JP6878395B2 - 過リン酸化タウに特異的な抗体およびその使用方法 - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許法施行規則(37 C.F.R.)第1.821条に従う1つまたは複数の配列表(以下参照)を含み、これは、コンピュータ可読媒体(ファイル名:0995.txt、2016年6月23日に作成され、40kBのサイズを有する)で開示され、このファイルは、全体が参照により本明細書に援用される。
Clavagueraおよび同僚は、タウ自体が内因性病原体(endo−pathogen)として働き得ることを実証した(Clavaguera,F.et al.(2009)Nat.Cell Biol.11,909−913)。低スピン(low spin)脳抽出物を、P301Sタウトランスジェニックマウスから単離し(Allen,B.et al.(2002)J.Neurosci.22,9340−9351)、希釈し、幼若ALZ17マウスの海馬および皮質領域に注入した。ALZ17マウスは、遅い病変(late pathology)のみを発現するタウトランスジェニックマウス株である(Probst,A.et al.(2000)Acta Neuropathol.99,469−481)。注入されたALZ17マウスは、固体線維状病変を直ぐに発現し、P301Sマウスに由来する免疫枯渇された脳抽出物または野生型マウスに由来する抽出物の投与は、タウ病変を誘発しなかった。可溶性(S1)およびサルコシル不溶性タウ(P3)中の脳抽出物の分別(Sahara,N.et al.(2013)J.Alzheimer’s.Dis.33,249−263)およびALZ17マウスへのこれらの注入は、P3画分が、病変の誘発に最も有効であることを実証した。それは、細胞内の過リン酸化線維状タウの大部分を含有する。病変の大部分は、P301S抽出物を野生型マウスの脳内に注入した場合にも誘発され得るが、NFTは形成されなかった。その後の研究において、Clavagueraらは、他のタウオパチー(嗜銀顆粒性認知症(AGD)、進行性核上まひ(PSP)、および大脳皮質基底核変性症(CBD))の死後脳組織から抽出されたヒトタウも、ALZ17モデルにおいてタウ病変を誘発し得ることを示した(Clavaguera,F.et al.(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110,9535−9540)。これらのデータの提示以来、いくつかの他のタウシーディングおよび拡散モデルが報告されている(Ahmed,Z.et al.(2014)Acta Neuropathol.127,667−683;Walker,L.C.et al.(2013)JAMA Neurol.70,304−310)。これらの研究からの主な結論は、細胞内封入体中の病原性タウが細胞から細胞周辺腔中へと分泌される機構を示す。次に、病理学的タウ材料は、順行および逆行方向の両方で、小胞の鞘に沿って輸送され、その後、バルクエンドサイトーシスによって、隣接する細胞によって取り込まれる。この機構は、ヒトの疾患において観察される病変の拡散が、明確な解剖学的パターンにしたがう理由を説明する。興味深いことに、病理学的タウの末梢投与は、ALZ17マウスにおけるタウ病変の形成を加速させ得る(Clavaguera,F.et al.(2014)Acta Neuropathol.127,299−301)。この拡散機構は、他のタンパク質症における疾患伝播を説明し得る(Goedert,M.et al.(2010)Trends Neurosci.33,317−325;Sigurdsson,E.M.et al.(2002)Trends Mol.Med.8,411−413)。
タウタンパク質が、内因性病原体として働き得るという発見は、潜在的な介入治療において標的にされ得る「病原性種」への探求を引き起こした。
免疫療法は、従来、受動および能動ワクチン手法に分けられる。能動ワクチン手法では、病原因子が患者に注入され、自然免疫系が免疫応答を引き起こす。これは、投与された抗原に対する高親和性抗体を生成するB細胞の成熟を誘発する。受動ワクチン手法では、自然免疫系の誘発は、抗原に対して特異的な抗体を注入することによって回避される。次に、固有のクリアランス系が、抗体結合リガンドを除去する。
抗体C5.2
ここで、抗体C5.2は、
(a)配列番号17のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(b)配列番号18のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;
(c)配列番号19のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3;
(d)配列番号20のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号21のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号22のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含み;
抗体C8.3
ここで、抗体C8.3は、
(a)配列番号25のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(b)配列番号26のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;
(c)配列番号27のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3;
(d)配列番号28のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号29のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号30のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含み;
抗体C10−2
ここで、抗体C10−2は、
(a)配列番号9のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(b)配列番号10のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;
(c)配列番号11のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3;
(d)配列番号12のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号13のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号14のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含み;
および
抗体D1.2
ここで、抗体D1.2は、
(a)配列番号1のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(b)配列番号2のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;
(c)配列番号3のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3;
(d)配列番号4のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号6のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含む。
(a)配列番号9のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(b)配列番号10のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および/または
(c)配列番号11のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含む抗体に関する。
(a)配列番号12のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(b)配列番号13のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および/または
(c)配列番号14のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含むか、またはさらに含む抗体に関する。
配列番号1:D1.2軽鎖CDR1
配列番号2:D1.2軽鎖CDR2
配列番号3:D1.2軽鎖CDR3
配列番号4:D1.2重鎖CDR1
配列番号5:D1.2重鎖CDR2
配列番号6:D1.2重鎖CDR3
配列番号7:D1.2軽鎖
配列番号8:D1.2重鎖
配列番号9:C10−2軽鎖CDR1
配列番号10:C10−2軽鎖CDR2
配列番号11:C10−2軽鎖CDR3
配列番号12:C10−2重鎖CDR1
配列番号13:C10−2重鎖CDR2
配列番号14:C10−2重鎖CDR3
配列番号15:C10−2軽鎖
配列番号16:C10−2重鎖
配列番号17:C5.2軽鎖CDR1
配列番号18:C5.2軽鎖CDR2
配列番号19:C5.2軽鎖CDR3
配列番号20:C5.2重鎖CDR1
配列番号21:C5.2重鎖CDR2
配列番号22:C5.2重鎖CDR3
配列番号23:C5.2軽鎖
配列番号24:C5.2重鎖
配列番号25:C8.3軽鎖CDR1
配列番号26:C8.3軽鎖CDR2
配列番号27:C8.3軽鎖CDR3
配列番号28:C8.3重鎖CDR1
配列番号29:C8.3重鎖CDR2
配列番号30:C8.3重鎖CDR3
配列番号31:C8.3軽鎖
配列番号32:C8.3重鎖
配列番号33:ヒトタウ
配列番号34:D1.2*軽鎖
配列番号35:ヒト化C10−2重鎖
配列番号36:ヒト化C10−2軽鎖
配列番号37:タウ残基386〜408(pS396、pS404)
(a)配列番号1のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(b)配列番号2のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(c)配列番号3のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を有する抗体軽鎖可変領域;
ならびに
(d)配列番号4のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号6のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を有する抗体重鎖可変領域を含むかまたはそれからなる抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを示すことが意図される。
(a)配列番号9のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(b)配列番号10のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(c)配列番号11のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を有する抗体軽鎖可変領域;
ならびに
(d)配列番号12のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号13のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号14のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を有する抗体重鎖可変領域を含むかまたはそれからなる抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを示すことが意図される。
(a)配列番号17のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(b)配列番号18のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(c)配列番号19のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を有する抗体軽鎖可変領域;
ならびに
(d)配列番号20のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号21のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号22のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を有する抗体重鎖可変領域を含むかまたはそれからなる抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを示すことが意図される。
(a)配列番号25のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(b)配列番号26のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(c)配列番号27のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を有する抗体軽鎖可変領域;
ならびに
(d)配列番号28のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号29のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号30のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を有する抗体重鎖可変領域を含むかまたはそれからなる抗体またはそのエピトープ結合フラグメントをフラグメントを示すことが意図される。
(i)非リン酸化タウに結合することが実質的にできないこと;
(ii)S404においてリン酸化され、S396においてリン酸化されないタウに結合することが実質的にできないこと;
(iii)S396においてリン酸化されるタウに結合する能力;
(iv)S396およびS404の両方においてリン酸化されるタウに結合する能力;
(v)それがリン酸化404残基(pS404)に結合することが実質的にできないように、リン酸化タウ残基S396およびS404を選択的に区別する能力;
(vi)ヒトアルツハイマー病の脳に由来する過リン酸化タウに結合する能力;
(vii)病理学的および非病理学的ヒトタウタンパク質を区別する能力;および/または
(viii)本明細書に記載されるように、トランスジェニックマウスに由来する免疫枯渇されたrTg4510抽出物とともに使用されるとき、過リン酸化タウ64kDaおよび70kDaバンドを少なくとも90%だけ特異的に減少させる一方、55kDaタウバンドを10%超減少させない能力;または本明細書に記載されるように、ヒトAD死後脳に由来する抽出物とともに使用されるとき、S396リン酸化過リン酸化タウバンドを少なくとも90%だけ特異的に減少させる一方、非過リン酸化タウバンドを10%超減少させない能力
の1つまたは複数を示す抗タウ抗体またはそのエピトープ結合フラグメントに関する。
(A)2N4Rタウの残基386〜410をカバーするTDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(配列番号37)を含む、18〜40、例えば18〜30、例えば20〜30連続アミノ酸残基を含む二リン酸化ペプチドを含む免疫原を哺乳動物に注入して、それによって、前記哺乳動物を免疫する工程と;
(B)前記哺乳動物の前記免疫化を2回以上繰り返す工程と;
(C)残基リン酸化S396を含む病原性過リン酸化タウに結合することが可能であるが、非病原性タウに結合する能力が実質的に低い高特異性、高親和性抗体の存在について、前記繰り返し免疫された哺乳動物に由来する血清試料をスクリーニングする工程と;
(D)前記高特異性、高親和性抗体を回収する工程と
を含む抗体に関する。
(A)2N4Rタウの残基386〜410をカバーするTDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL(配列番号37)を含む、18〜40、例えば18〜30、例えば20〜30連続アミノ酸残基を含む二リン酸化ペプチドを含む免疫原を哺乳動物に注入して、それによって、前記哺乳動物を免疫する工程と;
(B)前記哺乳動物の前記免疫化を2回以上繰り返す工程と;
(C)残基リン酸化S396を含む病原性過リン酸化タウに結合することが可能であるが、非病原性タウに結合する能力が実質的に低い高特異性、高親和性抗体の存在について、前記繰り返し免疫された哺乳動物に由来する血清試料をスクリーニングする工程と;
(D)前記高特異性、高親和性抗体を回収する工程と
を含む抗体にさらに関する。
抗体D1.2
(a)配列番号1のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(b)配列番号2のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;
(c)配列番号3のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3;
(d)配列番号4のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号6のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3。
(a)配列番号9のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(b)配列番号10のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;
(c)配列番号11のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3;
(d)配列番号12のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号13のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号14のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3。
(a)配列番号9のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(b)配列番号10のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;
(c)配列番号11のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含む抗体に関する。
(d)配列番号12のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号13のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号14のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含む抗体に関する。
(d)配列番号12のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号13のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号14のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3ならびに
(a)配列番号9のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(b)配列番号10のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;および
(c)配列番号11のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
のうちの1つ、2つまたは3つを含む抗体に関する。
(a)配列番号17のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(b)配列番号18のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;
(c)配列番号19のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3;
(d)配列番号20のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号21のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号22のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3。
(a)配列番号17のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;または
(b)配列番号18のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;または
(c)配列番号19のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3;および
(d)配列番号20のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;または
(e)配列番号21のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;または
(f)配列番号22のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含む。
(a)配列番号25のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(b)配列番号26のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2
(c)配列番号27のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3;
(d)配列番号28のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号29のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号30のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3。
a)配列番号4、配列番号12、配列番号20、および配列番号28からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1;
b)配列番号5、配列番号13、配列番号21、および配列番号29からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2;および
c)配列番号6、配列番号14、配列番号22、および配列番号30からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3;および
d)配列番号3、配列番号11、配列番号19、および配列番号27からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む。
a)配列番号20のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1;
b)配列番号21のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2;
c)配列番号22のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3;および
d)配列番号19のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含み得る。
Y−X−S(リン酸化)−P−
を有し、ここで、Yがチロシンであり、Xが天然アミノ酸であり、Pがプロリンであり、S(リン酸化)が、リン酸化ヒドロキシル側鎖を有するセリンである。
(i)本明細書に記載される本発明の抗体の可変領域または前記領域のエピトープ結合部分、および
(ii)免疫グロブリンのCH領域またはCH2およびCH3領域を含むその領域
を含む一価抗体であり、ここで、CH領域またはその領域は、ヒンジ領域に対応する領域および、免疫グロブリンがIgG4サブタイプでない場合、CH3領域などのCH領域の他の領域が、ポリクローナルヒトIgGの存在下で、同一のCH領域とともにジスルフィド結合を形成するか、または同一のCH領域とともに他の共有結合または安定した非共有重鎖間結合を形成することが可能なアミノ酸残基を含まないように修飾されている。
(i)非リン酸化タウに結合することが実質的にできないこと;
(ii)S404においてリン酸化され、S396においてリン酸化されないタウに結合することが実質的にできないこと;
(iii)S396においてリン酸化されるタウに結合する能力;
(iv)S396およびS404の両方においてリン酸化されるタウに結合する能力;
(v)それがリン酸化404残基に結合することが実質的にできないように、リン酸化タウ残基S396およびS404を選択的に区別する能力;
(vi)ヒトアルツハイマー病の脳に由来する過リン酸化タウに結合する能力;
(vii)病理学的および非病理学的ヒトタウタンパク質を区別する能力;および/または
(viii)本明細書に記載されるように、トランスジェニックマウスに由来する免疫枯渇されたrTg4510抽出物とともに使用されるとき、過リン酸化タウ64kDaおよび70kDaバンドを少なくとも90%だけ特異的に減少させる一方、55kDaタウバンドを10%超減少させない能力または本明細書に記載されるように、ヒトAD死後脳に由来する抽出物とともに使用されるとき、S396リン酸化過リン酸化タウバンドを少なくとも90%だけ特異的に減少させる一方、非過リン酸化タウバンドを10%超減少させない能力
である。
(i)非リン酸化タウに結合することが実質的にできないこと;
(ii)S404においてリン酸化され、S396においてリン酸化されないタウに結合することが実質的にできないこと;
(iii)S396においてリン酸化されるタウに結合する能力;
(iv)S396およびS404の両方においてリン酸化されるタウに結合する能力;
(v)それがリン酸化404残基に結合することが実質的にできないように、リン酸化タウ残基S396およびS404を選択的に区別する能力;
(vi)ヒトアルツハイマー病の脳に由来する過リン酸化タウに結合する能力;
(vii)病理学的および非病理学的ヒトタウタンパク質を区別する能力;および/または
(viii)本明細書に記載されるように、トランスジェニックマウスに由来する免疫枯渇されたrTg4510抽出物とともに使用されるとき、過リン酸化タウ64kDaおよび70kDaバンドを少なくとも90%だけ特異的に減少させる一方、55kDaタウバンドを10%超減少させない能力;または本明細書に記載されるように、ヒトAD死後脳に由来する抽出物とともに使用されるとき、S396リン酸化過リン酸化タウバンドを少なくとも90%だけ特異的に減少させる一方、非過リン酸化タウバンドを10%超減少させない能力
であり、特に、このような変化した機能性は、構造変化の結果であり、したがってそれと切り離すことができない。
(i)本明細書に定義されるタウ抗体またはそのエピトープ結合フラグメント、または調製物であって、このような用語が本明細書において定義される際、このような抗タウ抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む調製物、および
(ii)薬学的に許容できる担体
を含む医薬組成物に関する。
1.配列番号33のリン酸化残基396などの、ヒトタウのリン酸化残基396に免疫特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
(a)ヒト病理学的タウに対する選択性および特異性;
(b)0.5〜10nM、例えば1〜5nMまたは1〜2nMの、p−タウ386〜408(pS396/pS404)(配列番号33)に対する結合親和性(KD)
の1つまたは複数を示す、先行する実施形態のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
(b)配列番号2のアミノ酸配列または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;
(c)配列番号3のアミノ酸配列または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3;
(d)配列番号4のアミノ酸配列または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号6のアミノ酸配列または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含む、モノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
(b)配列番号10のアミノ酸配列または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;
(c)配列番号11のアミノ酸配列または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3;
(d)配列番号12のアミノ酸配列または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号13のアミノ酸配列または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号14のアミノ酸配列または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含む、モノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
(a)配列番号17のアミノ酸配列または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(b)配列番号18のアミノ酸配列または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;
(c)配列番号19のアミノ酸配列または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3;
(d)配列番号20のアミノ酸配列または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号21のアミノ酸配列または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号22のアミノ酸配列または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含むモノクローナル抗体。
(b)配列番号26のアミノ酸配列または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;
(c)配列番号27のアミノ酸配列または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3;
(d)配列番号28のアミノ酸配列または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号29のアミノ酸配列または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号30のアミノ酸配列または4つ以下のアミノ酸差、または3つ以下のアミノ酸差、または2つ以下のアミノ酸差、または1つ以下のアミノ酸差を有するアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含む、モノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
(b)配列番号5、配列番号13、配列番号21、および配列番号29からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2;および
(c)配列番号6、配列番号14、配列番号22、および配列番号30からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3;および
(d)配列番号3、配列番号11、配列番号19、および配列番号27からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む、モノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
(b)配列番号21のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2;
(c)配列番号22のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3;および
(d)配列番号19のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む、実施形態1〜7のいずれか1つに記載の本発明の抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
(i)非リン酸化タウに結合することが実質的にできないこと;
(ii)S404においてリン酸化され、S396においてリン酸化されないタウに結合することが実質的にできないこと;
(iii)S396においてリン酸化されるタウに結合する能力;
(iv)S396およびS404の両方においてリン酸化されるタウに結合する能力;
(v)それがリン酸化404残基に結合することが実質的にできないように、リン酸化タウ残基S396およびS404を選択的に区別する能力;
(vi)ヒトアルツハイマー病の脳に由来する過リン酸化タウに結合する能力;
(vii)病理学的および非病理学的ヒトタウタンパク質を区別する能力;および/または
(viii)本明細書に記載されるように、トランスジェニックマウスに由来する免疫枯渇されたrTg4510抽出物とともに使用されるとき、過リン酸化タウ64kDaおよび70kDaバンドを少なくとも90%だけ特異的に減少させる一方、55kDaタウバンドを10%%超減少させない能力;または本明細書に記載されるように、ヒトAD死後脳に由来する抽出物とともに使用されるとき、S396リン酸化過リン酸化タウバンドを少なくとも90%だけ特異的に減少させる一方、非過リン酸化タウバンドを10%超減少させない能力
からなる群から選択される調製物。
(i)非リン酸化タウに結合することが実質的にできないこと;
(ii)S404においてリン酸化され、S396においてリン酸化されないタウに結合することが実質的にできないこと;
(iii)S396においてリン酸化されるタウに結合する能力;
(iv)S396およびS404の両方においてリン酸化されるタウに結合する能力;
(v)それがリン酸化404残基に結合することが実質的にできないように、リン酸化タウ残基S396およびS404を選択的に区別する能力;
(vi)ヒトアルツハイマー病の脳に由来する過リン酸化タウに結合する能力;
(vii)病理学的および非病理学的ヒトタウタンパク質を区別する能力;および/または
(viii)本明細書に記載されるように、トランスジェニックマウスに由来する免疫枯渇されたrTg4510抽出物とともに使用されるとき、過リン酸化タウ64kDaおよび70kDaバンドを少なくとも90%だけ特異的に減少させる一方、55kDaタウバンドを10%超減少させない能力;または本明細書に記載されるように、ヒトAD死後脳に由来する抽出物とともに使用されるとき、S396リン酸化過リン酸化タウバンドを少なくとも90%だけ特異的に減少させる一方、非過リン酸化タウバンドを10%超減少させない能力
からなる群から選択される調製物。
という試験基準にしたがって、リン酸化残基396を含むヒトタウへの免疫特異的結合を示す、モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
C56/BL6およびFVBマウスを、TiterMax補助剤中で製剤化された10μgのP30コンジュゲートリン酸化タウ386〜408(pS396/pS404)(配列番号37)で免疫した。
マウスを、脾細胞とSP−2細胞との融合の3日前にTitermaxなしのP30コンジュゲートリン酸化タウ386〜408(pS396/pS404)で追加免疫した。1μg/mlのリン酸化タウ386〜408(pS396/pS404)で被覆されたELISAプレートへの陽性結合、およびドットブロットおよび脳溶解物で被覆されたELISAまたはMSDプレートを用いて、対照に由来する脳溶解物と比較した、ADおよびTG4510脳溶解物に由来するS1およびP3抗原に対する優先的結合活性の後、ハイブリドーマを、再クローニングサイクルのために選択した。
タウ生化学的分画
ヒトタウ突然変異P301Lを過剰発現するヒトまたはrTg4510マウスに由来する脳組織を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含有する10体積のトリス−緩衝生理食塩水中で以下のように均質化した:50mMのトリス/HCl(pH7.4);274mMのNaCl;5mMのKCl;1%のプロテアーゼ阻害剤混合物(Roche);1%のホスファターゼ阻害剤混液IおよびII(Sigma);および1mMのフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF;Sigma)。ホモジネートを、4℃で20分間にわたって27,000×gで遠心分離して、上清(S1)およびペレット画分を得た。ペレットを、5体積の高塩/スクロース緩衝液(0.8MのNaCl、10%のスクロース、10mMのトリス/HCl、[pH7.4]、1mMのEGTA、1mMのPMSF)中で再度均質化し、上記のように遠心分離した。上清を収集し、37℃で1時間にわたってサルコシル(1%の最終濃度;Sigma)とともにインキュベートした後、4℃で1時間にわたって150,000×gで遠心分離して、P3画分と呼ばれるサルコシル不溶性ペレットを得た。P3ペレットを、脳ホモジネートに使用された元の体積の半分に等しい体積になるまで、TE緩衝液(10mMのトリス/HCl[pH8.0]、1mMのEDTA)中で再懸濁させた。
分画された組織抽出物S1およびP3を、0.1MのDTTを含有するSDS−試料緩衝液に溶解させた。熱処理された試料(95℃で10分間)を、4〜12%のビス−トリスSDS−PAGEゲル(Invitrogen)におけるゲル電気泳動によって分離し、PVDF膜(BioRad Laboratories,Hercules,CA)上に移した。ドットブロット試料を、試料にわたって公知の濃度で、ニトロセルロース膜(Amersham,Pittsburgh,PA)上に直接滴下した。ウエスタンおよびドットブロット膜の両方を、TBS−Tween(0.5%)pH7.4中の5%の脱脂粉乳中でブロックした後、1μg/mlのD1.2またはC10−2中で、4℃で一晩インキュベートした。膜を洗浄し、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスIgG(1:5000;Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)とともにインキュベートした。結合抗体を、強化化学発光システム(ECL PLUS kit;PerkinElmer)を用いて検出した。定量化およびウエスタンおよびドットブロット免疫反応性の視覚分析を、コンピュータに接続されたLAS−4000 BioImaging Analyzer System(Fujifilm,Tokyo,Japan)およびMulti Gauge v3.1ソフトウェア(Fujifilm)を用いて行った。タンパク質充填量を、元の画分の体積によって調整し、これは元の組織の湿重量に換算され得る。結果が図1および図2に示される。
ハイブリドーマ上清を、0.1Mの炭酸塩緩衝液pH9を用いて、1μg/mlのペプチドリン酸化タウ386〜408(pS396/pS404)で被覆されたnuncプレートにおける抗体結合についてスクリーニングした。
病理学的タウへの結合について陽性の抗体を、様々なリン酸化ペプチド(p)エピトープに対する見かけの親和性(IC50)および選択性/特異性についてさらに特性評価した。MSDプレートを、上述されるように、100ng/mlのリン酸化タウ386〜408(pS396/pS404)で被覆した。リン酸化タウに対する抗体を、用量反応アッセイにおいて分析して、適切な分析シグナルレベル(最大機器シグナルの0.5〜2%に対応するMSDにおける典型的な5,000〜20,000RUまたはELISAにおける450nmで1.0〜1.5のODシグナルを提供する抗体濃度を特定した。抗体の選択を、2時間/室温で、段階的な濃度(0〜1000nM)のリン酸化タウ386〜408(pS396/404)とともにインキュベートした。続いて、反応物を、上述されるように、100ng/mlのペプチドリン酸化タウ386〜408(pS396/pS404)で被覆されたペプチド被覆MSDプレートに適用し、結合活性を測定した。阻害アッセイからのIC50値は、10〜100nMの見かけの親和性(KD)に対応する。
マウス脳組織を、8月齢のrTg4510マウス(CamKIIプロモータ下でヒトP301L−タウを過剰発現する)および非トランスジェニック同腹仔(non−Tg)から収集し、4%のパラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィンに埋め込んだ。パラフィンに埋め込まれる、前頭葉のヒト脳試料は、Tissue Solutions(Glasgow,UK)から入手した。末期アルツハイマー病と診断されたドナーに由来する組織を、月齢をマッチさせた非認知症対照ドナーと比較した。厚さ4umの切片を、脱パラフィンし、10分間にわたって10mMのクエン酸緩衝液、pH6中で切片をマイクロ波処理することによって抗原賦活化を行った。内因性ペルオキシダーゼを、1%の水素ペルオキシダーゼ、続いて、PBS/1%のBSA/0.3%のTriton X−100(PBS−BT)中の5%の正常ブタ血清でブロックした。切片を、様々な濃度で、PBS−BT中で希釈されたD1.2およびC10−2抗体とともに、4℃で一晩インキュベートした。切片を、PBS、0.25%のBSA、0.1%のTriton X−100中で洗浄してから、1時間にわたって1:500で、ビオチン化二次ブタ抗マウス抗体(E0464;DAKO,Glostrup,Denmark)とともにインキュベートした。さらなる洗浄の後、ストレプトアビジン−ビオチン複合体キット(Vector Laboratories,Burlingame,CA)を適用し、免疫反応性を、ジアミノベンジジンで視覚化した。切片を、ヘマトキシリンで対比染色した。結果が図5に示される。
MSDプレートを、AD脳(1:1500に希釈された)またはTG4510脳(1:3000に希釈された)に由来する可溶化P3抗原で被覆した。結果が図6に示される。
HEK293細胞を、平板培養の24時間後に、6ウェルプレートにおいてヒトタウ−P301L−FLAGで一過性にトランスフェクトし、続いて、24時間後に、24時間にわたって脳ホモジネートとともにインキュベートした後、細胞を分割および再度平板培養し、さらに24時間後に収集した。細胞を溶解させ、1%のtriton X、Phos−stopおよび完全なホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤(Roche)緩衝液が補充されたPBS中で超音波処理し、30分間にわたって100,000×gで超遠心分離した。ペレットを、SDS中で再懸濁させ、超音波処理し、30分間にわたって100,000×gで超遠心分離した。上清を、ウエスタンブロット法によって分析した。ヒトタウ−P301Lを発現する細胞は、rTg4510タウトランスジェニックマウスに由来する総脳ホモジネートをシーディングすると、不溶性(SDS画分、E1/FLAG検出)、過リン酸化(D1.2}pS396検出)タウを示した。マウスに由来する対照脳ホモジネートで処理された細胞は、凝集過リン酸化ヒトタウが存在しないことを示した。さらに、HEK293細胞の総細胞溶解物を、Cisbio製のタウ凝集アッセイを用いて分析した。このアッセイは、FRETにおいてドナー(Tb3+コンジュゲート)およびアクセプタ(d2コンジュゲート)抗体の両方に同じ抗体を用いた時間分解蛍光に基づくものである。10μlの試料を、10μlの抗体混合物と混合し、20時間インキュベートした。プレートをPherastarプレートリーダーで読み取って、時間分解蛍光(励起光のスイッチング後に測定/積分される(integrated)FRETシグナル)を評価した。アッセイは、ヒト剖検材料、rTg4510マウスにおいて、および高い特異性および感度を有する播種されたHEK細胞において凝集タウを測定する。結果が図7に示され、シーディング効果が、HELによる処理によって影響されなかったが、タウ抗体による処理によって部分的に改善されたことを示す(C10−2>D1.2>hACI36−2B6−Ab1)。
4.5〜5.5月齢のrTg4510およびtTA対照マウスにおける海馬のCA1領域におけるシナプス伝達および可塑性のインビボの電気生理学的評価は、i)基底シナプス伝達が、tTAマウスと比較してrTg4510において有意に低下され、ii)二発刺激促通が、tTAマウスと比較してrTg4510において有意に減少されることを示した。
60μgのマウスおよびヒト化C10−2抗体を、300μlのMagnetic dynabead懸濁液(Immunoprecipitation Kit Dynabeads Protein G Novex,Cat no 10007D)に固定した。十分な洗浄の後、ビーズを、60μlのrTg4510脳抽出物と混合し、室温で10分間インキュベートした。電磁ビーズを抽出物から分離し、抽出物をウエスタンブロットによって分析した。mC10−2およびhC10−2による欠失は、タウ凝集体をそれぞれ99および99.5%除去した。結果が図12に示される。
HEK293細胞を、6ウェルプレートにおいてヒトタウ−P301L−FLAGで一過性にトランスフェクトした。24時間後、細胞を、ヒト化またはマウスC10−2を用いて免疫枯渇させた脳ホモジネートとともにインキュベートした。24時間後、細胞を再度平板培養し、さらに24時間後に収集した。細胞を溶解させ、1%のtriton X、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤(Roche)が補充されたTBS中で超音波処理し、30分間にわたって100,000×gで超遠心分離した。ペレットを、1%のSDS中で再懸濁させ、超音波処理し、30分間にわたって100,000×gで超遠心分離した。上清を、ウエスタンブロット法によって分析した。ヒトタウ−P301Lを発現する細胞は、rTg4510タウトランスジェニックマウスに由来する総脳ホモジネートをシーディングすると、不溶性(SDS画分、E1/FLAG検出)、過リン酸化タウ(より高い分子量で動作する、D1.2/pS396タウ)を示した。tTAマウスに由来する対照脳ホモジネートで処理された細胞は、凝集過リン酸化ヒトタウが存在しないことを示した。さらに、HEK293細胞の総細胞溶解物を、Cisbio製のタウ凝集アッセイを用いて分析した。HELおよびhHEL抗体による欠失が、シーディングに影響を与えなかった一方、mC10−2およびhC10−2による欠失はそれぞれ、タウ凝集を88および96%および不溶性タウを97および100%防いだ。結果が図13に示される。
100μgのマウスC10−2、D1.2およびタウ5(Invitrogen)抗体を、500μlのMagnetic dynabead懸濁液(Immunoprecipitation Kit Dynabeads Protein G Novex,Cat no 10007D)に固定した。十分な洗浄の後、ビーズを、100μlのrTg4510脳抽出物と混合し、室温で10分間インキュベートした。電磁ビーズを抽出物から分離し、抽出物をウエスタンブロットによって分析した。C10−2およびD1.2は、ホモジネートに由来する正常なタウを除去しないが、市販のタウ5抗体は除去する。対照的に、本発明の2つの抗体は、セリン396においてリン酸化されるタウである過リン酸化タウ(64kDa)を95%だけ特異的に除去する。結果が図14に示される。
100μgのマウスC10−2およびD1抗体を、500μlのMagnetic dynabead懸濁液(Immunoprecipitation Kit Dynabeads Protein G Novex,Cat no 10007D)に固定した。十分な洗浄の後、ビーズを、100μlのアルツハイマー病の脳抽出物と混合し、室温で10分間インキュベートした。電磁ビーズを抽出物から分離し、抽出物をウエスタンブロットによって分析した。D1.2およびC10−2は、脳ホモジネート中の総タウのごくわずかな部分(8%)のみを除去する。しかしながら、抗体は、AD患者に特有の過リン酸化タウ(90%)を特異的に除去する。結果が図15に示される。
CamK2陽性ニューロン(rTg4510)中、tet−off応答因子下でヒト突然変異タウ(P301L 0N4R)を発現するトランスジェニックマウスを使用した。このモデルは、通常、3月齢でタウ病変を発生し始めるが、妊娠中および子が生まれてから最初の3週間にわたって母親にドキシサイクリンを供給することによって、病変は、より遅い段階で発生する(6月齢後に開始する)。試験に使用される、ドキシサイクリンで前処理されたマウスは、注入の時点で2.5月齢であった。マウスに、吸入剤の吸入によって麻酔をかけ、定位フレームに固定した。頭蓋骨を露出させ、ブレグマおよびラムダが水平になるまで調整した。ブレグマの2mm側方(右)および2.4mm後方で、頭蓋骨に孔を空けた。10μlのシリンジのベベルチップ(SGE)を用いて、シーディング材料を、上記の配置で、脳表面の1.4mm前面に注入した。2μlの、実施例11および12に記載される免疫枯渇された抽出物を、その部位(1μl/分)にゆっくりと注入し、シリンジを5分間そのままにして置いてから、それを取り出した。創傷を縫うことによって閉じ、目を覚ますまでマウスを加熱した。マウスを3ヶ月間飼育してから殺処分し、かん流を4%のPFAで固定した。
ドキシサイクリンで処理されたrTg4510マウス(実施例13に記載される)を、2月齢から開始して、15mg/kg/週で、マウスD1.2または対照抗体で長期的に処理した。2.5ヶ月の時点で、rTg4510脳抽出物を、海馬(実施例13に記載される)に注入した。マウスを、脳注入の1、2および3ヵ月後に殺処分し、免疫組織化学および以下の分析を、実施例13に記載されるように行った。D1.2処理は、シーディングが開始された2および3ヵ月後に、タウ病変を有意に減少させた。結果が図17に示される。
100μgのマウスおよびヒト化C10−2ならびに先行技術の抗体2.10.3およびHJ8.5抗体(ソース)を、500μlのMagnetic dynabead懸濁液(Immunoprecipitation Kit Dynabeads Protein G Novex,Cat no 10007D)に固定した。十分な洗浄の後、ビーズを、100μlのアルツハイマー病の脳抽出物と混合し、室温で10分間インキュベートした。電磁ビーズを抽出物から分離し、抽出物を、ウエスタンブロットおよびCisBioアッセイによって分析した。マウスおよびヒト化C10−2は、hHel対照抗体と比較して、pS396リン酸化タウの93および97%を効率的に除去したが、総タウの22および17%のみを除去した。2.10.3抗体は、セリン396リン酸化タウの91%および総タウの10%を除去した。2.10.3は、C10−2抗体(中央の64kDaバンド)と比較して、過リン酸化バンドの1つを除去する効率が低いようである。HJ8.5抗体は、タウの大部分、総タウの89%およびpS396タウの88%を除去することによって、C10−2および2.10.3抗体の両方と、完全に異なるプロファイルを有する。結果が図23〜24に示される。
また、実施例13に記載されている免疫枯渇されたAD抽出物を、実施例10に記載されているタウ凝集アッセイを用いて分析した。C10−2およびHJ8.5抗体は、AD材料に由来する凝集タウを、2.10.3抗体より効率的に除去している。全てhHel抗体と比較して、効率性の順に:HJ8.5(99%)、hC10−2(98%)、mC10−2(96%)および2.10.3(90%)。結果が図25に示される。
25μgの抗体(ヒト化C10−2または2.10.3)を、125μlのMagnetic dynabead懸濁液(Immunoprecipitation Kit Dynabeads Protein G Novex,Cat no 10007D)に固定した。十分な洗浄の後、被覆されたビーズを、可変量の非被覆洗浄ビーズと混合した。5μgの抗体に対応する100%のAb被覆ビーズから開始して、100%の非被覆ビーズに到るまで。ビーズの総量は、全ての試料において同じであった。ビーズを、20μlのAD抽出物と混合し、室温で10分間インキュベートした。電磁ビーズを抽出物から分離し、抽出物を分割し、急速凍結させ、使用するまで−80Cに保持した。
試料を、1×LDSローディングバッファーおよび100mMのDTT中で沸騰させた。3μlの抽出物に相当する体積を、4〜12%のビス−トリスNuPAGEゲル(LifeTech Novex)上に充填した。電気泳動の後、タンパク質を、Immobilon−FL PVDF膜(0.45μm、IPFL10100、Millipore)上にブロットした。膜を、SEAブロッキング緩衝液(Prod#37527、Thermo)でブロックした。タウおよびP−タウレベルを、タウ5(Abcam ab80579、1:2000)マウスC10−2(1μg/ml)、P−S199/202(Invitrogen 44768 G、1:1000)、P−S422(Abcam ab79415、1:750)、ヒトIPN(1μg/ml)を用いて試料中で評価した。Gapdhおよびアクチンを、充填対照として使用した(Abcam ab9484、1:2000、Sigma A5441、1:20000)。二次蛍光体コンジュゲートIgG抗体を使用し(IRDye 800CWヤギ抗ヒト、IRDye 800CW、ヤギ抗ウサギ、IRDye 680ヤギ抗マウス、LI−COR biosciences)、シグナルを、Odyssey CLxおよびImage studioソフトウェア(LI−COR biosciences)を用いて定量化した。個々のバンドならびにレーン全体におけるシグナルの定量化を行い、これから、S字形用量反応曲線をプロットし、可能であれば、最大効果およびEC50値を推定した。
両方の抗体は、アルツハイマー病の脳標本からタウのわずかな部分を除去する。P−S422タウに対する特異性を有することが示された2.10.3は、総タウ量の最大で24%を除去する一方、C10−2は、総タウの最大で15%を除去する(図26を参照)。
材料および方法
材料
コーティング緩衝液:炭酸塩緩衝液pH8.5、150mMのNaCL。ブロッキング緩衝液:3%のBSA(画分V)、PBS pH7.4中0.1%のNP40。洗浄緩衝液:0.1%のBSA(画分V)、PBS、pH7.4中0.1%のNP40。スルホタグヤギ総ヒト化タウ抗体(MSD D221LA−1、50μg/ml)。
者の指示にしたがって、MSDからのタウ抗体(1:50)。プレートを、MSD SE
CTOR(登録商標)S 600において分析した。AD P3およびAD S1(p)
を、同様の設備において試験した(図33/34)。
本発明は以下の態様を含み得る。
[1]
ヒトタウ(配列番号33)のリン酸化残基396に免疫特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
[2]
無傷の抗体からなる、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
[3]
Fvフラグメント(例えば一本鎖Fvおよびジスルフィド結合Fv);Fabフラグメント、Fab’フラグメントおよびF(ab) 2 フラグメントなどのFab様フラグメント;および単一のV H 可変領域またはV L 可変領域などのドメイン抗体からなる群から選択されるエピトープ結合フラグメントを含むかまたはそれからなる、請求項1に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
[4]
前記抗体が、サブタイプIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4の抗体からなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
[5]
ヒトまたはヒト化抗体である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
[6]
前記抗体が、タウ(配列番号33)におけるリン酸化404残基に結合することが実質的にできない、請求項1〜5のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
[7]
(a)配列番号1のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(b)配列番号2のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;
(c)配列番号3のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3;
(d)配列番号4のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号5のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号6のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含む、モノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
[8]
配列番号8の重鎖または配列番号7の軽鎖を含む、請求項7に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
[9]
配列番号8の重鎖および配列番号34の軽鎖を含む、請求項7に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
[10]
(a)配列番号9のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(b)配列番号10のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;
(c)配列番号11のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3;
(d)配列番号12のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号13のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号14のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
[11]
配列番号16の重鎖および/または配列番号15の軽鎖を含む、請求項10に記載のモノクローナル抗体。
[12]
(a)配列番号17のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(b)配列番号18のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;
(c)配列番号19のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3;
(d)配列番号20のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号21のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号22のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
[13]
配列番号24の重鎖および/または配列番号23の軽鎖を含む、請求項12に記載のモノクローナル抗体。
[14]
(a)配列番号25のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(b)配列番号26のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;
(c)配列番号27のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3;
(d)配列番号28のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号29のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号30のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
[15]
配列番号32の重鎖および/または配列番号31の軽鎖を含む、請求項14に記載のモノクローナル抗体。
[16]
前記重鎖が、配列番号8、配列番号16、配列番号24、配列番号32、および配列番号35からなる群から選択され、前記軽鎖が、配列番号7、配列番号15、配列番号23、および配列番号36からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
[17]
(a)配列番号4、配列番号12、配列番号20、および配列番号28からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1;
(b)配列番号5、配列番号13、配列番号21、および配列番号29からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2;および
(c)配列番号6、配列番号14、配列番号22、および配列番号30からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3;および
(d)配列番号3、配列番号11、配列番号19、および配列番号27からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
[18]
(a)配列番号20のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1;
(b)配列番号21のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2;
(c)配列番号22のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3;および
(d)配列番号19のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3
を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
[19]
2つの残基がチロシン残基から除去されたリン酸化セリンを含む過リン酸化タウのアミノ酸モチーフに対して選択的なモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
[20]
前記アミノ酸モチーフが、配列:
−Y−X−S(リン酸化)−P−
を有し、ここで、Yがチロシンであり、Xが天然アミノ酸であり、Pがプロリンであり、S(リン酸化)が、リン酸化ヒドロキシル側鎖を有するセリンである、請求項19に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
[21]
Fc領域を含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
[22]
物質の生体内半減期を増加させるための部分をさらに含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
[23]
i)抗体は、非リン酸化タウに実質的に結合しない;ii)抗体は、396がリン酸化されないとき、404においてリン酸化されるタウに実質的に結合しない;iii)抗体は、396においてリン酸化されるタウに結合する;およびiv)抗体は、396および404が両方ともリン酸化されるとき、タウに結合するという試験基準にしたがって、リン酸化残基396を含むヒトタウへの免疫特異的結合を示す、請求項1に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
[24]
2N4Rタウの残基386〜410をカバーするTDHGAEIVYK {p} SPVVSGDT {p} SPRHL(配列番号37)内の少なくとも18連続アミノ酸残基、例えば少なくとも20連続アミノ酸残基を含む二リン酸化ペプチドに対して誘導される、請求項1に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
[25]
2N4Rタウの残基386〜410をカバーするTDHGAEIVYK {p} SPVVSGDT {p} SPRHL(配列番号37)を含む18〜40、例えば18〜30、例えば20〜30連続アミノ酸残基を含む二リン酸化ペプチドに対して誘導される、請求項24に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
[26]
月齢をマッチさせた健常対照よりAD罹患患者に由来するリン酸化タウ(pタウ)に対する特異性を有するモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントであって、前記モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが、リン酸化−および多量体特異的Setup 1 ELISAを用いて、ADおよび健常対照被験体に由来する脳ホモジネート中のリン酸化タウ(pタウ)(配列番号33)を検出するためのELISAベースのアッセイにおいて健常対照材料と比較したAD疾患材料に対する特異性の50倍超、例えば100倍超の増加の、月齢をマッチさせた健常対照に由来するタウよりAD罹患患者に由来するリン酸化タウ(pタウ)に対する特異性の差を有するようになっている、請求項1に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
[27]
AD罹患タウに対する特異性を有するモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントであって、前記モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが、リン酸化−および多量体特異的Setup 1 ELISAを用いて、ADおよび健常対照被験体に由来する脳ホモジネート中のリン酸化タウ(pタウ)(配列番号33)を検出するためのELISAベースのアッセイにおいて健常対照材料と比較したAD疾患材料に対する特異性の50倍超、例えば100倍超の増加の、月齢をマッチさせた健常対照よりADに対する特異性の差を有するようになっている、請求項1に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
[28]
ヒトタウ(配列番号33)のリン酸化残基396に免疫特異的に結合することが可能な、2N4Rタウの残基386〜410をカバーする二リン酸化ペプチド:TDHGAEIVYK {p} SPVVSGDT {p} SPRHL(配列番号37)に対して誘導される、請求項1に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
[29]
ヒト細胞株、非ヒト哺乳動物細胞株、昆虫、酵母または細菌細胞株などの細胞株において生産または製造された、請求項1〜28のいずれか一項に記載の抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
[30]
CHO細胞株、HEK細胞株、BHK−21細胞株、マウス細胞株(骨髄腫細胞株など)、線維肉腫細胞株、PER.C6細胞株、HKB−11細胞株、CAP細胞株およびHuH−7ヒト細胞株において生産される、請求項29に記載の抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント。
[31]
前記モノクローナル抗体が、i)リン酸化エピトープS396に対して免疫特異的であり、かつii)ヒトアルツハイマー病の脳に由来する過リン酸化タウを特異的に認識するクローンを単離するために、ヒト病理学的および非病理学的タウでハイブリドーマをスクリーニングすることによって単離されたハイブリドーマによって発現され、前記抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが、病理学的および非病理学的ヒトタウタンパク質を区別することができる、請求項1に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
[32]
前記抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが、検出可能な部分をさらに含む、請求項1〜31のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
[33]
前記検出可能な部分が、蛍光標識、化学発光標識、常磁性標識、放射性同位体標識または酵素標識である、請求項32に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
[34]
請求項1〜33のいずれか一項に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む調製物であって、前記調製物が、タウに結合することが可能でないかまたは前記調製物の抗タウ機能性を実質的に変更しない自然発生する抗体を実質的に含まず、前記機能性が、
(i)非リン酸化タウに結合することが実質的にできないこと;
(ii)S404においてリン酸化され、S396においてリン酸化されないタウに結合することが実質的にできないこと;
(iii)S396においてリン酸化されるタウに結合する能力;
(iv)S396およびS404の両方においてリン酸化されるタウに結合する能力;
(v)それがリン酸化404残基に結合することが実質的にできないようにまたはそれがS396に優先的に結合するように、リン酸化タウ残基S396およびS404を選択的に区別する能力;
(vi)ヒトアルツハイマー病の脳に由来する過リン酸化タウに結合する能力;
(vii)病理学的および非病理学的ヒトタウタンパク質を区別する能力;および/または
(viii)実施例に記載されるように、トランスジェニックマウスに由来する免疫枯渇されたrTg4510抽出物とともに使用されるとき、過リン酸化タウ64kDaおよび70kDaバンドを少なくとも90%だけ特異的に減少させる一方、55kDaタウバンドを10%超減少させない能力
からなる群から選択される調製物。
[35]
請求項1〜33のいずれか一項に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む調製物であって、前記抗体または前記そのエピトープ結合フラグメントが、天然抗タウ抗体の構造と比べて、そのアミノ酸配列の構造変化を有し、前記構造変化により、前記抗体または前記フラグメントが、前記天然抗タウ抗体によって示される機能性と比べて変化した機能性を示し、前記機能性が、
(i)非リン酸化タウに結合することが実質的にできないこと;
(ii)S404においてリン酸化され、S396においてリン酸化されないタウに結合することが実質的にできないこと;
(iii)S396においてリン酸化されるタウに結合する能力;
(iv)S396およびS404の両方においてリン酸化されるタウに結合する能力;
(v)それがリン酸化404残基に結合することが実質的にできないようにまたはそれがS396に優先的に結合するように、リン酸化タウ残基S396およびS404を選択的に区別する能力;
(vi)ヒトアルツハイマー病の脳に由来する過リン酸化タウに結合する能力;
(vii)病理学的および非病理学的ヒトタウタンパク質を区別する能力;および/または
(viii)本明細書に記載されるように、トランスジェニックマウスに由来する免疫枯渇されたrTg4510抽出物とともに使用されるとき、過リン酸化タウ64kDaおよび70kDaバンドを少なくとも90%だけ特異的に減少させる一方、55kDaタウバンドを10%超減少させない能力
からなる群から選択される調製物。
[36]
請求項1〜31のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント、または請求項34〜35のいずれか一項に記載の調製物、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
[37]
請求項1〜31のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントをコードするか、またはその構成鎖をコードする核酸。
[38]
治療に使用するための、請求項1〜31のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント、請求項34〜35のいずれか一項に記載の調製物、または請求項36に記載の医薬組成物。
[39]
タウオパチーを治療、診断またはイメージングするのに使用するための、請求項1〜33のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント、請求項34〜35のいずれか一項に記載の調製物、または請求項36に記載の医薬組成物。
[40]
アルツハイマー病、嗜銀顆粒性認知症(AGD)、精神病、特に、ADに起因する精神病またはADの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神医学的症状、進行性核上まひ(PSP)、前頭側頭認知症(FTDまたはその変異型)、TBI(急性または慢性外傷性脳損傷)、大脳皮質基底核変性症(CBD)、ピック病、原発性加齢性タウオパチー(PART)、神経原線維変化優位型老年性認知症、パンチドランカー、慢性外傷性脳症、脳卒中、脳卒中の回復、パーキンソン病に関連する神経変性、染色体に関連するパーキンソン病、リティコ−ボディグ病(グアムパーキンソン認知症複合)、神経節膠腫および神経節細胞腫、髄膜血管腫症、脳炎後パーキンソン病、亜急性硬化性全脳炎、ハンチントン病、鉛脳症、結節性硬化症、ハレルフォルデン・スパッツ病およびリポフスチン症からなる群から選択されるタウオパチーを治療するのに使用するための、請求項1〜31のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント、または請求項34〜35のいずれか一項に記載の調製物または医薬組成物、または請求項36に記載の組成物。
[41]
タウオパチーを治療、診断またはイメージングするための薬剤の製造に使用するための、請求項1〜31のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント、または請求項34〜35のいずれか一項に記載の調製物、または請求項36に記載の医薬組成物。
[42]
前記薬剤が、アルツハイマー病、嗜銀顆粒性認知症(AGD)、進行性核上まひ(PSP)、大脳皮質基底核変性症(CBD)、ADに起因する精神病またはADの患者における精神病、およびレビー小体型認知症の患者の精神医学的症状を治療するためのものである、請求項41に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント、または調製物または医薬組成物、または組成物。
[43]
被験体におけるアルツハイマー病または他のタウオパチーを治療、診断またはイメージングする方法であって、請求項1〜37のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント、請求項34〜35のいずれか一項に記載の調製物、または請求項36に記載の医薬組成物を、有効量で前記被験体に投与する工程を含む方法。
[44]
前記治療が、長期である、請求項43に記載の方法。
[45]
前記長期治療が、少なくとも2週間、例えば少なくとも1ヶ月間、6ヶ月間、1年間またはそれ以上にわたる、請求項44に記載の方法。
[46]
前記被験体がヒトである、請求項43〜45のいずれか一項に記載の方法。
[47]
治療に使用するための、請求項1〜31のいずれか一項に記載の抗体、またはそのフラグメント、請求項34〜35のいずれか一項に記載の調製物、または請求項36に記載の医薬組成物を含むキット。
[48]
被験体の脳における前記タウの存在または量を検出または測定するのに使用するための、請求項1〜33のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント、または前記抗体またはフラグメントを含む調製物または医薬組成物。
[49]
前記検出または測定が、前記タウに結合された前記抗タウ抗体のインビボイメージングを含む、請求項48に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント、調製物または医薬組成物。
[50]
前記検出または測定が、前記タウに結合された、前記抗タウ抗体または前記そのフラグメントのエクスビボイメージングを含む、請求項48または49に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント、調製物または医薬組成物。
[51]
過リン酸化タウを含むもつれから過リン酸化タウを除去する方法であって、過リン酸化タウを抗体と接触させる工程と含み、前記もつれから90%の過リン酸化タウが取り除かれるように、前記抗体が、リン酸化残基396を有するタウに対して選択的であり、または請求項1〜31のいずれか一項に記載されるとおりである方法。
[52]
患者におけるアルツハイマー病の進行を遅らせる方法であって、請求項1〜31のいずれか一項に記載のリン酸化残基396を有するタウに対して選択的な抗体を投与することによって、前記患者における病理学的タウタンパク質の蓄積を減少させるかまたは軽減する工程を含む方法。
[53]
残基リン酸化S396を含む病原性過リン酸化タウに対して免疫特異的な高特異性、高親和性抗体を生成するための方法によって生成される抗体であって、前記方法が、
(A)2N4Rタウの残基386〜410をカバーするTDHGAEIVYK {p} SPVVSGDT {p} SPRHL(配列番号37)を含む、18〜40、例えば18〜30、例えば20〜30連続アミノ酸残基を含む二リン酸化ペプチドを含む免疫原を哺乳動物に注入して、それによって、前記哺乳動物を免疫する工程と;
(B)前記哺乳動物の前記免疫化を2回以上繰り返す工程と;
(C)残基リン酸化S396を含む病原性過リン酸化タウに結合することが可能であるが、非病原性タウに結合する能力が実質的に低い高特異性、高親和性抗体の存在について、前記繰り返し免疫された哺乳動物に由来する血清試料をスクリーニングする工程と;
(D)前記高特異性、高親和性抗体を回収する工程と
を含む抗体。
Claims (11)
- ヒトタウ(配列番号33)のリン酸化残基396に免疫特異的に結合することが可能であり、かつ、ヒトアルツハイマー病の脳に由来する過リン酸化タウを特異的に認識するモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメントであって、
(a)配列番号9のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1;
(b)配列番号10のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2;
(c)配列番号11のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3;
(d)配列番号12のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1;
(e)配列番号13のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2;および
(f)配列番号14のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3
を含む、モノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。 - 配列番号16の重鎖および配列番号15の軽鎖を含む、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- 無傷の抗体からなる、請求項1または2に記載のモノクローナル抗体。
- Fvフラグメント;Fabフラグメント、Fab’フラグメントおよびF(ab)2フラグメント;および単一のVH可変領域またはVL可変領域からなる群から選択されるエピトープ結合フラグメントを含むかまたはそれからなる、請求項1に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
- 前記抗体が、サブタイプIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4の抗体からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
- ヒトまたはヒト化抗体である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントおよび薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体またはそのエピトープ結合フラグメントをコードするか、またはその構成鎖をコードする核酸。
- 治療に使用するための、請求項1〜6のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント、または請求項7に記載の医薬組成物。
- タウオパチーを治療、診断またはイメージングするのに使用するための、請求項1〜6のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント、または請求項7に記載の医薬組成物。
- アルツハイマー病、嗜銀顆粒性認知症(AGD)、精神病、特に、ADに起因する精神病またはADの患者における精神病、レビー小体型認知症の患者の精神医学的症状、進行性核上まひ(PSP)、前頭側頭認知症(FTDまたはその変異型)、TBI(急性または慢性外傷性脳損傷)、大脳皮質基底核変性症(CBD)、ピック病、原発性加齢性タウオパチー(PART)、神経原線維変化優位型老年性認知症、パンチドランカー、慢性外傷性脳症、脳卒中、脳卒中の回復、パーキンソン病に関連する神経変性、染色体に関連するパーキンソン病、リティコ−ボディグ病(グアムパーキンソン認知症複合)、神経節膠腫および神経節細胞腫、髄膜血管腫症、脳炎後パーキンソン病、亜急性硬化性全脳炎、ハンチントン病、鉛脳症、結節性硬化症、ハレルフォルデン・スパッツ病およびリポフスチン症からなる群から選択されるタウオパチーを治療するのに使用するための、請求項1〜6のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、またはそのエピトープ結合フラグメント、または請求項7に記載の医薬組成物。
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