TW201542580A

TW201542580A - 胞苷－５－羧硫胺改質的核苷酸組成物及其製法

Info

Publication number: TW201542580A
Application number: TW103140482A
Authority: TW
Inventors: 約翰若羅夫; 尼柏薩珍吉科; 巴拉特格萬德
Original assignee: 身體邏輯公司
Priority date: 2013-11-21
Filing date: 2014-11-21
Publication date: 2015-11-16
Also published as: IL263380A; EP3330277A3; JP2021073211A; MX2020001158A; HK1223625A1; RU2016124202A; RU2732402C2; CA2928207C; IL269461B; US9938314B2; US20180201641A1; BR112016010165A2; AU2014353102A1; CA2928207A1; KR20160078989A; JP2016540755A; CN105658658B; HK1252242A1; TWI632155B; JP7008405B2

Abstract

本文描述5位經修飾之胞嘧啶核苷酸及核苷以及其亞磷醯胺及三磷酸酯衍生物。進一步提供製備及使用其之方法，以及該等經修飾之核苷之組成物及該等經修飾之核苷作為核酸分子(例如，適體)之一部分的用途。

Description

經胞苷-5-甲醯胺修飾之核苷酸組成物及其相關方法

[相關申請案]

本申請案依據35 U.S.C.§119(e)主張2013年11月21日申請之美國臨時申請案序列號61/907,274之優先權，該案以全文引用的方式併入本文中。

本發明大體而言係關於核酸化學領域，特定而言係關於5位經修飾之胞嘧啶以及其亞磷醯胺及三磷酸酯衍生物。本發明亦關於製備及使用其之方法。本發明包括經修飾之核苷作為寡核苷酸或適體之一部分的用途。

經修飾之核苷已用作治療劑、診斷劑，且用於併入寡核苷酸中以改良其特性(例如，穩定性)。

指數富集配位體系統進化(Systematic Evolution of Ligands for EXponential Enrichment,SELEX)為一種鑑別選擇性地結合靶分子之寡核苷酸(稱作「適體」)之方法。 SELEX製程描述於美國專利第5,270,163號中，該專利之內容以全文引用的方式併入本文中。SELEX方法涉及自寡核苷酸之隨機混合物選擇及鑑別寡核苷酸以達成結合親和力及選擇性之幾乎任何所需之準則。藉由將特定類型之經修飾之核苷引入在SELEX製程之過程中所鑑別之寡核苷酸中，可改變核酸酶穩定性、淨電荷、親水性或親脂性以提供寡核苷酸之三維結構及標靶結合能力之差異。因此，不同經修飾之核苷提供「調整」在SELEX之過程中所選擇之寡核苷酸之所需特性的能力。

在5位帶有N-取代之甲醯胺基的經修飾之去氧尿苷核苷酸已證實為有價值之工具，其用於改良蛋白質結合適體之試管內選擇(SELEX製程)(參見例如Gold等人，2010；Hollenstein，2012；及Imaizumi等人，2013)及用於所選適體之結合及藥物動力學特性之SELEX後最佳化(參見例如Davies等人，2012；Lee等人，2010；Kerr等人，2000；及Gaballah等人，2002)。尿苷-5-甲醯胺之一般合成依賴於常用經活化之酯中間物5-(2,2,2-三氟乙氧羰基)-2’-去氧尿苷(1)，其最初由Matsuda及共同工作者報導(參見例如Nomura等人，1997)。用多種一級胺(1.2當量，60℃，4小時)處理此經活化之酯得到相應5-(N-取代之甲醯胺)。Matsuda亦揭示胞苷系列中之類似經活化之酯N-乙醯基-5-(2,2,2-三氟乙氧羰基)-2’-去氧胞苷(參見例如Nomura等人，1996)。然而，此中間物由於N-乙醯基保護基之易變性及N-乙醯基-5-碘-胞苷合成前驅體之不穩定性實際上不太適用於合成胞苷-5-甲醯胺。

持續需要用於改良寡核苷酸標靶結合劑之替代性組成物，及合成該等組成物之其他方法。本發明藉由提供新穎的經胞苷-5-甲醯胺修飾之組成物來滿足該等需要。

本發明描述5位經修飾之胞嘧啶以及其亞磷醯胺及三磷酸酯衍生物，及製造及使用其之方法。

在一個態樣中，本發明提供一種包含式I所示之結構之化合物：

其中R獨立地為-(CH₂)_n-，其中n為選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10之整數；R^X1獨立地選自由以下組成之群組：

其中^＊表示R^X1基團與-(CH₂)_n-基團之連接點；且其中R^X4獨立地選自由以下組成之群組：經取代或未經取代之支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；羥基；鹵素(F、Cl、Br、I)；腈(CN)；硼酸(BO₂H₂)；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR^X2)；一級醯胺(CONH₂)；二級醯胺(CONHR^X2)；三級醯胺(CONR^X2R^X3)；磺醯胺(SO₂NH₂)；N-烷基磺醯胺(SONHR^X2)；R^X2及R^X3在每次出現時獨立地選自由以下組成之群組：經取代或未經取代之支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；苯基(C₆H₅)；經R^X4取代之苯基環(R^X4C₆H₄)，其中R^X4定義於上文；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR^X5)，其中R^X5為支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；及環烷基，其中R^X2與R^X3一起形成經取代或未經取代之5或6員環；X獨立地選自由-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH₂CH₂OCH₃、-NH₂及-疊氮基組成之群組；R’獨立地選自由-H、-OAc、-OBz、-P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN)及-OSiMe₂tBu組成之群組；R”獨立地選自由氫、4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)及三磷酸酯(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)₂)或其鹽組成之群組；Z獨立地選自由-H、經取代或未經取代之支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C4)組成之群組；及其鹽；有以下例外：當n=4時，則R^X1不可為H；當n=3時，則R^X1不可為CH₃；當n=0時，則R^X1不可為-CH(CH₃)₂；且當n=2，且R^X1為且R^X4為羥基時，則R^X1 不可為

在相關態樣中，n為選自1、2或3之整數。

在相關態樣中，R^X1選自由以下組成之群組：

其中^＊表示R^X1基團與-(CH₂)_n-基團之連接點；且Z獨立地選自由-H、經取代或未經取代之支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C4)組成之群組。

在相關態樣中，R^X4獨立地選自由支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C6)、-OH、-F及羧酸(COOH)組成之群組。

在相關態樣中，X獨立地選自由-H、-OH、-OMe及-F組成之群組。

在相關態樣中，R’選自由-H、-OAc及-P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN)組成之群組。

在相關態樣中，R”為三磷酸酯(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)₂)。

在另一態樣中，本發明提供一種包含選自由式II(BndC)、III(PEdC)、IV(PPdC)、V(NapdC)、VI(2NapdC)、VII(NEdC)及VIII(2NEdC)組成之群組之結構的化合物：其中X獨立地選自由-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH₂CH₂OCH₃、-NH₂及-疊氮基組成之群組。

在另一態樣中，本發明提供一種核酸分子，其包含上文所述之化合物中之任一者。

在一相關態樣中，核酸分子包含RNA、DNA 或其組合。

在一相關態樣中，核酸分子之長度為15至100個核苷酸。

在一相關態樣中，核酸分子為適體。

在一相關態樣中，核酸分子之至少一個額外核苷酸包含選自由2’位糖修飾組成之群組的化學修飾，包括(但不限於)2’-胺基(2’-NH₂)、2’-氟(2’-F)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-乙基(2’-OEt)、2’-O-丙基(2’-OPr)、2’-O-CH₂CH₂OCH₃及疊氮基。

在另一態樣中，本發明提供一種核酸分子，其包含有包含式IA所示之結構之化合物：

其中，^＊表示R^X1基團與-(CH₂)_n-基團之連接點；且其中，R^X4獨立地選自由以下組成之群組：支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；羥基；鹵素(F、Cl、Br、I)；腈(CN)；硼酸(BO₂H₂)；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR^X2)；一級醯胺(CONH₂)；二級醯胺(CONHR^X2)；三級醯胺(CONR^X2R^X3)；磺醯胺(SO₂NH₂)；N-烷基磺醯胺(SONHR^X2)；R^X2及R^X3在每次出現時獨立地選自由以下組成之群組：支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；苯基(C₆H₅)；經R^X4取代之苯基環(R^X4C₆H₄)，其中R^X4定義於上文；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR^X5)，其中R^X5為支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；及環烷基，其中R^X2與R^X3一起形成經取代或未經取代之5或6員環；X獨立地選自由-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH₂CH₂OCH₃、NH₂及-疊氮基組成之群組；Z獨立地選自由-H、經取代或未經取代之C(1-4)烷基組成之群組；及其鹽；有以下例外：當n=4時，則R^X1不可為H；當n=3時，則R^X1不可為CH₃；當n=0時，則R^X1不可為-CH(CH₃)₂；且當n=2，且R^X1為且R^X4為羥基時，則R^X1 不可為

在一相關態樣中，n為1、2或3。

在一相關態樣中，R^X1選自由以下組成之群組：

其中，

^＊表示R^X1基團與-(CH₂)_n-基團之連接點；且Z獨立地選自由-H、經取代或未經取代之C(1-4)烷基組成之群組。

在一相關態樣中，R^X4獨立地選自由支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C6)、-OH、-F及羧酸(COOH)組成之群組。

在一相關態樣中，X獨立地選自由-H、-OH、-OMe及-F組成之群組。

在一相關態樣中，R’選自由-H、-OAc及-P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN)組成之群組。

在一相關態樣中，R”為三磷酸酯(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)₂)。

在一相關態樣中，核酸分子包含DNA、RNA或其組合。

在一相關態樣中，核酸分子之長度為15至100個核苷酸。

在一相關態樣中，核酸分子為適體。

在一相關態樣中，核酸分子之至少一個額外核苷酸包含選自由2’位糖修飾組成之群組的化學修飾，其獨立地選自由2’-胺基(2’-NH₂)、2’-氟(2’-F)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-乙基(2’-OEt)、2’-O-丙基(2’-OPr)、2’-O-CH ₂ CH ₂ OCH ₃及疊氮基組成之群組。

在一相關態樣中，核酸分子進一步包含選自由骨架修飾、3’帽、5’帽及其組合組成之群組的修飾。

在一相關態樣中，化合物包含選自由式IIA、IIIA、IVA、VA、VIA、VIIA及VIIIA組成之群組的結構：

其中X獨立地選自由-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH₂CH₂OCH₃、NH₂及-疊氮基組成之群組。

在另一態樣中，本發明提供一種製備具有式I之化合物的方法：

其中，^＊表示R^X1基團與-(CH₂)_n-基團之連接點；且其中，R^X4獨立地選自由以下組成之群組：支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；羥基；鹵素(F、Cl、Br、I)；腈(CN)；硼酸(BO₂H₂)；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR^X2)；一級醯胺(CONH₂)；二級醯胺(CONHR^X2)；三級醯胺(CONR^X2R^X3)；磺醯胺(SO₂NH₂)；N-烷基磺醯胺(SONHR^X2)； R^X2及R^X3在每次出現時獨立地選自由以下組成之群組：支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；苯基(C₆H₅)；經R^X4取代之苯基環(R^X4C₆H₄)，其中R^X4定義於上文；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR^X5)，其中R^X5為支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；及環烷基，其中R^X2與R^X3一起形成經取代或未經取代之5或6員環；X獨立地選自由-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH₂CH₂OCH₃、NH₂及-疊氮基組成之群組；Z獨立地選自由-H、經取代或未經取代之C(1-4)烷基組成之群組；該方法包括提供具有式IX之化合物

其中，R^X6為碘基或溴基；R^X7及R^X8在每次出現時獨立地為氫或保護基；X獨立地選自由-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH₂CH₂OCH₃、NH₂及-疊氮基組成之群組；及在R^X1-R-NH₂、一氧化碳及溶劑存在下藉由鈀(0)催化之反應轉化具有式IX之化合物；及分離具有式I之化合物。

在一相關態樣中，R^X6為碘基。

在一相關態樣中，R^X7及R^X8為氫。

在一相關態樣中，X選自由-H、-OMe及-F組成之群組。

在一相關態樣中，n為1、2或3。

在一相關態樣中，R^X1選自由以下組成之群組：

其中，^＊表示R^X1基團與-(CH₂)_n-基團之連接點；且Z獨立地選自由-H、經取代或未經取代之C(1-4)烷基組成之群組。

在一相關態樣中，R”為氫或三磷酸酯(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)₂)。

在一相關態樣中，保護基選自由以下組成之群組：三苯基甲基、對甲氧苯基二苯基甲基、二對甲氧苯基二苯基甲基、對二甲氧基三苯甲基三苯甲基、甲醯基、第三丁氧羰基、苄氧羰基、2-氯苄氧羰基、4-氯苄氧羰基、2,4-二氯苄氧羰基、糠基羰基、第三戊氧羰基、金剛烷氧羰基、2-苯基丙基-(2)-氧羰基、2-(4-聯苯)丙基-(2)-氧羰基、2-硝基苯基硫基及二苯基膦基。

在一相關態樣中，溶劑選自由以下組成之群組：二甲基甲醯胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、四氫呋喃(THF)、乙酸乙酯、丙酮、乙腈(MeCN)、二甲亞碸(DMSO)及碳酸伸丙酯。

在另一態樣中，本發明提供一種製備具有選自由式II、III、IV、V、VI、VII及VIII組成之群組之式之化合物的方法其中X獨立地選自由-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH₂CH₂OCH₃、NH₂及-疊氮基組成之群組；該方法包括提供具有式IX之化合物

其中，R^X6為碘基或溴基；R^X7及R^X8在每次出現時獨立地為氫或保護基；X獨立地選自由-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH₂CH₂OCH₃及-疊氮基組成之群組；及在R^X1-R-NH₂、一氧化碳及溶劑存在下藉由鈀(0)催化之反應轉化具有式IX之化合物；及分離具有選自由式II、III及IV組成之群組之式之化合物。

在一相關態樣中，R^X6為碘基。

在一相關態樣中，R^X7及R^X8為氫。

在一相關態樣中，X選自由-H、-OMe及-F組成之群組。

本發明進一步提供一種選擇對靶分子具有結合親和力之核酸適體之方法，其包括：(a)使候選混合物與標靶接觸，其中該候選混合物包含經修飾之核酸適體，其中該候選混合物之至少一個或各個核酸適體中之一個、若干個或所有嘧啶包含本文所述之化合物(5位經修飾之胞嘧啶)，且其中對靶分子具有結合親和力之核酸適體形成核酸適體-靶分子複合物；(b)自該候選混合物分割該等核酸適體-靶分子複合物；(c)解離該等核酸適體-靶分子複合物以產生游離核酸適體；(d)擴增該等游離核酸適體以得到相對於該候選混合物中之其他核酸具有增加之自靶分子之解離半衰期的核酸適體；(e)鑑別至少一個核酸適體，其中該核酸適體對靶分子具有結合親和力。

在另一態樣中，使用富集有能夠結合至靶分子且當結合至靶分子時具有慢解離速率(off-rate)之核酸序列之核酸適體的混合物重複步驟a)至d)以進一步富集能夠結合至靶分子且當結合至靶分子時具有慢解離速率之核酸序列。

在另一態樣中，慢解離速率核酸適體之解離速率為約2分鐘至約360分鐘(或約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、45、60、75、90、105、120、150、180、210、240、270、300、330或360分鐘)。

在另一態樣中，慢解離速率核酸適體之解離速率大於或等於約2分鐘(或大於約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、45、60、75、90、105、120、150、180、210、240、270、300、330或360分鐘)。

在另一態樣中，靶分子為蛋白質或肽。

在另一態樣中，靶分子選自由PSCK9蛋白、PSMA蛋白、ERBB2蛋白及ERBB3蛋白組成之群組。

在另一態樣中，至少一個核酸適體能夠以小於100nM，或約0.1nM至約100nM(或0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、 57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100nM)之平衡結合常數(K _d)結合靶分子。

在另一態樣中，本文所述之方法進一步包括使候選混合物暴露於慢解離速率富集製程。

在另一態樣中，在步驟(b)之前進行慢解離速率富集製程。在一相關態樣中，慢解離速率富集製程選自由以下組成之群組：添加競爭分子、稀釋步驟、添加競爭分子繼之以稀釋步驟之組合、稀釋步驟繼之以添加競爭分子之組合，及同時進行之添加競爭分子與稀釋步驟之組合。

在又一相關態樣中，競爭分子為聚陰離子。在另一態樣中，競爭分子選自由寡核苷酸、dNTP、肝素及硫酸葡聚糖組成之群組。

本發明之前述及其他目的、特徵及優點將自以下詳細說明變得更顯而易見，該詳細說明係參考隨附圖式而展開。

圖1展示如實例之材料與方法部分所述之使用DNTP之引子延伸分析法的聚丙烯醯胺凝膠圖像。泳道1：dAdGdT(5%全長)；泳道2：dAdGdTdC(100%全長)；泳道3：dAdGdT+9a(119%全長)；泳道4：dAdGdT+9b(113%全長)；泳道5：dAdGdT+9c(120%全長)；泳道6：20/200 DNA梯。參考此圖可見，全部三種經修飾之三磷酸胞苷在此分析法中至少如天然、未經修飾之2’-去氧胞苷一般有效地併入。

除非另有注釋，否則技術術語係根據習知用法使用。在分子生物學中常用術語之定義可見於Benjamin Lewin,Genes V,Oxford University Press出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(編)，The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；及Robert A.Meyers(編)，Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)中。

除非另有說明，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解之含義相同的含義。除非本文另有明確指示，否則單數術語(其中^＊表示R^X1基團與-(CH₂)_n-基團之連接點；且其中^＊表示R^X1基團與-(CH₂)_n-基團之連接點)；及「一(a/an)」及「該」包括複數個指示物。「包含A或B」意謂包括A或B，或A及B。應進一步瞭解，對於核酸或多肽所給出之所有鹼基大小或胺基酸大小及所有分子量或分子品質值均為近似值，且出於描述而提供。

此外，本文所提供之範圍應理解為簡寫在該範圍內之所有值。舉例而言，1至50之範圍應理解為包括來自由以下組成之群組的任何數值、數值之組合或子範圍：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50(以及其分數，除非本文另有明確指示)。除非另有指示，否則任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括在所述範圍內之任何整數之值，且適當時包括其分數(諸如整數之十分之一及百分之一)。此外，除非另有指示，否則本文中關於任何物理特徵(諸如聚合物次單元、大小或厚度)所述之任何數值範圍應理解為包括在所述範圍內之任何整數。除非另有指示，否則如本文所用之「約」或「基本上由......組成」意謂所指示之範圍、值或結構±20%。如本文所用之術語「包括」及「包含」為開放式的且同義使用。應瞭解，如本文所用之術語「一」係指所列組分中之「一或多者」。替代物(例如「或」)之使用應理解為意謂替代物中之一者、兩者或其任何組合。

儘管類似或等效於本文所述者之方法及材料可用於實施或測試本發明，但下文描述適合之方法及材料。本文所提及之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻均以全文引用的方式併入。在相矛盾之情況下，將以本說明書(包括術語之解釋)為準。另外，材料、方法及實例僅為說明性的且不欲具限制性。

如本文所用之術語「核苷酸」係指核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸，或其經修飾之形式，以及其類似物。核苷酸包括以下物質：包括嘌呤(例如腺嘌呤、次黃嘌呤、鳥嘌呤及其衍生物及類似物)以及嘧啶(例如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶及其衍生物及類似物)。

如本文所用之術語「C-5經修飾之甲醯胺胞苷」或「胞苷-5-甲醯胺」係指在胞苷之C-5位具有甲醯胺(-C(O)NH-)修飾之胞苷，包括(但不限於)本文所說明之彼等部分(R^X1)。示例性C-5經修飾之甲醯胺胞苷包括(但不限於)5-(N-苄基甲醯胺)-2’-去氧胞苷(稱作「BndC」且下文展示為式(II))；5-(N-2-苯基乙基甲醯胺)-2’-去氧胞苷(稱作「PEdC」且下文展示為式(III))；5-(N-3-苯基丙基甲醯胺)-2’-去氧胞苷(稱作「PPdC」且下文展示為式(IV))；5-(N-1-萘基甲基甲醯胺)-2’-去氧胞苷(稱作「NapdC」且下文展示為式(V))；5-(N-2-萘基甲基甲醯胺)-2’-去氧胞苷(稱作「2NapdC」且下文展示為式(VI))；5-(N-1-萘基-2-乙基甲醯胺)-2’-去氧胞苷(稱作「NEdC」且下文展示為式(VII))；及5-(N-2-萘基-2-乙基甲醯胺)-2’-去氧胞苷(稱作「2NEdC」且下文展示為式(VIII))：

本文所述之C-5經修飾之胞苷的化學修飾亦可單獨地或以任何組合形式與2’位糖修飾、在環外胺處之修飾及4-硫代胞苷之取代及其類似者組合。

鹽

可能方便或合意地製備、純化及/或處理化合物之相應鹽，例如醫藥學上可接受之鹽。醫藥學上可接受之鹽之實例論述於Berge等人(1977)「Pharmaceutically Acceptable Salts」J.Pharm.Sci.66：1-19中。

舉例而言，若化合物為陰離子性，或具有可為陰離子性之官能基(例如-COOH可為-COO^-)，則可與適合之陽離子形成鹽。適合之無機陽離子之實例包括(但不限於)鹼金屬離子，諸如Na⁺及K⁺；鹼土金屬陽離子，諸如Ca²⁺及Mg²⁺；及其他陽離子，諸如Al⁺³。適合之有機陽離子之實例包括(但不限於)銨離子(即NH₄ ⁺)及經取代之銨離子(例如NH₃R^X+、NH₂R^X ₂ ⁺、NHR^X ₃ ⁺、NR^X ₄ ⁺)。一些適合之經取代之銨離子之實例為源自以下之銨離子：乙胺、二乙胺、二環己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、膽鹼、葡甲胺及緩血酸胺，以及胺基酸，諸如離胺酸及精胺酸。常見四級銨離子之一實例為N(CH₃)₄ ⁺。

若化合物為陽離子性，或具有可為陽離子性之官能基(例如-NH₂可為-NH₃ ⁺)，則可與適合之陰離子形成鹽。適合之無機陰離子之實例包括(但不限於)源自以下無機酸之陰離子：鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、亞硫酸、硝酸、亞硝酸、磷酸及亞磷酸。

適合之有機陰離子之實例包括(但不限於)源自以下有機酸之陰離子：2-乙醯氧基苯甲酸、乙酸、抗壞血酸、天冬胺酸、苯甲酸、樟腦磺酸、肉桂酸、檸檬酸、依地酸(edetic acid)、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、反丁烯二酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、麩胺酸、乙醇酸、羥基順丁烯二酸、羥基萘甲酸、羥乙基磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、順丁烯二酸、蘋果酸、甲烷磺酸、黏液酸、油酸、乙二酸、棕櫚酸、帕莫酸(pamoic acid)、泛酸、苯基乙酸、苯基磺酸、丙酸、丙酮酸、水楊酸、硬脂酸、丁二酸、對胺基苯磺酸、酒石酸、甲苯磺酸及戊酸。適合之聚合有機陰離子之實例包括(但不限於)源自以下聚合酸之陰離子：單寧酸(tannic acid)、羧甲基纖維素。

除非另有規定，否則提及特定化合物亦包括其鹽形式。

寡核苷酸之製備

在一個態樣中，本發明提供使用單獨或與其他經修飾之核苷及/或天然存在之核苷組合的本文所述之經修飾之核苷以製備經修飾之寡核苷酸之方法。寡去氧核苷之自動化合成為許多實驗室中之常規實踐(參見例如Matteucci,M.D.及Caruthers,M.H.,(1990)J.Am.Chem.Soc.,103：3185-3191，其內容特此以全文引用的方式併入)。寡核糖核苷之合成亦為熟知的(參見例如Scaringe,S.A.等人，(1990)Nucleic Acids Res.18：5433-5441，其內容特此以全文引用的方式併入)。如本文所述，亞磷醯胺適用於藉由化學合成將經修飾之核苷併入寡核苷酸中，且三磷酸酯適用於藉由酶促合成將經修飾之核苷併入寡核苷酸中(參見例如Vaught,J.D.等人(2004)J.Am.Chem.Soc.,126：11231-11237；Vaught,J.V.等人(2010)J.Am.Chem.Soc.132,4141-4151；Gait,M.J.「Oligonucleotide Synthesis a practical approach」(1984)IRL Press(Oxford,UK)； Herdewijn,P.「Oligonucleotide Synthesis」(2005)(Humana Press,Totowa,N.J.)(各文獻以全文引用的方式併入本文中))。

如本文所用之術語「修飾(modify/modification)」、「經修飾(modified)」及其任何變化形式當在提及寡核苷酸中使用時，意謂寡核苷酸之四個組成性核苷酸鹼基(即，A、G、T/U及C)中之至少一者為天然存在之核苷酸之類似物或酯。在一些實施例中，經修飾之核苷酸賦予寡核苷酸以核酸酶抗性。其他修飾可包括骨架修飾、甲基化、稀有鹼基配對組合(諸如異鹼基異胞苷與異胍)，及其類似修飾。修飾亦可包括3’及5’修飾，諸如加帽。其他修飾可包括用類似物取代天然存在之核苷酸中之一或多者、核苷酸間修飾，諸如具有不帶電鍵聯(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷醯胺酸酯、胺基甲酸酯等)之修飾及具有帶電鍵聯(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)之修飾、具有嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等)之修飾、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)之修飾、含有烷化劑之修飾及具有經修飾之鍵聯(例如α異頭核酸等)之修飾。此外，通常存在於核苷酸之糖上的任何羥基可經膦酸酯基或磷酸酯基置換；由標準保護基保護；或經活化以製備與額外核苷酸或與固體支撐物之額外鍵聯。5’及3’端OH基團可經磷酸化或經以下取代：胺、約1個至約20個碳原子之有機加帽基團部分、在一個實施例中在約10至約80kDa範圍內之聚乙二醇(PEG)聚合物、在另一實施例中在約20至約60kDa範圍內之PEG聚合物，或其他親水性或疏水性生物或合成聚合物。

聚核苷酸亦可含有此項技術中一般已知之核糖或去氧核糖之類似形式，包括2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-O-乙基、2’-O-丙基、2’-O-CH₂CH₂OCH₃、2’-氟、2’-NH₂或2’-疊氮基、碳環糖類似物、α-異頭糖、差向異構糖(諸如***糖、木糖或來蘇糖、哌喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖)、非環狀類似物及無鹼基核苷類似物(諸如甲基核糖苷)。如本文所述，一或多個磷酸二酯鍵可經替代性鍵聯基團置換。此等替代性鍵聯基團包括磷酸酯經P(O)S(「硫酯」)、P(S)S(「二硫酯」)、(O)NR^X ₂(「醯胺酸酯」)、P(O)R^X、P(O)OR^X’、CO或CH₂(「甲縮醛」)置換之實施例，其中各R^X或R^X’獨立地為H，或視情況含有醚(-O-)鍵、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基之經取代或未經取代之烷基(C1-C20)。聚核苷酸中並非所有鍵聯均必須為相同的。糖、嘌呤及嘧啶之類似形式之取代可有利於設計最終產物，如可為替代性骨架結構，如例如聚醯胺骨架。

聚核苷酸亦可含有碳環糖類似物、α-異頭糖、差向異構糖之類似形式，諸如***糖、木糖或來蘇糖、哌喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，非環狀類似物及無鹼基核苷類似物，諸如甲基核糖苷。

若存在，則對核苷酸結構之修飾可在組裝聚合物之前或之後賦予。核苷酸之序列可間雜有非核苷酸組分。聚核苷酸可在聚合之後進一步修飾，諸如藉由與標記組分結合。

如本文所用之「核酸」、「寡核苷酸」及「聚核苷酸」可互換使用以指代核苷酸聚合物，且包括此等種類之核酸、寡核苷酸及聚核苷酸之DNA、RNA、DNA/RNA雜交體及修飾，其中包括各種實體或部分在任何位置處與核苷酸單元之連接。術語「聚核苷酸」、「寡核苷酸」及「核酸」包括雙股或單股份子以及三螺旋分子。核酸、寡核苷酸及聚核苷酸為比術語適體更寬泛之術語，且因此術語核酸、寡核苷酸及聚核苷酸包括作為適體之核苷酸聚合物，但術語核酸、寡核苷酸及聚核苷酸並不限於適體。

在某些實施例中，本發明提供一種製備包含具有式I之化合物之核酸分子的方法：

其中，^＊表示R^X1基團與-(CH₂)_n-基團之連接點；且其中，R^X4獨立地選自由以下組成之群組：支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；羥基；鹵素(F、Cl、Br、I)；腈(CN)；硼酸(BO₂H₂)；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR^X2)；一級醯胺(CONH₂)；二級醯胺(CONHR^X2)；三級醯胺(CONR^X2R^X3)；磺醯胺(SO₂NH₂)；N-烷基磺醯胺(SONHR^X2)；R^X2及R^X3在每次出現時獨立地選自由以下組成之群組：支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；苯基(C₆H₅)；經R^X4 取代之苯基環(R^X4C₆H₄)，其中R^X4定義於上文；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR^X5)，其中R^X5為支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；及環烷基，其中R^X2與R^X3一起形成經取代或未經取代之5或6員環；X獨立地選自由-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH₂CH₂OCH₃、NH₂及-疊氮基組成之群組；R’獨立地選自由-H、-OAc、-OBz、-P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN)及-OSiMe₂tBu組成之群組；R”獨立地選自由氫、4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)及三磷酸酯(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)₂)或其鹽組成之群組；Z獨立地選自由-H、經取代或未經取代之C(1-4)烷基組成之群組；及其鹽，該方法包括合成具有複數個核苷酸及至少一種具有式I之化合物的核酸分子。

在某些實施例中，本發明提供製備包含具有選自由式II、III、IV、V、VI、VII及VIII組成之群組之式之化合物之核酸分子的方法：其中X獨立地選自由-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH₂CH₂OCH₃、NH₂及-疊氮基組成之群組；該方法包括合成具有複數個核苷酸及至少一種具有選自由式II、III及IV組成之群組之式之化合物的核酸分子。

當提及核酸之修飾時，如本文所用之術語「至少一個核苷酸」係指核酸中之一個、若干個或所有核苷酸，其指示核酸中之任何或所有A、C、T、G或U之任何或所有出現情況可經修飾或未經修飾。

在其他態樣中，本發明提供使用單獨或與其他經修飾之核苷及/或天然存在之核苷組合的本文所述之經修飾之核苷以製備適體及SOMAmer(描述於本文中)之方法。在特定實施例中，使用如下文所述之一般SELEX或經改良之SELEX製程來製備適體及SOMAmer。

如本文所用之「核酸配位體」、「適體」、「SOMAmer」及「純系」可互換使用以指代對靶分子具有合意作用之非天然存在之核酸。合意作用包括(但不限於)結合標靶、催化地改變標靶、以修飾或改變標靶或標靶之功能活性之方式與標靶反應、共價連接至標靶(如在自殺性抑制劑中)，及促進標靶與另一分子之間的反應。在一個實施例中，作用為對靶分子之特異性結合親和力，該靶分子為除聚核苷酸以外之經由獨立於沃森/克裏克鹼基配對(Watson/Crick base pairing)或三螺旋體形成之機制結合至核酸配位體之三維化學結構，其中適體不為具有由靶分子結合之已知生理功能的核酸。針對既定標靶之適體包括自核酸之候選混合物鑑別之核酸，其中適體為標靶之配位體，此係藉由包括以下之方法來達成：(a)使候選混合物與標靶接觸，其中相對於候選混合物中之其他核酸對標靶具有增加之親和力的核酸可自候選混合物之其餘部分分割；(b)自候選混合物之其餘部分分割該等親和力增加之核酸；及(c)擴增該等親和力增加之核酸以得到配位體富集之核酸混合物，藉此鑑別靶分子之適體。應認識到，親和相互作用為程度問題；然而，在此情形中，適體對其標靶之「特異性結合親和力」意謂適體一般相比其結合至混合物或樣品中之其他非標靶組分以程度高得多的親和力結合至其標靶。「適體」、「SOMAmer」或「核酸配位體」為具有特定核苷酸序列之一種類型或種類之核酸分子的一組複本。適體可包括任何適合數目之核苷酸。「適體」係指一組以上之此類分子。不同適體可具有相同或不同數目之核苷酸。適體可為DNA或RNA且可為單股、雙股，或含有雙股或三股區域。

如本文所用之「SOMAmer」或慢解離速率修飾之適體係指具有經改良之解離速率特徵之適體。SOMAmer可使用題為「Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates」之美國專利第7,947,447號中所述之經改良之SELEX方法產生。

如本文所用之「蛋白質」與「肽」、「多肽」或「肽片段」同義使用。「經純化」之多肽、蛋白質、肽或肽片段實質上不含細胞物質或來自獲得胺基酸序列之細胞、組織或無細胞來源之其他污染性蛋白質，或當以化學方式合成時基本上不含化學前驅體或其他化學物質。

SELEX方法

術語「SELEX」及「SELEX製程」在本文中可互換使用以一般指代以下組合：(1)選擇以合意方式與靶分子相互作用，例如以高親和力結合至蛋白質之核酸，與(2)擴增彼等所選之核酸。SELEX製程可用於鑑別對特異性靶分子或生物標誌物具有高親和力之適體。

SELEX一般包括製備核酸之候選混合物，使該候選混合物結合至所需靶分子以形成親和性複合物，使親和性複合物與未結合之候選核酸分離，自親和性複合物分離及隔離核酸，純化核酸，及鑑別特異性適體序列。該製程可包括多個輪次以進一步改進所選適體之親和力。該製程可在製程中之一或多個點處包括擴增步驟。參見例如題為「Nucleic Acid Ligands」之美國專利第5,475,096號。SELEX製程可用於產生共價結合其標靶之適體以及非共價結合其標靶之適體。參見例如題為「Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment：Chemi-SELEX」之美國專利第5,705,337號。

SELEX製程可用於鑑別含有經修飾之核苷酸之高親和力適體，該等核苷酸賦予適體經改良之特徵，諸如經改良之活體內穩定性或經改良之傳遞特徵。該等修飾之實例包括在核糖及/或磷酸酯及/或鹼基位置處之化學取代。經SELEX製程鑑別之含有經修飾之核苷酸之適體描述於題為「High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides」之美國專利第5,660,985號中，該專利描述含有在嘧啶之5’位及2’位經化學修飾之核苷酸衍生物的寡核苷酸。美國專利第5,580,737號(參見上文) 描述含有一或多個經2’-胺基(2’-NH₂)、2’-氟(2’-F)及/或2’-O-甲基(2’-OMe)修飾之核苷酸之高度特異性適體。亦參見題為「SELEX and PHOTOSELEX」之美國專利申請公開案第20090098549號，該案描述具有擴展之物理及化學特性之核酸文庫及其在SELEX及photoSELEX中之用途。

SELEX亦可用於鑑別具有合意解離速率特徵之適體。參見題為「Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates」之美國專利第7,947,447號，其以全文引用的方式併入本文中，該專利描述產生可結合至靶分子之適體的經改良之SELEX方法。描述產生自其各別靶分子具有較慢解離速率之適體及光適體之方法。該等方法涉及使候選混合物與靶分子接觸，允許形成核酸-標靶複合物，及進行慢解離速率富集製程，其中具有快解離速率之核酸-標靶複合物解離且不會重新形成，而具有慢解離速率之複合物保持完整。另外，該等方法包括使用經修飾之核苷酸產生候選核酸混合物以產生具有經改良之解離速率效能之適體(參見題為「SELEX and PhotoSELEX」之美國專利第8,409,795號)。(亦參見美國專利第7,855,054號及美國專利公開案第20070166740號)。此等申請案中之每一者以全文引用的方式併入本文中。

「標靶」或「靶分子」在本文中係指核酸可依合意方式對其起作用之任何化合物。靶分子可為(但不限於)蛋白質、肽、核酸、碳水化合物、脂質、多醣、醣蛋白、激素、受體、抗原、抗體、病毒、病原體、毒性物質、受質、代謝物、過渡態類似物、輔因子、抑制劑、藥物、染料、營養素、生長因子、細胞、組織、前述任一者之任何部分或片段等。幾乎任何化學或生物效應子可為適合之標靶。任何大小之分子可充當標靶。標靶亦可依某些方式修飾以提高標靶與核酸之間的相互作用之可能性或強度。標靶亦可包括特定化合物或分子之任何微小變化，諸如在蛋白質之情況下，例如胺基酸序列之微小變化、二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化，或任何其他操作或修飾，諸如與標記組分結合，該標記組分實質上不會改變分子之身份。「靶分子」或「標靶」為能夠結合至適體之一種類型或種類之分子或多分子結構的一組複本。「靶分子」或「標靶」係指一組以上之此類分子。標靶為肽之SELEX製程之實施例描述於題為「Modified SELEX Processes Without Purified Protein」之美國專利第6,376,190號中。

如本文所用之「競爭分子」及「競爭子」可互換使用以指代可與非靶分子形成非特異性複合物之任何分子。在此情形中，非靶分子包括游離適體，其中例如競爭子可用於抑制適體非特異性地結合(再結合)至另一非靶分子。「競爭分子」或「競爭子」為一種類型或種類之分子之一組複本。「競爭分子」或「競爭子」係指一組以上之此類分子。競爭分子包括(但不限於)寡核苷酸、聚陰離子(例如肝素、鯡魚精DNA、鮭魚精DNA、tRNA、硫酸葡聚糖、葡聚糖、無鹼基磷酸二酯聚合物、dNTP及焦磷酸酯)。在多個實施例中，可使用一或多個競爭子之組合。

如本文所用之「非特異性複合物」係指除適體與其靶分子以外之兩個或兩個以上分子之間的非共價締合。非特異性複合物表示分子種類之間的相互作用。非特異性複合物包括適體與非靶分子、競爭子與非靶分子、競爭子與靶分子及靶分子與非靶分子之間形成的複合物。

如本文所用之術語「慢解離速率富集製程」係指改變候選混合物之某些組分之相對濃度以使得具有慢解離速率之適體親和性複合物之相對濃度相對於具有較快、不太合意之解離速率之適體親和性複合物之濃度增加的製程。

在一個實施例中，慢解離速率富集製程為基於溶液之慢解離速率富集製程。在此實施例中，基於溶液之慢解離速率富集製程在溶液中進行，以使得混合物中形成適體親和性複合物之標靶及核酸在慢解離速率富集製程期間均不固定於固體支撐物上。在多個實施例中，慢解離速率富集製程可包括一或多個步驟，包括添加競爭分子及與競爭分子一起培育、稀釋混合物，或此等步驟之組合(例如在競爭分子存在下稀釋混合物)。由於慢解離速率富集製程之作用一般視不同適體親和性複合物(即，在靶分子與候選混合物中之不同核酸之間形成的適體親和性複合物)之不同解離速率而定，因此選擇慢解離速率富集製程之持續時間以便保留高比例之具有慢解離速率之適體親和性複合物，同時實質上減少具有快的解離速率之適體親和性複合物之數目。慢解離速率富集製程可在SELEX製程期間之一或多個週期中使用。當稀釋及添加競爭子以組合形式使用時，其可同時或依序以任何次序進行。當混合物中之總標靶(蛋白質)濃度較低時，可使用慢解離速率富集製程。在一個實施例中，當慢解離速率富集製程包括稀釋時，可盡可能實用地稀釋混合物，緊記回收經適體保留之核酸用於SELEX製程中之後續輪次。在一個實施例中，慢解離速率富集製程包括使用競爭子以及稀釋，從而允許以比不使用競爭子之情況下可能必需進行之稀釋更少程度地稀釋混合物。

在一個實施例中，慢解離速率富集製程包括添加競爭子，且競爭子為聚陰離子(例如肝素或硫酸葡聚糖(葡聚糖))。肝素及葡聚糖已在先前SELEX選擇中用於鑑別特異性適體。然而，在該等方法中，肝素或葡聚糖在標靶與適體結合以形成複合物之平衡步驟期間存在。在該等方法中，隨著肝素或葡聚糖之濃度增加，高親和力標靶/適體複合物與低親和力標靶/適體複合物之比率增大。然而，由於核酸與競爭子之間的標靶結合之競爭，高濃度之肝素或葡聚糖會減少在平衡狀態下高親和力標靶/適體複合物之數目。相比之下，本發明所述之方法在已允許形成標靶/適體複合物之後添加競爭子，且因此不會影響所形成之複合物之數目。在標靶與適體之間已發生平衡結合之後添加競爭子建立非平衡狀態，其適時發展至具有較少標靶/適體複合物之新平衡。在已達到新平衡之前捕獲標靶/適體複合物使得樣品富集慢解離速率適體，此係因為快解離速率複合物將首先解離。

在另一實施例中，聚陰離子性競爭子(例如硫酸葡聚糖或另一聚陰離子性物質)用於慢解離速率富集製程中以有助於鑑別耐受聚陰離子存在之適體。在此情形中，「聚陰離子耐性適體」為能夠形成適體/標靶複合物之適體，該複合物相比包括非聚陰離子耐性適體之適體/標靶複合物較小可能在亦含有聚陰離子耐性物質之溶液中解離。以此方式，聚陰離子耐性適體可用於進行分析方法以偵測樣品中標靶之存在或量或濃度，其中偵測方法包括使用適體所耐受之聚陰離子性物質(例如硫酸葡聚糖)。

因此，在一個實施例中，提供一種產生聚陰離子耐性適體之方法。在此實施例中，在使核酸之候選混合物與標靶接觸之後，使標靶及候選混合物中之核酸達到平衡。將聚陰離子性競爭子引入溶液中且在溶液中培育一段足以確保候選混合物中之大多數快解離速率適體自靶分子解離之時間。此外，候選混合物中可在聚陰離子性競爭子存在下解離之適體將自靶分子釋放。分割混合物以分離已保持與靶分子締合之高親和力、慢解離速率適體及自溶液中去除任何未複合之物質。接著可自靶分子釋放適體且將其分離。亦可對經分離之適體進行擴增及更多輪選擇以增加所選適體之總體效能。若對於特定應用而言不需要選擇慢解離速率適體，則亦可在最小培育時間下使用此製程。

因此，在一個實施例中，提供用於鑑別或產生具有低(長)解離速率之適體的經修改之SELEX製程，其中使靶分子與候選混合物接觸且一起培育一段足以使靶分子與候選混合物中所含之核酸之間發生平衡結合之時間。在平衡結合之後，將過量競爭分子(例如，聚陰離子競爭子)添加至混合物中，且將混合物與過量競爭分子一起培育一段預定時間。大比例之具有小於此預定培育期之解離速率的適體將在預定培育期期間自標靶解離。由於過量競爭分子可非特異性地結合至標靶且佔據標靶結合位點，故此等「快」解離速率適體與標靶之再締合降至最低。大比例之具有較長解離速率之適體將在預定培育期期間保持與標靶複合。在培育期結束時，自混合物之其餘部分分割核酸-標靶複合物允許慢解離速率適體之群體與具有快解離速率之適體分離。解離步驟可用於使慢解離速率適體自其標靶解離且允許進行對靶分子具有高親和力及特異性之慢解離速率適體(個別適體或慢解離速率適體之群組)的分離、鑑別、定序、合成及擴增。如同習知SELEX一般，自一輪經修改之SELEX製程鑑別之適體序列可用於合成新候選混合物以使得接觸、平衡結合、添加競爭分子、與競爭分子一起培育及分割慢解離速率適體之步驟可根據需要反複/重複進行多次。

在添加競爭子之前允許候選混合物與標靶之平衡結合、繼而添加過量競爭子及與競爭子一起培育一段預定時間的組合可選擇具有比先前所達成之解離速率大得多的解離速率之適體群體。為達成平衡結合，可將候選混合物與標靶一起培育至少約5分鐘或至少約15分鐘、約30分鐘、約45分鐘、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時或約6小時。

可根據需要選擇競爭分子與候選混合物及靶分子之混合物之預定培育期，考慮以下因素：諸如標靶之性質及已知適體對標靶之已知解離速率(若有)。預定培育期可選自：至少約5分鐘、至少約10分鐘、至少約20分鐘、至少約30分鐘、至少約45分鐘、至少約1小時、至少約2小時、至少約3小時、至少約4小時、至少約5小時、至少約6小時。

在其他實施例中，稀釋用作解離速率增強製程，且可進行經稀釋之候選混合物、靶分子/適體複合物之培育持續一段預定時間，其可選自：至少約5分鐘、至少約10分鐘、至少約20分鐘、至少約30分鐘、至少約45分鐘、至少約1小時、至少約2小時、至少約3小時、至少約4小時、至少約5小時、至少約6小時。

本發明之實施例係關於慢解離速率適體之鑑別、產生、合成及用途。此等適體為如下適體：其自非共價適體-標靶複合物之解離速率(t_1/2)高於藉由習知SELEX通常獲得之適體的解離速率。對於含有適體與標靶之非共價複合物之混合物，t_1/2表示一半適體自適體-標靶複合物解離所花費之時間。本發明之慢解離速率適體之t_1/2選自以下之一：大於或等於約30分鐘；介於約30分鐘與約240分鐘之間；介於約30分鐘至約60分鐘之間；介於約60分鐘至約90分鐘之間；介於約90分鐘至約120分鐘之間；介於約120分鐘至約150分鐘之間；介於約150分鐘至約180分鐘之間；介於約180分鐘至約210分鐘之間；介於約210分鐘至約240分鐘之間。

藉由SELEX程序鑑別之適體之表徵特徵為其對其標靶之高親和力。適體對其標靶之解離常數(k_d)將選自以下之一：小於約1μM、小於約100nM、小於約10nM、小於約1nM、小於約100pM、小於約10pM、小於約1pM。

化學合成

用於本發明所提供之化合物之化學合成的方法描述於本文中。此等及/或其他熟知方法可依已知方式修改及/或調整以有助於合成本發明所提供之其他化合物。

參考流程1，本發明亦提供一種合成C-5經修飾之胺基羰基嘧啶之3’-亞磷醯胺之方法。參考流程1，值得注意的是，鈀催化之一氧化碳及鹼與5-取代之核苷之反應在小於或等於2個大氣壓之一氧化碳壓力下進行；更特定而言為0.1至2個大氣壓(或0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2個大氣壓)，且甚至更特定而言為 1個大氣壓。在此等減壓下之反應相比在介於3個與4個大氣壓[50psi]之壓力下進行之先前方法得到較高產率及較純產物。

參考流程2，本發明亦提供一種合成C-5經修飾之胺基羰基嘧啶之5’-三磷酸酯之方法，其包括：在某些實施例中，保護基選自由以下組成之群組：三苯基甲基、對甲氧苯基二苯基甲基、二對甲氧苯基二苯基甲基、對二甲氧基三苯甲基三苯甲基、甲醯基、第三丁氧羰基、苄氧羰基、2-氯苄氧羰基、4-氯苄氧羰基、2,4-二氯苄氧羰基、糠基羰基、第三戊氧羰基、金剛烷氧羰基、2-苯基丙基-(2)-氧羰基、2-(4-聯苯)丙基-(2)-氧羰基、2-硝基苯基硫基及二苯基膦基。

提供以下實例以說明某些特定特徵及/或實施例。此等實例不應解釋為將本發明限於所描述之特定特徵或實施例。

實例實例1：5-(N-苄基甲醯胺)-2’-去氧胞苷之合成

此實例提供製備5-(N-苄基甲醯胺)-2’-去氧胞苷(或BndC；參見下文之流程1(4a))之方法。簡言之，藉由在室溫下於N,N-二甲基甲醯胺(DMF)中用必需之芳族一級胺RCH₂NH₂(5-10當量)、一氧化碳(</=1atm)及(Ph₃P)₄Pd(2莫耳%)處理24-48小時使市售5-碘-2’-去氧胞苷(3)轉化成相應N-取代之甲醯胺(4a-c)(流程1)。過量一級胺及有限一氧化碳為限制2-酮基甲醯胺副產物形成所必需(參見例如Uozumi,Y.等人(2001)及Takacs等人，2008)。經修飾之核苷產物(4a-c)易於藉由自醇中再結晶而純化。

起始物質：5-碘-2’-去氧胞苷、5-碘-2’-O-甲基-胞苷、5-碘-2’-去氧-2’-氟胞苷購自ChemGenes Corporation(Wilmington,MA 01887,USA)或Thermo Fisher Scientific Inc.(Waltham,MA 02454,USA)。99.9%純度之一氧化碳(安全性：有毒氣體)購自Specialty Gases of America(Toledo,OH 43611,USA)。所有其他試劑均購自Sigma-Aldrich(Milwaukee,WI 53201,USA)且按接收的狀態使用。

5-(N-苄基甲醯胺)-2’-去氧胞苷(4a)：向經氬氣填充之1L圓底燒瓶中饋入：5-碘-2’-去氧胞苷(30g，85mmol)、苄胺(109.3g，1020mmol，12當量)及無水N,N-二甲基甲醯胺(DMF，205mL)。快速磁性攪拌混合物直至所有固體已溶解。藉由抽真空至50mm及用氬氣再填充之兩個週期使所得溶液脫氣。添加雙(二亞苄基丙酮)鈀(0)(978mg，1.7mmol，0.02當量)與三苯基膦(1.92g，7.3mmol，0.086當量)之混合物，且快速攪拌所得細緻黑色懸浮液，抽真空至50mm且用來自橡膠氣球之一氧化碳(1atm)填充。在室溫(約20℃)下攪拌混合物且週期性地用一氧化碳再填充。26小時後，藉由tlc分析(矽膠，洗提劑：15%甲醇/85%二氯甲烷(v/v)，R_f(SM)=0.3，R_f(4a)= 0.4)發現反應完成。用乙酸乙酯(205mL)稀釋反應混合物，過濾，且用65%乙酸乙酯/35% DMF(100mL)正向沖洗。在旋轉蒸發器(50-80℃，1-2mm)上濃縮澄清綠色濾液直至所有溶劑及大部分苄胺已蒸餾。將暗橙色殘餘物(約75g)溶解於熱的絕對乙醇(650mL)中且快速熱過濾以去除少量不可溶薄片(約2g)。在緩慢攪拌下使澄清濾液冷卻，且產物結晶為針狀物。攪拌隔夜之後，過濾漿液，且用冰冷乙醇(100mL)洗滌濾餅。在真空中乾燥之後，獲得呈白色結晶固體狀之產物(4a)：22.0g，72%產率。 ¹H NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=8.73(t,J=5.8Hz,1H),8.42(s,1H),8.06(bs,1H),7.75(bs,1H),7.32(m,4H),7.25(m,1H),6.14(t,J=6.5Hz,1H),5.24(d,J=4.4Hz,1H),5.03(t,J=5.5Hz,1H),4.42(dd,J=15.4,7.2Hz,1H),4.41(dd,J=15.4,7.3Hz,1H),4.26(m,J=4.3Hz,1H),3.83(dd,J=7.9,4.3Hz,1H),3.64(m,1H),3.58(m,1H),2.19(m,2H)。¹³C NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=165.88(1C),163.97(1C),153.99(1C),144.26(1C),139.64(1C),128.80(2C),127.60(2C),127.30(1C),99.20(1C),88.08(1C),86.29(1C),70.44(1C),61.50(1C),42.72(1C),40.62(1C)。MS m/z：C₁₇H₁₉N₄O₅之[M^-]計算值359.36；實驗值359.1(ESI^-)。

4-N-乙醯基-5-(N-苄基甲醯胺)-2’-去氧胞苷 (5a)：向1L圓底燒瓶中饋入(4a)(20.0g，55.4mmol)及無水四氫呋喃(THF，500mL)。用乙酸酐(26.4mL，277 mmol，5當量)處理經充分攪拌之混合物，且在50℃下加熱混合物20小時。等分試樣(藉由溶解於50%甲醇/50%二氯甲烷中而均化)之Tlc分析顯示反應完成(矽膠，洗提劑：15%甲醇/85%二氯甲烷(v/v)，R_f(4a)=0.4，R_f(5a)=0.6)。冷卻漿液至5-10℃維持1小時，過濾，且用冷THF(40mL)洗滌。在真空中乾燥得到呈白色結晶針狀之產物(5a)，20.4g，91%產率。¹H NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=11.35(s,1H),8.98(t,J=5.7Hz,1H),8.73(s,1H),7.34(d,J=4.4Hz,4H),7.26(m,J=4.3Hz,1H),6.10(t,J=6.1Hz,1H),5.28(d,J=4.4Hz,1H),5.09(t,J=5.4Hz,1H),4.44(dd,J=15.3,8.1Hz,1H),4.43(dd,J=15.2,8.1Hz,1H),4.28(dt,J=9.8,4.0Hz,1H),3.91(dd,J=7.9,4.0Hz,1H),3.68(m,1H),3.60(m,1H),2.41(s,3H),2.34(m,1H),2.22(m,1H)。¹³C NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=171.27(1C),165.49(1C),159.77(1C),153.19(1C),146.24(1C),139.16(1C),128.82(2C),127.76(2C),127.41(1C),100.32(1C),88.67(1C),87.50(1C),70.11(1C),61.17(1C),43.00(1C),40.78(1C),26.70(1C)。MS m/z：C₁₉H₂₁N₄O₆之[M^-]計算值401.40；實驗值401.1(ESI^-)。

5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-4-N-乙醯基-5- (N-苄基甲醯胺)-2’-去氧胞苷(6a)：向250mL圓底燒瓶中饋入(5a)(4.82g，12mmol)及無水吡啶(40mL)。磁性攪拌所得無色溶液，同時經一小時分五份添加4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(4.47g，13.2mmol，1.1當量)。再攪拌橙黃色溶液30分鐘，用乙醇(4.2mL，72mmol)淬滅，且在旋轉蒸發器(1-2mm，35℃)上濃縮。用乙酸乙酯(100mL)及冷的飽和碳酸氫鈉水溶液(50mL)分配所得黏稠橙色殘餘物(約13g)。用硫酸鈉乾燥有機層，過濾且濃縮，留下黃色泡沫狀物。藉由急驟層析(矽膠，洗提劑：1%三乙胺/99%乙酸乙酯，R_f(6a)=0.4)純化，得到呈白色泡沫狀之(6a)，6.1g，72%產率。¹H NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=11.44(s,1H),9.12(t,J=5.5Hz,1H),8.46(s,1H),7.38(d,J=7.4Hz,2H),7.25(m,12H),6.84(m,4H),6.10(t,J=6.1Hz,1H),5.34(d,J=4.7Hz,1H),4.20(m,3H),4.05(m,1H),3.72(d,J=1.7Hz,6H),3.41(dd,J=10.5,6.0Hz,1H),3.20(dd,J=10.4,3.5Hz,1H),2.44(s,3H),2.39(m,1H),2.25(m,1H)。¹³C NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=171.28(1C),165.38(1C),159.88(1C),158.53(2C),153.07(1C),146.13(1C),145.26(1C),138.91(1C),136.00(1C),135.98(1C),130.16(2C),130.11(2C),128.78(2C),128.28(2C),128.13(2C),127.84(2C),127.46(1C),127.14(1C),113.60(4C),100.32(1C),88.04(1C),86.86(1C),86.19(1C),70.69(1C),60.22(1C),55.43(1C),55.42(1C),43.03(1C),40.70(1C),26.76(1C)。MS m/z：C₄₀H₃₉N₄O₈之[M^-]計算值703.77；實驗值703.2(ESI^-)。

5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-4-N-乙醯基-5- (N-苄基甲醯胺)-2’-去氧胞苷-3’-O-(N,N-二異丙基-O-2-氰 基乙基亞磷醯胺)(7a)。向250mL圓底燒瓶中饋入：(6a)(11.0g，15.6mmol)、無水二氯甲烷(40mL)、2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四異丙基亞磷醯二胺(5.9mL，18.7mmol，1.2當量)及最後三氟乙酸吡啶(3.61g，18.7mmol，1.2當量)。30min後，tlc分析顯示反應完成(矽膠，75%乙酸乙酯/25%己烷(v/v)，R_f(6a)=0.2，R_f(7a)=0.7/0.8[兩種異構物])。將整個反應混合物施加於經1%三乙胺/64%乙酸乙酯/35%己烷預調節(直至洗提劑呈鹼性)之矽膠急驟管柱，接著用65%乙酸乙酯/35%己烷(經氬氣吹洗)洗提。在密封罐中於氬氣下保護含產物之洗提份隔絕空氣且濃縮，得到呈無色泡沫狀之(7a)，10.8g，76%產率。 ¹H NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=11.47(s,1H),9.11(bs,1H),8.57/8.54(s,1H),7.37(m,2H),7.24(m,12H),6.84(m,4H),6.10(m,1H),4.40(m,1H),4.21(m,3H),3.70(m,8H),3.55(m,2H),3.28(m,2H),2.75(t,J=5.9Hz,1H),2.64(t,J=5.9Hz,1H),2.55(m,1H),2.42(m,4H),1.11(m,9H),0.98(d,J=6.8Hz,3H)。³¹P NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=147.55/147.37(s,1P)。MS m/z：C₄₅H₅₆N₆O₉P之[M^-]計算值903.99；實驗值903.3(ESI^-)。

為製備2-氰基乙基亞磷醯胺試劑(CEP試劑)，藉由與含乙酸酐(無鹼)之四氫呋喃(THF)一起攪拌對5-N-苄基甲醯胺(4a-c)選擇性地進行N-保護，接著藉由與含4,4’-二甲氧基三苯甲基氯之吡啶反應進行5’-O-保護，得到(4,4’-二甲氧基三苯甲基)衍生物(6a-c)(參見例如Ross等人，2006)。藉由三氟乙酸吡啶鎓催化之3’-醇與2-氰基乙基-N,N,N’,N’-四異丙基亞磷醯胺縮合(參見例如Sanghvi等人，2000)且最後藉由用經脫氣之溶劑進行矽膠急驟層析純化(參見例如Still等人，1978)來完成高純度(>98.0%)CEP試劑(7a-c)之合成。

為製備5’-三磷酸酯試劑(TPP試劑；流程 2)，用含乙酸酐之吡啶對經5’-O-DMT保護之核苷(6a-c)進行全乙醯化，繼而用1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇使DMT及 4-N-乙醯基保護基裂解(參見例如Leonard及Neelima,1995)。藉由路德維希-埃克斯坦製程(Ludwig-Eckstein process)使所得結晶3’-O-乙酸酯核苷(8a-c)轉化成粗5’-O-三磷酸酯。此等經化學修飾之核苷酸一般需要兩階段純化製程：陰離子交換層析(AEX)，繼之以逆相製備型HPLC以獲得高純度(>90%)。

Ludwig,J.及Eckstein,F.(1989)Rapid and Efficient Synthesis of Nucleoside 5’-O-(1-Thiotriphosphates),5’-Triphosphates and 2’,3’-Cyclophosphorothioates Using 2-Chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphophorin-4-one.J.Org.Chem.,54,631-635，其特此以全文引用的方式併入。

羧醯胺化反應亦適合於製備核酸酶抗性核糖類似物(參見例如Ito等人，2003)(流程4)，例如，5-(N-苄基甲醯胺)-2’-O-甲基-胞苷(12)及5-(N-3-苯基丙基甲醯胺)-2’-去氧-2’-氟-胞苷(13)。

5-(N-苄基甲醯胺)-2’-O-甲基-胞苷(12)：如針對(4a)所述自5-碘-2’-O-甲基胞苷製備，但不同之處在於使產物自熱的2-丙醇(12mL/g)中結晶，得到呈氈狀白色固體狀之(12)，79%產率。¹H NMR(500MHz,d6-DMSO)： δ=8.57(t,J=5.9Hz,1H),8.57(s,1H),8.05(bs,1H),7.85(bs,1H),7.33(m,4H),7.25(m,1H),5.85(d,J=3.1Hz,1H),5.27(t,J=5.4Hz,1H),5.11(d,J=6.8Hz,1H),4.43(dd,J=15.4,10.4Hz,1H),4.40(dd,J=15.3,10.4Hz,1H),4.17(dd,J=6.7,5.2Hz,1H),3.87(dt,J=6.8,3.2Hz,1H),3.80(dd,J=5.0,3.2Hz,1H),3.77(m,1H),3.61(ddd,J=12.2,5.3,3.4Hz,1H),3.44(s,3H)。¹³C NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=165.43(1C),163.57(1C),153.49(1C),143.99(1C),139.16(1C),128.40(2C),127.22(2C),126.90(1C),98.97(1C),87.95(1C),84.28(1C),83.05(1C),67.67(1C),59.92(1C),57.70(1C),42.40(1C)。MS m/z：C₁₈H₂₁N₄O₆之[M^-]計算值389.39；實驗值389.1(ESI^-)。

5-(N-3-苯基丙基)-2’-去氧-2’-氟-胞苷(13)：如針對(4c)所述自5-碘-2’-去氧-2’-氟-胞苷製備，呈氈狀白色固體狀(53%產率)。¹H NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=8.52(s,1H),8.07(bs,1H),7.95(t,J=5.4Hz,1H),7.85(bs,1H),7.22(t,J=7.4,5H),5.91(d,J=17.6Hz,1H),5.58(d,J=6.6Hz,1H),5.32(t,J=5.3Hz,1H),4.99(dd,J=53.2,3.9Hz,1H),4.27(m,1H),3.92(d,J=8.3Hz,1H),3.86(m,1H),3.58(ddd,J=12.5,5.4,2.9Hz,1H),3.19(dd,J=12.7,5.3Hz,2H),2.61(t,J=7.5Hz,2H),1.78(m,J=7.3Hz,2H)。¹³C NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=165.22(s,1C),163.74(s,1C),153.34(s,1C), 143.82(s,1C),141.73(s,1C),128.42(s,2C),128.35(s,2C),125.81(s,1C),99.26(1C),94.02(d,J=736.6Hz,1C),88.65(d,J=134.7Hz,1C),83.07(s,1C),67.00(d,J=65Hz,1C),59.24(s,1C),38.65(s,1C),32.64(s,1C),30.73(s,1C)。¹⁹F NMR(400MHz,d6-DMSO)：δ=-200.82(ddd,J=19.0,6.2,56.6Hz,1F)。MS m/z：C₁₉H₂₂N₄O₅之[M^-]計算值405.41；實驗值405.1(ESI^-)。

路德維希-埃克斯坦製程用於使經3’-O-乙醯基保護之中間物(8a-c)轉化成粗5’-O-三磷酸酯(9a-c)。替代性兩階段製備型HPLC純化用於此等經化學修飾之核苷酸。

3’-O-乙醯基-5-(N-1-苄基甲醯胺)-2’-去氧胞苷(8a)。向經氬氣吹掃之50mL圓底燒瓶中饋入(6a)(900mg，1.35mmol)、無水吡啶(9mL)及乙酸酐(0.63mL，6.75mmol)。在室溫下18小時後，在真空中(1mm，30℃)蒸發溶劑，得到黃褐色泡沫狀物，將其溶解於1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(9mL)中且在50℃下於氬氣下加熱。6小時後，將反應混合物傾倒至甲醇(15mL)與甲苯(10mL)之快速攪拌混合物中。濃縮(1mm，30℃)所得橙色溶液，得到紅色油性殘餘物，其與乙酸乙酯(6mL)混合後得到結晶漿液。藉由添加己烷(1mL)進一步增強結晶。攪拌混合物隔夜且過濾，同時用50：50乙酸乙酯：己烷洗滌濾餅。在乾燥後分離產物(8a)，呈淺灰色固體狀(405mg)，75%產率：¹H NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=8.82(t,J=5.8Hz,1H),8.41(s,1H),8.09(bs,1H),7.81(bs,1H),7.33(m,4H),7.25(m,1H),6.17(dd,J=8.0,6.0Hz,1H),5.24(dt,J=6.2,1.8Hz,1H),5.13(t,J=5.6Hz,1H),4.43(dd,J=15.4,13.3Hz,1H),4.19(dd,J=15.3,13.2Hz,1H),4.06(dd,J=5.9,3.7Hz,1H),3.65(m,2H),2.45(m,1H),2.34(ddd,J=14.2,5.9,1.5Hz,1H),2.07(s,3H)。¹³C NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=170.05(1C),165.34(1C),163.54(1C),153.44(1C),143.94(1C),139.20(1C),128.34(2C),127.16(2C),126.85(1C),99.06(1C),85.96(1C),85.06(1C),74.63(1C),61.18(1C),42.28(1C),37.31(1C),20.85(1C)。MS m/z：C₁₉H₂₁N₄O₆之[M^-]計算值401.40；實驗值401.1[M]^-。

3’-O-乙醯基-5-(N-1-萘基甲基甲醯胺)-2’-去氧 胞苷(8b)。如針對(8a)所述自(6b)製備，呈淺灰色固體狀，54%產率：¹H NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=8.89(t,J=5.8Hz,1H),8.44(s,1H),8.14(d,J=8.4Hz,1H),8.11(bs,1H),7.96(dd,J=8.6,1.3Hz,1H),7.86(dd,J=6.6,2.8Hz,1H),7.84(bs,1H),7.57(m,2H),7.49(m,2H), 6.15(dd,J=8.2,6.0Hz,1H),5.23(dt,J=6.2,1.9Hz,1H),5.13(t,J=5.8Hz,1H),4.94(dd,J=15.5,5.8Hz,1H),4.86(dd,J=15.7,5.4Hz,1H),4.05(dt,J=8.1,1.8Hz,1H),3.62(m,2H),2.45(m,1H),2.33(ddd,J=12.6,6.1,1.8Hz,1H),2.06(s,3H)。¹³C NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=170.51(1C),165.78(1C),164.02(1C),153.90(1C),144.52(1C),134.57(1C),133.74(1C),131.27(1C),129.02(1C),128.03(1C),126.80(1C),126.31(1C),125.94(1C),125.54(1C),123.78(1C),99.52(1C),86.60(1C),85.55(1C),70.12(1C),61.67(1C),40.80(1C),37.75(1C),21.32(1C)。MS m/z：C₂₃H₂₃N₄O₆之[M^-]計算值451.46；實驗值451.1(ESI^-)。

3’-O-乙醯基-5-(N-3-苯基丙基甲醯胺)-2’-去氧 胞苷(8c)。如針對(8a)所述自(6c)製備，呈白色固體狀，74%產率：¹H NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=8.37(s,1H),8.26(t,J=5.3Hz,1H),8.06(bs,1H),7.79(bs,1H),7.23(m,5H),6.16(dd,J=7.9,6.1Hz,1H),5.24(dt,J=4.2,2.1Hz,1H),5.18(t,J=5.6Hz,1H),4.06(dd,J=5.7,3.6Hz,1H),3.65(m,2H),3.19(dd,J=12.8,6.2Hz,2H),2.62(t,J=7.5Hz,2H),2.43(m,1H),2.34(m,1H),2.06(s,3H),1.78(m,J=7.4Hz,2H)。¹³C NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=170.52(1C),165.68(1C),164.00(1C),153.94(1C),144.09(1C),142.13(1C),128.80(2C),127.75(2C),126.21(1C),99.80(1C),86.42(1C),85.06 (1C),75.07(1C),61.63(1C),39.12(1C),37.91(1C),33.04(1C),31.18(1C),21.31(1C)。MS m/z：C₂₁H₂₅N₄O₆之[M^-]計算值429.45；實驗值429.1(ESI^-)。

實例2：5-(N-1-萘基甲基)-2’-去氧胞苷-5-甲醯胺之合成

此實例提供製備5-(N-1-萘基甲基)-2’-去氧胞苷-5-甲醯胺(或NapdC；參見實例1中之流程1(4b))之方法。

5-(N-1-萘基甲基)-2’-去氧胞苷-5-甲醯胺(4b)：如針對(4a)所述，使用1-萘基甲胺(6當量)替代苄胺來製備，在室溫下反應時間為48小時。濃縮反應混合物之後，用二異丙基醚(約40mL/g)萃取殘餘物以去除大部分過量1-萘基甲胺。使殘餘物自熱甲醇(50mL/g)中結晶，同時熱過濾，得到呈白色固體狀之產物(4b；流程1；實例1)，40%產率。¹H NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=8.81(t,J=5.5Hz,1H),8.43(s,1H),8.14(d,J=4.4,1H),8.09 (bs,1H),7.96(m,1H),7.79(m,1H),7.75(bs,1H),7.53(m,4H),6.14(t,J=6.6Hz,1H),5.24(d,J=4.3Hz,1H),5.01(t,J=5.6Hz,1H),4.90(dd,J=15.6,13.4Hz,1H),4.89(dd,J=15.5,13.2Hz,1H),4.26(m,J=4.1Hz,1H),3.84(dd,J=8.4,4.4Hz,1H),3.58(m,2H),2.20(m,2H)。¹³C NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=165.45(1C),163.58(1C),153.57(1C),143.93(1C),136.07(1C),134.20(1C),133.32(1C),128.61(1C),127.59(1C),126.34(1C),125.89(1C),125.53(1C),125.07(1C),123.36(1C),98.82(1C),87.71(1C),85.99(1C),70.13(1C),61.16(1C),42.42(1C),40.14(1C)。MS m/z：C₂₁H₂₁N₄O₅之[M^-]計算值409.42；實驗值409.1(ESI^-)。

4-N-乙醯基-5-(N-1-萘基甲基甲醯胺)-2’-去氧胞苷(5b)：向100mL圓底燒瓶中饋入(4b)(1.17g，2.85mmol)及無水四氫呋喃(26mL)且攪拌以形成灰白色漿液。將乙酸酐(1.4mL，14.3mmol，5當量)逐滴添加至混合物中，同時在室溫下攪拌。攪拌反應混合物，且加熱至50℃維持21小時。抽吸等分試樣用於TLC分析(矽膠，洗提劑：10%甲醇/90%二氯甲烷(v/v)，R_f(4b)=0.61，R_f(5b)=0.12)，其指示反應完成。將反應燒瓶轉移至冰浴中且攪拌>1小時。接著過濾混合物，且用經冷卻之異丙基醚沖洗濾餅。收集所得固體且在真空中進一步蒸發，得到細緻灰白色晶體(1.01g，78.2%產率)。¹H NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=11.35(s,1H),9.07(t,J=4.6Hz,1H),8.74(s, 1H),8.15(d,J=8.7Hz,1H),7.96(m,1H),7.87(m,1H),7.53(m,4H),6.11(t,J=6.2Hz,1H),5.29(d,J=4.2Hz,1H),5.08(t,J=5.4Hz,1H),4.92(dd,J=15.5,10.1Hz,1H),4.91(dd,J=15.7,9.7Hz,1H),4.28(dt,J=9.4,3.8Hz,1H),3.92(dd,J=7.6,3.9Hz,1H),3.64(m,1H),3.58(m,1H),2.42(s,3H),2.35(m,1H),2.22(m,1H)。¹³C NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=171.27(1C),165.53(1C),159.77(1C),153.20(1C),146.30(1C),136.48(1C),134.17(1C),133.74(1C),131.26(1C),129.02(1C),128.12(1C),126.83(1C),126.33(1C),125.95(1C),123.80(1C),100.38(1C),88.74(1C),87.63(1C),70.25(1C),61.29(1C),41.13(1C),40.92(1C),26.71(1C)。MS m/z：C₂₃H₂₃N₄O₆之[M^-]計算值451.46；實驗值451.1(ESI^-)。

5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-4-N-乙醯基-5- (N-1-萘基甲基甲醯胺)-2’-去氧胞苷(6b)：如針對6b)所述製備，呈無色固體狀，59%產率。¹H NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=11.40(s,1H),9.35(bt,1H),8.48(s,1H),8.02(m,1H),7.96(m,1H),7.86(d,J=8.4Hz,1H),7.54(m,2H),7.40(m,2H),7.35(m,1H),7.25(m,8H),6.85(d,J=8.9Hz,4H),6.09(t,J=6.1Hz,1H),5.32(d,J=3.7Hz,1H),4.72(dd,J=14.9,4.8Hz,1H),4.60(dd,J=15.1,3.4Hz,1H),4.16(dt,J=10.9,4.7Hz,1H),4.04(m,1H),3.70(s,6H),3.29(dd,J=10.5,6.4Hz,1H),3.18(dd,J= 10.4,7.0Hz,1H),2.43(s,3H),2.38(m,1H),2.26(m,1H)。¹³C NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=171.25(1C),165.37(1C),159.88(1C),158.52(1C),158.54(1C),153.03(1C),146.32(1C),145.31(1C),136.05(1C),135.97(1C),133.92(1C),133.74(1C),131.22(1C),130.20(2C),130.11(2C),129.05(1C),128.30(2C),128.15(2C),127.16(1C),126.81(1C),126.33(1C),125.85(1C),125.80(1C),123.65(1C),113.61(4C),100.49(1C),88.12(1C),86.79(1C),86.17(1C),70.59(1C),64.40(1C),55.41(2C),41.01(1C),40.70(1C),40.82(1C),26.76(1C)。MS m/z：C₄₄H₄₁N₄O₈之[M^-]計算值753.83；實驗值753.21(ESI^-)。

5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-4-N-乙醯基-5- (N-1-萘基甲基甲醯胺)-2’-去氧胞苷-3’-O-(N,N-二異丙基-O-2-氰基乙基亞磷醯胺)(7b)：如針對(7a)所述製備，呈白色泡沫狀(88%產率)。¹H NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=11.41(s,1H),9.13(bs,1H),8.56/8.54(s,1H),8.01(m,1H),7.95(m,1H),7.85(m,1H),7.53(m,2H),7.37(m,2H),7.24(m,9H),6.83(m,4H),6.06(m,1H),4.66(m,2H),4.39(m,1H),4.16(m,1H),3.68(m,8H),3.52(m,2H),3.28(m,1H),3.20(m,1H),2.74(t,J=5.8Hz,1H),2.63(t,J=5.9Hz,1H),2.45(m,5H),1.09(m,9H),0.96(d,J=6.8Hz,3H)。³¹P NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=146.93/146.69(s,1P)。MS m/z：C₅₃H₅₈N₆O₉P之[M^-]計算值954.05；實驗值953.3(ESI^-)。

實例3：5-(N-3-苯基丙基甲醯胺)-2’-去氧胞苷之合成

此實例提供製備5-(N-3-苯基丙基甲醯胺)-2’-去氧胞苷(或PPdC；參見實例1中之流程1(4c))之方法。

5-(N-3-苯基丙基甲醯胺)-2’-去氧胞苷(4c)：如針對(4a)(40nmol規模)所述，使用3-苯基丙胺(6當量)替代苄胺且使用在室溫下48小時之反應時間來製備。在旋轉蒸發器上去除溶劑之後，用***(約30mL/g)濕磨殘餘物以萃取過量3-苯基丙胺，且將膠狀殘餘物溶解於熱乙醇中，在室溫下攪拌18小時，繼而在0℃下攪拌1小時。過濾所得混合物且蒸發母液，得到棕色樹脂。將此物溶解於二氯甲烷與水之溫熱混合物中。在室溫下靜置且攪拌之後，在有機層中以及水層中形成白色羽狀晶體。過濾三相混合物，且用***洗滌濾餅，得到呈鬆散白色固體狀之(4c)(10.78g，69.5%產率)。¹H NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=8.39(s,1H),8.13(t,J=5.3Hz,1H),8.05 (bs,1H),7.71(bs,1H),7.28(t,J=7.4,2H),7.22(d,J=7.0,2H),7.17(t,J=7.4,1H),6.13(t,J=6.4Hz,1H),5.22(d,J=4.3Hz,1H),5.07(t,J=5.5Hz,1H),4.26(dt,J=9.4,4.1Hz,1H),3.83(dd,J=7.8,3.9Hz,1H),3.66(m,1H),3.58(m,1H),3.19(dd,J=12.9,6.7Hz,2H),2.61(t,J=7.5Hz,2H),2.19(m,2H),1.78(m,J=7.4Hz,2H)。¹³C NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=165.34(1C),163.56(1C),153.60(1C),143.53(1C),141.70(1C),128.38(2C),128.33(2C),125.78(1C),98.99(1C),87.63(1C),85.86(1C),69.82(1C),60.96(1C),40.36(1C),38.58(1C),32.63(1C),32.63(1C)。MS m/z：C₁₉H₂₃N₄O₅之[M^-]計算值387.42；實驗值387.1(ESI^-)。

4-N-乙醯基-5-(N-3-苯基丙基)甲醯胺-2’-去氧 胞苷(5c)：攪拌(4c)(10.8g，28mmol)於無水THF(100mL)中之溶液，且用乙酸酐(3當量)逐滴處理。在室溫下攪拌溶液18小時，得到細懸浮液。藉由逐滴添加二異丙基醚(35mL)來緩慢稀釋混合物。藉由過濾分離固體且在真空中乾燥，得到呈白色固體狀之(5c)(8.44g，70.5%產率)。¹H NMR(400MHz,d6-DMSO)：δ=11.34(s,1H),8.69(s,1H),8.41(t,J=5.2Hz,1H),7.23(m,5H),6.09(t,J=6.0Hz,1H),5.15(bs,2H),4.27(m,1H),3.90(dd,J=9.6,3.8Hz,1H),3.68(m,1H),3.59(m,1H),3.21(dd,J=12.3,7.0Hz 2H),2.62(m,2H),2.40(s,3H),2.33(m,1H),2.21(m,1H),1.79(m,2H)。¹³C NMR(400MHz,d6- DMSO)：δ=171.21(1C),165.34(1C),159.73(1C),153.21(1C),146.01(1C),142.08(1C),128.80(2C),128.75(2C),126.22(1C),99.14(1C),88.61(1C),87.41(1C),69.88(1C),61.05(1C),41.04(1C),39.22(1C),33.01(1C),30.97(1C),26.67(1C)。MS m/z：C₂₁H₂₅N₄O₆之[M^-]計算值429.45；實驗值429.1(ESI^-)。

5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-4-N-乙醯基-5- (N-3-苯基丙基)甲醯胺-2’-去氧胞苷(6c)：如針對實例1中之(6a)所述自(5c；流程1；實例1)製備，呈白色泡沫狀(64.6%產率)。¹H NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=11.38(s,1H),8.56(t,J=5.2Hz,1H),8.37(s,1H),7.35(d,J=7.4Hz,2H),7.21(m,12H),6.80(m,4H),6.11(t,J=6.0Hz,1H),5.32(d,J=4.8Hz,1H),4.16(dt,J=10.8,4.7Hz,1H),4.04(m,1H),3.70(d,J=2.2Hz,6H),3.26(dd,J=10.6,6.1Hz,1H),3.21(dd,J=10.5,3.3Hz,1H),3.03(m,1H),2.95(m,1H),2.49(s,2H),2.43(s,3H),2.39(m,1H),2.23(m,1H),1.57(m,2H)。¹³C NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=170.77(1C),164.81(1C),159.41(1C),158.07(1C),158.06(1C),152.69(1C),145.18(1C),144.81(1C),141.53(1C),135.51(1C),135.50(1C),129.70(2C),129.61(2C),128.32(2C),128.29(2C),127.81(2C),127.66(2C),126.66(1C),125.79(1C),113.13(4C),100.37(1C),87.47(1C),86.40(1C),85.72(1C),70.03(1C),59.80(1C),54.99(1C),54.97(1C),40.48(1C),38.92(1C),32.64(1C)32.29 (1C),26.27(1C)。MS m/z：C₄₂H₄₃N₄O₈之[M^-]計算值731.83；實驗值731.2(ESI^-)。

5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-4-N-乙醯基-5- (N-3-苯基丙基甲醯胺)-2’-去氧胞苷-3’-O-(N,N-二異丙基-O-2-氰基乙基亞磷醯胺)(7c)：如針對實例1中之(7a)所述自(6c；流程1；實例1)製備。在氬氣氛圍下向含有6c(7.11g，9.70mmol)之500mL圓底燒瓶中饋入無水二氯甲烷(97mL)。將無水N,N-二異丙基乙胺(3.4mL，19.4mmol)添加至燒瓶中，且在攪拌下冷卻混合物至0℃。在半小時時間內，將2-氰基乙基二異丙基氯亞磷醯胺(2.6mL，11.6mmol)逐滴添加至快速攪拌混合物中。在攪拌下使混合物緩慢升溫至室溫。17小時後，將反應物取樣用於TLC，其顯示反應完成(矽膠；洗提劑75%乙酸乙酯/25%己烷(v/v)，R_f(6c)=0.10，R_f(7b)=0.46/0.56[兩種異構物])。使用甲苯將反應混合物轉移至250mL分液漏斗中，且藉由用冷的經氬氣吹洗之2%碳酸氫鈉溶液洗滌(2x，400mL/洗滌)來淬滅。收集有機層且蒸發直至大部分二氯甲烷已去除。使用經冷卻、經氬氣吹洗之甲苯使有機層返回至分液漏斗中，且用經冷卻、經氬氣吹洗之去離子水洗滌(2x，400mL/洗滌)。接著用經冷卻、經氬氣吹洗之乙酸乙酯稀釋有機層，且用鹽水(1x，400mL)洗滌。收集有機層，經硫酸鈉乾燥，過濾且蒸發。用二氯甲烷溶解經處理之反應混合物，且將其裝載至經預調節之管柱(如針對(6b)製備)上且用經冷卻、經氬氣吹洗之流動相(80%乙酸乙酯/20%己烷)洗提，且在經密封、經氬氣吹掃之瓶中收集含產物之洗提份以限制產物接觸空氣。在<40℃下蒸發含產物之洗提份，得到白色泡沫狀物(6.16g，68.0%產率)。¹H NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=11.40(s,1H),8.56(m,1H),8.47/8.43(s,1H),7.35(m,2H),7.20(m,12H),6.80(m,4H),6.08(m,1H),4.40(m,1H),4.18(m,1H),3.70(m,8H),3.53(m,2H),3.30(m,2H),3.00(m,2H),2.75(t,J=5.9Hz,1H),2.63(t,J=5.9Hz,1H),2.56(m,1H),2.50(m,2H),2.40(m,4H),1.59(m,2H),1.11(m,9H),0.97(d,J=6.8Hz,3H)。³¹P NMR(500MHz,d6-DMSO)：δ=147.60/147.43(s,1P)MS m/z：C₅₁H₆₀N₆O₉P之[M^-]計算值932.05；實驗值931.4(ESI)

實例4：藉由兩階段製備型HPLC純化三磷酸核苷

此實例提供純化三磷酸核苷之方法。

經由兩種正交製備型HPLC技術來純化粗三磷酸酯(9a-c)：陰離子交換層析以分離三磷酸核苷與其他核苷副產物(諸如二磷酸酯及單磷酸酯)，及逆相層析以去除反應試劑之殘餘副產物。

以每次0.5mmol反應物之兩次注射，使用裝填有Source 15Q樹脂之HPLC管柱，以兩種碳酸氫三乙基銨緩衝液之線性洗提梯度洗提來進行陰離子交換層析(表1)。所需三磷酸酯通常為最後自管柱洗提之物質，在HPLC層析圖上呈具有10-12分鐘寬度之寬峰。分析洗提份，且將含產物之洗提份合併且在Genevac VC 3000D蒸發器中蒸發以產生無色至淡黃褐色樹脂。將此物於去離子水中重構且以單次注射而施加用於在Novapak HRC18製備型管柱上以含乙腈之乙酸三乙基銨緩衝液之線性梯度洗提來進行逆相純化(表2)。將含有純三磷酸酯之洗提份合併且蒸發以產生無色至淡黃褐色樹脂。

將最終純三磷酸酯(9a-c)於去離子水中重構以供分析且在240nm下使用Hewlett Packard 8452A二極體陣列分光光度計定量(表3)。

5-(N-1-苄基甲醯胺)-2’-去氧胞苷-5’-O-三磷酸酯(9a)。¹H NMR(300MHz,D₂O)：δ=8.45(s,1H),7.25(m,5H),6.14(t,J=6.9Hz,1H),4.57(m,J=2.9Hz,1H),4.43(dd,J=20.2,15.4Hz,2H),4.17(m,3H),2.39(m,1H),2.27(m,1H)。13C NMR ³¹P NMR(300MHz,D₂O)：δ=-9.96(d,J=50.0Hz,1P),-11.43(d,J=50.8Hz,1P),-23.24(t,J=50.5Hz,1P)MS m/z：C₁₇H₂₁N₄O₁₄P₃之[M^-]計算值599.04；實驗值599.1[M]^-。

5-(N-1-萘基甲基甲醯胺)-2’-去氧胞苷-5’-O-三 磷酸酯(9b)：¹H NMR(500MHz,D₂O)：δ=8.12(s,1H),7.98(d,J=8.5Hz,1H),7.69(d,J=8.1Hz,1H),7.58(m,1H),7.40(m,1H),7.33(m,1H),7.24(m,1H),5.87(t,J=6.7Hz,1H),4.66(d,J=8.1Hz,2H),4.40(m,J=3.0Hz,1H),4.04(m,3H),2.21(ddd,J=14.1,6.0,3.4Hz,1H),2.06(m,1H)。¹³C NMR(500MHz,D₂O)：δ=165.95(s,1C),163.15(s,1C),155.22(s,1C),143.33(s,1C),133.35(s,1C),133.17(s,2C),130.55(s,2C),128.66(s,1C),127.84(s,1C),126.65(s,1C),126.13(s,1C),125.64(s,1C),125.12(s,1C),123.11(s,1C),100.55(s,1C),86.88(s,1C),85.87(d,J=55.95Hz,1C),70.76(s,1C),65.38(d,J=36Hz,1C),41.19(s,1C),39.61(m,1C)。³¹P NMR(500MHz,D₂O)：δ=-10.99(d,J=82.4Hz,1P),-11.61(d,J=84.9Hz,1P),-23.47(t,J=83.5Hz,1P)。MS m/z：C₂₁H₂₄N₄O₁₄P₃之[M^-]計算值649.36；實驗值649.0(ESI^-)。

5-(N-3-苯基丙基甲醯胺)-2’-去氧胞苷-5’-O-三 磷酸酯(9c)。¹H NMR(500MHz,D₂O)：δ=8.07(s,1H),7.11(m,4H),6.98(m,1H),6.00(t,J=6.5Hz,1H),4.44(m,J=3.0Hz,1H),4.06(m,3H),3.21(m,1H),3.13(m,1H),2.50(t,J=7.5Hz,2H),3.13(ddd,J=14.1,10.9,3.1Hz,1H),2.13(m,1H),1.76(m,2H)。¹³C NMR(500MHz,D₂O)：δ=165.85(s,1C),163.50(s,1C),155.73(s,1C), 142.94(s,1C),142.40(s,1C),128.55(s,2C),128.40(s,2C),125.72(s,1C),101.15(s,1C),86.93(s,1C),85.96(d,J=55.2Hz,1C),70.90(s,1C),65.38(d,J=37.6Hz,1C),39.88(s,1C),39.55(s,1C),32.74(s,1C),26.68(s,1C)。³¹P NMR(500MHz,D₂O)：δ=-11.00(d,J=82.7Hz,1P),-11.09(d,J=85.7Hz,1P),-23.53(t,J=84.3Hz,1P)。MS m/z：C₁₉H₂₅N₄O₁₄P₃之[M^-]計算值627.35；實驗值627.0(ESI^-)。

實例5：固相寡核苷酸合成

ABI 3900自動化DNA合成器(Applied Biosystems,Foster City,CA)與習知亞磷醯胺方法聯用，針對經修飾之亞磷醯胺(7a-c)對偶合條件作出微小改變(表4)。試劑(7a)以於二氯甲烷/乙腈(1/1)中之0.1M溶液形式使用，且試劑(7b)及(7c)以於乙腈中之0.1M溶液形式使用。固體支撐物為裝填有經1000Å孔徑之3’-DMT-dT丁二酸酯裝載之可控孔度玻璃(CPG；Prime Synthesis,Aston,PA)的ABI型燒結管柱。藉由用含20%二乙胺之乙腈處理，繼而在35℃下進行氣態甲胺裂解及脫保護2小時來實現脫保護。在具有Agilent 6130B單相四極質譜偵測器之Agilent 1290 Infinity上，使用Acquity OST C18管柱1.7μm 2.1×100mm(Waters Corp.,Milford,MA)，在11分鐘內使用0至25% B之梯度(緩衝液A：100mM 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇，8.6mM三乙胺，pH 8.25；緩衝液B：含10%緩衝液A 之90%乙腈)來確定產物之身份及全長百分比(%FL)。

關鍵字：ACN 乙腈

Deblock 含10%二氯乙酸之甲苯

活化劑含0.3M 5-苄基巰基四唑及0.5% N-甲基咪唑之ACN

氧化劑含0.025M碘之44.9% ACN/45%吡啶/10.1%水

帽A 含乙酸酐之吡啶及四氫呋喃

帽B 含1-甲基咪唑之四氫呋喃

Ar 乾燥氬氣沖洗20秒

引子延伸分析法：在引子延伸分析法中使用含有所有可能三核苷酸組合之標準模板來評估作為KOD核酸外切酶缺失DNA聚合酶之受質的經修飾之三磷酸核苷。模板序列為： (SEQ ID NO：1)。

引子序列為：5'-atatatatgccacaccctgccctc-3'((AT)4-5P27,IDT Technologies)(SEQ ID NO：2)。

簡言之，在37℃下用10皮莫耳³²P-ATP與含3’磷酸酶缺失T4聚核苷酸激酶(New England Biolabs)之7mM Tris-HCl(pH 7.6，在25℃下)、10mM MgCl₂、5mM二硫蘇糖醇標記10皮莫耳引子30min，且藉由通過兩個Sephadex G-50柱(GE Healthcare)來純化。30μL引子延伸反應含有120mM Tris-HCl(pH 7.8)、10mM KCl、7mM MgSO₄、6mM(NH₄)₂SO₄、0.001% BSA、0.1% Triton X-100、3皮莫耳模板、6皮莫耳引子及7.5單位KOD核酸外切酶缺失DNA聚合酶(EMD Novagen)。在MJ熱循環儀(Bio-Rad)中於96孔板中將反應物在96℃下培育30秒且在65℃下培育1小時。

在8%丙烯醯胺、7M脲、1×TBE凝膠(Life Technologies)上分析5μL樣品，且在成像板上暴露1小時，隨後在FujiFilm FLA3000磷光成像儀(GE Healthcare)中掃描。

實例6：具有經胞苷-5-甲醯胺修飾之核苷酸之核酸分子之合成

此實例提供製備具有經胞苷-5-甲醯胺修飾之核苷酸之核酸分子的方法。

測試CEP(亞磷醯胺)試劑(7a-c；流程1，實例1)在自動化合成器上進行固相寡核苷酸合成之用途。對於各種新亞醯胺試劑，基於下文所示之模型序列，藉由在連續內部位置中***0、1、2、3、4或5個經胞苷-5-甲醯胺修飾之核苷酸來合成長度自34至39個核苷酸長度變化(或長度為34、35、36、37、38或39個核苷酸)之六個不同寡核苷酸。序列中之「X」指示序列內經胞苷-5-甲醯胺修飾之核苷酸之位置。

5'-GAGTGACCGTCTGCCTGX_0-5CAGACGACGAGCGGGA-3'(SEQ ID NO：3)

下表5概述使用0至5個經胞苷-5-甲醯胺修飾之核苷酸合成之寡核苷酸的產率百分比。

結果指示經修飾之胞苷亞磷醯胺(7a-c)之1至3個順序偶合之全長合成產率與未經修飾之DNA亞磷醯胺相當。對於經修飾之胞苷之4或5個順序偶合觀測到一些產率損失；然而，在所有情況下均獲得並確認大量全長產物。

實例7：由KOD DNA聚合酶併入經胞苷-5-甲醯胺修飾之核苷酸之三磷酸酯試劑(TPP試劑)

此實例顯示，經胞苷-5-甲醯胺修飾之核苷酸(流程2之9a、9b及9c)可用作KOD核酸外切酶缺失DNA 聚合酶之受質。

下圖1展示引子延伸分析法之結果。全部三種經修飾之三磷酸胞苷在此分析法中至少如天然、未經修飾之2’-去氧胞苷一般有效地併入。

總之，以5’-O-三磷酸酯與3’-O-CEP亞磷醯胺形式合成經胞苷-5-甲醯胺修飾之核苷酸之實際製程提供用於適體之試管內選擇及SELEX後最佳化之有價值的新試劑。

實例8：使用SELEX選擇經胞苷-5-甲醯胺修飾之核苷酸適體

此實例顯示可使用SELEX來選擇用於結合至蛋白質標靶之經胞苷-5-甲醯胺修飾之核苷酸適體。此外，此實例顯示來源於針對特定蛋白質標靶之SELEX的經胞苷-5-甲醯胺修飾之核苷酸適體與來源於針對相同蛋白質標靶之SELEX的經尿苷-5-甲醯胺修飾之核苷酸適體之比較。

四種不同蛋白質用作SELEX之標靶：PCSK9、PSMA、ERBB2及ERBB3。

使用標準寡核苷酸合成方案，使用KOD DNA聚合酶酶促合成經修飾之隨機文庫。隨機文庫包括標記為「dC/dT」且不含C-5經修飾之核苷酸之對照文庫；NapdC文庫、NapdU(5-[N-(1-萘基甲基)甲醯胺]-2’-去氧尿苷)文庫、PPdC文庫及PPdU(5-[N-(苯基-3-丙基)甲醯胺]-2’-去氧尿苷)文庫。使用靶向每個文庫之至少5奈莫耳最終產物之此等相同條件酶促合成所有隨機文庫(自起始反義模板之產率為50-60%)。使用10kDa NMW截止超濾離心裝置濃縮粗文庫。使用SPIN-X微量離心管短暫離心經濃縮之產物以去除任何抗生蛋白鏈菌素(SA)瓊脂糖珠粒，且藉由量測260nm下之吸光度且使用經估算之吸光係數來定量。對各經修飾之有義文庫針對其不能轉移游離SA而污染經生物素標記之反義股以及標準PCR擴增條件來進行品質控制(資料未示出)。

具有C端聚His標籤且在人類293(HEK293) 細胞中產生之重組人類PCSK9蛋白質Gln31-Gln692(75.1kDa)獲自ACRO Biosystems(目錄號PC9-H5223)。使此蛋白質糖基化且在SDS-PAGE凝膠上以DTT還原蛋白質操作自動蛋白水解***成20KDa(原結構域)及62kDa(成熟分泌蛋白)多肽。

重組人類PSMA(約110kDa)獲自R&D Systems(目錄號4234-ZN-010)，其為具有N端6XHis標籤之源自CHO之Lys44-Ala750。

具有C端聚His標籤且在人類293(HEK293) 細胞中產生之重組人類ErbB2蛋白Thr23-Thr652(72.4kDa)獲自ACRO Biosystems(目錄號HE2-H5225)。作為糖基化之結果，DTT還原蛋白質在針對此標靶之SDS-PAGE上於90-110kDa範圍內遷移。

具有C端6XHis標籤且在人類293(HEK293) 細胞中產生之重組人類ErbB3蛋白Ser20-Thr643(71.5kDa)獲自ACRO Biosystems(目錄號ER3-H5223)。作為糖基化之結果，DTT還原蛋白質在針對此標靶之SDS-PAGE上於100-110kDa範圍內遷移。

使用磁性Dynabeads® His-Tag捕獲珠粒Life technologies(目錄號10104D)檢查SELEX中所用之所有標靶的純度及分段捕獲效率。使用His標籤捕獲珠粒有效地捕獲所有標靶。

所有選擇步驟遵循SELEX方案(5mM DxSO4，動力學激發起始第2輪)。對於第一輪，各SELEX實驗使用1000皮莫耳(約10¹⁵個序列)隨機文庫。標靶為50皮莫耳濃度(捕獲於500μg His捕獲珠粒上)，且在37℃下使複合物平衡1小時，接著用1XSB18、0.05% TWEEN20洗滌數次。用20mM NaOH洗提所選序列，中和，且使用5’OH引子及3’生物素標記引子進行PCR擴增。將經擴增之雙股未經修飾之DNA捕獲於SA磁性珠粒上，洗滌，且洗提去除有義DNA，且使用經修飾之核苷酸進行引子延伸以再生經富集、經修飾之彙集物用於下一輪SELEX實驗。

完成總共六輪選擇。一般而言，樣品為1nM 蛋白質濃度，在+/-蛋白質選擇樣品之C_t差異並無改良，指示序列可能無進一步富集時，在第6輪停止SELEX，對於所有樣品製得經修飾之有義eDNA且彙集針對各別標靶之親和力。應注意，以與經修飾之文庫類似之方式加工未經修飾之對照DNA富集文庫，即使經PCR擴增及經洗提之有義DNA股可指定用於下一輪SELEX中。

eDNA經放射性標記，且對於所有經富集之彙集物進行過濾結合分析法且與相應起始隨機文庫相比較。隨機文庫不結合至該四種蛋白質。表6展示四種蛋白質標靶PCSK9、PSMA、ERBB2及ERBB3之親和力資料結果。

如表6中所示，經由SELEX針對結合至PSMA標靶蛋白質而富集之具有至少一個C-5經修飾之胞苷核苷酸之核酸適體彙集物的平均結合親和力(K _d)為0.86nM(NapdC)，與具有針對相同蛋白質之NapdU之核酸適體彙集物的7.8nM相比較；及6.32nM(PPdC)，與具有針對相同蛋白質之PPdU之核酸適體彙集物的6.79nM相比較。經由SELEX針對結合至ERBB3標靶蛋白質而富集之具有至少一個C-5經修飾之胞苷核苷酸之核酸適體彙集物的平均結合親和力(K _d)為0.25nM(NapdC)，與具有針對相同蛋白質之NapdU之核酸適體彙集物的0.38nM相比較。

針對結合至蛋白質PSCK9、PSMA、ERBB2 及ERBB3之核酸適體之SELEX彙集物的進一步分析顯示，使用具有至少一個C-5經修飾之胞苷核苷酸之核酸適體進行的SELEX與使用具有至少一個C-5經修飾之尿苷核苷酸之核酸適體進行的SELEX相比提供較大數目之多複本(多於兩(2)個複本)核酸序列。下表7概述使用NapdC、NapdU、PPdC及PPdU進行之SELEX之差異。

一般而言，表7顯示C-5經修飾之胞苷核苷酸提供在經由SELEX針對標靶蛋白質結合而富集之核酸適體序列之彙集物中具有兩個以上複本之較大數目之序列。因此，一般而言，在針對蛋白質標靶之SELEX中C-5經修飾之胞苷核苷酸提供多複本核酸序列之較大多樣性，由此提供較大數目之核酸適體以供選擇用於進一步表徵及開發作為蛋白質結合試劑及/或治療劑。C-5經修飾之胞苷核苷酸之此益處鑑於與開發用於特定目的之核酸適體相關的挑戰而更好地實現(例如用於分析法-拉下分析法、蛋白質純化、質譜分析之蛋白質結合子；試劑工具及/或治療劑-蛋白質促效劑或拮抗劑)。較大數目之多複本核酸適體提供較大數目之序列，其可進行篩選及進一步開發用於特定目的且降低該開發之失敗率。

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<120> 經胞苷-5-甲醯胺修飾之核苷酸組成物及其相關方法

<130> 0057.65PCT

<150> US 61/907,274

<151> 2013-11-21

<160> 3

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 131

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 1

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 2

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<220>

<221> misc_特徵

<222> (18)..(22)

<223> 經胞苷-5-甲醯胺修飾之核苷酸，此等核苷酸可能不存在。

<400> 3

Claims

一種化合物，其包含式I所示之結構：其中R獨立地為-(CH₂)_n-，其中n為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；R^X1獨立地選自由以下組成之群組：其中，^＊表示該R^X1基團與該-(CH₂)_n-基團之連接點；且其中，R^X4獨立地選自由以下組成之群組：支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；羥基；鹵素(F、Cl、Br、I)；腈(CN)；硼酸(BO₂H₂)；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR^X2)；一級醯胺(CONH₂)；二級醯胺(CONHR^X2)；三級醯胺(CONR^X2R^X3)；磺醯胺(SO₂NH₂)；N-烷基磺醯胺(SONHR^X2)；R^X2及R^X3在每次出現時獨立地選自由以下組成之群組：支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；苯基(C₆H₅)；經R^X4取代之苯基環(R^X4C₆H₄)，其中R^X4定義於上文；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR^X5)，其中R^X5為支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；及環烷基，其中R^X2=R^X3=(CH₂)_n；X獨立地選自由-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH₂CH₂OCH₃及-疊氮基組成之群組；R’獨立地選自由-H、-OAc、-OBz、-P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN)及-OSiMe₂tBu組成之群組；R”獨立地選自由氫、4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)及三磷酸酯(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)₂)或其鹽組成之群組；Z獨立地選自由-H、經取代或未經取代之C(1-4)烷基組成之群組；及其鹽；有以下例外：當n=4時，則R^X1不可為H；當n=3時，則R^X1不可為CH₃；當n=0時，則R^X1不可為-CH(CH₃)₂；且當n=2，且R^X1為且R^X4為羥基時，則R^X1不可為
如申請專利範圍第1項之化合物，其中n為1、2或3。
如申請專利範圍第1項之化合物，其中R^X1選自由以下組成之群組：其中，^＊表示該R^X1基團與該-(CH₂)_n-基團之連接點；且Z獨立地選自由-H、經取代或未經取代之C(1-4)烷基組成之群組。
如申請專利範圍第1項之化合物，其中R^X4獨立地選自由支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C6)、-OH、-F及羧酸(COOH)組成之群組。
如申請專利範圍第1項之化合物，其中X獨立地選自由-H、-OH、-OMe及-F組成之群組。
如申請專利範圍第1項之化合物，其中R’選自由-H、-OAc及-P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN)組成之群組。
如申請專利範圍第1項之化合物，R”為三磷酸酯(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)₂)。
一種化合物，其包含選自由式II(BndC)、III(PEdC)、IV(PPdC)、V(NapdC)、VI(2NapdC)、VII(NEdC)及VIII(2NEdC)組成之群組的結構：其中X獨立地選自由-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH₂CH₂OCH₃及-疊氮基組成之群組。
一種核酸分子，其包含如申請專利範圍第1項之化合物。
如申請專利範圍第9項之核酸分子，其中該核酸分子包含RNA、DNA或其組合。
如申請專利範圍第9項之核酸分子，其中該核酸分子之長度為15至100個核苷酸。
如申請專利範圍第9項之核酸分子，其中該核酸分子為適體。
如申請專利範圍第9項之核酸分子，其中該核酸分子之至少一個額外核苷酸包含選自由2’位糖修飾組成之群組的化學修飾：2’-胺基(2’-NH₂)、2’-氟(2’-F)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-乙基(2’-OEt)、2’-O-丙基(2’-OPr)及2’-O-CH₂CH₂OCH₃。
一種核酸分子，其包含有包含式IA所示之結構之化合物：其中R獨立地為-(CH₂)_n-，其中n為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；R^X1獨立地選自由以下組成之群組：其中，^＊表示該R^X1基團與該-(CH₂)_n-基團之連接點；且其中，R^X4獨立地選自由以下組成之群組：支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；羥基；鹵素(F、Cl、Br、I)；腈(CN)；硼酸(BO₂H₂)；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR^X2)；一級醯胺(CONH₂)；二級醯胺(CONHR^X2)；三級醯胺(CONR^X2R^X3)；磺醯胺(SO₂NH₂)；N-烷基磺醯胺(SONHR^X2)；R^X2及R^X3在每次出現時獨立地選自由以下組成之群組：支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；苯基(C₆H₅)；經R^X4 取代之苯基環(R^X4C₆H₄)，其中R^X4定義於上文；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR^X5)，其中R^X5為支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；及環烷基，其中R^X2=R^X3=(CH₂)_n；X獨立地選自由-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH₂CH₂OCH₃及-疊氮基組成之群組；Z獨立地選自由-H、經取代或未經取代之C(1-4)烷基組成之群組；及其鹽；有以下例外：當n=4時，則R^X1不可為H；當n=3時，則R^X1不可為CH₃；當n=0時，則R^X1不可為-CH(CH₃)₂；且當n=2，且R^X1為且R^X4為羥基時，則R^X1不可為
如申請專利範圍第14項之核酸分子，其中n為1、2或3。
如申請專利範圍第14項之核酸分子，其中R^X1選自由以下組成之群組：其中，^＊表示該R^X1基團與該-(CH₂)_n-基團之連接點；且Z獨立地選自由-H、經取代或未經取代之C(1-4)烷基組成之群組。
如申請專利範圍第14項之核酸分子，其中R^X4獨立地選自由支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C6)、-OH、-F及羧酸(COOH)組成之群組。
如申請專利範圍第14項之核酸分子，其中X獨立地選自由-H、-OH、-OMe及-F組成之群組。
如申請專利範圍第14項之核酸分子，其中該核酸分子包含DNA、RNA或其組合。
如申請專利範圍第14項之核酸分子，其中該核酸分子之長度為15至100個核苷酸。
如申請專利範圍第14項之核酸分子，其中該核酸分子為適體。
如申請專利範圍第14項之核酸分子，其中該核酸分子之至少一個額外核苷酸包含選自由2’位糖修飾組成之群組的化學修飾：2’-胺基(2’-NH₂)、2’-氟(2’-F)、2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-O-乙基(2’-OEt)、2’-O-丙基(2’-OPr)及2’-O-CH₂CH₂OCH₃。
如申請專利範圍第14項之核酸分子，其進一步包含選自由骨架修飾、3’帽、5’帽及其組合組成之群組的修飾。
如申請專利範圍第14項之核酸分子，其中化合物包含選自由式IIA、IIIA、IVA、VA、VIA、VIIA及VIIIA組成之群組的結構：其中X獨立地選自由-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH₂CH₂OCH₃及-疊氮基組成之群組。
一種製備具有式I之化合物的方法，其中R獨立地為-(CH₂)_n-，其中n為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；R^X1獨立地選自由以下組成之群組：其中，^＊表示該R^X1基團與該-(CH₂)_n-基團之連接點；且其中，R^X4獨立地選自由以下組成之群組：支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；羥基；鹵素(F、Cl、Br、I)；腈(CN)；硼酸(BO₂H₂)；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR^X2)；一級醯胺(CONH₂)；二級醯胺(CONHR^X2)；三級醯胺(CONR^X2R^X3)；磺醯胺(SO₂NH₂)；N-烷基磺醯胺(SONHR^X2)；R^X2及R^X3在每次出現時獨立地選自由以下組成之群組：支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；苯基(C₆H₅)；經R^X4取代之苯基環(R^X4C₆H₄)，其中R^X4定義於上文；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR^X5)，其中R^X5為支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；及環烷基，其中R^X2=R^X3=(CH₂)_n；X獨立地選自由-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH₂CH₂OCH₃及-疊氮基組成之群組；R’獨立地選自由-H、-OAc、-OBz、-P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN)及-OSiMe₂tBu組成之群組；R”獨立地選自由氫、4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)及三磷酸酯(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)₂)或其鹽組成之群組；Z獨立地選自由-H、經取代或未經取代之C(1-4)烷基組成之群組；該方法包括提供具有式IX之化合物其中，R^X6為碘基或溴基；R^X7及R^X8在每次出現時獨立地為氫或保護基；X獨立地選自由-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH₂CH₂OCH₃及-疊氮基組成之群組；及在R^X1-R-NH₂、一氧化碳及溶劑存在下藉由鈀(0)催化之反應轉化該具有式IX之化合物；及分離該具有式I之化合物。
如申請專利範圍第25項之方法，其中R^X6為碘基。
如申請專利範圍第25項之方法，其中R^X7及R^X8為氫。
如申請專利範圍第25項之方法，其中X選自由-H、-OMe及-F組成之群組。
如申請專利範圍第25項之方法，其中n為1、2或3。
如申請專利範圍第25項之方法，其中R^X1選自由以下組成之群組：其中，^＊表示該R^X1基團與該-(CH₂)_n-基團之連接點；且Z獨立地選自由-H、經取代或未經取代之C(1-4)烷基組成之群組。
如申請專利範圍第25項之方法，其中R^X4獨立地選自由支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C6)、-OH、-F及羧酸(COOH)組成之群組。
如申請專利範圍第25項之方法，其中R’選自由-H、-OAc及-P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN)組成之群組。
如申請專利範圍第25項之方法，R”為氫或三磷酸酯(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)₂)；或其鹽。
如申請專利範圍第25項之方法，其中該保護基選自由以下組成之群組：三苯基甲基、對甲氧苯基二苯基甲基、二對甲氧苯基二苯基甲基、對二甲氧基三苯甲基三苯甲基、甲醯基、第三丁氧羰基、苄氧羰基、2-氯苄氧羰基、4-氯苄氧羰基、2,4-二氯苄氧羰基、糠基羰基、第三戊氧羰基、金剛烷氧羰基、2-苯基丙基-(2)-氧羰基、2-(4-聯苯)丙基-(2)-氧羰基、2-硝基苯基硫基及二苯基膦基。
如申請專利範圍第25項之方法，其中該鈀(0)催化之反應係在介於0.1與2個大氣壓之間的一氧化碳壓力下進行。
如申請專利範圍第25項之方法，其中該溶劑選自由以下組成之群組：二甲基甲醯胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、四氫呋喃(THF)、乙酸乙酯、丙酮、乙腈(MeCN)、二甲亞碸(DMSO)及碳酸伸丙酯。
一種製備具有選自由式II、III、IV、V、VI、VII及VIII組成之群組之式之化合物的方法，其中X獨立地選自由-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH₂CH₂OCH₃及-疊氮基組成之群組；該方法包括提供具有式IX之化合物其中，R^X6為碘基或溴基；R^X7及R^X8在每次出現時獨立地為氫或保護基；X獨立地選自由-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH₂CH₂OCH₃及-疊氮基組成之群組；及在R^X1-R-NH₂、一氧化碳及溶劑存在下藉由鈀(0)催化之反應轉化該具有式IX之化合物；及分離該具有選自由式II、III、IV、V、VI、VII及VIII組成之群組之式之化合物。
如申請專利範圍第37項之方法，其中R^X6為碘基。
如申請專利範圍第37項之方法，其中R^X7及R^X8為氫。
如申請專利範圍第37項之方法，其中X選自由-H、-OMe及-F組成之群組。
如申請專利範圍第37項之方法，其中該保護基選自由以下組成之群組：三苯基甲基、對甲氧苯基二苯基甲基、二對甲氧苯基二苯基甲基、對二甲氧基三苯甲基三苯甲基、甲醯基、第三丁氧羰基、苄氧羰基、2-氯苄氧羰基、4-氯苄氧羰基、2,4-二氯苄氧羰基、糠基羰基、第三戊氧羰基、金剛烷氧羰基、2-苯基丙基-(2)-氧羰基、2-(4-聯苯)丙基-(2)-氧羰基、2-硝基苯基硫基及二苯基膦基。
如申請專利範圍第37項之方法，其中該溶劑選自由以下組成之群組：二甲基甲醯胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、四氫呋喃(THF)、乙酸乙酯、丙酮、乙腈(MeCN)、二甲亞碸(DMSO)及碳酸伸丙酯。
如申請專利範圍第37項之方法，其中該鈀(0)催化之反應係在介於0.1與2個大氣壓之間的一氧化碳壓力下進行。
一種製備包含具有式IA之化合物之核酸分子的方法，其中R獨立地為-(CH₂)_n-，其中n為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；R^X1獨立地選自由以下組成之群組：其中，^＊表示該R^X1基團與該-(CH₂)_n-基團之連接點；且其中，R^X4獨立地選自由以下組成之群組：支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；羥基；鹵素(F、Cl、Br、I)；腈(CN)；硼酸(BO₂H₂)；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR^X2)；一級醯胺(CONH₂)；二級醯胺(CONHR^X2)；三級醯胺(CONR^X2R^X3)；磺醯胺(SO₂NH₂)；N-烷基磺醯胺(SONHR^X2)；R^X2及R^X3在每次出現時獨立地選自由以下組成之群組：支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；苯基(C₆H₅)；經R^X4取代之苯基環(R^X4C₆H₄)，其中R^X4定義於上文；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR^X5)，其中R^X5為支鏈或直鏈低碳烷基(C1-C20)；及環烷基，其中R^X2=R^X3=(CH₂)_n；X獨立地選自由-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH₂CH₂OCH₃及-疊氮基組成之群組；Z獨立地選自由-H、經取代或未經取代之C(1-4)烷基組成之群組；及其鹽，該方法包括合成具有複數個核苷酸及至少一種具有式IA之化合物的核酸分子。
一種製備包含具有選自由式IIA、IIIA、IVA、VA、VIA、VIIA及VIIIA組成之群組之式之化合物之核酸分子的方法，其中X獨立地選自由-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH₂CH₂OCH₃及-疊氮基組成之群組；該方法包括合成具有複數個核苷酸及至少一種具有選自由式IIA、IIIA、IVA、VA、VIA、VIIA及VIIIA組成之群組之式之化合物的核酸分子。
一種選擇對靶分子具有結合親和力之核酸適體之方法，其包括：(a)使候選混合物與該標靶接觸，其中該候選混合物包含經修飾之核酸適體，其中該候選混合物之至少一個或各個核酸適體中之一個、若干個或所有嘧啶包含如申請專利範圍第1項至第8項中任一項之化合物，且其中對該靶分子具有結合親和力之核酸適體形成核酸適體-靶分子複合物；(b)自該候選混合物分割該等核酸適體-靶分子複合物；(c)解離該等核酸適體-靶分子複合物以產生游離核酸適體；(d)擴增該等游離核酸適體以得到相對於該候選混合物中之其他核酸具有增加之自該靶分子之解離半衰期的核酸適體；(e)鑑別其中一個、若干個或所有嘧啶包含如申請專利範圍第1項至第8項中任一項之化合物之至少一個核酸適體，其中該核酸適體對該靶分子具有結合親和力。
如申請專利範圍第46項之方法，其中使用富集有能夠結合至該靶分子且當結合至該靶分子時具有慢解離速率之核酸序列之核酸適體的混合物重複步驟a)至d)以進一步富集能夠結合至該靶分子且當結合至該靶分子時具有慢解離速率之核酸序列。
如申請專利範圍第46項之方法，其中該慢解離速率核酸適體之解離速率為約2分鐘至約360分鐘(或約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、45、60、75、90、105、120、150、180、210、240、270、300、330或360分鐘)。
如申請專利範圍第46項之方法，其中該慢解離速率核酸適體之解離速率大於或等於約2分鐘(或大於約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、45、60、75、90、105、120、150、180、210、240、270、300、330或360分鐘)。
如申請專利範圍第46項之方法，其中該靶分子為蛋白質或肽。
如申請專利範圍第46項之方法，其中該靶分子選自由PSCK9蛋白、PSMA蛋白、ERBB2蛋白及ERBB3蛋白組成之群組。
如申請專利範圍第46項之方法，其中該至少一個核酸適體能夠以小於100nM，或約0.1nM至約100nM(或0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100nM)之平衡結合常數(K _d)結合該靶分子。
如申請專利範圍第46項之方法，其進一步包括使該候選混合物暴露於慢解離速率富集製程。
如申請專利範圍第53項之方法，其中該慢解離速率富集製程係在步驟(b)之前進行。
如申請專利範圍第53項之方法，其中該慢解離速率富集製程選自由以下組成之群組：添加競爭分子、稀釋步驟、添加競爭分子繼之以稀釋步驟之組合、稀釋步驟繼之以添加競爭分子之組合，及同時進行之添加競爭分子與稀釋步驟之組合。
如申請專利範圍第55項之方法，其中該競爭分子為聚陰離子。
如申請專利範圍第55項之方法，其中該競爭分子選自由寡核苷酸、dNTP、肝素及硫酸葡聚糖組成之群組。