TW201841656A - Ｋｌｋ５拮抗劑用於治療疾病之用途 - Google Patents

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大衛 B 亞艾
穆萊 希查姆 阿勞歐 伊斯瑪儀
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羅伯特 A 拉蕯路斯
凱利 拉雅特
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Abstract

本文提供治療個體之方法、預測個體之反應及選擇罹患諸如氣喘或內瑟頓氏症候群(Netherton Syndrome)等與KLK5相關之疾病之個體的方法。特定而言，本文提供KLK5拮抗劑之用途，其用於治療或診斷氣喘或內瑟頓氏症候群，該等KLK5拮抗劑係例如抗體或Fc融合多肽以及包含其之醫藥調配物。

Description

KLK5拮抗劑用於治療疾病之用途
本文提供治療個體之方法、預測個體之反應及選擇罹患諸如氣喘或內瑟頓氏症候群(Netherton Syndrome)等與KLK5相關之疾病之個體的方法。特定而言，本文提供KLK5拮抗劑之用途，其用於治療或診斷氣喘或內瑟頓氏症候群，該等KLK5拮抗劑係例如抗體或結合多肽以及包含其之醫藥調配物。
氣喘係與遺傳及環境風險因素二者相關之臨床異質性病症。來自氣喘雙生子研究之遺傳性估計值自35%至80%變化，此指示遺傳風險之重要作用。例如，參見Ullemar等人，Allergy 71, 230-238 (2016)。已針對氣喘及氣喘有關表型實施若干次大規模GWAS，且多個所鑑別之基因座(例如靠近ORMDL3 、 IL13 、 IL1RL1 及TSLP 基因之彼等基因座)已在多個研究群體中確認。例如，參見Bonnelykke等人，Nat Genet 46, 51-55 (2014)。該等研究使疾病之遺傳學基礎及氣喘之病理生理學二者增加，但經由已公開之GWAS鑑別之常見變異體極少涉及總體遺傳風險。此「缺失遺傳性」之概念已深入論述及辯論，且已假定係由於若干因素造成，包括偵測基因-基因相互作用之能力不足、有限之結構變異分析及罕見變異之潛在貢獻。參見 Manolio等人，Nature 461, 747-753 (2009)。揭示常見疾病遺傳易感性之另一策略係經由選擇表型上相似之子組，且已提出，在追求更全面地理解氣喘遺傳結構時此策略將係有用的。參見 Bonnelykke及Ober，J Allergy Clin Immunol 137, 667-679 (2016)。影響氣喘患者總體風險之基因可促成單獨且獨立之生物過程，該等過程一起影響疾病結果。在減少樣品大小的同時經由亞表型分析使研究群體均一化，可揭示在該患者子集中富集之變異體。
已顯示2型發炎之若干種生物標記有效界定其中疾病係由2型發炎驅動之彼等氣喘患者。參見 Wan及Woodruff，Immunol Allergy Clin North Am 36, 547-557 (2016)。自該等生物標記獲得之知識已引至對新穎治療之鑑別，該等新穎治療在罹患2型發炎驅動之疾病之氣喘患者中顯示改良之效能。參見 Corren等人，N Engl J Med 365, 1088-1098 (2011)。然而，圍繞低2型氣喘之知識較為缺乏，且該等患者很可能將佔今後重度氣喘尚未滿足之醫療需求之大部分。例如，參見Arron等人，Clin Immunol 161, 11-22 (2015)。
下游2型生物標記中之一者骨膜素係由支氣管上皮細胞及肺纖維母細胞分泌，且可由Th2細胞介素(包括IL-13)誘導。參見 Takayama等人，J Allergy Clin Immunol 118, 98-104 (2006)。骨膜素對於治療前血清骨膜素含量較高之患者係富含抗IL-13 (萊比克珠單抗(lebrikizumab))臨床反應之預測性生物標記；相反，治療前血清骨膜素含量較低之患者臨床獲益明顯較少。參見 Corren等人，N Engl J Med 365, 1088-1098 (2011)。由於外周骨膜素含量對於界定具有不同治療反應之氣喘亞群有效，因此假定此生物標記亦可將異質性氣喘研究群體分層以增加遺傳研究中之強度。大多數氣喘GWAS專注於氣喘群體，而不考慮2型發炎狀態。
氣喘鑑別特徵在於可逆性氣流阻塞、支氣管高反應性及氣道發炎之廣泛的呼吸有關症狀。氣喘嚴重程度在患者之間差異較大，且患者中之分子異質性已有詳細記錄。業內需要針對氣喘、特定而言伴低程度之2型氣道發炎之中度-重度氣喘之改良治療。
本文提供治療個體氣喘之方法，其包括向該個體投與有效量之KLK5拮抗劑。
本文進一步提供預測罹患氣喘之個體對包含KLK5拮抗劑之治療之反應的方法，該方法包括(a) 量測來自該個體之生物樣品中之KLK5含量，(b) 將該樣品中所偵測到之KLK5含量與參考含量進行比較，及(c) 當該樣品中所量測之KLK5含量與參考含量相比升高時，預測該個體將對治療有反應，且當該樣品中所量測之KLK5含量與參考含量相比降低時，預測該個體將對治療無反應。
本文進一步提供選擇罹患氣喘之個體進行包含KLK5拮抗劑之治療之方法，其包括確定來自該個體之生物樣品中位於KLK5基因體序列中之遺傳變異存在或不存在，其中該遺傳變異之存在指示該個體適於用KLK5拮抗劑治療。
本文進一步提供偵測指示罹患氣喘之個體適於用KLK5拮抗劑治療之KLK5基因體序列中之遺傳變異存在或不存在之方法，其包括(a) 使來自該個體之樣品與能夠偵測位於KLK5基因體序列中之該遺傳變異存在或不存在之試劑接觸；及(b) 確定該遺傳變異存在或不存在，其中該遺傳變異之存在指示該個體適於用KLK5拮抗劑治療。
在該等方法中之任一者之一些實施例中，氣喘與升高含量之KLK5相關。在該等方法中之任一者之一些實施例中，氣喘與升高含量之嗜中性白血球相關。在該等方法中之任一者之一些實施例中，氣喘係選自由以下組成之群：低2型氣喘、低骨膜素性氣喘及低嗜酸性白血球性氣喘。在該等方法中之任一者之一些實施例中，氣喘與內瑟頓氏症候群不相關。在該等方法中之任一者之一些實施例中，氣喘與SPINK5之活性降低相關。在該等方法中之任一者之一些實施例中，氣喘與編碼SPINK5或其基因產物之基因中之一或多種遺傳變異不相關。在該等方法中之任一者之一些實施例中，針對氣喘對個體之治療係基於遺傳變異之存在或不存在。在該等方法中之任一者之一些實施例中，氣喘與位於KLK5基因體序列中之遺傳變異有關。在一些實施例中，該遺傳變異係SNP。在一些實施例中，該遺傳變異係SNP rs117639512。
在該等方法中之任一者之一些實施例中，KLK5拮抗劑藉由結合至KLK5之活性位點來抑制KLK5。在該等方法中之任一者之一些實施例中，KLK5拮抗劑藉由結合至結合區來抑制KLK5，該結合區包含選自由在未處理之全長KLK5 (亦即，包括信號肽)之位置108、147、150、153、168及245處之胺基酸殘基組成之群之KLK5胺基酸殘基中之一或多者。在該等方法中之任一者之一些實施例中，KLK5拮抗劑抑制KLK5之絲胺酸蛋白酶活性。
在該等方法中之任一者之一些實施例中，KLK5拮抗劑係選自由以下組成之群：抗體、結合多肽、多核苷酸及小分子。在一些實施例中，抗體係單株抗體。在一些實施例中，抗體係人類、人類化或嵌合抗體。在一些實施例中，抗體係全長IgG1抗體。在一些實施例中，抗體之IC50 為小於約50 µM - 1 µM、小於約1 µM - 500 nM、小於約500 nM - 100 nM、小於約100 nM - 10 nM、小於約10 nM - 1 nM或小於約1000 pM - 100 pM。在一些實施例中，抗體之IC50 為小於約10 nM - 1 nM。在一些實施例中，抗體之IC50 為小於約2 nM - 1 nM。在一些實施例中，IC50 係藉由如本文所述之直接分析或偶合分析來測定。
在一些實施例中，結合多肽係KLK5結合多肽。在一些實施例中，KLK5結合多肽係融合多肽。在一些實施例中，融合多肽係SPINK融合多肽。在一些實施例中，融合多肽係SPINK Fc融合多肽。在一些實施例中，融合多肽係SPINK Fc融合多肽。在一些實施例中，SPINK Fc融合多肽包含一或多個SPINK5之結構域。在一些實施例中，該一或多個SPINK5之結構域包含SEQ ID NO:17 (E421-A695)。在一些實施例中，該一或多個來自SPINK5之結構域包含SEQ ID NO:22 (M293-R355)。在一些實施例中，該一或多個來自SPINK5之結構域係來自小鼠來源。在一些實施例中，該一或多個SPINK5之結構域包含SEQ ID NO:15 (E490-Y757)。在一些實施例中，該一或多個來自SPINK5之結構域包含SEQ ID NO:20 (R291-R352)。在一些實施例中，該一或多個來自SPINK5之結構域係人類來源。在一些實施例中，SPINK Fc融合多肽包含SPINK9之一個結構域。在一些實施例中，SPINK9之一個結構域包含SEQ ID NO:28 (I20-C86.C22S.H48R.M49E)。在一些實施例中，SPINK9之一個結構域係來自人類來源。
在一些實施例中，小分子係蛋白酶抑制劑。在一些實施例中，蛋白酶抑制劑係亮抑酶肽。
在該等方法中之任一者之一些實施例中，樣品係選自由以下組成之群：支氣管肺泡灌洗、肺實質、支氣管上皮下膜(sub-epithelium)、腦脊髓液、血液、血清、痰液、唾液、黏膜刮擦物、組織生檢、淚液分泌物、***或汗液。
本文進一步提供KLK5拮抗劑，其用於醫學治療或診斷，包括氣喘之療法及/或治療。
本文進一步提供SPINK融合多肽。在一些實施例中，該SPINK融合多肽係SPINK Fc融合多肽。在一些實施例中，該SPINK Fc融合多肽抑制KLK5之活性。在一些實施例中，該SPINK Fc融合多肽包含一或多個SPINK5之結構域。在一些實施例中，該一或多個SPINK5之結構域包含SEQ ID NO:17 (E421-A695)。在一些實施例中，該一或多個來自SPINK5之結構域包含SEQ ID NO: 22 (M293-R355)。在一些實施例中，該一或多個來自SPINK5之結構域係來自小鼠來源。在一些實施例中，該一或多個SPINK5之結構域包含SEQ ID NO:15 (E490-Y757)。在一些實施例中，該一或多個來自SPINK5之結構域包含SEQ ID NO:20 (R291-R352)。在一些實施例中，該一或多個來自SPINK5之結構域係人類來源。在一些實施例中，該SPINK Fc融合多肽包含SPINK9之一個結構域。在一些實施例中，SPINK9之一個結構域包含SEQ ID NO:28 (I20-C86.C22S.H48R.M49E)。在一些實施例中，SPINK9之一個結構域係來自人類來源。
在一些實施例中，SPINK融合多肽之IC50 為小於約50 µM - 1 µM、小於約1 µM - 500 nM、小於約500 nM - 100 nM、小於約100 nM - 10 nM、小於約10 nM - 1 nM或小於約1000 pM - 100 pM。在一些實施例中，SPINK融合多肽之IC50 為小於約10 nM - 1 nM。在一些實施例中，SPINK融合多肽之IC50 為小於約3 nM - 1 nM。在一些實施例中，IC50 係藉由如本文所述之直接分析或偶合分析來測定。
本文進一步提供如本文所述之SPINK融合多肽，其用於醫學治療或診斷，包括與KLK5相關之疾病之療法及/或治療。
本文進一步提供醫藥調配物，其包含醫藥學活性量之如本文所述之SPINK融合多肽及醫藥學上可接受之載劑。
本文進一步提供治療個體之與KLK5相關之疾病之方法，其包括向該個體投與有效量之如本文所述之SPINK融合多肽。
在SPINK融合多肽中之任一者之一些實施例中，與KLK5相關之疾病係與個體樣品中升高含量之KLK5相關。在一些實施例中，與KLK5相關之疾病係與個體樣品中升高數目之嗜中性白血球相關。在一些實施例中，與KLK5相關之疾病係內瑟頓氏症候群。在一些實施例中，樣品係選自由以下組成之群：支氣管肺泡灌洗、肺實質及支氣管上皮下膜。在一些實施例中，個體係人類。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張於2017年4月21日提出申請之美國臨時專利申請案第62/488,515號之優先權，其全部內容係以引用的方式併入本文中。序列表
本申請案含有序列表，其已以ASCII格式電子提交，且係以全文引用的方式併入本文中。於2018年4月11日創建之該ASCII拷貝命名為P34247-WO_SL.txt且大小為93個千位元組。
本文提供使用KLK5拮抗劑之治療方法。在一些實施例中，本文提供使用KLK5拮抗劑治療氣喘之方法。特定而言，本文提供藉由向個體投與有效量之KLK5拮抗劑治療氣喘之方法。本文亦提供基於偵測KLK5中遺傳變異之存在或不存在預測個體之反應或選擇罹患氣喘之個體用於以KLK5拮抗劑治療之方法。在一些實施例中，本文提供使用KLK5拮抗劑治療內瑟頓氏症候群之方法。特定而言，本文提供使用KLK5拮抗劑治療內瑟頓氏症候群之方法，其中該KLK5拮抗劑係SPINK融合多肽(例如，SPINK Fc融合多肽)。本文亦提供用於治療或診斷氣喘之KLK5拮抗劑以及包含其之醫藥調配物。I. 定義
除非另有指示，否則如本文所用之術語「KLK5」及「血管舒緩素-5 (Kallikrein-5)」係指來自任何脊椎動物來源之任何天然KLK5，該脊椎動物來源包括哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類)及囓齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。該術語涵蓋未經處理之「全長」KLK5以及自處理細胞產生之KLK5之任何形式。該術語亦涵蓋KLK5之天然變異體，例如，剪接變異體或等位基因變異體。在一些實施例中，例示性人類KLK5之胺基酸序列係UNIPROT Q9Y337。在一些實施例中，例示性人類KLK5之胺基酸序列係選自由以下組成之群：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3 (N153D變異體)、SEQ ID NO:5 (G55R變異體)及SEQ ID NO:7 (G55R, N153D變異體)。在一些實施例中，例示性人類KLK5之胺基酸序列係UNIPROT Q9Y337之胺基酸殘基23-293 (減去信號肽)且示於SEQ ID NO:2中。在一些實施例中，例示性人類KLK5之胺基酸序列係示於SEQ ID NO:4中之N153D變異體之胺基酸殘基23-293 (減去信號肽)。在一些實施例中，例示性人類KLK5之胺基酸序列係示於SEQ ID NO:6中之G55R變異體之胺基酸殘基23-293 (減去信號肽)。在一些實施例中，例示性人類KLK5之胺基酸序列係示於SEQ ID NO:8中之G55R, N153D變異體之胺基酸殘基23-293 (減去信號肽)。
此段落中以下之編號係關於未處理之全長KLK5。在一些實施例中，人類KLK5之胺基酸序列包含在位置153處之胺基酸N。在一些實施例中，人類KLK5之胺基酸序列包含在位置153處之胺基酸D。在一些實施例中，人類KLK5之胺基酸序列包含在位置55處之胺基酸G。在一些實施例中，人類KLK5之胺基酸序列包含在位置55處之胺基酸R。在一些實施例中，人類KLK5之胺基酸序列包含在位置55處之胺基酸G及在位置153處之胺基酸N。在一些實施例中，人類KLK5之胺基酸序列包含在位置55處之胺基酸G及在位置153處之胺基酸D。在一些實施例中，人類KLK5之胺基酸序列包含在位置55處之胺基酸R及在位置153處之胺基酸N。在一些實施例中，人類KLK5之胺基酸序列包含在位置55處之胺基酸R及在位置153處之胺基酸D。
此段落中以下之編號係關於未處理之全長KLK5。在一些實施例中，人類KLK5之核酸序列包含在位置153處編碼N之序列。在一些實施例中，人類KLK5之核酸序列包含在位置153處編碼D之序列。在一些實施例中，人類KLK5之核酸序列包含在位置55處編碼G之序列。在一些實施例中，人類KLK5之核酸序列包含在位置55處編碼R之序列。在一些實施例中，人類KLK5之核酸序列包含在位置55處編碼G之序列及在位置153處編碼N之序列。在一些實施例中，人類KLK5之核酸序列包含在位置55處編碼G之序列及在位置153處編碼D之序列。在一些實施例中，人類KLK5之核酸序列包含在位置55處編碼R之序列及在位置153處編碼N之序列。在一些實施例中，人類KLK5之核酸序列包含在位置55處編碼R之序列及在位置153處編碼D之序列。
除非另有指示，否則如本文所用之術語「SPINK5」及「絲胺酸蛋白酶抑制劑5型Kazal」係指來自任何脊椎動物來源之任何天然SPINK5，該脊椎動物來源包括哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類)及囓齒類動物(例如小鼠及大鼠)。該術語涵蓋未經處理之「全長」SPINK5以及自處理細胞產生之SPINK5之任何形式。該術語亦涵蓋SPINK5之天然變異體，例如，剪接變異體或等位基因變異體。在一些實施例中，例示性人類SPINK5之胺基酸序列係UNIPROT Q9NQ38且示於SEQ ID NO:9中。在一些實施例中，例示性人類SPINK5之胺基酸序列係UNIPROT Q9NQ38之胺基酸殘基23-1064 (減去信號肽)且示於SEQ ID NO:10中。在一些實施例中，例示性小鼠SPINK5之胺基酸序列係UNIPROT Q5K5D4且示於SEQ ID NO:11中。在一些實施例中，例示性小鼠SPINK5之胺基酸序列係UNIPROT Q5K5D4之胺基酸殘基23-1064 (減去信號肽)且示於SEQ ID NO:12中。
除非另有指示，否則如本文所用之術語「SPINK9」或「絲胺酸蛋白酶抑制劑9型Kazal」係指來自任何脊椎動物來源之任何天然SPINK9，該脊椎動物來源包括哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類)及囓齒類動物(例如小鼠及大鼠)。該術語涵蓋未經處理之「全長」SPINK9以及自處理細胞產生之SPINK9之任何形式。該術語亦涵蓋SPINK9之天然變異體，例如，剪接變異體或等位基因變異體。在一些實施例中，例示性人類SPINK9之胺基酸序列係UNIPROT Q5DT21且示於SEQ ID NO:23中。在一些實施例中，例示性人類SPINK9之胺基酸序列係UNIPROT Q5DT21之胺基酸殘基20-86 (減去信號肽)且示於SEQ ID NO:24中。
「KLK5之拮抗劑」、「KLK5拮抗劑」、「KLK5之抑制劑」或「KLK5抑制劑」係干擾KLK5之活化或功能之藥劑，例如，部分或完全阻斷、抑制或中和由KLK5調介之生物活性。舉例而言，KLK5之拮抗劑可係指部分或完全阻斷、抑制或中和由KLK5調介之生物活性之任何分子。KLK5拮抗劑之實例包括抗體(例如，抗KLK5抗體)、結合多肽(例如，KLK5結合多肽，例如SPINK Fc融合多肽)、多核苷酸(例如，KLK5多核苷酸拮抗劑，例如短干擾RNA (siRNA)或規律成簇間隔短回文重複RNA (CRISPR-RNA或crRNA，包括具有crRNA及tracrRNA序列之單導向RNA (sgRNA))及小分子(例如，KLK5小分子拮抗劑，例如小分子蛋白酶抑制劑)。在一些實施例中，拮抗劑係結合至KLK5之抗體或小分子。
如本文中所互換使用之「多核苷酸」或「核酸」係指任何長度之核苷酸之聚合物，且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或其類似物或可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應併入至聚合物中之任何受質。多核苷酸可包含經修飾之核苷酸，例如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，則可在聚合物組裝之前或之後賦予對核苷酸結構之修飾。核苷酸序列可藉由非核苷酸組分中斷。多核苷酸可在合成後藉由(例如)與標記偶聯來進一步修飾。其他類型之修飾包括(例如)「帽子」、用類似物取代天然核苷酸中之一或多者、核苷酸間修飾，例如具有不帶電連接(例如，膦酸甲基酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯等)及具有帶電連接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)之彼等修飾、含有側接部分(例如，蛋白質(例如，核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-離胺酸等)之彼等修飾、具有嵌入劑(例如，吖啶、補骨脂素等)之彼等修飾、含有螯合劑(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)之彼等修飾、含有烷基化劑之彼等修飾、具有經修飾連接(例如，α變旋異構核酸等)之彼等修飾以及多核苷酸之未經修飾形式。此外，通常存在於糖中之羥基中之任一者均可由(例如)膦酸酯基團、磷酸酯基團置換，由標準保護基團保護，或經活化以製備與額外核苷酸之額外連接，或可偶聯至固體或半固體載體。5'及3'末端OH可經胺或1至20個碳原子之有機封端基團部分磷酸化或取代。其他羥基亦可衍生化成標準保護基團。多核苷酸亦可含有業內通常已知之核糖或去氧核糖糖之類似形式，包括(例如) 2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-變旋異構糖、差向異構糖(例如***糖、木糖或來蘇糖(lyxose))、吡喃糖糖、呋喃糖糖、景天庚酮糖(sedoheptulose)、非環類似物及無鹼基核苷類似物(例如甲基核苷)。一或多個磷酸二酯連接可由替代連接基團置換。該等替代連接基團包括(但不限於)以下實施例：其中磷酸酯由P(O)S(「硫代酯」)、P(S)S (「二硫代酯」)、(O)NR2 (「醯胺化物」)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2 (「甲乙縮醛」)置換，其中每一R或R'獨立地係H或視情況含有醚(-O-)連接之經取代或未經取代之烷基(1-20個C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基(araldyl)。並非多核苷酸中之所有連接均需要相同。前述說明適於本文中所提及之所有多核苷酸，包括RNA及DNA。
除非另有指示，否則如本文所用之術語「多肽」係指來自任何脊椎動物來源之所關注之任何天然多肽(例如，KLK5、SPINK5或SPINK9)，該脊椎動物來源包括哺乳動物，例如靈長類動物(例如，人類)及囓齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。該術語涵蓋未經處理之「全長」多肽以及自處理細胞產生之多肽之任何形式。該術語亦涵蓋多肽之天然變異體，例如，剪接變異體或等位基因變異體。
如本文所用之術語「SPINK融合多肽」係指其中SPINK多肽或其片段(例如，SPINK多肽之某些結構域(例如，SPINK5及/或SPINK9)直接或間接地連接至另一多肽(例如，非SPINK多肽)之融合多肽。
如本文所用之術語「SPINK Fc融合多肽」係指其中SPINK多肽或其片段(例如，SPINK多肽之某些結構域(例如，SPINK5及/或SPINK9)直接或間接地連接至Fc區之融合多肽。在一些實施例中，Fc區係選自由以下組成之群：IgG1 Fc區、IgG2a Fc區及IgG4 Fc區。在一些實施例中，Fc區係IgG2a Fc區。在一些實施例中，IgG2a Fc區係小鼠IgG2a Fc區。在一些實施例中，Fc區係IgG1 Fc區。在一些實施例中，IgG1 Fc區係人類IgG1 Fc區。在一些實施例中，Fc區係IgG4 Fc區。在一些實施例中，IgG4 Fc區係人類IgG4 Fc區。在一些實施例中，SPINK多肽或其片段係人類SPINK多肽或其片段。在一些實施例中，SPINK多肽或其片段係小鼠SPINK多肽或其片段。應理解，本文中提供微小序列變化形式(例如***、缺失、取代)、尤其不影響SPINK多肽、SPINK結構域或SPINK Fc融合多肽之功能及/或活性之SPINK多肽、SPINK結構域或Fc之保守胺基酸取代。在一些實施例中，本文所提供之SPINK Fc融合多肽可結合至KLK5，其可導致KLK5之抑制。在一些實施例中，SPINK多肽或其片段係SPINK 5。在一些實施例中，SPINK多肽或其片段係SPINK 9。SPINK Fc融合多肽之功能及/或活性可藉由業內已知之方法來分析，該等方法包括(但不限於) ELISA、配體-受體結合分析及Stat3螢光素酶分析。
在一些實施例中，SPINK Fc融合多肽之Fc區不具有效應物活性(例如，不結合至FcγIIIR)或展現實質上低於全IgG抗體之效應物活性。在一些實施例中，SPINK Fc融合多肽之Fc區不觸發細胞毒性，例如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)。除非另有指定，否則「SPINK Fc融合」、「SPINK Ig融合多肽」、「SPINK Fc融合多肽」或「SPINK Fc」在整個本申請案中可互換使用。
術語「小分子」係指分子量為約2000道耳頓(dalton)或更小、較佳地約500道耳頓或更小之任何分子。
「親和力」或「結合親和力」係指分子(例如，抗體、結合多肽、多核苷酸、小分子)之單一結合位點與其結合搭配物(例如，抗原)之間之非共價相互作用之總強度。除非另有指示，否則如本文所用之「結合親和力」係指固有結合親和力，其反映結合對之成員(例如，抗體、結合多肽、多核苷酸、小分子及抗原中之任一者)之間之1:1相互作用。分子X對於其搭配物Y之親和力通常可表示為解離常數(Kd)。親和力可藉由業內已知之常見方法來量測，該等方法包括本文所述之彼等方法(例如，肽受質分析、直接分析或偶合分析)。
術語「抗體」在本文中係以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現期望抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體以外之分子，其包含完整抗體中結合完整抗體所結合之抗原的一部分。抗體片段之實例包括(但不限於) Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 、雙價抗體(diabody)、直鏈抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)及自抗體片段形成之多特異性抗體。
「結合至相同表位之抗體」或「結合至相同結合區之抗體」作為參考抗體係指在競爭分析中將參考抗體與其結合搭配物(例如，抗原)之結合阻斷50%或更多之抗體，且相反地，參考抗體在競爭分析中將抗體與其結合搭配物之結合阻斷50%或更多。
術語「抗KLK5抗體」及「結合至KLK5之抗體」係指能夠以足夠親和力結合KLK5，從而使得該抗體可用作靶向KLK5之診斷劑及/或治療劑之抗體。在一些實施例中，抗KLK5抗體與無關多肽(除KLK5以外之多肽)結合之程度低於該抗體與KLK5結合之約10%，如藉由(例如)放射免疫分析(RIA)所量測。在一些實施例中，結合至KLK5之抗體之解離常數(Kd)係≤ 1μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如10-8 M或更低，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)。在一些實施例中，抗KLK5抗體結合至在KLK多肽之不同種類中保守之KLK5之結合區(例如表位)。
「阻斷性」抗體或「拮抗劑抗體」係抑制或降低其所結合抗原之生物活性之抗體。較佳之阻斷性抗體或拮抗劑抗體實質上或完全地抑制抗原之生物活性。
術語「嵌合」抗體係指其中重鏈及/或輕鏈之一部分源自特定來源或物種、而重鏈及/或輕鏈之其餘部分源自不同來源或物種之抗體。
抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定結構域或恆定區之類型。存在5大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等類別中之若干種可進一步分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及µ。
「結合區」係指KLK5拮抗劑(例如抗體、結合多肽、多核苷酸、小分子)選擇性結合之結合搭配物(例如，抗原)之部分。對於結合多肽結合搭配物，線性結合區可係約4-15個(例如，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個)胺基酸殘基之肽部分。非線性構形結合區可包含在結合多肽結合搭配物之三維(3D)結構中緊密靠近之多肽序列之殘基。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，以指具有實質上與天然抗體結構類似之結構或具有含有Fc區之重鏈的抗體(例如，抗KLK5抗體)。
「人類抗體」係具有對應於如下抗體之胺基酸序列之胺基酸序列之抗體：其係由人類或人類細胞產生或源自利用人類抗體譜或其他編碼人類抗體之序列之非人類來源。此人類抗體之定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基之嵌合抗體。在一些實施例中，人類化抗體將包含實質上全部之至少一個、且通常兩個可變結構域，其中全部或實質上全部之HVR(例如，CDR)對應於非人類抗體之彼等HVR，且全部或實質上全部之FR對應於人類抗體之彼等FR。人類化抗體視情況可包含源自人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體之「人類化形式」(例如非人類抗體)係指已經受人類化之抗體。
如本文所用之術語「超變區」或「HVR」係指抗體可變結構域之序列(「互補決定區」或「CDR」)超變及/或形成在結構上經定義之環(「超變環」)及/或含有抗原接觸殘基(「抗原觸點」)之區中之每一者。通常，抗體包含6個HVR：3個在VH中(H1、H2、H3)，且3個在VL中(L1、L2、L3)。本文中之例示性HVR包括： (a) 超變環，其出現於胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)處(Chothia及Lesk,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))； (b) CDR，其出現於胺基酸殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3)處(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))； (c) 抗原觸點，其出現於胺基酸殘基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)及93-101 (H3)處(MacCallum等人，J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；及 (d) (a)、(b)及/或(c)之組合，包括HVR胺基酸殘基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)及94-102 (H3)。
除非另有指示，否則可變結構域中之HVR殘基及其他殘基(例如，FR殘基)在本文中係根據Kabat等人，上文文獻編號。
如參考抗體、結合多肽、多核苷酸或小分子所用之術語「經分離」係已自其自然環境之組分分離者。在一些實施例中，將抗體、結合多肽、多核苷酸或小分子純化至大於95%或99%之純度，如藉由(例如)電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或反相HPLC)所測定。
如本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上同源抗體群體獲得之抗體，亦即，包含該群體之個別抗體相同及/或結合相同結合區(例如，表位)，可能之變異體抗體除外，例如，含有天然突變或在產生單株抗體製劑期間產生，此等變異體通常以較小量存在。與通常包括針對不同決定簇(表位)之不同抗體之多株抗體製劑相比，單株抗體製劑之每一單株抗體針對抗原上之單一決定簇。因此，修飾語「單株」指示如自抗體之實質上同源群體獲得之抗體特徵，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。舉例而言，本文所述之單株抗體可藉由多種技術製得，包括(但不限於)雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法及利用含有所有或一部分人類免疫球蛋白基因座之轉基因動物之方法，此等方法及用於製備單株抗體之其他例示性方法。
術語「可變區」或「可變結構域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原結合之結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變結構域(分別為VH及VL)通常具有類似結構，其中每一結構域包含四個保守框架區(FR)及三個超變區(HVR)。(例如，參見Kindt等人，Kuby Immunology ，第6版，W.H. Freeman及Co.，第91頁(2007)。)單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體之VH或VL結構域分離以分別篩選互補VL或VH結構域文庫。例如，參見Portolano等人，J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson等人，Nature 352:624-628 (1991)。
「相關(correlate或correlating)」意指以任何方式對第一分析或方案之性能及/或結果與第二分析或方案之性能及/或結果進行比較。舉例而言，可使用第一分析或方案之結果來進行第二方案及/或可使用第一分析或方案之結果來確定是否應實施第二分析或方案。關於多核苷酸分析或方案之實施例，可使用多核苷酸表現分析或方案之結果來確定是否應實施特定治療方案。
「升高之表現」、「升高之表現程度」或「升高之含量」係指相對於對照(例如未罹患疾病或病症(例如，氣喘)之一或多個個體或內部對照(例如，管家生物標記))，個體中生物標記之表現增加或含量增加。
術語「管家生物標記」係指通常類似地存在於所有細胞類型中之生物標記或生物標記組(例如，多核苷酸及/或多肽)。在一些實施例中，管家生物標記係「管家基因」。「管家基因」在本文中係指編碼其活性對維持細胞功能至關重要且通常類似地存在於所有細胞類型中之蛋白質之基因或基因組。
如本文所用之術語「KLK5基因體序列」係指KLK5基因之cDNA及/或基因體形式，其可包括內含子以及上游及下游調控序列。
術語「表現之程度」或「表現程度」一般而言可互換使用，且通常係指生物樣品中生物標記之量。「表現」通常係指資訊(例如，基因編碼及/或後生)轉化成存在於細胞中且在細胞中運行之結構之過程。因此，如本文所用，「表現」可係指轉錄成多核苷酸、轉譯成多肽或甚至多核苷酸及/或多肽修飾(例如，多肽之轉譯後修飾)。所轉錄多核苷酸、所轉譯多肽或多核苷酸及/或多肽修飾(例如，多肽之轉譯後修飾)之片段亦應視為表現，不論其係源自藉由選擇式剪接產生之轉錄物或降解之轉錄物，抑或源自多肽之轉譯後處理(例如，藉由蛋白分解)。「經表現基因」包括轉錄成作為mRNA之多核苷酸且接著轉譯成多肽之彼等基因，亦及轉錄成RNA但不轉譯成多肽之彼等基因(例如，轉送及核糖體RNA)。
與個體之增加的臨床益處相關之生物標記之「存在」、「量」或「含量」係生物樣品中之可偵測含量。該等量可藉由熟習此項技術者已知亦及本文所揭示之方法來量測。所評價之生物標記之表現程度或量可用來確定對治療之反應。
「降低之表現」、「降低之表現程度」或「降低之含量」係指相對於對照(例如未罹患疾病或病症(例如，氣喘)之個體或內部對照(例如，管家生物標記))，個體中生物標記之表現減少或含量減少。
如本文所用之「參考樣品」、「參考細胞」、「參考組織」、「對照樣品」、「對照細胞」或「對照組織」係指用於比較目的之樣品、細胞、組織、標準或程度。在一個實施例中，參考樣品、參考細胞、參考組織、對照樣品、對照細胞或對照組織係自同一個體之身體之健康及/或無疾病部分(例如，組織或細胞)獲得。舉例而言，毗鄰病變細胞或組織之健康及/或無疾病之細胞或組織(例如，毗鄰腫瘤之細胞或組織)。在另一實施例中，參考樣品係自同一個體之身體之未經處理組織及/或細胞獲得。在另一實施例中，參考樣品、參考細胞、參考組織、對照樣品、對照細胞或對照組織係自另一個體之身體之健康及/或無疾病部分(例如，組織或細胞)獲得。在甚至另一實施例中，參考樣品、參考細胞、參考組織、對照樣品、對照細胞或對照組織係自另一個體之身體之未經處理組織及/或細胞獲得。
如本文所用之術語「樣品」係指自所關注個體獲得或源自該個體之調配物，其含有已基於(例如)物理、生物化學、化學及/或生理特性表徵及/或鑑別之細胞及/或其他分子實體。舉例而言，片語「病變樣品」及其變化形式係指自所關注個體獲得之任何樣品，其將預期或已知含有待表徵之細胞及/或分子實體。樣品包括(但不限於)原代或培養細胞或細胞系、細胞上清液、細胞溶解物、血小板、血清、血漿、玻璃體液、淋巴液、滑液、濾泡液、***、羊水、乳、全血、血液源細胞、尿、腦脊髓液、唾液、痰液、淚液、汗液、黏液、腫瘤溶解物及組織培養基、組織提取物(例如均質化組織)、腫瘤組織、細胞提取物及其組合。
「組織樣品」或「細胞樣品」意指自個體之組織獲得之類似細胞之集合。組織或細胞樣品之來源可係如來自新鮮、冷凍及/或保藏器官、組織樣品、活檢及/或吸出物之固體組織；血液或任何血液成分，例如血漿；體液，例如腦脊髓液、羊膜液、腹膜液或間隙液；來自個體妊娠期或發育之任何時間之細胞。組織樣品亦可係原代或培養細胞或細胞系。視情況，組織或細胞樣品係自病變組織/器官獲得。組織樣品可含有不與天然組織天然混合之化合物，例如防腐劑、抗凝血劑、緩衝劑、固定劑、營養素、抗生素或諸如此類。
藥劑(例如，醫藥調配物)之「有效量」係指在所需時間段內以所需劑量有效達成期望治療結果之量。
「個體」係哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)家養動物(例如，牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如，人類及非人類靈長類動物，例如猴子)、兔及囓齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。在一些實施例中，個體係人類。
如本文所用之術語「患者」係指動物，例如哺乳動物。在一個實施例中，患者係指人類。
術語「醫藥調配物」係指如下製劑：其所呈現形式容許其中所含活性成分之生物活性有效，且不含對將投與該調配物之個體具有不可接受毒性之額外組分。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外之成分，其對個體無毒。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文所用之術語「高Th2性氣喘」係指展現高含量之一或多種Th2細胞有關細胞介素(例如，IL13、IL4、IL9、IL5)或展現Th2細胞介素相關發炎之氣喘。在一些實施例中，術語高Th2性氣喘可與高嗜酸性白血球性氣喘互換使用。在一些實施例中，高Th2性氣喘係Th2驅動之氣喘。在一些實施例中，氣喘患者已確定為嗜酸性白血球性發炎陽性(EIP)。例如，參見國際專利申請公開案第WO 2015/061441號，其係以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，與對照或參考含量相比，已確定個體具有升高含量之至少一種嗜酸性白血球性標誌基因。參見 WO2015/061441。在一些實施例中，高Th2性氣喘係高骨膜素性氣喘。在一些實施例中，個體具有高血清骨膜素。在一些實施例中，個體為18歲或以上。在一些實施例中，與對照或參考含量相比，已確定個體具有升高含量之血清骨膜素。在一些實施例中，對照或參考含量係群體中骨膜素之中值含量。在一些實施例中，已確定個體具有20 ng/ml或更高之血清骨膜素。在一些實施例中，已確定個體具有25 ng/ml或更高之血清骨膜素。在一些實施例中，已確定個體具有50 ng/ml或更高之血清骨膜素。在一些實施例中，血清骨膜素之對照或參考含量係20 ng/ml、25 ng/ml或50 ng/ml。在一些實施例中，氣喘係高嗜酸性白血球性氣喘。在一些實施例中，與對照或參考含量相比，已確定個體具有升高之嗜酸性白血球計數。在一些實施例中，對照或參考含量係群體之中值含量。在一些實施例中，已確定個體具有150或更高之嗜酸性白血球計數/μl血液。在一些實施例中，已確定個體具有200或更高之嗜酸性白血球計數/μl血液。在一些實施例中，已確定個體具有250或更高之嗜酸性白血球計數/μl血液。在一些實施例中，已確定個體具有300或更高之嗜酸性白血球計數/μl血液。在一些實施例中，已確定個體具有350或更高之嗜酸性白血球計數/μl血液。在一些實施例中，已確定個體具有400或更高之嗜酸性白血球計數/μl血液。在一些實施例中，已確定個體具有450或更高之嗜酸性白血球計數/μl血液。在一些實施例中，已確定個體具有500或更高之嗜酸性白血球計數/μl血液。在一些較佳實施例中，已確定個體具有300或更高之嗜酸性白血球計數/μl血液。在一些實施例中，嗜酸性白血球係末梢血嗜酸性白血球。在一些實施例中，嗜酸性白血球係痰液嗜酸性白血球。在一些實施例中，個體展現升高含量之FeNO (呼出硝酸分數)及/或升高含量之IgE。舉例而言，在一些情況下，個體展現高於以下中任一者之FeNO值：約5 ppb (十億分率)、10 ppb、15 ppb、20 ppb、25 ppb、30 ppb、35 ppb、40 ppb、45 ppb、50 ppb、60 ppb、70 ppb、80 ppb、90 ppb及100 ppb。在一些情況下，個體之IgE含量高於50 IU/ml。
如本文所用之術語「低Th2性氣喘」、「非高Th2性氣喘」、「低2型氣喘」、「低T2性氣喘」、「非嗜酸性白血球性氣喘」、「乏粒細胞性(pauci-granulocytic)氣喘」或「乏發炎性氣喘」係指展現低含量之一或多種Th2細胞有關細胞介素(例如IL13、IL4、IL9、IL5)或展現非Th2細胞介素相關發炎之氣喘。在一些實施例中，術語低Th2性氣喘可與低嗜酸性白血球性氣喘互換使用。在一些實施例中，已確定氣喘患者為嗜酸性白血球性發炎陰性(EIN)。例如，參見WO 2015/061441。在一些實施例中，低Th2性氣喘係Th17驅動之氣喘。在一些實施例中，低Th2性氣喘係低骨膜素性氣喘。在一些實施例中，個體為18歲或以上。在一些實施例中，與對照或參考含量相比，已確定個體具有降低含量之血清骨膜素。在一些實施例中，對照或參考含量係群體中骨膜素之中值含量。在一些實施例中，已確定個體具有少於20 ng/ml之血清骨膜素。在一些實施例中，氣喘係低嗜酸性白血球性氣喘。在一些實施例中，與對照或參考含量相比，已確定個體具有降低之嗜酸性白血球計數。在一些實施例中，對照或參考含量係群體之中值含量。在一些實施例中，已確定個體具有少於150個嗜酸性白血球計數/μl血液。在一些實施例中，已確定個體具有少於100個嗜酸性白血球計數/μl血液。在某些較佳實施例中，已確定個體具有少於300個嗜酸性白血球計數/μl血液。
「治療」(及諸如「治療(treat或treating)」等變化形式)係指試圖改變所治療個體或細胞之自然過程之臨床干預。治療之期望效應包括以下中之一或多者：預防疾病發生或復發、緩和症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理結果、穩定(亦即不惡化)疾病狀態、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態、若未接受治療則與預期存活期相比延長存活及改良預後。
除非本文另有指示或上下文明顯矛盾，否則在闡述本文實施例之上下文中使用術語「一(a及an)」及「該(the)」及類似術語均應解釋為涵蓋單數及複數二者。除非另有註明，否則術語「包含」、「具有」、「包括」及「含有」應解釋為開放性術語(亦即，意指「包括(但不限於)」)。應理解，本文所提供之態樣及實施例包括「由態樣及實施例組成」及/或「基本上由態樣及實施例組成」。
如熟習此項技術者所理解，在提及「約」時，本文中之值或參數包括(及描述)關於該值或參數本身之實施例。舉例而言，關於「約X」之說明包括對「X」之說明。
片語「實質上不同」係指兩個數值(通常一個數值與分子相關且另一數值與參考/對比分子相關)之間具有足夠高差異度，從而使得熟習此項技術者將認為該兩個值之間之差異在藉由該等值(例如Kd值)所量測生物學特性之背景下具有統計學顯著性。該兩個值之間之差異可(例如)大於約10%、大於約20%、大於約30%、大於約40%及/或大於約50%，其隨參考/對比分子之值而變化。
如本文所用之片語「實質上類似」係指兩個數值(通常一個數值與分子相關且另一數值與參考/對比分子相關)之間具有足夠高類似度，從而使得熟習此項技術者將認為該兩個值之間之差異在藉由該等值(例如Kd值)所量測生物學特性之背景下不具統計學顯著性。該兩個值之間之差異可(例如)小於約20%、小於約10%及/或小於約5%，其隨參考/對比值而變化。片語「實質上正常」係指實質上類似於參考(例如，正常參考)。II. 使用 KLK5 拮抗劑之方法
本文提供使用KLK5拮抗劑用於抑制KLK5之方法。舉例而言，本文提供治療個體氣喘之方法，其包括向該個體投與有效量之KLK5拮抗劑。在一些實施例中，KLK5拮抗劑抑制KLK5之絲胺酸蛋白酶活性。在一些實施例中，KLK5拮抗劑係選自由以下組成之群：抗體(例如抗KLK5抗體)、結合多肽(例如，KLK5結合多肽，例如SPINK Fc融合多肽)、多核苷酸(例如，KLK5多核苷酸拮抗劑，例如siRNA或CRISPR-RNA，包括具有CRISPR-RNA及tracrRNA序列之sgRNA)及小分子(例如，KLK5小分子拮抗劑，例如小分子蛋白酶抑制劑)。在一些實施例中，KLK5拮抗劑係抗體(例如，單株抗體)。
本文進一步提供預測罹患氣喘之個體對包含KLK5拮抗劑之治療之反應的方法，該方法包括(a) 量測來自該個體之生物樣品中之KLK5含量，(b) 將該樣品中所偵測到之KLK5含量與參考含量進行比較，及(c) 當該樣品中所量測之KLK5含量與參考含量相比升高時，預測該個體將對治療有反應，且當該樣品中所量測之KLK含量與參考含量相比降低時，預測該個體將不對治療有反應。在一些實施例中，KLK5拮抗劑抑制KLK5之絲胺酸蛋白酶活性。在一些實施例中，KLK5拮抗劑係選自由以下組成之群：抗體(例如，抗KLK5抗體)、結合多肽(例如，KLK5結合多肽，例如SPINK Fc融合多肽)、多核苷酸(例如，KLK5多核苷酸拮抗劑，例如siRNA或CRISPR-RNA，包括具有CRISPR-RNA及tracrRNA序列之sgRNA)及小分子(例如，KLK5小分子拮抗劑，例如小分子蛋白酶抑制劑)。在一些實施例中，KLK5拮抗劑係抗體(例如，單株抗體)。
本文進一步提供選擇罹患氣喘之個體進行包含KLK5拮抗劑之治療之方法，其包括確定來自該個體之生物樣品中位於KLK5基因體序列中之遺傳變異存在或不存在，其中該遺傳變異之存在指示該個體適於用KLK5拮抗劑治療。在一些實施例中，KLK5拮抗劑抑制KLK5之絲胺酸蛋白酶活性。在一些實施例中，KLK5拮抗劑係選自由以下組成之群：抗體(例如，抗KLK5抗體)、結合多肽(例如，KLK5結合多肽，例如SPINK Fc融合多肽)、多核苷酸(例如，KLK5多核苷酸拮抗劑，例如siRNA或CRISPR-RNA，包括具有CRISPR-RNA及tracrRNA序列之sgRNA)及小分子(例如，KLK5小分子拮抗劑，例如小分子蛋白酶抑制劑)。在一些實施例中，KLK5拮抗劑係抗體(例如，單株抗體)。
本文進一步提供偵測指示罹患氣喘之個體適於用KLK5拮抗劑治療之KLK5基因體序列中之遺傳變異存在或不存在之方法，其包括(a) 使來自該個體之樣品與能夠偵測位於KLK5基因體序列中之該遺傳變異存在或不存在之試劑接觸；及(b) 確定該遺傳變異存在或不存在，其中該遺傳變異之存在指示該個體適於用KLK5拮抗劑治療。在一些實施例中，KLK5拮抗劑抑制KLK5之絲胺酸蛋白酶活性。在一些實施例中，KLK5拮抗劑係選自由以下組成之群：抗體(例如，抗KLK5抗體)、結合多肽(例如，KLK5結合多肽，例如SPINK Fc融合多肽)、多核苷酸(例如，KLK5多核苷酸拮抗劑，例如siRNA或CRISPR-RNA，包括具有CRISPR-RNA及tracrRNA序列之sgRNA)及小分子(例如，KLK5小分子拮抗劑，例如小分子蛋白酶抑制劑)。在一些實施例中，KLK5拮抗劑係抗體(例如，單株抗體)。在一些實施例中，試劑係選自寡核苷酸、DNA探針、RNA探針及核酶。在一些實施例中，試劑經標記。
本文進一步提供選擇用於治療與KLK5相關之疾病之化合物的方法，其包括確定測試化合物是否係KLK5拮抗劑，其中為KLK5拮抗劑之測試化合物適宜作為治療與KLK5相關之疾病之化合物。在一些實施例中，KLK5拮抗劑抑制KLK5之絲胺酸蛋白酶活性。在一些實施例中，KLK5拮抗劑係選自由以下組成之群：抗體(例如，抗KLK5抗體)、結合多肽(例如，KLK5結合多肽，例如SPINK Fc融合多肽)、多核苷酸(例如，KLK5多核苷酸拮抗劑，例如siRNA或CRISPR-RNA，包括具有CRISPR-RNA及tracrRNA序列之sgRNA)及小分子(例如，KLK5小分子拮抗劑，例如小分子蛋白酶抑制劑)。在一些實施例中，KLK5拮抗劑係抗體(例如，單株抗體)。
在該等方法中之任一者之一些實施例中，氣喘與來自該個體之樣品中KLK5之含量升高相關。在一些實施例中，氣喘與來自該個體之樣品中SPINK5之活性降低相關。在一些實施例中，氣喘與來自該個體之樣品中嗜中性白血球含量升高相關。在一些實施例中，氣喘係選自由以下組成之群：低2型氣喘、低骨膜素性氣喘及低嗜酸性白血球性氣喘。在一些實施例中，氣喘與內瑟頓氏症候群不相關。在一些實施例中，氣喘與編碼SPINK5或其基因產物之基因中之一或多種遺傳變異不相關。在一些實施例中，氣喘與位於KLK5基因體序列中之遺傳變異有關。在一些實施例中，該方法進一步包含基於遺傳變異之存在治療個體之氣喘。在一些實施例中，該遺傳變異係SNP。在一些實施例中，該遺傳變異係SNP rs117639512。
在該等方法中之任一者之一些實施例中，氣喘係持續性慢性重度氣喘，伴隨可威脅生命之惡化症狀之急性事件(加劇或眩暈)。在一些實施例中，氣喘係特應性(亦稱為過敏性)氣喘、非過敏性氣喘(例如，通常由呼吸道病毒感染(例如，流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、人類間質肺炎病毒及呼吸道融合病毒)或吸入刺激物(空氣污染物、煙霧、柴油顆粒、揮發性化學品及室內或室外氣體)或甚至由乾冷空氣觸發)。在一些實施例中，氣喘係由於急性或慢性首次或二次暴露於「菸」(通常香菸、雪茄、菸斗)、吸入或「霧吸(vaping)」(菸草、***或其他此等物質)所致之間歇性或運動誘發之氣喘或由近期服用阿司匹林(aspirin)或相關NSAID觸發之氣喘。在一些實施例中，氣喘係輕度或皮質類固醇初始氣喘、新診斷且未經治療之氣喘或先前不需要長期使用吸入之局部或全身類固醇來控制症狀(咳嗽、喘鳴、呼吸短促/呼吸暫停或胸痛)之氣喘。在一些實施例中，氣喘係慢性皮質類固醇抗性氣喘、皮質類固醇難治性氣喘、不受皮質類固醇或其他慢性氣喘控制藥劑控制之氣喘。在一些實施例中，氣喘係中度至重度氣喘。在一些實施例中，氣喘係高Th2性氣喘。在一些實施例中，氣喘係重度氣喘。在一些實施例中，氣喘係特應性氣喘、過敏性氣喘、非過敏性氣喘(例如，由於感染及/或呼吸道融合病毒(RSV)所致)、運動誘發之氣喘、阿司匹林敏感/加劇氣喘、輕度氣喘、中度至重度氣喘、皮質類固醇初始氣喘、慢性氣喘、皮質類固醇抗性氣喘、皮質類固醇難治性氣喘、新診斷且未經治療之氣喘、由於吸菸所致之氣喘、不受皮質類固醇控制之氣喘。在一些實施例中，氣喘係2型輔助性T淋巴球(Th2)或2型(Th2)高或2型(T2)驅動之氣喘。在一些實施例中，氣喘係嗜酸性白血球性氣喘。在一些實施例中，氣喘係過敏性氣喘。在一些實施例中，已確定個體為嗜酸性白血球性發炎陽性(EIP)。參見 WO2015/061441。在一些實施例中，氣喘係高骨膜素性氣喘(例如，骨膜素含量為至少約20 ng/mL、25 ng/mL或50 ng/mL血清中之任一者)。在一些實施例中，氣喘係高嗜酸性白血球性氣喘(例如，至少約150、200、250、300、350、400個嗜酸性白血球計數/ml血液中之任一者)。在一些實施例中，氣喘係低Th2性氣喘或非Th2驅動之氣喘。在一些實施例中，已確定個體為嗜酸性白血球性發炎陰性(EIN)。參見 WO2015/061441。在一些實施例中，氣喘係低骨膜素性氣喘(例如，骨膜素含量少於約20 ng/mL血清)。在一些實施例中，氣喘係低嗜酸性白血球性氣喘(例如，少於約150個嗜酸性白血球計數/μl血液或少於約100個嗜酸性白血球計數/μl血液)。
在該等方法中之任一者之一些實施例中，樣品係選自由以下組成之群：腦脊髓液、血液、血清、痰液、唾液、黏膜刮擦物、組織生檢、淚液分泌物、***及汗液。在一些實施例中，樣品係選自由以下組成之群：支氣管肺泡灌洗、肺實質及支氣管上皮下膜。
生物標記之存在及/或表現程度/量可基於業內已知之任何適宜準則定性地及/或定量地測定，該準則包括(但不限於) DNA、mRNA、cDNA、多肽、多肽片段及/或基因拷貝數。在一些實施例中，第一樣品中生物標記之存在及/或表現程度/量與第二樣品中之存在/不存在及/或表現程度/量相比增加。在一些實施例中，第一樣品中生物標記之存在/不存在及/或表現程度/量與第二樣品中之存在及/或表現程度/量相比減少。在一些實施例中，第二樣品係參考樣品、參考細胞、參考組織、對照樣品、對照細胞或對照組織。用於測定基因之存在/不存在及/或表現程度/量之額外揭示內容闡述於本文中。在一些實施例中，KLK5可用作生物標記。在一些實施例中，SPINK5可用作生物標記。
在該等方法中之任一者之一些實施例中，KLK5拮抗劑係與額外治療劑組合投與個體。在一些實施例中，該額外治療劑係IL-13軸結合拮抗劑、IL-5軸結合拮抗劑、IL-33軸結合拮抗劑、M1 prime拮抗劑、IgE拮抗劑、TRPA1拮抗劑、CRTH2拮抗劑、支氣管擴張劑或氣喘症狀控制藥劑、免疫調節劑、皮質類固醇、Th2路徑抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑或磷酸二酯酶抑制劑。在一些實施例中，IL-13軸結合拮抗劑係抗IL-13抗體。在一些實施例中，抗IL-13抗體係萊比克珠單抗。在一些實施例中，IL-5軸結合拮抗劑係IL-5結合拮抗劑或IL-5受體結合拮抗劑。在一些實施例中，IL-33軸結合拮抗劑係IL-33結合拮抗劑或ST2結合拮抗劑。在一些實施例中，IL-33結合拮抗劑係抗IL-33抗體。在一些實施例中，M1 prime拮抗劑係奎立珠單抗(quilizumab)。
在該等方法中之任一者之一些實施例中，KLK5拮抗劑係以皮下、靜脈內、肌內、局部、經口、經皮、腹膜內、眶內、藉由植入、藉由吸入、鞘內、室內或鼻內方式投與。在一些實施例中，KLK5拮抗劑係以皮下方式投與。在一些實施例中，KLK5拮抗劑係用於人類個體中。
在該等方法中之任一者之一些實施例中，升高之表現係指藉由標準技術已知方法(例如本文所述之彼等方法)偵測之生物標記(例如，多肽或核酸(例如，基因或mRNA))之含量與參考樣品、參考細胞、參考組織、對照樣品、對照細胞或對照組織相比總體增加約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大中之任一者。在一些實施例中，升高之表現係指樣品中生物標記之表現程度/量增加，其中該增加為參考樣品、參考細胞、參考組織、對照樣品、對照細胞或對照組織中各別生物標記之表現程度/量之至少約1.5X、1.75X、2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、25X、50X、75X或100X中之任一者。在一些實施例中，升高之表現係指與參考樣品、參考細胞、參考組織、對照樣品、對照細胞、對照組織或內部對照(例如，管家基因)相比，總體增加大於約1.5倍、約1.75倍、約2倍、約2.25倍、約2.5倍、約2.75倍、約3.0倍或約3.25倍。在一些實施例中，生物標記係參與KLK5路徑之分子。在一些實施例中，該分子係SPINK5。在一些實施例中，該分子係KLK5。在一些實施例中，該分子係KLK5之生物學受質。在一些實施例中，生物學受質係選自由以下組成之群：KLK7、KLK8、KLK14、PAR2及整聯蛋白/組織基質蛋白。
在該等方法中之任一者之一些實施例中，降低之表現係指藉由標準技術已知方法(例如本文所述之彼等方法)偵測之生物標記(例如，多肽或核酸(例如，基因或mRNA))之含量與參考樣品、參考細胞、參考組織、對照樣品、對照細胞或對照組織相比總體降低約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大中之任一者。在一些實施例中，降低之表現係指樣品中生物標記之表現程度/量減少，其中該減少為參考樣品、參考細胞、參考組織、對照樣品、對照細胞或對照組織中各別生物標記之表現程度/量之至少約0.9X、0.8X、0.7X、0.6X、0.5X、0.4X、0.3X、0.2X、0.1X、0.05X或0.01X中之任一者。
樣品中各種生物標記之存在及/或表現程度/量可藉由數種方法來分析，該等方法中之多者為業內所已知且為熟習此項技術者所理解，包括(但不限於)免疫組織化學(「IHC」)、西方墨點(Western blot)分析、免疫沈澱、分子結合分析、ELISA、ELIFA、螢光活化細胞分選(「FACS」)、MassARRAY、蛋白質體學、基於血液之定量分析(例如血清ELISA)、生物化學酶促活性分析、原位雜交、南方(Southern)分析、北方(Northern)分析、全基因體定序、聚合酶鏈式反應(「PCR」)(包括定量即時PCR (「qRT-PCR」)及其他擴增型偵測方法，例如分枝DNA、SISBA、TMA及諸如此類)、RNA-Seq、FISH、微陣列分析、基因表現譜及/或基因表現之系列分析(「SAGE」)以及可由多肽、基因及/或組織陣列分析實施之眾多種分析中之任一者。評估基因狀態及基因產物之典型方案參見(例如) Ausubel等人編輯，1995, Current Protocols In Molecular Biology, 第2單元(北方印漬)、第4單元(南方印漬)、第15單元(免疫印漬)及第18單元(PCR分析)中。亦可使用多重免疫分析，例如可自Rules Based Medicine或Meso Scale Discovery (「MSD」)獲得之彼等分析。III. KLK5 拮抗劑
本文提供用於本文所述之任何方法(例如治療或診斷氣喘或內瑟頓氏症候群之方法)中之KLK5拮抗劑。在一些實施例中，KLK5拮抗劑係選自由以下組成之群：抗體(例如，抗KLK5抗體)、結合多肽(例如，KLK5結合多肽，例如SPINK Fc融合多肽)、多核苷酸(例如，KLK5多核苷酸拮抗劑，例如siRNA或CRISPR-RNA，包括具有CRISPR-RNA及tracrRNA序列之sgRNA)及小分子(例如，KLK5小分子拮抗劑，例如小分子蛋白酶抑制劑)。在一些實施例中，抗體係單株抗體。在一些實施例中，抗體係人類、人類化或嵌合抗體。在一些實施例中，抗體係全長IgG1抗體。KLK5拮抗劑之詳細描述可參見本文下文之部分A. - E.。
舉例而言，根據以上實施例中任一者之KLK5拮抗劑結合至選自由以下組成之群之胺基酸序列中任一者之一或多個殘基：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8。在KLK5拮抗劑中任一者之一些實施例中，KLK5拮抗劑結合至選自由以下組成之群之胺基酸序列中之任一者：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8。在一些實施例中，KLK5拮抗劑結合至胺基酸序列SEQ ID NO:1之一或多個殘基(UniProt號Q9Y337之胺基酸殘基1-293)。在一些實施例中，KLK5拮抗劑結合至胺基酸序列SEQ ID NO:1 (UniProt號Q9Y337之胺基酸殘基1-293)。在一些實施例中，KLK5拮抗劑結合至KLK5上之特定結合區。在一些實施例中，該結合區係位於KLK5之活性位點內。在一些實施例中，該結合區包含KLK5之約1、2、3、4、5、6、7、8、9及/或10個胺基酸殘基中之任一者。在一些實施例中，該結合區包含KLK5之胺基酸殘基中之一或多者，該等殘基係選自由未處理之全長KLK5 (亦即，包括信號肽)之位置108、147、150、153、168及245處之胺基酸殘基組成之群。
在一些實施例中，該結合區包含在KLK5拮抗劑之任一原子約以下中任一者內之胺基酸殘基：10埃(Å)、9 Å、8 Å、7 Å、6 Å、5 Å、4 Å、3 Å、2 Å及/或1 Å。在一些實施例中，該結合區包含在KLK5拮抗劑之任一原子小於以下中任一者內之胺基酸殘基：10Å、9Å、8Å、7Å、6Å、5Å、4Å、3Å、2 Å及/或1 Å。在一些實施例中，該結合區包含在KLK5拮抗劑之任一原子介於以下任一者之間內之胺基酸殘基：10-9 Å、9-8 Å、8-7 Å、7-6 Å、6-5 Å、5-4 Å、4-3 Å、3-2 Å及/或2-1 Å。在一些實施例中，該結合區包含在KLK5拮抗劑之任一原子約以下中任一者內之胺基酸殘基：9.5 Å、9 Å、8.5 Å、8 Å、7.5 Å、7 Å、6.5 Å、6 Å、5.5 Å、5 Å、4.5 Å、4 Å、3.5 Å、3 Å、2.5 Å、2 Å、1.5 Å及/或1 Å。接觸結合區之KLK5拮抗劑之胺基酸殘基(亦即，互補位(paratope))可藉由(例如)測定與結合區複合之KLK5拮抗劑之晶體結構或藉由實施氫/氘交換來確定。
此外，根據以上實施例中任一者之KLK5拮抗劑實質上或完全抑制KLK5之生物活性。在一些實施例中，KLK5之生物活性為絲胺酸蛋白酶活性。在一些實施例中，KLK5之生物活性為胰蛋白酶樣絲胺酸蛋白酶活性。在一些實施例中，KLK5之生物活性為KLK5促進之人類平滑肌細胞增殖及收縮。在一些實施例中，KLK5之生物活性為KLK5誘導之發炎性細胞介素、趨化介素及黏附分子之上皮表現。在一些實施例中，KLK5之生物活性為KLK5誘導之嗜中性白血球趨化性細胞介素之上皮產生及嗜中性白血球流入至肺組織中。在一些實施例中，KLK5之生物活性抑制至少約以下中之任一者：20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%及/或更多。在一些實施例中，KLK5之生物活性抑制約以下中之任一者：20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%及/或更多。在一些實施例中，KLK5之生物活性抑制介於以下中之任一者之間：20%-30%、30%-40%、40%-50%、50%-60%、60%-70%、70%-80%、80%-90%及/或90%-100%。
在KLK5拮抗劑中任一者之一些實施例中，KLK5拮抗劑實質上或完全抑制SPINK5與KLK5之結合。在一些實施例中，SPINK5與KLK5之結合抑制至少約以下中之任一者：20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%及/或更多。在一些實施例中，SPINK5與KLK5之結合抑制約以下中之任一者：20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%及/或更多。在一些實施例中，SPINK5與KLK5之結合抑制介於以下中任一者之間：20%-30%、30%-40%、40%-50%、50%-60%、60%-70%、70%-80%、80%-90%及/或90%-100%。
在KLK5拮抗劑中任一者之一些實施例中，KLK5拮抗劑對KLK5之結合親和力(解離常數)為小於約以下中之任一者：10-7 nM、10-8 nM、10-9 nM、10-10 nM、10-11 nM、10-12 nM及/或10-13 nM。在一些實施例中，KLK5拮抗劑對KLK5之結合親和力為小於以下中之任一者：10-7 nM、10-8 nM、10-9 nM、10-10 nM、10-11 nM、10-12 nM及/或10-13 nM。
在KLK5拮抗劑中任一者之一些實施例中，KLK5拮抗劑之IC50 為小於約以下中之任一者：1000 nM、500 nM、100 nM、50 nM、10 nM、5nM、1 nM、500 pM、100 pM、50 pM、10 pM、5 pM及/或1 pM。在一些實施例中，KLK5拮抗劑之IC50 為小於以下中之任一者：1000 nM、500 nM、100 nM、50 nM、10 nM、5nM、1 nM、500 pM、100 pM、50 pM、10 pM、5 pM及/或1 pM。在一些實施例中，KLK5拮抗劑之IC50 為介於約以下中任一者之間：50 µM - 1 µM、1 µM - 500 nM、500 nM - 100 nM、100 nM - 10 nM、10 nM - 1 nM、1000 pM - 500 pM、500 pM - 200 pM、200 pM - 150 pM、150 pM - 100 pM、100 pM - 10 pM及/或10 pM - 1 pM。 A. 抗體
本文提供用於本文所述方法中之經分離抗KLK5抗體。在以上實施例中之任一者中，抗KLK5抗體經人類化。此外，根據以上實施例中任一者之抗KLK5抗體係單株抗體，包括嵌合、人類化或人類抗體。在一些實施例中，抗-KLK5抗體係抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙價抗體或F(ab’)2 片段。在一些實施例中，抗KLK5抗體係全長IgG1抗體。在一些實施例中，抗KLK5抗體係單株小鼠IgG2B抗體。在一些實施例中，單株小鼠IgG2B抗體係mAb1108 (純系編號193318, R & D Systems, Minneapolis, MN)。
在另一態樣中，根據以上實施例中任一者之抗KLK5抗體可單獨或組合併入任一特徵，如下文部分中所闡述： 1. 親和力
在一些實施例中，本文所提供之抗KLK5抗體之解離常數(Kd)為≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM及/或≤ 0.001 nM (例如，10-8 M或更低，例如10-8 M至10-13 M，例如10-9 M至10-13 M)。在一實施例中，Kd係藉由放射標記抗原結合分析(RIA)來量測。在一個實施例中，RIA係利用抗KLK5抗體之Fab形式及其抗原來實施。舉例而言，Fab對抗原之溶液結合親和力係藉由以下來量測：在滴定系列之未標記抗原存在下，利用最低濃度之(125 I)標記之抗原平衡Fab，接著利用抗Fab抗體包覆之盤捕獲所結合抗原(例如，參見Chen等人， J. Mol. Biol. 293:865-881(1999))。為確立該分析之條件，利用50 mM碳酸鈉(pH 9.6)中之5 μg/ml捕獲用抗Fab抗體(Cappel Labs)將MICROTITER® 多孔盤(Thermo Scientific)包覆過夜，且隨後在室溫下(大約23℃)利用PBS中之2% (w/v)牛血清白蛋白封阻2至5小時。在非吸附性盤(Nunc編號269620)中，將100 pM或26 pM [125 I]抗原與所關注Fab之連續稀釋液混合(例如，與Presta等人，Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)中對抗VEGF抗體Fab-12之評價一致)。接著將所關注Fab培育過夜；然而，可繼續培育較長時間(例如約65小時)以確保達到平衡。之後，將混合物轉移至捕獲盤以在室溫下進行培育(例如1小時)。接著去除溶液且利用於PBS中之0.1%聚山梨醇酯20 (TWEEN-20® )將盤洗滌8次。在盤已乾燥時，添加150 μl/孔之閃爍體(MICROSCINT-20TM ；Packard)，且在TOPCOUNTTM γ計數器(Packard)上經10分鐘對該等盤進行計數。選擇得到小於或等於20%之最大結合之每一Fab之濃度用於競爭性結合分析。
根據另一實施例，使用BIACORE® 表面電漿共振分析來量測Kd。舉例而言，使用BIACORE® -2000或BIACORE® -3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)之分析係在25℃下利用固定化抗原CM5晶片以約10個反應單位(RU)實施。在一個實施例中，根據供應商說明使用N -乙基-N’ -(3-二甲基胺基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N -羥基琥珀醯亞胺(NHS)來活化羧甲基化之右旋糖酐生物感測器晶片(CM5, BIACORE, Inc.)。利用10 mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5 μg/ml (約0.2 μM)，之後以5 μl/分鐘之流速注射以達成大約10個反應單位(RU)之偶合多肽。在注射抗原後，注射1 M乙醇胺以阻斷未反應之基團。對於動力學量測，在25℃下以大約25 μl/min之流速注射於含有0.05%聚山梨醇酯20 (TWEEN-20TM )表面活性劑之PBS (PBST)中之Fab之兩倍連續稀釋物(0.78 nM至500 nM)。使用簡單一對一Langmuir結合模型(BIACORE® 評估軟體3.2版)藉由同時擬合締合及解離感測圖來計算締合速率(k締合 )及解離速率(k解離 )。平衡解離常數(Kd )係計算為比率k解離 / k締合。 例如，參見Chen等人，J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)。若藉由上文表面電漿共振分析測得之締合速率超過106 M-1 s-1 ，則締合速率可藉由使用螢光淬滅技術來測定，該技術在25℃下在增加濃度之抗原存在下量測於PBS (pH 7.2)中之20 nM抗-抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度之增加或減少(激發= 295 nm；發射= 340 nm，16 nm帶通)，如在分光光度計(例如具有攪拌比色杯之停流裝備之分光光度計(Aviv Instruments)或8000-系列SLM- AMINCOTM 分光光度計(ThermoSpectronic))中所量測。 2. 抗體片段
在一些實施例中，本文所提供之抗KLK5抗體係抗體片段。抗體片段包括(但不限於) Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 、Fv及scFv片段及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003)。關於scFv片段之綜述，例如參見Pluckthün，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies ，第113卷，Rosenburg及Moore編輯(Springer-Verlag, New York)，第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含補救受體結合表位殘基且具有增加活體內半衰期之Fab及F(ab')2 片段之論述，參見美國專利第5,869,046號。
雙價抗體係具有兩個抗原結合位點之可為二價或雙特異性之抗體片段。例如，參見EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)。三價抗體及四價抗體亦闡述於Hudson等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003)中。
單一結構域抗體係包含抗體中重鏈可變結構域之全部或一部分或輕鏈可變結構域之全部或一部分之抗體片段。在一些實施例中，單一結構域抗體係人類單一結構域抗體(Domantis, Inc.,Waltham, MA；例如，參見美國專利第6,248,516號)。
抗體片段可藉由各種技術來製得，該等技術包括(但不限於)蛋白水解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E. coli )或噬菌體)來產生，如本文所述。 3. 嵌合及人類化抗體
在一些實施例中，本文所提供之抗KLK5抗體係嵌合抗體。某些嵌合抗體闡述於(例如)美國專利第4,816,567號及Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 81:6851-6855 (1984))中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如，源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(例如猴子)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體係其中類別或亞類已自親代抗體之類別或亞類發生變化之「類別切換」抗體。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在一些實施例中，嵌合抗體係人類化抗體。通常，將非人類抗體人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親代非人類抗體之特異性及親和力。通常，人類化抗體包含一或多個可變結構域，其中HVR (例如，CDR)(或其部分)係源自非人類抗體，且FR(或其部分)係源自人類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，產生HVR殘基之抗體)之相應殘基取代以(例如)恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製備方法綜述於(例如) Almagro及Fransson，Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)中，且進一步闡述於(例如)以下文獻中：Riechmann等人，Nature 332:323-329 (1988)；Queen等人Proc.Nat ' l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；美國專利第5, 821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36:25-34 (2005)(闡述特異性決定區(SDR)接枝)；Padlan，Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)(闡述「表面重塑」)；Dall’Acqua等人，Methods 36:43-60 (2005)(闡述「FR改組」)；及Osbourn等人， Methods 36:61-68 (2005)及Klimka等人，Br. J. Cancer ，83:252-260 (2000) (闡述FR改組之「引導選擇」方法)。
可用於人類化之人類框架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之框架區(例如，參見，Sims等人，J. Immunol. 151:2296 (1993))；源自輕鏈或重鏈可變區之特定亞組之人類抗體之共有序列的框架區(例如，參見，Carter等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 89:4285 (1992)；及Presta等人，J. Immunol. , 151:2623 (1993))；人類成熟(體細胞突變)框架區或人類種系框架區(例如，參見，Almagro及Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))；及源自篩選FR文庫之框架區(例如，參見，Baca等人，J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及Rosok等人，J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996))。 4. 人類抗體
在一些實施例中，本文所提供之抗KLK5抗體係人類抗體。人類抗體可使用業內已知之各種技術來產生。人類抗體概述於van Dijk及van de Winkel，Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)及Lonberg，Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)中。
可藉由向轉基因動物投與免疫原來製備人類抗體，該轉基因動物已經改良以產生完整人類抗體或具有因應抗原性攻擊之人類可變區之完整抗體。此等動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，該等基因座替代內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在此等轉基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常已不活化。關於自轉基因動物獲得人類抗體之方法之綜述，參見Lonberg，Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)。例如，亦參見美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，其闡述XENOMOUSETM 技術；美國專利第5,770,429號，其闡述HuMab®技術；美國專利第7,041,870號，其闡述K-M MOUSE®技術；及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，其闡述VelociMouse®技術。可進一步(例如)藉由與不同人類恆定區組合來修飾由此等動物產生之完整抗體之人類可變區。
人類抗體亦可藉由基於雜交瘤之方法來製備。已闡述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞系。(例如，參見KozborJ. Immunol. , 133: 3001 (1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及Boerner等人，J. Immunol ., 147: 86 (1991)。)經由人類B細胞雜交瘤技術產生之人類抗體亦闡述於Li等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 103:3557-3562 (2006)中。其他方法包括闡述於(例如)美國專利第7,189,826號(闡述來自雜交瘤細胞系之單株人類IgM抗體之產生)及Ni，Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (闡述人類-人類雜交瘤)中之彼等方法。人類雜交瘤技術(Trioma technology)亦闡述於Vollmers及Brandlein，Hist. & Histopath ., 20(3):927-937 (2005)及Vollmers及Brandlein，Methods Find Exp. Clin. Pharmacol ., 27(3):185-91 (2005)中。
人類抗體亦可藉由分離選自人類源噬菌體展示文庫之Fv純系可變結構域序列來產生。此等可變結構域序列可然後與期望之人類恆定結構域進行組合。自抗體文庫選擇人類抗體之技術闡述於下文中。 5. 文庫源抗體
抗KLK5抗體可藉由篩選組合文庫中具有一或多種期望活性之抗體來分離。舉例而言，業內已知用於產生噬菌體展示文庫及自此等庫篩選具有期望結合特性之抗體之多種方法。此等方法綜述於(例如) Hoogenboom等人，Methods Mol. Biol. 178:1-37 (O’Brien等人編輯，Human Press, Totowa, NJ, 2001)且進一步闡述於(例如) McCafferty等人，Nature 348:552-554；Clackson等人，Nature 352: 624-628 (1991)；Marks等人，J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)；Marks及Bradbury，Methods Mol. Biol. 248:161-175 (Lo編輯, Human Press, Totowa, NJ, 2003)；Sidhu等人，J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee等人，J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及Lee等人，J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)中。
在某些噬菌體展示方法中，藉由聚合酶鏈式反應(PCR)來單獨選殖VH及VL基因之譜且將其隨機重組於噬菌體文庫中，其可然後篩選抗原結合噬菌體，如Winter等人，Ann. Rev. Immunol ., 12: 433-455 (1994)中所闡述。噬菌體通常展示呈單鏈Fv (scFv)片段或呈Fab片段之抗體片段。來自免疫化來源之文庫可向免疫原提供高親和力抗體而無需構築雜交瘤。或者，可選殖天然譜(例如，自人類)以向各種無任何免疫之非自體抗原以及自體抗原提供單一來源之抗體，如Griffiths等人，EMBO J , 12: 725-734 (1993)所闡述。最終，亦可藉由以下方式以合成方式製得天然文庫：選殖來自幹細胞之未重排V-基因區段，且使用含有隨機序列之PCR引子編碼高度可變CDR3區且在活體外完成重排，如Hoogenboom及Winter，J. Mol. Biol ., 227: 381-388 (1992)中所闡述。描述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括例如：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
本文中將自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段視為人類抗體或人類抗體片段。 6. 多特異性抗體
在一些實施例中，本文所提供之抗KLK5抗體係多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體係對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在一些實施例中，結合特異性中之一者係KLK5且另一者係關於任一其他抗原。在一些實施例中，雙特異性抗體可結合至KLK5之兩個不同表位。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑局域化至表現KLK5之細胞。雙特異性抗體可以全長抗體或抗體片段形式來製備。
製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見Milstein及Cuello,Nature 305: 537 (1983))、WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J. 10: 3655 (1991))及「隆凸於孔洞中(knob-in-hole)」改造(例如，參見美國專利第5,731,168號)。多特異性抗體亦可藉由以下方式來製備：改造用於製備抗體Fc-異源二聚分子之靜電牽引效應(WO 2009/089004A1)；使兩個或更多個抗體或片段交聯(例如，參見美國專利第4,676,980號及Brennan等人，Science 229: 81 (1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(例如，參見Kostelny等人，J. Immunol ., 148(5):1547-1553 (1992))；使用用於製備雙特異性抗體片段之「雙價抗體」技術(例如，參見Hollinger等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 90:6444-6448 (1993))；及使用單鏈Fv (sFv)二聚體(例如，參見Gruber等人，J. Immunol. 152:5368 (1994))；及製備三特異性抗體(例如，如Tutt等人，J. Immunol. 147: 60 (1991)中所闡述)。
本文亦包括具有三個或更多個功能抗原結合位點之經改造抗體，包括「章魚抗體(Octopus antibodies)」(例如，參見US 2006/0025576A1)。
本文之抗體或片段亦包括「雙重作用之FAb」或「DAF」，其包含結合至所關注多肽(例如KLK5)以及另一不同抗原之抗原結合位點(例如，參見US 2008/0069820)。B. KLK5 結合多肽
亦提供結合KLK5之結合多肽(KLK5結合多肽)以用於本文所述之方法中。在一些實施例中，KLK5結合多肽係KLK5拮抗劑。在一些實施例中，KLK5結合多肽係融合多肽。在一些實施例中，融合多肽係SPINK融合多肽。在一些實施例中，SPINK融合多肽係SPINK Fc融合多肽。在一些實施例中，SPINK Fc融合多肽包含2個SPINK多肽或其片段。在結合多肽中任一者之一些實施例中，該2個SPINK多肽中之每一者或其片段包含一或多個SPINK5之結構域。在一些實施例中，該2個SPINK5多肽中之每一者或其片段包含1、2、3、4、5、6、7及/或8個Kazal結構域。在一些實施例中，該2個SPINK5多肽中之每一者或其片段包含1個Kazal結構域(亦即，每個SPINK5 Fc融合多肽2個Kazal結構域)。在一些實施例中，該2個SPINK5多肽中之每一者或其片段包含4個Kazal結構域(亦即，每個SPINK5 Fc融合多肽8個Kazal結構域)。在一些實施例中，該4個Kazal結構域係Kazal結構域6、7、8及/或9。在一些實施例中，Kazal結構域6、7、8及/或9係來自小鼠SPINK5 (UNIPROT Q5K5D4)。在一些實施例中，Kazal結構域6、7、8及/或9包含來自小鼠SPINK5 (UNIPROT Q5K5D4)之胺基酸殘基E421-A695。在一些實施例中，SPINK5 Fc融合多肽包含SPINK5胺基酸序列SEQ ID NO:17。在一些實施例中，SPINK5 Fc融合多肽之Fc區係選自由以下組成之群：IgG1 Fc區、IgG2a Fc區及IgG4 Fc區。在一些實施例中，Fc區係IgG2a Fc區。在一些實施例中，IgG2a Fc區係小鼠IgG2a Fc區。在一些實施例中，SPINK5 Fc融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:16。在一些實施例中，該2個SPINK5多肽中之每一者或其片段包含1個Kazal結構域(亦即，每個SPINK5 Fc融合多肽2個Kazal結構域)。在一些實施例中，該1個Kazal結構域係Kazal結構域4。在一些實施例中，Kazal結構域4係來自小鼠SPINK5 (UNIPROT Q5K5D4)。在一些實施例中，Kazal結構域4包含來自小鼠SPINK5 (UNIPROT Q5K5D4)之胺基酸殘基M293-R355。在一些實施例中，SPINK5 Fc融合多肽之Fc區係選自由以下組成之群：IgG1 Fc區、IgG2a Fc區及IgG4 Fc區。在一些實施例中，Fc區係IgG2a Fc區。在一些實施例中，IgG2a Fc區係小鼠IgG2a Fc區。在一些實施例中，SPINK5 Fc融合多肽包含SPINK5胺基酸序列SEQ ID NO:22。在一些實施例中，SPINK5 Fc融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:21。在一些實施例中，該4個Kazal結構域係Kazal結構域8、9、10及/或11。在一些實施例中，Kazal結構域8、9、10及/或11係來自人類SPINK5 (UNIPROT Q9NQ38)。在一些實施例中，Kazal結構域8、9、10及/或11包含來自人類SPINK5 (UNIPROT Q9NQ38)之胺基酸殘基E490-Y757。在一些實施例中，SPINK5 Fc融合多肽包含SPINK5胺基酸序列SEQ ID NO:15。在一些實施例中，SPINK5 Fc融合多肽之Fc區係選自由以下組成之群：IgG1 Fc區、IgG2a Fc區及IgG4 Fc區。在一些實施例中，Fc區係IgG1 Fc區。在一些實施例中，IgG1 Fc區係人類IgG1 Fc區。在一些實施例中，人類IgG1 Fc區在位置356處具有胺基酸E。在一些實施例中，人類IgG1 Fc區在位置358處具有胺基酸M。在一些實施例中，SPINK5 Fc融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:13。在一些實施例中，Fc區係IgG4 Fc區。在一些實施例中，IgG4 Fc區係人類IgG4 Fc區。在一些實施例中，人類IgG4 Fc區在位置228處具有胺基酸S。在一些實施例中，人類IgG4 Fc區在位置228處具有胺基酸P。在一些實施例中，SPINK5 Fc融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:14。在一些實施例中，該2個SPINK5多肽中之每一者或其片段包含1個Kazal結構域(亦即，每個SPINK5 Fc融合多肽2個Kazal結構域)。在一些實施例中，該1個Kazal結構域係Kazal結構域5。在一些實施例中，Kazal結構域5係來自人類SPINK5 (UNIPROT Q9NQ38)。在一些實施例中，Kazal結構域5包含來自人類SPINK5 (UNIPROT Q9NQ38)之胺基酸殘基R291-R352。在一些實施例中，SPINK5 Fc融合多肽之Fc區係選自由以下組成之群：IgG1 Fc區、IgG2a Fc區及IgG4 Fc區。在一些實施例中，Fc區係IgG1 Fc區。在一些實施例中，IgG1 Fc區係人類IgG1 Fc區。在一些實施例中，人類IgG1 Fc區在位置356處具有胺基酸E。在一些實施例中，人類IgG1 Fc區在位置358處具有胺基酸M。在一些實施例中，SPINK5 Fc融合多肽包含SPINK5胺基酸序列SEQ ID NO:20。在一些實施例中，SPINK5 Fc融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:18。在一些實施例中，Fc區係IgG4 Fc區。在一些實施例中，IgG4 Fc區係人類IgG4 Fc區。在一些實施例中，人類IgG4 Fc區在位置228處具有胺基酸S。在一些實施例中，人類IgG4 Fc區在位置228處具有胺基酸P。在一些實施例中，SPINK5 Fc融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:19。
在結合多肽中任一者之一些實施例中，該2個SPINK多肽中之每一者或其片段包含1個SPINK9結構域。在一些實施例中，該2個SPINK9多肽中之每一者或其片段包含1個Kazal結構域(亦即，每個SPINK9 Fc融合多肽2個Kazal結構域)。在一些實施例中，該1個Kazal結構域係Kazal結構域1。在一些實施例中，Kazal結構域1係來自人類SPINK9 (UNIPROT Q5DT21)。在一些實施例中，Kazal結構域1包含來自人類SPINK9 (UNIPROT Q5DT21)之胺基酸殘基I20-C86。在一些實施例中，來自人類SPINK9之I20-C86在位置22處包含胺基酸C。在一些實施例中，來自人類SPINK9之I20-C86在位置22處包含胺基酸S。在一些實施例中，來自人類SPINK9之I20-C86在位置48處包含胺基酸H。在一些實施例中，來自人類SPINK9之I20-C86在位置48處包含胺基酸R。在一些實施例中，來自人類SPINK9之I20-C86在位置49處包含胺基酸M。在一些實施例中，來自人類SPINK9之I20-C86在位置49處包含胺基酸E。在一些實施例中，來自人類SPINK9之I20-C86包含SPINK9胺基酸序列SEQ ID NO:28。在一些實施例中，SPINK9 Fc融合多肽之人類Fc區係選自由以下組成之群：IgG1 Fc區、IgG2a Fc區及IgG4 Fc區。在一些實施例中，Fc區係IgG1 Fc區。在一些實施例中，IgG1 Fc區係人類IgG1 Fc區。在一些實施例中，人類IgG1 Fc區在位置356處具有胺基酸E。在一些實施例中，人類IgG1 Fc區在位置358處具有胺基酸M。在一些實施例中，SPINK9 Fc融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:25。在一些實施例中，Fc區係IgG2a Fc區。在一些實施例中，IgG2a Fc區係人類IgG2a Fc區。在一些實施例中，SPINK9 Fc融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:27。在一些實施例中，Fc區係IgG4 Fc區。在一些實施例中，IgG4 Fc區係人類IgG4 Fc區。在一些實施例中，人類IgG4 Fc區在位置228處具有胺基酸S。在一些實施例中，人類IgG4 Fc區在位置228處具有胺基酸P。在一些實施例中，SPINK9 Fc融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO:26。
KLK5結合多肽可使用已知多肽合成方法學來化學合成或可使用重組技術來製備及純化。KLK5結合多肽之長度通常為至少約5個胺基酸，或者長度為至少約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95及/或100個胺基酸及/或更多，其中此等KLK5結合多肽能夠結合、較佳地特異性地結合至KLK5。
KLK5結合多肽可使用熟知技術無需過多實驗來鑑別。就此而言，應注意，用於篩選多肽文庫以結合能夠特異性結合至KLK5之多肽的技術為業內所熟知(例如，參見美國專利第5,556,762號、第5,750,373號、第4,708,871號、第4,833,092號、第5,223,409號、第5,403,484號、第5,571,689號、第5,663,143號；PCT公開案第WO 84/03506號及第WO84/03564號；Geysen等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 81:3998-4002 (1984)；Geysen等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 82:178-182 (1985)；Geysen等人，Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)；Geysen等人，J. Immunol. Meth ., 102:259-274 (1987)；Schoofs等人，J. Immunol ., 140:611-616 (1988)；Cwirla, S. E.等人，(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 87:6378；Lowman, H.B.等人，(1991)Biochemistry , 30:10832；Clackson, T.等人，(1991)Nature 352: 624；Marks, J. D.等人，(1991),J. Mol. Biol. , 222:581；Kang, A.S.等人，(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 88:8363及Smith, G. P. (1991)Current Opin. Biotechnol. , 2:668)。
產生肽文庫及篩選該等文庫之方法亦揭示於美國專利第5,723,286號、第5,432,018號、第5,580,717號、第5,427,908號、第5,498,530號、第5,770,434號、第5,734,018號、第5,698,426號、第5,763,192號及第5,723,323號中。C. KLK5 小分子拮抗劑
本文提供用作KLK5小分子拮抗劑之小分子，其用於上文所闡述之方法中。在一些實施例中，該小分子拮抗劑實質上或完全抑制KLK5生物活性。在一些實施例中，生物活性係絲胺酸蛋白酶活性。在一些實施例中，生物活性係胰蛋白酶樣絲胺酸蛋白酶活性。在一些實施例中，KLK5小分子拮抗劑係蛋白酶抑制劑。在一些實施例中，蛋白酶抑制劑係亮抑酶肽。
小分子較佳係除如本文所定義之結合多肽或抗體以外之有機分子，其較佳地特異性結合至如本文所述之KLK5。結合有機小分子可使用已知方法學來鑑別及化學合成(例如，參見PCT公開案第WO00/00823號及第WO00/39585號)。結合有機小分子之大小通常小於約2000道耳頓，或者大小小於約1500、750、500、250或200道耳頓，其中能夠結合、較佳地特異性結合至如本文所述之多肽之此等有機小分子可使用熟知技術無需過多實驗來鑑別。就此而言，應注意，用於篩選能夠結合至所關注多肽之分子之有機小分子文庫之技術為業內所熟知(例如，參見PCT公開案第WO00/00823號及第WO00/39585號)。結合有機小分子可係(例如)醛、酮、肟、腙、縮胺基脲、卡肼、一級胺、二級胺、三級胺、N-取代之肼、醯肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、醯胺、脲、胺基甲酸酯、碳酸酯、縮酮、縮硫酮、縮醛、縮硫醛、芳基鹵、芳基磺酸鹽、烷基鹵、烷基磺酸鹽、芳香族化合物、雜環化合物、苯胺、烯烴、炔烴、二醇、胺基醇、噁唑啶、噁唑啉、噻唑啶、噻唑啉、烯胺、磺醯胺、環氧化物、氮丙啶、異氰酸酯、磺醯氯、重氮化合物、酸性氯化物或諸如此類。D. KLK5 拮抗劑多核苷酸
本文亦提供用於本文所述方法中之KLK5多核苷酸拮抗劑。KLK5多核苷酸拮抗劑可係反義核酸及/或核酶。反義核酸包含與KLK5之RNA轉錄物之至少一部分互補之序列。然而，絕對互補性儘管較佳，但並不需要。
KLK5多核苷酸拮抗劑可係在嚴格條件下與KLK5核酸序列雜交之核酸(例如，siRNA及CRISPR-RNA，包括具有CRISPR-RNA及tracrRNA序列之sgRNA)。參見 Mali等人，Science. 339: 823-26, (2013)。
本文所提及之「與RNA之至少一部分互補」之序列意指具有足夠互補性以能夠與RNA雜交從而形成穩定雙鏈體之序列；在雙鏈反義核酸之情形下，可由此測試雙鏈體DNA之單鏈，或可分析三鏈體形成。雜交能力將取決於互補性程度及反義核酸長度二者。通常，雜交核酸愈大，則其可含有愈多之與RNA之鹼基錯配且仍形成穩定之雙鏈體(或視情形而定三鏈體)。熟習此項技術者藉由使用測定雜交複合物熔點之標準程序可確定錯配之可容忍度。
與訊息之5'端互補之多核苷酸(例如，5'未經轉譯之序列直至且包括AUG起始密碼子)應在抑制轉譯方面最有效地起作用。然而，與mRNA之3'未經轉譯序列互補之序列亦已顯示有效抑制mRNA之轉譯。概言之參見 Wagner, R., 1994,Nature 372:333-335。因此，與基因之5'-或3'-非轉譯、非編碼區互補之寡核苷酸可用於反義方法中以抑制內源mRNA之轉譯。與mRNA之5'未經轉譯區互補之多核苷酸應包括AUG起始密碼子之互補序列。與mRNA編碼區互補之反義多核苷酸係有效性較低之轉譯抑制劑。無論設計為與mRNA之5'-、3'-或編碼區雜交，反義核酸之長度應為至少六個核苷酸，且較佳係長度在6至約50個核苷酸範圍內之寡核苷酸。在特定態樣中，寡核苷酸為至少10個核苷酸、至少17個核苷酸、至少25個核苷酸或至少50個核苷酸。E. 本文所述抗體及結合多肽之變異體 1. 糖基化變異體
在以上實施例中之任一者中，改變本文所提供之抗體(例如，抗KLK5抗體)或結合多肽(例如，KLK5結合多肽)以增加或降低抗體或結合多肽糖基化之程度。多肽糖基化位點之添加或缺失可藉由改變胺基酸序列從而使得產生或移除一或多個糖基化位點來便捷地完成。
倘若抗體或結合多肽包含Fc區，則其所附接之碳水化合物可改變。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含具支鏈、二分枝寡醣，其通常藉由N-連接附接至Fc區之CH2結構域之Asn297。例如，參見Wright等人，TIBTECH 15:26-32 (1997)。該寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸以及附接至二分枝寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc之海藻醣。在一些實施例中，可對如本文所述之抗體或結合多肽中之寡醣進行修飾以產生具有某些改良性質之變異體。
在一個實施例中，提供具有缺乏附接(直接或間接)至Fc區之海藻醣之碳水化合物結構之抗體或結合多肽變異體。舉例而言，此抗體或Fc融合多肽中海藻醣之量可係1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。海藻醣之量係藉由計算糖鏈內Asn297處之海藻醣相對於附接至Asn 297之所有糖結構(例如複合、雜合及高甘露糖結構)之總和的平均量來測定，如藉由MALDI-TOF質譜法所量測，如 (例如)WO 2008/077546中所闡述。Asn297係指位於Fc區中約位置297處之天冬醯胺殘基(Fc區殘基之Eu編號)；然而，因抗體或結合多肽中之微小序列變化，故Asn297亦可位於位置297上游或下游之約± 3個胺基酸處，亦即，介於位置294與位置300之間。此等海藻糖基化變異體可具有改良之ADCC功能。例如，參見美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta, L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。與「去海藻糖基化」或「海藻醣缺乏」抗體變異體有關之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech. Bioeng . 87: 614 (2004)。 能夠產生去海藻糖基化抗體之細胞系之實例包括缺乏多肽海藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta, L；及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其在實例11中)及基因剔除細胞系，例如α-1,6-海藻醣基轉移酶基因FUT8剔除CHO細胞(例如，參見Yamane-Ohnuki等人，Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y.等人，Biotechnol. Bioeng. , 94(4):680-688 (2006)；及WO2003/085107)。
進一步提供二等分寡醣之抗體變異體，例如，其中附接至抗體Fc區之二分枝寡醣由GlcNAc二等分。此等抗體變異體可具有降低之海藻糖基化及/或改良之ADCC功能。此等抗體變異體之實例闡述於(例如) WO 2003/011878 (Jean-Mairet等人)、美國專利第6,602,684號(Umana等人)及US 2005/0123546 (Umana等人)中。亦提供在附接至Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變異體。此等抗體變異體可具有改良之CDC功能。此等抗體變異體闡述於(例如) WO 1997/30087 (Patel等人)、WO 1998/58964 (Raju, S.)及WO 1999/22764 (Raju, S.)中。2. Fc區變異體
在一些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入至抗體(例如，抗KLK5抗體)或結合多肽(例如，KLK5結合多肽)之Fc區中。Fc區變異體可包含人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，該序列在一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如取代)。
在一些實施例中，提供具有一些但非所有效應物功能之抗體變異體或結合多肽變異體，此情況使其成為多個應用之合意的候選物，在該等應用中抗體或結合多肽之活體內半衰期較為重要，但某些效應物功能(例如補體及ADCC)係不必要或有害的。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析來確認CDC及/或ADCC活性之降低/消耗。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體或結合多肽缺乏FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。調介ADCC之主要細胞NK細胞僅表現Fc(RIII)，而單核球表現Fc(RI)、Fc(RII)及Fc(RIII)。FcR於造血細胞上之表現彙總於Ravetch及Kinet，Annu. Rev. Immunol 9:457-492 (1991)之第464頁上之表3中。評價所關注分子之ADCC活性之活體外分析之非限制性實例闡述於美國專利第5,500,362號(例如，參見Hellstrom, I.等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986))及Hellstrom, I等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；5,821,337 (參見Bruggemann, M.等人，J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987))中。或者，可採用非放射性分析方法(例如，參見用於流式細胞術之ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)及CytoTox 96® 非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI))。可用於此等分析之效應細胞包括末梢血單核細胞(PBMC)及天然殺手(NK)細胞。或者或另外，可在活體內評價所關注分子之ADCC活性，例如在諸如Clynes等人，Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)中所揭示之動物模型中。亦可實施C1q結合分析以確認抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。例如，參見WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評價補體活化，可實施CDC分析(例如，參見Gazzano-Santoro等人，J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S.等人，Blood 101:1045-1052 (2003)；及Cragg, M.S.及M.J. Glennie,Blood 103:2738-2743 (2004))。亦可使用業內已知之方法來實施FcRn結合及活體內清除/半衰期測定(例如，參見Petkova, S.B.等人，Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006))。
具有降低效應物功能之抗體包括具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者的取代之彼等抗體(美國專利第6,737,056號)。此等Fc突變異體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者處具有取代之Fc突變異體，包括在殘基265及297處取代為丙胺酸之所謂的「DANA」Fc突變異體(美國專利第7,332,581號)。
闡述具有經改良或減小之與FcR結合之某些抗體或結合多肽變異體。(例如，參見美國專利第6,737,056號、WO 2004/056312及Shields等人，J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001))。在一些實施例中，抗體變異體或結合多肽變異體包含具有一或多個改良ADCC之胺基酸取代之Fc區，例如在Fc區之位置298、333及/或334處之取代(殘基之EU編號)。在一些實施例中，在Fc區中作出改變，從而改變(亦即，改良或減小) C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如，如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人，J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)中所闡述。
具有延長之半衰期及與新生Fc受體(FcRn) (其負責將母體IgG轉移至胎中) (Guyer等人，J. Immunol . 117:587 (1976)及Kim等人，J. Immunol . 24:249 (1994))之改良結合之抗體闡述於US2005/0014934A1 (Hinton等人)中。彼等抗體包含具有一或多個改良Fc區與FcRn之結合之取代的Fc區。此等Fc變異體包括在以下Fc區殘基之一或多者處具有取代之彼等變異體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，取代Fc區殘基434 (美國專利第7,371,826號)。亦參見Duncan及Winter，Nature 322:738-40 (1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及關於Fc區變異體之其他實例之WO 94/29351。 3. 半胱胺酸改造之變異體
在一些實施例中，可期望產生半胱胺酸改造之抗體(例如抗KLK5抗體)或結合多肽(例如，KLK5結合多肽)，其中一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在具體實施例中，經取代殘基係在抗體或結合多肽之可及位點處出現。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基團藉此位於抗體之可及位點處且可用於使抗體或結合多肽偶聯至其他部分(例如藥物部分或連接子-藥物部分)，以產生免疫偶聯物，如本文進一步所闡述。在一些實施例中，以下殘基中之任一者或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205 (Kabat編號)；重鏈之A118 (EU編號)；及重鏈Fc區之S400 (EU編號)。半胱胺酸改造之抗體或Fc融合多肽可如(例如)美國專利第7,521,541號中所述來產生。 4. 胺基酸變異體抗體變異體
在一些實施例中，涵蓋本文所提供之抗體(例如，抗KLK5抗體)或結合多肽(例如，KLK5結合多肽)之胺基酸序列變異體。舉例而言，可期望改良抗體或結合多肽之結合親和力及/或其他生物學性質。抗體或結合多肽之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入至編碼抗體或結合多肽之核苷酸序列中或藉由肽合成來製備。此等修飾包括(例如)抗體或結合多肽之胺基酸序列內殘基之缺失及/或***及/或取代。可實施缺失、***及取代之任一組合以達成最終構築體，條件係最終構築體具有期望特性，例如抗原結合性。
在一些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體或結合多肽變異體。用於取代突變誘發之所關注位點包括HVR及FR。保守取代示於表 1 中之「較佳取代」標題下。更多實質性變化提供於表 1 之「例示性取代」標題下，且如下文參考胺基酸側鏈類別進一步所闡述。可將胺基酸取代引入至抗體或結合多肽及經篩選具有期望活性之產物中，該期望活性係(例如)保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性或經改良之ADCC或CDC。表 1
可根據常見側鏈性質將胺基酸分組： (1) 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3) 酸性：Asp、Glu； (4) 鹼性：His、Lys、Arg； (5) 影響鏈定向之殘基：Gly、Pro； (6) 芳香族殘基：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將使得需要將該等類別中一者之成員交換為另一類別。 5. 衍生物
在一些實施例中，本文所提供之抗體(例如，抗KLK5抗體)或結合多肽(例如，KLK5結合多肽)可進一步經修飾以含有業內已知且容易獲得之其他非蛋白質性部分。適用於衍生抗體或結合多肽之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或隨機共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯基基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化之多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其在水中具有穩定性而在製造方面具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為具支鏈或非具支鏈。附接至抗體及/或結合多肽之聚合物的數量可有所變化，且若附接一個以上之聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，衍生所用聚合物之數量及/或類型可基於包括(但不限於)以下之考慮因素來確定：欲改良之抗體及/或結合多肽之具體性質或功能、抗體衍生物及/或結合多肽衍生物是否將用於界定條件下之療法等。
在另一實施例中，提供抗體及/或結合多肽與非蛋白質性部分之偶聯物，其可藉由暴露於輻射來選擇性加熱。在一個實施例中，非蛋白質性部分係碳奈米管(Kam等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。輻射可具有任何波長，且包括(但不限於)如下波長之輻射：其並不危害正常細胞，但將非蛋白質性部分加熱至可將毗鄰抗體及/或結合多肽-非蛋白質性部分之細胞殺死之溫度。IV. 醫藥調配物及投與方法
如本文所述之KLK5拮抗劑之醫藥調配物係藉由將具有期望純度之此等拮抗劑與一或多種可選之醫藥學上可接受之載劑以凍乾調配物或水溶液形式混合來製備。參見 Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版, Osol, A.編輯(1980)。在一些實施例中，本文所提供之KLK5拮抗劑係抗體(例如，抗KLK5抗體)、結合多肽(例如，KLK5結合多肽)、多核苷酸(例如，KLK5多核苷酸拮抗劑，例如siRNA或CRISPR-RNA，包括具有CRISPR-RNA及tracrRNA序列之sgRNA)及小分子(例如，小分子蛋白酶抑制劑)。
醫藥學上可接受之載劑通常在所用劑量及濃度下對接受者無毒，且包括(但不限於)：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；六甲氯銨；苯紮氯銨(benzalkonium chloride)；苄索氯銨(benzethonium chloride)；酚、丁基醇或苄基醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；鹽形成相對離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。本文之例示性醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，例如可溶性中性活性透明質酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人類可溶性PH-20透明質酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(HYLENEX® , Baxter International, Inc.)。某些例示性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)闡述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，將sHASEGP與一或多種額外糖胺多糖酶(例如軟骨素酶)組合。
例示性凍乾調配物闡述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括闡述於美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中之彼等調配物，後者調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
本文之調配物亦可視需要含有一種以上用於所治療特定適應症之活性成分，較佳為具有彼此不會產生不利影響之補充活性之彼等成分。此等活性成分適宜地以有效地用於預期目的之量以組合形式存在。
活性成分亦可分別裝入藉由(例如)凝聚技術或介面聚合製備之微膠囊(例如，羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠質藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)或粗滴乳液中。參見 Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版, Osol, A.編輯(1980)。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適宜實例包括含有KLK5拮抗劑之固體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質呈成形物件之形式，例如膜或微膠囊。
欲用於活體內投與之調配物通常為無菌的。無菌性可藉由(例如)經由無菌過濾膜進行過濾來容易地完成。
本文進一步提供用於本文所述方法中之包含KLK5拮抗劑之醫藥調配物。在一些實施例中，該調配物包含醫藥學上可接受之載劑、佐劑或媒劑。在一些實施例中，該調配物包含有效地可量測地抑制KLK5蛋白酶活性之量之化合物。在一些實施例中，該調配物經調配用於向有需要之個體投與。
包含KLK5拮抗劑之調配物可以以下方式投與：經口、非經腸、藉由吸入噴霧、局部、經皮、經直腸、經鼻、經頰、舌下、經***、腹膜內、肺內、皮內、硬膜外或經由植入型藥盒(implanted reservoir)。如本文所用之術語「非經腸」包括皮下、靜脈內、肌內、關節內、滑膜內、胸骨內、鞘內、肝內、病灶內及顱內注射或輸注技術。
對於任何特定個體之具體劑量及治療方案將取決於多種因素，包括年齡、體重、一般健康、性別、飲食、投與時間、***速率、藥物組合、治療醫師之判斷及所治療特定疾病之嚴重程度。調配物中所提供KLK5拮抗劑之量亦將取決於調配物中之特定化合物。
在一個實施例中，每劑量中投與之KLK5拮抗劑之有效量將在約0.01 mg/kg-100 mg/kg範圍內、或者為約0.1 mg/kg個體體重/天至20 mg/kg個體體重/天，其中所用化合物之典型初始範圍為0.3 mg/kg/天至15 mg/kg/天。
KLK5拮抗劑可單獨使用或與如上文所述之用於治療之其他藥劑組合使用。舉例而言，醫藥組合調配物或投用方案中之第二藥劑可具有與KLK5拮抗劑之互補活性，從而使得其彼此不會產生不利影響。該等化合物可於單一醫藥調配物中一起投與或分開投與。
術語「共投與」係指同時投與或任何方式之分開依序投與KLK5拮抗劑及另外之一或多種活性醫藥成分。若投與不同時，則在彼此極其接近之時間內投與化合物。此外，化合物是否以相同劑型投與無所謂，例如，一種化合物可局部投與且另一化合物可經口投與。
通常，任何具有針對所治療之疾病或病狀之活性的藥劑可共投與。此等藥劑之實例可參見Cancer Principles and Practice of Oncology, V.T. Devita及S. Hellman (編輯), 第6版(2001年2月15日), Lippincott Williams & Wilkins Publishers。熟習此項技術者應能夠基於該等藥物之具體特性及所涉及疾病辨別出可使用何種藥劑組合。V. 篩選及 / 或鑑別具有期望功能之 KLK5 拮抗劑之方法
用於本文所述方法中之其他KLK5拮抗劑(包括抗體(例如，抗KLK5抗體)、結合多肽(例如，KLK5結合多肽)、多核苷酸(例如，KLK5多核苷酸拮抗劑，例如siRNA或CRISPR-RNA，包括具有CRISPR-RNA及tracrRNA序列之sgRNA)及小分子(例如，KLK5小分子拮抗劑，例如小分子蛋白酶抑制劑))可藉由業內已知之各種分析來鑑別、針對其物理學/化學性質及/或生物活性進行篩選或表徵。
候選KLK5拮抗劑可藉助一系列步驟進行計算評估及設計，其中針對與KLK5上個別結合靶向位點之締合能力來篩選及選擇化學實體或片段。熟習此項技術者可使用若干方法中之一者針對與KLK5、且更特定而言與KLK5上之靶向位點締合之能力來篩選化學實體或片段。該過程可基於KLK5坐標或業內已知之彼等坐標之子集藉由對(例如)電腦螢幕上之靶向位點進行視覺檢查來開始。
在篩選及/或鑑別方法中之任一者之一些實施例中，候選KLK5拮抗劑係抗KLK5抗體、KLK5結合多肽(例如，SPINK5 Fc融合多肽或SPINK9 Fc融合多肽)、KLK5多核苷酸拮抗劑或KLK5小分子拮抗劑。在一些實施例中，KLK5拮抗劑實質上或完全抑制KLK5之生物活性。在一些實施例中，生物活性係絲胺酸蛋白酶活性。在一些實施例中，生物活性係胰蛋白酶樣絲胺酸蛋白酶活性。在一些實施例中，KLK5拮抗劑結合至KLK5上之特定結合區。在一些實施例中，KLK5拮抗劑結合至KLK5之活性位點。
本文所提供之抗KLK5抗體、KLK5結合多肽、KLK5多核苷酸拮抗劑及/或KLK5小分子拮抗劑可藉由業內已知之各種分析來鑑別、針對其物理學/化學性質及/或生物活性進行篩選或表徵。
在一態樣中，針對本文所提供之抗KLK5抗體、KLK5結合多肽、KLK5多核苷酸拮抗劑及/或KLK5小分子拮抗劑之KLK5結合活性對其進行測試，例如藉由諸如ELISA、西方印漬分析、Scatchard細胞表面結合或表面電漿共振等已知方法。在另一態樣中，可使用競爭分析來鑑別與本文所提供之抗KLK5抗體或KLK5結合多肽競爭與KLK5結合之抗體。在另一態樣中，本文所提供之抗KLK5抗體或KLK5結合多肽可用於偵測生物樣品中KLK5之存在或生物樣品中所存在之KLK5的量。在一些實施例中，首先用非特異性同型對照抗體來封阻生物樣品以使樣品中之任何Fc受體飽和。
在一態樣中，提供用於鑑別本文所提供之抗KLK5抗體或KLK5結合多肽之生物活性之分析。在一些實施例中，用於鑑別生物活性之此等分析係(例如)肽受質分析或偶合分析。抗KLK5抗體或KLK5結合多肽之生物活性可包括(例如)與KLK5之結合且藉此降低KLK5之生物活性。在一些實施例中，抗KLK5抗體或KLK5結合多肽之生物活性可包括與KLK多肽之其他種類(例如，KLK7、KLK8及KLK14)之結合且藉此降低其生物活性。VI. 製品
在另一態樣中，提供含有可用於治療、預防及/或診斷上文所述病症之材料之製品。該製品包含容器及位於該容器上或與該容器相連之標籤或包裝插頁。適宜容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可自諸如玻璃或塑膠等多種材料形成。容器裝有自身或與另一有效治療、預防及/或診斷病狀之調配物組合之調配物，且可具有無菌存取通道(例如，該容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。調配物中之至少一種活性劑係如本文所述之KLK5拮抗劑。標籤或包裝插頁指示調配物用於治療所選病狀。此外，該製品可包含(a) 其中含有調配物之第一容器，其中該調配物包含KLK5拮抗劑及(b) 其中含有調配物之第二容器，其中該調配物包含氣喘治療劑。
在一些實施例中，該製品包含容器、該容器上之標籤及該容器內所含之調配物；其中該調配物包括一或多種試劑(例如，結合至一或多種生物標記或探針之一級抗體及/或針對本文所述生物標記中之一或多者之引子)，容器上之標籤指示該調配物可用於評估樣品中一或多種生物標記之存在，及使用該等試劑用於評估樣品中一或多種生物標記之存在之說明書。該製品可進一步包含一組用於製備樣品及利用試劑之說明書及材料。在一些實施例中，該製品可包括諸如一級及二級抗體二者等試劑，其中二級抗體偶聯至標記(例如，酶標記)。在一些實施例中，該製品一或多種針對本文所述生物標記中之一或多者之探針及/或引子。
在製品中任一者之一些實施例中，KLK5拮抗劑係如本文所提供之抗KLK5抗體、KLK5結合多肽、KLK5多核苷酸拮抗劑及/或KLK5小分子拮抗劑。
此實施例中之製品可進一步包含指示調配物可用於治療特定病狀之包裝插頁。在一些實施例中，該包裝插頁包含用於投與KLK5拮抗劑作為氣喘治療劑之說明書。或者或另外，該製品可進一步包含第二(或第三)容器，該容器包含醫藥學上可接受之緩衝劑，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者角度來看期望之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
該製品中之其他可選組分包括一或多種緩衝液(例如，封阻緩衝液、洗滌緩衝液、受質緩衝液等)、諸如藉由酶標記化學改變之受質(例如，色素原)、表位修復溶液、對照樣品(陽性及/或陰性對照)、對照玻片等其他試劑。 實例
以下係方法及調配物之實例。應理解，鑒於上文所提供之一般描述可實踐各種其他實施例。除非在申請專利範圍中另外明確陳述，否則本文所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如「例如」)之使用意欲僅更好地說明實施例且不一定加以任何限制。本文中所引用之所有文件均係以全文引用的方式併入。實例 1 材料及方法
所有機構研究均由當地機構審查委員會(institutional review board)審查並批准。另外，所有個體在基因分型之前均給予知情同意。基因分型係在表 2 中所彙總之多個不同平台上完成。表 2
以此順序實施樣品QC：(1) 檢出率(Call rate)＜ 95% (去除N=84) (2) 雜合性(去除N=82) (3) 相關性/重複/IBD (去除N=22) (4) 血統異常值(去除N=262)。對於每一單獨之數據集，以HapMap樣品運行EIGENSTRAT分析，且若樣品係關於歐洲(CEPH及TSI)組(N=383)之異常值，則將其排除。
實施SNP QC，若其(1) 檢出率＜ 95%, (2) 係單形態的且(3)自Hardy-Weinberg平衡嚴重偏離(P ＜ 1×10-7 )，則排除SNP。對於未與該構建對齊之數據集，實施至hg19之轉換(liftover)。另外，填補(imputation)管線需要所有數據集與正鏈對齊，此乃因HapMap數據係在正鏈上。使用Shapeit來檢查鏈問題且在可以時翻轉至正鏈。最後，選擇chr1-chr22中用於填補之SNP。合併之發現數據集具有299,784個與氣喘病例數據集及基於群體之數據集重疊之SNP。存在230,853個與構成複製數據集之8個不同病例及對照數據集重疊之SNP。
使用HapMap參考單倍型及通過品質控制作為推斷之基因型數據實施全基因體填補。在SNPTESTv2中之邏輯回歸模型中使用後填補基因型概率。另外，藉由調整重要主要組分來針對群體分層及複製數據集對發現數據集進行調整；選擇解釋＞1%方差之PC (參見 下文)。填補資訊＜ 0.6之SNP自分析排除。額外之分析後QC包括去除對照中MAF＜2%之任何SNP及組合病例及對照中HWE p值＜1E-10 之SNP。接著使用PLINK對發現及複製結果運行整合分析。使用0.1之異質性p值截止值來確定是否應將固定效應或隨機效應模型用於整合分析。
此分析中所使用之GTEx數據係自線上GTEx門戶(http://www.gtexportal.org/home/testyourown)獲得。搜索於2016年11月11日進行；針對KLK5輸入之命令係：rs117639512,KLK5, Esophagus_Gastroesophageal_Junction; rs117639512,KLK5, Esophagus_Muscularis; rs117639512,KLK5,Skin_Not_Sun_Exposed_Suprapubic; rs117639512,KLK5,Skin_Sun_Exposed_Lower_leg。針對KLK4輸入之命令係：rs117639512,KLK4, Prostate; rs117639512,KLK4,Uterus。
SPINK9與KLK5之結合親和力係使用BIAcore™-T200儀器藉由表面電漿共振(SRP)來量測。藉由蛋白質A生物感測器晶片(GE Healthcare，目錄號29127557)捕獲內部表現之具有鼠類IgG2a片段可結晶區(Fc)之SPINK9以達成大約100個反應單位(RU)。對於動力學量測，將人類KLK5結合多肽之四倍連續稀釋液(200 nM至0.1953 nM)在25℃下以30 ml/min之流速注射於HBS-T緩衝液中。締合速率(k締合 )及解離速率(k解離 )係使用簡單一對一Langmuir結合模型(BIAcore Evaluation T200軟體2.0版)來計算。平衡解離常數(KD )計算為比率k解離 /k締合 。整合分析中所用之個體
整合分析中使用總計1,350名成人氣喘患者及3,690名對照。在該等中，在品質控制量測後，667名氣喘患者係在低2型氣喘(稱為低骨膜素)組中，且626名係在2型發炎性(稱為高骨膜素)組中。病例之平均年齡為45歲(SD = 15)且對照為41歲(SD = 15)。所有個體均係歐洲高加索人(Caucasian)後裔。個體之大多數(57.8%)為女性。在病例中所預測之平均FEV1%為72.9 (SD = 17)且在對照中為101.6 (SD = 8)。將病例及對照分成兩個同類群組。同類群組1包括自Genentech 對萊比克珠單抗(抗IL-13)及Xolair (抗IgE)之觀察及臨床試驗獲得之氣喘患者DNA樣品(總N=520)。同類群組2包括自Genentech針對萊比克珠單抗之臨床試驗(N=234)及自在昆士蘭醫學研究所(Queensland Institute for Medical Research)(N=774)及芝加哥大學(University of Chicago)(N=226)確定之成人氣喘患者獲得之完全獨立之DNA樣品組。將樣品與基於遺傳學上確定之祖先(同類群組1；N=3,120)選擇之對照進行比較，且由肺臟學家篩選為氣喘陰性(同類群組2；N=1,146)。分析來自同類群組2之所有病例及對照之血清骨膜素含量，且使用中值蛋白質含量將個體分為低骨膜素及高骨膜素子組。每一同類群組之特性示於表 3 中。該表僅包括通過QC且包括在分析中之樣品。表 3 *) 年齡數據係在以下範圍內：69 ≤ 54歲、489 = 55-59歲、761 = 60-64歲、810 = 65-69歲、503 = 70-74歲、153 ≥ 75歲。已知氣喘風險等位基因分析
目前，2型發炎與低2型氣喘患者間之遺傳異質性程度未知。如所述基於骨膜素含量使研究群體分層。參見 Corren等人，N Engl J Med 365, 1088-1098 (2011)。首先在高骨膜素病例(N=626)與對照(N=1,696)之間及低骨膜素病例(N=667)與對照(N=1,887)之間比較已知氣喘風險等位基因之等位基因頻率。測定高骨膜素及低骨膜素子組與對照相比之效應值富集。結果示於圖 1 及表 4 中。若干個已知氣喘基因(例如，TSLP 、 IL4 、 IL4R 、 IL6R )在子組之間顯示無差異。若干Th2相關基因座(例如，GATA3 及IL33 )之比值比(OR)在高骨膜素子組中富集。PDE4D 基因座在高骨膜素子組中顯示基本上為零之OR (OR=0.96)且在低骨膜素子組中富集(P=6.0×10-4 ；OR=1.3)。此基因座係直接顯示低及高骨膜素病例間之等位基因頻率統計學上不同之唯一基因座(P=0.02)。因此，所觀察到的許多公開之氣喘基因座係泛氣喘基因座，其鑒於該等研究並未區分基於2型發炎狀態之個體而係直觀的。然而，其他基因座在子組之間具有差異，此表明在按骨膜素狀態劃分氣喘群體時新穎基因座將顯現。鑒於上文所提及之知識缺乏及所預測之圍繞此患者群體之尚未滿足的醫學需求，關注低骨膜素性氣喘子組。表 4 低骨膜素性氣喘對對照 GWAS
使用具有血清骨膜素含量量測值之健康對照(N=790)，使用骨膜素作為連續性狀實施GWAS，且發現無基因座達到全基因體顯著性。此表明正常對照中之骨膜素含量未受到強烈之遺傳影響。因此使用低骨膜素性氣喘(N=667)對對照(N=1,887) GWAS中之整個對照群體。測試在此分析中達到與對照中骨膜素含量相關聯之全基因體顯著性之所有令人關注之SNP，以確定該(等)SNP係與2型低發炎氣喘特異性相關，而非簡單地與外周骨膜素之含量相關。總計觀察到一個針對SNP rs117639512之關聯超過全基因體顯著性之臨限值(P=2.75×10-8 ，OR = 0.33，圖 2 )。P＜1×10-5 (LD修剪)之SNP之完整列表示於表 5 中。SNP rs117639512之詳細資訊示於表 6 中。在具有骨膜素量測值之對照子組中，rs117639512 SNP與外周骨膜素含量不相關(P=0.99)。另外，亦針對嗜酸性白血球(EOS)含量對群體進行分層(低EOS含量＜300 ng/mL)以查看在低EOS氣喘患者中是否亦發現低骨膜素性氣喘患者中之關聯。二者均係2型活性之指標，但不完全相關(ρ=0.23)。參見 Arron等人，Ann Am Thorac Soc 10增刊, S206-213 (2013)。測試與對照(N=1,768)相比，SNP rs117639512在低EOS氣喘病例(N=390)中之關聯，發現效應方向與低骨膜素分析(P=0.008；OR= 0.51)中所觀察到之效應方向類似。SNP rs117639512係位於在500 kb DNA段(stretch)內含有11個KLK之較大血管舒緩素(KLK)基因簇基因座中(圖 3 )。此SNP係位於KLK5基因體序列中。該關聯似乎對於低2型氣喘係特異性的，此乃因P值在2型高發炎患者中並不顯著(表 6 ：rs117639512之詳細關聯分析，P=0.63，OR= 1.11)。表 5 表 6 KLK5 係此基因座之候選基因
為鑑別此基因座中之相關基因，首先檢查mRNA表現模式。使用公開可獲得之資料庫，KLK4 主要表現於***及子宮內膜中，而KLK5 主要表現於食管及皮膚中。參見 Wu等人，Nucleic Acids Res 44, D313-316 (2016)。查詢GTEx門戶資料庫(參見 Consortium，Science 348, 648-660 (2015))以研究rs117639512對主要表現組織中KLK4及KLK5 mRNA含量之可能的功能性效應。rs117639512對KLK4之效應不能在***或子宮中進行評價，此乃因在GTEx資料庫中其在該兩個組織中均為單形態的。GTEx含有總計四種食管及皮膚組織(食管-胃食管連接處及肌層；曝露於陽光及不曝露於陽光之皮膚)。KLK5 eQTL在該等組織中之任一者中並未達到統計學顯著性(曝露於陽光之皮膚中最低P=0.051)，此至少部分地係由於SNP之較低的次要等位基因頻率(歐洲高加索人群體中0.01-0.05，參見 Genomes Project, Auton等人，Nature 526, 68-74 (2015))。此係人類遺傳變異之全球性參考。與主要等位基因純合子相比，所有組織(食管- GE連接處除外)在雜合子中均顯示較低之KLK5之mRNA含量。資料庫中無用於比較之次要等位基因純合子。因此，看起來rs117639512之次要等位基因與較低之KLK5 mRNA含量相關，然而，由於rs117639512之較低的次要等位基因頻率，因此需要更大之資料庫以證實此假設。感興趣的是，內瑟頓氏症候群係由基因SPINK5 中之突變引起。參見 Descargues等人，Nat Genet 37, 56-65 (2005)。SPINK5 編碼LEKTI，其係KLK5 及KLK7 之絲胺酸蛋白酶抑制劑。參見 Schechter等人，Biol Chem 386, 1173-1184 (2005)。SPINK5 中之突變導致高度上調之KLK5表現，其進而經由PAR2 (蛋白酶活化受體 2)依賴性及獨立性路徑誘導發炎。參見 Hovnanian, A.，Cell Tissue Res 351, 289-300 (2013)。儘管內瑟頓氏症候群最常見與皮膚病症相關，但在一些情形下共患氣喘。參見 Judge等人，Br J Dermatol 131, 615-621 (1994)。因此，基於連鎖不平衡、表現模式及症候群性共病，KLK5 係此基因座中最相關之候選基因。此外，來自eQTL分析之效應方向與此SNP之保護性OR一致，使得較低之KLK5含量似乎對氣喘風險具有保護作用。用於測定 KLK5 抑制之分析
使用重組KLK5直接活性分析來量測KLK5抑制劑(例如SPINK Fc融合多肽及mAb1108)對人類血管舒緩素5 (KLK5)之抑制。將重組人類KLK5 (Genentech)於直接分析緩衝液(75 mM Tris (pH 8.0)、150 mM NaCl及0.01% Tween 20)中稀釋至5 nM，且與抗KLK5抗體合併於384孔分析盤中(384孔低體積，黑色，圓底，Corning，目錄號4514)。抗體係於磷酸鹽樣品緩衝液(70 mM磷酸鈉(pH 6)、200 mM NaCl及0.01% Tween-20)或檸檬酸鹽/Tris樣品緩衝液(10 mM檸檬酸、30 mM Tris (pH 6)及0.01% Tween 20)中供應。抗體稀釋液係於適當樣品緩衝液或直接分析緩衝液中製得。將盤在周圍溫度下培育30分鐘。將螢光肽受質Boc-VPR-AMC (Bachem，部件號I-1120)直接添加至分析盤。最終孔內濃度為50 µM Boc-VPR-AMC、5 nM重組人類KLK5及0.19-100 nM抗KLK5抗體。使用PHERAstar® Plus讀數儀，使用340 nm激發/460 nm發射模組以每102 s檢查盤30-60分鐘。RFU/s反應速率係藉由線性範圍內讀數之線性回歸來計算，通常在204 s時開始且持續直至分析結束。單獨之緩衝液及100 nM最終SPINK9.SRE.Fc (Genentech)分別用作100%及0%活性對照。抗KLK5抗體之IC50 係自其各別曲線之四參數擬合來確定。
使用偶合之前KLK7螢光肽分析來量測抗KLK5抗體對人類血管舒緩素5 (KLK5)之抑制。若抗體樣品係於檸檬酸鹽/Tris樣品緩衝液中，則將重組人類KLK5 (Genentech)於前KLK7檸檬酸鹽/Tris偶合緩衝液(50 mM Tris (pH 7.5)、150 mM NaCl及0.01% Tween 20)中稀釋至5 nM，或若抗體樣品係於磷酸鹽樣品緩衝液中，則將重組人類KLK5 (Genentech)於前KLK7磷酸鹽偶合緩衝液(50 mM Tris (pH 8.0)、150 mM NaCl及0.01% Tween 20)中稀釋至5 nM。接著將經稀釋之KLK5與抗KLK5抗體合併於384孔分析盤(384孔低體積，黑色，圓底，Corning，目錄號4514)中。抗體稀釋液係如針對直接KLK5分析所闡述來製得。將盤在周圍溫度下培育30分鐘。將螢光肽受質suc-LLVY-AMC (Bachem，部件號I-1395)及前KLK7 (Genentech)直接添加至分析盤且在周圍溫度下培育。最終孔內濃度為100 µM suc-LLVY-AMC、125 nM前KLK7、5 nM重組人類KLK5及0.19-100 nM抗KLK5抗體。24小時後，每102 s進行螢光讀數達30-60 min，且RFU終點值係藉由對最後5次讀數取平均值來計算。單獨之緩衝液及100 nM最終SPINK9.SRE.Fc (Genentech)分別用作100%及0%活性對照。抗KLK5抗體之IC50 係自其各別曲線之四參數擬合來確定。
使用重組KLK7螢光肽分析來測定KLK5抑制劑之選擇性。於前KLK7磷酸鹽偶合緩衝液(50 mM Tris (pH 8.0)、150 mM NaCl及0.01% Tween 20)中利用KLK5活化重組人類KLK7 (Genentech)。接著將經稀釋之KLK7與KLK5抑制劑合併於384孔分析盤(384孔低體積，黑色，圓底，Corning，目錄號4514)中。抑制劑稀釋液係如針對直接KLK5分析所闡述來製得。將盤在周圍溫度下培育50分鐘。將螢光肽受質suc-LLVY-AMC (Bachem，部件號I-1395)及前KLK7 (Genentech)直接添加至分析盤且在周圍溫度下培育。最終孔內濃度為100 µM suc-LLVY-AMC、125 nM前KLK7、5 nM重組人類KLK5及0.19-100 nM KLK5抑制劑。24小時後，每102 s進行螢光讀數達30-60 min，且RFU終點值係藉由對最後5次讀數取平均值來計算。單獨之緩衝液及100 nM最終SPINK9.SRE.Fc (Genentech)分別用作100%及0%活性對照。KLK5抑制劑之IC50 係自其各別曲線之四參數擬合來確定。
使用KLK5源裂解肽偵測藉由LC/MS實施前KLK7分析以用於IC50 測定。為實施前KLK7分析，藉由與液相層析耦合之質譜法偵測來自酶KLK5與受質前KLK7間之反應之產物肽EEAQGDK (SEQ ID NO:30)。所有化合物均經50 mM碳酸氫銨緩衝液(Powder/Certified, Fisher Chemical, A643-500)稀釋，其中分析中之最終濃度為5 nM KLK5 (Genentech)且抑制劑係在0.01 nM 至12 nM範圍內，其稀釋於96孔盤(Biorad，硬殼96孔PCR盤，低廓形，薄壁，有緣，藍色/透明編號HSP9631)中。所使用之抑制劑係SPINK9.SRE.Fc (Genentech)及mAb1108 (單株小鼠IgG2b純系編號193318, R & D Systems, Minneapolis, MN)。將盤在室溫下培育30分鐘。之後，將15 nM受質前KLK7 (Genentech)添加至酶加抑制劑中。2小時後，使用0.5 uL甲酸(99.5+%, Optima™ LC/MS級, Fisher Chemical, A117-10X1AMP)將反應物淬滅。在QTRAP 6500 LC-MS/MS質譜儀(Sciex, Framingham, MA)中使用以下質量之組合對肽進行偵測：Q1, 388.7 m/z及Q3, 319.0 m/z。使用合成KLK7肽校準曲線來量測所產生肽之定量。IC50 值係使用Prism 6軟體(GraphPad Software, La Jolla, CA)來確定。
使用KLK5源裂解肽偵測藉由LC/MS實施前KLK1分析以用於IC50 測定。為實施前KLK1分析，藉由與液相層析耦合之質譜法偵測來自酶KLK5與受質前KLK1間之反應之產物肽APPIQSR (SEQ ID NO:31)。所有化合物均經50 mM碳酸氫銨緩衝液(Powder/Certified, Fisher Chemical, A643-500)稀釋，其中分析中之最終濃度為0.5 nM KLK5 (Genentech)且抑制劑係在0.01 nM至12 nM範圍內，其稀釋於96孔盤中(Biorad，硬殼96孔PCR盤，低廓形，薄壁，有緣，藍色/透明編號HSP9631)。所使用之抑制劑係SPINK9.SRE.Fc (Genentech)及mAb1108 (單株小鼠IgG2b純系編號193318, R & D Systems, Minneapolis, MN)。將盤在室溫下培育60分鐘。之後，將300 nM受質前KLK1 (Genentech)添加至酶加抑制劑中。20分鐘後，使用0.5 uL甲酸(99.5+%, Optima™ LC/MS級, Fisher Chemical, A117-10X1AMP)將反應物淬滅。在QTRAP 6500 LC-MS/MS質譜儀(Sciex, Framingham, MA)中使用以下質量之組合對肽進行偵測：Q1, 384.7 m/z及Q3, 600.3 m/z。IC50 值係使用峰面積及Prism 6軟體(GraphPad Software, La Jolla, CA)來確定。實例 2- 氣喘中 KLK5 之表徵 KLK5 在氣喘患者肺組織中表現且升高
檢查KLK5在肺組織中之表現。開發敏感性免疫分析以量測健康供體(MAST-A同類群組)及皮質類固醇難治性氣喘患者(BOBCAT同類群組)之支氣管肺泡灌洗(BAL)中之KLK5。參見 Jia等人，J Allergy Clin Immunol 130, 647-654 e610 (2012)及Sun等人，Sci Signal 8, ra122 (2015)。與健康志願者相比，氣喘患者中KLK5之平均含量升高約四倍(圖 4 )。另外，氣喘患者BAL中KLK5之含量與預測之強力呼氣容積1 (FEV1)呈負相關 (P＜0.05)，從而指示KLK5增加之患者可罹患更嚴重之支氣管阻塞及氣道疾病。肺中KLK5之含量與血清Th2生物標記(骨膜素及血液嗜酸性白血球)不相關，且高骨膜素及低骨膜素氣喘患者均具有相似含量之BAL KLK5。為理解KLK5之細胞來源，在各種原代肺駐留細胞中比較KLK5轉錄物含量。KLK5 mRNA由支氣管上皮細胞強力表現，且在肺平滑肌、纖維母細胞、內皮細胞或單核細胞中偵測不到。為原位檢查KLK5表現，藉由使用KLK5啟動子之開放閱讀框中具有LacZ之KLK5-LacZ報導基因小鼠系來檢查其表現。LacZ陽性細胞主要限於支氣管上皮細胞。綜上所述，該等數據表明，支氣管上皮細胞可能係肺中KLK5之主要細胞來源且造成支氣管肺泡灌洗中之KLK5。重組 KLK5 誘導之肺嗜中性白血球外滲及肺上皮細胞介素產生
接下來，產生重組KLK5且表徵其生物化學功能。具有C末端his標籤之重組全長KLK5表現於293個細胞中。經分泌KLK5之前序列(aa23-66)去除且係以位置67處之N末端異白胺酸開始。位置245處之絲胺酸至丙胺酸突變(S245A)消除KLK5催化活性，且S245A KLK5突變異體具有完整N末端前序列。結果表明，自活化及信號肽去除可能係KLK5自身固有的。
為研究KLK5在肺中之效應，以鼻內方式向小鼠投與重組KLK5。在KLK5投與後24小時，觀察到支氣管肺泡灌洗液中嗜中性白血球之數量增加大於10倍(圖 5A )。嗜酸性白血球、巨噬細胞或淋巴球之數量無顯著變化。肺實質之組織切片中嗜中性白血球之選擇性募集亦增加且該等顆粒球定位至支氣管上皮下膜。鼻內投與催化性突變異體KLK5並不導致嗜中性白血球外滲。因此，KLK5募集嗜中性白血球至肺隔室中之能力高度依賴於蛋白酶之酶活性。
為理解KLK5如何影響嗜中性白血球募集，將重組KLK5添加至A549肺上皮細胞系中且經由定量PCR檢查發炎細胞介素及趨化介素之表現。KLK5 (但不係其催化非活性突變異體)快速誘導促發炎基因轉錄物，包括Tslp 、 Tnfa 、Il8 及Icam1 (圖 5B )。Tslp 、 Tnfa 、IL-8 及Icam1 之誘導亦見於原代經分離之支氣管上皮細胞。此外，SPINK5 Fc融合多肽抑制KLK5刺激之發炎細胞介素及趨化介素產生。實例 3- 直接分析及偶合分析中 KLK5 之抑制
為評估SPINK Fc融合多肽之抑制譜，開發監測KLK5裂解螢光肽受質之活體外分析。簡言之，KLK5裂解受質Boc-VPR-AMC之末端精胺酸間之肽鍵，釋放7-胺基-4-甲基香豆素(AMC)，從而導致螢光增加。在添加螢光受質之前，將KLK5與SPINK5 M293-R355 (圖 6A )、SPINK5 E421-A695 (圖 6B )或SPINK9.SRE.Fc (圖 6C )一起培育導致由於KLK5鈍化所致之螢光信號降低。因此，SPINK Fc融合多肽係KLK5之強效抑制劑，如藉由Boc-VPR-AMC裂解所監測。
如圖 6 中所展示，SPINK Fc融合多肽係KLK5之強效抑制劑，如藉由小肽受質之裂解所監測。為進一步評估該等 SPINK Fc融合多肽之抑制譜，開發利用前KLK7及特異性KLK7螢光肽受質Suc-LLVY-AMC之偶合分析(圖 7 )。簡而言之，將KLK5與前KLK7一起培育導致KLK7前結構域之裂解及去除。前結構域之去除使KLK7活化，其然後能夠作用於螢光受質以釋放AMC螢光團。類似於使用小肽受質(圖 6 )之數據，將KLK5與SPINK5 M293-R355 (圖 7A )、SPINK5 E421-A695 (圖 7B )或SPINK9.SRE.Fc (圖 7C )一起培育導致強效抑制前KLK7之活化及KLK7特異性肽受質之隨後裂解。綜上所述，圖 6 及 7 展示使用肽或巨分子(前KLK7)受質，SPINK Fc融合多肽係KLK5之強效抑制劑。
為評估SPINK Fc融合多肽之特異性，針對經活化之KLK7分析抑制劑，且監測螢光肽受質Suc-LLVY-AMC之裂解(圖 8 )。作為KLK特異性之對照，亦分析市售抗KLK5抗體mAb1108。由於此抗體對KLK5具有特異性，預期其不應抑制KLK7或受質之裂解。如圖 8 中可見，SPINK5 M293-R355 (圖 8A )及SPINK5 E421-A695 (圖 8B )二者部分地抑制KLK7，而SPINK9.SRE.Fc (圖 8C )及mAb1108 (圖 8D )展示無抑制。此指示SPINK9.SRE.Fc及mAb1108特異性地相互作用且抑制KLK5，而SPINK5 M293-R355及SPINK5 E421-A695可係混雜之KLK抑制劑。
為表徵抗KLK5抗體mAb1108之抑制譜，測定各種KLK5濃度(圖 9 )下之直接分析中之IC50 值(圖 6 )。不同於SPINK Fc融合多肽，mAb1108係KLK5之部分抑制劑，使得螢光肽受質裂解降低約30% (圖 9 )。另外，mAb1108之IC50 值展示對KLK5濃度之依賴性，此表明抗體可能係KLK5之緊密結合抑制劑。
為進一步評估mAb1108之抑制譜，在直接(圖 6 )及前KLK7偶合(圖 7 )分析二者中針對SPINK9 Fc融合多肽分析市售抗體。在直接分析(圖 10 )中，SPINK9 Fc融合多肽係KLK5裂解螢光肽受質之強效抑制劑，而mAb1108展示部分抑制。在偶合分析(圖 11 )中使用巨分子受質前KLK7，SPINK9 Fc融合多肽及mAb1108二者均係KLK5活性之強效抑制劑。綜上所述，該等數據指示，雖然mAb1108在直接分析(圖 8 及 9 )中確實展示KLK5之部分抑制且在偶合分析(圖 11B )中完全抑制，但SPINK9 Fc融合多肽在直接(圖 6 及 10 )及偶合分析(圖 7 及 11 )二者中均係KLK5之強效抑制劑。實例 4- 藉由 LC/MS 之 KLK5 源裂解肽偵測以用於 IC50 測定
使用監測KLK5源裂解產物肽之LC/MS分析來評價SPINK9.SRE.Fc及mAb1108藉由重組KLK5抑制前KLK7或前KLK1之蛋白分解之能力。在KLK7分析中，SPINK9.SRE.Fc及mAb1108完全抑制KLK5 (5 nM)裂解前KLK7，IC50 值分別為1.13 nM (圖 12A )或1.86 nM (圖 12 B )。然而在KLK1分析中，儘管SPINK9.SRE.Fc及mAb1108二者均抑制KLK5 (0.5 nM)裂解前KLK1，但僅SPINK9.SRE.Fc完全抑制KLK5，IC50 為0.58 nM (圖 12C )，而mAb1108展現最大約40%之KLK5抑制，IC50 為0.34 nM (圖 12 D )。結論
綜上所述，該等數據表明，KLK5誘導嗜中性白血球趨化性細胞介素之上皮產生及嗜中性白血球流入至肺組織中。本文提供來自專門專注於低骨膜素或低2型發炎氣喘患者之第一次GWAS之結果。鑑別出KLK4/5基因座處之SNP，其在低骨膜素性氣喘群體中對於氣喘風險具有保護作用。此發現亦在低嗜酸性白血球性氣喘患者中觀察到。19q13處之血管舒緩素基因座先前經由連鎖研究及GWAS與氣喘相關。參見 Myers等人，J Allergy Clin Immunol 130, 1294-1301 (2012)。經由GWAS鑑別出之SNP rs1061477位於KLK3之內含子2中，其位於SNP rs117639512之大約63 kb 3'處。該等SNP彼此不處於連鎖不平衡中(r2 =0.004, D'=0.293)。其他人則已研究嗜酸性白血球含量之遺傳學。參見 Gudbjartsson等人，Nat Genet 41, 342-347 (2009)。發現IL13及IL33基因座處之SNP與嗜酸性白血球含量相關。該等亦係充分複製之氣喘風險基因座。然而，在任一研究中，KLK4/5區1 MB內無SNP鑑別為達到所提出之顯著性。此顯示，此基因座可對低骨膜素或低2型氣喘具有特異性。
SNP rs117639512係基因內的，位於KLK4與KLK5之間。由於此SNP之頻率相對較低，因此不能在在線資料庫中測試對KLK4之功能，且不能觀察到關於KLK5之不同mRNA含量之統計學顯著性。然而，在所測試之大多數組織中，觀察到導致次要等位基因攜帶者之KLK5之mRNA含量較低之類似效應方向。此與SNP所見之保護性OR組合，指示KLK5之較低含量對於氣喘風險具有保護性。此與來自內瑟頓氏症候群患者之發現一致，其中嚴重上調之KLK5含量導致許多特應性表型，包括氣喘。內瑟頓氏症候群與KLK5調節子SPINK5中之功能喪失突變相關。評價影響SPINK5之mRNA含量的SNP之GTEx資料庫。SNP rs1363727處之最強命中與替代等位基因攜帶者之GTEx資料庫中之顯著較低之SPINK5 mRNA含量相關(10個組織中P＜1.2×10-8 )。在低骨膜素性氣喘群體中測試此SNP，且其並未達到氣喘風險之統計學顯著性(P=0.063；OR=1.14)，但與KLK4/KLK5基因座SNP相比具有相反之效應方向。此指示較低含量之SPINK5可增加發生氣喘之風險。SPINK5之功能降低及KLK5之活性增加與來自內瑟頓氏症候群之發現一致。因此，遺傳學證據表明，在內瑟頓氏症候群背景之外，降低KLK5含量可對氣喘具有保護作用。
KLK5結合多肽含量在重度氣喘患者之支氣管肺泡灌洗液中升高，且與預測之FEV1呈負相關(p ＜ 0.05)，此支持KLK5可在支氣管阻塞及氣喘發病機理中起致病作用之假設。KLK5在氣喘以及其他過敏性疾病中之調節尚不清楚。KLK5與2型發炎生物標記(例如，骨膜素、FeNO及血液嗜酸性白血球計數)之間無相關性。KLK5主要由肺上皮表現。氣喘患者具有頻繁之損傷及上皮障壁喪失，其與涉及誘導之生長因子、修復處理及組織重塑之再生過程相關。重度氣喘中失調之上皮細胞活化、再生過程及組織重塑可歸因於氣喘患者肺隔室中之異常KLK5含量。
SPINK5經由直接結合至其催化活性位點係KLK5之天然可逆抑制劑。SPINK5由許多黏膜組織表現，包括皮膚、肺、食管及胃腸道。在內瑟頓氏症候群中，SPINK5缺乏導致KLK5活性增加、皮膚發炎及過敏性症狀。參見 Briot等人，J Exp Med 206, 1135-1147 (2009)。發現SPINK5直接由發炎性細胞介素、特定而言介白素IL-13誘導(數據未顯示)。與此觀察一致，與高Th2性氣喘患者相比，低Th2性氣喘患者中SPINK5轉錄物減少。主要由SPINK5表現降低驅動之KLK5/SPINK5之較高比率可促成低Th2性氣喘患者中之氣喘病理學。
產生KLK5之重組形式，且發現少量之酶活性KLK5強效誘導嗜中性白血球流入至支氣管肺泡灌洗及肺組織中。由於無催化活性之KLK5 (或熱不活化之KLK5，數據未顯示)，嗜中性白血球不會外滲至動物肺中，故催化活性對於嗜中性白血球募集至關重要。此與KLK5轉基因小鼠在皮膚病灶中具有大量嗜中性白血球浸潤之報導一致。參見 Furio等人，J Exp Med 211, 499-513 (2014)。KLK5誘導發炎細胞介素、趨化介素及黏附分子之上皮表現。特定而言，IL-8係關鍵嗜中性白血球趨化性細胞介素。ICAM-1經由其與CD11b/CD18整聯蛋白之相互作用係嗜中性白血球黏附之關鍵黏附分子。TNF-α誘導血管滲漏且促進細胞外滲至周圍組織中。由KLK5誘導之發炎性細胞介素、趨化介素及黏附分子可共同作用以促進嗜中性白血球流入至局部組織中。發炎性趨化介素/細胞介素之快速誘導指示可存在一或多種細胞表面受體以調介細胞信號傳導事件。
總之，本文提供顯示KLK5基因座處之SNP與氣喘風險之遺傳關聯之數據，該氣喘風險係特定於低骨膜素或低2型發炎氣喘病例。此外，所呈現之數據描述KLK5對氣喘症狀及亞表型之效應。本文中所呈現之結果表明，降低KLK5活性可對氣喘具有保護性效應。
SEQ ID NO:1 ＞sp|Q9Y337|KLK5_人類血管舒緩素-5 OS=智人GN=KLK5 PE=1 SV=2，(全長KLK5，包括加下劃線之信號肽胺基酸1-22)
SEQ ID NO:2 KLK5之成熟形式(減去信號肽胺基酸1-22)
SEQ ID NO:3 |KLK5_人類血管舒緩素-5 (包括加下劃線之信號肽胺基酸1-22在內之全長KLK5之N153D變異體)
SEQ ID NO:4 KLK5之成熟形式(N153D變異體，減去信號肽胺基酸1-22)
SEQ ID NO:5 |KLK5_人類血管舒緩素-5 (包括加下劃線之信號肽胺基酸1-22在內之全長KLK5之G55R變異體)
SEQ ID NO:6 KLK5之成熟形式(G55R變異體，減去信號肽胺基酸1-22)
SEQ ID NO:7 |KLK5_人類血管舒緩素-5 (包括加下劃線之信號肽胺基酸1-22在內之全長KLK5之G55R, N153D變異體)
SEQ ID NO:8 KLK5之成熟形式(G55R, N153D變異體，減去信號肽胺基酸1-22)
SEQ ID NO:9 ＞sp|Q9NQ38|ISK5_人類絲胺酸蛋白酶抑制劑5型Kazal OS=智人GN=SPINK5 PE=1 SV=2 (全長人類SPINK5，包括加下劃線之信號肽胺基酸1-22)
SEQ ID NO:10人類SPINK5之成熟形式(減去信號肽胺基酸1-22)
SEQ ID NO:11 ＞tr|Q5K5D4|Q5K5D4_小鼠Spink5蛋白質OS=家鼷鼠(Mus musculus) GN=Spink5 PE=2 SV=1 (全長小鼠SPINK5，包括加下劃線之信號肽胺基酸1-22)
SEQ ID NO:12小鼠SPINK5之成熟形式(減去信號肽胺基酸1-22)
SEQ ID NO:13 (Hu SPINK5 (E490-Y757，Kazal結構域D8-D11；加雙下劃線：連接子；加下劃線：Fc人類IgG1 E356.M358)
SEQ ID NO:14；(Hu SPINK5 (E490-Y757，Kazal結構域D8-D11；加雙下劃線：連接子；加下劃線：Fc人類IgG4.S228P)
SEQ ID NO:15 (Hu SPINK5 (E490-Y757，Kazal結構域D8-D11)
SEQ ID NO:16 (Mu SPINK5 (E421-A695)-Fc, (Kazal結構域D6-D9；加雙下劃線：連接子；加下劃線：Fc小鼠IgG2a)
SEQ ID NO:17 (Mu SPINK5 (E421-A695，Kazal結構域D6-D9)
SEQ ID NO:18 (Hu SPINK5 (R291-R352；Kazal結構域D5；加雙下劃線：連接子；加下劃線：Fc人類IgG1 E356.M358 )
SEQ ID NO:19 (Hu SPINK5 (R291-R352；Kazal結構域D5；加雙下劃線：連接子；加下劃線：Fc人類IgG4.S228P)
SEQ ID NO:20 (Hu SPINK5 (R291-R352；Kazal結構域D5)
SEQ ID NO:21 (Mu SPINK5 (M293-R355；Kazal結構域D4；加雙下劃線：連接子；加下劃線：Fc小鼠IgG2a)
SEQ ID NO:22 (Mu SPINK5 (M293-R355；Kazal結構域D4)
SEQ ID NO:23 ＞sp|Q5DT21|ISK9_人類絲胺酸蛋白酶抑制劑9型Kazal OS=智人GN=SPINK9 PE=1 SV=1 (全長人類SPINK9，包括加下劃線之信號肽胺基酸1-19)
SEQ ID NO:24人類SPINK9之成熟形式(減去信號肽胺基酸1-19)
SEQ ID NO:25 (Hu SPINK9 (I20-C86.C22S.H48R.M49E；加雙下劃線：連接子；加下劃線：Fc人類IgG1 E356.M358)
SEQ ID NO:26 (Hu SPINK9 (I20-C86.C22S.H48R.M49E；加雙下劃線：連接子；加下劃線：Fc人類IgG4.S228P)
SEQ ID NO:27 (Hu SPINK9 (I20-C86.C22S.H48R.M49E；加雙下劃線：連接子；加下劃線：Fc小鼠IgG2a)
SEQ ID NO:28 (Hu SPINK9 (I20-C86.C22S.H48R.M49E))
無
圖 1A 及1B . 高骨膜素(圖1A)及低骨膜素(圖1B)子組與對照之比較。基因座係藉由富集同類群組來繪製。八個基因座顯示無明顯差異且並未示出。對於每一基因座，繪製OR且在列示對照比較之情形下繪製P值。
圖 2. 以曼哈頓圖(Manhattan plot)之形式顯示整合分析中全基因體關聯結果之彙總。在667名成人非2型發炎性氣喘患者及1,887名對照中實施全基因體單一變異體分析。P ＜ 5×10-8 之全基因體顯著性程度係由上線(由「X」標記)指示，且提示顯著性(P ＜ 1×10-5 )係由下線(由「XX」標記)指示。
圖 3. 彙總染色體19上KLK基因座之結果之LocusZoom39圖。藉由變異體與該區中最強關聯之SNP rs117639512之間的連鎖不平衡之程度對該等變異體進行色彩編碼。
圖 4A 及4B . 氣喘支氣管肺泡灌洗中之KLK5增加與骨膜素含量無關。圖4A)健康志願者或重度氣喘患者之支氣管肺泡灌洗中KLK5結合多肽之含量；圖4B)重度氣喘患者中KLK5之含量與所預測FEV1值之關聯。
圖 5A 及5B . 重組KLK5誘導肺嗜中性白血球外滲及肺上皮細胞介素產生。圖5A) 將WT或SA突變KLK5 (每隻小鼠2 μg)鼻內遞送至小鼠中且藉由流式細胞術分析來量化嗜中性白血球細胞數量(藉由Ly6G+CD11b+細胞量化)。圖5B)用2 μg/ml SA突變異體或WT或在10 µg SPINK5 Fc融合多肽之存在下處理肺上皮細胞。Tslp 、 Tnfa 、IL-8 及Icam1 之轉錄物係藉由即時RT-PCR來量化。
圖 6A 、 6B 及6C . 重組KLK5活性在直接分析中受SPINK Fc融合多肽抑制。將KLK5與SPINK5 M293-R355 (圖6A)、SPINK5 E421-A695 (圖6B)或SPINK9 (I20-C86.C22S.H48R.M49E)-Fc (本文中亦稱為SPINK9.SRE.Fc) (圖6C)一起預培育30分鐘，之後添加螢光受質Boc-VPR-AMC。使用PHERAstar® Plus讀數儀監測反應。RFU/s反應速率係藉由線性範圍內讀數之線性回歸來計算。IC50 參數係自其各別曲線之四參數擬合來確定。
圖 7A 、 7B 及7C. 重組KLK5活性在前KLK7偶合分析中受SPINK Fc融合多肽抑制。將KLK5與SPINK5 M293-R355 (圖7A)、SPINK5 E421-A695 (圖7B)或SPINK9.SRE.Fc (圖7C)一起預培育30分鐘，之後添加前KLK7及螢光受質Suc-LLVY-AMC (SEQ ID NO:29)。使用PHERAstar® Plus讀數儀監測反應。RFU/s反應速率係藉由線性範圍內讀數之線性回歸來計算。IC50 參數係自其各別曲線之四參數擬合來確定。
圖 8A 、 8B 、 8C 及8D. 重組KLK7活性部分地由SPINK Fc融合多肽抑制，但不受SPINK9.SRE.Fc或mAb1108抑制。將KLK5與SPINK5 M293-R355 (圖8A)、SPINK5 E421-A695 (圖8B)、SPINK9.SRE.Fc (圖8C)或mAb1108 (圖8D)一起預培育50分鐘，之後添加前KLK7及螢光受質Suc-LLVY-AMC (SEQ ID NO:29)。使用PHERAstar® Plus讀數儀監測反應。RFU/s反應速率係藉由線性範圍內讀數之線性回歸來計算。IC50 參數係自其各別曲線之四參數擬合來確定。
圖 9A 、 9B 、 9C 及9D. 市售抗體mAb1108係人類KLK5之部分抑制劑。將20 nM (圖9A)、10 nM (圖9B)、5 nM (圖9C)及2.5 nM (圖9D) KLK5與mAb1108一起培育30分鐘，之後添加螢光受質Boc-VPR-AMC。使用PHERAstar® Plus讀數儀監測反應。RFU/s反應速率係藉由線性範圍內讀數之線性回歸來計算。IC50 值係自各別曲線之四參數擬合來確定。
圖 10A 及10B. SPINK9.SRE.Fc融合蛋白在直接分析中係KLK5之強效抑制劑。將KLK5與SPINK9.SRE.Fc融合(圖10A)或mAb1108 (圖10B)一起培育30分鐘，之後添加螢光受質Boc-VPR-AMC。使用PHERAstar® Plus讀數儀監測反應。RFU/s反應速率係藉由線性範圍內讀數之線性回歸來計算。IC50 參數係自其各別曲線之四參數擬合來確定。
圖 11A 及11B. SPINK9.SRE.Fc融合蛋白在前KLK7偶合分析中係KLK5之強效抑制劑。在前KLK7偶合分析中，將KLK5與SPINK9.SRE.Fc融合(圖11A)或mAb1108 (圖11B)一起培育30分鐘，之後添加前KLK7及螢光受質Suc-LLVY-AMC (SEQ ID NO:29)。使用PHERAstar® Plus讀數儀監測反應。RFU/s反應速率係藉由線性範圍內讀數之線性回歸來計算。IC50 值係自各別曲線之四參數擬合來確定。
圖 12A 、 12B 、 12C 及12D. SPINK9.SRE.Fc (圖12A及12C)及mAb1108 (圖12B及12D)劑量依賴性地抑制重組KLK5自前KLK7 (圖12A及12B)及前KLK1 (圖12C及12D)裂解信號肽。藉由LC/MS偵測KLK7及KLK1信號肽。在將5 nM KLK5與15 nM前KLK7培育2小時之前或在將0.5 nM KLK5與300 nM (圖12C)或355 nM (圖12D)前KLK1培育20分鐘之前，將SPINK9.SRE.Fc或mAb1108與KLK5預培育。

Claims (45)

  1. 一種KLK5拮抗劑之用途，其用於製備治療個體氣喘之藥劑。
  2. 一種預測罹患氣喘之個體對包含KLK5拮抗劑之治療之反應的方法，該方法包括： (a) 量測來自該個體之生物樣品中之KLK5含量， (b) 將該樣品中所偵測到之該KLK5含量與參考含量進行比較，且 (c) 當該樣品中所量測之該KLK5含量與該參考含量相比升高時，預測該個體將對該治療有反應，且當該樣品中所量測之該KLK含量與該參考含量相比降低時，預測該個體將不對該治療有反應。
  3. 一種選擇罹患氣喘之個體進行包含KLK5拮抗劑之治療之方法，其包括確定來自該個體之生物樣品中位於KLK5基因體序列中之遺傳變異存在或不存在，其中該遺傳變異之存在指示該個體適於用KLK5拮抗劑治療。
  4. 一種偵測KLK5基因體序列中之遺傳變異存在或不存在以指示罹患氣喘之個體適於用KLK5拮抗劑治療之方法，其包括： (a) 使來自該個體之樣品與能夠偵測位於該KLK5基因體序列中之該遺傳變異存在或不存在之試劑接觸；且 (b) 確定該遺傳變異存在或不存在，其中該遺傳變異之存在指示該個體適於用KLK5拮抗劑治療。
  5. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法或用途，其中氣喘與位於KLK5基因體序列中之遺傳變異有關。
  6. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之方法或用途，其中氣喘與升高含量之KLK5相關。
  7. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之方法或用途，其中氣喘與升高含量之嗜中性白血球相關。
  8. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之方法或用途，其中氣喘係選自由以下組成之群：低2型氣喘(type 2 low asthma)、低骨膜素性氣喘(periostin low asthma)及低嗜酸性白血球性氣喘(eosinophil low asthma)。
  9. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之方法或用途，其中氣喘與內瑟頓氏症候群(Netherton Syndrome)不相關。
  10. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之方法或用途，其中氣喘與SPINK5之活性降低相關。
  11. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之方法或用途，其中氣喘與編碼SPINK5或其基因產物之基因中之一或多種遺傳變異不相關。
  12. 如申請專利範圍第3項或第4項之方法，其中針對該個體之氣喘之治療係基於該遺傳變異之存在或不存在。
  13. 如申請專利範圍第3項或第4項之方法，其中該遺傳變異係SNP。
  14. 如申請專利範圍第3項或第4項之方法，其中該遺傳變異係SNP rs117639512。
  15. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之方法或用途，其中該KLK5拮抗劑藉由結合至KLK5之活性位點來抑制KLK5。
  16. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之方法或用途，其中該KLK5拮抗劑藉由結合至結合區來抑制KLK5，該結合區包含KLK5胺基酸殘基中之一或多者，其選自由在未處理之全長KLK5之位置108、147、150、153、168及245處之胺基酸殘基組成之群。
  17. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之方法或用途，其中該KLK5拮抗劑抑制KLK5之絲胺酸蛋白酶活性。
  18. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之方法或用途，其中該KLK5拮抗劑係選自由以下組成之群：抗體、結合多肽、多核苷酸及小分子。
  19. 如申請專利範圍第18項之方法或用途，其中該KLK5拮抗劑係抗體。
  20. 如申請專利範圍第19項之方法或用途，其中該抗體係單株抗體。
  21. 如申請專利範圍第19項之方法或用途，其中該抗體係人類、人類化或嵌合抗體。
  22. 如申請專利範圍第19項之方法或用途，其中該抗體係全長IgG1抗體。
  23. 如申請專利範圍第18項之方法或用途，其中該結合多肽係Fc融合多肽。
  24. 如申請專利範圍第23項之方法或用途，其中該Fc融合多肽包含一或多個SPINK5之結構域。
  25. 如申請專利範圍第23項之方法或用途，其中該Fc融合多肽包含SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 21之胺基酸序列。
  26. 如申請專利範圍第23項之方法或用途，其中該Fc融合多肽包含SPINK9之一個結構域。
  27. 如申請專利範圍第23項之方法或用途，其中該Fc融合多肽包含SEQ ID NO:27之胺基酸序列。
  28. 如申請專利範圍第18項之方法或用途，其中該小分子係蛋白酶抑制劑。
  29. 如申請專利範圍第28項之方法或用途，其中該蛋白酶抑制劑係亮抑酶肽(leupeptin)。
  30. 如申請專利範圍第2項至第4項中任一項之方法，其中該樣品係選自由以下組成之群：支氣管肺泡灌洗(bronchial alveolar lavage)、肺實質(lung parenchyma)、支氣管上皮下膜(bronchial sub-epithelium)、腦脊髓液、血液、血清、痰液、唾液、黏膜刮擦物、活組織切片(tissue biopsy)、淚液分泌物、***或汗液。
  31. 一種KLK5拮抗劑，其用於醫學治療或診斷，包括氣喘之療法及/或治療。
  32. 一種SPINK Fc融合多肽，其中該SPINK Fc融合多肽抑制KLK5之活性。
  33. 如申請專利範圍第32項之SPINK Fc融合多肽，其中該SPINK Fc融合多肽包含一或多個來自SPINK5或SPINK9之結構域。
  34. 如申請專利範圍第33項之SPINK Fc融合多肽，其中該一或多個來自SPINK5之結構域包含選自由SEQ ID NO:17及SEQ ID NO:22組成之群之序列。
  35. 如申請專利範圍第33項之SPINK Fc融合多肽，其中該一或多個來自SPINK9之結構域包含SEQ ID NO:28。
  36. 如申請專利範圍第33項至第35項中任一項之SPINK Fc融合多肽，其中該一或多個結構域係來自小鼠或人類來源。
  37. 如申請專利範圍第33項至第35項中任一項之SPINK Fc融合多肽，其中該SPINK Fc融合多肽抑制KLK5至少約50%。
  38. 一種醫藥調配物，其包含醫藥學活性量之如申請專利範圍第32項至第37項中任一項之Fc融合多肽及醫藥學上可接受之載劑。
  39. 如申請專利範圍第32項至第35項中任一項之SPINK Fc融合多肽，其用於醫學治療或診斷，包括與KLK5相關之疾病之療法及/或治療。
  40. 一種如申請專利範圍第32項至第37項中任一項之Fc融合多肽之用途，其用於製備治療個體之與KLK5相關之疾病之藥劑。
  41. 如申請專利範圍第40項之用途，其中該與KLK5相關之疾病係與該個體樣品中升高含量之KLK5相關。
  42. 如申請專利範圍第40項之用途，其中該與KLK5相關之疾病係與該個體樣品中升高數目之嗜中性白血球相關。
  43. 如申請專利範圍第41項或第42項之用途，其中該與KLK5相關之疾病係內瑟頓氏症候群。
  44. 如申請專利範圍第41項或第42項之用途，其中該樣品係選自由以下組成之群：支氣管肺泡灌洗(bronchial alveolar lavage)、肺實質(lung parenchyma)及支氣管上皮下膜(bronchial sub-epithelium)。
  45. 如申請專利範圍第1項至第4項及第40項至第42項中任一項之方法或用途，其中該個體係人類。
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