KR101492134B1 - 코리네형 세균 유래 ｓｏｄ 유전자의 프로모터 변이체 및 상기 프로모터 변이체를 이용한 Ｌ-라이신의 생산 방법 - Google Patents

코리네형 세균 유래 ｓｏｄ 유전자의 프로모터 변이체 및 상기 프로모터 변이체를 이용한 Ｌ-라이신의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 코리네형 세균 유래의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)를 코딩하는 유전자(sod 유전자)의 프로모터 변이체, 상기 프로모터 변이체를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 및 상기 숙주세포를 이용하여 배양하는 단계를 포함하는 L-라이신의 발효 생산방법에 관한 것으로, 상기 sod 유전자의 프로모터 변이체가 삽입된 숙주세포를 이용하여, 모균주보다 아미노산의 생합성을 강화시킴으로써, L-라이신과 같은 아미노산의 발효 생산증대 효과를 갖는다.

Description

코리네형 세균 유래 ｓｏｄ 유전자의 프로모터 변이체 및 상기 프로모터 변이체를 이용한 Ｌ-라이신의 생산 방법{Promoter variant of sod gene derived from coryneform bacteria and method for producing L-lysine using the promoter variant}
본 발명은 코리네형 세균 유래 sod 유전자의 프로모터 변이체 및 상기 프로모터 변이체를 이용한 L-라이신의 생산 방법 및 상기 프로모터 변이체를 이용한 L-라이신의 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 코리네형 세균 유래의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)를 코딩하는 유전자(이하, "sod 유전자"라 한다)의 프로모터 변이체, 상기 프로모터 변이체를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 및 상기 숙주세포를 이용하여 배양하는 단계를 포함하는 L-라이신의 생산방법에 관한 것이다.
코리네형 세균은 그람 양성균이며, 높은 GC 함량을 갖는다. C. glutamicum은 1957년에 토양에서 분리되었는데, 바이오틴 제한(biotin limitation) 방법에 의해 글루타메이트를 생산하는 특징을 보이고, 세포분열시 굽어지는 특징을 가지고 있으며 포자를 형성하지 못하는 균으로 알려져 있다.
상기 코리네형 세균은 대표적으로 널리 이용되는 산업용 균으로 적절한 배양조건에서 대사산물을 많은 양으로 분비할 수 있는 능력을 지니고 있기 때문에,L-라이신, L-아르기닌, L-트레오닌 등의 다양한 아미노산 및 핵산 등의 생산에 유용하게 이용되고 있다.
그 중, L-라이신은 사람이나 동물의 체내에서 합성되지 않는 필수 아미노산으로서, 식품, 의약 그리고 사료첨가용으로 사용되고 있다. 이처럼 L-라이신을 산업적으로 생산하는 것이 경제적으로 중요한 사업공정이므로, L-라이신 생산 효율을 증대하기 위한 다양한 방법이 연구되어 왔다.
50년대 이후 L-라이신의 생합성 경로가 연구된 이래 현재 대부분이 코리네박테리움 속(Corynebacteriun sp.)과 브레비박테리움 속(Brevibacterium sp.)를 이용한 발효에 의해 생산되고, 이후 꾸준히 L-라이신의 생산량이 증대되고 있으며, 세계적으로 L-라이신의 시장은 매년 5% 이상 증가하고 있다 (Kalinowski et al.,2003. J Biotechnol 104: 5-25, Patek et al.1994. Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140).
코리네형 세균 균주를 이용하여 L-라이신의 생산을 증대시키기 위하여 고전적인 돌연변이(classical mutagenesis)를 통해 돌연변이 균주를 얻거나 발효조건들을 개선하고 있으며, 유전공학을 통한 L-라이신 생합성 경로 관련 유전자의 증폭, 다른 경로의 유전자 결실 등의 방법이 이용되었으며(유럽공개특허 제0733710호1), 한국공개특허 제2010-20140호, 제2008-8620호 및 제2008-10073호에 따르면, L-라이라이신 생산에 관련된 유전자인 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제, 아스파테이트키나제, 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제의 프로모터를 변형시켜 그 유전자의 발현을 증대시키는 방법이 이용되었다.
SOD(superoxide dismutase, Gene ID:1020869)는 슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical)을 O2와 H2O2로 디스뮤테이션을 촉매하는 효소로 알려져 있으며, 상기 효소는 조효소(cofactor)에 따라 Cu/Zn SOD, Fe SOD, Mn SOD와 Ni SOD 등이 알려져 있으며, 세균에서 발견되는 SOD는 Mn SOD와 Fe SOD가 대부분으로 세포질에 존재하는 것으로 알려져 있다 (Tainer and Getzoff, 1983. Nature 306:284-287).
이에 반하여, 병원성 세균의 경우는 숙주의 ROS 공격에 대한 방어 및 공격과 관련하여 Cu/Zn SOD 효소로 주로 주변 세포질(periplasm)에 존재하는 것으로 알려져 있다. 즉, Cu/Zn SOD는 진핵세포와 병원성 및 인체 내부 공생 세균에서 발견되는데 반하여, Fe/Mn SOD는 원핵세포, 원생생물, 미토콘드리아에서 확인된다 (Borgstahl et al., 1992 Cell 71:107-118). 이외에도 Ni-hooked SOD (Barondeau et al., 2004 Biochem. 43(25):8038-8047)와 설페이트 환원 세균인 Desulfo vibrio에서 non-classical SODs 등이 보고되었다 (Silva et al., 1999 Eur.J.Biochem.259:235).
Escherichia coli의 SOD는 2개의 이소자임(isoenzyme)으로 호기성/혐기성 상태에서는 Fe SOD가, 그리고 호기적 상태 하에서는 Mn SOD 만이 나타난다고 보고되었고(Hassen and Fridovich. 1977 Fed. Proc. 36:715), SOD 유전자 조절에 fur(ferric uptake regulation)등이 관여 한다고 알려져 있다 (Tardat and Touati, 1993 Mol Microbiol. 9(1)53-63).
세균에 있어서, 산화성 스트레스(oxidative stress)와 관련된 SOD 연구는 E.coli 이후 Lactococcus lactis (Sanders et al., 1995 J. Bacteriol. 177:5254-5260), Vibrio species (Kimoto et al., 2001 Microbiol.Immunol.45:135-142), Porphyromonas gingivalis (Ohara et al., 2006 Microbiology. 152:955-966), Corynebacterium melassecola (Merkamm and Guyonvarch, 2001 J. Bacteriol. 183(4):1284), Corynebacterium glutamicum (Shafey et al., 2008 Microbiol. Res. 163:80-86), Staphylococcus aureus (2009 J. Bacteriol. 191(10):3301), Helicobacter pylori (2009 J. Agric. Food Chem., 57(17):7743) 등이 보고되었다.
이들 중, SOD 발현에 관한 레귤레이터에 대한 연구까지 알려진 경우도 있지만, 대부분의 균종에 있어서는 SOD 효소 정제 및 효소특성의 연구 단계에 있다. 하지만, 이 유전자 발현 제어에 중요한 역할을 하는 프로모터에 대한 연구가 아직 미비하고, 이 유전자의 프로모터 영역을 예측하고 이 프로모터 개량에 관한 연구결과는 아직 보고된 바가 없다.
본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 한계를 해결하기 위하여 연구를 수행하던 중, 코리네형 세균 유래 sod 유전자의 프로모터 부위를 결정하고, 상기 프로모터 부위를 변이시킨 프로모터 변이체를 통하여 프로모터의 활성을 측정한 결과, 내재적 활성보다 증가된 신규한 sod 유전자 프로모터 변이체를 제공할 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 신규한 코리네형 세균 유래 sod 유전자의 프로모터 변이체를 제공하고, 상기 프로모터 변이체의 증가된 활성을 이용하여 L-라이신 등과 같은 아미노산을 대량 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 코리네형 세균 유래의 SOD를 코딩하는 유전자(sod 유전자)의 프로모터 변이체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프로모터 변이체를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 숙주세포를 이용하여 배양하는 단계를 포함하는 아미노산의 생산방법을 제공한다.
본 발명에 의한 코리네형 세균 유래 sod 유전자의 프로모터 변이체는, 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자(ddh 유전자), 아스파르토키나아제를 코딩하는 유전자(ask 유전자), 트랜스케톨라제를 코딩하는 유전자(tkt 유전자), 디하이드로피콜레이트 씬타아제를 코딩하는 유전자(dapA 유전자), 디하이드로피콜레이트 리덕타아제를 코딩하는 유전자(dapB 유전자), 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자(lysA 유전자), 아스파르트 세미알데하이드를 코딩하는 유전자(asd 유전자), 아스파테이트 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자(aspB 유전자), 글루코즈 6-포스페이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자(zwf 유전자), 포스페이트 글루코네이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자(gnd 유전자), 프럭토오즈 비스포스파타아제를 코딩하는 유전자(fbp 유전자), 피루베이트 카르복실라아제를 코딩하는 유전자(pycA 유전자)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 목적 유전자의 코딩 서열과 작동 가능하게 연결됨으로써, 발현되는 효소의 활성이 증가될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 sod 유전자의 프로모터 변이체가 삽입된 숙주세포를 이용하여, 모균주보다 L-라이신과 같은 아미노산의 생합성을 과발현시킴으로써, L-라이신과 같은 아미노산의 생산증대 효과를 갖는다.
도 1은 sod 유전자의 프로모터의 영역을 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명에 사용된 벡터의 기본구조인 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pK19mobsacB를 나타내는 도면이다.
도 3은 코리네박테리움 염기치환용 벡터 pCGDH를 나타내는 도면이다.
본 발명에서 "프로모터"라는 용어는, 폴리머라아제에 대한 결합부위를 포함하고 프로모터 다운스트림 (downstream) 유전자의 mRNA로의 전사개시 활성을 갖는, 코딩 영역의 상위(upstream)의 비해독된 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
또한, 본 발명에서 "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는, 프로모터 활성을 갖는 핵산 서열이 ddh 유전자 및 다른 효소 등을 코딩하는 유전자의 전사 개시 및 프로모터 서열과 유전자 서열의 기능적 연결, 즉 발현이 필요한 유전자와 이의 조절 서열이 서로 기능적으로 결합되어 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다.
또한, 본 발명에서 "상동성"이라는 용어는, 두 개의 폴리뉴클레오티드 사이의 동일성의 퍼센트를 의미하는 것으로서, 서열 정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬함으로써 상동성을 결정할 수 있다.
또한, 본 발명에서 "벡터"라는 용어는, 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제조물을 뜻한다. 상기에서 "조절요소"는 전사를 수행하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
또한, 본 발명에서 "숙주세포"라는 용어는, 벡터가 숙주세포에 형질전환됨으로서 숙주세포 내에서 다양한 유전적 또는 분자적 영향을 미치게 되는 세포를 의미한다.
또한, 본 발명에서 "형질전환"이라는 용어는, DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외의 인자로서 또는 염색체로의 삽입에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.
본 발명의 일 태양은, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 코리네형 세균 유래 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)를 코딩하는 유전자(sod 유전자)의 프로모터 변이체에 관한 것이다.
본 발명에 의한 상기 프로모터 변이체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 sod 유전자의 프로모터 변이체일 수 있다.
원핵생물에서의 프로모터는 RNA 중합효소가 결합하는 전사시점 근처의 결합부위로 정의되며, 전사시작 지점으로부터 앞쪽으로 -10, -35 부위의 염기쌍이 떨어져 있는 두 개의 짧은 염기서열로 구성되어 있는데, 본 발명의 SOD 프로모터 변이체는 자연형 프로모터 (wild type)보다 높은 활성을 가지도록 개량된 것으로서, 상기 -35에서 -10 부위 안에서 변이시킴으로써 다운 스트림 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다.
상기 프로모터 변이체는 다운 스트림 목적 유전자의 발현 증가를 위하여, 그 유전자의 자연형 프로모터와 함께 사용될 수 있으며, 포함되는 서열의 길이 및 종류는 필요에 따라 조절될 수 있다.
또한, 본 발명의 프로모터 변이체는 자연형 프로모터에 비해 활성이 증가된 프로모터 활성을 가짐으로써, 목적에 적합하게 프로모터의 기능을 개선시킬 수 있는데, 상기 변이는 다양한 방법에 의해 이루어질 수 있으며, 그 예는 부위-지정 돌연변이(site-directed mutagenesis), 에러유발 PCR(error-prone PCR), DNA 셔플링 방법((DNA shuffling) 등이 있다.
보다 구체적인 양태로서, 본 발명에 따른 프로모터 변이체는, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 단편일 수 있다.
보다 바람직하게는, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 서열로 구성되는 DNA 단편일 수 있다
또한, 본 발명의 프로모터 변이체는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 삽입 및 결실 변이체 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
상기 치환, 결실 또는 삽입의 임의의 조합은 구성요소의 기능이 온전히 동일하게 남아 있도록 유도될 수 있는데, 본 발명에 따른 프로모터 변이체는 DNA 단편이 상기 서열번호 1, 2, 3 또는 4로 표시되는 DNA 단편에 적어도 95% 이상의 상동성을 가지는 DNA 단편일 수 있다.
본 발명의 다른 태양은, 상기 프로모터 변이체를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명에 이용되는 벡터는 코리네형 세균 뿐만 아니라, 적합한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주세포의 게놈과 무관하게 복제 가능하거나 게놈 그 자체에 봉합될 수 있다. 이 때 상기 적합한 숙주세포는 벡터가 복제가능한 것으로서, 복제가 개시되는 특정 핵산서열인 복제 원점을 포함할 수 있다.
벡터로 사용되는 플라스미드는 숙주 내에 삽입 후에 선별될 수 있는 마커를 가지고 있으며, 바람직하게는 플라스미드 pK19mobsacB를 XbaI와 EcoRI 제한효소를 이용하여 절단한 뒤, 프로모터 돌연변이 서열을 삽입시켜 벡터를 제조할 수 있다.
본 발명에 의한 벡터는 일반적 기능을 수행하도록 구조 유전자의 N-말단 서열의 서로 다른 변이체가 있는 부분을 포함하는 프로모터 변이체 핵산 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결될 수 있는데, 상기 재조합 벡터와의 연결은 잘 알려진 기술분야로서, 유전자 재조합 기술을 이용하며, DNA절단 및 연결은 일반적으로 잘 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 재조합 벡터는 선택 마커(selection marker)를 포함할 수 있는데, 상기 선택 마커는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 선별하기 위한 것으로서, 상기 선택 마커가 처리된 배지에서 선택 마커를 발현하는 세포만 생존할 수 있기 때문에, 형질전환된 세포의 선별이 가능하다. 상기 선택 마커의 대표적인 예로서 카나마이신, 스트렙토마이신, 클로람페니콜 등이 있으며, 본 발명에서는 카나마이신을 사용할 수 있다.
본 발명에 의한 재조합 벡터는 상기 프로모터 변이체가 목적 유전자의 코딩 서열과 작동 가능하게 연결된 것일 수 있는데, 상기 목적 유전자로는 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제를 코딩하는 ddh 유전자, 아스파르토키나아제를 코딩하는 ask 유전자, 트랜스케톨라제를 코딩하는 tkt 유전자, 디하이드로피콜레이트 씬타아제를 코딩하는 dapA 유전자, 디하이드로피콜레이트 리덕타아제를 코딩하는 dapB 유전자, 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제를 코딩하는 lysA 유전자, 아스파르트 세미알데하이드를 코딩하는 asd 유전자, 아스파테이트 트랜스아미나아제를 코딩하는 aspB 유전자, 글루코즈 6-포스페이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 zwf 유전자, 포스페이트 글루코네이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 gnd 유전자, 프럭토오즈 비스포스파타아제를 코딩하는 fbp 유전자, 피루베이트 카르복실라아제를 코딩하는 pycA 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 ddh 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 Gene ID:3344238이고, ask 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 Gene ID:3345161이며, tkt 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 Gene ID:3343601이고, dapA 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 Gene ID: 3345490이며, dapB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 Gene ID: 3345049이고, lysA 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 Gene ID: 3344931이며, asd 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 Gene ID: 3345564이며, aspB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 Gene ID: 3343262이고, zwf 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 Gene ID: 3345621이며, gnd 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 Gene ID: 3344993이고, fbp 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 Gene ID: 3345276이며, pycA의 뉴클레오타이드 서열은 Gene ID: 3344537이다.
본 발명의 또 다른 태양은, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 숙주세포로는 코리네형 세균, 즉 코리네 박테리움 (Co-rynebacterium) 속 또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속의 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰, 보다 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, 또는 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 유래의 L-아미노산 생산 돌연변이체, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10065일 수 있다.
또한, 상기 숙주세포는 예를 들면, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰과 다른 코리네박테리움속 균주인 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum), 및 이들로부터 제조된 L-아미노산 생산 돌연변이체일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 형질전환된 숙주세포는 상기 프로모터 변이체가 염색체내에 상동 재조합으로 삽입될 수 있다. 상동 재조합 방법으로는 유전자를 녹-아웃(knock-out)하거나 도입하는 유전학적 기법으로서, 상기 방법을 이용하여 변이된 프로모터 부위를 숙주세포에서 사용할 수 있게 제작된 것일 수 있다. 보다 구체적으로는 프로모터 활성을 증진시키도록 제작한 프로모터 변이체 서열을 ddh 유전자, ask 유전자, tkt 유전자 등과 같은 상기 코리네박테리움 글루타미쿰의 목적 유전자의 프로모터 부위를 상동 재조합의 방법으로 대체할 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양은, 상기 형질전환된 숙주세포를 이용하여 배양하는 단계를 포함하는 아미노산의 생산방법에 관한 것이다.
상기 아미노산으로는 L-라이신, L-트레오닌, L-메티오닌 등을 들 수 있으나, L-라이신이 바람직하다.
상기한 바와 같은 형질전환된 숙주세포(형질전환체)의 배양은 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 통상적인 방법에 따라 실시될 수 있다. 이들 공지된 배양 방법은 문헌[Chmiel, (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991);및 Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))에 기술되어 있다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 균주에 대한 배양배지는 공지되어 있다(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981).
사용될 수 있는 당원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원도 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다.
사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 또한, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다.
배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 원하는 표적 물질의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
본 실시예에서는 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutases; SOD, EC 1.15.1.1)의 프로모터의 영역부위를 확인하기 위하여 프로모터 예측 프로그램을 사용하고, 다양한 sod 프로모터 변이체의 활성(strength)을 확인하기 위하여, L-라이신 합성에 관련된 유전자에 작동 가능하게 연결될 수 있는 형질전환체를 제작하였고, 코리네박테리아 클루타미쿰 균주에 상동 재조합을 통한 치환방법으로 개량 균주를 얻었다.
< 실시예 1> 코리네형 세균 유래 SOD 유전자의 프로모터 확보 및 염기서열 분석
1. sod 프로모터 영역 지정과 결정
본 실시예에서는 C. glutamicum ATCC 13032의 게놈 중, MsrA(EC.1.8.4.11) 유전자와 SodA (EC.1.15.1.1.) 유전자 사이의 부위를 정방향 프라이머(서열번호 5: 5'-GGGATCCTC GAAGGATC GTA AACAACCTCCAC-3'와 역방향 프라이머(서열번호 6: 5'-GGATCCTCCTTTCGTA GGTTTCCGCACC GAG-3'를 사용하여 PCR로 증폭시켜 pGEM-T 벡터 (Promega Corporation, Madison, WI. Cat. No. A1360) 내로 클로닝한 후, DNA 염기서열 분석을 실시하여 sod 유전자의 프로모터로 결정하였다.
SOD 프로모터에 해당하는 DNA 염기서열을 PROBABS와 PROMOSCAN 프로그램으로 컴퓨터 기반 분석(computer-based analysis)을 실시한 결과를 도 1의 SOD 프로모터의 영역으로 나타내었다.
2. sod 프로모터의 부위 지정과 전사시작 부위 확인
코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum ) SOD 유전자 발현에 관여하는 프로모터 부위를 computer-aided program 을 통해 putative -10과 -35 부위가 확인되었다.
상기 프로모터의 전사시작 부위를 확인하기 위하여, C. glutamicum ATCC 13032로부터 Trizol™ 용액(Invitrogen사)을 시약 제조사의 방법에 따라 total RNA를 분리하였다. 다만 상기 Trizol™ 처리시 글래스 비드 (≥100㎛)를 가하여 4℃에서 3초 on/5초 off 조건으로 비드 비터(bead beatter)로 3회 처리하여 세포 용해를 유도하였다. 이때 5'-Full RACE PCR에 사용한 프라이머와 각 프라이머의 뉴클레오타이드 서열을 사용하였다.
간략히 설명하면, 분리한 세균 RNA에 C. glutamicum SOD 특이 프라이머 (RI)를 이용하면 먼저 1st cDNA를 역전사 효소로 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 75℃에서 5분간 열처리하였다.
다음에 주형 RNA를 RNase 처리로 분해하였다. 이를 주형으로 하여 제작한 프라이머 세트로 SOD 의 비번역 부위(untranslated region)를 PCR로 증폭한 다음 클로닝한 후, DNA 서열분석을 통하여 SOD 유전자의 전사개시 부위를 최종 확인하였다.
< 실시예 2> 변이 프로모터 삽입용 재조합 벡터의 제작
프로모터 야생형 프로모터는 C. glutamicum ATCC13032 균주를 주형으로 히여 SOD 프로모터 부위로 인식되어진 약 300 bp의 크기를 사용하였고, SOD의 프로모터 변이체는 이미 Bioneer사에 의해 합성되어진 플라스미드를 주형으로 하여 하기 표 1의 pCGDH 정방향 프라이머(서열번호 7) 및 pCGDH 역방향 프라이머(서열번호 8)로 PCR을 수행하여 단편을 수득하였다.
상기 프로모터에 작동 가능하게 디아미노피멀레이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자(ddh 유전자)를 연결하고, 오버랩 PCR을 수행하여 PCR 단편을 수득하였다.
클로닝 작업을 위하여 XbaI과 EcoRI으로 제한효소 처리하였고, pK19mobsacB 벡터Schafer A, et al. 1994 Gene 145: 69-73)에 동일한 XbaI과 EcoRI을 이용하여 제한효소로 소화시켜 PCR 정제 키트(퀴아젠 (Qiagen), Hilden, Germany)로 정제한 후 T4 DNA 리가제를 이용하여 클로닝하고, E. coli DH5a (RBC Bioscience, Taiwan Cat. No. RH618. Hanahan, D. 1983 J . Mol. Biol. 166:557-580) 에 형질전환시켰다.
플라스미드 함유 세포의 선택은 카나마이신 (50㎍/ml)이 포함되어진 LB (Luria-Bertani) 아가 플레이트에 도말하고, 37℃에서 16시간 정치하였다. 생성된 콜로니들의 플라스미드 확인은 plasmid miniprep kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 추출하였고, 클로닝에 사용되어진 XbaI 및 EcoRI 제한 효소로 처리하여 유전자의 단편을 확인하고 최종 그 유전자의 염기서열 분석을 확인하였다.
이렇게 생성된 플라스미드는 "pCGDH"라고 명명하였다(서열번호 1). 상기 pCGDH을 주형으로 다양한 sod 프로모터 변이체를 위한 프라이머를 이용하여 Quick-change site directed mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA) 시스템으로 변이 도입을 수행하였다.
상기 sod 프로모터 변이체를 위한 프라이머는 하기 표 1에서 보는 바와 같이, SDm1은 서열번호 9, 10을, SDm2는 서열번호 11, 12를 각각 사용하였으며, SDm3는 서열번호 13, 14를 사용하였다.
각 프라이머 125 ng을 사용하고, PfuUltra DNA 중합효소를 첨가하여 95℃에서 1분 동안 예열 단계를 거친 후, 18 사이클을 수행하였다. 각 사이클은 95℃에서 50초 동안 변성, 60℃에서 50초 동안 풀림, 68℃에서 약 4분 동안 신장 단계로 이루어지고, 마지막 사이클은 68℃에서 7분간 신장 단계를 수행하였다.
PCR을 수행하고 DpnI 효소처리 후, XL10-Gold 대장균 세포에 형질전환시킨 다음, 카나마이신 (50㎍/ml)이 포함되어진 LB (Luria-Bertani) 아가 플레이트에 도말하여 37℃에서 16시간 정치하여 얻어진 sod 프로모터 변이 클론들을 각각 "SDm1", "SDm2" 및 "SDm3"라고 명명하였다. 선택된 콜로니들의 변이발생 유무는 최종 DNA 시퀀싱을 통하여 확인하였다.
sod 프로모터 변이체를 위한 프라이머
프라이머 염기서열 서열번호
pCGDH(정방향) CGT CTA GAC TGC AGC TTT AAG CGC CTC ATCAGC GG 7
pCGDH(역방향) CGC GAA TTC TTG CTT CGT CGA TGA AGT TGAC 8
SDm1(정방향) TAGGTCGGCTGAAAAATCCCGTTGCAATATCAACAA 9
SDm1(역방향) TTGTTGATATTGCAACGGGATTTTTCAGCCGACCTA 10
SDm2(정방향) ATCAACAAAAAGGTGTATAATGGGGAGGTGTCGCA 11
SDm2(역방향) TGCGACACCTCCCCATTATACACCTTTTTGTTGAT 12
SDm3(정방향) ATATCAACAAAAAGGTGTACAATTGGGAGGTGTCGC 13
SDm3(역방향) GCGACACCTCCCAATTGTACACCTTTTTGTTGATAT 14
<실시예 3> 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 내로의 삽입 및 효소활성 측정
본 실시예에서는 코리네박테리움의 프로모터 변이체가 삽입되어 있는 상기 기 벡터를 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰을 형질전환시키고 상동 재조합을 통해 치환시킴으로써, 변이 유전자를 삽입시켰다.
1. 형질 전환
상기 pK19mobsacB 벡터에 프로모터 변이 도입이 확인된 클론을 C. glutamicum에 형질전환하기 위하여 C. glutamicum KFCC10065를 수용성 세포(competent cell)로 제작하였다.
10ml CM-broth 배지[포도당 10 g, 폴리펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, NaCl 2.5 g, Urea 2 g (증류수 1리터 기준), pH 7.0]에서 30℃의 온도로 밤새 배양하였다. 상기 전배양된 세포는 100ml의 BHIS 배지[BHI 37 g, 2M 소르비톨 250ml (증류수 1L 기준)]에 OD(600nm)가 0.2-0.3이 되도록 접종하여 30℃에서 200 rpm으로 OD(600nm)가 0.8-0.9이 될 때까지 6시간 동안 배양하였다.
배양액은 전처리된 튜브(prechilled tube)에 넣고 4℃에서 5000 rpm에 3-4번 10% 글리세롤로 반복적으로 세정하여 세포를 회수하고, 이 세포는 10% 글리세롤로 현탁시켜 100 ㎕씩 분주하여 -70℃에서 보관하면서 사용하였다.
상기 수용성 세포를 이용하여 제작된 구축물을 electorporation 0.2cm cuvette을 이용하여 BIO-RAD사의 펄서(2.5kv, 25 ㎌, 200Ω)로 형질전환시켰다. 그 후, CM-broth 배지 1ml을 첨가한 후에 바로 46℃에서 6분 동안 예열(pre-warmming)하고 200 rpm , 30℃에서 2 시간 동안 진탕배양을 한 후, 카나마이신 (25㎍/ml)이 포함되어진 BHIS (Brain Heart Infusion) 아가 플레이트에 도말하고, 30℃에서 32시간 동안 정치하였다.
상기 생성된 콜로니들은 2차 재조합에 이용하기 위해 200 ㎕ BHIS 배지에 접종하고 30℃에서 200rpm으로 밤새 배양하고, 그 배양액을 1:1000으로 희석하여 10% 수크로오즈 (Jager, et al., 1992. J Bacteriol. 174:5462)가 포함된 CM 아가 플레이트에 도말하고, 30℃에서 72시간 동안 정치한 후 생성된 콜로니를 다시 카나마이신의 내성이 없는지 확인한 후, PCR로 확인하고 DNA 시퀀싱으로 최종 확인하였다.
2. 효소활성 측정
선별된 콜로니들을 활성화시켜 10ml CM 배지에 1 루프 접종하여 30℃, 16 시간, 180 rpm의 조건으로 진탕 배양하였다. 10ml CM 배지에서 진탕된 세포 1 ml을 접종하고 30℃, 180 rpm에서 96시간 동안 진탕배양하였다.
배양된 세포를 원심분리 (3,660g, 15분, 4℃)를 통하여 균체를 수거하고 50 mM 인산칼륨 버퍼 (pH 7.5) 5 ml로 3회 세척한 후, 동일한 버퍼를 사용하여 2.5 ml로 재현탁하고, 현탁액 1㎖당 1.25g의 글래스 비드를 넣어 비드 비터(mini-beadbeater, Biospec Products, OK,USA)를 30초씩 이용하고, 얼음에 3분 동안 정치시키는 과정을 10회 반복하여 균체를 파쇄하였다.
원심분리(10,000g, 30분, 4℃)를 통하여 상층액을 수거하고 브래드 포드 방법(Anal. Biochem. 1976. 72:248-254, BIO-RAD LABORATORIES. 1985)을 이용하여 단백질을 정량한 후, 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제 (ddh) 효소활성을 측정하기 위하여 조단백질 용액으로 사용하였다. 상기 효소활성의 측정은 0.2 M Glycine/NaOH (pH 10.5), 2 mM NADP, 4 mM 메조디아미 노피멜레이트(meso-DAP)를 포함하고 있는 반응액과 약 0.01 ml의 조단백질 용액을 혼합하여 총 부피가 1ml이 되도록 하여 반응을 개시한 후, 상온에서 5분간 반응시키고 340 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제 효소활성 단위는 1분간 1 mg의 단백질이 환원시킨 NADPH mmole로 정의하였다.
측정 결과, 하기 표 2에서 보는 바와 같이, 코리네박테움 글루타미쿰 10065-SDm2는 코리네박테움 글루타미쿰 10065-SDwt(야생형 sod 프로모터를 삽입한 균주)보다 약 2.5배 증가된 것이 확인되었다. 또한 코리네박테움 글루타미쿰 10065-SDm1은 코리네박테움 글루타미쿰 10065-SDwt보다 1.5 배가 증가되었고 코리네박테움 글루타미쿰 10065-SDm3은 코리네박테움 글루타미쿰 10065-SDwt보다는 1.7배 증가된 것이 확인되었다.
효소활성 측정 결과
균주 Specific activity (UNIT) PESDmutant/PESDwt
10065-SDwt 10.9 1
10065-SDm1 16.4 1.5
10065-SDm2 27.3 2.5
10065-SDm3 18.5 1.7
< 실시예 4> 형질전환된 숙주세포를 이용한 L-라이신 생산
코리네박테리움 글루타미쿰 10065 균주 및 실시예3 에서 제조한 프로모터 변이체로 형질전환된 개량 균주의 L-라이신 생산을 위해 아래와 같이 배양하였다.
CM 배지[포도당 10 g, 폴리펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, NaCl 2.5 g, Urea 2 g (증류수 1리터 기준), pH 7.0]를 10 ml 함유한 100ml 플라스크에 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 10065와 코리네박테리움 글루타미쿰 SDm1, 코리네박테리움 글루타미쿰 SDm2, 및 코리네박테리움 글루타미쿰 SDm3 균주를 각각 접종하고, 30℃에서 16시간, 180 rpm의 조건으로 진탕배양하였다.
100 ml 플라스크에 하기의 L-라이신 배지를 10 ml 첨가하여 CM 배지에서 진탕 배양된 세포 1 ml을 접종하고, 30℃, 180 rpm, 96시간의 조건으로 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 L-라이신의 생산량을 측정은 RI 디텍터를 이용하여 HPLC (LC-20AD Shimazu, Japan) (Hill DW et al., 1979. Anal Chem 51:1338)로 분석하였다. 컬럼은 Ionospher 5C column (100×3.0 mm; Chrompack, Engstingen, Germany)으로 40℃에서 분석하였고 측정결과를 표 3에 나타내었다.
하기 표 3과 같은 결과에 의해, ddh 활성이 강하게 나타난 코리네박테리움 글루타미쿰 SDm2의 L-라이신 생산량이 모균주보다 10.3% 증가된 것을 알 수 있었고, 야생형 sod 프로모터 균주(코리네박테움 글루타미쿰 10065-SDwt) 보다는 7.2% 증가된 것을 확인하였다
또한, 코리네박테리움 글루타미쿰 SDm1와 코리네박테리움 글루타미쿰 SDm2은 10065-SDwt(야생형 sod 프로모터를 삽입한 균주)보다 4.7% 증가되었고, SDm1과 SDm3은 10065-SDwt 균주보다는 각각 2.2% 및 2.8% 증가된 것을 알 수 있었다.
[L-라이신 배지 조성 (pH 7. 0)]
당밀 16g, 원당 51g, (NH4)2SO4 30g, KH2PO4 1g, MgSO4-7H2O 1g, FeSO4-7H2O 10mg, MnSO4-5H2O 10mg, Thiamine 1mg, Biotin 1mg, CaCO3 5% (증류수 1L 기준)
L-라이신 생산량 측정 결과
균 주 L-라이신 (g/l)
코리네박테리움 글루타미쿰 10065-SDwt 32.0
코리네박테리움 글루타미쿰 10065-SDm1 32.7
코리네박테리움 글루타미쿰 10065-SDm2 33.5
코리네박테리움 글루타미쿰 10065-SDm3 32.9
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 통상의 기술자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명에 의한 코리네형 세균 유래 sod 유전자의 프로모터 변이체는, 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자(ddh 유전자), 아스파르토키나아제를 코딩하는 유전자(ask 유전자), 트랜스케톨라제를 코딩하는 유전자(tkt 유전자), 디하이드로피콜레이트 씬타아제를 코딩하는 유전자(dapA 유전자), 디하이드로피콜레이트 리덕타아제를 코딩하는 유전자(dapB 유전자), 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자(lysA 유전자), 아스파르트 세미알데하이드를 코딩하는 유전자(asd 유전자), 아스파테이트 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자(aspB 유전자), 글루코즈 6-포스페이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자(zwf 유전자), 포스페이트 글루코네이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자(gnd 유전자), 프럭토오즈 비스포스파타아제를 코딩하는 유전자(fbp 유전자), 피루베이트 카르복실라아제를 코딩하는 유전자(pycA 유전자)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 목적 유전자의 코딩 서열과 작동 가능하게 연결됨으로써, 발현되는 효소의 활성이 증가될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 sod 유전자의 프로모터 변이체가 삽입된 숙주세포를 이용하여, 모균주보다 L-라이신과 같은 아미노산의 생합성을 과발현시킴으로써, L-라이신과 같은 아미노산 발효생산 균주개발에 유용하게 사용될 수 있다.
<110> PAIK KWANG INDUSTRIAL CO., Ltd; Kyungpook National University <120> Promoter variant of sod gene derived from coryneform bacteria and method for producing L-lysine using the promoter variant <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOD promotersequesnce(pCGI) <400> 1 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga ttttttaccc 300 300 <210> 2 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOD promoter variant(SDm1) <400> 2 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaatcc cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga ttttttaccc 300 300 <210> 3 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOD promoter variant(SDm2) <400> 3 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggtgtataat ggggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga ttttttaccc 300 300 <210> 4 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOD promoter(SDm3) <400> 4 aagcgcctca tcagcggtaa ccatcacggg ttcgggtgcg aaaaaccatg ccataacagg 60 aatgttcctt tcgaaaattg aggaagcctt atgcccttca accctactta gctgccaatt 120 attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaatcc cgttgcaata 180 tcaacaaaaa ggtgtacaat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga agcgccatct 240 gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tacgaaagga ttttttaccc 300 300 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 gggatcctcg aaggatcgta aacaacctcc ac 32 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 6 ggatcctcct ttcgtaggtt tccgcaccga g 31 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 7 cgtctagact gcagctttaa gcgcctcatc agcgg 35 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 8 cgcgaattct tgcttcgtcg atgaagttga c 31 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 9 taggtcggct gaaaaatccc gttgcaatat caacaa 36 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 10 ttgttgatat tgcaacggga tttttcagcc gaccta 36 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 11 atcaacaaaa aggtgtataa tggggaggtg tcgca 35 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 12 tgcgacacct ccccattata cacctttttg ttgat 35 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 13 atatcaacaa aaaggtgtac aattgggagg tgtcgc 36 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 14 gcgacacctc ccaattgtac acctttttgt tgatat 36

Claims (10)

  1. 서열번호 3으로 이루어진 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 코리네형 세균 유래의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)를 코딩하는 유전자의 프로모터 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 3으로 이루어진 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 프로모터 변이체.
  3. 제1항의 프로모터 변이체를 포함하는 재조합 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 상기 프로모터 변이체가 목적 유전자의 코딩 서열과 작동 가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 목적 유전자가 디아미노피멜레이트 디하이드로게나제를 코딩하는 ddh 유전자, 아스파르토키나아제를 코딩하는 ask 유전자, 트랜스케톨라제를 코딩하는 tkt 유전자, 디하이드로피콜레이트 씬타아제를 코딩하는 유전자(dapA 유전자), 디하이드로피콜레이트 리덕타아제를 코딩하는 유전자(dapB 유전자), 디아미노피멜레이트 디카르복실라아제를 코딩하는 유전자(lysA 유전자), 아스파르트 세미알데하이드를 코딩하는 유전자(asd 유전자), 아스파테이트 트랜스아미나아제를 코딩하는 유전자(aspB 유전자), 글루코즈 6-포스페이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자(zwf 유전자), 포스페이트 글루코네이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자(gnd 유전자), 프럭토오즈 비스포스파타아제를 코딩하는 유전자(fbp 유전자), 피루베이트 카르복실라아제를 코딩하는 유전자(pycA 유전자)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  6. 제3항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 제1항의 프로모터 변이체가 염색체내에 상동 재조합으로 삽입되는 것을 특징으로 하는 미생물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 미생물이 코리네박테리움 속 세균인 것을 특징으로 하는 미생물.
  9. 제6항의 미생물을 이용하여 배양하는 단계를 포함하는 아미노산의 생산방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 아미노산이 L-라이신인 것을 특징으로 하는 아미노산의 생산방법.
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