KR102290214B1

KR102290214B1 - 시티딘-5-카르복스아미드 변형된 뉴클레오티드 조성물 및 그와 관련된 방법들

Info

Publication number: KR102290214B1
Application number: KR1020167012432A
Authority: KR
Inventors: 존 롤로프; 네보쟈 야닉; 바라트 나투 가완디
Original assignee: 소마로직, 인크.
Priority date: 2013-11-21
Filing date: 2014-11-19
Publication date: 2021-08-18
Also published as: IL263380A; EP3330277A3; JP2021073211A; MX2020001158A; HK1223625A1; RU2016124202A; RU2732402C2; CA2928207C; IL269461B; US9938314B2; US20180201641A1; BR112016010165A2; AU2014353102A1; CA2928207A1; KR20160078989A; JP2016540755A; CN105658658B; HK1252242A1; TWI632155B; JP7008405B2

Abstract

본 발명은 5-위치 변형된 시토신 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 뿐만 아니라 이들의 포스포라미다이트 및 트리포스페이트 유도체들을 개시한다. 또한, 이들의 제조 및 사용 방법, 및 핵산 분자 (예, 앱타머)의 일부로서 변형된 뉴클레오시드의 조성물 및 용도가 개시된다.

Description

시티딘-5-카르복스아미드 변형된 뉴클레오티드 조성물 및 그와 관련된 방법들 {CYTIDINE-5-CARBOXAMIDE MODIFIED NUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND METHODS RELATED THERETO}

본 출원 발명은 2013년 11월 21일자로 출원된 미국 가출원 제61/907,274호의 우선권을 35 U.S.C. §119(e) 하에 주장하며, 이를 그의 전문으로서 참고로 본 명세서에 인용한다.

본 발명은 일반적으로 핵산 화학 분야에 관한 것이며, 상세하게는 5 -위치 변형된 시토신 뿐만 아니라 이들의 포스포라미다이트 및 트리포스페이트 유도체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들의 제조 및 사용 방법들에 관한 것이다. 본 발명은 올리고뉴클레오티드 또는 앱타머의 일부로서 변형된 뉴클레오시드의 용도를 포함한다.

2014년 10월 2일자로 2킬로바이트 크기로 생성된 "Sequences 0057.65PCT ST25"라는 표제의 서열 목록을 그의 전문으로서 본 명세서에 참고로 인용한다.

변형된 뉴클레오시드들은 치료제 및 진단제로서, 및 그들의 특성 (예, 안정성)을 개선하기 위해 올리고뉴클레오티드 내로 혼입하기 위해 사용되어 왔다.

SELEX (Systematic Evolution of Ligands for EXponential Enrichment)는 표적 분자들에 선택적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드 ("앱타머"라 지칭됨)를 식별하는 방법이다. SELEX 공정은 미국 특허 제5,270,163호에 개시되어 있고, 그의 내용은 전문으로서 참고로 본원에 인용된다. SELEX 방법은 결합 친화도 및 선택성의 임의의 바람직한 기준을 실질적으로 달성하기 위해 올리고뉴클레오티드의 랜덤 혼합물로부터 올리고뉴클레오티드의 선택 및 식별을 포함한다. SELEX 공정의 과정에서 식별된 올리고뉴클레오티드에 특정 유형의 변형된 뉴클레오시드를 도입함으로써, 뉴클레아제 안정성, 순수 전하, 친수성 또는 친유성은 올리고뉴클레오티드의 3차원 구조 및 표적 결합 능력에서 차이를 제공하기 위해 변경될 수 있다. 따라서, 상이한 변형된 뉴클레오시드들은 SELEX 과정에서 선택된 올리고뉴클레오티드의 바람직한 특성들을 "조율하는" 능력을 제공한다.

N-치환된-카르복스아미드 기를 5-위치에 함유하는 변형된 데옥시우리딘 뉴클레오티드들은 단백질-결합 앱타머의 생체 외 선택 (SELEX 공정)을 개선하기 위해서 (예, Gold 등, 2010; Hollenstein, 2012; 및 Imaizumi 등, 2013 참조) 및 선택된 앱타머들의 결합 및 약물동태학적 특성들의 후-SELEX 최적화를 위해서 (예, Davies, 등, 2012; Lee 등, 2010; Kerr 등, 2000; 및 Gaballah 등, 2002 참조) 귀중한 도구인 것으로 입증되어 왔다. 우리딘-5-카르복스아미드의 일반적인 합성은 일반적인 활성화된 에스테르 중간체인 5-(2,2,2-트리플루오로에톡시카르보닐)-2'-데옥시우리딘 (1)에 의존하고, 이는 원래 Matsuda와 동료들에 의해 보고되었다 (예 Nomura 등, 1997 참조). 다양한 1급 아민류에 의한 이러한 활성화된 에스테르의 처리 (1.2 당량, 60 ℃, 4 시간)는 상응하는 5-(N-치환된-카르복스아미드)를 제공한다. Matsuda는 또한 시티딘 시리즈인, N-아세틸-5-(2,2,2-트리플루오로에톡시카르보닐)-2'-데옥시시티딘 내의 유사한 활성화된 에스테르를 개시하였다 (예 Nomura 등, 1996 참조). 그러나, 이러한 중간체는 N-아세틸 보호기의 불안정도 및 N-아세틸-5-요오도-시티딘 합성 전구체들의 불안정성으로 인해 시티딘-5-카르복스아미드의 합성을 위해 실제로 덜 유용하다.

올리고뉴클레오티드 표적 결합제들을 개선하기 위한 대안적 조성물, 및 그러한 조성물들을 합성하기 위한 추가의 방법들에 대한 요구가 계속 있어왔다. 본 발명은 신규한 시티딘-5-카르복스아미드 변형된 조성물들을 제공함으로써 그러한 요구를 충족시킨다.

요약

본 발명은 5-위치 변형된 시토신 뿐만 아니라 그의 포스포라미다이트 및 트리포스페이트 유도체, 및 이들의 제조 및 사용 방법들을 개시한다.

일 측면에서, 본 발명은 화학식 I에 나타낸 구조를 포함하는 화합물 및 이의 염을 제공하고:

상기 식 중에서,

R은 독립적으로 -(CH₂)_n-이고 (여기서 n 은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10으로부터 선택되는 정수임);

R^x1은 독립적으로 하기로 구성된 군으로부터 선택되고:

상기 식 중에서,

*는 -(CH₂)_n- 기에 대한 R^X1 기의 부착 지점을 나타내고;

R^X4는 독립적으로 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1-C20); 히드록실기; 할로겐 (F, Cl, Br, I); 니트릴 (CN); 붕소산 (B0₂H₂); 카르복실산 (COOH); 카르복실산 에스테르 (COOR^X2); 1급 아미드 (CONH₂); 2급 아미드 (CONHR^X2); 3급 아미드 (CONR^X2R^X3); 술폰아미드 (SO₂NH₂); N-알킬술폰아미드 (SONHR^X2)로 구성된 군으로부터 선택되며;

R^X2　및 R^X3은 각각의 경우에 대해 독립적으로 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1-C20); 페닐 (C₆H₅); R^X4치환된 페닐 고리 (R^X4C₆H₄) (여기서 R^X4는 상기 정의됨); 카르복실산 (COOH); 카르복실산 에스테르 (COOR^X5) (여기서 R^X5는 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1-C20)임); 및 시클로알킬로 구성된 군으로부터 선택되고 (여기서 R^X2과 R^X3은　함께 치환된 또는 치환되지 않은 5 또는 6 원자 고리를 형성함);

X는 독립적으로 -H, -OH, -OMe, -O-알릴, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃　및 -NH₂및아지도로 구성된 군으로부터 선택되며;

R'는 독립적으로 -H, -Ac; -Bz; -P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN); 및 -SiMe₂tBu로 구성된 군으로부터 선택되고;

R"는 독립적으로 수소, 4,4'-디메톡시트리틸 (DMT) 및 트리포스페이트 (-P(0)(OH)-0-P(0)(OH)-0-P(0)(OH)₂) 또는 이들의 염으로 구성된 군으로부터 선택되며;

Z는 독립적으로 -H, 치환된 또는 미치환된 C(l-4)알킬로 구성된 군으로부터 선택되고;

단,

n = 4인 경우, R^X1은 H일 수 없고;

n = 3인 경우, R^X1은 CH₃일 수 없으며;

n = 0인 경우, R^X1은 -CH(CH₃)₂일 수 없고; 그리고

n = 2이고, R^X1이

이며, R^X4가 히드록실인 경우, R^X1은

일 수 없는 예외를 갖는다.

관련된 측면에서, n은 1, 2 또는 3으로부터 선택된 정수이다.

관련된 측면에서, R^x1은 하기로 구성된 군으로부터 선택되고:

상기 식 중에서,

*는 -(CH₂)_n- 기에 대한 R^x1 기의 부착 지점을 나타내고; 그리고

Z는 독립적으로 -H, 치환된 또는 미치환된 C(l-4)알킬로 구성된 군으로부터 선택된다.

관련된 측면에서, R^X4는 독립적으로 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1-C6); -OH; -F 및 카르복실산 (COOH)로 구성된 군으로부터 선택된다.

관련된 측면에서, X는 독립적으로 -H, -OH, -OMe 및 -F로 구성된 군으로부터 선택된다.

관련된 측면에서, R'는 -H, -Ac 및 -P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN)로 구성된 군으로부터 선택된다.

관련된 측면에서, R"는 트리포스페이트 (-P(0)(OH)-0-P(0)(OH)-0-P(0)(OH)₂)이다.

다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식들 II (BndC), III (PEdC), IV (PPdC), V (NapdC), VI (2NapdC), VII (NEdC) 및 VIII (2NEdC)로 구성된 군으로부터 선택되는 구조를 포함하는 화합물을 제공하고:

상기 식 중에서,

X는 독립적으로 -H, -OH, -OMe, -O-알릴, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃　및-NH₂및 아지도로 구성된 군으로부터 선택된다.

다른 측면에서, 본 발명은 상기 화합물들 중의 어느 하나를 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

관련된 측면에서, 상기 핵산 분자는 RNA, DNA 또는 이들의 조합물을 포함한다.

관련된 측면에서, 상기 핵산 분자는 15개 내지 100개 뉴클레오티드 길이를 갖는다.

관련된 측면에서, 상기 핵산 분자가 앱타머이다.

관련된 측면에서, 상기 핵산 분자의 적어도 하나의 추가의 뉴클레오티드는 2'-아미노 (2'-NH₂), 2'-플루오로 (2'-F), 2'-0-메틸 (2'-OMe), 2'-0-에틸 (2'-OEt), 2'-0-프로필 (2'-OPr) 및 2'-0-CH₂CH₂OCH₃ 및 아지도를 포함하는 2'-위치 당 변형으로 구성된 군으로부터 선택된 화학적 변형을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 IA로 나타낸 구조를 포함하는 화합물 및 이의 염을 포함하는 핵산 분자를 제공하고:

상기 식 중에서,

R은 독립적으로 -(CH₂)_n-이고 (여기서 n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10임);

R^x1은 독립적으로 하기로 구성된 군으로부터 선택되고:

상기 식 중에서,

*는 -(CH₂)_n- 기에 대한 R^X1 기의 부착 지점을 나타내고;

X는 독립적으로 -H, -OH, -OMe, -O-알릴, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH_3,NH₂　및 -아지도로 구성된 군으로부터 선택되며;

단,

n = 4인 경우, R^X1은 H일 수 없고;

n = 3인 경우, R^X1은 CH₃일 수 없으며;

n = 0인 경우, R^X1은 -CH(CH₃)₂일 수 없고; 그리고

n = 2이고, R^X1이

이며, R^X4가 히드록실인 경우, R^X1은

일 수 없는 예외를 갖는다.

관련된 측면에서, n은 1, 2 또는 3이다.

상기 식 중에서,

관련된 측면에서, R^X4는 독립적으로 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1-C6); -OH; -F 및 카르복실산 (COOH)으로 구성된 군으로부터 선택된다.

관련된 측면에서, 상기 핵산 분자는 DNA, RNA 또는 이들의 조합물을 포함한다.

관련된 측면에서, 상기 핵산 분자는 앱타머이다.

관련된 측면에서, 상기 핵산 분자의 적어도 하나 첨가된 뉴클레오티드는 2'-아미노 (2'-NH₂), 2'-플루오로 (2'-F), 2'-0-메틸 (2'-OMe), 2'-0-에틸 (2'-OEt), 2'-0-프로필 (2'-OPr) 및 2'-0-CH₂CH₂OCH₃ 및 아지도로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되는 2'-위치 당 변형으로 구성된 군으로부터 선택되는 화학적 변형을 포함한다.

관련된 측면에서, 핵산 분자는 골격 변형, 3' 캡, 5' 캡 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 변형을 추가로 포함한다.

관련된 측면에서, 화합물은 하기 화학식들 IIA, IIIA, IVA, VA, VIA, VIIA 및 VIIIA로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 포함하고:

상기 식 중에서,

X는 독립적으로 -H, -OH, -OMe, -O-알릴, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃, NH₂　및 -아지도로 구성된 군으로부터 선택된다.

다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 I을 갖는 화합물의 제조 방법을 제공한다:

상기 식 중에서,

R^x1은 독립적으로 하기로 구성된 군으로부터 선택되고:

상기 식 중에서,

*는 -(CH₂)_n- 기에 대한 R^X1 기의 부착 지점을 나타내고;

X는 독립적으로 -H, -OH, -OMe, -O-알릴, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃, NH₂　및 -아지도로 구성된 군으로부터 선택되며;

Z는 독립적으로 -H, 치환된 또는 미치환된 C(l-4)알킬로 구성된 군으로부터 선택되고,

상기 방법은 하기 화학식 IX을 갖는 화합물을 제공하는 단계;

(상기 식 중에서,

R^X6은 요오드 또는 브롬 기이고;

R^X7　및 R^X8은 각각의 경우에 대해 독립적으로 수소 또는 보호기이며;

X는 독립적으로 -H, -OH, -OMe, -O-알릴, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃,　NH₂및 -아지도로 구성된 군으로부터 선택됨);

화학식 IX를 갖는 화합물을 팔라듐(0) 촉매된 반응에 의해 R^X1-R-NH₂, 일산화탄소 및 용매의 존재 하에 변형시키는 단계; 및

화학식 I을 갖는 화합물을 단리시키는 단계를 포함한다.

관련된 측면에서, R^X6은 요오드 기이다.

관련된 측면에서, R^X7　및 R^X8은 수소이다.

관련된 측면에서, X는 -H, -OMe 및 -F로 구성된 군으로부터 선택된다.

관련된 측면에서, n은 1, 2 또는 3이다.

상기 식 중에서,

관련된 측면에서, R'는 -H, -Ac 및 -P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN)으로 구성된 군으로부터 선택된다.

관련된 측면에서, R"는 수소 또는 트리포스페이트 (-P(0)(OH)-0-P(0)(OH)-0-P(0)(OH)₂)이다.

관련된 측면에서, 상기 보호기는 트리페닐메틸, p-아니실디페닐메틸, 디-p-아니실디페닐메틸, p-디메톡시 트리틸트리틸, 포르밀, t-부틸옥시카르보닐, 벤질옥시카르보닐, 2-클로로벤질옥시카르보닐, 4-클로로벤조일옥시카르보닐, 2,4-디클로로벤질옥시카르보닐, 푸르푸릴카르보닐, t-아밀옥시카르보닐, 아다만틸옥시카르보닐, 2-페닐프로필-(2)-옥시카르보닐, 2-(4-비페닐)프로필-(2)-옥시카르보닐, 2-니트로페닐술페닐 및 디페닐포스피닐로 구성된 군으로부터 선택된다.

관련된 측면에서, 상기 용매는 디메틸포름아미드 (DMF), 디클로로메탄 (DCM), 테트라히드로푸란 (THF), 에틸 아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴 (MeCN), 디메틸 술폭사이드 (DMSO) 및 프로필렌 카보네이트로 구성된 군으로부터 선택된다.

다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식들 II, III, IV, V, VI, VII 및 VIII로 구성된 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는 화합물의 제조 방법을 제공하고:

상기 식 중에서,

X는 독립적으로 -H, -OH, -OMe, -O-알릴, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃, NH₂　및 -아지도로 구성된 군으로부터 선택되고,

(상기 식 중에서,

R^X6은 요오드 또는 브롬 기이고;

X는 독립적으로 -H, -OH, -OMe, -O-알릴, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃　및 -아지도로 구성된 군으로부터 선택됨);

화학식들 II, III 및 IV로 구성된 군으로부터 선택되는 화학식을 갖는 화합물을 단리시키는 단계를 포함한다.

관련된 측면에서, R^X6은 요오드 기이다.

관련된 측면에서, R^X7　및 R^X8은 수소이다.

본 발명은 (a) 후보 혼합물을 표적과 접촉시키는 단계 (여기서 상기 후보 혼합물은 상기 후보 혼합물의 적어도 하나의, 또는 각각의 핵산 앱타머 내의 하나의, 여러 개의 또는 모든 피리미딘들이 여기에서 기술된 화합물을 포함하고 (5-위치 변형된 시토신), 상기 표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 핵산 앱타머들이 핵산 앱타머-표적 분자 착물들을 형성하는 변형된 핵산 앱타머들을 포함함); (b) 상기 핵산 앱타머-표적 분자 착물들을 상기 후보 혼합물로부터 분할하는 단계; (c) 상기 핵산 앱타머-표적 분자 착물들을 해리시켜 유리 핵산 앱타머들을 생성하는 단계; (d) 상기 유리 핵산 앱타머들을 증폭시켜 상기 후보 혼합물 내의 다른 핵산들과 비교하여 상기 표적 분자로부터 증가된 해리 반감기를 갖는 핵산 앱타머들을 산출하는 단계; 및 (e) 적어도 하나의 핵산 앱타머를 식별하는 단계로서, 하나의 여러 개의 또는 모든 피리미딘들이 청구항들 1 내지 8 중의 어느 한 항의 화합물을 포함하고, 상기 핵산 앱타머가 상기 표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는, 상기 식별 단계를 포함하는 표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 핵산 앱타머를 선택하는 방법을 추가로 제공한다.

다른 측면에서, 단계 a) 내지 d)가 반복되고, 이때 핵산 앱타머의 혼합물은, 표적 분자에 결합될 수 있고 상기 표적 분자에 결합될 때 느린 오프-속도를 갖는 핵산 서열에 대해 추가로 농축(enriched)되기 위하여, 상기 표적 분자와 결합될 수 있고 상기 표적 분자와 결합 될 때 느린 오프-속도를 갖는 핵산 서열 내에서 농축(enriched)된다.

다른 측면에서, 상기 느린 오프-속도 핵산 앱타머의 해리 속도는 약 2 분 (또는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330 또는 360 분) 내지 약 360 분 이다.

다른 측면에서, 상기 느린 오프-속도 핵산 앱타머의 해리 속도는 약 2 분 이상 (또는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330 또는 360 분 이상)이다.

다른 측면에서, 상기 표적 분자는 단백질 또는 펩티드이다.

다른 측면에서, 상기 표적 분자는 PSCK9 단백질, PSMA 단백질, ERBB2 단백질 및 ERBB3 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다.

다른 측면에서, 상기 적어도 하나의 핵산 앱타머는 100 nM 미만, 또는 약 0.1 nM 내지 약 100 nM (또는 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100 nM으로부터)의 평형 결합 상수 (K_d)를 갖는 상기 표적 분자에 결합할 수 있다.

다른 측면에서, 본원에 기재된 방법은 상기 후보 혼합물을 느린 오프-속도 농축 공정에 노출시키는 단계를 추가로 포함한다.

다른 측면에서, 상기 느린 오프-속도 농축 공정은 단계 (b)에 앞서 수행된다. 관련된 측면에서, 상기 느린 오프-속도 농축 공정은 경쟁자 분자를 첨가하는 단계, 희석 단계, 희석 단계 이후 경쟁자 분자를 첨가하는 단계의 조합, 경쟁자 분자를 첨가하는 단계 이후 희석 단계의 조합, 및 경쟁자 분자를 동시에 첨가하는 단계와 희석 단계의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.

또 다른 관련된 측면에서, 상기 경쟁자 분자는 폴리음이온이다. 다른 측면에서, 상기 경쟁자 분자는 올리고뉴클레오티드, dNTPs, 헤파린 및 덱스트란 설페이트로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 상기 및 기타 목적, 특징 및 장점은 수반된 도면을 참조하여 진행되는 하기의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.

도 1은 실시예의 재료 및 방법 섹션에 기재된 바와 같이 DNTP's에 의한 프라이머 확장 분석의 폴리아크릴아미드 겔 이미지를 보여준다. 레인 1 : dAdGdT (5% 전체 길이); 레인 2: dAdGdTdC (100% 전체 길이); 레인 3: dAdGdT + 9a (119% 전체 길이); 레인 4: dAdGdT + 9b (113% 전체 길이); 레인 5: dAdGdT + 9c (120% 전체 길이); 레인 6: 20/200 DNA 사다리. 이 도면을 참조하여 모두 3개의 변형된 시티딘 트리포스페이트가 이 분석에서 천연 미변형된 2'-데옥시시티딘 만큼 적어도 효율적을 혼입된 것을 알 수 있었다.

달리 명시되지 않는 한, 기계적 용어들은 종래 용도에 따라 사용된다. 분자 생물학에서 통상의 용어의 정의는 Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew 등 (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)에서 발견될 수 있다.

달리 설명되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기계적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 단수형 용어 *는 -(CH₂)_n- 기에 대한 R^X1 기의 부착 지점을 나타내고; *는 -(CH₂)_n- 기에 대한 R^X1 기의 부착 지점을 나타내며; 단수 ("a" "one" 및 "the")는 문맥이 분명하게 달리 지시하지 않는 한 복수개의 참조물을 포함한다. "A 또는 B를 포함하는"은 A를 포함하거나, 또는 B를 포함하거나, 또는 A 및 B를 포함하는 것을 의미한다. 핵산 또는 폴리펩티드에 대해 주어진 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값들은 대략적이고 설명을 위해 제공됨이 추가로 이해되어야 한다.

또한, 본원에 제공된 범위는 그 범위 내의 모든 값들에 대한 약칭인 것으로 이해된다. 예를 들면, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 (뿐만 아니라 문맥이 분명히 달리 지시하지 않는 한 그의 분획들)로 구성된 군으로부터 임의의 수, 수들의 조합, 또는 부분 범위를 포함하는 것으로 이해된다. 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는 달리 지시되지 않는 한 인용된 범위 내의 임의의 정수 값 및 적절한 경우 그의 분획들 (예컨대 정수의 1/10 또는 1/100)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 중합체 서브유닛, 크기 또는 두께와 같은 임의의 물리적 특성과 관련하여 본원에 인용된 임의의 숫자 범위는 달리 지시되지 않는 한 인용된 범위 내의 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 "약" 또는 "로 반드시 구성된"은 달리 지시되지 않는 한 지시된 범위, 값, 또는 구조의 ± 20%를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "함유하는" 및 "포함하는"은 개방형으로 종지되고 동의어로 사용된다. 본원에 사용된 용어 "일" 및 "하나"는 "하나 이상의" 열거된 성분들을 나타냄이 이해되어야 한다. 대안 (예, "또는")의 사용은 대안들 중의 하나, 둘 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

본원에 기재된 것들과 유사하거나 또는 동등한 방법들 및 재료들이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적절한 방법들 및 재료들이 아래 기재되어 있다. 본원에 언급된 모든 공개들, 특허 출원들, 특허들, 및 기타 참고 문헌들은 그들의 전문으로서 참고 문헌으로 인용된다. 혼동이 있는 경우, 용어들의 설명을 포함하는 본 발명의 명세서가 조절할 것이다. 또한, 재료들, 방법들, 및 실시예들은 단지 예시적인 것으로 제한하고자 의도되지 않는다.

본원에 사용된 용어 "뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 그의 유사체 뿐만 아니라 그의 변형된 형태를 나타낸다. 뉴클레오티드들은 피리미딘류 (예, 시토신, 우라실, 티미딘, 및 그들의 유도체들 및 유사체들) 뿐만 아니라 푸린류 (예, 아데닌, 하이포크산틴, 구아닌, 및 이들의 유도체들 및 유사체들)을 포함하는 종들을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "C-5 변형된 카르복스아미드시티딘" 또는 "시티딘-5-카르복스아미드"는 본원에 예시된 그들 모이어티들 (R^X1)를 포함하지만 이들로만 제한되지 않는 시티딘의 C-5 위치에서 카르복시아미드 (-C(O)NH-) 변형을 갖는 시티딘을 나타낸다. 예시 C-5 변형된 카르복스아미드시티딘은 5-(N-벤질카르복스아미드)-2'-데옥시시티딘 ("BndC"라 지칭되고 화학식 (II)로서 아래 도시됨); 5-(N-2-페닐에틸카르복스아미드)-2'-데옥시시티딘 ("PEdC"라 지칭되고 화학식 (III)으로서 아래 도시됨); 5 -(N-3-페닐프로필카르복스아미드)-2'-데옥시 시티딘 ("PPdC"라 지칭되고 화학식 (IV)로서 아래 도시됨); 5-(N-l-나프틸메틸카르복스아미드)-2'-데옥시시티딘 ("NapdC"라 지칭되고 화학식 (V)로서 아래 도시됨); 5-(N-2-나프틸메틸카르복스아미드)-2'-데옥시시티딘 ("2NapdC"라 지칭되고 화학식 (VI)으로서 아래 도시됨); 5-(N-l-나프틸-2-에틸카르복스아미드)-2'-데옥시 시티딘 ("NEdC"라 지칭되고 화학식 (VII)로서 아래 도시됨); 및 5-(N-2-나프틸-2-에틸카르복스아미드)-2'-데옥시시티딘 ("2NEdC"라 지칭되고 화학식 (VIII)로서 아래 도시됨)을 포함하지만 이들로만 제한되지 않는다:

본원에 기재된 C-5 변형된 시티딘들의 화학적 변형은 단독으로 또는 임의의 조합으로 2'-위치 당 변형, 환외 아민들에서 변형들, 및 4-티오시티딘의 치환 등과 조합될 수 있다.

염류

화합물의 상응하는 염, 예를 들면, 제약학적으로-허용가능한 염을 제조, 정제, 및/또는 처리하는 것이 편리하거나 또는 바람직할 수 있다. 제약학적으로 허용가능한 염들의 예는 Berge 등 (1977)의 "Pharmaceutically Acceptable Salts" J. Pharm. Sci. 66: 1-19에서 고찰된다.

예를 들면, 화합물이 음이온성이거나, 또는 음이온성일 수 있는 관능기 (예, -COOH는 -COO일 수 있음)를 갖는 경우, 염은 적절한 양이온에 의해 형성될 수 있다. 적절한 무기 양이온들의 예는 알칼리 금속 이온들 예컨대 Na⁺ 및 K⁺, 알칼리 토금속 양이온들 예컨대 Ca² ⁺ 및 Mg² ⁺, 및 기타 양이온들 예컨대 Al⁺³을 포함하지만 이들로만 제한되지 ?는다. 적절한 유기 양이온들의 예는 암모늄 이온 (즉, NH₄ ⁺) 및 치환된 암모늄 이온들 (예, NH₃R^X ⁺, NH₂R^X ₂ ⁺, NHR^X ₃ ⁺,NR^X ₄ ⁺)을 포함하지만 이들로만 제한되지 않는다. 일부 적절한 치환된 암모늄 이온들의 예는 아미노산, 예컨대 리신 및 아르기닌 뿐만 아니라 하기: 즉, 에틸아민, 디에틸아민, 디시클로헥실아민, 트리에틸아민, 부틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페리진, 벤질아민, 페닐벤질아민, 콜린, 메글루민, 및 트로메타민으로부터 유도된 것들이다. 통상적인 4급 암모늄 이온의 예는 N(CH₃)₄ ⁺이다.

화합물이 양이온성이거나, 또는 양이온성일 수 있는 관능기 (예, -NH₂　는 -NH₃ ⁺　일 수 있음)를 갖는 경우, 염은 적절한 음이온에 의해 형성될 수 있다. 적절한 무기 음이온들의 예는 하기 무기 산들: 즉, 염화수소산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 아황산, 질산, 아질산, 인산 및 아인산으로부터 유도된 것들을 포함하지만 이들로만 제한되지 않는다.

적절한 유기 음이온들의 예는 하기 유기산들: 즉, 2-아세티옥시벤조산, 아세트산, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤조산, 캄포르술폰산, 신남산, 시트르산, 에데트산, 에탄디술폰산, 에탄술폰산, 푸마르산, 글루텝톤산, 글루콘산, 글루탐산, 글리콜산, 히드록시말레산, 히드록시나프탈렌 카르복실산, 이세티온산, 락트산, 락토비온산, 라우르산, 말레산, 말산, 메탄술폰산, 점액산, 올레산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 판토텐산, 페닐아세트산, 페닐술폰산, 프로피온산, 피루브산, 살리실산, 스테아르산, 숙신산, 술파닐산, 타르타르산, 톨루엔술폰산, 및 발레르산으로부터 유도된 것들을 포함하지만 이들로만 제한되지 않는다. 적절한 중합체성 유기 음이온들의 예는 하기 중합체성 산: 즉, 탄틴산, 카르복시메틸 셀룰로스로부터 유도된 것들을 포함하지만 이들로만 제한되지 않는다.

달리 명시되지 않는 한, 특정 화합물에 대한 참조물은 또한 이의 염 형태를 포함한다.

올리고뉴클레오티드들의 제조

일 측면에서, 본 발명은 변형된 올리고뉴클레오티드들을 제조하기 위해 본원에 기재된 변형된 뉴클레오시드들을 단독으로 또는 다른 변형된 뉴클레오시드들 및/또는 자연적으로 발생하는 뉴클레오시드들과 조합하여 사용하는 방법들을 제공한다. 올리고데옥시뉴클레오시드들의 자동화된 합성은 많은 실험실에서 일상적인 관행이다 (예, Matteucci, M. D. and Caruthers, M. H., (1990) J. Am. Chem. Soc, 103:3185-3191을 참조하며, 그의 내용을 그의 전문으로서 참고 문헌으로 이에 인용한다). 올리고리보뉴클레오시드들의 합성은 또한 잘 공지되어 있다(see 예 Scaringe, S. A., 등, (1990) 핵산s Res. 18:5433-5441을 참조하며, 그의 내용을 그의 전문으로서 참고 문헌으로 이에 인용한다). 본원에 언급된 바와 같이, 포스포라미다이트들은 변형된 뉴클레오시드를 올리고뉴클레오티드 내로 화학적 합성에 의해 혼입하는데 유용하고, 트리포스페이트들은 변형된 뉴클레오시드를 올리고뉴클레오티드 내로 효소적 합성에 의해 혼입하는데 유용하다. (예를 들어, Vaught, J. D. 등 (2004) J. Am. Chem. Soc, 126: 11231-11237; Vaught, J. V., 등 (2010) J. Am. Chem. Soc . 132, 4141-4151; Gait, M. J. "Oligonucleotide Synthesis a practical approach" (1984) IRL Press (Oxford, UK); Herdewijn, P. "Oligonucleotide Synthesis" (2005) (Humana Press, Totowa, N.J 참조하고, 이들 각각은 그의 전문으로서 참고 문헌으로 이에 편입된다).

본원에 사용된 용어들 "변형하다," "변형된," "변형," 및 그의 임의의 변화는 올리고뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때, 올리고뉴클레오티드의 4개의 구성 성분 뉴클레오티드 염기들 (즉, A, G, T/U, 및 C) 중의 적어도 하나가 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드의 유사체 또는 에스테르임을 의미한다. 일부 구현예들에서, 변형된 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드에 뉴클레아제 저항을 부여한다. 추가의 변형들은 골격 변형들, 메틸화, 특이한 염기-짝 지음 조합들 예컨대 이소염기 이소시티딘 및 이소구아니딘, 등을 포함할 수 있다. 변형들은 또한 3' 및 5' 변형들, 예컨대 캡핑(capping)을 포함할 수 있다. 다른 변형들은 유사체, 인터뉴클레오티드 변형들 예컨대, 예를 들면, 충전되지 않은 결합을 갖는 것들 (예, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트, 등) 및 충전된 결합을 가진 것들 (예, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 등), 삽입제들을 갖는 것들 (예, 아크리딘, 프소랄렌, 등), 킬레이터를 함유하는 것들 (예, 금속들, 방사선 활성 금속들, 붕소, 산화성 금속들, 등), 알킬화제를 함유하는 것들, 및 변형된 결합을 가진 것들 (예, 알파 아노머성 핵산들, 등)에 의한 하나 이상의 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드들의 치환을 포함할 수 있다. 또한, 뉴클레오티드의 당 위에 통상적으로 존재하는 임의의 히드록실기는 포스포네이트 기 또는 포스페이트 기에 의해 대체될 수 있거나; 표준 보호기들에 의해 보호될 수 있거나; 또는 추가의 뉴클레오티드들에 대한 또는 고체 지지체에 대한 추가의 결합을 제조하기 위해 활성화될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH 기들은 약 1 내지 약 20개의 탄소 원자들의 유기 캡핑(capping)기 모이어티들인 아민, 일 구현예에서 약 10 내지 약 80 kDa 범위의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중합체, 다른 구현예에서 약 20 내지 약 60 kDa 범위의 PEG 중합체들 또는 다른 친수성 또는 소수성 생물학적 또는 합성 중합체들로 포스포릴화되거나 또는 치환될 수 있다.

폴리뉴클레오티드들은 또한 2'-0-메틸, 2'-0-알릴, 2'-0-에틸, 2'-0-프로필, 2'-0-CH₂CH₂OCH₃, 2'-플루오로, 2'-NH₂　또는 2'-아지도, 카르보시클릭 당 유사체들, α-아노머성 당, 에피머성 당 예컨대 아라비노스, 크실로스 또는 릭소오스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환식 유사체들 및 무염기성 뉴클레오시드 유사체들 예컨대 메틸 리보시드를 포함하여 당업계에 일반적으로 공지된 리보스 또는 데옥시리보스 당의 유사한 형태들을 함유할 수 있다. 본원에 언급된 바와 같이, 하나 이상의 포스포디에스테르 결합들은 대체 연결 기들로 대체될 수 있다. 이들 대체 연결 기들은 포스페이트가 P(0)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (0)NR^x　₂　("아미데이트"), P(0) R^x, P(0)OR^x', CO 또는 CH₂　("포름아세탈")로 대체되는 구현예들을 포함하고, 여기서 각각의 R^x　또는 R^x'는 독립적으로 H 또는 선택적으로 에테르 (-0-) 결합, 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아랄킬을 함유하는 치환된 또는 미치환된 알킬 (C1-C20). 폴리뉴클레오티드 내의 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 당류, 푸린류, 및 피리미딘류의 유사한 형태들의 치환은 예를 들면 폴리아미드 골격과 같은 골격 구조물을 대체할 수 있듯이 최종 제품을 고안하는데 있어서 유리할 수 있다.

폴리뉴클레오티드들은 또한 카르보시클릭 당 유사체들, α-아노머성 당, 에피머성 당 예컨대 아라비노스, 크실로스 또는 릭소오스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환식 유사체들 및 무염기성 뉴클레오시드 유사체들 예컨대 메틸 리보시드의 유사한 형태들을 함유할 수 있다.

존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 그 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드들의 서열은 비-뉴클레오티드 성분들에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후에, 예컨대 라벨링 성분과의 콘주게이션에 의해 추가로 변형될 수 있다.

본원에 사용된, "핵산," "올리고뉴클레오티드," 및 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드들의 중합체를 나타내도록 상호 교환적으로 사용되고, DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드들 및 핵산들, 올리고뉴클레오티드들 및 폴리뉴클레오티드들의 이들 종류의 변형들을 포함하고, 여기서 임의의 위치에서 뉴클레오티드 유닛에 대한 다양한 실체들 또는 모이어티들의 부착이 포함되어 있다. 용어 "폴리뉴클레오티드," "올리고뉴클레오티드," 및 "핵산"은 이중- 또는 단일-가닥의 분자들 뿐만 아니라 삼중-나선형 분자들을 포함한다. 핵산, 올리고뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드는 용어 앱타머보다 더 광범위한 용어이고, 따라서, 용어 핵산, 올리고뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드는 앱타머들인 뉴클레오티드들의 중합체들을 포함하지만, 용어 핵산, 올리고뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드는 앱타머들로 제한되지 않는다.

특정 구현예들에서, 본 발명은 하기 화학식 I을 갖는 화합물 및 이의 염을 포함하는 핵산 분자의 제조 방법을 제공하고:

상기 식 중에서,

R^x1은 독립적으로 하기로 구성된 군으로부터 선택되고:

상기 식 중에서,

*는 -(CH₂)_n- 기에 대한 R^X1 기의 부착 지점을 나타내고;

상기 방법은 복수개의 뉴클레오티드 및 화학식 I를 갖는 적어도 하나의 화합물을 갖는 핵산 분자를 합성하는 단계를 포함한다.

특정 구현예들에서, 본 발명은 하기 화학식들 II, III, IV, V, VI, VII and VIII로 구성된 군으로부터 선택된 화학식을 갖는 화합물을 포함하는 핵산 분자의 제조 방법을 제공하고:

상기 식 중에서,

상기 방법은 복수개의 뉴클레오티드 및 화학식들 II, III 및 IV로 구성된 군으로부터 선택된 화학식을 갖는 적어도 하나의 화합물을 갖는 핵산 분자를 합성하는 단계를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "적어도 하나의 뉴클레오티드"는 핵산의 변형들을 언급할 때, 핵산 중의 하나, 여러 개 또는 모든 뉴클레오티드들을 나타내고, 핵산 중의 임의의 또는 모든 A, C, T, G 또는 U의 임의의 또는 모든 경우가 변형될 수 있거나 또는 그렇지 않음을 지시한다.

다른 측면에서, 본 발명은 앱타머들 및 소마머(SOMAmer)들 (본원에 기재됨)을 제조하기 위해 본원에 기재된 변형된 뉴클레오시드들을 단독으로 또는 다른 변형된 뉴클레오시드들 및/또는 자연적으로 발생하는 뉴클레오시드들과 조합하여 사용하는 방법들을 개시한다. 특정 구현예들에서, 앱타머들 및 소마머들은 아래 기재된 바의 일반적인 SELEX 또는 개선된 SELEX 공정을 사용하여 제조된다.

본원에 사용된, "핵산 리간드," "앱타머," "소마머(SOMAmer)," 및 "클론"은 표적 분자에 대한 바람직한 작용을 하는 비-자연적으로 발생하는 핵산을 나타내도록 상호 교환 가능하게 사용된다. 바람직한 작용은 표적의 결합, 표적을 촉매적으로 변화시키는 단계, 표적 또는 표적의 기능적 활성을 변형시키거나 또는 변경하는 방식으로 표적과 반응하는 단계, (아포토시스 억제제(suicide inhibitor)에서와 같이) 표적에 공유적으로 부착되는 단계, 및 상기 표적과 다른 분자 사이의 반응을 촉진하는 단계를 포함하지만 이들로만 제한되지 않는다. 일 구현예에서, 그 작용은 표적 분자에 대한 특이적 결합 친화도이고, 그러한 표적 분자는 Watson/Crick 염기 짝 지음 또는 삼중 나선 형성과 독립적인 메커니즘을 통해 핵산 리간드에 결합하는 폴리뉴클레오티드 이외의 3차원 화학적 구조물이고, 여기서 앱타머는 표적 분자에 의해 결속되는 공지된 생리학적 기능을 갖는 핵산이 아니다. 주어진 표적에 대한 앱타머들은 핵산들의 후보 혼합물로부터 (여기서 앱타머는 표적의 리간드임) 하기 단계들을 포함하는 방법: 즉, (a) 후보 혼합물을 표적과 접촉시키는 단계 (여기서 후보 혼합물 내의 다른 핵산들에 비해 상대적으로 표적에 대해 증가된 친화도를 갖는 핵산들이 후보 혼합물의 나머지로부터 분배될 수 있음); (b) 후보 혼합물의 나머지로부터 증가된 친화도 핵산들을 분배하는 단계; 및 (c) 증가된 친화도 핵산들을 증폭시켜 핵산들의 리간드-농축된 혼합물을 수득하고, 그로 인해 표적 분자의 앱타머들이 식별되는 단계를 포함하는 방법에 의해 식별되는 핵산들을 포함한다. 친화도 상호작용은 어느 정도의 문제인 것으로 인식되지만; 그러나, 이러한 맥락에서, 그의 표적에 대한 앱타머의 "특이적 결합 친화도"는 그 앱타머가 일반적으로 혼합물 또는 시료 내의 다른 비-표적, 성분들에 결합하는 것보다 훨씬 더 큰 친화도로 그의 표적에 결합하는 것을 의미한다. "앱타머," "소마머," 또는 "핵산 리간드"는 특정 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자의 하나의 종류 또는 종들의 사본들의 세트이다. 앱타머는 임의의 적절한 수의 뉴클레오티드들을 포함할 수 있다. "앱타머들"은 하나 이상의 그러한 분자들 세트를 나타낸다. 상이한 앱타머들은 동일하거나 또는 상이한수의 뉴클레오티드들을 가질 수 있다. 앱타머들은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 단일 가닥, 이중 가닥일 수 있거나, 또는 이중 가닥 또는 삼중 가닥 영역을 함유할 수 있다.

본원에 사용된, "소마머" 또는 느린 오프-속도 변형된 앱타머는 개선된 오프-속도 특성을 갖는 앱타머를 나타낸다. 소마머들은 "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates"라는 표제의 미국 특허 제7,947,447호에 개시된 개선된 SELEX 방법들을 사용하여 생성될 수 있다.

본원에 사용된, "단백질"은 "펩티드," "폴리펩티드," 또는 "펩티드 단편"과 동의어로 사용된다. "정제된" 폴리펩티드, 단백질, 펩티드, 또는 펩티드 단편은 그로부터 아미노산 서열이 얻어지거나 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체들 또는 기타 화학 물질들이 실질적으로 없는 세포, 조직, 또는 세포-없는 소스로부터 세포 물질 또는 기타 오염시키는 단백질들이 실질적으로 없다.

SELEX 방법

용어 "SELEX" 및 "SELEX 공정"은 일반적으로 (1) 바람직한 방식으로, 예를 들면 단백질에 대한 높은 친화도를 갖는 결합에 의한 표적 분자와 상호 작용하는 핵산들의 선택과 (2) 그들 선택된 핵산들의 증폭의 조합을 나타내도록 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다. SELEX 공정은 특이적 표적 분자 또는 바이오마커에 대한 높은 친화도를 갖는 앱타머들을 식별하기 위해 사용될 수 있다.

SELEX는 일반적으로 핵산들의 후보 혼합물을 제조하는 단계, 후보 혼합물을 목적하는 표적 분자에 결합시켜 친화도 착물을 형성하는 단계, 친화도 착물들을 미결속된 후보 핵산들로부터 분리하는 단계, 핵산을 친화도 착물로부터 분리하고 단리시키는 단계, 핵산을 정제하는 단계, 및 특이적 앱타머 서열을 식별하는 단계를 포함함다. 그 공정은 선택된 앱타머의 친화도를 추가로 정제하기 위해 다중 라운드를 포함할 수 있다. 그 공정은 그 공정의 하나 이상의 지점들에서 증폭 단계들을 포함할 수 있다. 예, "Nucleic Acid Ligands"라는 표제의 미국 특허 제5,475,096호 참조. 그 SELEX 공정은 그의 표적에 비-공유적으로 결합하는 앱타머 뿐만 아니라 그의 표적에 공유적으로 결합하는 앱타머를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예, "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX"라는 표제의 미국 특허 제5,705,337호 참조.

그 SELEX 공정은 앱타머에 대해 개선된 특성들, 예컨대, 예를 들면, 개선된 생체 내 안정성 또는 개선된 전달 특성을 부여하는 변형된 뉴클레오티드들을 함유하는 고-친화도 앱타머들을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 변형들의 예는 리보스 및/또는 포스페이트 및/또는 염기 위치들에서 화학적 치환을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드들을 함유하는 SELEX 공정-식별된 앱타머들은 "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides"라는 표제의 미국 특허 제5,660,985호에 개시되어 있으며, 이 특허는 피리미딘들의 5'- 및 2'-위치들에서 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 유도체들을 함유하는 올리고뉴클레오티드들을 개시하고 있다. 미국 특허 제5,580,737호 (상기 참조)는 2^*-아미노 (2^*-NH₂), 2'-플루오로 (2^*-F), 및/또는 2^*-O-메틸 (2^*-OMe)로 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드들을 함유하는 고도로 특이한 앱타머들을 개시하고 있다. 또한, "SELEX and PHOTOSELEX"라는 표제로, 확장된 물리적 및 화학적 특성들을 갖는 핵산 라이브러리 및 SELEX 및 포토SELEX에서 그들의 용도를 개시하는 미국 특허 출원 공개 제20090098549호 참조.

SELEX는 또한 바람직한 오프-속도 특성들을 갖는 앱타머들을 식별하기 위해 사용될 수 있다. "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates"라는 표제이고 그의 전문으로서 참고 문헌으로 본원에 인용되고, 표적 분자들에 결합할 수 있는 앱타머들을 생성하기 위한 개선된 SELEX 방법들을 개시하는 미국 특허 제7,947,447호 참조. 그들의 각각의 표적 분자들로부터 더 느린 해리 속도를 갖는 앱타머들 및 포토앱타머들을 생성하는 방법들이 개시되어 있다. 그 방법들은 후보 혼합물을 표적 분자와 접촉시키는 단계, 핵산-표적 착물들의 형성이 일어나도록 허용하는 단계, 및 느린 오프-속도 농축 공정을 수행하는 단계를 포함하고, 여기서 빠른 해리 속도를 갖는 핵산-표적 착물들은 해리되어 재형성되지 않는 한편, 느린 해리 속도를 갖는 착물들은 그대로 남아있다. 추가로, 그 방법들은 개선된 오프-속도 성능을 갖는 앱타머들을 생성하기 위해 후보 핵산 혼합물들의 생성에 변형된 뉴클레오티드들을 사용하는 것을 포함한다 ("SELEX and PhotoSELEX"라는 표제의 미국 특허 제8,409,795호 참조). (또한 미국 특허 제7,855,054호 및 U.S. 특허 공개 제20070166740호 참조). 이들 출원 각각은 그의 전문으로서 참고 문헌으로 본원에 인용된다.

"표적" 또는 "표적 분자" 또는 "표적"은 본원에서 그 위에서 핵산이 원하는 방식으로 작용할 수 있는 임의의 화합물을 나타낸다. 표적 분자는 제한 없이 단백질, 펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 다당류, 글리코단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 병원균, 독성 물질, 기질, 대사 산물, 전이 상태 유사체, 보조 인자, 억제제, 약물, 염료, 영양소, 성장 인자, 세포, 조직, 상기한 것들 중의 임의의 것의 임의의 일부 또는 단편 등일 수 있다. 사실상 임의의 화학적 또는 생물학적 작동 인자는 적절한 표적일 수 있다. 임의의 크기의 분자들이 표적들로서 작용할 수 있다. 표적은 또한 표적과 핵산 사이의 상호작용의 가능성 또는 강도를 증진시키기 위한 특정 방식들로 변형될 수 있다. 표적은 또한 특정 화합물 또는 분자의 임의의 소소한 변화, 예컨대, 단백질의 경우에, 예를 들면, 아미노산 서열, 이황화물 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 포스포릴화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 라벨링 성분과의 콘쥬게이션에서 소소한 변화를 포함할 수 있고, 이는 분자의 정체성을 실질적으로 변경하지 않는다. "표적 분자" 또는 "표적"은 앱타머에 결합할 수 있는 분자 또는 다분자 구조물의 한 종류 또는 종들의 사본들의 세트이다. "표적 분자들" 또는 "표적들"은 하나 이상의 그러한 분자들의 세트를 나타낸다. 표적이 펩티드인 SELEX 공정의 구현예들은 "Modified SELEX Processes Without Purified Protein"라는 표제의 미국 특허 제6,376,190호에 개시되어 있다.

본원에 사용된, "경쟁자 분자" 및 "경쟁자"는 비-표적 분자와 비-특이적 착물을 형성할 수 있는 임의의 분자를 나타내도록 상호 교환 가능하게 사용된다. 이러한 맥락에서, 비-표적 분자들은 예를 들면, 앱타머가 다른 비-표적 분자에 대해 비-특이적으로 결합 (재결합)하는 것을 억제하기 위해 경쟁자가 사용될 수 있는 유리 앱타머들을 포함한다. "경쟁자 분자" 또는 "경쟁자"는 분자의 하나의 종류 또는 종들의 사본들의 세트이다. "경쟁자 분자들" 또는 "경쟁자들"은 하나 이상의 그러한 분자들의 세트를 의미한다. 경쟁자 분자들은 올리고뉴클레오티드, 폴리음이온 (예, 헤파린, 청어 정자 DNA, 연어 정자 DNA, tRNA, 덱스트란 설페이트, 폴리덱스트란, 무염기성 포스포디에스테르 중합체들, dNTPs, 및 파이로포스페이트)을 포함하지만 이들로만 제한되지 않는다. 다양한 구현예들에서, 하나 이상의 경쟁자의 조합이 사용될 수 있다.

본원에 사용된, "비-특이적 착물"은 앱타머와 그의 표적 분자 이외에 2개 이상의 분자들 사이의 비-공유 연합을 나타낸다. 비-특이적 착물은 분자들의 부류 간의 상호작용을 나타낸다. 비-특이적 착물들은 앱타머와 비-표적 분자, 경쟁자와 비-표적 분자, 경쟁자와 표적 분자, 및 표적 분자와 비-표적 분자 사이에 형성된 착물들을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "느린 오프-속도 농축 공정(slow off-rate enrichment process)"은 느린 해리 속도를 갖는 앱타머 친화도 착물들의 상대적 농도가 더 빠르고 덜 바람직한 해리 속도를 갖는 앱타머 친화도 착물들의 농도에 대해 상대적으로 증가되도록 후보 혼합물의 특정 성분들의 상대적 농도를 변경시키는 공정을 나타낸다. 일 구현예에서, 상기 느린 오프-속도 농축 공정은 용액-기반 느린 오프-속도 농축 공정이다. 이러한 구현예에서, 용액-기반 느린 오프-속도 농축 공정은 혼합물 내에 앱타머 친화도 착물들을 형성하는 어떠한 표적이나 또는 핵산들도 느린 오프-속도 농축 공정 동안 고체 지지체 상에 고정되지 않도록 용액 중에서 일어난다. 다양한 구현예들에서, 느린 오프-속도 농축 공정은 경쟁자 분자의 첨가 및 그와의 인큐베이션, 혼합물의 희석, 또는 이들의 조합 (예, 경쟁자 분자의 존재 하의 혼합물의 희석)을 포함하여 하나 이상의 단계들을 포함할 수 있다. 느린 오프-속도 농축 공정의 효과는 일반적으로 상이한 앱타머 친화도 착물들 (즉, 후보 혼합물 내의 표적 분자와 상이한 핵산들 사이에 형성된 앱타머 친화도 착물들)의 차별화된 해리 속도에 달려있기 때문에, 느린 오프-속도 농축 공정의 지속은 빠른 해리 속도를 갖는 앱타머 친화도 착물들의 수를 실질적으로 감소시키면서 느린 해리 속도를 갖는 앱타머 친화도 착물들의 높은 비율을 유지하도록 선택된다. 느린 오프-속도 농축 공정은 SELEX 공정 동안 하나 이상의 주기로 사용될 수 있다. 경쟁자의 희석 및 첨가가 조합하여 사용될 때, 그것들은 임의의 순서로 동시에 또는 순차로 수행될 수 있다. 느린 오프-속도 농축 공정은 혼합물 내의 전체 표적 (단백질) 농도가 낮을 때 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 느린 오프-속도 농축 공정이 희석을 포함할 때, 혼합물은 앱타머 보유 핵산들이 SELEX 공정에서 하기 라운드를 위해 회수되는 것을 염두에 두고 실용화되는 것 만큼 희석될 수 있다. 일 구현예에서, 느린 오프-속도 농축 공정은 희석뿐만 아니라 경쟁자의 사용을 포함하고, 혼합물이 경쟁자의 사용 없이 필요할지도 모르는 것보다 덜 희석되도록 허용한다.

일 구현예에서, 느린 오프-속도 농축 공정은 경쟁자의 첨가를 포함하고, 경쟁자는 폴리음이온 (예, 헤파린 또는 덱스트란 설페이트 (덱스트란))이다. 헤파린 및 덱스트란은 선행된 SELEX 선택에서 특이적 앱타머들의 식별을 위해 사용되어 왔다. 그러나, 그러한 방법들에서, 헤파린 또는 덱스트란은 표적과 앱타머가 결합하여 착물들을 형성하는 평형화 단계 동안 존재한다. 그러한 방법들에서, 헤파린 또는 덱스트란의 농도가 증가함에 따라, 낮은 친화도 표적/앱타머 착물들에 대한 높은 친화도 표적/앱타머 착물들의 비율이 증가한다. 그러나, 헤파린 또는 덱스트란의 높은 농도는 핵산과 경쟁자 사이의 표적 결합에 대한 경쟁으로 인해 평형 시에 높은 친화도 표적/앱타머 착물들의 수를 감소시킬 수 있다. 이와 대조적으로, 현재 기재된 방법들은 표적/앱타머 착물들이 형성되도록 허용된 후에 경쟁자를 첨가하고, 따라서 형성되는 착물들의 수에 영향을 미치지 않는다. 평형 결합이 표적과 앱타머 사이에서 발생한 후 경쟁자의 첨가는 더 적은 수의 표적/앱타머 착물들에 의해 새로운 평형으로 제 시간에 진화하는 비-평형 상태를 생성한다. 새로운 평형에 도달하기 전에 표적/앱타머 착물들을 트래핑하는 것은 빠른 오프-속도 착물들이 먼저 해리될 것이므로 느린 오프-속도 앱타머들에 대한 시료를 농축시킨다.

다른 구현예에서, 폴리음이온성 경쟁자 (예, 덱스트란 설페이트 또는 다른 폴리음이온성 물질)는 폴리음이온의 존재에 대해 내화성인 앱타머의 식별을 촉진하기 위해 느린 오프-속도 농축 공정에 사용된다. 이러한 맥락에서, "폴리음이온성 내화성 앱타머"는 비폴리음이온성 내화성 앱타머를 포함하는 앱타머/표적 착물보다 폴리음이온성 내화성 물질을 함유하는 용액에서 해리되기 쉽지 않은 앱타머/표적 착물을 형성할 수 있는 앱타머이다. 이러한 방식으로, 폴리음이온성 내화성 앱타머들은 시료 내의 표적의 존재 또는 양 또는 농도를 검출하기 위한 분석 방법들의 수행에 사용될 수 있고, 여기서 검출 방법은 앱타머가 내화성인 폴리음이온성 물질 (예 덱스트란 설페이트)의 사용을 포함한다.

따라서, 일 구현예에서, 폴리음이온성 내화성 앱타머의 생성 방법이 제공된다. 이러한 구현예에서, 핵산들의 후보 혼합물을 표적과 접촉시킨 후, 후보 혼합물 내의 표적과 핵산들은 평형에 이르도록 허용된다. 폴리음이온성 경쟁자는 도입되어, 후보 혼합물 내의 빠른 오프 속도 앱타머들의 대부분이 표적 분자로부터 해리되는 것을 보장하기에 춘분한 시간 동안 용액 내에서 인큐베이션되도록 허용된다. 또한, 폴리음이온성 경쟁자의 존재 하에 해리될 수 있는 후보 혼합물 내의 앱타머들은 표적 분자로부터 배출될 것이다. 표적 분자와 연합하여 남겨진 높은 친화도, 느린 오프-속도 앱타머들을 단리시키고 용액으로부터 임의의 착물화되지 않은 물질들을 제거하기 위해 혼합물이 분배된다. 이어서, 앱타머는 표적 분자로부터 배출되어 단리될 수 있다. 단리된 앱타머는 또한 증폭될 수 있고 추가의 선택 라운드들인 선택된 앱타머들의 전체적인 성능을 증가시키기 위해 적용될 수 있다. 이러한 공정은 또한 느린 오프-속도 앱타머들의 선택이 특정 용도에 대해 요구되지 않는 경우에 최소 인큐베이션 시간으로 사용될 수 있다.

따라서, 일 구현예에서 변형된 SELEX 공정은 느린 (긴) 오프 속도를 갖는 앱타머들의 식별 또는 생성을 위해 제공되고 여기서 표적 분자 및 후보 혼합물은 그 후보 혼합물에 함유된 표적 분자와 핵산들 사이에 평형 결합이 발생하기에 충분한 시간 동안 함께 접촉되고 인큐베이션된다. 평형 결합에 이어 과량의 경쟁자 분자, 예, 폴리음이온 경쟁자가 혼합물에 첨가되고 혼합물은 과량의 경쟁자 분자와 함께 소정의 기간 동안 인큐베이션된다. 이러한 소정의 인큐베이션 기간 미만인 오프 속도를 갖는 상당한 비율의 앱타머들은 소정의 인큐베이션 기간 동안 표적으로부터 해리될 것이다. 이들 "빠른" 오프 속도 앱타머들과 표적의 재연합은 표적에 비-특이적으로 결합할 수 있고 표적 결합 부위를 점유할 수 있는 과량의 경쟁자 분자 때문에 최소화된다. 더 긴 오프 속도를 갖는 현저한 비율의 앱타머들들은 소정의 인큐베이션 기간 동안 표적에 대해 착물화되어 남겨질 것이다. 인큐베이션 기간의 말기에, 혼합물의 나머지로부터 핵산-표적 착물들을 분배하는 것은 빠른 오프 속도를 갖는 것들로부터 느린 오프-속도 앱타머들의 개체군의 분리를 허용한다. 해리 단계는 그들의 표적으로부터 느린 오프-속도 앱타머들을 해리시키기 위해 사용될 수 있고 표적 분자에 대한 높은 친화도 및 특이성을 갖는 느린 오프-속도 앱타머들 (개별적인 앱타머들 또는 일 군의 느린 오프-속도 앱타머들)의 단리, 식별, 서열화, 합성 및 증폭을 허용한다. 종래의 SELEX에 의해서와 같이, 변형된 SELEX 공정의 1 라운드로부터 식별된 앱타머 서열들은 접촉, 평형 결합, 경쟁자 분자의 첨가, 경쟁자 분자에 의한 인큐베이션 및 느린 오프-속도 앱타머들의 분배 단계들이 원하는 만큼 여러 번 되풀이/반복될 수 있도록 새로운 후보 혼합물의 합성에 사용될 수 있다.

경쟁자의 첨가에 앞서 표적에 의한 후보 혼합물의 평형 결합을 허용하는 단계, 이어서 과량의 경쟁자의 첨가 및 소정의 기간 동안 경쟁자와의 인큐베이션의 조합은 이전에 달성된 것들보다 훨씬 더 큰 오프 속도를 갖는 앱타머들의 개체군의 선택을 허용한다. 평형 결합을 달성하기 위해, 후보 혼합물은 적어도 약 5 분, 또는 적어도 약 15 분, 약 30 분, 약 45 분, 약 1 시간, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4 시간, 약 5 시간 또는 약 6 시간 동안 표적과 인큐베이션될 수 있다.

후보 혼합물과 표적 분자의 혼합물에 의한 경쟁자 분자의 소정의 인큐베이션 기간은 인자들 예컨대 표적의 특성 및 표적에 대해 공지된 앱타머들의 공지된 오프 속도 (존재하는 경우)를 고려하여 원하는 대로 선택될 수 있다. 소정의 인큐베이션 기간은 하기: 적어도 약 5 분, 적어도 약 10 분, 적어도 약 20 분, 적어도 약 30 분, 적어도 약 45 분, 적어도 약 1 시간, 적어도 약 2 시간, 적어도 약 3 시간, 적어도 약 4 시간, 적어도 약 5 시간, 적어도 약 6 시간으로부터 선택될 수 있다.

다른 구현예들에서 희석이 희석된 후보 혼합물의 오프 속도 증진 공정 및 인큐베이션으로서 사용되고, 표적 분자/앱타머 착물이 소정의 기간 동안 착수될 수 있고, 이는 하기: 적어도 약 5 분, 적어도 약 10 분, 적어도 약 20 분, 적어도 약 30 분, 적어도 약 45 분, 적어도 약 1 시간, 적어도 약 2 시간, 적어도 약 3 시간, 적어도 약 4 시간, 적어도 약 5 시간, 적어도 약 6 시간으로부터 선택될 수 있다.

발명의 구현예들은 느린 오프-속도 앱타머들의 식별, 생성, 합성 및 용도와 관련된다. 종래의 SELEX에 의해 일반적으로 얻어진 앱타머들의 그것보다 더 큰 비-공유 앱타머-표적 착물로부터의 해리 속도 (t_/1/2)를 갖는 앱타머들이 있다. 앱타머 및 표적의 비-공유 착물들을 함유하는 혼합물에 대해, t_/1/2는 앱타머들의 절반이 앱타머-표적 착물들로부터 해리되기 위해 취해진 시간을 나타낸다. 본 발명에 따른 느린 해리 속도 앱타머들의 t_1/ ₂은 하기: 약 30 분 이상; 약 30 분 내지 약 240 분; 약 30 분 내지 약 60 분; 약 60 분 내지 약 90 분, 약 90 분 내지 약 120 분; 약 120 분 내지 약 150 분; 약 150 분 내지 약 180 분; 약 180 분 내지 약 210 분; 약 210 분 내지 약 240 분 중의 하나로부터 선택된다.

SELEX 절차에 의해 식별된 앱타머의 특징적인 특성은 그의 표적에 대한 그의 높은 친화도이다. 앱타머는 하기: 약 1μM 미만, 약 100nM 미만, 약 10nM 미만, 약 1nM 미만, 약 100pM 미만, 약 10pM 미만, 약 lpM 미만 중의 하나로부터 선택된 그의 표적에 대한 해리 상수 (k_d)를 가질 것이다.

화학적 합성

본 발명에 제공된 화합물들의 화학적 합성 방법들이 본원에 개시되어 있다. 이들 및/또는 다른 잘 공지된 방법들은 본 발명에 제공된 추가의 화합물들의 합성을 촉진하기 위해 공지된 방식으로 변형 및/또는 채택될 수 있다.

반응식 1과 관련하여, 본 발명은 또한 C-5 변형된 아미노카르보닐피리미딘의 3'-포스포라미다이트의 합성 방법을 제공한다. 반응식 1과 관련하여, 일산화탄소 및 염기와 5 -치환된 뉴클레오시드의 팔라듐 촉매된 반응은 2 기압 이하의 일산화탄소 압력에서; 더 구체적으로 0.1 내지 2 기압 (또는 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6., 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 또는 2 기압), 및 훨씬 더 구체적으로 1 기압에서 수행되는 것이 주목할 가치가 있다. 이들 감소된 압력에서 반응은 3 내지 4 기압의 압력 [50 psi]에서 수행된 이전의 방법들보다 더 높은 수율 및 더 순수한 제품으로 이어진다.

반응식 2와 관련하여, 본 발명은 또한 C-5 변형된 아미노카르보닐피리미딘의 5 '-트리포스페이트의 합성 방법을 제공한다:

특정 구현예들에서 보호기는 트리페닐메틸, p-아니실디페닐메틸, 디-p-아니실디페닐메틸, p-디메톡시 트리틸트리틸, 포르밀, t-부틸옥시카르보닐, 벤질옥시카르보닐, 2-클로로벤질옥시카르보닐, 4-클로로벤조일옥시카르보닐, 2,4-디클로로벤질옥시카르보닐, 푸르푸릴카르보닐, t-아밀옥시카르보닐, 아다만틸옥시카르보닐, 2-페닐프로필-(2)-옥시카르보닐, 2-(4-비페닐)프로필-(2)-옥시카르보닐, 2-니트로페닐술페닐 및 디페닐포스피닐로 구성된 군으로부터 선택된다.

하기 실시예들은 어떤 특정한 특징들 및/또는 구현예들을 예시하도록 제공된다. 이들 실시예들은 기재된 특정한 특징들 또는 구현예들로 본 발명을 제한하도록 이해되지 않아야 한다.

실시예

실시예 1: 5 -(N- 벤질카르복스아미드 )-2'- 데옥시시티딘의 합성

이 실시예는 5-(N-벤질카르복스아미드)-2'-데옥시시티딘의 제조 방법들을 제공한다 (또는 BndC; 아래 반응식 1 (4a) 참조). 간단히 말해서, 상업적으로 입수할 수 있는 5-요오도-2'-데옥시시티딘 (3)은 실온에서 24-48 시간 동안 N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 중의 필수 방향족 1급 아민 RCH₂NH₂　(5-10 당량), 일산화탄소 (</= 1 기압), 및 (Ph₃P)₄Pd (2 몰%)에 의한 처리에 의해 상응하는 N-치환된-카르복스아미드 (4a-c)로 전환되었다 (반응식 1). 과량의 1급 아민 및 제한된 일산화탄소는 2-케토카르복스아미드 부산물들의 형성을 제한하는데 필수적이었다 (예, Uozumi, Y. 등 (2001) 및 Takacs 등, 2008 참조). 변형된 뉴클레오시드 생성물들 (4a-c)은 알코올알콜로 재결정화에 의해 용이하게 정제되었다.

출발 물질들: 5-요오도-2'-데옥시시티딘; 5-요오도-2'-0-메틸-시티딘; 5-요오도-2'-데옥시-2'-플루오로시티딘은 ChemGenes Corporation (미국 매사추세츠주 01887, 윌밍턴) 또는 Thermo Fisher Scientific Inc. (미국 매사추세츠주 02454, 월트햄)로부터 구매되었다. 99.9% 순도의 일산화탄소 (안정성: 독가스)는 Specialty Gases of America (미국 오하이오주 43611, 톨레도)로부터 구매되었다. 모든 다른 시약들은 Sigma-Aldrich (미국 위스콘신주 53201, 밀워키)로부터 구매되었고 받은 대로 사용되었다.

5-(N- 벤질카르복스아미드 )-2'- 데옥시시티딘 (4a): 아르곤-충전된 1L 둥근 바닥 플라스크는 하기: 5-요오도-2'-데옥시시티딘 (30 g, 85 mmol); 벤질아민 (109.3 g, 1020 mmol, 12 당량); 및 무수 N,N-디메틸포름아미드 (DMF, 205 mL)으로 충전되었다. 혼합물은 모든 고체들이 용해될 때까지 신속하게 자기적으로-교반되었다. 생성된 용액은 50 mm까지 2 싸이클의 비우기에 의해 탈기되었고 아르곤에 의해 재충전되었다. 비스(디벤질리딘아세톤)팔라듐(0) (978 mg, 1.7 mmol, 0.02 당량)과 트리페닐포스핀 (1.92 g, 7.3 mmol, 0.086 당량)의 혼합물이 첨가되었고, 생성된 미세한 흑색 현탁액은 신속히 교반되고, 50 mm까지 비워지고, 고무 풍선으로부터 일산화탄소 (1 기압)로 충전되었다. 혼합물은 실온에서 (~20 ℃) 교반되었고 일산화탄소로 주기적으로 재충전되었다. 26 시간 후, 반응은 tlc 분석 (실리카 겔, 용리제: 15% 메탄올/85% 디클로로메탄 (v/v), R_f(SM) = 0.3, R_f(4a) = 0.4)에 의해 완료된 것으로 밝혀졌다. 반응 혼합물은 에틸 아세테이트 (205 mL)에 의해 희석되고, 여과되고, 65% 에틸 아세테이트/35% DMF (100 mL)에 의해 앞으로 헹구어졌다. 모든 용매 및 대부분의 벤질 아민이 증발될 때까지 투명한 녹색 여액이 회전 증발기 (50-80 ℃, 1-2 mm) 상에서 증폭되었다. 짙은 주황색 잔류물 (~75 g)이 뜨거운 무수 에탄올 (650 mL)에 용해되었고 소량의 불용성 플레이크 (~2 g)를 제거하기 위해 신속히 핫-필터링되었다. 투명한 여액은 느린 교반 하에 냉각되었고, 생성물은 침상물로서 결정화되었다. 철야 교반 후, 슬러리는 여과되고, 케이크는 얼음처럼 차가운 에탄올 (100 mL)로 세척되었다. 진공에서 건조 후, 생성물 (4a)은 백색, 결정질 고체로서 얻어졌다: 22.0 g, 72% 수율. ¹H NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ = 8.73 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.06 (bs, 1H), 7.75 (bs, 1H), 7.32 (m, 4H), 7.25 (m, 1H), 6.14 (t, J= 6.5 Hz, 1H), 5.24 (d, J= 4.4 Hz, 1H), 5.03 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.42 (dd, J = 15.4, 7.2 Hz, 1H), 4.41 (dd, J= 15.4, 7.3 Hz, 1H), 4.26 (m, J = 4.3 Hz, 1H), 3.83 (dd, J= 7.9, 4.3 Hz, 1H), 3.64 (m, 1H), 3.58 (m, 1H), 2.19 (m, 2H).　¹³C NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ = 165.88 (1C), 163.97 (1C), 153.99 (1C), 144.26 (1C), 139.64 (1C), 128.80 (2C), 127.60 (2C), 127.30 (1C), 99.20 (1C), 88.08 (1C), 86.29 (1C), 70.44 (1C), 61.50 (1C), 42.72 (1C), 40.62 (1C). MS m/z: [M^-] C₁₇H₁₉N₄O₅에 대한 이론치, 359.36; 실측치, 359.1 (ESI^-).

4-N-아세틸-5-(N- 벤질카르복스아미드 )-2'- 데옥시시티딘 (5a): 1L 둥근 바닥 플라스크는 (4a) (20.0 g, 55.4 mmol), 및 무수 테트라히드로푸란 (THF, 500 mL)으로 충전되었다. 잘-교반된 혼합물은 아세트산 무수물 (26.4 mL, 277 mmol, 5 당량)로 처리되었고 혼합물은 50 ℃에서 20 시간 동안 가열되었다. 분취물 (50% 메탄올/50% 디클로로메탄에 용해시킴으로써 균질화됨)의 Tlc 분석은 반응이 완료되었음을 나타냈다 (실리카 겔, 용리제: 15% 메탄올/85% 디클로로메탄 (v/v), R_f(4a) = 0.4, R_f(5a) = 0.6). 슬러리는 5-10 ℃로 1시간 동안 냉각되었고, 여과되었고, 차가운 THF (40 mL)에 의해 세척되었다. 진공 건조는 생성물 (5a)를 백색, 결정질 침상물로서 제공하였다, 20.4 g, 91% 수율. ¹H NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ=11.35 (s, 1H), 8.98 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 8.73 (s, 1H), 7.34 (d, J = 4.4 Hz, 4H), 7.26 (m, J = 4.3 Hz, 1H), 6.10 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 5.28 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 5.09 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.44 (dd, J= 15.3, 8.1 Hz, 1H), 4.43 (dd, J= 15.2, 8.1 Hz, 1H), 4.28 (dt, J= 9.8, 4.0 Hz, 1H), 3.91 (dd, J= 7.9, 4.0 Hz, 1H), 3.68 (m, 1H), 3.60 (m, 1H), 2.41 (s, 3H), 2.34 (m, lH), 2.22 (m, 1H).　¹³C NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 171.27 (1C), 165.49 (1C), 159.77 (1C), 153.19 (1C), 146.24 (1C), 139.16 (1C), 128.82 (2C), 127.76 (2C), 127.41 (1C), 100.32 (1C), 88.67 (1C), 87.50 (1C), 70.1 1 (1C), 61.17 (1C), 43.00 (1C), 40.78 (1C), 26.70 (1C). MS m/z: [M^~] C₁₉H₂₁N₄O₆,에 대한 이론치, 401.40; 실측치, 401.1 (ESI^-)

5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-4-N-아세틸-5-(N- 벤질카르복스아미드 )-2'- 데옥시시티딘 (6a): 250 mL 둥근 바닥 플라스크는 (5a) (4.82 g, 12 mmol) 및 무수 피리딘 (40 mL)으로 충전되었다. 생성된 무색 용액은 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드 (4.47 g, 13.2 mmol, 1.1 당량)가 5회 분량으로 1시간에 걸쳐 첨가됨에 따라 자기적으로-교반되었다. 주황색-황색 용액은 30 분 이상 동안 교반되었고, 에탄올 (4.2 mL, 72 mmol)에 의해 급랭되었고, rotovap 상에서 증폭되었다 (1-2 mm, <35 ℃). 생성된 점착성 주황색 잔류물 (~13 g)은 에틸 아세테이트 (100 mL) 및 차가운 포화 중탄산 나트륨 수용액 (50 mL)에 의해 분배되었다. 유기 층은 황산 나트륨에 의해 건조되고, 여과되고, 증폭되어 황색 발포체를 남겼다. 플래시 크로마토그래피 (실리카 겔, 용리제: 1% 트리에틸아민/99% 에틸 아세테이트, R_f(6a) = 0.4)에 의한 정제는 (6a)를 백색 발포체로서 제공하였다, 6.1 g, 72% 수율. ¹H NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 11.44 (s, 1H), 9.12 (t, J= 5.5 Hz, 1H), 8.46 (s, 1H), 7.38 (d, J= 7.4 Hz, 2H), 7.25 (m, 12H), 6.84 (m, 4H), 6.10 (t, J= 6.1 Hz, 1H), 5.34 (d, J= 4.7 Hz, 1H), 4.20 (m, 3H), 4.05 (m, 1H), 3.72 (d, J= 1.7 Hz, 6H), 3.41 (dd, J =10.5, 6.0 Hz, 1H), 3.20 (dd, J=10.4, 3.5 Hz, 1H), 2.44 (s, 3H), 2.39 (m, 1H), 2.25 (m, 1H).　¹³C NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 171.28 (1C), 165.38 (1C), 159.88 (1C), 158.53 (2C), 153.07 (1C), 146.13 (1C), 145.26 (1C), 138.91 (1C), 136.00 (1C), 135.98 (1C), 130.16 (2C), 130.11 (2C), 128.78 (2C), 128.28 (2C), 128.13 (2C), 127.84 (2C), 127.46 (1C), 127.14 (1C), 113.60 (4C), 100.32 (1C), 88.04 (1C), 86.86 (1C), 86.19 (1C), 70.69 (1C), 60.22 (1C), 55.43 (1C), 55.42 (1C), 43.03 (1C), 40.70 (1C), 26.76 (1C). MS m/z: [M^-] C₄₀H₃₉N₄O₈,에 대한 이론치, 703.77; 실측치, 703.2 (ESI^-).

5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-4-N-아세틸-5-(N- 벤질카르복스아미드 )-2'- 데옥시시티딘 -3'-O-(N,N-디이소프로필-0-2-시아노에틸포스포라미다이트) (7a). 250 mL 둥근 바닥 플라스크는 하기: (6a) (11.0 g, 15.6 mmol); 무수 디클로로메탄 (40 mL); 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포르디아미다이트 (5.9 mL, 18.7 mmol, 1.2 당량); 및 마지막으로 피리딘 트리플루오로아세테이트 (3.61 g, 18.7 mmol, 1.2 당량)로 충전되었다. 30 분 후, tlc 분석은 반응이 완료되었음을 나타냈다 (실리카 겔, 75% 에틸 아세테이트/25% 헥산 (v/v), R_f(6a) = 0.2, R_f(7a) = 0.7/0.8 [2개의 이성질체]). 전체 반응 혼합물은 1% 트리에틸아민/64% 에틸 아세테이트/35% 헥산으로 (용리제가 염기성일 때까지) 미리 조절된 실리카 겔 플래시 컬럼에 인가되었고, 이어서 65% 에틸 아세테이트/35% 헥산 (아르곤-살포됨)에 의해 용리되었다. 생성물-함유 분획들은 아르곤 하에 밀봉된 항아리에서 공기로부터 보호되었고 증폭되어 (7a)를 무색 발포체로서 제공하였다, 10.8 g, 76% 수율. ¹H NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 11.47 (s, 1H), 9.11 (bs, 1H), 8.57/8.54 (s, 1H), 7.37 (m, 2H), 7.24 (m, 12H), 6.84 (m, 4H), 6.10 (m, 1H), 4.40 (m, 1H), 4.21 (m, 3H), 3.70 (m, 8H), 3.55 (m, 2H), 3.28 (m, 2H), 2.75 (t, J= 5.9 Hz, 1H), 2.64 (t, J= 5.9 Hz, 1H), 2.55 (m, 1H), 2.42 (m, 4H), 1.11 (m, 9H), 0.98 (d, J= 6.8 Hz, 3H).　³¹P NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 147.55/147.37 (s, IP). MS m/z: [M^-] C₄₅H₅₆N₆O₉P에 대한 이론치, 903.99; 실측치, 903.3 (ESI^-).

2-시아노에틸포스포라미다이트 시약 (CEP 시약)의 제조를 위해, 5-N-벤질카르복삼 (4a-c)은 테트라히드로푸란 (THF) 중의 아세트산 무수물 (염기 없음)에 의해 교반함으로써 선택적으로 N-보호되었고, 이어서 (4,4'-디메톡시트리틸)-유도체 (6a-c)로서 피리딘 중의 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드에 의한 반응에 의해 5'-O-보호되었다 (예, Ross 등, 2006 참조). 고 순도 (>98.0%) CEP 시약 (7a-c)의 합성은 3'-알콜과 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필 포스포라미다이트의 피리디늄 트리플루오로아세테이트-촉매된 축합 (예, Sanghvi, 등, 2000 참조) 및 탈기된 용매에 의한 실리카 겔 플래시 크로마토그래피에 의한 최종 정제 (예, Still 등, 1978 참조)에 의해 완료되었다.

5'-트리포스페이트 시약 (TPP 시약; 반응식 2)의 제조를 위해, 5'-O-DMT-보호된 뉴클레오시드 (6a-c)는 피리딘 중의 아세트산 무수물에 의해 퍼아세틸화(peracetylated)되었고, 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올에 의한 DMT 및 4-N-아세틸 보호기의 분열이 이어졌다 (예, Leonard 및 Neelima, 1995 참조). 생성된 결정질 3'-O-아세테이트 뉴클레오시드 (8a-c)는 Ludwig-Eckstein 공정에 의해 조악한 5'-O-트리포스페이트로 전환되었다. 이들 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 고 순도 (>%90)를 얻기 위해 일반적으로 2단계 정제 공정: 음이온 교환 크로마토그래피 (AEX), 이어서 역상 예비-HPLC를 필요로 한다.

Ludwig, J. 및 Eckstein, F. (1989) 2-클로로-4H-l,3,2-벤조디옥사포스포린-4-온을 사용하는 뉴클레오시드 5'-O-(l-티오트리포스페이트), 5'-트리포스페이트 및 2',3'-시클로포스포로티오에이트의 신속하고 효율적인 합성. J. Org. Chem., 54, 631-635, 이는 그의 전문으로서 참고 문헌으로 본원에 인용된다.

카르복시아미드화 반응은 또한 뉴클레아제-저항 리보-당 유사체들 (예, Ito 등, 2003 참조) (반응식 4), 예를 들면, 5-(N-벤질카르복스아미드)-2'-O-메틸-시티딘 (12) 및 -5-(N-3-페닐프로필카르복스아미드)-2'-데옥시-2'-플루오로-시티딘 (13)의 제조를 위해 적절하였다.

5-(N- 벤질카르복스아미드 )-2'-O- 메틸 -시티딘 (12): 생성물이 고온 2-프로판올 (12 mL/g)로부터 결정화되어 (12)를 펠티 백색 고체로서 제공하는 것을 제외하고는 (4a)에 대해 기재된 바와 같이 5-요오도-2'-O-메틸시티딘으로부터 제조됨, 79% 수율. ¹H NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 8.57 (t, J= 5.9 Hz, 1H), 8.57 (s, 1H), 8.05 (bs, 1H), 7.85 (bs, 1H), 7.33 (m, 4H), 7.25 (m, 1H), 5.85 (d, J= 3.1 Hz, 1H), 5.27 (t, J= 5.4 Hz, 1H), 5.11 (d, J= 6.8 Hz, 1H), 4.43 (dd, J= 15.4, 10.4 Hz, 1H), 4.40 (dd, J=15.3, 10.4 Hz, 1H), 4.17 (dd, J = 6.7, 5.2 Hz, 1H), 3.87 (dt, J= 6.8, 3.2 Hz,?1H), 3.80 (dd, J= 5.0, 3.2 Hz,?1H), 3.77 (m, 1H), 3.61 (ddd, J = 12.2, 5.3, 3.4 Hz, 1H), 3.44 (s, 3H).　¹³C NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 165.43 (1C), 163.57 (1C), 153.49 (1C), 143.99 (1C), 139.16 (1C), 128.40 (2C), 127.22 (2C), 126.90 (1C), 98.97 (1C), 87.95 (1C), 84.28 (1C), 83.05 (1C), 67.67 (1C), 59.92 (1C), 57.70 (1C), 42.40 (1C). MS m/z: [M^-] C₁₈H₂₁N₄O₆에 대한 이론치, 389.39; 실측치, 389.1 (ESI^-).

5-(N-3- 페닐프로필 )-2'- 데옥시 -2'- 플루오로 -시티딘 (13): 펠티 백색 고체로서 (4c)에 대해 기재된 바와 같이 5-요오도-2'-데옥시-2'-플루오로-시티딘으로부터 제조됨 (53% 수율). ¹H NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 8.52 (s, 1H), 8.07 (bs, 1H), 7.95 (t, J= 5.4 Hz, 1H), 7.85 (bs, 1H), 7.22 (t, J= 7.4, 5H), 5.91 (d, J= 17.6 Hz, 1H), 5.58 (d, J= 6.6 Hz, 1H), 5.32 (t, J= 5.3 Hz, 1H), 4.99 (dd, J= 53.2, 3.9 Hz, 1H), 4.27 (m, 1H), 3.92 (d, J= 8.3 Hz, 1H), 3.86 (m, 1H), 3.58 (ddd, J=12.5, 5.4, 2.9 Hz, 1H), 3.19 (dd, J= 12.7, 5.3 Hz, 2H), 2.61 (t, J= 7.5 Hz, 2H), 1.78 (m, J= 7.3 Hz, 2H).　¹³C NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 165.22 (s, IC), 163.74 (s, IC), 153.34 (s, IC), 143.82 (s, IC), 141.73 (s, IC), 128.42 (s, 2C), 128.35 (s, 2C), 125.81 (s, IC), 99.26 (1C), 94.02 (d, J= 736.6 Hz, IC), 88.65 (d, J= 134.7 Hz, IC), 83.07 (s, IC), 67.00 (d, J= 65 Hz, IC), 59.24 (s, IC), 38.65 (s, IC), 32.64 (s, IC), 30.73 (s, IC).　¹⁹F NMR (400 MHz, d6-DMSO): δ= -200.82 (ddd, J= 19.0, 6.2, 56.6 Hz, IF). MS m/z: [M^-] C₁₉H₂₂N₄O₅에 대한 이론치, 405.41; 실측치, 405.1 (ESI^-).

Ludwig-Eckstein 공정은 3'-O-아세틸-보호된 중간체 (8a-c)를 조악한 5'-O-트리포스페이트 (9a-c)로 전환시키기 위해 사용되었다. 대안의 2단계 예비 HPLC 정제가 이들 화학적으로-변형된 뉴클레오티드에 대해 사용되었다.

3'-0-아세틸-5-(N-l- 벤질카르복스아미드 )-2'- 데옥시시티딘 (8a). 아르곤이 제거된(purged) 50 mL 둥근 바닥 플라스크가 (6a) (900 mg, 1.35 mmol), 무수 피리딘 (9 mL) 및 아세트산 무수물 (0.63 mL, 6.75 mmol)로 충전되었다. 18 시간 후 실온에서, 용매는 진공에서 증발되어 (1mm, 30 ℃) 황갈색 발포체를 수득하였고, 이는 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올 (9 mL)에 용해되고, 50 ℃에서 아르곤 하에 가열되었다. 6 시간 후, 반응 혼합물은 메탄올 (15 mL)과 톨루엔 (10 mL)의 신속하게 교반되는 혼합물에 부어졌다. 생성된 주황색 용액은 증폭되어 (1mm, 30 ℃) 적색 유상 잔류물을 수득하였고, 이는 에틸 아세테이트 (6 mL)와 혼합됨에 따라, 결정질 슬러리를 제공하였다. 결정화는 헥산 (1 mL)의 첨가에 의해 추가로 증진되었다. 혼합물은 철야 교반되고 여과되었고, 필터 케이크를 50:50 에틸 아세테이트: 헥산으로 세척하였다. 생성물 (8a)은 건조 후에 옅은 회색 고체로서 단리되었다 (405 mg), 75% 수율:　^lH NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 8.82 (t, J= 5.8 Hz, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.09 (bs, 1H), 7.81 (bs, 1H), 7.33 (m, 4H), 7.25 (m, 1H), 6.17 (dd, J= 8.0, 6.0 Hz, 1H), 5.24 (dt, J = 6.2, 1.8 Hz, 1H), 5.13 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.43 (dd, J= 15.4, 13.3 Hz, 1H), 4.19 (dd, J=15.3, 13.2 Hz, 1H), 4.06 (dd, J= 5.9, 3.7 Hz, 1H), 3.65 (m, 2H), 2.45 (m, 1H), 2.34 (ddd, J= 14.2, 5.9, 1.5 Hz, 1H), 2.07 (s, 3H).　¹³C NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 170.05 (1C), 165.34 (1C), 163.54 (1C), 153.44 (1C), 143.94 (1C), 139.20 (1C), 128.34 (2C), 127.16 (2C), 126.85 (1C), 99.06 (1C), 85.96 (1C), 85.06 (1C), 74.63 (1C), 61.18 (1C), 42.28 (1C), 37.31 (1C), 20.85 (1C). MS m/z: [M^-] C₁₉H₂₁N₄O₆에 대한 이론치, 401.40; 실측치, 401.1 [M]^-.

3'-O-아세틸-5-(N-l- 나프틸메틸카르복스아미드 )-2'- 데옥시시티딘 (8b). 옅은 회색 고체로서 (8a)에 대해 기재된 바와 같이 (6b)로부터 제조됨, 54% 수율:　^lH NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 8.89 (t, J= 5.8 Hz, 1H), 8.44 (s, 1H), 8.14 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.11 (bs, 1H), 7.96 (dd, J= 8.6, 1.3 Hz, 1H), 7.86 (dd, J= 6.6, 2.8 Hz, 1H), 7.84 (bs, 1H), 7.57 (m, 2H), 7.49 (m, 2H), 6.15 (dd, J= 8.2, 6.0 Hz, 1H), 5.23 (dt, J= 6.2, 1.9 Hz, 1H), 5.13 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 4.94 (dd, J= 15.5, 5.8 Hz, 1H), 4.86 (dd, J= 15.7, 5.4 Hz, 1H), 4.05 (dt, J= 8.1, 1.8 Hz, 1H), 3.62 (m, 2H), 2.45 (m, 1H), 2.33 (ddd, J= 12.6, 6.1, 1.8 Hz, 1H), 2.06 (s, 3H).　¹³C NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 170.51 (1C), 165.78 (1C), 164.02 (1C), 153.90 (1C), 144.52 (1C), 134.57 (1C), 133.74 (1C), 131.27 (1C), 129.02 (1C), 128.03 (1C), 126.80 (1C), 126.31 (1C), 125.94 (1C), 125.54 (1C), 123.78 (1C), 99.52 (1C), 86.60 (1C), 85.55 (1C), 70.12 (1C), 61.67 (1C), 40.80 (1C), 37.75 (1C), 21.32 (1C). MS m/z: [M^-] C₂₃H₂₃N₄O₆에 대한 이론치, 451.46; 실측치, 451.1 (ESI^-).

3'-O-아세틸-5-(N-3- 페닐프로필카르복스아미드 )-2'- 데옥시시티딘 (8c). 백색 고체로서 (8a)에 대해 기재된 바와 같이 (6c)로부터 제조됨, 74% 수율: ¹H NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 8.37 (s, 1H), 8.26 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 8.06 (bs, 1H), 7.79 (bs, 1H), 7.23 (m, 5H), 6.16 (dd, J= 7.9, 6.1 Hz, 1H), 5.24 (dt, J=4.2, 2.1 Hz, 1H), 5.18 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.06 (dd, J= 5.7, 3.6 Hz, 1H), 3.65 (m, 2H), 3.19 (dd, J= 12.8, 6.2 Hz, 2H), 2.62 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.43 (m, 1H), 2.34 (m, lH), 2.06 (s, 3H), 1.78 (m, J = 7.4 Hz, 2H).　¹³C NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 170.52 (1C), 165.68 (1C), 164.00 (1C), 153.94 (1C), 144.09 (1C), 142.13 (1C), 128.80 (2C), 127.75 (2C), 126.21 (1C), 99.80 (1C), 86.42 (1C), 85.06 (1C), 75.07 (1C), 61.63 (1C), 39.12(1C), 37.91 (1C), 33.04 (1C), 31.18 (1C), 21.31 (1C). MS m/z: [M^-] C₂₁H₂₅N₄O₆에 대한 이론치, 429.45; 실측치, 429.1 (ESI^-).

실시예 2: 5 -(N-l- 나프틸메틸 )-2'- 데옥시시티딘 -5- 카르복스아미드의 합성

이 실시예는 5-(N-l-나프틸메틸)-2'-데옥시시티딘-5-카르복스아미드 (또는 NapdC; 실시예 1의 반응식 1 (4b) 참조)의 제조 방법을 제공한다.

5-(N-l- 나프틸메틸 )-2'- 데옥시시티딘 -5- 카르복스아미드 (4b): 실온에서 48 시간의 반응 시간으로 벤질아민 대신에 1-나프틸메틸아민 (6 당량)을 사용하여 (4a)에 대해 기재된 바와 같이 제조됨. 반응 혼합물을 증폭시킨 후, 잔류물은 과량의 1-나프틸메틸아민의 대부분을 제거하기 위해 디이소프로필 에테르 (~40 mL/g)로 추출되었다. 잔류물은 고온 메탄올 (50 mL/g)로부터 고온 여과에 의해 결정화되어 백색 고체로서 생성물 (4b; 반응식 1; 실시예 1)을 제공하였다, 40% 수율. ¹H NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 8.81 (t, J= 5.5 Hz, 1H), 8.43 (s, 1H), 8.14 (d, J= 4.4, 1H), 8.09 (bs, 1H), 7.96 (m, 1H), 7.79 (m, 1H), 7.75 (bs, 1H), 7.53 (m, 4H), 6.14 (t, J= 6.6 Hz, 1H), 5.24 (d, J= 4.3 Hz, 1H), 5.01 (t, J= 5.6 Hz, 1H), 4.90 (dd, J= 15.6, 13.4 Hz, 1H), 4.89 (dd, J= 15.5, 13.2 Hz, 1H), 4.26 (m, J= 4.1 Hz, 1H), 3.84 (dd, J= 8.4, 4.4 Hz, 1H), 3.58 (m, 2H), 2.20 (m, 2H).　¹³C NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 165.45 (1C), 163.58 (1C), 153.57 (1C), 143.93 (1C), 136.07 (1C), 134.20 (1C), 133.32 (1C), 128.61 (1C), 127.59 (1C), 126.34 (1C), 125.89 (1C), 125.53 (1C), 125.07 (1C), 123.36 (1C), 98.82 (1C), 87.71 (1C), 85.99 (1C), 70.13 (1C), 61.16 (1C), 42.42 (1C), 40.14 (1C). MS m/z: [M^-] C₂₁H₂₁N₄O₅에 대한 이론치, 409.42; 실측치, 409.1 (ESI^-).

4-N-아세틸-5-(N-l- 나프틸메틸카르복스아미드 )-2'- 데옥시시티딘 (5b): 100 mL 둥근 바닥 플라스크는 (4b) (1.17 g, 2.85 mmol) 및 무수 테트라히드로푸란 (26 mL)으로 충전되었고 교반되어 회백색 슬러리를 형성하였다. 아세트산 무수물 (1.4 mL, 14.3 mmol, 5 당량)이 실온에서 교반되면서 혼합물에 적가되었다. 반응 혼합물이 21 시간 동안 교반되었고 50°C로 가열되었다. 분취물을 TLC 분석 (실리카 겔, 용리제: 10% 메탄올/90% 디클로로메탄 (v/v), R_f(4b) = 0.61, R_f(5b) = 0.12)을 위해 끌어냈고, 이는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 플라스크는 얼음 조로 옮기고 1 시간 초과(>1시간) 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물은 여과하고 필터 케이크는 식힌 이소프로필 에테르로 헹구었다. 생성된 고체들을 수집하고 추가로 진공에서 증발시켜 미세한 회-백색 결정을 수득하였다 (1.01 g, 78.2% 수율). ¹H NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 11.35 (s, 1H), 9.07 (t, J = 4.6 Hz, 1H), 8.74 (s, 1H), 8.15 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.96 (m, 1H), 7.87 (m, 1H), 7.53 (m, 4H), 6.11 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 5.29 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 5.08 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.92 (dd, J = 15.5, 10.1 Hz, 1H), 4.91 (dd, J = 15.7, 9.7 Hz, 1H), 4.28 (dt, J = 9.4, 3.8 Hz, 1H), 3.92 (dd, J = 7.6, 3.9 Hz, 1H), 3.64 (m, 1H), 3.58 (m, 1H), 2.42 (s, 3H), 2.35 (m, 1H), 2.22 (m, 1H).　¹³C NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 171.27 (1C), 165.53 (1C), 159.77 (1C), 153.20 (1C), 146.30 (1C), 136.48 (1C), 134.17 (1C), 133.74 (1C), 131.26 (1C), 129.02 (1C), 128.12 (1C), 126.83 (1C), 126.33 (1C), 125.95 (1C), 123.80 (1C), 100.38 (1C), 88.74 (1C), 87.63 (1C), 70.25 (1C), 61.29 (1C), 41.13 (1C), 40.92 (1C), 26.71 (1C). MS m/z: [M^-] C₂₃H₂₃N₄O₆에 대한 이론치, 451.46; 실측치, 451.1 (ESI^-).

5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-4-N-아세틸-5-(N-l- 나프틸메틸카르복스아미드 )-2'-데옥시시티딘 (6b): 무색 고체로서 6b)에 대해 기재된 바와 같이 제조됨, 59% 수율. ¹H NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 11.40 (s, 1H), 9.35 (bt, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.02 (m, 1H), 7.96 (m, 1H), 7.86 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.54 (m, 2H), 7.40 (m, 2H), 7.35 (m, 1H), 7.25 (m, 8H), 6.85 (d, J= 8.9 Hz, 4H), 6.09 (t, J= 6.1 Hz, 1H), 5.32 (d, J= 3.7 Hz, 1H), 4.72 (dd, J= 14.9, 4.8 Hz, 1H), 4.60 (dd, J= 15.1, 3.4 Hz, 1H), 4.16 (dt, J= 10.9, 4.7 Hz, 1H), 4.04 (m, 1H), 3.70 (s, 6H), 3.29 (dd, J= 10.5, 6.4 Hz, 1H), 3.18 (dd, J= 10.4, 7.0 Hz, 1H), 2.43 (s, 3H), 2.38 (m, lH), 2.26 (m, 1H).　¹³C NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 171.25 (1C), 165.37 (1C), 159.88 (1C), 158.52 (1C), 158.54 (1C), 153.03 (1C), 146.32 (1C), 145.31 (1C), 136.05 (1C), 135.97 (1C), 133.92 (1C), 133.74 (1C), 131.22 (1C), 130.20 (2C), 130.11 (2C), 129.05 (1C), 128.30 (2C), 128.15 (2C), 127.16 (1C), 126.81 (1C), 126.33 (1C), 125.85 (1C), 125.80 (1C), 123.65 (1C), 113.61 (4C), 100.49 (1C), 88.12 (1C), 86.79 (1C), 86.17 (1C), 70.59 (1C), 64.40 (1C), 55.41 (2C), 41.01 (1C), 40.70 (1C), 40.82 (1C), 26.76 (1C). MS m/z: [M^-] C₄₄H₄₁N₄O₆에 대한 이론치, 753.83; 실측치, 753.21 (ESI^-).

5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-4-N-아세틸-5-(N-l- 나프틸메틸카르복스아미 드)-2'-데옥시시티딘-3'-O-(N,N-디이소프로필-O-2-시아노에틸포스포라미다이트) (7b): 백색 발포체로서 (7a)에 대해 기재된 바와 같이 제조됨 (88% 수율). ¹H NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 11.41 (s, 1H), 9.13 (bs, 1H), 8.56/8.54 (s, 1H), 8.01 (m, 1H), 7.95 (m, 1H), 7.85 (m, 1H), 7.53 (m, 2H), 7.37 (m, 2H), 7.24 (m, 9H), 6.83 (m, 4H), 6.06 (m, 1H), 4.66 (m, 2H), 4.39 (m, 1H), 4.16 (m, 1H), 3.68 (m, 8H), 3.52 (m, 2H), 3.28 (m, 1H), 3.20 (m, 1H), 2.74 (t, J= 5.8 Hz, 1H), 2.63 (t, J= 5.9 Hz, 1H), 2.45 (m, 5H), 1.09 (m, 9H), 0.96 (d, J= 6.8 Hz, 3H).　³¹P NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 146.93/146.69 (s, IP). MS m/z: [M^-] C₅₃H₅₈N₆O₉P에 대한 이론치, 954.05; 실측치, 953.3 (ESI^-).

실시예 3: 5 -(N-3- 페닐프로필카르복스아미드 )-2'- 데옥시시티딘의 합성

이 실시예는 5-(N-3-페닐프로필카르복스아미드)-2'-데옥시시티딘 (또는 PPdC; 실시예 1에서 반응식 1 (4c) 참조)의 제조 방법을 제공한다.

5-(N-3- 페닐프로필카르복스아미드 )-2'- 데옥시시티딘 (4c): 실온에서 48 시간의 반응 시간 동안 벤질아민 대신에 3-페닐프로필아민 (6 당량)을 사용하여 (4a) (40 nmol 규모)에 대해 기재된 바와 같이 제조됨. rotovap 상에서 용매의 제거 후, 잔류물은 과량의 3-페닐프로필아민을 추출하기 위해 디에틸 에테르 (-30 mL/g)로 분쇄되었고, 고무질 잔류물은 고온 에탄올에 용해되었고, 실온에서 18 시간 동안 교반되었고, 0 ℃에서 1 시간 동안 교반이 이어졌다. 생성된 혼합물이 여과되고, 모액은 증발되어 갈색 수지로 되었다. 이 물질은 디클로로메탄과 물의 따뜻한 혼합물에 용해되었다. 실온에서 정치 및 교반 후, 백색의 깃털 상 결정들이 유기 층 내에, 및 수성 층 내에 마찬가지로 형성되었다. 삼상 혼합물은 여과되었고 필터 케이크는 디에틸 에테르로 세척되어 솜털같은 백색 고체로서 (4c)를 제공한다 (10.78 g, 69.5% 수율). ¹H NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 8.39 (s, 1H), 8.13 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 8.05 (bs, 1H), 7.71 (bs, 1H), 7.28 (t, J= 7.4, 2H), 7.22 (d, J= 7.0, 2H), 7.17 (t, J= 7.4, 1H), 6.13 (t, J= 6.4 Hz, 1H), 5.22 (d, J= 4.3 Hz, 1H), 5.07 (t, J= 5.5 Hz, 1H), 4.26 (dt, J= 9.4, 4.1 Hz, 1H), 3.83 (dd, J= 7.8, 3.9 Hz, 1H), 3.66 (m, 1H), 3.58 (m, 1H), 3.19 (dd, J= 12.9, 6.7 Hz, 2H), 2.61 (t, J= 7.5 Hz, 2H), 2.19 (m, 2H), 1.78 (m, J= 7.4 Hz, 2H).　¹³C NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 165.34 (1C), 163.56 (1C), 153.60 (1C), 143.53 (1C), 141.70 (1C), 128.38 (2C), 128.33 (2C), 125.78 (1C), 98.99 (1C), 87.63 (1C), 85.86 (1C), 69.82 (1C), 60.96 (1C), 40.36 (1C), 38.58 (1C), 32.63 (1C), 32.63 (1C). MS m/z: [M^-] C₁₉H₂₃N₄O₅에 대한 이론치, 387.42; 실측치, 387.1 (ESI^-).

4-N-아세틸-5-(N-3- 페닐프로필 ) 카르복스아미드 -2'- 데옥시시티딘 (5c): 무수THF (100 mL) 중의 (4c) (10.8 g, 28 mmol)의 용액은 교반되었고 아세트산 무수물 (3 당량)로 적가(dropwise) 처리되었다. 용액은 18 시간 동안 실온에서 교반되어 묽은 현탁액을 제공한다. 혼합물은 디이소프로필 에테르 (35 mL)의 적가에 의해 서서히 희석되었다. 고체는 여과에 의해 단리되었고 진공 건조되어 백색 고체로서 (5c)를 제공하였다 (8.44 g, 70.5% 수율). ¹H NMR (400 MHz, d6-DMSO): δ= 11.34 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.41 (t, J= 5.2 Hz, 1H), 7.23 (m, 5H), 6.09 (t, J= 6.0 Hz, 1H), 5.15 (bs, 2H), 4.27 (m, 1H), 3.90 (dd, J= 9.6, 3.8 헐,?), 3.68 (m, 1H), 3.59 (m, 1H), 3.21 (dd, J= 12.3, 7.0 Hz 2H), 2.62 (m, 2H), 2.40 (s, 3H), 2.33 (m, 1H), 2.21 (m, 1H), 1.79 (m, 2H).　¹³C NMR (400 MHz, d6-DMSO):δ= 171.21 (1C), 165.34(1C), 159.73 (1C), 153.21 (1C), 146.01 (1C), 142.08 (1C), 128.80 (2C), 128.75 (2C), 126.22 (1C), 99.14 (1C), 88.61 (1C), 87.41 (1C), 69.88 (1C), 61.05 (1C), 41.04 (1C), 39.22 (1C), 33.01 (1C), 30.97 (1C), 26.67 (1C). MS m/z: [M^-] C₂₁H₂₅N₄O₆에 대한 이론치, 429.45; 실측치, 429.1 (ESI^-).

5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-4-N-아세틸-5-(N-3- 페닐프로필 ) 카르복스아미드 -2'-데옥시시티딘 (6c): 백색 발포체로서 실시예 1에서 (6a)에 대해 기재된 바와 같이 (5c; 반응식 1; 실시예 1)로부터 제조됨 (64.6% 수율). ¹H NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 11.38 (s, 1H), 8.56 (t, J= 5.2 Hz, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.35 (d, J= 7.4 Hz, 2H), 7.21 (m, 12H), 6.80 (m, 4H), 6.11 (t, J= 6.0 Hz, 1H), 5.32 (d, J= 4.8 Hz, 1H), 4.16 (dt, J= 10.8, 4.7 Hz, 1H), 4.04 (m, 1H), 3.70 (d, J= 2.2 Hz, 6H), 3.26 (dd, J= 10.6, 6.1 Hz, 1H), 3.21 (dd, J= 10.5, 3.3 Hz, 1H), 3.03 (m, 1H), 2.95 (m, 1H), 2.49 (s, 2H), 2.43 (s, 3H), 2.39 (m, 1H), 2.23 (m, 1H), 1.57 (m, 2H).　¹³C NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 170.77 (1C), 164.81 (1C), 159.41 (1C), 158.07 (1C), 158.06 (1C), 152.69 (1C), 145.18 (1C), 144.81 (1C), 141.53 (1C), 135.51 (1C), 135.50 (1C), 129.70 (2C), 129.61 (2C), 128.32 (2C), 128.29 (2C), 127.81 (2C), 127.66 (2C), 126.66 (1C), 125.79 (1C), 113.13 (4C), 100.37 (1C), 87.47 (1C), 86.40 (1C), 85.72 (1C), 70.03 (1C), 59.80 (1C), 54.99 (1C), 54.97 (1C), 40.48 (1C), 38.92 (1C), 32.64 (1C) 32.29 (1C), 26.27 (1C). MS m/z: [M^-] C₄₂H₄₃N₄O₈에 대한 이론치, 731.83; 실측치, 731.2 (ESI^-).

5'-O-(4,4'- 디메톡시트리틸 )-4-N-아세틸-5-(N-3- 페닐프로필카르복스아미 드)-2'-데옥시시티딘-3'-O-(N,N-디이소프로필-O-2-시아노에틸포스포라미다이트) (7c): 실시예 1에서 (7a)에 대해 기재된 바와 같이 (6c; 반응식 1; 실시예 1)로부터 제조됨. 아르곤 기압 하에 6c (7.1 lg, 9.70 mmol)를 함유하는 500 mL 둥근 바닥 플라스크는 무수 디클로로메탄 (97 mL)로 충전되었다. 무수 N, N-디이소프로필에틸아민 (3.4 mL, 19.4 mmol)은 플라스크에 첨가되었고, 혼합물은 교반되면서 0 ℃로 냉각되었다. 30분의 과정에 걸쳐, 2-시아노에틸디이소프로필 클로로포스포라미다이트 (2.6 mL, 11.6 mmol)는 빠르게 교반되는 혼합물에 적가되었다. 혼합물은 교반되면서 실온으로 서서히 가온되도록 허용되었다. 17 시간 후, 반응은 TLC를 위해 샘플링되었고, 이는 반응이 완료되었음을 나타냈다 (실리카 겔; 용리제 75% 에틸 아세테이트/25% 헥산 (v/v), R_f(6c) = 0.10, R_f(7b) = 0.46/0.56 [2개의 이성질체]). 반응 혼합물은 톨루엔을 사용하여 250 mL 분별 깔때기로 전이되었고 차가운, 아르곤 살포된 2% 중탄산 나트륨 용액 (2x, 400 mL/세척액)으로 세척함으로써 급랭되었다. 디클로로메탄의 대부분이 제거될 때까지 유기 층이 수집되고 증발되었다. 유기 층은 냉각된 아르곤-살포된 톨루엔과 함께 분별 깔때기로 되돌려졌고 냉각된 아르곤-살포된 탈이온수 (2x, 400 mL/세척액)로 세척되었다. 이어서 유기 층은 냉각된 아르곤-살포된 에틸 아세테이트로 희석되었고 염수 (lx, 400 mL)로 세척되었다. 유기 층이 수집되었고, 황산 나트륨 상에서 건조되고, 여과되고, 증발되었다. 작업된 반응 혼합물은 디클로로메탄에 의해 용해되었고, 미리-조절된 컬럼 ((6b)에 대해서와 같이 제조됨) 상으로 로딩되었고, 냉각된, 아르곤 살포된 이동 상 (80% 에틸 아세테이트/20% 헥산)으로 용출되었고, 공기와의 생성물 접촉을 제한하기 위해 생성물 함유 분획들이 밀봉된 아르곤-제거된 병 내에서 수집되었다. 생성물 함유 분획들은 <40 ℃에서 증발되어 백색 발포체를 수득하였다 (6.16 g, 68.0% 수율). ¹H NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 11.40 (s, 1H), 8.56 (m, 1H), 8.47/8.43 (s, 1H), 7.35 (m, 2H), 7.20 (m, 12H), 6.80 (m, 4H), 6.08 (m, 1H), 4.40 (m, 1H), 4.18 (m, 1H), 3.70 (m, 8H), 3.53 (m, 2H), 3.30 (m, 2H), 3.00 (m, 2H), 2.75 (t, J= 5.9 Hz, 1H), 2.63 (t, J= 5.9 Hz, 1H), 2.56 (m, 1H), 2.50 (m, 2H), 2.40 (m, 4H), 1.59 (m, 2H), 1.11 (m, 9H), 0.97 (d, J= 6.8 Hz, 3H).³¹P NMR (500 MHz, d6-DMSO): δ= 147.60/147.43 (s, IP) MS m/z: [M^-] C₅₁H₆₀N₆O₉P에 대한 이론치, 932.05; 실측치, 931.4 (ESI^-).

실시예 4: 2단계 예비 HPLC에 의한 뉴클레오시드 트리포스페이트 정제

이 실시예는 뉴클레오시드 트리포스페이트의 정제 방법을 제공한다.

조악한 트리포스페이트 (9a-c)는 2개의 직교 예비 HPLC 기술: 뉴클레오시드 트리포스페이트를 다른 뉴클레오시드 부산물들 (예컨대 디포스페이트 및 모노포스페이트)로부터 분리하기 위한 음이온 교환 크로마토그래피 및 반응 시약의 잔류 부산물들을 제거하기 위한 역상 크로마토그래피를 통해 정제되었다.

음이온 교환 크로마토그래피는 소스 15Q 수지로 충전된 HPLC 컬럼을 사용하여 각각 0.5 mmol씩 반응하는 2개의 주입부(injections)에서 수행되었고, 2개의 중탄산 트리에틸암모늄 완충액의 선형 용리 구배로 용출되었다 (표 1). 목적하는 트리포스페이트는 통상적으로 HPLC 크로마토그램 상의 10-12 분 폭의 넓은 피크로서 컬럼으로부터 용출하는 최종 물질이다. 분획들이 분석되었고, 생성물-함유 분획들이 합해져서 Genevac VC 3000D 증발기 내에서 증발되어 무색 내지 옅은 황갈색 수지를 생성하였다. 이 물질은 탈이온수 중에서 재구성되고, 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액 중의 아세토니트릴의 선형 구배로 용출되는 Novapak HRC18 프렙 컬럼 상에서 역상 정제를 위해 단일 주입으로 도포되었다 (표 2). 순수한 트리포스페이트를 함유하는 분획들이 합해지고 증발되어 무색 내지 옅은 황갈색 수지를 생성하였다.

최종적인 순수한 트리포스페이트 (9a-c)는 분석을 위해 탈이온수 중에서 재구성되었고, 240 nm에서 Hewlett Packard 8452A Diode Array Spectrophotometer를 사용하여 정량화되었다 (표 3).

표 1 : AEX 정제 조건

표 2 : RP- HPLC 정제 조건

표 3 : 트리포스페이트 수율 및 순도

5-(N-l- 벤질카르복스아미드 )-2'- 데옥시시티딘 -5'-O- 트리포스페이트 (9a). ¹H NMR (300 MHz, D₂0): δ= 8.45 (s, 1H), 7.25 (m, 5H), 6.14 (t, J= 6.9 Hz, 1H), 4.57 (m, J= 2.9 Hz, 1H), 4.43 (dd, J= 20.2, 15.4 Hz, 2H), 4.17 (m, 3H), 2.39 (m, 1H), 2.27 (m, 1H). 13C NMR　³¹P NMR (300 MHz, D₂O): δ= - 9.96 (d, J= 50.0 Hz, IP), - 11.43 (d, J = 50.8 Hz, IP), - 23.24(t, J= 50.5Hz, IP MS m/z: [M^-] C₁₇H₂₁N₄O₁₄P₃에 대한 이론치, 599.04; 실측치, 599.1 (ESI^-).

5-(N-l-나프틸메틸카르복스아미드)-2'-데옥시시티딘-5'-O-트리포스페이트 (9b): ¹H NMR (500 MHz, D₂0): δ= 8.12 (s, 1H), 7.98 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 7.69 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 7.58 (m, 1H), 7.40 (m, 1H), 7.33 (m, 1H), 7.24 (m, 1H), 5.87 (t, J= 6.7 Hz, 1H), 4.66 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.40 (m, J= 3.0 Hz, 1H), 4.04 (m, 3H), 2.21 (ddd, J= 14.1, 6.0, 3.4 Hz, 1H), 2.06 (m, 1H).　¹³C NMR (500 MHz, D₂0): δ= 165.95 (s, 1C), 163.15 (s, 1C), 155.22 (s, 1C), 143.33 (s, 1C), 133.35 (s, 1C), 133.17 (s, 2C), 130.55 (s, 2C), 128.66 (s, 1C), 127.84 (s, 1C), 126.65 (s, 1C), 126.13 (s, 1C), 125.64 (s, 1C), 125.12 (s, 1C), 123.11 (s, 1C), 100.55 (s, 1C), 86.88 (s, 1C), 85.87 (d, J= 55.95 Hz, 1C), 70.76 (s, 1C), 65.38 (d, J= 36 Hz, 1C), 41.19 (s, 1C), 39.61 (m, 1C).　³¹P NMR (500 MHz, D₂0): δ= - 10.99 (d, J= 82.4 Hz, IP), - 11.61 (d, J = 84.9 Hz, IP), - 23.47 (t, J= 83.5 Hz, IP). MS m/z: [M^-] C₂₁H₂₄N₄O₁₄P₃에 대한 이론치, 649.36; 실측치, 649.0 (ESI^-).

5-(N-3- 페닐프로필카르복스아미드 )-2'- 데옥시시티딘 -5'-O- 트리포스페이 트 (9c). ¹H NMR (500 MHz, D₂0): δ= 8.07 (s, 1H), 7.1 1 (m, 4H), 6.98 (m, 1H), 6.00 (t, J= 6.5 Hz, 1H), 4.44 (m, J = 3.0 Hz, 1H), 4.06 (m, 3H), 3.21 (m, 1H), 3.13 (m, 1H), 2.50 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.13 (ddd, J= 14.1 , 10.9, 3.1 Hz, 1H), 2.13 (m, 1H), 1.76 (m, 2H).¹³C NMR (500 MHz, D₂0): δ= 165.85 (s, 1C), 163.50 (s, 1C), 155.73 (s, 1C), 142.94 (s, 1C), 142.40 (s, 1C), 128.55 (s, 2C), 128.40 (s, 2C), 125.72 (s, 1C), 101.15 (s, 1C), 86.93 (s, 1C), 85.96 (d, J = 55.2 Hz, 1C), 70.90 (s, 1C), 65.38 (d, J= 37.6 Hz, 1C), 39.88 (s, 1C), 39.55 (s, 1C), 32.74 (s, 1C), 26.68 (s, 1C).　³¹P NMR (500 MHz, D₂O): δ= - 11.00 (d, J = 82.7 Hz, IP), - 11.09 (d, J = 85.7 Hz, IP), - 23.53 (t, J = 84.3 Hz, IP). MS m/z: [M^-] C₁₉H₂₅N₄O₁₄P₃에 대한 이론치, 627.35; 실측치, 627.0 (ESI^-).

실시예 5: 고체상 올리고뉴클레오티드 합성

ABI 3900 자동화된 DNA 합성기 (캐나다 포스터시, Applied Biosystems)는 변형된 포스포라미다이트 (7a-c)를 위한 커플링 조건에 최소한의 변화를 갖는 종래의 포스포라미다이트 방법으로 사용되었다 (표 4). 시약 (7a)은 디클로로메탄/아세토니트릴 (1/1) 중의 0.1 M 용액으로서 사용되었고, 시약 (7b) 및 (7c)는 아세토니트릴 중의 0.1 M 용액으로서 사용되었다. 고체 지지체는 1000 Å 공극 크기를 갖는 3'-DMT-dT 숙시네이트로 부하된 조절 공극 유리 (CPG, 펜실베니아주 애스톤, Prime Synthesis)로 패킹된 ABI 스타일 프릿(fritted) 컬럼이다. 탈보호는 아세토니트릴 중의 20% 디에틸아민에 의한 처리에 의해 수행되었고, 가스상 메틸아민 분열 및 탈보호가 35 ℃에서 2 시간 동안 이어졌다. 생성물의 실체 및 전체 길이% (%FL)는 Agilent 1290 Infinity 상에서 Acquity OST CI 8 컬럼 1.7 μm 2.1x100mm (메사추세츠주 밀포드, Waters Corp.)를 사용하는 Agilent 6130B 단일 사중 극자 질량 분석기 검출기에 의해 11 분에 0 내지 25 % B의 구배를 사용하여 결정되었다 (완충액 A: 100 mM 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올, 8.6 mM 트리에틸아민, pH 8.25; 완충액 B: 90 % 아세토니트릴 중의 10% 완충액 A).

표 4 : ABI 3900 커플링 사이클 파라메터 (50 nmol 규모)

중요 용어:

ACN 아세토니트릴

Deblock 톨루엔 중의 10% 디클로로아세트산

활성제 ACN 중의 0.3 M 5-벤질메르캅노테트라졸 및 0.5% N-메틸이미다졸

산화제 44.9% ACN 중의 0.025 M 요오드/45% 피리딘/10.1 % 물

Cap A 피리딘 및 테트라히드로푸란 중의 아세트산 무수물

Cap B 테트라히드로푸란 중의 1-메틸이미다졸

Ar 20초 동안 무수 아르곤 플러시

프라이머 확장 분석: 변형된 뉴클레오시드 트리포스페이트는 모든 가능한 삼중 뉴클레오티드 조합을 함유하는 표준 템플릿을 사용하여 프라이머 확장 분석에서 KOD 엑소뉴클레아제-마이너스 DNA 폴리머라제에 대한 기질로서 평가되었다. 템플릿 서열은 하기과 같았다:

프라이머 서열은 하기과 같았다:

간단히 말해서, 10 p몰의 프라이머는 10 p몰의　³²P-ATP에 의해 37 ℃에서 30 분 동안 7 mM Tris-HCl, 25 ℃, pH 7.6, 10 mM MgCl₂, 5 mM 디티오트레이톨에서 3' 포스파타제 마이너스 T4 폴리뉴클레오티드 카이나제 (New England Biolabs)로 라벨링되었고, 2개의 Sephadex G-50 카트리지 (GE Healthcare)를 통한 통과에 의해 정제되었다. 30 μL 프라이머 확장 반응은 120 mM Tris-HCl, pH 7.8, 10 mM KC1, 7 mM MgS0₄, 6 mM (NH₄)₂S0₄, 0.001 % BSA, 0.1% Triton X-100, 3 p몰의 템플릿, 6 p몰의 프라이머, 및 7.5 유닛의 KOD 엑소뉴클레아제-마이너스 DNA 폴리머라제 (EMD Novagen)을 함유하였다. 반응은 MJ 열순환기 (Bio-Rad) 내의 96-웰 플레이트 내에서 96 ℃에서 30 초 동안 및 65 ℃에서 1 시간 동안 항온되었다.

5개의 μL 시료가 8% 아크릴아미드, 7 M 우레아, lx TBE 겔 (Life Technologies) 상에서 분석되었고 FujiFilm FLA3000 phosphorimager (GE Healthcare) 내에서 주사하기 전에 이미징 플레이트 상에서 1시간 동안 노출되었다.

실시예 6: 시티딘-5- 카르복스아미드를 갖는 핵산 분자들의 합성

변형된 뉴클레오티드

이 실시예는 시티딘-5-카르복스아미드 변형된 뉴클레오티드를 갖는 핵산 분자들의 제조 방법을 제공한다.

CEP (포스포라미다이트) 시약 (7a-c; 반응식 1, 실시예 1)은 자동화된 합성기 상에서 고체상 올리고뉴클레오티드 합성의 사용에 대해 시험되었따. 각각의 새로운 아미다이트 시약에 대해, 34개 내지 39개 뉴클레오티드 길이 (또는 34, 35, 36, 37, 38 또는 39개 뉴클레오티드 길이)로 변화하는 6개의 상이한 올리고뉴클레오티드는 아래 나타낸 모델 서열을 기준으로 연속적인 내부 위치에서 0, 1, 2, 3, 4 또는 5 시티딘-5-카르복스아미드 변형된 뉴클레오티드의 삽입에 의해 합성되었다. 서열 내의 "X"는 서열 내의 시티딘-5-카르복스아미드 변형된 뉴클레오티드의 위치를 지시한다.

아래 표 5는 올리고뉴클레오티드의 % 수율이 0 내지 5 시티딘-5-카르복스아미드 변형된 뉴클레오티드로부터 합성됨을 요약한다.

표 5 : 변형된 2'- 데옥시시티딘을 혼입한 합성 DNA 서열

그 결과는 변형된 시티딘 포스포라미다이트 (7a-c)의 1 내지 3 순차 커플링에 대한 전체 길이 합성 수율이 미변형된 DNA 포스포라미다이트에 필적하였음을 지시한다. 수율의 일부 손실은 변형된 시티딘의 4 또는 5 순차 커플링에 대해 관찰되었다; 그러나 현저한 양의 전체 길이 생성물이 얻어졌고 모든 경우에 확인되었다.

실시예 7: KOD DNA 폴리머라제에 의한 시티딘-5- 카르복스아미드 변형된 뉴클레오티드의 트리포스페이트 시약 (TPP 시약)의 혼입

이 실시예는 시티딘-5-카르복스아미드 변형된 뉴클레오티드 (반응식 2의 9a, 9b 및 9c)가 KOD 엑소뉴클레아제-마이너스 DNA 폴리머라제에 의해 기질로서 사용될 수 있음을 보여준다.

아래 도 1은 프라이머 확장 분석의 결과를 보여준다. 모두 3개의 변형된 시티딘 트리포스페이트가 적어도 이 분석에서 천연의 미변형된 2'-데옥시시티딘만큼 효율적으로 혼입되었다.

요약하자면, 5'-O-트리포스페이트 및 3'-O-CEP 포스포라미다이트 각각으로 시티딘-5-카르복스아미드 변형된 뉴클레오티드를 합성하는 실질적인 공정은 앱타머들의 시험관 내 선택 및 후-SELEX 최적화를 위한 값진 새로운 시약을 제공한다.

실시예 8: SELEX에 의한 시티딘-5- 카르복스아미드 변형된 뉴클레오티드 앱타머들의 선택

이 실시예는 시티딘-5-카르복스아미드 변형된 뉴클레오티드 앱타머들이 SELEX에 의해 단백질 표적에 대한 결합을 위해 선택될 수 있음을 보여준다. 더욱이, 이 실시예는 SELEX로부터 유도된 시티딘-5-카르복스아미드 변형된 뉴클레오티드 앱타머들 대 동일한 단백질 표적에 대해 SELEX로부터 유도된 우리딘-5-카르복스아미드 변형된 뉴클레오티드 앱타머들에 대한 특이적 단백질 표적의 비교를 보여준다.

4개의 상이한 단백질이 SELEX에 대한 표적으로서 사용되었다: PCSK9, PSMA, ERBB2 및 ERBB3.

변형된 랜덤 라이브러리는 표준 올리고뉴클레오티드 합성 프로토콜을 사용하는 KOD DNA 폴리머라제를 사용하여 효소적으로 합성되었다. 랜덤 라이브러리는 "dC/dT"로서 라벨링된 대조군 라이브러리를 포함하였고, 어떠한 C-5 변형된 뉴클레오티드; NapdC 라이브러리, NapdU (5-[N-(l-나프틸메틸)카르복스아미드]-2'-데옥시우리딘) 라이브러리, PPdC 라이브러리 및 PPdU (5-[N-(페닐-3-프로필)카르복스아미드]-2'-데옥시우리딘) 라이브러리도 함유하지 않았다. 모든 랜덤 라이브러리는 라이브러리당 적어도 5 nmole 최종 생성물을 표적화하는 동일한 조건을 사용하여 효소적으로 합성되었다 (출발 안티센스 템플릿으로부터 50-60% 수율). 조악한 라이브러리는 10 kDa NMW 차단 한외 여과 원심 분리 장치를 사용하여 증폭되었다. 증폭된 생성물은 SPIN-X 마이크로 원심 분리 튜브를 사용하여 임의의 스트렙타빈 (SA) 아가로스 비드를 제거하기 위해 스핀 다운되었고, 260 nm에서 흡광도를 측정하고 추정된 흡광 계수를 사용함으로써 정량화되었다. 각각의 변형된 센스 라이브러리는 비오티닐화된 안티센스 가닥의 오염에 대해 자유 SA를 이동시키는 것에 대한 그것의 불능 및 또한 표준 PCR 증폭 조건에 대해 품질 관리되었다 (데이터는 도시되지 않음).

C-말단 폴리 His 태그를 갖고 인간 293 (HEK293) 셀에서 생성된 재조합 인간 PCSK9 단백질 Gln31-Gln692 (75.1 kDa)는 ACRO Biosystems (Cat# PC9-H5223)으로부터 얻어졌다. 이 단백질은 글리코실화되고, 자동-단백질 가수분해로 쪼개진 DTT-감소된 단백질은 SDS-PAGE 겔 상에서 20 KDa (프로도메인) 및 62 kDa (성숙한 분비된 단백질) 폴리펩티드로서 참여한다.

재조합 인간 PSMA (~110 kDa)는 R&D Systems (Cat# 4234-ZN-010) 로부터 얻었고, 이는 N-말단 6XHis 태그를 갖는 CHO-유도된 Lys44-Ala750이었다.

C-말단 폴리 His 태그를 갖고 인간 293 (HEK293) 셀에서 생성된 재조합 인간 ErbB2 단백질 Thr23-Thr652 (72.4 kDa)는 ACRO Biosystems (Cat# HE2-H5225)로부터 얻었다. 글리코실화의 결과로서, DTT-감소된 단백질은 이러한 표적에 대해 SDS-PAGE 상에서 90-110 kDa 범위에서 이주한다.

C-말단 6XHis 태그를 갖고 인간 293 (HEK293) 셀에서 생성된 재조합 인간 ErbB3 단백질 Ser20 - Thr643 (71.5 kDa)는 ACRO Biosystems (Cat# ER3-H5223)로부터 얻었다. 글리코실화의 결과로서, DTT-감소된 단백질은 이러한 표적에 대해 SDS-PAGE 상에서 100-110 kDa 범위에서 이주한다.

SELEX에 사용된 모든 표적은 자기 Dynabeads® His-태그 캡처 비드 생명 기술 (Cat# 10104D)을 사용하여 그들의 순도 및 파티션 캡처 효능에 대해 점검되었다. 모든 표적은 His 태그 캡처 비드를 사용하여 효율적으로 캡처링되었다.

SELEX 프로토콜 (5 mM DxS04 역학적 도전 출발 라운드 2)이 모든 선택 단계들에 대해 이어졌다. 라운드 1에 대해, 각각의 SELEX 실험에 대해 1000 pmole (~10¹⁵　서열) 랜덤 라이브러리가 사용되었다. 표적들은 50 pmole 농도 (500 μg His 캡처 비드 상에서 캡처됨)였고, 착물들은 37 ℃에서 1 시간 동안 평형화되었고, 1XSB18, 0.05% TWEEN20으로 여러 번 세척되었다. 선택된 서열들은 20 mM NaOH에 의해 용출되었고, 중화되었고, 5' OH 프라이머 및 3' 비오티닐화된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭되었다. 증폭된 이중-가닥 미변형된 DNA는 SA 자기 비드 상에서 캡처링되었고, 세척되고, 센스 DNA는 완전히 용리되었고, 프라이머는 SELEX 실험의 하기 라운드에 사용되어야 할 농축된 변형된 풀을 재생하기 위해 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 확장되었다.

전체 6회의 선택 라운드가 완료되었다. 일반적으로, +/- 단백질 선택 시료에 대한 C_t　차이가 아마도 서열의 어떠한 추가의 농축도 지시하지 않음을 개선하고 있지 않을 경우에 시료는 1 nM 단백질 농도였고, SELEX는 라운드 6에서 정지되었고, 변형된 센스 eDNA가 모든 시료에 대해 만들어졌고, 각각의 표적에 대한 풀 친화도 수행되었다. PCR 증폭되고 용출된 센스 DNA 가닥이 하기 SELEX 라운드에 직접적으로 사용될 수 있다하더라도, 미변형된 대조군 DNA 농축된 라이브러리는 변형된 라이브러리와 유사한 방식으로 처리되었음이 주목되어야 한다.

eDNAs는 방사능-표지되었고, 여과 결합 분석은 모든 농축된 풀에 대해 수행되었고, 상응하는 출발 랜덤 라이브러리와 비교되었다. 랜덤 라이브러리는 4개의 단백질에 결합하지 않았다. 표 6은 4개의 단백질 표적 PCSK9, PSMA, ERBB2 및 ERBB3에 대한 친화도 데이터 결과를 보여준다.

표 6 : 6 라운드의 SELEX 후 표적 풀(pool) 친화도 데이터

표 6에 나타낸 바와 같이, SELEX를 통해 PSMA 표적 단백질에 대한 결합을 위해 농축된 적어도 하나의 C-5 변형된 사이토딘 뉴클레오티드를 갖는 핵산 앱타머들의 풀에 대한 평균 결합 친화도 (K_d)는 동일한 단백질에 반하여 NapdU를 갖는 핵산 앱타머들의 풀에 대해 7.8 nM임에 비교하여 0.86 nM (NapdC)였고; 동일한 단백질에 반하여 PPdU를 갖는 핵산 앱타머들의 풀에 대해 6.79 nM임에 비교하여 6.32 nM (PPdC)였다. SELEX를 통해 ERBB3 표적 단백질에 대한 결합을 위해 농축된 적어도 하나의 C-5 변형된 사이토딘 뉴클레오티드를 갖는 핵산 앱타머들의 풀에 대한 평균 결합 친화도 (K_d)는 동일한 단백질에 반하여 NapdU를 갖는 핵산 앱타머들의 풀에 대해 0.38 nM임에 비교하여 0.25 nM (NapdC)였다.

단백질들 PSCK9, PSMA, ERBB2 및 ERBB3에 대한 결합을 위해 농축된 핵산 앱타머들의 SELEX 풀의 추가의 분석은 적어도 하나의 C-5 변형된 사이토딘 뉴클레오티드를 갖는 핵산 앱타머들에 의해 수행된 SELEX가 적어도 하나의 C-5 변형된 우리딘 뉴클레오티드를 갖는 핵산 앱타머들에 의해 수행된 SELEX에 비교하여 더 큰 수의 다중 사본 (2개의 사본 이상)의 핵산 서열들을 제공하였음을 보였다. 아래 표 7은 NapdC, NapdU, PPdC 및 PPdU에 의해 수행된 SELEX의 차이를 요약한다.

표 7 : 6 라운드의 SELEX 후 다중 사본 (>2) 시퀀스의 수

일반적으로, 표 7은 C-5 변형된 사이토딘 뉴클레오티드가 SELEX를 통해 표적 단백질 결합에 대해 농축된 핵산 앱타머 서열들의 풀에서 2개 이상의 사본을 갖는 많은 서열들을 제공함을 보여준다. 따라서, 일반적으로, 단백질 표적에 반하여 SELEX에서 C-5 변형된 사이토딘 뉴클레오티드는 더 큰 다양성의 다중 사본 핵산 서열들을 제공하고, 이는 결과적으로 단백질 결합 시약 및/또는 치료제로서 추가의 특성화 및 개발을 위해 선택하기 위한 많은 수의 핵산 앱타머들을 제공한다. 이러한 유리한 C-5 변형된 사이토딘 뉴클레오티드는 특정 목적 (예, 분석 - 풀-다운 분석을 위한 단백질 결합제, 단백질 정제, 질량 분광학; 시약 툴 및/또는 치료제 - 단백질 작용제 또는 길항제)을 위해 핵산 앱타머를 개발하는 것과 연관된 도전에 비추어 더 잘 실현된다. 더 큰 수의 다중 사본 핵산 앱타머는 선별될 수 있고 특정 목적을 위해 추가로 개발될 수 있고, 그러한 개발의 실패율을 감소시키는 많은 수의 서열들을 제공한다.

<110> SomaLogic, Inc. <120> Cytidine-5-Carboxamide Modified Nucleotide Compositions and Methods Related Thereto <130> 0057.65PCT <150> US 61/907,274 <151> 2013-11-21 <160> 3 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 ttttttttct tcttctcctt tctcttccca aaatcacacg gacccagggc attctagata 60 tggtttacgc tcaagcgaac ttgccgtcct gagtgtaaag agggaaagag ggcagggtgt 120 ggcatatata t 131 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 atatatatgc cacaccctgc cctc 24 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (18)..(22) <223> cytidine-5-carboxamide modified nucleotides, these nucleotides may be absent. <400> 3 gagtgaccgt ctgcctgnnn nncagacgac gagcggga 38

Claims

하기 화학식 I로 나타낸 구조를 포함하는 화합물 또는 이의 염.

상기 식 중에서,
R은 독립적으로 -(CH₂)_n-이고 (여기서 n은 0, 1, 2 또는 3임);
R^X1은 독립적으로 하기로 구성된 군으로부터 선택되고:

*는 -(CH₂)_n- 기에 대한 R^X1 기의 부착 지점을 나타내고;
R^X4는 독립적으로 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C20); 히드록실기; 할로겐 (F, Cl, Br, I); 니트릴 (CN); 붕소산 (B0₂H₂); 카르복실산 (COOH); 카르복실산 에스테르 (COOR^X2); 1차 아미드 (CONH₂); 2차 아미드 (CONHR^X2); 3차 아미드 (CONR^X2R^X3); 술폰아미드 (SO₂NH₂); N-알킬술폰아미드 (SONHR^X2)로 구성된 군으로부터 선택되며;
R^X2　및 R^X3은 각각의 경우에 대해 독립적으로 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C20); 페닐 (C₆H₅); R^X4치환된 페닐 고리 (R^X4C₆H₄) (여기서 R^X4는 상기 정의됨); 카르복실산 (COOH); 카르복실산 에스테르 (COOR^X5) (여기서 R^X5는 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C20)임); 및 시클로알킬로 구성된 군으로부터 선택되고;
X는 독립적으로 -H, -OH, -OMe, -O-CHCH₂, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃　및 -아지도로 구성된 군으로부터 선택되며;
R'는 독립적으로 -H, -Ac; -Bz; -P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN); 및 -SiMe₂tBu로 구성된 군으로부터 선택되고;
R"는 독립적으로 수소, 4,4'-디메톡시트리틸 (DMT) 및 트리포스페이트 (-P(0)(OH)-0-P(0)(OH)-0-P(0)(OH)₂) 또는 이들의 염으로 구성된 군으로부터 선택되며;
단,
n = 2이고, R^X1이
이며, R^X4가 히드록실인 경우, R^X1은
일 수 없는 예외를 갖는다.
제 1항에 있어서, 상기 R^X4가 독립적으로 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C6); -OH; -F 및 카르복실산 (COOH)로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 X는 독립적으로 -H, -OH, -OMe 및 -F로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 R'가 -H, -Ac 및 -P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN)로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 R"가 트리포스페이트 (-P(0)(OH)-0-P(0)(OH)-0-P(0)(OH)₂)인 화합물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 핵산 분자.
하기 화학식 I로 나타낸 구조를 포함하는 화합물 또는 이의 염.

상기 식 중에서,
R은 독립적으로 -(CH₂)_n-이고 (여기서 n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10임);
R^X1은 독립적으로 하기로 구성된 군으로부터 선택되고:

*는 -(CH₂)_n- 기에 대한 R^X1 기의 부착 지점을 나타내고;
R^X4는 독립적으로 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C20); 히드록실기; 할로겐 (F, Cl, Br, I); 니트릴 (CN); 붕소산 (B0₂H₂); 카르복실산 (COOH); 카르복실산 에스테르 (COOR^X2); 1차 아미드 (CONH₂); 2차 아미드 (CONHR^X2); 3차 아미드 (CONR^X2R^X3); 술폰아미드 (SO₂NH₂); N-알킬술폰아미드 (SONHR^X2)로 구성된 군으로부터 선택되며;
R^X2　및 R^X3은 각각의 경우에 대해 독립적으로 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C20); 페닐 (C₆H₅); R^X4치환된 페닐 고리 (R^X4C₆H₄) (여기서 R^X4는 상기 정의됨); 카르복실산 (COOH); 카르복실산 에스테르 (COOR^X5) (여기서 R^X5는 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C20)임); 및 시클로알킬로 구성된 군으로부터 선택되고;
X는 독립적으로 -H, -OH, -OMe, -O-CHCH₂, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃　및 -아지도로 구성된 군으로부터 선택되며;
R'는 독립적으로 -H, -Ac; -Bz; -P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN); 및 -SiMe₂tBu로 구성된 군으로부터 선택되고;
R"는 독립적으로 수소, 4,4'-디메톡시트리틸 (DMT) 및 트리포스페이트 (-P(0)(OH)-0-P(0)(OH)-0-P(0)(OH)₂) 또는 이들의 염으로 구성된 군으로부터 선택되며;
단,
n = 2이고, R^X1이
이며, R^X4가 히드록실인 경우, R^X1은
일 수 없는 예외를 갖는다.
제 7항에 있어서, 상기 R^X4가 독립적으로 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C6); -OH; -F 및 카르복실산 (COOH)로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물.
제 7항에 있어서, 상기 X는 독립적으로 -H, -OH, -OMe 및 -F로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물.
제 7항에 있어서, 상기 R'가 -H, -Ac 및 -P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN)로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물.
제 7항 내지 제10항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 핵산 분자.
하기 화합식 IX를 갖는 화합물을 제공하는 단계;
상기 화학식 IX을 갖는 화합물을 R^X1-R-NH₂, 일산화탄소(carbon monoxide) 및 용매(solvent)의 존재하에서 팔라듐(0)(palladium(0)) 촉매 반응을 통해 변환시키는 단계; 및
하기 화학식 I을 갖는 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법으로,

상기 화학식에서,
R은 독립적으로 -(CH₂)_n-이고 (여기서 n은 0, 1, 2 또는 3임);
R^X1은 독립적으로 하기로 구성된 군으로부터 선택되고:

*는 -(CH₂)_n- 기에 대한 R^X1 기의 부착 지점을 나타내고;
R^X4는 독립적으로 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C20); 히드록실기; 할로겐 (F, Cl, Br, I); 니트릴 (CN); 붕소산 (B0₂H₂); 카르복실산 (COOH); 카르복실산 에스테르 (COOR^X2); 1차 아미드 (CONH₂); 2차 아미드 (CONHR^X2); 3차 아미드 (CONR^X2R^X3); 술폰아미드 (SO₂NH₂); N-알킬술폰아미드 (SONHR^X2)로 구성된 군으로부터 선택되며;
R^X2　및 R^X3은 각각의 경우에 대해 독립적으로 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C20); 페닐 (C₆H₅); R^X4치환된 페닐 고리 (R^X4C₆H₄) (여기서 R^X4는 상기 정의됨); 카르복실산 (COOH); 카르복실산 에스테르 (COOR^X5) (여기서 R^X5는 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C20)임); 및 시클로알킬로 구성된 군으로부터 선택되고;
X는 독립적으로 -H, -OH, -OMe, -O-CHCH₂, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃　및 -아지도로 구성된 군으로부터 선택되며;
R'는 독립적으로 -H, -Ac; -Bz; -P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN); 및 -SiMe₂tBu로 구성된 군으로부터 선택되고; 및
R"는 독립적으로 수소, 4,4'-디메톡시트리틸 (DMT) 및 트리포스페이트 (-P(0)(OH)-0-P(0)(OH)-0-P(0)(OH)₂) 또는 이들의 염으로 구성된 군으로부터 선택되며;

상기 화학식에서,
R^X6은 요오드(iodine) 또는 브롬(bromine) 기(group)이고,
R^X7및R^X8은 각 경우에 독립적으로, 수소 또는 보호기이며,
X는 독립적으로 -H, -OH, -OMe, -O-CHCH₂, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃　및 -아지도로 구성된 군으로부터 선택된다.
제 12항에 있어서, 상기 R^X4가 독립적으로 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C6); -OH; -F 및 카르복실산 (COOH)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제조방법.
제 12항에 있어서, 상기 R'가 -H, -Ac 및 -P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제조방법.
제 12항에 있어서, 상기 R"가 수소, 트리포스페이트 (-P(0)(OH)-0-P(0)(OH)-0-P(0)(OH)₂) 또는 이들의 염인 것인 제조방법.
하기 화합식 IX를 갖는 화합물을 제공하는 단계;
상기 화학식 IX을 갖는 화합물을 R^X1-R-NH₂, 일산화 탄소(carbon monoxide) 및 용매(solvent)의 존재하에서 팔라듐(0)(palladium(0)) 촉매 반응을 통해 변환시키는 단계; 및
하기 화학식 I을 갖는 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법으로,

상기 화학식에서,
R은 독립적으로 -(CH₂)_n-이고 (여기서 n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10임);
R^X1은 독립적으로 하기로 구성된 군으로부터 선택되고:

*는 -(CH₂)_n- 기에 대한 R^X1 기의 부착 지점을 나타내고;
R^X4는 독립적으로 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C20); 히드록실기; 할로겐 (F, Cl, Br, I); 니트릴 (CN); 붕소산 (B0₂H₂); 카르복실산 (COOH); 카르복실산 에스테르 (COOR^X2); 1차 아미드 (CONH₂); 2차 아미드 (CONHR^X2); 3차 아미드 (CONR^X2R^X3); 술폰아미드 (SO₂NH₂); N-알킬술폰아미드 (SONHR^X2)로 구성된 군으로부터 선택되며;
R^X2　및 R^X3은 각각의 경우에 대해 독립적으로 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C20); 페닐 (C₆H₅); R^X4치환된 페닐 고리 (R^X4C₆H₄) (여기서 R^X4는 상기 정의됨); 카르복실산 (COOH); 카르복실산 에스테르 (COOR^X5) (여기서 R^X5는 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C20)임); 및 시클로알킬로 구성된 군으로부터 선택되고;
X는 독립적으로 -H, -OH, -OMe, -O-CHCH₂, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃　및 -아지도로 구성된 군으로부터 선택되며;
R'는 독립적으로 -H, -Ac; -Bz; -P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN); 및 -SiMe₂tBu로 구성된 군으로부터 선택되고; 및
R"는 독립적으로 수소, 4,4'-디메톡시트리틸 (DMT) 및 트리포스페이트 (-P(0)(OH)-0-P(0)(OH)-0-P(0)(OH)₂) 또는 이들의 염으로 구성된 군으로부터 선택되며;

상기 화학식에서,
R^X6은 요오드(iodine) 또는 브롬(bromine) 기(group)이고,
R^X7및R^X8은 각 경우에 독립적으로, 수소 또는 보호기이며, 및
X는 독립적으로 -H, -OH, -OMe, -O-CHCH₂, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃　및 -아지도로 구성된 군으로부터 선택된다.
제 16항에 있어서, 상기 n은 1, 2 또는 3인 제조방법.
제 16항에 있어서, 상기 R^X4가 독립적으로 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C6); -OH; -F 및 카르복실산 (COOH)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제조방법.
제 16항에 있어서, 상기 R'가 -H, -Ac 및 -P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제조방법.
제 16항에 있어서, 상기 보호기가 트리페닐메틸, p-아니실디페닐메틸, 디-p-아니실디페닐메틸, p-디메톡시 트리틸트리틸, 포르밀, t-부틸옥시카르보닐, 벤질옥시카르보닐, 2-클로로벤질옥시카르보닐, 4-클로로벤조일옥시카르보닐, 2,4-디클로로벤질옥시카르보닐, 푸르푸릴카르보닐, t-아밀옥시카르보닐, 아다만틸옥시카르보닐, 2-페닐프로필-(2)-옥시카르보닐, 2-(4-비페닐)프로필-(2)-옥시카르보닐, 2-니트로페닐술페닐 및 디페닐포스피닐로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제조방법.
하기 화합식 IX를 갖는 화합물을 제공하는 단계;
상기 화학식 IX을 갖는 화합물을 R^X1-R-NH₂, 일산화 탄소(carbon monoxide) 및 용매(solvent)의 존재하에서 팔라듐(0)(palladium(0)) 촉매 반응을 통해 변환시키는 단계; 및
하기 화학식 I을 갖는 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법으로,

상기 화학식에서,
R은 독립적으로 -(CH₂)_n-이고 (여기서 n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10임);
R^X1은 독립적으로 하기로 구성된 군으로부터 선택되고:

*는 -(CH₂)_n- 기에 대한 R^X1 기의 부착 지점을 나타내고;
R^X4는 독립적으로 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C20); 히드록실기; 할로겐 (F, Cl, Br, I); 니트릴 (CN); 붕소산 (B0₂H₂); 카르복실산 (COOH); 카르복실산 에스테르 (COOR^X2); 1차 아미드 (CONH₂); 2차 아미드 (CONHR^X2); 3차 아미드 (CONR^X2R^X3); 술폰아미드 (SO₂NH₂); N-알킬술폰아미드 (SONHR^X2)로 구성된 군으로부터 선택되며;
R^X2　및 R^X3은 각각의 경우에 대해 독립적으로 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C20); 페닐 (C₆H₅); R^X4치환된 페닐 고리 (R^X4C₆H₄) (여기서 R^X4는 상기 정의됨); 카르복실산 (COOH); 카르복실산 에스테르 (COOR^X5) (여기서 R^X5는 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C20)임); 및 시클로알킬로 구성된 군으로부터 선택되고;
X는 독립적으로 -H, -OH, -OMe, -O-CHCH₂, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃　및 -아지도로 구성된 군으로부터 선택되며;
R'는 독립적으로 -H, -Ac; -Bz; -P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN); 및 -SiMe₂tBu로 구성된 군으로부터 선택되고; 및
R"는 독립적으로 수소, 4,4'-디메톡시트리틸 (DMT) 및 트리포스페이트 (-P(0)(OH)-0-P(0)(OH)-0-P(0)(OH)₂) 또는 이들의 염으로 구성된 군으로부터 선택되며;

상기 화학식에서,
R^X6은 요오드(iodine) 또는 브롬(bromine) 기(group)이고,
R^X7및R^X8은 각 경우에 독립적으로, 수소 또는 보호기이며, 상기 보호기는 트리페닐메틸, p-아니실디페닐메틸, 디-p-아니실디페닐메틸, p-디메톡시 트리틸트리틸, 포르밀, t-부틸옥시카르보닐, 벤질옥시카르보닐, 2-클로로벤질옥시카르보닐, 4-클로로벤조일옥시카르보닐, 2,4-디클로로벤질옥시카르보닐, 푸르푸릴카르보닐, t-아밀옥시카르보닐, 아다만틸옥시카르보닐, 2-페닐프로필-(2)-옥시카르보닐, 2-(4-비페닐)프로필-(2)-옥시카르보닐, 2-니트로페닐술페닐 및 디페닐포스피닐로 구성된 군으로부터 선택되며, 및
X는 독립적으로 -H, -OH, -OMe, -O-CHCH₂, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃　및 -아지도로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 제조방법.
제 21항에 있어서, 상기 X는 -H, -OMe 및 -F로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제조방법.
제 21항에 있어서, 상기 n은 1, 2, 또는 3인 것인 제조방법.
제 21항에 있어서, 상기 R^X4가 독립적으로 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C6); -OH; -F 및 카르복실산 (COOH)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제조방법.
제 21항에 있어서, 상기 R'가 -H, -Ac 및 -P(NiPr₂)(OCH₂CH₂CN)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제조방법.
제 21항에 있어서, 상기 R"가 수소, 트리포스페이트 (-P(0)(OH)-0-P(0)(OH)-0-P(0)(OH)₂) 또는 이들의 염인 것인 제조방법.
제 12항, 제 16항 및 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R^X6은 요오드(iodine) 기인 제조방법.
제 12항, 제 16항 및 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R^X7및R^X8은 수소인 제조방법.
제 12항, 제 16항 및 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 팔라듐(0) 촉매 반응은 0.1 및 2 기압 사이의 일산화탄소 압력하에서 수행되는 것인 제조방법.
제 12항, 제 16항 및 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용매는 디메틸포름아미드 (DMF), 디클로로메탄 (DCM), 테트라히드로푸란 (THF), 에틸 아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴 (MeCN), 디메틸 술폭사이드 (DMSO) 및 프로필렌 카보네이트로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 제조방법.
복수개의 뉴클레오티드 및 화학식 IA로 표시되는 적어도 하나의 화합물을 갖는 핵산 분자를 합성하는 단계를 포함하는 하기 화학식 IA를 갖는 화합물을 포함하는 핵산 분자의 제조 방법으로,

상기 화학식에서,
R은 독립적으로 -(CH₂)_n-이고 (여기서 n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10임);
R^X1은 독립적으로 하기로 구성된 군으로부터 선택되고:

*는 -(CH₂)_n- 기에 대한 R^X1 기의 부착 지점을 나타내고;
R^X4는 독립적으로 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C20); 히드록실기; 할로겐 (F, Cl, Br, I); 니트릴 (CN); 붕소산 (B0₂H₂); 카르복실산 (COOH); 카르복실산 에스테르 (COOR^X2); 1차 아미드 (CONH₂); 2차 아미드 (CONHR^X2); 3차 아미드 (CONR^X2R^X3); 술폰아미드 (SO₂NH₂); N-알킬술폰아미드 (SONHR^X2)로 구성된 군으로부터 선택되며;
R^X2　및 R^X3은 각각의 경우에 대해 독립적으로 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C20); 페닐 (C₆H₅); R^X4치환된 페닐 고리 (R^X4C₆H₄) (여기서 R^X4는 상기 정의됨); 카르복실산 (COOH); 카르복실산 에스테르 (COOR^X5) (여기서 R^X5는 분지된 또는 선형 저급 알킬 (C1 내지 C20)임); 및 시클로알킬로 구성된 군으로부터 선택되고; 및
X는 독립적으로 -H, -OH, -OMe, -O-CHCH₂, -F, -OEt, -OPr, -OCH₂CH₂OCH₃　및 -아지도로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 제조방법.
(a) 후보 혼합물을 표적 분자와 접촉시키는 단계로, 상기 후보 혼합물은 제 1항 내지 제 5항 및 제 7항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 적어도 하나의, 또는 각각의 핵산 앱타머를 포함하고, 상기 핵산 앱타머는 상기 표적 분자에 대한 결합 친화도를 가져 핵산 앱타머-표적 분자 착물을 형성하며;
(b) 상기 핵산 앱타머-표적 분자 착물을 상기 후보 혼합물로부터 분할하는 단계;
(c) 상기 핵산 앱타머-표적 분자 착물을 해리시켜 유리 핵산 앱타머를 생성하는 단계;
(d) 상기 유리 핵산 앱타머들을 증폭시켜, 상기 후보 혼합물 내의 다른 핵산과 비교하여 상기 표적 분자로부터 증가된 해리 반감기를 갖는 핵산 앱타머를 산출하는 단계; 및
(e) 제 1항 내지 제 5항 및 제 7항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하고 상기 표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는, 적어도 하나의 핵산 앱타머를 식별하는 단계;
를 포함하는 표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 핵산 앱타머를 선택하는 방법.
제 32항에에 있어서,
상기 단계 a) 내지 d)는 상기 표적 분자에 결합할 수 있는 핵산 서열로 농축(enriched)되고 상기 표적 분자에 결합할 때 느린 오프-속도를 갖는 핵산 앱타머의 혼합물로 반복 수행되어 상기 표적 분자에 결합할 수 있는 핵산 서열이 추가로 농축(enriched)되고 상기 표적 분자에 결합할 때 느린 오프-속도를 갖도록 하는 표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 핵산 앱타머를 선택하는 방법.
제 32항에 있어서, 상기 핵산 앱타머의 해리 속도는 2 분 내지 360 분인, 표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 핵산 앱타머를 선택하는 방법.
제 32항에 있어서, 상기 핵산 앱타머의 해리 속도는 2 분 이상인, 표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 핵산 앱타머를 선택하는 방법.
제 32항에 있어서, 상기 표적 분자는 단백질 또는 펩타이드인 표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 핵산 앱타머를 선택하는 방법.
제 32항에 있어서, 상기 표적 분자는 PSCK9(a proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) 단백질, PSMA(a prostate-specific membrane antigen) 단백질, ERBB2(a receptor tyrosine-protein kinase erbB-2) 단백질 및 ERBB3(a receptor tyrosine-protein kinase erbB-3) 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 핵산 앱타머를 선택하는 방법.
제 32항에 있어서, 상기 적어도 하나의 핵산 앱타머는 100 nM 미만의 평형 결합 상수 (K_d)를 갖는 상기 표적 분자에 결합할 수 있는 것인, 표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 핵산 앱타머를 선택하는 방법.
제 32항에 있어서, 상기 후보 혼합물을 느린 오프-속도 농축 공정에 노출시키는 단계를 추가로 포함하는, 표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 핵산 앱타머를 선택하는 방법.
제 39항에 있어서, 상기 느린 오프-속도 농축 공정이 단계 (b)에 앞서 수행되는, 표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 핵산 앱타머를 선택하는 방법.
제 39항에 있어서, 상기 느린 오프-속도 농축 공정이 경쟁자 분자를 첨가하는 단계, 희석 단계, 희석 단계 이후 경쟁자 분자를 첨가하는 단계의 조합, 경쟁자 분자를 첨가하는 단계 이후 희석 단계의 조합, 및 경쟁자 분자를 동시에 첨가하는 단계와 희석 단계의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 핵산 앱타머를 선택하는 방법.
제 41항에 있어서, 상기 경쟁자 분자가 폴리음이온(polyanion)인, 표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 핵산 앱타머를 선택하는 방법.
제 41항에 있어서, 상기 경쟁자 분자가 올리고뉴클레오티드, dNTPs(nucleoside triphosphate), 헤파린 및 덱스트란 설페이트로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 표적 분자에 대한 결합 친화도를 갖는 핵산 앱타머를 선택하는 방법.
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