JP7125477B2 - グリシン生産能が増加された微生物及びこれを用いた発酵組成物の生産方法 - Google Patents

グリシン生産能が増加された微生物及びこれを用いた発酵組成物の生産方法 Download PDF

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Description

本出願は、グリシン生産能が増加された微生物及びこれを用いた発酵組成物の生産方法に関するもので、より詳細には、ＨｉｓＧに変異が導入されてグリシン生産能が増加されたコリネバクテリウム属微生物、これを用いたグリシン及びグルタミン酸を含む発酵組成物の製造方法、及び前記発酵組成物に関する。
Ｌ－アミノ酸はタンパク質の基本構成単位であって、薬品の原料と食品添加剤、動物飼料、栄養剤、殺虫剤、殺菌剤などの重要素材として用いられる。その中でも、Ｌ－グルタミン酸は発酵によって生産される代表的なアミノ酸であって、特有の独特の味（旨味）を有し、食品分野ではもちろん、医薬品分野、その他の動物飼料の分野などに広く利用されている重要なアミノ酸の一つである。また、グリシンは主に甘味を出して、食品工業で調味料として用いられ、天然調味料と一緒に用いて味を高める。さらに、酸化防止の作用、緩衝作用などにも用いられており、医薬の面では輸液、制酸剤、総合アミノ酸製剤、栄養補給剤として用いられている。
前記アミノ酸を生産する通常の方法としては、主にブレビバクテリウム（Brevibacterium）やコリネバクテリウム（非特許文献１）、その他にも大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus）、放線菌（Streptomyces）、ペニシリウム（Penicillum）属、クレブシエラ（Klebsiella）、エルウィニア（Erwinia）、パントエア（Pantoea）属などの微生物を用いた発酵の方法があり（特許文献１及び２）、また、モノクロロ酢酸法、ストレッカー（Strecker）法などの合成法を介した工業的な方法によっても生産される。
また、アミノ酸を効率的に生産するための多様な研究、例えば、アミノ酸高効率生産の微生物や発酵工程の技術を開発するための努力が成されている。具体的には、コリネバクテリウム属菌株におけるアミノ酸生合性に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させたり、またはアミノ酸生合成に不要な遺伝子を除去することのような目的物質特異的な接近方法が開発され（特許文献３及び４）、このような方法の他に、アミノ酸の生産に関与しない遺伝子を除去する方法、アミノ酸の生産において具体的に機能が知られてない遺伝子を除去する方法も活用されている。しかし、依然として効率的かつ高収率でアミノ酸を生産しうる方法に対する研究の必要性が台頭している。
米国特許第３，２２０，９２９号 米国特許第６，６８２，９１２号 韓国登録特許公報第１０－０９２４０６５号 韓国登録特許公報第１０－１２０８４８０号 韓国登録特許公報第１０－０２９２２９９号 国際公開特許第２００８－０３３００１号
Amino Acid Fermentation、Gakkai Shuppan Center ：195-215、1986 Microb Biotechnol. 2013 Mar; 6(2):103-117. Karlin ＆Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993) Methods Enzymol., 183, 63, 1990 Sambrook et al.,supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 Appl. Microbiol. Biothcenol.,1999,52:541-545
本発明者らは、複数のアミノ酸を同時に生産しうる方法を開発するために努力した結果、グルタミン酸生産菌株で親菌株と比較してＨｉｓＧ活性を強化する場合、グルタミン酸の生成能は維持しつつ、グリシンの生成能を向上させうることを確認し、本出願を完成した。
本出願の一つの目的は、ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ（ATP phosphoribosyltransferase：ＨｉｓＧ）の活性が強化された、グリシン生産能が増加されたコリネバクテリウム属微生物を提供することにある。
本出願のもう一つの目的は、前記コリネバクテリウム属微生物を培地で培養して発酵する段階を含む、グリシン及びグルタミン酸を含む発酵組成物の製造方法を提供することにある。
本出願のもう一つの目的は、前記方法によって製造された発酵組成物を提供することにある。
本出願のＨｉｓＧ変異は微生物に導入して、グルタミン酸とグリシンを同時に生産しうるため、アミノ酸の生産に有用に活用できる。また、発酵物内のグルタミン酸の量とグリシンの量を調節して、発酵物の味と嗜好性を改善させ、発酵液及びこれを用いた調味素材の製品に適用できる。
これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用されてもよい。すなわち、本出願で開示された様々な要素の任意の組み合わせが本出願のカテゴリに属する。また、下記記述された具体的な叙述によって、本出願のカテゴリが制限されるとは見られない。
前記のような目的を達成するために、本出願の一つの様態は、ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ（ATP phosphoribosyltransferase：ＨｉｓＧ）の活性が強化された、グリシン生産能が増加されたコリネバクテリウム属微生物を提供する。
具体的には、配列番号４で表されるアミノ酸配列の２３３番目のアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）に置換されたＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ（ATP phosphoribosyltransferase：ＨｉｓＧ）を含む、グリシンの生産能が増加されたコリネバクテリウム属微生物を提供しうる。
また、具体的には、前記配列番号４で表されるアミノ酸配列の２３３番目のアミノ酸がヒスチジン（Ｈ）に置換されて、２３５番目のアミノ酸がグルタミン（Ｑ）に置換されたＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ（ATP phosphoribosyltransferase：ＨｉｓＧ）を含む、グリシンの生産能が増加されたコリネバクテリウム属微生物を提供しうる。
本出願で「ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ（ATP phosphoribosyltransferase」は、「ＨｉｓＧ」とも命名され、ヒスチジン合成経路に関与する酵素を意味する。ヒスチジン合成経路は、合計９つの酵素からなり（ＨｉｓＧ－ＨｉｓＥ－ＨｉｓＩ－ＨｉｓＡ－ＨｉｓＨ－ＨｉｓＢ－ＨｉｓＣ－ＨｉｓＮ－ＨｉｓＤ）、前記ＨｉｓＧはその中で１段階を構成する。
前記ＨｉｓＧ はヒスチジン生成に関与することが知られていたが、グリシン生成との関連性については公知されず、本発明者らによって初めて究明された。より具体的には、ＨｉｓＧの活性強化を介してグリシンの生成量が増加すること、特に、ＨｉｓＧは生産物であるヒスチジンによりフィードバック阻害を受けるが、本出願ではヒスチジンフィードバック阻害を解除した変異を導入して、これに伴うグリシン生成量の増加及びグルタミン酸生成量の維持効果は、本発明者らによって初めて究明された。
本出願において、「ＨｉｓＧの活性強化」は、ＨｉｓＧ酵素の活性がコリネバクテリア属微生物が天然の状態で有している酵素の活性状態である、内在的活性より増加されたことを意味する。ＨｉｓＧの活性を強化させる方法の例として、ｉ）ＨｉｓＧをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドをさらに染色体に挿入する方法またはＨｉｓＧをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドをベクターシステムに導入する方法などによって、前記酵素をコードする塩基配列のコピー数を増加させる方法、ｉｉ）ｈｉｓＧ遺伝子のプロモーターを強化する方法、例えば、強いプロモーターに交替する方法、またはプロモーターに変異を導入する方法が含まれてもよく、ｉｉｉ）遺伝子変異により活性が強い酵素に変異させる方法などがある。
具体的には、本出願では配列番号４で表されるＨｉｓＧアミノ酸配列の２３３番目のアミノ酸であるグリシンがヒスチジンに置換されるか、配列番号４で表されるＨｉｓＧアミノ酸配列の２３３番目のアミノ酸であるグリシンがヒスチジンに置換されて、２３５番目のアミノ酸であるトレオニンがグルタミンに置換されてもよい。それに応じて、前記のような変異されたＨｉｓＧを含むコリネバクテリウム属微生物は、グルタミン酸の生性能にはほとんど影響を与えずに維持しつつ、グリシン生成能を著しく増加させうる。前記グリシン生産能の増加は、本出願の変形、すなわち前記置換を含まないＨｉｓＧを有する微生物に比べて増加されたものであってもよい。
他の例として、ＨｉｓＧ酵素のプロモーターを変異または置換を介して内在的プロモーターに比べて強いプロモーターに変異させてもよい。前記内在的酵素のプロモーターの代わりに塩基置換変異を有する改良型プロモーターまたは異種プロモーターが連結されてもよく、前記異種プロモーターの例としては、ｃｊ７プロモーター、ｌｙｓＣＰ１プロモーター、ＥＦ－Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡプロモーター、ａｃｅＢプロモーターなどがあるが、これに限定されるものではない。
また、前記ｈｉｓＧ遺伝子はｈｉｓＥ遺伝子とオペロンで構成されているため、ｈｉｓＥＧ遺伝子のプロモーター配列が変異または置換によるｈｉｓＧの過発現を介してＨｉｓＧ酵素の活性を強化させうる。より具体的には、ｈｉｓＥＧ遺伝子のプロモーター配列の変異は、配列番号１からポリヌクレオチド配列の５３番目及び５５番目ヌクレオチドをＴに置換、またはポリヌクレオチド配列の５３番目及び５５番目ヌクレオチドをＴに、６０番目ヌクレオチドをＧに置換して、内在的プロモーターに比べて強いプロモーターでＨｉｓＧ酵素の活性を強化しうる。コリネバクテリウム・グルタミカムのプロモーター配列の研究文献（非特許文献２）を見るとＲＮＡシーケンシング（RNA-seq）を介して多数の転写開始点（transcriptional start point：ＴＳＰ）及びプロモーターの位置を把握できる。ここで、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型ＡＴＣＣ１３８６９菌株のＲＡＮ ｓｅｑ実験を介してｈｉｓＥＧ遺伝子のプロモーター配列を確認し、内在的（native）プロモーター変形を介してｈｉｓＥＧ過発現を誘導した。内在的プロモーター変形の方法の１つとして、コリネバクテリウム・グルタミカムのプロモーターの－３５及び－１０領域配列の変異を介してコンセンサス配列に近づくようにする方法がある。特に、ｈｉｓＥＧ遺伝子のプロモーター配列から－１０領域（ＴＡＴＡボックス）の配列をコンセンサス配列に近づくように変異した場合、内在的プロモーターに比べて強いプロモーターに変形してもよい。
具体的には、前記コリネバクテリウム属微生物に含まれるＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼは、配列番号５のアミノ酸配列からなるものであってもよく、または、前記ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼは、配列番号６のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
また、本出願のアミノ酸配列は、従来知られている突然変異誘発法、例えば、方向性進化法（direct evolution）及び部位特異的突然変異法（site-directed mutagenesis）などにより変形されてもよい。
したがって、前記ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼは、前記配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％以上、具体的には、７０％以上、より具体的には、８０％以上、さらに具体的には、８３％以上、８４％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＨｉｓＧを含んでもよい。前記配列と相同性を有する配列として、実質的に配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列と同一または相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本出願のカテゴリに含まれるのは自明である。
この時、前記用語、「グルタミン酸」（L-glutamic acid、L-glutamate）は、アミノ酸の一種であって、非必須アミノ酸に区分される。中枢神経系で最も一般的な興奮性神経伝達物質として知られていて、また、旨味が出るといわれ、このモノナトリウム塩（monosodium glutamate：ＭＳＧ）が調味料として開発され、広く用いられている。一般的に、グルタミン酸を生産する微生物の発酵を介して製造される。
また、前記用語、「グリシン」（glycine）は、甘味を出す無色結晶のアミノ酸であって、グライシンとも言う。食品の調味料として主に用いられ、医薬の面では輸液、制酸剤、総合アミノ酸製剤、栄養補給剤としても用いられている。一般的に、モノクロロ酢酸法、ストレッカー（Strecker）法などの工業的な合成法によって製造されるが、合成法はＤ型及びＬ型のアミノ酸が混合されて製造されるため、光学分割をしなければならないという不便さがあった。したがって、反応条件がおだやかで短時間に大量の生産が可能であり、工程が環境親和的で、生産物質が生分解性であるなどの多様な利点を有する発酵法でグリシンを製造する必要がある。
本出願において、用語、「相同性」は、与えられたアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と一致する程度を意味し、パーセンテージとして示してもよい。本明細書で、与えられたアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と同一または類似の活性を有するその相同性配列が「％相同性」として示される。前記アミノ酸配列またはヌクレオチド配列に対する相同性は、例えば、文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ [参照：非特許文献３]やＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（参照：非特許文献４）を使用して決定してもよい。これらのアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（参照：http://www.ncbi.nlm.nih.gov）。
前記「厳しい条件」は、ポリヌクレオチド間の特異的混成化を可能にする条件を意味する。これらの条件は、文献（例えば、非特許文献５）に具体的に記載されている。例えば、相同性が高い遺伝子同士、６０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９７％以上、特に具体的には、９９％以上の相同性を有する遺伝子同士ハイブリッド化し、それより相同性が低い遺伝子同士ハイブリッド化しない条件、または通常のサザンハイブリッド化の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１ ％ＳＤＳ、より具体的には、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には、２回～３回洗浄する条件を列挙しうる。混成化は、たとえ混成化の厳格度に応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能としても、２つのヌクレオチドが相補的配列を有することを要求する。前記用語「相補的」は、互いに混成化が可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するために用いられる。例えば、ＤＮＡに関すると、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本出願は、また実質的に類似のポリヌクレオチド配列だけでなく、全体の配列に相補的な単離されたポリヌクレオチド断片を含んでもよい。
具体的には、相同性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値で混成化段階を含む混成化条件を用い、上述した条件を用いて探知してもよい。また、前記Ｔｍ値は６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて、当業者によって適切に調節してもよい。ポリヌクレオチドを混成化する適切な厳格度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は該当技術分野でよく知られている（非特許文献５を参照）。
本出願において、用語、「微生物」は、野生型微生物や、自然的または人為的に遺伝的変形が起きた微生物をすべて含み、外部遺伝子が挿入されたり、内在的遺伝子の活性が強化されたり弱化されるなどの原因によって特定機序が弱化されたり増強された微生物をすべて含む概念である。
本出願で、前記微生物は前記ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼを含んでもよい。また、前記 ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼはベクターを介した形質転換によって前記微生物に導入されてもよいが、これに制限されない。また、微生物は前記ＨｉｓＧが発現できれば、前記ＨｉｓＧをコードする遺伝子が、染色体上に位置するか、染色体外に位置するかとは関係がない。
本出願において、用語、「ベクター」は、適合した宿主内で目的遺伝子を発現させうるように遺伝物質を保有する人為的ＤＮＡ分子であって、前記ＨｉｓＧをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ製造物を意味してもよい。
本出願で用いられるベクターは、宿主細胞内で発現可能なものであれば特に制限されず、当業界に知られている任意のベクターを用いて宿主細胞を形質転換させてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。
例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＬＢ３、λＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いてもよい。
また、宿主細胞内の染色体挿入用ベクターを介して染色体内に本出願のＨｉｓＧをコードするポリヌクレオチドを導入してもよい。例えば、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣ、ｐＣＥＳ２０８、ｐＸＭＪ１９ベクターなどを用いてもよいが、これに制限されない。
また、前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組換えによって行ってもよい。
本出願のベクターは、相同組換えによって染色体内に挿入されうるため、前記染色体が挿入されたかどうかを確認するための選別マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、すなわちポリヌクレオチドの挿入有無を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能な表現型を付与するマーカーが用いられてもよい。選択剤（selective agent）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみ生存するか、または他の表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別しうる。
本出願において、用語、「形質転換」は、前記ポリヌクレオチドまたはＨｉｓＧをコードする遺伝子を含むベクターを宿主細胞内に導入し、宿主細胞内で前記遺伝子及びＨｉｓＧが発現できるようにすることを意味する。さらに、宿主細胞内で目的遺伝子が発現することさえできれば、形質転換された遺伝子は、宿主細胞の染色体上に位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらすべての場合を含んでもよい。
前記形質転換する方法は、前記遺伝子を細胞内に導入するすべての方法を含み、宿主細胞に応じて、当分野で公知のように、適合した標準技術を選択して行ってもよい。例えば、電気穿孔法（electroporation）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥデキストラン法、陽イオンリポソーム法、及び酢酸リチウムＤＭＳＯ法などがあるが、これに制限されない。
本出願で前記微生物は、本出願のＨｉｓＧが導入されてグリシンの生産能を増加させうる微生物であれば、制限なく含まれてもよい。
具体的には、前記微生物はコリネバクテリウム属微生物であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）またはコリネバクテリウム・フラバム（Corynebacterium flavum）であってもよく、最も具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムであってもよいが、これに制限されない。
本出願のもう一つの様態は、前記コリネバクテリウム属微生物を培地で培養して発酵する段階を含む、グリシン及びグルタミン酸を含む発酵組成物の製造方法を提供する。
本出願のもう一つの様態は、前記方法により製造された発酵組成物を提供する。
前記発酵組成物は、グリシンの含量が増加されたものであってもよい。
前記微生物は、前述のとおりである。
本出願において、用語、「培養」は、微生物を適当に人工的に調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願で前記微生物を用いて目的物質を生産する方法は、当業界に広く知られている方法を用いて行ってもよい。具体的には、前記培養は、バッチ工程、注入バッチまたは反復注入バッチ工程（fed batch or repeated fed batch process）で連続式で培養してもよいが、これに制限されるものではない。培養に用いられる培地は、適切な方法で特定菌株の要件を満たす必要がある。コリネバクテリウム菌株に対する培養培地は公知されている（例えば、Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981）。
培地中に用いられる糖源としては、ブドウ糖、サッカロース、乳糖、果糖、マルトース、でん粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油などのようなオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は、個別的に、または混合物として用いられてもよく、これに制限されるものではない。
用いられる窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆ミール、及び尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も、個別的に、または混合物として用いてもよく、これに制限されるものではない。
用いられるリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウムを含有する塩が含まれてもよい。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有してもよい。最後に、前記物質に加えて、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が用いられてもよい。また、培養培地に適切な前駆体が用いられてもよい。前記された原料は、培養過程で培養物に適切な方法によって回分式または連続式で添加してもよい。
前記微生物の培養中に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方法で用いて培養物のｐＨを調節してもよい。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡の生成を抑制してもよい。好気状態を維持するために培養物の内に酸素または酸素含有気体（例えば、空気）を注入してもよい。
培養物（培地）の温度は、通常２０℃～４５℃、具体的には、２５℃～４０℃であってもよい。培養時間は、所望の目的物質の生成量が得られるまで続けてもよいが、具体的には、１０～１６０時間であってもよい。
培養物（培地）からの目的物質の回収は、当業界に知られている通常の方法によって分離されて回収されてもよい。これらの分離方法には、遠心分離、ろ過、クロマトグラフィー及び結晶化などの方法が用いられる。例えば、培養物を低速遠心分離してバイオマスを除去して得られた上澄み液を、イオン交換クロマトグラフィーを介して分離してもよいが、これに制限されるものではない。別の方法として、培養物（培地）から菌体分離及びろ過工程を行い、別の精製工程なしに目的物質を回収してもよい。別の方法として、前記回収段階は、精製工程をさらに含んでもよい。
本出願において、用語、「前記発酵組成物」は、本出願の微生物を培養して得られた組成物を意味する。さらに、前記発酵組成物は、前記微生物を培養した後、適切な後処理工程を経た後、得られた液状または粉末形態の組成物を含んでもよい。この時、適切な後処理工程は、例えば、前記微生物の培養工程、菌体除去工程、濃縮工程、ろ過工程、及び担体混合工程を含んでもよく、追加で乾燥工程をさらに含んでもよい。場合に応じて、前記後処理工程は、精製工程を含まなくてもよい。前記発酵組成物は、本出願の微生物を培養することにより、一定水準のグルタミン酸の含量を維持しつつ、グリシンの含量が増加された組成物を含むことにより、最適な味を出せる。
また、「前記発酵組成物」は、前記の液状または粉末形態の組成物が含まれた調味素材の製品（例えば、スープ用粉末製品、スナックシーズニング製品など）を排除しない。さらに、「前記発酵組成物」は、本出願の微生物を培養して得られた組成物を含みさえすれば、非発酵の工程で得られた物質及び／または非天然の工程で得られた別の物質をさらに混合した場合を排除しない。
以下、本出願の実施例を介してより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本出願を例示的に説明するためのもので、本出願の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１．グリシン生産能の増加のためのＫＦＣＣ１１０７４菌株への変異導入及び変異が導入されたＫＦＣＣ１１０７４のグルタミン酸及びグリシン生成量の確認
実施例１-１．変異が導入されたベクターの製作
グルタミン酸生産菌株におけるＨｉｓＧ活性強化を介してグリシン生成能の増加効果を確認するために、ＨｉｓＥＧ遺伝子のプロモーター内に変異を起こした菌株及びヒスチジンフィードバック阻害を解除した変異を導入した菌株を製作し、これのグリシン生産能を確認した。
一方、ｈｉｓＥとｈｉｓＧ遺伝子はオペロンで構成されて、これら遺伝子はヒスチジン生合成経路に関与する遺伝子である。特に、前記ＨｉｓＧは、生産物であるヒスチジンによりフィードバック阻害を受けるため、フィードバック阻害が解除された変異を導入してＨｉｓＧ遺伝子の活性を増加させる場合、菌株のグリシン生産能が増加させるかどうかを確認した。ここで、グルタミン酸生産菌株として知られているＫＦＣＣ１１０７４菌株（特許文献５）にＨｉｓＥＧプロモーター変異及びＨｉｓＧのヒスチジンフィードバック阻害解除変異をそれぞれ導入した。具体的には、ＨｉｓＥＧプロモーターを含む配列番号１からポリヌクレオチド配列の５３番目及び５５番目ヌクレオチドをＴに置換、ポリヌクレオチド配列の５３番目及び５５番目ヌクレオチドをＴに置換、６０番目ヌクレオチドをＧに置換するために遺伝子置換ベクターを製作した。
また、配列番号４で表されるＨｉｓＧアミノ酸配列の２３３番目のグリシン（Ｇｌｙ／Ｇ）をヒスチジン（Ｈｉｓ／Ｈ）に置換、２３３番目及び２３５番目のグリシン（Ｇｌｙ／Ｇ）とトレオニン（Ｔｈｒ／Ｔ）をヒスチジン（Ｈｉｓ／Ｈ）とグルタミン（Ｇｌｎ／Ｑ）に置換するために遺伝子置換ベクターを製作した。それぞれの置換ベクターを製作するための遺伝子断片は、ＡＴＣＣ１３８６９ゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを介して獲得した。米国国立衛生研究所ジーンバンク（NIH GenBank）に登録されているコリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３８６９）遺伝子及び周辺の塩基配列に対する情報に基づいて、それぞれのプライマーを製作した。
ＨｉｓＥＧプロモーター置換ベクターを製作するためのＰＣＲの条件は、９５℃で５分間変性した後、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１分の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応をで行った。より具体的には、配列番号７及び８のプライマーを用いて増幅した５００ｂｐのポリヌクレオチドと配列番号９及び１０のプライマーを用いて増幅した５００ｂｐのポリヌクレオチドを得た。前記得られた２つの遺伝子断片を制限酵素ＳａｌＩで切断したｐＤＺベクター（特許文献３及び６）にインフュージョン酵素を用いて連結することにより、ｈｉｓＥＧプロモーターを含む２つの遺伝子置換ベクターを製作し、これを「ｐＤＺ－ｈｉｓＥＧ－ｐｒｏ－２ｍｔ」と命名した。また、配列番号７及び１１のプライマーを用いて増幅した５００ｂｐのポリヌクレオチドと配列番号１０及び１２のプライマーを用いて増幅した５００ｂｐのポリヌクレオチドを得た。前記得られた２つの遺伝子断片を制限酵素ＳａｌＩで切断したｐＤＺベクター（特許文献３及び６）にインフュージョン酵素を用いて連結することにより、ｈｉｓＥＧプロモーターを含む１つの遺伝子置換ベクターを製作し、これを「ｐＤＺ－ｈｉｓＥＧ－ｐｒｏ－３ｍｔ」と命名した。前記のベクター製作のために用いられたプライマー配列情報は、下記表１に示した。
ＨｉｓＧアミノ酸配列の２３３番目、２３３番目及び２３５番目のアミノ酸をそれぞれＨ、Ｈ及びＱに置換するために、遺伝子置換ベクターを製作した。具体的には、ＰＣＲの条件は９５℃で５分間変性した後、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１分の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。配列番号１３及び１４のプライマーを用いて増幅した７２２ｂｐのポリヌクレオチドと配列番号１５及び１６のプライマーを用いて増幅した７９８ｂｐのポリヌクレオチドを得た。前記得られた２つの遺伝子断片を制限酵素ＳａｌＩで切断したｐＤＺベクター（特許文献３及び６）にインフュージョン酵素を用いて連結することにより、ＨｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ）変異を含むポリヌクレオチドが含まれた１つの１．５ｋｂｐ遺伝子置換ベクターを製作し、これを「ｐＤＺ－ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ）」と命名した。また、配列番号１３及び１７のプライマーを用いて増幅した７２２ｂｐのポリヌクレオチドと配列番号１６及び１８のプライマーを用いて増幅した７９８ｂｐのポリヌクレオチドを得た。前記得られた２つの遺伝子断片を制限酵素ＳａｌＩで切断したｐＤＺベクター（特許文献３及び６）にインフュージョン酵素を用いて連結することにより、ＨｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）変異を含むポリヌクレオチドが含まれた１つの１．５ｋｂｐ遺伝子置換ベクターを製作し、これを「ｐＤＺ－ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）」と命名した。前記のベクター製作のために用いられたプライマー配列情報は、下記表１に示した。
Figure 0007125477000001
 実施例１－２．変異が導入されたＫＦＣＣ１１０７４の製作及びグルタミン酸及びグリシン生成量の確認
前記実施例１－１を介して製作したＨｉｓＥＧプロモータ置換ベクターであるｐＤＺ－ｈｉｓＥＧ－ｐｒｏ－２ｍｔ及びｐＤＺ－ｈｉｓＥＧ－ｐｒｏ－３ｍｔとＨｉｓＧ遺伝子置換ベクターであるｐＤＺ－ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ）及びｐＤＺ－ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）をそれぞれＫＦＣＣ１１０７４菌株に電気穿孔法で導入した。変異がそれぞれ導入されたグルタミン酸及びグリシン生産菌株「ＫＦＣＣ１１０７４_Ｐｒｏ（２ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ」、「ＫＦＣＣ１１０７４_Ｐｒｏ（３ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ」、「ＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ）」及び「ＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）」を製作した。
具体的には、形質転換（非特許文献６）を介して製作し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株をカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／Ｌを含有した寒天栄養培地から選別した。選別した１次菌株を再び２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、ターゲット変異が導入された菌株をそれぞれ選別した。最終的に形質転換された菌株の変異（置換）有無は、配列番号７及び１０のプライマー対と配列番号１３及び１６のプライマー対を用いてそれぞれＰＣＲを行った後にシーケンシングを介して確認した。
その後、選別した菌株、ＫＦＣＣ１１０７４_Ｐｒｏ（２ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ、ＫＦＣＣ１１０７４_Ｐｒｏ（３ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ、ＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ）及びＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）を栄養培地に塗抹して３０℃で１６時間培養した。その後、１２１℃で１５分間加圧殺菌された発酵培地２５ｍｌを２５０ｍｌの振とう用三角フラスコに分注して栄養培地で培養された菌株を接種して４８時間培養した。培養条件は、回転数２００ｒｐｍ、温度３７℃、ｐＨ８．０で調節した。前記栄養培地と発酵培地の組成は次のとおりである。
栄養培地：
グルコース１％、肉汁０．５％、ポリペプトン１％、塩化ナトリウム０．２５％、酵母エキス０．５％、寒天２％、ウレア０．２％、ｐＨ７．２
発酵培地：
粗糖６％、炭酸カルシウム５％、硫酸アンモニウム２．２５％、１リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０４％、硫酸鉄１０ｍｇ ／Ｌ、ビオチン０．３ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩０．２ｍｇ／Ｌ
培養終了した後、ＨＰＬＣを用いた方法を介してＬ－グルタミン酸及びグリシン生産量を測定し、測定結果は、下記表２に示した。
Figure 0007125477000002
 表２に示すように、変異が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１１０７４_Ｐｒｏ（２ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ、ＫＦＣＣ１１０７４_Ｐｒｏ（３ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ、ＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ）及びＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）菌株が生産したＬ－グルタミン酸の濃度は、変異が導入されないコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１１０７４菌株が生産したＬ－グルタミン酸の濃度と類似していることを確認した。
一方、前記ＫＦＣＣ１１０７４_Ｐｒｏ（２ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ及びＫＦＣＣ１１０７４_Ｐｒｏ（３ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ及びＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ）菌株が生産したグリシン濃度は、前記ＫＦＣＣ１１０７４が生産したグリシンの濃度に比べて、それぞれ３３ｍｇ／Ｌ、４４ｍｇ／Ｌ及び４５ｍｇ／Ｌ増加することを確認した。特に、ＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）菌株の場合、グリシン濃度が２６８ｍｇ／Ｌで、大幅に増加することを確認した。
すなわち、ＨｉｓＥＧプロモーター変異とＨｉｓＧフィードバック阻害の解除を含んでいる前記変異は微生物のＬ－グルタミン酸の生成能にはほとんど影響を与えずに維持しつつ、グリシン生成能を著しく増加させることを確認した。
実施例２．変異が導入されたＡＴＣＣ１３８６９菌株のグルタミン酸及びグリシン生成量の確認
前記の変異が野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３８６９菌株においても、グルタミン酸の生産能には影響を与えず、グリシン生成能の増加効果があるかを確認するために、変異が導入されたＡＴＣＣ１３８６９基盤菌株を製作した。
前記実施例１－１を介して製作したＨｉｓＥＧプロモーター置換ベクターであるｐＤＺ－ｈｉｓＥＧ－ｐｒｏ－２ｍｔ及びｐＤＺ－ｈｉｓＥＧ－ｐｒｏ－３ｍｔとＨｉｓＧ遺伝子置換ベクターであるｐＤＺ－ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ）及びｐＤＺ－ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）をそれぞれＡＴＣＣ１３８６９菌株に電気穿孔法で導入した。変異がそれぞれ導入されたグルタミン酸及びグリシン生産菌株「ＡＴＣＣ１３８６９_Ｐｒｏ（２ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ」、「ＡＴＣＣ１３８６９_Ｐｒｏ（３ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ」、「ＡＴＣＣ１３８６９_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ）」及び「ＡＴＣＣ１３８６９_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）」を製作した。
具体的には、形質転換（非特許文献６）を介して製作し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株をカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／Ｌを含有した寒天栄養培地から選別した。選別した１次菌株を再び２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、ターゲット変異が導入された菌株をそれぞれ選別した。最終的に形質転換された菌株の変異（置換）有無は、配列番号７及び１０のプライマー対と配列番号１３及び１６のプライマー対を用いてそれぞれＰＣＲを行った後にシーケンシングを介して確認した。
それぞれのコロニーを栄養培地で継代培養した後、発酵培地で５時間培養した。その後、それぞれの培地に２５％ツイン４０（tween40）を０．４％濃度で追加し、それぞれのコロニーを再び３２時間培養した。
栄養培地：
グルコース１％、肉汁０．５％、ポリペプトン１％、塩化ナトリウム０．２５％、酵母エキス０．５％、寒天２％、ウレア０．２％、ｐＨ７．２
発酵培地：
粗糖６％、炭酸カルシウム５％、硫酸アンモニウム２．２５％、１リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０４％、硫酸鉄１０ｍｇ ／Ｌ、ビオチン０．３ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩０．２ｍｇ／Ｌ
前記条件でそれぞれのコロニーを培養して、ＹＳＩを用いてＬ－グルタミン酸の濃度を測定し、ＨＰＬＣを用いてグリシンの濃度を測定した。測定したＬ－グルタミン酸及びグリシンの濃度は下記表３に示した。
Figure 0007125477000003
 表３に示すように、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３８６９）に変異が導入されたＡＴＣＣ１３８６９_Ｐｒｏ（２ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ、ＡＴＣＣ１３８６９_Ｐｒｏ（３ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ、ＡＴＣＣ１３８６９_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ）及びＡＴＣＣ１３８６９_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）菌株が生産したＬ－グルタミン酸の濃度は、ＡＴＣＣ１３８６９菌株が生産したＬ－グルタミン酸の濃度と類似していたが、グリシンの濃度はすべて増加することを確認した。
すなわち、ＨｉｓＥＧプロモーター変異とＨｉｓＧフィードバック阻害の解除を含んでいる前記変異は微生物のＬ－グルタミン酸の生成能にはほとんど影響を与えずに維持しつつ、グリシン生成能を著しく増加させることを再び確認した。
一方、前記ＡＴＣＣ１３８６９_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ）及びＡＴＣＣ１３８６９_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）菌株は、２０１９年３月１４日付でブダペスト条約下の寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に菌株名 「ＣＡ０２－９２１６」及び「ＣＡ０２－９２１７」として国際寄託し、「ＫＣＣＭ１２４５８Ｐ」及び「ＫＣＣＭ１２４５９Ｐ」の寄託番号を付与された。
実施例６．調味素材製品の製造のための発酵組成物の製造
前記のように、ＨｉｓＧ活性を強化した菌株がＬ－グルタミン酸の生成能にほとんど影響を与えずにグリシンの生成能が増加されることを確認した。したがって、本出願のＨｉｓＧ活性強化コリネバクテリウム属微生物を用いた発酵組成物を製造した。
例示的に、基本的によく知られている調味料素材であるグルタミン酸を主成分として製造し、豊かな味の構成を高めるために、他の調味料素材の副産物成分を増加させるために、発酵菌株及び発酵過程を調節した。
前記のＨｉｓＥＧプロモーター変異とＨｉｓＧフィードバック阻害の解除を含んでいる前記変異２つをすべて含む菌株を用いて、５Ｌ発酵槽を用いた発酵組成物を製造した。
培養培地の製造に用いられた成分はすべて食品等級に該当する成分だけを用いた。
１次種培地：グルコース１％、酵母抽出物１％、ペプトン１％、硫酸アンモニウム０．１％、塩化ナトリウム０．２５％、リン酸第１カリウム0.１５％、リン酸第２カリウム０．１５％を含有して、ｐＨが８．０である１次種培地を製造した。
２次種培地：純度９８．５％のオーガニック粗糖４．６％、硫酸マグネシウム０．０５％、酵母抽出物０．５％、リン酸第１カリウム０．２％、硫酸鉄０．００２％、ビオチン１ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩２ｍｇ／Ｌ及びわずかの消泡剤を含有し、ｐＨが７．２である２次種培地を製造した。
発酵培地：純度９８．５％のオーガニック粗糖４％、硫酸マグネシウム０．０３％、酵母抽出物１％、リン酸０．２２％、水酸化カリウム０．４％、ビオチン０．２ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩０．６ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン０．００２％、硫酸鉄０．００２％、硫酸亜鉛０．００２％、硫酸銅０．０００６％及びわずかの消泡剤を含有し、ｐＨが７．４である発酵培地を製造した。
前記１次種培地５０ｍｌを５００ｍｌ容量の振とう用三角フラスコに分注し、１２１℃で２０分間加圧殺菌して冷却した後、前記菌株をそれぞれ接種し、回転数２００回／分、温度３０℃で５～７時間振とう培養した。
前記２次種培地を１．５Ｌ容量の試験発酵槽に０．２５Ｌ調製して、１２１℃で ２０分間加圧殺菌して冷却させた後、前記１次種培養液を５０ ｍｌ接種した後、回転数９００回／分、３１．５℃で１５時間培養した。
前記発酵培地を５Ｌ容量の試験発酵槽に０．２５Ｌ調製して、１２１℃で２０分間加圧殺菌して冷却させた後、前記２次種培養液０．２６Ｌを接種した後、回転数９００回／分、３０～３４℃で培養した。
前記条件で培養しながら前記コリネバクテリウム・グルタミカムの培養中発酵液のｐＨが７．０～７．４の範囲になるように２８％アンモニア水を用い、続けて調節した。培養中の残糖の濃度が０．５～１．５％になると殺菌されたオーガニック粗糖を随時投入して添加された糖の合計が発酵液量に比べて、３０～３４％になるまで続けて培養した。
Figure 0007125477000004
 その結果、前記表４に示すように、両菌株間のグルタミン酸の生産量はあまり差がなく、変異が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ/ Ｔ２３５Ｑ）_Ｐｒｏ（３ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ菌株が生産した発酵液内のグリシンの含量が著しく増加することを確認した。
３ｋＬ発酵槽を用いた発酵組成物の場合にも、両菌株間のグルタミン酸の生産量はあまり差がなく、変異が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ/ Ｔ２３５Ｑ）_Ｐｒｏ（３ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ 菌株はＫＦＣＣ１１０７４菌株に比べて、グルタミン酸の生産量に大きな差がないのに（６４．２ｇ／Ｌ ｖｓ ７３ｇ／Ｌ）グリシンの含量が著しく増加（０．２ｇ／Ｌ vs ３．２ｇ／Ｌ）したことを確認した。
以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者は、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、制限的なものではないものと理解しなければならない。本出願の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Figure 0007125477000005
Figure 0007125477000006

Claims (1)

  1. グリシンを製造するための組成物であって、ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ（ATPphosphoribosyltransferase：ＨｉｓＧ）の活性が強化されたコリネバクテリウム・グルタミカムを含有する、組成物。

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