TW201700975A - 從血液中捕捉及偵測循環多發性骨髓瘤細胞的分析法 - Google Patents

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Abstract

本發明包括用於單離循環多發性骨髓瘤細胞的方法及治療疑似罹患異常漿細胞疾病之病患的方法。

Description

從血液中捕捉及偵測循環多發性骨髓瘤細胞的分析法
本發明包括用於單離循環多發性骨髓瘤細胞的方法及治療疑似罹患異常漿細胞疾病之病患的方法。
相關申請
此非臨時專利申請案主張對2011年7月21日提出申請之臨時專利申請案-美國專利申請案第61/510,170號之優先權。
多發性骨髓瘤(也稱為骨髓瘤或漿細胞骨髓瘤)是漿細胞的漸進式血液癌症。病情的特徵在於骨髓中過量的漿細胞及完整單株免疫球蛋白或游離單株輕鏈的過度生產。
臨床上，以各種參數為基礎來進行該疾病的診斷、分期及治療，這些參數包括以血清及/或尿液中之單株(或骨髓瘤)蛋白質(M蛋白質)的量為基礎之骨髓瘤腫瘤細胞的質量，連同血紅素及血清鈣濃度、以骨骼檢查為基礎之溶解性骨病灶數及腎衰竭的存在與否。特性化病情的額外方法包括骨髓檢查上之漿細胞大於百分之十(10%)的偵測、軟組織漿細胞瘤的存在及游離κ(kappa)和λ(lambda)血清免疫球蛋白輕鏈的偵測。骨髓檢查係使用標準組織切片及┘免疫組織化學分析技術來完成。可實施骨髓樣本的額外細胞遺傳研究來決定預後。由於其侵入性質，若臨床上有所指示，則追蹤監 控由化學與骨髓評估組成。
目前係評估骨髓之流式細胞分析作為針對疾病特性的工具，並用於區別癌性漿細胞障礙與正常漿細胞及偵測微量殘癌。儘管如此，此方法仍持續依賴侵入性程序。有明顯需要發展侵入性較低的技術，以在疾病的整個歷史期間進行偵測、監控及特性化，且這些細胞在血液中的存在便可提供那樣的機會。
此外，需發展更為靈敏的工具，以用於在包括未知臨床意義的單株免疫球蛋白增高(MGUS)及潛伏性多發性骨髓瘤之疾病的前期更準確地進行風險評估並監控疾病進展。一些研究資料提出可在疾病前期偵測到循環漿細胞，並可與使之與預後相關聯，其為在疾病前期使用標準化方法捕捉、計算及特性化這些細胞提供依據。
在針對異常漿細胞鑑別，特別是藉由流動式細胞儀進行鑑別的文獻(Report of the European Myeloma Network on Multiparametric Flow Cytometry in Multiple Myeloma and Related Disorders.Andy C.Rawstron et al.Haematologica,2008；93(3).)中，普遍的共識已包括數種主要由CD138、CD38及CD45組成之主要生物標記的使用。亦已證實例如CD19及CD56之額外的生物標記在診斷中的效用。
本發明研究循環骨髓瘤細胞，以評估單獨或與一或多個額外的生物標記或與FISH結合的這些特定生物標記是否可用於異常循環漿細胞的捕捉與偵測，包括微量殘癌的偵測。FISH可用於偵測已在多發性骨髓瘤中敘述之許多細胞遺傳異常。IGH基因座t(4；14)之易位及p53基因座del(17p)之缺失已顯現出具有針對多發性骨髓瘤之無事件及整體存活的預測值。(Genetic Abnormalities and Survival in Multiple Myeloma：The Experience of the InterGroupe Francophone du Myelome.Herve Avet-Loiseau et al.Blood, 2007；109：3489-3495)這些探針及數種其他的多發性骨髓瘤標記在Poseidon型錄中可得，並可適於與CellTracks®平台併用。
商業上存在有使用CD138磁性粒子的免疫磁性篩選套件。Stem Cell Technologies所具有的EasySep® Human CD138 Positive Selection Kit可從骨髓與周邊血液單核細胞(PBMC)中選擇CD138陽性細胞，而Miltenyi Biotech所具有的CD138 Microbeads則用於從骨髓、PBMC及全血中篩選CD138陽性細胞。收集到的樣本典型地使用流動細胞儀執行分析。
本文所述的發明由一方法組成，其係用於捕捉及偵測循環漿細胞(CPC)及異常漿細胞或多發性骨髓瘤細胞(「CMMC」)，包括從周邊血液偵測微量殘癌。本發明提供在數毫升的血液樣本中偵測數目極少之CMMC的非侵入性手段，以在其整個歷史期間對疾病進行偵測、監控及特性化，亦提供更為靈敏的工具，以用於在包括未知臨床意義的單株免疫球蛋白增高(MGUS)及潛伏性多發性骨髓瘤之疾病的前期更準確地進行風險評估並監控疾病進展。自周邊血液捕捉並特性化這些循環漿細胞可針對多發性骨髓瘤病患的管理提供新穎的生物標記。
在含有防腐劑的CellSave管中收集血液允許血液運輸及儲存，同時使細胞降解最小化。使用與存在漿細胞上之細胞表面標記Syndecan-1或CD138共軛的膠體磁性粒子捕捉細胞。一旦捕捉細胞便以額外的細胞標示CD38-PE(藻紅蛋白)、CD19及CD45-APC(別藻藍蛋白)和CD56-FITC(螢光異硫氰酸鹽)來進行標記，以區別多發性骨髓瘤細胞與背景污染白血球(白血液細胞)。鐵磁流體及細胞標記試劑均為新CellSearc® CMMC服務套件的一部分。此套件由7個成分組成，其中4個與Cellsearch® Epithelial Cell套件中發現的試劑一致。這4種共用試劑為捕捉增強試劑 (Capture Enhancement Reagent)、Perm試劑、核酸染料及CellFix。3個新試劑由CD138鐵磁流體、由CD38-PE組成的染色試劑、CD19及CD45-APC和一由CD56-FITC組成之單獨標記染色試劑組成。
圖1繪示CD 138抗體與特定細胞株的反應性。
圖2繪示CD 38抗體與特定細胞株的反應性。
圖3繪示在PBMC上進行測試之不同的CD19 APC抗體的反應性。
圖4繪示在各種稀釋度下之CD 19 APC的染色。
圖5繪示在PBMC上之CD 56抗體的染色。
圖6繪示在各種細胞株上之CD 56染色的染色。
圖7繪示無CD56的染色。
圖8繪示一細胞株在一稀釋度下的CD 56 FITC染色。
圖9繪示一細胞株在一稀釋度下的CD 56 FITC染色。
圖10繪示一細胞株在一稀釋度下的CD 56 FITC染色
圖11繪示來自MM 1S細胞的代表性影像。
圖12繪示來自H929細胞的代表性影像。
圖13繪示續存之白血液細胞的代表性影像。
圖14繪示一病患樣本的影像。
圖15繪示一病患樣本的影像。
圖16繪示一病患樣本的影像。
圖17繪示一病患樣本的影像。
圖18繪示來自正常捐贈者的影像。
本發明包括一捕捉、單離及分析循環多發性骨髓瘤細胞的方法，該方法包含：(a)從一測試對象取得一血液樣本；(b)使該樣本與一第一配位子共軛的膠體磁性粒子接觸；(c)使步驟(b)的該樣本遭受一磁場，以產生磁性粒子束縛循環多發性骨髓瘤細胞的一分離部分；(d)以一第一額外標記處理步驟(c)的該樣本；(e)分析循環多發性骨髓瘤細胞。
如本文所用，「樣本」一詞指的是一血液量，較佳的是表示為體積測量。較佳的血液樣本體積為約2mL至10mL，更佳的是3至7.5mL，最佳的是4mL。「膠體磁性粒子」一詞指的是金屬或有機金屬粒子。這類粒子的實例在美國專利第5,597,531號、第5,698,271號、第5,698,271號及第6,365,662號中揭示，其全文，特別是針對這類膠體磁性粒子的敘述係併入於此以供參照。其可選擇性地以聚合物塗佈，較佳的是例如牛血清白蛋白及酪蛋白之生物來源聚合物。
「配位子」一詞指的是與CMMC或循環漿細胞(「CPC」)之細胞相關標記結合的蛋白質。較佳的蛋白質為抗體，較佳的是抗CD 138、抗CD 38及抗CD 56，更佳的是抗CD 138及抗CD 38，甚至更佳的是抗CD 138。這類配位子可藉由實質上與6,365,662所揭示之方法類似的方法來共軛於膠體磁性粒子。在本發明的步驟(b)中可使用二或多個配位子，且較佳的是在該步驟中使用至少兩個配位子。
「磁場」一詞可藉由多種方法的任一種來產生，特別是藉由實質上如全文併入於此以供參照之美國專利第7,901,950號中所述的兩個磁力分離器來產生。「額外標記」一詞意指一特定針對CMMC或排除CMMC 的細胞相關蛋白質。這類蛋白質包括，但不限於選自由下列所構成之群組的抗體：抗CD38、抗CD19及抗CD45、抗CD 138、抗CD 56、抗λ(anti-lambda)、抗κ(anti-kappa)、抗CD 200、抗Ki67。這類抗體可以例如藻紅蛋白、螢光異硫氰酸鹽及別藻藍蛋白之指示劑標示，且較佳的是其係以一或多個標記來進行標示。額外標記可包含例如DAPI的核酸染料。較佳的額外標記係選自由抗CD38、抗CD19及抗CD45所組成之群組；特別較佳的額外標記為抗CD38。在本發明的步驟(d)中可使用二或多個額外標記，且較佳的是使用至少兩個額外標記，更佳的是三個額外標記，最佳的是四個額外標記。
「分析」一詞意指評估磁性捕捉樣本，以決定下列的一或多個：樣本是否含有CMMC或CPC。這類鑑定可視覺上地或電子式地實施，以決定磁性捕捉樣本的螢光度。這類分析方法在美國專利第7,011,794號中揭示，其全文係併入於此以供參照。特別是，將針對CD38為陽性且針對CD19和CD45為陰性的磁性捕捉樣本鑑定為CMMC。
本發明包括一決定病患是否為針對與異常漿細胞相關疾病之治療性介入之可能候選人的方法：(a)處理該病患的血液，以決定樣本中有多少CMMC；(b)藉由計數來決定該樣本中存在的CMMC數目是否等於或大於或等於正常範圍。
如本文所用，樣本一詞具有在上文所提及的涵義及較佳範圍。「處理」一詞意指藉由本文所述的方法處理病患的血液樣本，以單離及鑑定CMMC。
「治療性介入」一詞係指為了治療與異常漿濃度相關之疾病而尋求或取得任何醫療介入。這類疾病包括，但不限於多發性骨髓瘤、MGUS及潛伏性多發性骨髓瘤。這類治療性介入包括，但不限於就醫、接受例如 輻射治療之治療性處理及使用治療與異常漿濃度相關之任何疾病的藥物進行治療和監控這類治療性處理的效果。例如，若一病患接受藥物治療，則可在治療過程期間評估該病患的CMMC濃度，以決定藥物是否有作用。這類藥物包括，但不限於德薩美松(Dexamethasone)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、長春新鹼(Vincristine)、硼替佐米(Bortezomib)、美法侖(Melphalan)、唑來膦酸(Zometa)、嘔立舒(Aloxi)、那度胺雷利米得(Lenalidomide)、多柔比星(Doxirubicin)及其類似物。
「正常範圍」一詞意指在不具有與異常漿細胞相關之疾病的樣本群體中所存在的CMMC細胞數。較佳的是此正常範圍在約3mL至約7.5mL的血液樣本中小於7個CMMC。「大於正常範圍」一詞為超過正常範圍的CMMC數。此數目越高，病患就越可能具有與異常漿細胞相關的疾病之一。若一病患的血液樣本中具有介於8和20之間的CMMC，則這類病患便有較高可能性罹患與異常漿細胞相關的疾病之一。若一病患的血液樣本中具有介於21和49之間的CMMC，則此病患具有升高的濃度，且更可能罹患與異常漿細胞相關的疾病之一；若一病患具有介於50和千百萬之間的CMMC，則該病患具有高度升高的濃度，且甚至更可能罹患這類疾病之一。
尚且更進一步地，本發明包括一決定經受治療性介入之病患是否減少CMMC數的方法，該方法包含：(a)處理該病患的血液，以決定在一第一時間點上於樣本中有多少CMMC；(b)藉由計數來決定存在於該樣本中的CMMC數是否等於或大於或等於該正常範圍；(c)處理該病患的血液，以決定在一第二時間點上於樣本中有多少CMMC； (d)藉由計數來決定存在於該樣本中的CMMC數是否等於或大於或等於該正常範圍；(e)比較步驟(b)及(d)中的該數目。
所有在上文定義的詞均具有相同涵義及較佳範圍。
更進一步地，本發明包括一決定具有異常漿細胞疾病且已成功針對這類疾病進行治療之病患是否處於緩解狀態的方法，該方法包含：(a)處理該病患的血液，以決定在一第一時間點上於樣本中有多少CMMC；(b)藉由計數來決定存在於該樣本中的CMMC數是否等於或大於或等於該正常範圍；(c)處理該病患的血液，以決定在一第二時間點上於樣本中有多少CMMC；(d)藉由計數來決定存在於該樣本中的CMMC數是否等於或大於或等於該正常範圍；(e)比較步驟(b)及(d)中的該數目。
所有在上文定義的詞均具有相同涵義及較佳範圍。
甚至更進一步地，本發明包括一用於捕捉循環多發性骨髓瘤細胞的試劑，其包括膠體磁性粒子及至少一個配位子。
所有在上文定義的詞均具有相同涵義及較佳範圍。
尚且更進一步地，本發明包括捕捉、單離及分析循環漿細胞的方法，該方法包含以下步驟：(a)從一測試對象取得一血液樣本；(b)使該樣本與一第一配位子共軛的膠體磁性粒子接觸；(c)使步驟(b)的該樣本遭受一磁場，以產生磁性粒子束縛循環多發性骨 髓瘤細胞的一分離部分；(d)以一第一額外標記處理步驟(c)的該樣本；(e)分析循環漿細胞。
所有在上文定義的詞均具有相同涵義及較佳範圍。
循環多發性骨髓瘤細胞(CMMC)為一種可從血液捕捉的異常漿細胞形式，且已使用CellTracks® AutoPrep®及CellTracks Analyzer II® System進行捕捉及分析。在此程序中，使用捕捉試劑(鐵磁流體)與螢光生物標記(例如，抗CD38-藻紅蛋白(PE)抗體)及染料(例如，核酸染料DAPI)之一組合來鑑定異常漿細胞，並區別其與污染白血球及碎片。CD138或Syndecan-1為一種細胞表面標記，可見於成熟漿細胞及漿細胞惡性腫瘤(例如，多發性骨髓瘤)之上，但不出現在其他正常的周邊血液白血球上。為此，將抗CD138耦合至鐵磁流體、磁性奈米粒子，用於以磁性方式從周邊血液樣本中選出循環漿細胞。為偵測污染白血球中之異常漿細胞，使用數種螢光生物標記。抗CD38共軛於藻紅蛋白(PE)，並用作用於偵測漿細胞的陽性標記。不過，由於CD38亦可見於一些類型的白血球上(活化T及B細胞)，測定亦使用別藻藍蛋白(APC)共軛抗CD45及與別藻藍蛋白(APC)共軛之抗CD19作為陰性標記。CD45為可見於周邊血液白血球上之泛白血球標記，而CD19為特定的B細胞標記。骨髓瘤細胞為功能分化的B細胞，其不表現CD45或CD19的任一者。此測定中之一最終標記為抗CD56，其與螢光異硫氰酸鹽(FITC)共軛。CD56可見於一些周邊白血球子集(例如，NK細胞)上，但亦表現在75%的骨髓瘤細胞上，且常與較為不良的病患預後相關。所以，雖然CD56並非針對多發性骨髓瘤之陽性或陰性標記，仍可在病患的藥物治療期間監控其在細胞上的表現程度。
起初，此分析是使用例如RPMI 8226、H929及MM.1S等細胞 株來發展，以針對包括CD138、CD38及CD56之決定存在多發性骨髓瘤細胞上的標記評估不同抗體。由於這些細胞株對CD45及CD19而言為陰性，遂使用PBMC取代來評估那些抗體。
將經濃縮及染色的細胞轉移至CellTracks®匣體及MagNest®，以用於磁性安裝。使用CellTracks Analyzer II®掃描匣體。將個別的細胞影像呈現給操作員進行查核，並以螢光及細胞形態為基礎來評定為CMMC。在一模型摻入(spike-in)系統中，測定持續從摻入來自健康捐贈者之4.0mL血液的多發性骨髓瘤細胞株H929回收~60%的細胞。測定在從0至2000個摻入H929細胞之整體測試範圍中為線性(r2 0.98，斜率0.50，截距10)。使用來自年齡匹配之健康捐贈者(n=22)及多發性骨髓瘤病患(n=66)和MGUS病患(n=7)的血液來驗證測定結果。在來自正常捐贈者的4.0mL血液中，在12/22(55%)中偵測到0個CPC，且在10/22(45%)的樣本中偵測到少量(1至6個CPC)。有趣的是，一名正常捐贈者體內發現一個CD56陽性CPC。多發性骨髓瘤病患之CMMC在4.0mL血液中的範圍從0至17,000個。在91%的病患中偵測到一或多個CMMC，在68%中5，在58%中10，且在35%中100。CD 56的表現在病患族群中高度可變。在MGUS病患中，CMMC的範圍在4.0mL血液中從0至112個。在6/7的病患中偵測到一或多個CMMC，在4/6中>5個，在2/6中>10個，且在1/6中>100個。
為進一步特徵化CMMC及區別CPC與CMMC，發展一種螢光原位雜交(FISH)測定的介面來與上述的捕捉及偵測系統併用。使用四色FISH探針，以同時偵測高風險突變。下列實例說明本發明。
實例
縮寫
PE-藻紅蛋白
FITC-螢光異硫氰酸鹽
APC-別藻藍蛋白
PBMC-周邊血液單核細胞
抗體來源-
CD 138：Gen-Probe Diaclone SAS
1 Bd A Fleming，BP 1985
F-25020 Besancon Cedex，France
CD38及CD19：R&D Systems
614 McKinley Place N.E.
Minneapolis，MN 55413
實例1捕捉目標
圖1顯示針對與細胞株RPMI 8226、H929及MM.1S之反應性進行測試的抗CD138抗體，表現最佳的抗體是殖株B-A38。首先以不同抗體標示細胞株，抗體皆為鼠抗人抗體，之後以抗鼠PE共軛對標示，並藉由流動細胞儀來進行分析。殖株B-A38在所有多發性骨髓瘤細胞株上均呈現最高的螢光染色。
實例2偵測目標
圖2顯示針對與細胞株RPMI 8226、H929及MM.1S之反應性進行測試的抗CD38抗體，表現最佳的抗體是殖株240742。初始係使用直接抗CD38-FITC共軛對來測試細胞株，但稍後發現FITC共軛對並非十分適於在CellTracks®平台上進行偵測。隨後製備並測試此抗體之一PE共軛對，並 發現其適於偵測。
實例3稀釋度決定
選擇兩者均作為APC共軛對之抗CD19及抗CD45來作為陰性偵測標記，因為缺少這兩者為異常漿細胞的指示。抗CD45APC已是CellSearch® CTC染色試劑之一成分，所以不需要進一步的最佳化。且由於接受評估之骨髓瘤細胞株皆未表現CD19，使用PBMC來評估不同的抗CD19APC殖株。抗CD19在PBMC上的測試結果可見於圖3。根據製造商的建議規程在從EDTA及CellSave管收集到的PBMC上實施染色。殖株SJ25C1係選定為表現最佳的共軛對。之後在各種稀釋度下以AutoPrep®上所用的相同反應體積測試該共軛對，如圖4。選擇1：5的稀釋度作為最終用於染色的稀釋度。
實例4染色CD56及PBMC
選擇抗CD56作為FITC標記試劑，因其表現在具有異常表現之75%的骨髓瘤案例上。根據製造商的建議規程在細胞株(圖6)及PBMC(圖5)上實施測試。選擇NCAM 16.2作為表現最佳的共軛對。
實例5 CD 56 FITC稀釋度
在AutoPrep®上以各種稀釋度測試抗CD56 FITC共軛對NCAM 16.2與H929細胞，參見圖7至10。經測試，在細胞株上沒有明顯的最佳稀釋度。除非可測試病患樣本來幫助決定最佳濃度，否則便選擇1：4的稀釋度作為最終用於染色的稀釋度。
實例6影像
接著建構CMMC原型套件，其係由下列所組成：抗CD138鐵磁流體；由抗CD38 PE、抗CD45 APC及抗CD19 APC組成的染色試劑；及抗CD56 FITC標記試劑。套件的剩餘成分為捕捉增強試劑(PN 7037)、通 透性試劑(Permeabilization Reagent)(PN 7038)、核酸染料(PN 7041)及CellFix(PN 7042)。第一回合的測試使用不同濃度的抗CD138鐵磁流體。以先前的流量資料為基礎，將最終抗CD38 PE的濃度設定為1μg/ml(染色試劑濃度為5.7μg/ml)。最終抗CD45 APC的濃度為接近2μg/ml(染色試劑濃度為13μg/ml-和CellSearch® CTC Kit中的相同)，並將原料抗CD19 APC共軛對以染色試劑1：5的稀釋。在標記試劑小玻璃瓶中以1：4的濃度使用抗CD56 FITC。將H929細胞摻入7.5ml之CellSave血液中，並於AutoPrep®上以濃度135、185、220及270μg/ml的鐵磁流體進行處理。之後在CellTracks Analyzer II®上分析樣本，H929細胞之回收在約220μg/ml達到55至60%的平線區。
因此決定套件中之最終鐵磁流體的濃度為每7.5ml血液樣本220μg/ml，其類似於許多其他CellSearch®套件中所用的濃度。
回收之H929及MM.1S細胞的CellTracks®影像分別可見於圖11及圖12。須注意相較於MM.1S細胞，H929細胞有較大的CD 56染色。圖13中可見到續存的白血液細胞(CD38+/CD45+)。
實例7病患樣本
總計對66個多發性骨髓瘤病患樣本進行CMMC測試。這些樣本係取自Conversant，原先使用CellTracks® CMMC服務套件測試7.5mL的血液，但顯然許多樣本具有大量的CMMC，因此決定將進行測試的血液體積減少至4mL。先在CellTracks® AutoPrep®上處理樣本，接著在CellTracks Analyzer II®上進行掃描。圖10為從病患血液樣本產生的資料列表。多發性骨髓瘤病患之4.0mL血液中的CMMC範圍從0至17,000。在91%的病患中偵測到一或多個CMMC，在68%中5，在58%中10，且在35%中100。CD56的表現在病患族群中高度可變。MGUS病患之4.0mL血液中的CMMC範圍從0至112個。在6/7的病患中偵測到一或多個CMMC，在4/6中>5個，在2/6中 >10個，且在1/6中>100個。圖14至17顯示來自病患樣本之一些具代表性的CellTracks®影像。
表1說明
期數：骨髓瘤細胞之程度與特徵的診斷分類，其包括I期、II期及III期。隨著期數進展，癌細胞數從相對少量進展至中等量，再進展至相對大量。例如M蛋白質、貧血及血清鈣的額外症狀亦隨著期數進展而增加。
治療狀態：反映疾病狀態及治療方式
治療類型：藥物或輻射治療
體積：在CellSearch® System
上進行處理的周邊血液體積總事件：為了進行多發性骨髓瘤細胞的人工分類而呈現給使用者之CellTracks®瀏覽器影像的總數
總MM細胞(CD38+、CD19/45-)：經使用者決定為符合多發性骨髓瘤(MM)細胞基準之來自總事件的影像總數。這些細胞為CD38陽性及CD19/45陰性。
CD38+、CD19/45-、CD56+：CD56陽性之多發性骨髓瘤細胞的數目
CD38+、CD19/45-、CD56-：CD56陰性之多發性骨髓瘤細胞的數目
未指定事件：總事件減去總MM細胞，其係經使用者分類為多發性骨髓瘤細胞的事件。未指定事件為白血液細胞、電腦雜訊或其他未分類為MM細胞之碎片的組合。
表1：CMMC多發性骨髓瘤病患樣本表
實例8正常對象
之後亦對二十二位年齡匹配的正常人進行測試。這些樣本亦取自Conversant，並以4ml血液使用CellTracks® CMMC服務套件進行測試。在CellTracks® AutoPrep®上處理樣本，之後在CellTracks Analyzer II®上進行掃描。表2為產生自4ml血液樣本的資料表。在來自正常捐贈者的4.0mL血液中，12/22(55%)中偵測到0個CPC，10/22(45%)樣本中偵測到少量(1至6個)。有趣的是，一位正常捐贈者體內發現一個CD56陽性CPC。參見圖18。總瀏覽器事件的平均數接近1500。
為進一步特徵化CMMC及區別CPC與CMMC，發展休止期螢光原位雜交(FISH)測定來與上述的捕捉及偵測系統併用。使用四色FISH探針，以同時偵測高風險突變，其包括IgH基因座(t(4；14)(p16；q32)及t(14；16)(q32；q23))的兩個復發易位及TP53基因座(△17p13)的缺失。FISH測定在細胞株H929、MM1s及U266上進行驗證，其分別顯示位處t(4；14)、t(14；16)及△17p13的突變。在9個CMMC病患樣本上測試FISH測定，且8個樣本產生可評估的結果。兩個樣本顯示t(4；14)融合；3個病患顯示畸變的FISH訊號圖案，其指示染色體4或14的非整倍性；且剩餘病患顯示正常的FISH圖案。
實例9使用抗CD 38及抗CD 138之病患樣本的捕捉
在本發明中，與用於捕捉骨髓瘤細胞之膠體磁性粒子共軛之細胞表面標記抗CD138可隨時間推移自骨髓瘤細胞的表面剝落。亦存在於骨髓瘤細胞上之表面標記CD38則不經受自細胞表面的剝落。發展磁性奈米粒子，其係耦合至抗CD138及抗CD38兩者，並以病患樣本及正常捐贈者兩者針對捕捉骨髓瘤細胞之能力進行測試。抗CD38及抗CD 138兩者均與藻紅蛋白(PE)共軛，且兩者均識別出與用於製作磁性奈米粒子之抗CD38及抗CD 138不同的抗原決定基，將這兩者用來與別藻藍蛋白(APC)共軛之抗CD45及抗CD19一起進行偵測。
針對CMMC使用替用捕捉試劑測試總數22個的多發性骨髓瘤病患樣本。這些樣本係取自Conversant，並在CellTracks® AutoPrep®上處理4ml，之後在CellTracks Analyzer II®上進行掃描。表3為產生自病患樣本的表。多發性骨髓瘤病患之4.0mL血液中的CMMC範圍從0至2244個。在82%的病患中偵測到一或多個CMMC，在64%中5個，在59%中10個，且在23% 中100個。
實例9使用抗CD 38及抗CD 138之病患樣本的捕捉
接著亦使用與實例8相同的套件配置來測試十二個正常捐贈者。這些樣本為內部捐贈者，並在CellTracks® AutoPrep®上處理4ml血液，接著在CellTracks Analyzer II®上進行掃描。表4為產生自4mL血液樣本的表。在來自正常捐贈者的4.0mL血液中，在5/12(42%)中偵測到0個CPC，且在7/12(58%)的樣本中偵測到少量(1至3個CPC)。

Claims (6)

  1. 一種決定病患是否為針對與異常漿細胞相關疾病之治療性介入之可能候選人的方法(a)處理該病患的血液，以決定樣本中有多少CMMC；(b)藉由計數來決定存在於該樣本中的CMMC數是否等於或大於或等於該正常範圍。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中處理包含：(a)從一測試對象取得一血液樣本；(b)使該樣本與一第一配位子共軛的膠體磁性粒子接觸；(c)使步驟(b)的該樣本遭受一磁場，以產生磁性粒子束縛循環多發性骨髓瘤細胞的一分離部分；(d)以一第一額外標記處理步驟(c)的該樣本；(e)分析循環多發性骨髓瘤細胞。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在一病患樣本中之CMMC的正常範圍係在約2mL至10mL的血液中少於7個CMMC。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含若在約2mL至約10mL之血液中的CMMC數大於8，則建議治療性介入。
  5. 一種決定經受治療性介入之病患是否減少CMMC數的方法，該方法包含：(a)處理該病患的血液，以決定在一第一時間點上於樣本中有多少CMMC；(b)藉由計數來決定存在於該樣本中的CMMC數是否等於或大於或等於該正常範圍； (c)處理該病患的血液，以決定在一第二時間點上於樣本中有多少CMMC；(d)藉由計數來決定存在於該樣本中的CMMC數是否等於或大於或等於該正常範圍；(e)比較步驟(b)及(d)中的該數目。
  6. 一種決定具有異常漿細胞疾病且已成功針對這類疾病進行治療之病患是否處於緩解狀態的方法，該方法包含：(a)處理該病患的血液，以決定在一第一時間點上於樣本中有多少CMMC；(b)藉由計數來決定存在於該樣本中的CMMC數是否等於或大於或等於該正常範圍；(c)處理該病患的血液，以決定在一第二時間點上於樣本中有多少CMMC；(d)藉由計數來決定存在於該樣本中的CMMC數是否等於或大於或等於該正常範圍；(e)比較步驟(b)及(d)中的該數目。
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