語"HisG"如本文所使用是指"ATP磷酸核糖基轉移酶",是參與組胺酸合成路徑的酶。組胺酸合成路徑總共包含9種酶,分別參與9種酶(HisG-HisE-HisI-HisA-HisH-HisB-HisC-HisN-HisD),其中HisG構成第一步驟。
據此,hisE及hisG基因係由操縱子所組成,因此本發明的多核苷酸可調控hisE基因以及hisG基因的轉錄。所以,目標基因可以是編碼磷酸核糖基-ATP焦磷酸酶(HisE)的基因,可以是編碼ATP磷酸核糖基轉移酶(HisG)的基因,或其組合。
已知HisE及HisG參與組胺酸的製造,但其與甘胺酸製造的關係尚未知,而由本發明者等人首次確認。特別是,本發明者等人首次確認,經由hisEG基因的啟動子之修飾而過度表達hisE及/或hisG,因而增加HisE及HisG酶的活性,並確認由於同樣的理由而增加及維持甘胺酸產量的作用。
本文中,術語"L-麩胺酸"或"L-麩胺酸鹽"是指一種歸類為非必需胺基酸的胺基酸。L-麩胺酸已知為中樞神經系統中最常見的興奮性神經傳導物質。此外,由於L-麩胺酸具有鮮味,麩胺酸鈉(MSG)也由此發展起來,而廣泛地使用作為增味劑。一般是通過生產麩胺酸的微生物醱酵而製造麩胺酸。
此外,術語"甘胺酸"是指一種具有無色結晶形式及甜味的胺基酸。甘胺酸主要作為食品的增味劑,在醫藥方面,則使用於輸注液、制酸劑、多胺基酸製劑及營養補充劑。一般,經由工業合成方法諸如一氯乙酸法、Strecker法等來製備甘胺酸。然而,由於在使用合成方法時產生D型及L型胺基酸的混合物,必須進行光學解析而不方便。因此,需要採用醱酵法製備甘胺酸,該方法具有多種優點,即,反應條件溫和、短時間內可大量製造、製程環保、所產生的物質可生物降解。
具體地,多核苷酸可以是由SEQ ID NO:2或3的核苷酸序列所組成的多核苷酸。
此外,本發明核苷酸序列可經由已知的突變方法修飾,諸如定向演化、定點突變等。
因此,所述多核苷酸可包括包含與核苷酸序列SEQIDNO:2或3具有至少60%同源性的核苷酸序列的多核苷酸,具體地至少70%,更具體的至少80%,甚至更具體地至少83%、84%、88%、90%、93%、95%或97%。明顯地,具有這種同源性的多核苷酸序列,其一部分被刪除、修飾、取代或添加,也在本發明的範圍內,只要所產生的多核苷酸序列具有與SEQIDNO:2或3核苷酸序列基本上等同或對應的生物活性。
如本文所使用,術語"同源性"可以指出與指定核苷酸序列的匹配程度,並且可以百分比(%)表示。在本發明中,將具有與指定核苷酸序列相同或相似活性的同源序列表示為"%同源性"。與核苷酸序列的同源性可以經由,例如,演算法BLAST(參見Karlin and Altschul,Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))或Fasta(參見Pearson,Methods Enzymol.,183,63,1990)來確定。以此演算法為基礎,已開發稱為BLASTN或BLASTX的程式(參見http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
如本文所使用,術語"嚴格條件"是指允許多核苷酸之間特定雜交的條件。例如,文獻(如,J.Sambrook et al)中具體說明這種嚴格條件。例如,嚴格條件可包含其中具有高同源性的基因(如,60%或更多,具體地90%或更多,更具體地95%或更多,甚至更具體地97%或更多,甚至更具體地99%或更多)可以相互雜交,而具有較低同源性的基因不能相互雜交的條件;或常規Southern雜 交的條件(即,在鹽濃度及溫度分別為60℃、1×SSC、0.1%SDS,具體地60℃、0.1×SSC、0.1%SDS,及更具體地68℃、0.1×SSC、0.1%SDS下洗滌1次,及具體地洗滌2或3次的條件)。雜交要求兩個核苷酸具有互補序列,但鹼基間的誤配可能取決於雜交的嚴格程度。術語"互補"用來說明能夠相互雜交的核苷酸鹼基間的關係。例如,就DNA而言,腺苷與胸腺嘧啶互補,及胞嘧啶與鳥嘌呤互補。因此,本發明還可包含基本上相似的核苷酸序列以及與整個序列互補的分離的多核苷酸片段。
具體地,可以使用雜交條件檢測具有同源性的多核苷酸,包含Tm值為55℃並使用上述條件的雜交步驟。此外,Tm值可以是60℃、63℃或65℃,但不限於此。所屬領域的普通熟練技術人員可以根據其目的而適當地調整Tm值。多核苷酸雜交的適當嚴格程度取決於多核苷酸的長度及互補程度,而這些變數在所屬領域是眾所周知的(參見Sambrook et al.,supra,9.50-9.51,11.7-11.8)。
特別是,"由SEQ ID NO:2或3的核苷酸序列所組成"係意指,如同使用限制酶時,不排除核苷酸的添加、刪除及/或突變,這可能發生在將多核苷酸連接到目標基因並用作為啟動子之連接目標基因的過程期間。
例如,可以不受限制地包含由SEQID NO:2或3的核苷酸序列所組成的具有啟動子活性的多核苷酸,只要該多核苷酸包含核苷酸序列,而該核苷酸序列具有本發明的啟動子活性,並且在嚴格條件下與SEQID NO:2或3的全部或部分核苷酸序列互補的序列雜交。
再者,可將本發明多核苷酸可操作地連接編碼目標蛋白質的基因。
如本文所使用,術語"基因表達調控序列"是指包含本發明多核苷酸並且能夠表達可操作地連接多核苷酸的目標基因的序列。
所屬領域的普通熟練技術人員可經由修飾包含啟動子的基因調控序列來嘗試增強目標基因的表達,例如,經由修飾起始密碼子來增強基因表達。在具體例中,該修飾可以是將起始密碼子從‘GTG’取代為‘ATG’。
如本文所使用,術語"可操作地連接"是指本發明具有啟動子活性的多核苷酸在功能上與基因序列相連,以啟動及介導目標基因的轉錄。可使用所屬領域中已知的基因重組技術實現與基因序列的可操作連接,並且可使用所屬領域中已知的限制酶及連接酶進行位點特定性DNA裂解及連接,但不限於此。
再者,本發明的基因表達調控序列除執行基因轉錄之啟動子以外可進一步包含用於調控基因轉錄的任何操縱子序列,以及編碼合適的mRNA核糖體結合位點的序列、調控轉錄及轉譯終止的DNA等。
例如,除啟動子外,適合原核生物的調控序列可進一步包含核糖體結合位點,但不限於此。本發明之具有啟動子活性的多核苷酸可按所屬領域普通熟練技術人員的要求,如上述包含用於調控基因表達的序列。
在本發明中,目標基因是指編碼目標蛋白質的基因,其表達將在微生物中受到調控。
例如,該基因可能是參與胺基酸諸如麩胺酸、甘胺酸、組胺酸等的製造基因,但不限於此。具體地,該基因可以是編碼組胺酸生合成相關酶的基因,但不限於此。更具體地,該基因可以是編碼HisE及/或HisG的基因,但不限於此。例如,hisE基因及hisG基因可構成操縱子,及本發明的多核苷酸可增強hisE及/或hisG的轉錄活性。此外,hisE及hisG可以是內源基因或外源基因,及可包含調控其活性的突變。例如,HisG可包含組胺酸回饋抑制釋放突變。所 屬領域的普通熟練技術人員可通過已知的資料庫諸如美國國家衛生研究院(NIH)的GenBank,而輕易得到編碼HisE或HisG的基因序列。
為了本發明的目的,基因表達調控序列可增加編碼參與組胺酸合成酶的基因之表達,具體地可增加hisE基因及/或hisG基因的表達。
本發明的又另一方面提供載體,該載體包括多核苷酸;及編碼可操作地連接該多核苷酸基因表達調控序列之編碼目標蛋白質的基因,及包括編碼目標蛋白質的基因之載體。
多核苷酸如上文所述。
具體地,目標蛋白質可以是磷酸核糖基-ATP焦磷酸酶(HisE)、ATP磷酸核糖基轉移酶(HisG),或其組合。作為目標蛋白質,HisE及HisG可包含與其具有同源性的蛋白質,也可以是部分胺基酸經修飾的蛋白質。具體例中,ATP磷酸核糖基轉移酶(HisG)可以是其中SEQID NO:16的HisG胺基酸序列的第233個及第235個胺基酸分別經組胺酸(H)及麩醯胺酸(Q)取代者。
如本文所使用,術語"載體"是指具有能夠在適當的宿主中表達目標基因的遺傳物質的人工DNA分子,並指包含多核苷酸或適當的基因表達調控序列,及可操作地連接該調控序列之編碼目標蛋白質的基因核苷酸序列的DNA建構。
只要可以在宿主細胞中表達,本發明中使用的載體就不會特別受到限制,並且所屬領域中已知的任何載體都可用於轉形宿主細胞。常規載體的實例可包含天然或重組質體、黏接質體、病毒及噬菌體。
例如,可使用pWE15、M13、λLB、λBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A、Charon21A等作為噬菌體載體或黏接質體載體;及可使 用以pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等為基礎者作為質體載體。
此外,可通過載體在宿主細胞中***染色體而用本發明具有啟動子活性的多核苷酸置換染色體中的內源性啟動子。例如,可使用載體pECCG 117、pDZ、pACYC 177、pACYC184、pCL、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC、pCES208、pXMJ19等,但並不限於此。
此外,可經由所屬領域已知的任何方法將多核苷酸***染色體中,如,經由同源重組。
由於本發明的載體可以經由誘導同源重組而***到染色體中,因此可另外包含篩選標記,以確定將基因成功地***到染色體中。篩選標記用於篩選用載體轉形的細胞,換句話說,用以確定是否***多核苷酸。可使用提供可篩選的表現型諸如抗藥性、營養缺陷性、對毒性藥物的抗藥性或表面蛋白質表達的標記。在篩選劑處理的環境中,只有表達篩選標記的細胞才能存活,或者細胞顯現出不同的表型,從而可通過這種方法選擇成功轉形的細胞。
如本文所使用,術語"轉形"是指將包括多核苷酸或基因表達調控序列及編碼目標蛋白質的基因之載體導入宿主細胞,以便在宿主細胞中表達該基因。再者,只要目標基因能在宿主細胞中表達,轉形的多核苷酸及編碼目標蛋白質的轉形基因是位於宿主細胞的染色體上或染色體外並不重要,這兩種情況都包含在內。
轉形方法可包含將基因表達調控序列及編碼目標蛋白質的基因導入細胞的所有方法,並可取決於宿主細胞經由選擇在所屬領域中已知的合適標準技術來進行。例如,可從電穿孔、磷酸鈣(CaPO4)沉澱、氯化鈣(CaCl2)沉澱、 顯微注射、聚乙二醇(PEG)技術、DEAE-聚葡糖技術、陽離子脂質體技術及乙酸鋰-DMSO技術中選擇合適的標準技術,但不限於此。
本發明的又另一方面是提供包括多核苷酸的棒狀桿菌屬微生物;及可操作地連接多核苷酸之編碼目標蛋白質的基因。
多核苷酸及可操作地連接多核苷酸之編碼目標蛋白質的基因係如以上所述。
如本文所使用,術語"微生物"包含所有野生型微生物及天然或人工基改微生物,可以是由於***外源性基因或增強或減弱內源性基因的活性而具有特定的衰減或增強機制的微生物。
在本發明中,微生物可包含多核苷酸,具體地是多核苷酸及/或可操作地連接多核苷酸之編碼目標蛋白質的基因。或者,微生物可以包含多核苷酸或基因表達調控序列,及包含多核苷酸或基因表達調控序列及編碼目標蛋白質的基因之載體,但不限於此。此外,多核苷酸、編碼目標蛋白質的基因及載體也可以經由轉形而導入微生物體內,但不限於此。再者,只要該基因能在微生物中表達,多核苷酸及編碼目標蛋白質的基因是位在染色體上或染色體外並不重要。
為了本發明的目的,包含多核苷酸及編碼目標蛋白質的基因之微生物可以是其中麩胺酸產量維持及甘胺酸產量增加的微生物。
例如,微生物可以是其中HisE及/或HisG活性增強的微生物。
本發明中,只要是在微生物中導入具有啟動子活性的本發明多核苷酸而作用為啟動子之微生物即可不受限制地包含在內。
具體地,微生物可以是棒狀桿菌屬微生物;更具體地可以是麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)或黃色棒狀桿菌(Corynebacterium flavum);及最具體地可以是麩胺酸棒狀桿菌,但不限於此。
本發明的又另一個目的是提供製造目標物質的方法,包括:在培養基中培養棒狀桿菌屬微生物;並從培養基中回收目標物質。
多核苷酸及微生物如以上所述。
本發明中,目標物質可以是胺基酸。具體地,除非另有說明,該胺基酸可以是L-型胺基酸,及可以是選自由甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、甲硫胺酸、天門冬胺酸、天門冬醯胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、***酸、酪胺酸、色胺酸、脯胺酸及其組合所構成之群組,但不限於此。
更具體地,胺基酸可以是麩胺酸、甘胺酸或其組合,但不限於此。
如本文所使用,術語"培養"是指在人工控制的環境條件下培養微生物。本發明中,可經由所屬領域廣泛熟知的方法來實現使用帶有多核苷酸的微生物來製造目標物質的方法。具體地,可以批次製程或連續製程來進行培養,諸如饋料批式製程或重複式饋料批次製程,但不限於此。用於培養的培養基必須滿足所使用之特定菌株的要求。適合用於培養棒狀桿菌菌株的培養基是所屬領域已知者(如,Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology,Washington D.C.,USA,1981)。
可用於培養基的碳源可以是醣類及碳水化合物諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、澱粉及纖維素;油類及脂肪類諸如大豆油、葵花籽油、花 生油及椰子油;脂肪酸類諸如棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸;醇類諸如甘油及乙醇;及有機酸類諸如乙酸。這些材料可以單獨使用,也可以組合使用,但不限於此。
可使用之氮源的實例包含蛋白質腖、酵母抽出物、肉汁、麥芽抽出物、玉米浸液、大豆粉及尿素,或無機化合物諸如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨。這些氮源也可以單獨使用或組合使用,但不限於此。
可用於培養基的磷源可包含磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀或相應的含鈉鹽。此外,除上述材料外,培養基可含有對細胞生長必要的金屬鹽,還可補充生長所必需的材料,諸如胺基酸及維生素。此外,可使用適合培養基的前驅物。上述原料可以按批次或連續的方式充分投入培養物中。
微生物培養期間,可用適宜的鹼性化合物諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨水,或酸性化合物諸如磷酸或硫酸來調節培養物的pH值。可以用消泡劑諸如脂肪酸聚乙二醇酯來調節起泡。可經由導入氧氣或含氧氣體混合物(如,空氣)來維持培養物的有氧狀態。
培養溫度(培養基)一般可在20℃至45℃,具體地是25℃至40℃。可繼續培養直到獲得所需的目標物質產量,具體地是10小時至160小時。
可以經由所屬領域已知的常規分離方法從培養物(培養基)中回收目標物質。分離方法可使用諸如離心、過濾、層析、結晶等方法。例如,可以較低的速度離心培養基以去除生物量而得到上清液,再以離子交換層析分離該上清液,但不限於此。在替代方法中,可以進行從培養物(培養基)中分離及過濾細菌細胞的程序來回收目標物質,而無需額外的純化程序。在另一種替代方法中,可以回收目標物質,並且回收步驟可進一步包含純化程序。
本發明的又另一個目的是提供製備醱酵組成物的方法,包括在培養基中培養棒狀桿菌屬微生物而醱酵。
本發明的又另一個目的是提供經由上述方法而製備的醱酵組成物。
多核苷酸及微生物如以上所述,及在培養基中培養微生物的步驟也如以上所述。
如本文所使用,術語"醱酵組成物"是指經由在培養基中培養本發明微生物而得到的組成物。再者,醱酵組成物可包含培養微生物隨後經適當後處理而獲得的液體或粉末形式的組成物。特別是,適當的後處理程序可包含,例如,培養微生物的程序、去除細菌細胞的程序、濃縮程序、過濾程序及混合載體的程序,並且可進一步包含乾燥程序。在某些情況下,後處理程序可以不包含純化程序。經由培養本發明微生物而得到的醱酵組成物,其特徵是增加麩胺酸的產量,同時降低乳酸的產量,從而能提供最佳風味。
此外,"醱酵組成物"不排除含有液體或粉末形式的組成物的調味品(如,湯粉產品、點心調味品等)。再者,"醱酵組成物"不排除進一步包含經由非醱酵程序而獲得的物質或經由非天然程序而獲得的另一物質的情況,只要其中包含經由培養本發明微生物而獲得的組成物。
將本發明的新穎啟動子導入生產胺基酸的微生物中,以提高微生物中胺基酸的產量。特別是,在利用新穎啟動子製造胺基酸的情況下,可以用醱酵法製造一直用現有合成方法製備的甘胺酸,此外還可以同時製造麩胺酸及甘胺酸。因此,新穎啟動子可適用於胺基酸的製造。此外,本發明還可以經由調控醱酵產品中麩 胺酸及甘胺酸的含量來提高醱酵產品的風味及適口性,而用於製備醱酵液及將其應用在調味品中。
在下文中,將以附帶的示例性具體例詳細說明本發明。然而,本文中揭露的示例性具體例僅用於說明性目的,不應解釋為限制本發明的範圍。
實施例1:篩選甘胺酸產量增加的突變株
實施例1-1:經由UV照射而誘導隨機突變
為篩選具有提高之甘胺酸產率(即,醱酵之目標產物)的突變株而將野生型麩胺酸棒狀桿菌(ATCC13869)塗布在含洋菜的營養培養基上,在30℃下培養16小時。將數百個所得到的菌落在室溫下用UV照射,以誘導該菌株基因組的隨機突變。
實施例1-2:突變誘導菌株的醱酵產量及菌株篩選實驗
之後,進行已誘導隨機突變的突變菌株的醱酵效價(titer)實驗。
將各菌落在營養培養基中繼代培養,然後在醱酵培養基中培養5小時。之後,將25% tween 40按0.4%的濃度添加到各培養基中,然後再將各菌落培養32小時。
營養培養基:
葡萄糖1%、肉汁0.5%、多蛋白質腖1%、氯化納0.25%、酵母抽出物0.5%、洋菜2%、尿素0.2%、pH 7.2
醱酵培養基:
粗糖6%、碳酸鈣5%、硫酸銨2.25%、單磷酸鉀0.1%、硫酸鎂0.04%、硫酸鐵(10mg/L)、生物素(0.3mg/L)、硫胺素鹽酸鹽(0.2mg/L)
在上述條件下進行各菌落的培養,然後篩選出生產L-麩胺酸的突變株,其產量相當於或大於野生型麩胺酸棒狀桿菌(ATCC13869)的產量。此外,對所篩選的突變株,用YSI法測定L-麩胺酸的濃度,用HPLC測定甘胺酸的濃度。表1顯示所測得L-麩胺酸及甘胺酸的濃度。
根據表1,選出"ATCC13869-g3"、"ATCC13869-g6"、"ATCC13869-g10"、"ATCC13869-g10"及"ATCC13869-g20"作為相較於野生型菌株的產量,麩胺酸產量相等或較高及甘胺酸產量增加的菌株。
實施例2:透過基因序列確認突變
為了確認突變株的基因突變,對ATCC13869-g3、ATCC13869-g6、ATCC13869-g10及ATCC13869-g20菌株的基因進行測序,並與野生型菌株比較。
結果發現,ATCC13869-g3及ATCC13869-g10菌株在編碼磷酸核糖基-ATP焦磷酸酶(HisE)的基因啟動子區的特定位置上具有相同的突變。此外,除了該相同的突變外,發現ATCC13869-g20菌株在編碼ATCC13869-g3及ATCC13869-g10菌株HisE的基因啟動子區的特定位置上,還存在一個額外的突變。
具體地,確認菌株ATCC13869-g3及ATCC13869-g10存在突變,其中SEQ ID NO:1啟動子區的序列中第53個及第55個核苷酸A及G被T取代。確認ATCC13869-g20菌株存在突變,其中SEQ ID NO:1啟動子區的核苷酸序列中第53個核苷酸(即,A)被T取代,及第55個核苷酸(即,G)被T取代,及第60個核苷酸(即,T)被G取代。SEQ ID NO:1的啟動子區是常見包含於棒狀桿菌屬微生物的序列,更具體地,野生型麩胺酸棒狀桿菌(ATCC13032、ATCC13869及ATCC14067)。
因此,在實施例3及4中,試圖確認上述突變是否影響棒狀桿菌屬微生物中麩胺酸及甘胺酸的產量。
實施例3:製備導入突變的菌株並確認甘胺酸產量
實施例3-1:製備導入突變的菌株
嘗試製備導入實施例2中確認之突變的突變株。具體地,為了將突變導入野生型麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869(即,為了用T取代SEQID:1多核苷酸序列的第53個及第55個核苷酸;或用T取代SEQ ID NO:1多核苷酸序列的第53個及第55個核苷酸,用G取代SEQ ID NO:1多核苷酸序列的第60個核苷酸),而設計出含有目標突變的75-mer長度的反向寡核苷酸(SEQ ID NO:4或5)。
具體地,使用電脈衝法(Appl.Microbiol.Biotechnol.,1999,52:541-545),將SEQ ID NO:4或5的寡核苷酸(30μg)轉形入野生型麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869及ATCC13032中,然後於此添加複合液體培養基(1mL)。於30℃將所得物在160rpm振盪培養30分鐘。之後,將培養基在冰上培養10分鐘,於4℃在4000rpm離心10分鐘,然後去除上清液而得到微生物細胞。之後,於此添加10%甘油溶液(4℃)並混合,然後將所得物於4℃在4000rpm離心10分鐘。去除上清液然後洗滌微生物細胞。重複該步驟再清洗一次微生物細胞,於此添加10%甘油溶液(4℃及0.1mL),而製備接下來轉形用的菌株。之後,用上述電脈衝法對SEQ ID NO:4或5的寡核苷酸重複10次轉形程序,然後在複合平板培養基上塗布所得物而得到菌落(Nat.Protoc.,2014 Oct;9(10):2301-16)。
經由對所得菌落進行基因序列分析的結果,確認目標突變已導入到菌株中。此外,將該經導入突變的菌株命名為"ATCC13869::hisEG-pro-2mt"、"ATCC13869::hisEG-pro-3mt"及"ATCC13032::hisEG-pro-2mt"、"ATCC13032::hisEG-pro-3mt"。
實施例3-2:確認甘胺酸產量
以如實施例1-2中的相同方式培養實施例3-1中所製備的突變株ATCC13869::hisEG-pro-2mt、ATCC13869::hisEG-pro-3mt及ATCC13032::hisEG- pro-2mt、ATCC13032::hisEG-pro-3mt,及彼等之野生型麩胺酸棒狀桿菌菌株ATCC13869及ATCC13032。
培養完成後,測定各培養基中L-麩胺酸及甘胺酸的濃度。以下表2顯示L-麩胺酸及甘胺酸的測定濃度。
如表2所示,確認經導入突變的各麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869::hisEG-pro-2mt、ATCC13869::hisEG-pro-3mt及ATCC13032::hisEG-pro-2mt、ATCC13032::hisEG-pro-3mt所生產的L-麩胺酸濃度,與各野生型麩胺酸棒狀桿菌ATCC13869及ATCC13032生產的相似。
相反地,野生型麩胺酸棒狀桿菌菌株ATCC13869及ATCC13032分別生產122mg/L及73mg/L甘胺酸。然而,ATCC13869::hisEG-pro-2mt及ATCC13032::hisEG-pro-2mt菌株分別生產134mg/L及91mg/L甘胺酸。因此,確認突變株生產的甘胺酸濃度高於野生型菌株。此外,ATCC13869::hisEG-pro-3mt及ATCC13032::hisEG-pro-3mt菌株分別生產141mg/L甘胺酸及99mg/L甘 胺酸,顯示甘胺酸濃度高於ATCC13869::hisEG-pro-2mt及ATCC13032::hisEG-pro-2mt菌株所生產的甘胺酸濃度。
即,確認這些突變顯著提高甘胺酸的產量,同時保持微生物中L-麩胺酸產量而無顯著影響。
同時,ATCC13869::hisEG-pro-2mt及ATCC13869::hisEG-pro-3mt菌株於2018年2月28日及2019年3月14日在根據布達佩斯條約的國際寄存機構韓國微生物菌種中心(KCCM),以菌株名稱"CA02-9206"及"CA02-9215"寄存,並分配登錄號KCCM12226P及KCCM12457P。
實施例4:確認經導入突變的KFCC11074之麩胺酸及甘胺酸產量
實施例4-1:製備經導入突變的載體
為了確認突變在麩胺酸產量提高的菌株中是否表現出相同的效果,除了野生型菌株外,還嘗試將該突變導入到KFCC11074(Korean Patent No.10-0292299)菌株中,該菌株稱為麩胺酸生產菌株。
具體地,構建一個基因取代載體,以T取代菌株中所含有的SEQID:1多核苷酸序列的第53個及第55個核苷酸;用T取代SEQ ID NO:1多核苷酸序列的第53個及第55個核苷酸及用G取代SEQ ID NO:1多核苷酸序列的第60個核苷酸。使用ATCC13869基因組DNA作為模板,經由PCR而得到建構載體的基因片段。根據在美國國家衛生研究院的GenBank(NIH GenBank)註冊的麩胺酸棒狀桿菌(ATCC13869)基因及相鄰核苷酸序列的資訊,製備含有SEQ ID NOS:6、7、8、9、10及11的引子。
於95℃變性5分鐘後,在下列條件下進行共30循環的PCR:95℃變性30秒,55℃低溫黏合(annealing)30秒及72℃聚合1分鐘。之後,於72℃進行5分 鐘聚合反應。更具體地,得到使用SEQ ID NOS:6及7引子擴增的多核苷酸(500bp)及使用SEQ ID NOS:8及9引子擴增的多核苷酸(500bp)。將所得到的兩個DNA片段連接到載體pDZ(Korean Patent No.10-0924065及International Publication No.2008-033001)上,該載體係經由使用浸入酵素,用限制酶SalI進行酶切,從而製備包含hisE啟動子的單一基因取代載體,該載體命名為"pDZ-hisE-Pro-2mt"。此外,得到使用SEQ ID NOS:6及11引子擴增的多核苷酸(500bp),及使用SEQ ID NOS:10及9的引子擴增的多核苷酸(500bp)。將所得到的兩個DNA片段連接到載體pDZ(Korean Patent No.10-0924065及International Publication No.2008-033001)上,該載體係經由使用浸入酵素,用限制酶SalI進行酶切,從而製備包含hisE啟動子的單一基因取代載體,該載體命名為"pDZ-hisE-Pro-3mt"。下列表3顯示製備載體所使用的引子序列資料。
實施例4-2:製備經導入突變的KFCC11074及確認麩胺酸及甘胺酸產量
將實施例4-1中製備的用於基因取代的載體(即,pDZ-hisE-pro-2mt及pDZ-hisE-pro-3mt),經由電穿孔導入KFCC11074菌株中而製備"KFCC11074_Pro(2mt)_hisEG"及"KFCC11074_Pro(3mt)_hisEG",其為經導入突變的麩胺酸-及甘胺酸-生產菌株。
具體地,是通過轉形(Appl.Microbiol.Biotechnol.,1999,52:541-545)而製備的,在含有卡那黴素(kanamycin)(25mg/L)的洋菜營養培養基上,篩選其中載體經由同源序列重組而***染色體的菌株。將初篩選的菌株再次進行第二次交叉,並分別篩選出經導入兩個或三個目標突變的菌株。使用SEQ ID NOS:6及9的引子對進行PCR測序後,確認最終轉形菌株的突變(取代)。
之後,將所篩選的菌株KFCC11074_Pro(2mt)_hisEG及KFCC11074_Pro(3mt)_hisEG塗布在營養培養基上並於30℃培養16小時。將已在121℃下15分鐘加壓滅菌的醱酵培養基(25mL)分裝至振盪用三角瓶(250mL),然後接種在營養培養基中培養的菌株並培養48小時。培養條件設在200rpm、37℃及pH 8.0。營養培養基及醱酵培養基的成分如下。
營養培養基:
葡萄糖1%、肉汁0.5%、多蛋白質腖1%、氯化納0.25%、酵母抽出物0.5%、洋菜2%、尿素0.2%、pH 7.2
醱酵培養基:
粗糖6%、碳酸鈣5%、硫酸銨2.25%、單磷酸鉀0.1%、硫酸鎂0.04%、硫酸鐵(10mg/L)、生物素(0.3mg/L)、硫胺素鹽酸鹽(0.2mg/L)
培養完成後,使用HPLC測定L-麩胺酸及甘胺酸產量,以下表4顯示測定結果。
如表4所示,確認經導入突變的麩胺酸棒狀桿菌菌株KFCC11074_Pro(2mt)_hisEG及KFCC11074_Pro(3mt)_hisEG所生產的L-麩胺酸濃度,與未經突變的麩胺酸棒狀桿菌菌株KFCC11074所生產的L-麩胺酸濃度相似。
相反地,確認KFCC11074_Pro(2mt)_hisEG及KFCC11074_Pro(3mt)_hisEG菌株所生產的甘胺酸濃度相對於KFCC11074菌株所生產的甘胺酸濃度則分別增加33mg/L及42mg/L。
即,確認這些突變顯著提高甘胺酸的產量,同時保持微生物中L-麩胺酸產量而無顯著影響。
實施例5:製備經導入hisG回饋抑制釋放突變的菌株並確認麩胺酸及甘胺酸的生產力
實施例5-1:製備經導入hisG回饋抑制釋放突變的載體
由於經上述實施例1-1至4-2確認hisEG基因的啟動子突變提高菌株的甘胺酸生產力,為了最大限度地提高對甘胺酸生產力的效應,因此在菌株中導入組胺酸回饋抑制釋放突變。之後,確認甘胺酸的生產力。
同時,hisE及hisG基因由操縱子所組成,及這些基因參與組胺酸生合成路徑。特別是,由於HisG是經由產物組胺酸回饋抑制的,因此試圖確認當引入回饋抑制釋放突變以提高HisG活性時,菌株的甘胺酸生產力是否會增加。
具體地,有試圖將文獻中已知的G233H及T235Q突變體導入hisG基因(Schendzielorz et al.,2014)。為了分別用H及Q取代SEQ ID NO:16的hisG胺基酸序列的第233個及第235個胺基酸,而構建基因取代載體。使用ATCC13869基因組DNA作為模板,經由PCR而得到建構載體的基因片段。根據在美國國家衛生研究院的GenBank(NIH GenBank)註冊的麩胺酸棒狀桿菌(ATCC13869)基因及相鄰核苷酸序列的資訊,製備含有SEQ ID NOS:12、13、14及15多核苷酸的引子。
於95℃變性5分鐘後,在下列條件下進行共30循環的PCR:95℃變性30秒,55℃低溫黏合30秒及72℃聚合1分鐘。之後,於72℃進行5分鐘聚合反應。得到使用SEQ ID NOS:12及13引子擴增的多核苷酸(722bp)及使用SEQ ID NOS:14及15引子擴增的多核苷酸(798bp)。將所得到的兩個DNA片段連接到載體pDZ(Korean Patent No.10-0924065及International Publication No.2008-033001)上,該載體係經由使用浸入酵素,用限制酶SalI進行酶切,從而製備包含hisG(G233H/T235Q)突變體的多核苷酸的單一基因取代載體(1.5kbp),該載體命名為"pDZ-hisG(G233H/T235Q)"。下列表5顯示製備載體所使用之引子序列資料。
實施例5-2:製備並評估經導入HisG回饋抑制釋放突變的hisE啟動子-突變菌株
將上述實施例5-1所製備的基因取代載體"pDZ-hisG(G233H/T235Q)",導入KFC11074菌株中而製備具有HisG回饋抑制釋放的KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)菌株。此外,將該載體導入KFCC11074_Pro(2mt)_hisEG及KFCC11074_Pro(3mt)_hisEG中,而製備導入本發明突變的KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)_Pro(2mt)_hisEG及KFCC11074_hisG G(G233H/T235Q)_Pro(3mt)_hisEG菌株。
具體地,通過轉形而製備菌株(Appl.Microbiol.Biotechnol.,1999,52:541-545),在含有卡那黴素(25mg/L)的洋菜營養培養基上,篩選其中載體經由同源序列重組而***染色體的菌株。將初篩選的菌株再次進行第二次交叉,而篩選經導入目標G233H/T235Q突變的菌株。使用SEQ ID NOS:12及15的引子對進行PCR後,進行測序確認最終轉形菌株的突變(取代)。
之後,如實施例4-2中的相同方式培養所篩選的KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)及KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)_Pro(2mt)_hisEG菌株。培養 完成後,測定各培養基中L-麩胺酸及甘胺酸的濃度。以下表6顯示L-麩胺酸及甘胺酸的測定濃度。
如表6所示,確認經導入hisEG啟動子突變的麩胺酸棒狀桿菌KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)_Pro(2mt)_hisEG及KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)_Pro(3mt)_hisEG菌株所生產的L-麩胺酸濃度,與只經導入HisG回饋抑制釋放突變的麩胺酸棒狀桿菌KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)菌株所生產的L-麩胺酸濃度相似。
同時,確認KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)_Pro(2mt)_hisEG及KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)_Pro(3mt)_hisEG菌株所生產的甘胺酸濃度相對於KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)菌株所生產的甘胺酸濃度顯著地增加314.3mg/L。
即,確認這些突變顯著提高甘胺酸的生產力,同時保持微生物中L-麩胺酸生產力而無顯著影響。此外,展現這種結果乃經由hisE及hisG活性的提高。
實施例6:製備用於製備調味產品的醱酵組成物
如以上所述,已確認含有本發明核苷酸的菌株在不顯著影響L-麩胺酸的情況下顯示生產甘胺酸的能力增強。因此,嘗試用含有本發明之核苷酸的棒狀桿菌屬微生物來製備醱酵組成物。
例如,嘗試以基本上習知的調味材料麩胺酸作為活性成分來製備醱酵組成物,並控制醱酵菌株及醱酵程序,增加調味材料中其他副產物成分的比例,以提高濃郁風味的構成。
實施例6-1:使用5L醱酵槽製備醱酵組成物
具體地,用5L醱酵槽使用實施例5中的菌株而製備醱酵組成物。
用於製備所使用培養基的所有成分均是相當於食品級的成分。
製備初代種子培養基如下:葡萄糖(1%)、蛋白質腖(10g)、酵母抽出物(1%)、蛋白質腖(1%)、硫酸銨(0.1%)、NaCl(0.25%)、KH2PO4(0.15%)、K2HPO4(0.15%)、pH(8.0)
製備次代種子培養基如下:有機粗糖(4.6%,純度98.5%)、硫酸鎂(0.05%)、酵母抽出物(0.5%)、KH2PO4(0.2%)、硫酸鐵(0.002%)、生物素(1mg/L)、硫胺素HCl(2mg/L)、少量消泡劑、pH(7.2)
製備醱酵培養基如下:有機粗糖(4%,純度98.5%)、硫酸鎂(0.03%)、酵母抽出物(1%)、磷酸(0.22%)、KOH(0.4%)、生物素(0.2mg/L)、硫胺素HCl(0.6mg/L)、硫酸鎂(0.002%)、硫酸鐵(0.002%)、硫酸鋅(0.002%)、硫酸銅(0.006%)、少量消泡劑、pH(7.4)
將初代種子培養基(50mL)分配到各個500mL三角搖瓶中,在壓力下於121℃滅菌20分鐘。然後,接種各種子培養並在轉速200rpm振盪下,於30℃培養5至7小時。
在1.5L試驗醱酵槽中製備0.25L的次代種子培養基,在壓力下於121℃滅菌20分鐘,並冷卻。然後,於其中接種初代種子培養(50mL),並在轉速900rpm下,於31.5℃培養15小時。
在5L試驗醱酵槽中製備0.25L的醱酵培養基,在壓力下於121℃滅菌20分鐘,並冷卻。然後,於其中接種入次代種子培養(0.26L),並在轉速900rpm下,於30℃至34℃培養。
在上述條件下培養時,使用28%氨持續調節醱酵培養物的pH值,使其在麩胺酸棒狀桿菌的培養期間保持在7.0至7.4之間。當培養液中殘糖濃度為0.5%至1.5%時,繼續添加滅菌有機粗糖以持續培養,直至添加糖之總量達到醱酵液量的30%至34%。
結果,如以上表7所示,確認雖然兩菌株在麩胺酸產量上沒有顯著差異,但經導入突變的麩胺酸棒狀桿菌KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)_Pro(3mt)_hisEG菌株的醱酵液中所生產的甘胺酸含量顯著增加。
即使在使用3kL醱酵槽製備醱酵組成物的情況下,兩菌株間的麩胺酸產量也沒有顯著差異。然而,相較於KFCC11074菌株,經導入突變的麩胺酸棒狀桿菌KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)_Pro(3mt)_hisEG菌株,顯示明顯增加的甘胺酸產量(即,0.2g/L對3.2g/L),但是兩菌株間的麩胺酸產量差異不顯著(64.2g/L對73g/L)。
從以上所述,本發明有關領域的普通熟練技術人員將能夠理解本發明可以其他具體形式體現,而無需修改本發明的技術概念或基本特徵。在這方面,本文所揭露的示例性具體例僅用於說明性目的,不應解釋為限制本發明的範圍。相反地,本發明不僅涵蓋示例性具體例,而且還涵蓋可包含在所附申請專利範圍所定義的本發明的精神及範圍內的各種選擇、修改、等價形式及其他具體例。
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<213> 麩胺酸棒狀桿菌
Claims (14)
- 一種具有啟動子活性的多核苷酸,係在SEQ ID NO:1的核苷酸序列中,第53個及第55個核苷酸經T取代;或第53個及第55個核苷酸經T取代及第60個核苷酸經G取代。
- 如申請專利範圍第1項所述之多核苷酸,其中該多核苷酸係由SEQ ID NO:2或3的核苷酸序列所組成。
- 如申請專利範圍第1項或第2項所述之多核苷酸,其中該核苷酸可操作地連接編碼目標蛋白質的基因。
- 一種載體,包括申請專利範圍第1項或第2項所述之多核苷酸;及可操作地連接該多核苷酸之編碼目標蛋白質的基因。
- 如申請專利範圍第4項所述之載體,其中該目標蛋白質是磷酸核糖基-ATP焦磷酸酶(HisE)、ATP磷酸核糖基轉移酶(HisG),或其組合。
- 一種棒狀桿菌屬微生物,包括申請專利範圍第1項所述之多核苷酸;及可操作地連接該多核苷酸之編碼目標蛋白質的基因。
- 如申請專利範圍第6項所述之微生物,其中該多核苷酸係由SEQ ID NO:2或3的核苷酸序列所組成。
- 如申請專利範圍第7項所述之微生物,其中該目標蛋白質是磷酸核糖基-ATP焦磷酸酶(HisE)、ATP磷酸核糖基轉移酶(HisG),或其組合。
- 如申請專利範圍第8項所述之微生物,其中,在ATP磷酸核糖基轉移酶(HisG)中,SEQID NO:16的HisG胺基酸序列的第233個及第235個胺基酸分別經組胺酸(H)及麩醯胺酸(Q)取代。
- 如申請專利範圍第6項至第9項中任一項所述之微生物,其中該棒狀桿菌屬微生物為麩胺酸棒狀桿菌。
- 一種製造目標物質的方法,包括:在培養基中培養申請專利範圍第6項至第9項中任一項所述之棒狀桿菌屬微生物;及從培養基中回收目標物質。
- 如申請專利範圍第11項所述之方法,其中該目標物質為胺基酸。
- 一種製備醱酵組成物的方法,包括在培養基中培養申請專利範圍第6項至第9項中任一項所述之棒狀桿菌屬微生物並進行醱酵。
- 一種醱酵組成物,係經由申請專利範圍第13項所述之方法而製備者。
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