CN111655860B - 新型启动子及利用其生产l-氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及新型启动子和使用其生产L‑氨基酸的方法，且更具体地，涉及具有启动子活性的新型多核苷酸、包含其的载体和棒杆菌属的微生物、利用该微生物生产L‑氨基酸的方法、和生产发酵组合物的方法、以及该发酵组合物。

Description

新型启动子及利用其生产L-氨基酸的方法
技术领域
本公开涉及新型启动子和利用该启动子生产L-氨基酸的方法，且更具体地，涉及具有启动子活性的新型多核苷酸、包含该多核苷酸的载体和棒杆菌属(genusCorynebacterium)的微生物、利用该微生物生产L-氨基酸和发酵组合物的方法、以及发该酵组合物。
背景技术
L-氨基酸是蛋白质的基本结构单元，以及被用作如医药原料、食品添加剂、动物饲料、营养补充剂、农药、杀菌剂等的重要材料。其中，L-谷氨酸是通过发酵产生的代表性氨基酸，且具有特有的、独特的味道(鲜味(umami taste))，且因此是广泛应用于食品领域以及医药领域和其他动物饲料领域的重要氨基酸。进一步，甘氨酸由于其甜味，在食品工业中主要被用作增味剂，并与天然增味剂一起使用以增强味道。此外，甘氨酸还因其抗氧化活性、缓冲作用等而被应用，在医药方面，它被用于输液溶液、制酸剂、多氨基酸制剂、和营养补充剂中。
生产氨基酸的典型方法包括使用短杆菌属(genus Brevibacterium)或棒杆菌属的微生物(Amino Acid Fermentation,GakkaiShuppan Center:195-215,1986)或使用大肠杆菌(Escherichia coli)或芽孢杆菌属(genus Bacillus)、链霉菌属(genusStreptomyces)、青霉菌属(genus Penicillum)、克雷伯氏菌属(genus Klebsiella)、欧文氏菌属(genus Erwinia)、泛菌属(genus Pantoea)等的微生物(美国专利号3,220,929和6,682,912)的发酵方法。另外，这种氨基酸也通过使用如一氯乙酸法、Strecker法等合成工艺的工业方法生产。
另外，为了有效地生产氨基酸，已经进行了各种研究；例如，努力开发用于有效生产氨基酸的微生物或发酵工艺技术。具体地，已经开发了特异性用于目的物质的特异性接近方法(specific approaches)，如增强编码在棒杆菌属菌株中参与氨基酸生物合成的酶的基因的表达或缺失氨基酸生物合成所不必要的基因(韩国专利号10-0924065和1208480)。除了这些方法之外，还利用了移除不参与氨基酸生产的基因的方法和移除其生产氨基酸的具体功能未知的基因的方法。然而，对研究有效、高产率地生产氨基酸的方法的需求仍在增长。
发明内容
技术问题
本发明人致力于开发能够同时生产多种氨基酸的方法，且结果，他们开发了具有本公开的启动子活性的新型多核苷酸，并且发现新型多核苷酸能够提高甘氨酸生产能力，同时维持菌株的谷氨酸生产能力，从而完成了本公开。
技术方案
本公开的目的是提供具有启动子活性的多核苷酸，其中，在SEQ ID NO:1的核苷酸序列中，用T取代第53和55个核苷酸；或者用T取代第53和55个核苷酸，且用G取代第60个核苷酸。
本公开的另一个目的是提供载体，该载体包含多核苷酸；及编码可操作地连接到多核苷酸的目的蛋白的基因。
本公开的又一个目的是提供棒杆菌属的微生物，该棒杆菌属的微生物包含多核苷酸；及编码可操作地连接到多核苷酸的目的蛋白的基因。
本公开的又一个目的是提供生产目的物质的方法，其包括：在培养基中培养棒杆菌属的微生物；以及从培养基中回收目的物质。
本公开的又一个目的是提供制备发酵组合物的方法，其包括通过在培养基中培养棒杆菌属的微生物进行发酵。
本公开的又一个目的是提供通过上述方法制备的发酵组合物。
有益效果
本公开的新型启动子被引入到生产氨基酸的微生物中，以增加微生物中氨基酸的生产量。特别地，在通过利用新型启动子生产氨基酸的情况下，通过现有合成方法已经制备的甘氨酸可以通过发酵法生产，并且进一步可以同时生产谷氨酸和甘氨酸。因此，新型启动子对于氨基酸的生产可以是有用的。另外，本公开可通过调节发酵产物中谷氨酸和甘氨酸的量来改进发酵产物的味道和适口性，用于发酵液的制备及其在调味产品中的应用。
具体实施方式
下面，将详细描述本公开。同时，本公开中公开的每个描述和实施方式可应用于其它描述和实施方式。也就是说，本公开中公开的各种要素的所有组合都落入本公开的范围内。进一步，下面公开的具体描述不应被解释为限制本公开的范围。
为了实现上述目的，本公开的一方面提供了具有启动子活性的多核苷酸，其中，在SEQ ID NO:1的核苷酸序列中，用T取代第53和第55个核苷酸；或者用T取代第53和55个核苷酸，且用G取代第60个核苷酸。
如本文所用，术语“SEQ ID NO:1的核苷酸序列”可指磷酸核糖基-ATP焦磷酸酶(HisE)基因的启动子序列的一部分。
特别地，术语“磷酸核糖基-ATP焦磷酸酶”是指参与组氨酸合成途径的酶，其中L-组氨酸是由5-磷酸-α-D-核糖1-二磷酸(5-phospho-alpha-D-ribose 1-diphosphote)合成的，并且在本公开中可与“HisE”互换地命名。组氨酸合成途径由总共9个步骤组成，分别涉及9种酶(HisG-HisE-HisI-HisA-HisH-HisB-HisC-HisN-HisD)，其中HisE涉及ATP磷酸核糖基转移酶(HisG)(其涉及第一个步骤)之后的第二个步骤。
如本文所用，术语“启动子”是指编码区上游的非转译(non-translated)核苷酸序列，其包括聚合酶结合结构域并具有启动子的目的基因变为mRNA的转录起始活性，即，聚合酶结合到其上以启动基因转录的DNA结构域，并且可以位于mRNA转录起始区的5’区。特别地，启动子的目的基因可以是编码磷酸核糖基-ATP焦磷酸酶的基因，但不限于此。
在本公开中，包括由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3组成的多核苷酸序列的具有启动子活性的多核苷酸可与术语“多核苷酸”、“本公开的核苷酸序列”、“本公开的多核苷酸”、“hisEG启动子”等互换地命名。另外，这些术语可在本公开中使用。
本公开的多核苷酸是其中SEQ ID NO:1的核苷酸序列(即基因hisEG的启动子序列)被修饰的多核苷酸，具体地，这种修饰可以是其中在SEQ ID NO:1的核苷酸序列中，用T取代第53和55个核苷酸；或者用T取代第53和55个核苷酸，且用G取代第60个核苷酸的修饰。因此，多核苷酸可以是由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列组成的多核苷酸。
特别地，术语“修饰”是指遗传或非遗传稳定的表型变化，并且与本公开中的术语“突变”可互换地命名。
具体地，多核苷酸可以具有相对于多核苷酸(其不包括多核苷酸修饰)的活性被修饰(增加或减少)的启动子活性。因此，可以调节(增加或减少)与多核苷酸可操作地连接的目的基因的表达和由目的基因编码的蛋白质的活性，并且进一步，可以调节目的基因以外的基因的表达。
对于本公开的目的，多核苷酸可以是用于增强hisE基因表达的多核苷酸。另外，基因hisE和hisG由操纵子组成，且因此该多核苷酸可进一步具有增强基因hisG表达的目的。
另外，多核苷酸可以是用于增加甘氨酸的生产量的多核苷酸。
特别地，本文中使用的术语“HisG”是指“ATP磷酸核糖基转移酶”，并且是参与组氨酸合成途径的酶。组氨酸合成途径由总共九种酶组成(HisG-HisE-HisI-HisA-HisH-HisB-HisC-HisN-HisD)，其中HisG构成第一步。
因此，基因hisE和hisG由操纵子组成，且因此本公开的多核苷酸可以调节基因hisE以及基因hisG的转录。因此，目的基因可以是编码磷酸核糖基-ATP焦磷酸酶(HisE)的基因、编码ATP磷酸核糖基转移酶(HisG)的基因、或其组合。
已知HisE和HisG参与组氨酸的生成，但尚不知道其与甘氨酸的生成的关系，并且是由本发明人首次鉴定的。特别地，本发明人首次确认了由于通过hisEG基因的启动子的修饰而使HisE和/或HisG过表达，从而增加HisE和HisG酶的活性，以及由于其增加和维持甘氨酸生产量的效果。
本文，术语“L-谷氨酸”或“L-谷氨酸盐”是指一种氨基酸，并且被分类为非必需氨基酸。已知L-谷氨酸是中枢神经***中最常见的兴奋性神经递质。此外，由于L-谷氨酸具有鲜味，因此由其开发了谷氨酸一钠(MSG)，并被广泛用作增味剂。它一般通过生产谷氨酸的微生物的发酵产生。
此外，术语“甘氨酸”是指具有无色结晶形式和甜味的氨基酸。甘氨酸主要用作食品的增味剂，和在医药方面，其被用于输液溶液、制酸剂、多氨基酸制剂、营养补充剂。通常，甘氨酸通过诸如一氯乙酸法、Strecker法等工业合成方法制备。然而，由于在使用合成方法时产生D-型和L-型氨基酸的混合物，因此存在有必要进行光学拆分的不便。因此，要求通过发酵法制备甘氨酸，该方法具有多种优点，即反应条件温和、可在短时间内大量生产、工艺环境友好、且所产物质是可生物降解的。
具体地，多核苷酸可以是由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列组成的多核苷酸。
另外，本公开的核苷酸序列可以通过已知的诱变方法进行修饰，如定向进化、定点诱变等。
因此，多核苷酸可以包含包括与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有至少60％、具体地至少70％、更具体地至少80％、和甚至更具体地至少83％、84％、88％、90％、93％、95％或97％的同源性的核苷酸序列的多核苷酸。显然，只要所得多核苷酸序列具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列实质上等同或对应的生物活性，具有这种同源性的多核苷酸序列(其一部分被缺失、修饰、取代或添加)也在本公开的范围内。
如本文所用，术语“同源性”可以表明与给定核苷酸序列的匹配程度，并且可以表示为百分比(％)。在本公开中，具有与给定核苷酸序列相同或相似的活性的同源序列表示为“％同源性”。对核苷酸序列的同源性可以通过例如算法BLAST(参见Karlin和Altschul,Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))或FASTA(参见Pearson,Methods Enzymol.,183,63,1990)来确定。基于该算法，已经开发了称为BLASTN或BLASTX的程序(参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
如本文所用，术语“严格条件”是指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。例如，在文献(例如，J.Sambrook等人)中具体描述了这种严格的条件。例如，严格条件可以包括具有高同源性(例如，60％或更高、具体地90％或更高、更具体地95％或更高、甚至更具体地97％或更高、和甚至更具体地99％或更高)的基因能彼此杂交，而具有比其同源性低的基因不能彼此杂交的条件；或常规southern杂交的条件(即，对应于60℃、1×SSC、0.1％SDS，具体地在60℃、0.1×SSC、0.1％SDS；且更具体地在68℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度和温度下洗涤一次、和更具体地两次或三次的条件)。尽管根据杂交的严格程度，碱基之间的错配是可能的，但杂交要求两个核苷酸具有互补序列。术语“互补”用于描述能够相互杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，关于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开还可包括实质上相似的核苷酸序列以及与整个序列互补的分离的多核苷酸片段。
具体地，使用包括在55℃的Tm值下的杂交步骤的杂交条件并使用上述条件，可以检测具有同源性的多核苷酸。另外，Tm值可以为60℃、63℃或65℃，但不限于此。本领域普通技术人员可以根据其目的适当地调整Tm值。杂交多核苷酸的适当严格程度取决于多核苷酸的长度和互补程度，这些变量在本领域中是公知的(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51，11.7-11.8)。
特别地，“由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列组成”的表达是指，如当使用限制性内切酶时，不排除核苷酸的添加、缺失和/或突变(这些可能在多核苷酸被连接到目的基因并被用作启动子时在与目的基因连接的过程期间发生)。
例如，如果多核苷酸包括具有本公开的启动子活性并且在严格条件下与对于SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列的全部或部分的互补序列杂交的核苷酸序列，则可以不受限制地包括具有由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列组成的启动子活性的多核苷酸。
此外，本公开的多核苷酸可操作地连接到编码目的蛋白的基因。
如本文所用，术语“基因表达调节序列”是指包括本公开的多核苷酸并且能够表达可操作地连接到该多核苷酸的目的基因的序列。
本领域普通技术人员可以能够尝试通过修饰包括启动子的基因调节序列来增强目的基因的表达，例如，通过起始密码子的修饰来增强基因表达。在一个实施方式中，修饰可以是将起始密码子从“GTG”替换为“ATG”。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指具有启动子活性的本公开的多核苷酸在功能上连接到基因序列以启动和介导目的基因的转录。可以利用本领域已知的基因重组技术实现与基因序列的可操作连接，并且可以使用本领域已知的限制性内切酶和连接酶进行位点特异性DNA切割和连接，但这些不限于此。
此外，除了用于进行基因转录的启动子之外，本公开的基因表达调节序列可以进一步包括用于调节基因转录的任何操纵子序列、以及编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、用于调节转录和翻译终止的DNA等。
例如，适合于原核生物的调节序列除启动子外可进一步包括核糖体结合位点，但不限于此。如本领域普通技术人员所要求的，本公开的具有启动子活性的多核苷酸可以由如上所述的用于调节基因表达的序列组成。
在本公开中，目的基因是指编码目的蛋白(其表达在微生物中待被调节)的基因。
例如，基因可以是参与诸如谷氨酸、甘氨酸、组氨酸等氨基酸生产的基因，但不限于此。具体地，基因可以是编码组氨酸生物合成相关酶的基因，但不限于此。更具体地，基因可以是编码HisE和/或HisG的基因，但不限于此。例如，hisE基因和hisG基因可以构成操纵子，并且本公开的多核苷酸可以增强hisE和/或hisG的转录活性。另外，hisE和hisG可以是内源性基因或外源基因，并且可以包括用于调节它们的活性的突变。例如，HisG可以包括组氨酸反馈抑制解除突变。编码HisE或HisG的基因序列可由本领域普通技术人员通过已知数据库如美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)的GenBank容易地获得。
对于本公开的目的，基因表达调节序列可以增加编码参与组氨酸合成的酶的基因的表达，并且具体地可以增加hisE基因和/或hisG基因的表达。
本公开的又一方面提供了包含多核苷酸；和编码可操作地连接到该多核苷酸基因表达调节序列的目的蛋白的基因的载体、以及包含编码目的蛋白的基因的载体。
多核苷酸如上所述。
具体地，目的蛋白可以是磷酸核糖基-ATP焦磷酸酶(HisE)、ATP磷酸核糖基转移酶(HisG)或其组合。作为目的蛋白，HisE和HisG可以包括与其具有同源性的蛋白，并且可以是部分氨基酸被修饰的蛋白。在实施方式中，ATP磷酸核糖基转移酶(HisG)可以是其中SEQ IDNO:16的HisG氨基酸序列的第233和235位氨基酸分别被组氨酸(H)和谷氨酰胺(Q)取代的酶。
如本文所用，术语“载体”是指具有能够在合适宿主中表达目的基因的遗传物质的人工DNA分子，并且是指一种DNA构建体，该DNA构建体包括多核苷酸或合适的基因表达调节序列以及编码可操作地连接到调节序列的目的蛋白的基因的核苷酸序列。
只要载体可以在宿主细胞中表达，本公开中使用的载体没有特别的限制，并且本领域中已知的任何载体都可以用于转化宿主细胞。常规载体的实例可包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。
例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、λLB3、λBL4、λⅨII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A、Charon21A等；且作为质粒载体，可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的质粒载体。
此外，染色体中的内源性启动子可以经由载体被具有启动子活性的本公开的多核苷酸置换以用于在宿主细胞中***染色体。例如，可以使用载体pECCG117、pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC、pCES208、pXMJ19等，但不限于这些。
另外，将多核苷酸***到染色体中可以通过本领域已知的任何方法来完成，例如通过同源重组。
由于可以通过诱导同源重组将本公开的载体***到染色体中，因此可以额外包括选择标记以确认基因是否成功***到染色体中。选择标记用于筛选被载体转化的细胞，换句话说，用于确定是否***了多核苷酸。可以使用提供可选择表型(如抗药性、辅源营养、对毒剂的抗性、或表面蛋白的表达)的标记。在用选择剂处理的环境中，只有表达选择标记的细胞才能存活，或者细胞表现出不同的表型，因此可以通过这种方法选择成功转化的细胞。
如本文所用，术语“转化”是指将包含多核苷酸或基因表达调节序列及编码目的蛋白的基因的载体引入到宿主细胞中，以允许基因在宿主细胞中表达。此外，只要目的基因能够在宿主细胞中表达，编码目的基因的转化多核苷酸和转化基因是位于宿主细胞的染色体上还是染色体外并无所谓，且包括这两种情况。
转化方法可以包括将基因表达调节序列和编码目的蛋白的基因引入到细胞中的所有方法，并且可以根据宿主细胞通过选择本领域已知的合适的标准技术来进行。例如，合适的标准技术可选自电穿孔、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)技术、DEAE-葡聚糖技术、阳离子脂质体技术和乙酸锂-DMSO技术，但不限于此。
本公开的又一方面提供了棒杆菌属的微生物，其包含多核苷酸；和编码可操作地连接到多核苷酸的目的基因的基因。
多核苷酸和编码可操作地连接到多核苷酸的目的基因的基因如上所述。
如本文所用，术语“微生物”包括所有野生型微生物和自然或人工遗传修饰的微生物，并且它可以是由于外源基因的***或内源性基因活性的加强或减弱而具有特定的减弱或加强机制的微生物。
在本公开中，微生物可包括多核苷酸，具体地多核苷酸和/或编码可操作地连接到多核苷酸的目的基因的基因。可替代地，微生物可以包括多核苷酸或基因表达调节序列、和包含多核苷酸或基因表达调节序列及编码目的蛋白的基因的载体，但不限于此。另外，多核苷酸、编码目的蛋白的基因、和载体可以通过转化引入到微生物中，但不限于此。此外，只要基因能够在微生物中表达，多核苷酸和编码目的蛋白的基因位于染色体上还是染色体外都无所谓。
对于本公开的目的，包含多核苷酸和编码目的蛋白的基因的微生物可以是其中谷氨酸的生产量被维持并且甘氨酸的生产量被增加的微生物。
例如，微生物可以是其中HisE和/或HisG的活性增强的微生物。
在本公开中，只要微生物是引入具有启动子活性的本公开的多核苷酸以使其作为启动子起作用的微生物，其可不受限制地被包括在内。
具体地，微生物可以是棒杆菌属的微生物；更具体地，可以是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)或黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)；且最具体地，可以是谷氨酸棒杆菌，但不限于此。
本公开的又一方面提供了生产目的物质的方法，包括：在培养基中培养棒杆菌属的微生物；以及从培养基中回收目的物质。
多核苷酸和微生物如上所述。
在本公开中，目的物质可以是氨基酸。具体地，除非另有说明，氨基酸可以是L-型氨基酸，并且可以是选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸及其组合的氨基酸，但不限于此。
更具体地，氨基酸可以是谷氨酸、甘氨酸或其组合，但不限于此。
如本文所用，术语“培养”是指在人工控制的环境条件下培养微生物。在本公开中，利用具有多核苷酸的微生物生产目的物质的方法可以通过本领域中广泛已知的方法进行。具体地，培养可以在分批工艺中或连续工艺(如分批补料工艺或重复分批补料工艺)中进行，但不限于此。用于培养的培养基必须满足所使用的特定菌株的要求。适合用于培养棒杆菌菌株的培养基是本领域已知的(例如，Manual of Methods for General Bacteriologyby the American Society for Bacteriology,Washington D.C.,USA,1981)。
可用于培养基的碳源可以是糖和碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，如大豆油、葵花籽油、花生油、和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸、和亚油酸；醇，如甘油和乙醇；和有机酸，如乙酸。这些物质可以单独使用或组合使用，但不限于此。
可使用的氮源的实例包括蛋白胨、酵母提取物、肉汤(broth)、麦芽提取物、玉米浆、豆粕和尿素、或无机化合物(如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)。这些氮源也可以单独使用或组合使用，但不限于此。
可用于培养基中的磷源可包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、或相应的含钠盐。另外，培养基可以含有细胞生长所必要的金属盐，并且除了上述物质之外，还可以补充生长所必需的物质，如氨基酸和维生素。进一步，可以使用适合于培养基的前体。上述原料可以以分批或连续的方式充分地供给到培养物中。
在微生物培养期间，可通过适当的碱性化合物(如氢氧化钠、氢氧化钾或氨)，或酸性化合物(如磷酸或硫酸)来调节培养物的pH。起泡可以通过抗起泡剂(如脂肪酸聚乙二醇酯)来调节。可通过引入氧气或含氧气体混合物(例如，空气)来维持培养物的好氧条件。
培养物(培养基)的温度一般可以是20℃至45℃，具体地为25℃至40℃。可以继续培养直到获得目的物质的所需生产量，具体地为10小时至160小时。
从培养物(培养基)中回收目的物质可以通过本领域已知的常规分离方法进行。对于分离方法，可以使用诸如离心、过滤、层析、结晶等方法。例如，可以将通过在低速下离心培养基以除去生物质而获得的上清液通过离子交换层析分离，但不限于此。在可替代的方法中，可以通过进行从培养产物(培养基)中分离和过滤细菌细胞的工艺，而不需要附加的纯化工艺来回收目的物质。在另一可替代方法中，回收步骤可进一步包括纯化工艺。
本公开的又一方面提供了制备发酵组合物的方法，包括通过在培养基中培养棒杆菌属的微生物进行发酵。
本公开的又一方面提供了通过上述方法制备的发酵组合物。
多核苷酸和微生物如上所述，且在培养基中培养微生物的步骤也如上所述。
如本文所用，术语“发酵组合物”是指通过在培养基中培养本公开的微生物而获得的组合物。此外，发酵组合物可以包括在培养微生物之后进行合适的后处理之后获得的液体或粉末形式的组合物。特别地，合适的后处理工艺可以包括例如培养微生物的工艺、移除细菌细胞的工艺、浓缩工艺、过滤工艺和混合载体的工艺，并且可以进一步包括干燥工艺。在一些情况下，后处理工艺可不包括纯化工艺。通过培养本发明的微生物而获得的发酵组合物的特征在于，谷氨酸的生产量被增加，而乳酸的生产量被减少，从而使得其能够提供最佳味道。
另外，“发酵组合物”不排除含有液体或粉末形式的组合物的调味产品(例如，粉末汤产品、零食调味产品等)。此外，只要通过培养本公开的微生物获得的组合物被包含其中，“发酵组合物”不排除其中进一步包括通过非发酵工艺获得的物质或通过非自然工艺获得的其他物质的情况。
实施例
在下文，将结合所附示例性实施方式详细描述本公开。然而，本文公开的示例性实施方式仅用于说明性目的，而不应被解释为限制本公开的范围。
实施例1：用于提高甘氨酸生产能力的突变菌株的选择
实施例1-1：通过紫外线照射诱导随机突变的
为了选出具有提高甘氨酸(即发酵的目的产物)生产能力的突变菌株，将野生型谷氨酸棒杆菌(ATCC13869)平皿接种在含有琼脂的营养培养基上，在30℃下培养16小时。在室温下用UV照射数百个由此获得的菌落，以诱导菌株中基因组上的随机突变。
实施例1-2：突变诱导菌株的发酵效价实验及菌株的选择
此后，对已经诱导出随机突变的突变菌株进行了发酵效价实验。
每个菌落在营养培养基中继代培养，然后在发酵培养基中培养5小时。此后，向各培养基中加入25％吐温40，浓度为0.4％，然后各再次培养个菌落32小时。
营养培养基：
葡萄糖1％、肉汁0.5％、聚蛋白胨1％、氯化钠0.25％、酵母提取物0.5％、琼脂2％、尿素0.2％、pH7.2
发酵培养基：
原糖6％、碳酸钙5％、硫酸铵2.25％、一磷酸钾0.1％、硫酸镁0.04％、硫酸铁(10mg/L)、生物素(0.3mg/L)、盐酸硫胺素(0.2mg/L)
在上述条件下培养每个菌落，然后选择生产L-谷氨酸(其产量等于或大于野生型谷氨酸棒杆菌(ATCC13869)的产量)的突变菌株。另外，对于所选择的突变菌株，利用YSI测定L-谷氨酸的浓度，和利用HPLC测定甘氨酸的浓度。测得的L-谷氨酸和甘氨酸浓度如表1中所示。
[表1]
基于表1，选择“ATCC13869-g3”、“ATCC13869-g6”、“ATCC13869-g10”、“ATCC13869-g10”和“ATCC13869-g20”作为与野生型菌株中生产的量相比，谷氨酸的生产量相等或更多且甘氨酸的生产量增加的菌株。
实施例2：通过基因测序确认突变
为了确认突变菌株的基因突变，对菌株ATCC13869-g3、ATCC13869-g6、ATCC13869-g10和ATCC13869-g20中的基因进行了测序，并与野生型菌株的基因进行了比较。
结果，发现了菌株ATCC13869-g3和ATCC13869-g10在编码磷酸核糖基-ATP焦磷酸酶(HisE)的基因的启动子区中特定位置含有相同的突变。另外，发现ATCC13869-g20菌株在编码ATCC13869-g3和ATCC13869-g10菌株的HisE的基因的启动子区中特定位置上除了相同的突变之外还含有额外的突变。
具体地，确认菌株ATCC13869-g3和ATCC13869-g10含有突变，其中在SEQ ID NO:1的启动子区的序列中第53和55个核苷酸(A和G)，被T取代。确认ATCC13869-g20菌株含有突变，其中在SEQ ID NO:1的启动子区的核苷酸序列中，第53个核苷酸(即，A)被T取代，且第55个核苷酸(即，G)被T取代，且第60个核苷酸(即，T)被G取代。SEQ ID NO:1的启动子区是普遍包括在棒杆菌属的微生物中，更具体地，野生型谷氨酸棒杆菌(ATCC13032、ATCC13869、和ATCC14067)中的序列。
因此，在实施例3和实施例4中，尝试确认上述突变是否影响棒杆菌属的微生物中谷氨酸和甘氨酸的生产量。
实施例3：引入有突变的菌株的制备和甘氨酸生产量的确认
实施例3-1：引入有突变的菌株的制备
尝试制备引入有实施例2中确认的突变的突变菌株。具体地，为了将突变引入到野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13869(即，为了用T取代SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的第53和55个核苷酸；或者用T取代SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的第53和55个核苷酸，且用G取代SEQ IDNO:1的多核苷酸序列的第60个核苷酸)，将含有目的突变的反向寡核苷酸设计为75-mer长度(SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5)。
具体地，使用电脉冲法(Appl.Microbiol.Biotechnol.,1999,52:541-545)将SEQID NO:4或SEQ ID NO:5的寡核苷酸(30μg)转化到野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869和ATCC13032中，和然后向其中加入复合液体培养基(1mL)。然后将所得物在30℃下培养30分钟，同时以160rpm振荡。此后，将培养基在冰上温育10分钟，在4℃下以4000rpm离心10分钟，然后移除上清液以获得微生物细胞。此后，向其中加入10％甘油溶液(4℃)并混合，然后在4℃下以4000rpm离心10分钟。移除上清液，然后洗涤微生物细胞。再次重复一次上述步骤以再次洗涤微生物细胞，并向其中加入10％甘油溶液(4℃，0.1mL)，以为下一次转化准备菌株。此后，使用上述电脉冲法，用SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的寡核苷酸重复转化过程10次，然后将所得物平皿接种在复合平板培养基上以获得菌落(Nat.Protoc.,2014Oct；9(10):2301-16)。
对所获得的菌落进行基因序列分析的结果是，确认目的突变被引入到菌株中。另外，将引入突变的菌株命名为“ATCC13869::hisEG-pro-2mt”、“ATCC13869::hisEG-pro-3mt”以及“ATCC13032::hisEG-pro-2mt”、“ATCC13032::hisEG-pro-3mt”。
实施例3-2：甘氨酸生产量的确认
以与实施例1-2相同的方式培养实施例3-1中制备的突变菌株ATCC13869::hisEG-pro-2mt、ATCC13869::hisEG-pro-3mt以及ATCC13032::hisEG-pro-2mt、ATCC13032::hisEG-pro-3mt，以及它们的野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869和ATCC13032。
培养完成后，测定各培养基中L-谷氨酸和甘氨酸的浓度。测得的L-谷氨酸和甘氨酸浓度示于下表2中。
[表2]
如表2所示，确认引入突变的谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869::hisEG-pro-2mt、ATCC13869::hisEG-pro-3mt以及ATCC13032::hisEG-pro-2mt、ATCC13032::hisEG-pro-3mt各自产生的L-谷氨酸浓度与野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869和ATCC13032各自产生的L-谷氨酸浓度相似。
相反，野生型谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869和ATCC13032分别生产122mg/L和73mg/L的甘氨酸。然而，菌株ATCC13869::hisEG-pro-2mt和ATCC13032::hisEG-pro-2mt分别生产134mg/L和91mg/L的甘氨酸。因此，确认突变菌株中生产的甘氨酸浓度高于野生型菌株中生产的甘氨酸浓度。另外，菌株ATCC13869::hisEG-pro-3mt和ATCC13032::hisEG-pro-3mt分别生产141mg/L和99mg/L的甘氨酸，因此显示出比菌株ATCC13869::hisEG-pro-2mt和ATCC13032::hisEG-pro-2mt中生产的甘氨酸浓度更高的甘氨酸浓度。
即，确认突变显著提高了甘氨酸生产能力，同时维持了微生物中L-谷氨酸生产能力且对其没有显著影响。
同时，菌株ATCC13869::hisEG-pro-2mt和ATCC13869::hisEG-pro-3mt于2018年2月28日和2019年3月14日以菌株名称“CA02-9206”和“CA02-9215”保藏在根据布达佩斯条约下的国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM)，并被分配保藏号KCCM12226P和KCCM12457P。
实施例4:引入突变的KFCC11074的谷氨酸和甘氨酸的生产量的确认
实施例4-1:引入突变的载体的制备
为了确认除了野生型菌株之外，突变是否即使在谷氨酸生产能力提高的菌株中也显示出相同的效果，尝试将突变引入到已知为谷氨酸生产菌株的菌株KFCC11074(韩国专利号10-0292299)中。
具体地，构建用于基因取代的载体，以用T取代菌株中包含的SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的第53和55个核苷酸；以及用T取代SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的第53和55个核苷酸，且用G取代SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的第60个核苷酸。使用ATCC13869基因组DNA为模板，通过PCR获得用于构建载体的基因片段。基于在美国国立卫生研究院GenBank(NIHGenBank)登记的谷氨酸棒杆菌(ATCC13869)的基因和相邻核苷酸序列的信息，制备包括SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的多核苷酸的引物。
在95℃下变性5分钟后，在以下条件下进行PCR共30个循环：在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，和在72℃下聚合1分钟。然后，在72℃下进行聚合反应5分钟。更具体地，获得了利用SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的引物扩增的多核苷酸(500bp)和利用SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的引物扩增的多核苷酸(500bp)。将获得的两个DNA片段通过利用输注酶(infusion enzyme)连接到已用限制性内切酶SalI消化的载体pDZ(韩国专利号10-0924065和国际公开号2008-033001)上，从而制备包括hisE启动子的用于基因取代的单一载体，并且将载体命名为“pDZ-hisE-pro-2mt”。另外，获得了利用SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:11的引物扩增的多核苷酸(500bp)和利用SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:9的引物扩增的多核苷酸(500bp)。将获得的两个DNA片段通过利用输注酶连接到已用限制性内切酶SalI消化的载体pDZ(韩国专利号10-0924065和国际公开号2008-033001)上，从而制备包括hisE启动子的用于基因取代的单一载体，并且将载体命名为“pDZ-hisE-pro-3mt”。用于载体制备的引物序列的信息示于下表3中。
[表3]
SEQ ID NO 引物 序列(5′至3′)
4 hisE-pro-2mt-AF GATCCTCTAGAGTCGACTTCGACGAATCCCTCG
5 hisE-pro-2mt-AR CGGTACATTATACCACACAACAGTTATCAATG
6 hisE-pro-2mt-BF GTGGTATAATGTACCGAGTGAAGACATTTGAC
7 hisE-pro-2mt-BR ATGCCTGCAGGTCGACTGATACCCAAATCGAG
10 hisE-pro-3mt-AR CGGTCCATTATACCACACAACAGTTATCAATG
11 hisE-pro-3mt-BF GTGGTATAATGGACCGAGTGAAGACATTTGAC
实施例4-2：引入突变的KFCC11074的制备以及谷氨酸和甘氨酸的生产量的确认
通过电穿孔将实施例4-1中制备的用于基因取代的载体(即，pDZ-hisE-pro-2mt和pDZ-hisE-pro-3mt)引入到菌株KFCC11074中，以制备“KFCC11074_Pro(2mt)_hisEG”和“KFCC11074_Pro(3mt)_hisEG”，其是引入突变的谷氨酸和甘氨酸生产菌株。
具体地，通过转化制备(Appl.Microbiol.Biotechnol.,1999,52:541-545)，并且在含有卡那霉素(25mg/L)的琼脂营养培养基上选择其中通过同源序列重组将载体***染色体上的菌株。将选择的原代菌株再次进行二次交换(crossover)，并分别选择引入了两个或三个目的突变的菌株。利用SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:9的一对引物进行PCR后，通过测序确认最终转化菌株的突变(取代)。
此后，将选出的菌株KFCC11074_Pro(2mt)_hisEG和KFCC11074_Pro(3mt)_hisEG平皿接种于营养培养基上，并在30℃下培养16小时。将在121℃下加压灭菌15分钟的发酵培养基(25mL)分装到250mL锥形瓶(Erlenmeyer flask)中振荡，然后接种在营养培养基中培养的菌株，并培养48小时。培养条件设定为200rpm、37℃、和pH 8.0。营养培养基和发酵培养基的组成如下。
营养培养基：
葡萄糖1％、肉汁0.5％、聚蛋白胨1％、氯化钠0.25％、酵母提取物0.5％、琼脂2％、尿素0.2％、pH 7.2
发酵培养基：
原糖6％、碳酸钙5％、硫酸铵2.25％、一磷酸钾0.1％、硫酸镁0.04％、硫酸铁(10mg/L)、生物素(0.3mg/L)、盐酸硫胺素(0.2mg/L)
培养完成后，利用HPLC测定L-谷氨酸和甘氨酸的生成量，且测定结果示于下表4中。
[表4]
菌株 L-谷氨酸(g/L) L-甘氨酸(mg/L)
KFCC11074 11.8 170
KFCC11074_Pro(2mt)_hisEG 11.7 203
KFCC11074_Pro(3mt)_hisEG 12.0 212
如表4中所示，确认引入突变的谷氨酸棒杆菌菌株KFCC11074_Pro(2mt)_hisEG和KFCC11074_Pro(3mt)_hisEG生产的L-谷氨酸浓度与未引入突变的谷氨酸棒杆菌菌株KFCC11074生产的L-谷氨酸浓度相似。
另一方面，确认了菌株KFCC11074_Pro(2mt)_hisEG和KFCC11074_Pro(3mt)_hisEG生产的甘氨酸浓度相对于菌株KFCC11074生产的甘氨酸浓度分别增加了33mg/L和42mg/L。
即，确认突变显著提高了甘氨酸生产能力，同时维持了微生物中L-谷氨酸生产能力且对其没有显著影响。
实施例5：引入hisG反馈抑制解除突变的菌株的制备和谷氨酸和甘氨酸的量的确认
实施例5-1：引入hisG反馈抑制解除突变的载体的制备
由于通过上述实施例1-1至4-2确认了通过在基因hisEG的启动子中的突变提高了菌株的甘氨酸生产能力，因此为了最大化增加甘氨酸生产能力的效果，将组氨酸反馈抑制解除突变引入到菌株中。此后，确认了甘氨酸生产能力。
同时，hisE和hisG基因由操纵子组成，且这些基因参与组氨酸生物合成途径。特别地，由于HisG被产物组氨酸反馈抑制，因此尝试确认当引入反馈抑制解除突变以增加HisG的活性时，是否会增加菌株的甘氨酸生产能力。
具体地，尝试将文献(Schendzielorz等人,2014)中已知的G233H和T235Q突变体引入到基因hisG中。构建用于基因取代的载体，以分别用H和Q取代SEQ ID NO:16的hisG氨基酸序列的第233和235位氨基酸。使用ATCC13869基因组DNA作为模板，通过PCR获得用于构建载体的基因片段。基于在美国国立卫生研究院GenBank(NIH GenBank)登记的谷氨酸棒杆菌(ATCC13869)的基因和相邻核苷酸序列的信息，制备包括SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14和SEQ ID NO:15的多核苷酸的引物。
在95℃下变性5分钟后，在以下条件下进行PCR共30个循环：在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，和在72℃下聚合1分钟。此后，在72℃下进行聚合反应5分钟。获得了利用SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的引物扩增的多核苷酸(722bp)和利用SEQ ID NO:14和SEQID NO:15的引物扩增的多核苷酸(798bp)。将获得的两个DNA片段通过利用输注酶连接到已用限制性内切酶SalI消化的载体pDZ(韩国专利号10-0924065和国际公开号2008-033001)，从而制备包括含有hisG(G233H/T235Q)突变体的多核苷酸的用于基因取代的单个载体(1.5kbp)，并且将该载体命名为“pDZ-hisG(G233H/T235Q)”。用于载体制备的引物序列的信息示于下表5中。
[表5]
实施例5-2：引入了用于HisG反馈抑制解除的突变的hisE启动子突变菌株的制备和评价
将通过上述实施例5-1制备的用于基因取代的载体“pDZ-hisG(G233H/T235Q)”引入到菌株KFCC11074中，以制备HisG反馈抑制解除的菌株KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)。另外，将载体引入到菌株KFCC11074_Pro(2mt)_hisEG和KFCC11074_Pro(3mt)_hisEG中，以制备引入了本公开的突变的菌株KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)_Pro(2mt)_hisEG和KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)_Pro(3mt)_hisEG。
具体地，通过转化制备菌株(Appl.Microbiol.Biotechnol.,1999,52:541-545)，并且在含有卡那霉素(25mg/L)的琼脂营养培养基上，选择其中通过同源序列重组将载体***染色体上的菌株。将所选择的原代菌株再次进行二次交换，并选择引入目的G233H/T235Q突变的菌株。通过利用SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:15的一对引物进行PCR后，通过测序确认最终转化菌株的突变(取代)。
此后，以与实施例4-2相同的方式培养选择的菌株KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)和KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)_Pro(2mt)_hisEG。培养完成后，测定各培养基中L-谷氨酸和甘氨酸的浓度。测得的L-谷氨酸和甘氨酸浓度示于下表6中。
[表6]
如表6中所示，确认了通过引入hisEG启动子突变的谷氨酸棒杆菌菌株KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)_Pro(2mt)_hisEG和KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)_Pro(3mt)_hisEG生产的L-谷氨酸浓度与仅引入HisG反馈抑制解除突变的谷氨酸棒杆菌菌株KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)生产的L-谷氨酸浓度相似。
同时，确认了菌株KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)_Pro(2mt)_hisEG和KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)_Pro(3mt)_hisEG产生的甘氨酸浓度相对于菌株KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)生产的甘氨酸浓度显著增加了314.3mg/L。
即，确认了突变显著增加了甘氨酸生产能力，同时维持了微生物中L-谷氨酸生产能力且对其没有显著影响。此外，这种结果还表现在hisE和hisG的增加的活性。
实施例6：用于制备调味产品的发酵组合物的制备
如上所述，确认了含有本公开的核苷酸的菌株在对L-谷氨酸没有显著影响的情况下显示出增加的生产甘氨酸的能力。因此，尝试利用含有本申请的核苷酸的棒杆菌属的微生物制备发酵组合物。
例如，尝试使用基本上是公知的调味料的谷氨酸作为活性成分来制备发酵组合物，并且控制发酵菌株和发酵过程以为了增加浓郁味道的构成的目的，增加调味料的其他副产物成分的比例。
实施例6-1：利用5L发酵罐制备发酵组合物
具体地，对于实施例5中利用的菌株，利用5L发酵罐制备发酵组合物。
用于制备所用培养基的所有成分都是与食品级相对应的成分。
初级种子培养基的制备如下：
葡萄糖(1％)、蛋白胨(10g)、酵母提取物(1％)、蛋白胨(1％)、硫酸铵(0.1％)、NaCl(0.25％)、KH2PO4(0.15％)、K2HPO4(0.15％)、pH(8.0)
二级种子培养基的制备如下：
有机原糖(4.6％，纯度98.5％)、硫酸镁(0.05％)、酵母提取物(0.5％)、KH2PO4(0.2％)、硫酸铁(0.002％)、生物素(1mg/L)、盐酸硫胺素(2mg/L)、少量消泡剂、pH(7.2)
发酵培养基的制备如下：
有机原糖(4％，纯度98.5％)、硫酸镁(0.03％)、酵母提取物(1％)、磷酸(0.22％)、KOH(0.4％)、生物素(0.2mg/L)、盐酸硫胺素(0.6mg/L)、硫酸锰(0.002％)、硫酸铁(0.002％)、硫酸锌(0.002％)、硫酸铜(0.006％)、少量消泡剂、pH(7.4)
将初级种子培养基(50mL)分配到每个500mL锥形摇瓶中，在121℃下在压力下高压灭菌20分钟。然后，接种每种种子培养物，并以200rpm的转速，在30℃下振荡温育5至7小时。
在1.5L试验发酵罐中以0.25L的量制备二级种子培养基，在121℃下在压力下高压灭菌20分钟，并冷却。然后，接种初级种子培养基(50mL)，并以900rpm的转速，在31.5℃下温育15小时。
在5L试验发酵罐中以0.25L的量制备发酵培养基，在121℃下在压力下高压灭菌20分钟，并冷却。然后，将二级种子培养基(0.26L)接种到其上，并以900rpm的转速，在30℃至34℃下温育。
在上述条件下培养的同时，在谷氨酸棒杆菌培养期间，使用28％氨水连续调节发酵培养物的pH，以使其在7.0至7.4的范围内。当培养物中残留糖的浓度在0.5％至1.5％的范围内时，连续添加灭菌的有机原糖以继续培养，直到添加的糖的总量变为发酵液量的30％至34％。
[表7]
结果，如上表7所示，确认虽然在两个菌株之间谷氨酸生产量没有显著差异，但是引入突变的谷氨酸棒杆菌KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)_Pro(3mt)_hisEG菌株生产的发酵液中甘氨酸的量显著增加。
即使在利用3kL发酵罐制备发酵组合物的情况下，在两个菌株之间谷氨酸产量也没有显著差异。然而，尽管在两个菌株之间谷氨酸产量没有显著差异(64.2g/L vs 73g/L)，但是引入突变的谷氨酸棒杆菌KFCC11074_hisG(G233H/T235Q)_Pro(3mt)_hisEG菌株与KFCC11074菌株相比，显示出甘氨酸量的显著增加(即0.2g/L vs 3.2g/L)。
根据以上所述，本公开所属领域的普通技术人员将能够理解，在不修改本公开的技术概念或本质特征的情况下，本公开可以以其它具体形式体现。就这一点而言，本文公开的示例性实施方式仅用于说明性目的，而不应被解释为限制本公开的范围。相反，本公开意在不仅覆盖示例性实施方式，而且还覆盖可包括在如由所附权利要求限定的本公开的精神和范围内的各种替代、修改、等同和其它实施方式。
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<210> 1
<211> 65
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌
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aattattcga ctaatatcct cccccaaaca cacattgata actgttgtgt ggaagaatgt 60
accga 65
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hisEG启动子
<400> 2
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accga 65
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<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hisEG启动子
<400> 3
aattattcga ctaatatcct cccccaaaca cacattgata actgttgtgt ggtataatgg 60
accga 65
<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 4
tcgtacagcg agtcaaatgt cttcactcgg tacattatac cacacaacag ttatcaatgt 60
gtgtttgggg gagga 75
<210> 5
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸
<400> 5
tcgtacagcg agtcaaatgt cttcactcgg tccattatac cacacaacag ttatcaatgt 60
gtgtttgggg gagga 75
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hisE-pro-2mt-AF
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<220>
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<220>
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gatcctctag agtcgacccc aaacaagggc tcgc 34
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<220>
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<212> DNA
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<213> 人工序列
<220>
<223> hisG(G233H/T235Q)-BR
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atgcctgcag gtcgacgcaa ggttggcaac aac 33
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<211> 281
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒杆菌
<400> 16
Met Leu Lys Ile Ala Val Pro Asn Lys Gly Ser Leu Ser Glu Arg Ala
1 5 10 15
Met Glu Ile Leu Ala Glu Ala Gly Tyr Ala Gly Arg Gly Asp Ser Lys
20 25 30
Ser Leu Asn Val Phe Asp Glu Ala Asn Asn Val Glu Phe Phe Phe Leu
35 40 45
Arg Pro Lys Asp Ile Ala Ile Tyr Val Ala Gly Gly Gln Leu Asp Leu
50 55 60
Gly Ile Thr Gly Arg Asp Leu Ala Arg Asp Ser Gln Ala Asp Val His
65 70 75 80
Glu Val Leu Ser Leu Gly Phe Gly Ser Ser Thr Phe Arg Tyr Ala Ala
85 90 95
Pro Ala Asp Glu Glu Trp Ser Ile Glu Lys Leu Asp Gly Lys Arg Ile
100 105 110
Ala Thr Ser Tyr Pro Asn Leu Val Arg Asp Asp Leu Ala Ala Arg Gly
115 120 125
Leu Ser Ala Glu Val Leu Arg Leu Asp Gly Ala Val Glu Val Ser Ile
130 135 140
Lys Leu Gly Val Ala Asp Ala Ile Ala Asp Val Val Ser Thr Gly Arg
145 150 155 160
Thr Leu Arg Gln Gln Gly Leu Ala Pro Phe Gly Glu Val Leu Cys Thr
165 170 175
Ser Glu Ala Val Ile Val Gly Arg Lys Asp Glu Lys Val Thr Pro Glu
180 185 190
Gln Gln Ile Leu Leu Arg Arg Ile Gln Gly Ile Leu His Ala Gln Asn
195 200 205
Phe Leu Met Leu Asp Tyr Asn Val Asp Arg Asp Asn Leu Asp Ala Ala
210 215 220
Thr Ala Val Thr Pro Gly Leu Ser Gly Pro Thr Val Ser Pro Leu Ala
225 230 235 240
Arg Asp Asn Trp Val Ala Val Arg Ala Met Val Pro Arg Arg Ser Ala
245 250 255
Asn Ala Ile Met Asp Lys Leu Ala Gly Leu Gly Ala Glu Ala Ile Leu
260 265 270
Ala Ser Glu Ile Arg Ile Ala Arg Ile
275 280

Claims (14)

1.具有启动子活性的多核苷酸，所述多核苷酸由其中第53和第55个核苷酸被T取代；或者第53和第55个核苷酸被T取代且第60个核苷酸被G取代的SEQ ID NO:1的核苷酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列组成。
3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接到编码目的蛋白的基因。
4.包含权利要求1或2所述的多核苷酸的载体；和编码可操作地连接到所述多核苷酸的目的蛋白的基因。
5.根据权利要求4所述的载体，其中所述目的蛋白是磷酸核糖基-ATP焦磷酸酶(HisE)、ATP磷酸核糖基转移酶(HisG)、或其组合。
6.棒杆菌属(genus Corynebacterium)的微生物，所述微生物包含权利要求1所述的多核苷酸；和编码可操作地连接到所述多核苷酸的目的蛋白的基因。
7.根据权利要求6所述的微生物，其中所述多核苷酸由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列组成。
8.根据权利要求7所述的微生物，其中所述目的蛋白是磷酸核糖基-ATP焦磷酸酶(HisE)、ATP磷酸核糖基转移酶(HisG)、或其组合。
9.根据权利要求8所述的微生物，其中，在所述ATP磷酸核糖基转移酶(HisG)中，分别用组氨酸(H)和谷氨酰胺(Q)取代SEQ ID NO:16的HisG氨基酸序列的第233和第235位氨基酸。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的微生物，其中所述棒杆菌属的微生物是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
11.生产目的物质的方法，所述方法包括：
在培养基中培养权利要求6至9中任一项所述的棒杆菌属的微生物；以及
从所述培养基中回收所述目的物质。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述目的物质是氨基酸。
13.制备发酵组合物的方法，所述方法包括通过在培养基中培养权利要求6至9中任一项所述的棒杆菌属的微生物来进行发酵。
14.发酵组合物，所述发酵组合物包含权利要求6至9中任一项所述的棒杆菌属的微生物。
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