CN105658658A - 胞苷-5-甲酰胺修饰的核苷酸组合物及其相关方法 - Google Patents
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Abstract
本文描述的是5-位修饰的胞嘧啶核苷酸和核苷以及其亚磷酰胺和三磷酸酯衍生物。进一步提供其制备和使用方法,以及作为核酸分子(例如,适体)的一部分的修饰的核苷的组合物和用途。
Description
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求享有2013年11月21日提交的系列号为61/907,274的美国临时申请的优先权,该申请的内容以全文引用的方式并入本文。
领域
本公开一般涉及核酸化学领域,具体地涉及5-位修饰的胞嘧啶以及其亚磷酰胺和三磷酸酯衍生物。本公开还涉及其制备和使用方法。本公开包括作为寡核苷酸或适体的一部分的修饰的核苷的用途。
以全文引用的方式并入本文的标题为“序列0057.65PCT_ST25”的序列表,其创建于2014年10月2日,大小为2千字节。
背景
修饰的核苷已经被用作治疗剂、诊断剂以及用于结合到寡核苷酸当中以改进其性质(例如,稳定性)。
SELEX(用于指数富集的配体的***演化)是用于识别选择性地结合靶分子的寡核苷酸(被称为“适体”)的方法。SELEX法描述于第5,270,163号美国专利中,该专利的内容以全文引用的方式并入本文。SELEX方法涉及自寡核苷酸的随机混合物来选择和识别寡核苷酸以实现结合亲和力及选择性的几乎任何所需的标准。通过对SELEX法的过程中识别的寡核苷酸引入特定类型的修饰的核苷,可以改变核酸酶稳定性、净电荷、亲水性或亲脂性以提供寡核苷酸的三维结构和靶结合能力方面的差异。因此,不同修饰的核苷提供“调整”在SELEX的过程中选定的寡核苷酸的所需性质的能力。
已证实在5-位上携带N-取代的甲酰胺基团的修饰的脱氧尿苷核苷酸是有价值的工具,用于改进蛋白质-结合适体的体外选择(SELEX法)(参见,例如Gold等人,2010;Hollenstein,2012;和Imaizumi等人,2013)以及用于选定适体的结合及药代动力学性质的后SELEX优化(参见,例如Davies,等人,2012;Lee等人,2010;Kerr等人,2000;和Gaballah等人,2002)。尿苷-5-甲酰胺的一般合成依赖于一种共同活化的酯中间体5-(2,2,2-三氟乙氧羰基)-2'-脱氧尿苷(1),其最初由Matsuda及合作者予以报道(参见,例如Nomura等人,1997)。用各种伯胺(1.2当量,60℃,4h)处理此活化酯得到相应的5-(N-取代的甲酰胺)。Matsuda还公开了胞苷系列中类似的活化酯N-乙酰基-5-(2,2,2-三氟乙氧羰基)-2'-脱氧胞苷(参见,例如Nomura等人,1996)。然而,由于N-乙酰基保护基团的不安定性以及N-乙酰基-5-碘-胞苷合成前体的不稳定性,此中间体对于合成胞苷-5-甲酰胺来说较少有实用性。
仍然需要开发用于改进寡核苷酸靶结合剂的替代组合物以及用于合成这类组合物的进一步的方法。本公开通过提供新型的胞苷-5-甲酰胺修饰的组合物来满足这类需求。
发明内容
本公开描述5-位修饰的胞嘧啶以及其亚磷酰胺和三磷酸酯衍生物,并且涉及其制备和使用方法。
在一方面,本公开提供包含式I中所示的结构的化合物及其盐:
其中
R独立地为-(CH2)n-,其中n是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数;
RX1独立地选自:
其中*表示RX1基团与-(CH2)n-基团的附接点;且
其中
RX4独立地选自取代或未取代的支链或直链低级烷基(C1-C20);羟基基团;卤素(F、Cl、Br、I);腈(CN);硼酸(BO2H2);羧酸(COOH);羧酸酯(COORX2);伯酰胺(CONH2);仲酰胺(CONHRX2);叔酰胺(CONRX2RX3);磺酰胺(SO2NH2);N-烷基磺酰胺(SONHRX2);
RX2和RX3每次出现时独立地选自取代或未取代的支链或直链低级烷基(C1-C20);苯基(C6H5);RX4取代的苯环(RX4C6H4),其中RX4定义如上;羧酸(COOH);羧酸酯(COORX5),其中RX5是支链或直链低级烷基(C1-C20);和环烷基,其中RX2和RX3一起形成取代或未取代的5或6元环;
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3、-NH2和-叠氮基;
R'独立地选自-H、-OAc;-OBz;-P(NiPr2)(OCH2CH2CN);和-OSiMe2tBu;
R”独立地选自氢、4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)和三磷酸酯(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2)或其盐;
Z独立地选自-H、取代或未取代的支链或直链低级烷基(C1-C4);
有以下例外:
当n=4时,则RX1不能是H;
当n=3时,则RX1不能是CH3;
当n=0时,则RX1不能是-CH(CH3)2;和
当n=2并且RX1是且RX4是羟基时,则RX1不能是
在相关方面,n是选自1、2或3的整数。
在相关方面,RX1选自:
其中
*表示RX1基团与-(CH2)n-基团的附接点;且
Z独立地选自-H、取代或未取代的支链或直链低级烷基(C1-C4)。
在相关方面,RX4独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C6);-OH;-F和羧酸(COOH)。
在相关方面,X独立地选自-H、-OH、-OMe和-F。
在相关方面,R'选自-H、-OAc和-P(NiPr2)(OCH2CH2CN)。
在相关方面,R"是三磷酸酯(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2)。
在另一方面,本公开提供包含选自式II(BndC)、III(PEdC)、IV(PPdC)、V(NapdC)、VI(2NapdC)、VII(NEdC)和VIII(2NEdC)的结构的化合物:
其中
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3、-NH2和-叠氮基。
在另一方面,本公开提供包含上述化合物任一者的核酸分子。
在相关方面,核酸分子包含RNA、DNA或其组合。
在相关方面,核酸分子长度为15至100个核苷酸。
在相关方面,核酸分子为适体。
在相关方面,核酸分子的至少一个另外的核苷酸包含选自2'-位糖修饰的化学修饰,所述2'-位糖修饰包括但不限于2'-氨基(2'-NH2)、2'-氟(2'-F)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-乙基(2'-OEt)、2'-O-丙基(2'-OPr)、2'-O-CH2CH2OCH3和叠氮基。
在另一方面,本公开提供一种核酸分子,所述核酸分子包含具有式IA中所示的结构的化合物及其盐:
其中
R独立地为-(CH2)n-,其中n是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数;
RX1独立地选自:
其中,*表示RX1基团与-(CH2)n-基团的附接点;且
其中,
RX4独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C20);羟基基团;卤素(F、Cl、Br、I);腈(CN);硼酸(BO2H2);羧酸(COOH);羧酸酯(COORX2);伯酰胺(CONH2);仲酰胺(CONHRX2);叔酰胺(CONRX2RX3);磺酰胺(SO2NH2);N-烷基磺酰胺(SONHRX2);
RX2和RX3每次出现时独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C20);苯基(C6H5);RX4取代的苯环(RX4C6H4),其中RX4定义如上;羧酸(COOH);羧酸酯(COORX5),其中RX5是支链或直链低级烷基(C1-C20);和环烷基,其中RX2和RX3一起形成取代或未取代的5或6元环;
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3、NH2和-叠氮基;
Z独立地选自-H、取代或未取代的C(1-4)烷基;
有以下例外:
当n=4时,则RX1不能是H;
当n=3时,则RX1不能是CH3;
当n=0时,则RX1不能是-CH(CH3)2;和
当n=2并且RX1是且RX4是羟基时,则RX1不能是
在相关方面,n是1、2或3。
在相关方面,RX1选自:
其中,
*表示RX1基团与-(CH2)n-基团的附接点;且
Z独立地选自-H、取代或未取代的C(1-4)烷基。
在相关方面,RX4独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C6);-OH;-F和羧酸(COOH)。
在相关方面,X独立地选自-H、-OH、-OMe和-F。
在相关方面,R'选自-H、-OAc和-P(NiPr2)(OCH2CH2CN)。
在相关方面,R"是三磷酸酯(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2)。
在相关方面,核酸分子包含DNA、RNA或其组合。
在相关方面,核酸分子长度为15至100个核苷酸。
在相关方面,核酸分子为适体。
在相关方面,核酸分子的至少一个另外的核苷酸包含选自2'-位糖修饰的化学修饰,所述2'-位糖修饰独立地选自2'-氨基(2'-NH2)、2'-氟(2'-F)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-乙基(2'-OEt)、2'-O-丙基(2'-OPr)、2'-O-CH2CH2OCH3和叠氮基。
在相关方面,核酸分子还包含选自主链修饰、3'帽、5'帽及其组合的修饰。
在相关方面,化合物包含选自式IIA、IIIA、IVA、VA、VIA、VIIA和VIIIA的结构:
其中
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3、NH2和-叠氮基。
在另一方面,本公开提供制备具有式I的化合物的方法:
其中
R独立地为-(CH2)n-,其中n是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数;
RX1独立地选自:
其中,*表示RX1基团与-(CH2)n-基团的附接点;且
其中,
RX4独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C20);羟基基团;卤素(F、Cl、Br、I);腈(CN);硼酸(BO2H2);羧酸(COOH);羧酸酯(COORX2);伯酰胺(CONH2);仲酰胺(CONHRX2);叔酰胺(CONRX2RX3);磺酰胺(SO2NH2);N-烷基磺酰胺(SONHRX2);
RX2和RX3每次出现时独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C20);苯基(C6H5);RX4取代的苯环(RX4C6H4),其中RX4定义如上;羧酸(COOH);羧酸酯(COORX5),其中RX5是支链或直链低级烷基(C1-C20);和环烷基,其中RX2和RX3一起形成取代或未取代的5或6元环;
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3、NH2和-叠氮基;
Z独立地选自-H、取代或未取代的C(1-4)烷基;
所述方法包括提供具有式IX的化合物
其中,
RX6是碘或溴基团;
RX7和RX8每次出现时独立地为氢或保护基团;
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3、NH2和-叠氮基;以及
在RX1-R-NH2、一氧化碳和溶剂的存在下通过钯(0)催化的反应转化具有式IX的化合物;以及
离析具有式I的化合物。
在相关方面,RX6是碘基团。
在相关方面,RX7和RX8是氢。
在相关方面,X选自-H、-OMe和-F。
在相关方面,n是1、2或3。
在相关方面,RX1选自:
其中,
*表示RX1基团与-(CH2)n-基团的附接点;且
Z独立地选自-H、取代或未取代的C(1-4)烷基。
在相关方面,RX4独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C6);-OH;-F和羧酸(COOH)。
在相关方面,R'选自-H、-OAc和-P(NiPr2)(OCH2CH2CN)。
在相关方面,R"是氢或三磷酸酯(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2)。
在相关方面,保护基团选自三苯基甲基、对甲氧苯基二苯基甲基、二对甲氧苯基二苯基甲基、对二甲氧基三苯甲基三苯甲基、甲酰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基、2-氯苄氧羰基、4-氯苯甲酰氧羰基、2,4-二氯苄氧羰基、糠基羰基、叔戊氧羰基、金刚烷氧羰基、2-苯基丙基-(2)-氧羰基、2-(4-联苯基)丙基-(2)-氧羰基、2-硝基苯基亚磺酰基和二苯基氧膦基。
在相关方面,溶剂选自二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯、丙酮、乙腈(MeCN)、二甲基亚砜(DMSO)和碳酸丙烯酯。
在另一方面,本公开提供制备具有选自式II、III、IV、V、VI、VII和VIII的式的化合物的方法
其中
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3、NH2和-叠氮基;
所述方法包括提供具有式IX的化合物
其中,
RX6是碘或溴基团;
RX7和RX8每次出现时独立地为氢或保护基团;
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3和-叠氮基;以及
在RX1-R-NH2、一氧化碳和溶剂的存在下通过钯(0)催化的反应转化具有式IX的化合物;以及
分离具有选自式II、III和IV的式的化合物。
在相关方面,RX6是碘基团。
在相关方面,RX7和RX8是氢。
在相关方面,X选自-H、-OMe和-F。
在相关方面,保护基团选自三苯基甲基、对甲氧苯基二苯基甲基、二对甲氧苯基二苯基甲基、对二甲氧基三苯甲基三苯甲基、甲酰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基、2-氯苄氧羰基、4-氯苯甲酰氧羰基、2,4-二氯苄氧羰基、糠基羰基、叔戊氧羰基、金刚烷氧羰基、2-苯基丙基-(2)-氧羰基、2-(4-联苯基)丙基-(2)-氧羰基、2-硝基苯基亚磺酰基和二苯基氧膦基。
在相关方面,溶剂选自二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯、丙酮、乙腈(MeCN)、二甲基亚砜(DMSO)和碳酸丙烯酯。
本公开进一步提供选择对靶分子具有结合亲和力的核酸适体的方法,包括:(a)使候选混合物与靶接触,其中候选混合物包含其中候选混合物的至少一种或每种核酸适体中的一种、若干或所有嘧啶包含本文描述的化合物(5-位修饰的胞嘧啶)的修饰的核酸适体,且其中对靶分子具有结合亲和力的核酸适体形成核酸适体-靶分子复合物;(b)自候选混合物分隔核酸适体-靶分子复合物;(c)解离核酸适体-靶分子复合物以生成游离的核酸适体;(d)扩增游离的核酸适体以产生相对于候选混合物中的其它核酸而言自靶分子的解离半衰期增加的核酸适体;(e)识别至少一种核酸适体,其中该核酸适体对靶分子具有结合亲和力。
在另一方面,用富集了能够与靶分子结合并且当结合于靶分子时具有慢解离速率的核酸序列的核酸适体的混合物重复步骤a)到d)以进一步富集能够与靶分子结合并且当结合于靶分子时具有慢解离速率的核酸序列。
在另一方面,慢解离速率核酸适体的解离的速率为约2分钟至约360分钟(或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、45、60、75、90、105、120、150、180、210、240、270、300、330或360分钟)。
在另一方面,慢解离速率核酸适体的解离的速率大于或等于约2分钟(或大于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、45、60、75、90、105、120、150、180、210、240、270、300、330或360分钟)。
在另一方面,靶分子是蛋白质或肽。
在另一方面,靶分子选自PSCK9蛋白、PSMA蛋白、ERBB2蛋白和ERBB3蛋白。
在另一方面,至少一种核酸适体能够以小于100nM或约0.1nM至约100nM(或0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、8990、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100nM)的平衡结合常数(Kd)结合靶分子。
在另一方面,本文描述的方法进一步包括使候选混合物暴露于慢解离速率富集过程。
在另一方面,在步骤(b)之前进行慢解离速率富集过程。在相关方面,慢解离速率富集过程选自加入竞争分子、稀释步骤、加入竞争分子随后是稀释步骤的组合、稀释步骤随后是加入竞争分子的组合,以及同时加入竞争分子和稀释步骤的组合。
在又一相关方面,竞争分子是聚阴离子。在另一方面,竞争分子选自寡核苷酸、dNTP、肝素和硫酸葡聚糖。
由以下参考附图进行的详细描述能更加显而易见本发明的前述及其它目标、特征和优点。
附图说明
图1显示采用如实施例的材料及方法部分中描述的DNTP的引物延伸测定的聚丙烯酰胺凝胶图像。泳道1:dAdGdT(5%全长);泳道2:dAdGdTdC(100%全长);泳道3:dAdGdT+9a(119%全长);泳道4:dAdGdT+9b(113%全长);泳道5:dAdGdT+9c(120%全长);泳道6:20/200DNA梯带。参考此图可见,在此测定中所有三种修饰的三磷酸胞苷均至少如天然未修饰的2'-脱氧胞苷一样有效地结合。
具体实施方式
除另有说明外,按常规用法使用技术术语。分子生物学中常见术语的定义可见于BenjaminLewin,GenesV,牛津大学出版社出版,1994年(ISBN0-19-854287-9);Kendrew等人(编辑),TheEncyclopediaofMolecularBiology,BlackwellScienceLtd.出版,1994年(ISBN0-632-02182-9);和RobertA.Meyers(编辑),MolecularBiologyandBiotechnology:aComprehensiveDeskReference,VCHPublishers,Inc.出版,1995年(ISBN1-56081-569-8)。
除另有解释外,本文使用的所有技术和科学术语具有的含义与本公开所属领域的普通技术人员所理解的相同。单数的术语其中,*表示RX1基团与-(CH2)n-基团的附接点;且其中,*表示RX1基团与-(CH2)n-基团的附接点;并且“一个(种)”和“所述”包括复数的指代项,除非上下文明确指出另外的情况。“包含A或B”意指包括A或B或者A和B。进一步要理解的是,对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值都是近似的,并且是供描述提供的。
进一步地,要将本文提供的范围理解成该范围内的所有值的简写。例如,要将1至50的范围理解成包括由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50组成的组中的任何数、数的组合或子范围(以及其部分,除非上下文明确地另有规定)。要将任何浓度范围、百分比范围、比例范围或整数范围理解成包括所例举的范围内的任何整数以及(当适当时)其分数(如整数的十分之一和百分之一)的值,除非另有指示。还有,要将本文例举的涉及任何物理特征(如聚合物亚单元、大小或厚度)的任何数值范围理解成包括所例举范围内的任何整数,除非另有指示。如本文所用,“约”或“基本上由......组成”意指所指示范围、值或结构的±20%,除非另有指示。如本文所用,术语“包括”和“包含”是开放式的并且是以同义的方式使用的。应当理解的是,如本文所用的术语“一个(种)”是指“一个(种)或多个(种)”所列举的组分。应当将替代项的使用(例如,“或”)理解成意指替代项的任一者、两者或其任意组合。
虽然在实践或测试本公开内容时可采用与本文中所述类似或等同的方法及材料,但下面描述的是合适的方法及材料。本文提到的所有出版物、专利申请、专利及其它参考文献均以引用的方式全文并入。在有冲突的情况下,以包括术语的解释在内的本说明书为准。此外,材料、方法及实施例仅是示例性的,并不旨在具有限制意义。
如本文所用,术语“核苷酸”是指核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其修饰形式以及其类似物。核苷酸包括了包括嘌呤(例如,腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤及它们的衍生物和类似物)以及嘧啶(例如,胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶及它们的衍生物和类似物)的物质。
如本文所用,术语“C-5修饰的甲酰胺胞苷”或“胞苷-5-甲酰胺”是指在胞苷的C-5位置上带有甲酰胺(-C(O)NH-)修饰的胞苷,所述修饰包括但不限于本文示出的那些部分(RX1)。示例的C-5修饰的甲酰胺胞苷包括但不限于5-(N-苄基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(被称为“BndC”并且在下面显示为式(II);5-(N-2-苯基乙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(被称为“PEdC”并且在下面显示为式(III);5-(N-3-苯基丙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(被称为“PPdC”并且在下面显示为式(IV);5-(N-1-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(被称为“NapdC”并且在下面显示为式(V);5-(N-2-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(被称为“2NapdC”并且在下面显示为式(VI);5-(N-1-萘基-2-乙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(被称为“NEdC”并且在下面显示为式(VII);和5-(N-2-萘基-2-乙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(被称为“2NEdC”并且在下面显示为式(VIII):
本文描述的C-5修饰的胞苷的化学修饰也可单独或以任意组合的方式与2'-位糖修饰、在环外胺处的修饰和4-硫代胞苷的取代等结合。
盐
可能方便或期望制备、纯化和/或处理化合物的相应盐,例如药学上可接受的盐。Berge等人(1977)"PharmaceuticallyAcceptableSalts"J.Pharm.Sci.66:1-19中讨论了药学上可接受的盐的例子。
例如,如果化合物是阴离子性的或者具有可以是阴离子性的官能团(例如,-COOH可以是-COO-),则可以与合适的阳离子形成盐。合适的无机阳离子的例子包括但不限于碱金属离子(如Na+和K+)、碱土阳离子(如Ca2+和Mg2+)及其它阳离子(如Al+3)。合适的有机阳离子的例子包括但不限于铵离子(即,NH4 +)和取代的铵离子(例如,NH3RX+、NH2RX 2 +、NHRX 3 +、NRX 4 +)。一些合适的取代的铵离子的例子为衍生自以下的那些:乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨丁三醇,以及氨基酸,如赖氨酸和精氨酸。常见的季铵离子的例子是N(CH3)4 +。
如果化合物是阳离子性的或者具有可以是阳离子性的官能团(例如,-NH2可以是-NH3 +),则可以与合适的阴离子形成盐。合适的无机阴离子的例子包括但不限于衍生自以下无机酸的那些:盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸和亚磷酸。
合适的有机阴离子的例子包括但不限于衍生自以下有机酸的那些:2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、依地酸、乙二磺酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、羟基马来酸、羟基萘甲酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、粘酸、油酸、草酸、棕榈酸、扑酸、泛酸、苯乙酸、苯磺酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、酒石酸、甲苯磺酸和戊酸。合适的聚合有机阴离子的例子包括但不限于衍生自以下聚合酸的那些:鞣酸、羧甲基纤维素。
除另有规定外,提及特定的化合物也包括其盐形式。
寡核苷酸的制备
在一方面,本公开提供使用本文描述的修饰的核苷单独或与其它修饰的核苷和/或天然存在的核苷组合以制备修饰的寡核苷酸的方法。寡脱氧核苷的自动化合成在许多实验室中是常规的操作(参见例如Matteucci,M.D.和Caruthers,M.H.,(1990)J.Am.Chem.Soc.,103:3185-3191,其内容在此以引用的方式全文并入)。寡核糖核苷的合成也是熟知的(参见例如Scaringe,S.A.等人,(1990)NucleicAcidsRes.18:5433-5441,其内容在此以引用的方式全文并入)。如本文所指出的那样,亚磷酰胺适用于通过化学合成将修饰的核苷结合到寡核苷酸当中,且三磷酸酯适用于通过酶促合成将修饰的核苷结合到寡核苷酸当中(参见例如Vaught,J.D.等人(2004)J.Am.Chem.Soc.,126:11231-11237;Vaught,J.V.等人(2010)J.Am.Chem.Soc.132,4141-4151;Gait,M.J."OligonucleotideSynthesisapracticalapproach"(1984)IRLPress(Oxford,UK);Herdewijn,P."OligonucleotideSynthesis"(2005)(HumanaPress,Totowa,N.J.(上述中的每一者以全文引用的方式并入本文)。
如本文所用,当就寡核苷酸而言使用时,术语“修饰(modify)”、“修饰的(modified)”、“修饰(modification)”及其任何变化型式意指寡核苷酸的四种构成核苷酸碱基(即A、G、T/U和C)的至少一者是天然存在的核苷酸的类似物或酯。在一些实施方案中,修饰的核苷酸对寡核苷酸赋予核酸酶抗性。另外的修饰可包括主链修饰、甲基化、异常碱基配对组合(如异碱基异胞苷和异胍),等等。修饰也可以包括3'和5'修饰,如加帽。其它修饰可包括用类似物取代天然存在的核苷酸中的一种或多种、核苷酸间修饰,举例如具有不带电键联(例如,膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等)的修饰和具有带电键联(例如,硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰、具有嵌入剂(例如,吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如,金属、放射性金属、硼、氧化性金属等)的修饰、含有烷化剂的修饰,以及具有修饰的键联(例如,α异头核酸)的修饰。进一步地,任何通常存在于核苷酸的糖上的羟基基团可以被膦酸酯基团或磷酸酯基团置换;由标准的保护基团进行保护;或者被活化以制备与另外的核苷酸或与固体支持物的另外的键联。可以用以下来磷酸化或取代5'和3'末端OH基团:胺、约1至约20个碳原子的有机加帽基团部分、在一个实施方案中约10至约80kDa的聚乙二醇(PEG)聚合物、在另一实施方案中约20至约60kDa的PEG聚合物,或其它亲水或疏水性生物或合成的聚合物。
多核苷酸也可含有本领域中通常已知的核糖或脱氧核糖糖类的类似形式,包括2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-O-乙基、2'-O-丙基、2'-O-CH2CH2OCH3、2'-氟、2'-NH2或2'-叠氮基、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖(如***糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖)、无环类似物和无碱基核苷类似物(如甲基核糖核苷)。如本文所指出的那样,一个或多个磷酸二酯键联可以被替代的连接基团置换。这些替代的连接基团包括其中磷酸酯被以下置换的实施方案:P(O)S(“硫酯”)、P(S)S(“二硫酯”)、(O)NRX 2(“酰胺化物”)、P(O)RX、P(O)ORX'、CO或CH2(“甲缩醛”),其中每个RX或RX'独立地为H或者任选含有醚(-O-)键联的取代或未取代的烷基(C1-C20)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。多核苷酸中并非所有的键联都需要是相同的。糖、嘌呤和嘧啶的类似形式的取代在设计最终产物时可以是有利的,如可以是替代的主链结构,例如像聚酰胺主链。
多核苷酸也可以含有碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖的类似形式(如***糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖)、无环类似物和无碱基核苷类似物(如甲基核糖核苷)。
如果有对核苷酸结构的修饰,则其可以是在聚合物的组装之前或之后赋予的。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸在聚合后可以被进一步修饰,如通过与标记组分缀合。
如本文所用,“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用以指代核苷酸的聚合物,并且包括DNA、RNA、DNA/RNA杂合物及这些种核酸、寡核苷酸和多核苷酸的修饰,其中包括各种实体或部分与核苷酸单元在任何位置上的附接。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”包括双链或单链分子以及三螺旋分子。核酸、寡核苷酸和多核苷酸是比术语适体更广义的术语,因此术语核酸、寡核苷酸和多核苷酸包括为适体的核苷酸的聚合物,但术语核酸、寡核苷酸和多核苷酸不限于适体。
在某些实施方案中,本公开提供制备核酸分子的方法,所述核酸分子包含具有式I的化合物及其盐:
其中
R独立地为-(CH2)n-,其中n是选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的整数;
RX1独立地选自
其中,*表示RX1基团与-(CH2)n-基团的附接点;且
其中,
RX4独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C20);羟基基团;卤素(F、Cl、Br、I);腈(CN);硼酸(BO2H2);羧酸(COOH);羧酸酯(COORX2);伯酰胺(CONH2);仲酰胺(CONHRX2);叔酰胺(CONRX2RX3);磺酰胺(SO2NH2);N-烷基磺酰胺(SONHRX2);
RX2和RX3每次出现时独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C20);苯基(C6H5);RX4取代的苯环(RX4C6H4),其中RX4定义如上;羧酸(COOH);羧酸酯(COORX5),其中RX5是支链或直链低级烷基(C1-C20);和环烷基,其中RX2和RX3一起形成取代或未取代的5或6元环;
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3、NH2和-叠氮基;
R'独立地选自-H、-OAc;-OBz;-P(NiPr2)(OCH2CH2CN);和-OSiMe2tBu;
R”独立地选自氢、4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)和三磷酸酯(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2)或其盐;
Z独立地选自-H、取代或未取代的C(1-4)烷基;
所述方法包括合成具有多种核苷酸和至少一种具有式I的化合物的核酸分子。
在某些实施方案中,本公开提供制备核酸分子的方法,所述核酸分子包含具有选自式II、III、IV、V、VI、VII和VIII的式的化合物:
其中
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3、NH2和-叠氮基;
所述方法包括合成具有多种核苷酸和至少一种具有选自式II、III和IV的式的化合物的核酸分子。
如本文所用,当提及核酸的修饰时的术语“至少一种核苷酸”是指核酸中的一种、若干或所有核苷酸,指示核酸中任何或所有出现的A、C、T、G或U任一者或全部均可以被修饰或不被修饰。
在其它方面,本公开提供使用本文描述的修饰的核苷单独或与其它修饰的核苷和/或天然存在的核苷组合以制备(本文描述的)适体和SOMAmer的方法。在具体的实施方案中,采用一般的SELEX或下面描述的改进的SELEX法制备适体和SOMAmer。
如本文所用,“核酸配体”、“适体”、“SOMAmer”和“克隆”可互换使用来指代对靶分子具有期望作用的非天然存在的核酸。期望作用包括但不限于靶的结合、以催化方式改变靶、按修饰或改变靶或靶的功能活性的方式与靶反应、与靶共价附接(如在***性抑制剂中)和促进靶与别的分子之间反应。在一个实施方案中,作用为对于靶分子的特异性结合亲和力,这种靶分子为不同于通过不依赖于沃森/克里克碱基配对或三螺旋形成的机制与核酸结合的多核苷酸的三维化学结构,其中适体不是具有被靶分子结合的已知生理功能的核酸。对给定靶的适体包括通过包括以下的方法自核酸的候选混合物中识别的核酸,其中适体为靶的配体:(a)使候选混合物与靶接触,其中可以将相对于候选混合物中的其它核酸而言对靶的亲和力增加的核酸与候选混合物的其余部分分隔;(b)将亲和力增加的核酸与候选混合物的其余部分分隔;和(c)扩增亲和力增加的核酸以产生核酸的配体富集混合物,藉此识别靶分子的适体。公认的是亲和相互作用是程度的问题;然而,在这个背景下,适体对于其靶的“特异性结合亲和力”意指适体通常以比其与混合物或样品中的其它非靶组分结合高得多的亲和程度与其靶结合。“适体”、“SOMAmer”或“核酸配体”是具有特定核苷酸序列的一种类型或种类的核酸分子的一组拷贝。适体可包括任意合适数目的核苷酸。“适体”是指不止一个这样的分子组。不同的适体可具有相同或不同数目的核苷酸。适体可以是DNA或RNA,并且可以是单链的、双链的,或者含有双链或三链区。
如本文所用,“SOMAmer”或“慢解离速率修饰的适体”是指解离速率特性改进的适体。可采用标题为“MethodforGeneratingAptamerswithImprovedOff-Rates”的第7,947,447号美国专利中描述的改进的SELEX方法生成SOMAmer。
如本文所用,“蛋白质”与“肽”、“多肽”或“肽片段”同义使用。“纯化的”多肽、蛋白质、肽或肽片段基本上不含细胞物质或来自细胞、组织或由其得到氨基酸序列的无细胞源的其它污染性蛋白质,或者当是化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。
SELEX方法
术语“SELEX”和“SELEX法”在本文中可互换使用,通常是指以下的组合:(1)以期望的方式与靶分子相互作用的核酸的选择,例如以高亲和力与蛋白质结合,与(2)这些选定核酸的扩增。SELEX法可用于识别对特定的靶分子或生物标志物具有高亲和力的适体。
SELEX通常包括制备核酸的候选混合物、使候选混合物与所需的靶分子结合以形成亲合复合物、将亲和复合物与未结合的候选核酸分离、将核酸与亲和复合物分离并离析、纯化核酸以及识别特定的适体序列。该法可包括多轮以进一步改进选定适体的亲和力。该法可在方法的一点或多点包括扩增步骤。参见例如标题为“NucleicAcidLigands”的第5,475,096号美国专利。SELEX法可用于生成共价结合其靶的适体以及非共价结合其靶的适体。参见例如标题为“SystematicEvolutionofNucleicAcidLigandsbyExponentialEnrichment:Chemi-SELEX”的第5,705,337号美国专利。
SELEX法可用于识别含有修饰的核苷酸的高亲和力适体,所述修饰的核苷酸对适体赋予改进的特性,例如改进的体内稳定性或改进的递送特性。这类修饰的例子包括在核糖和/或磷酸酯和/或碱基位置上的化学取代。SELEX法识别的含有修饰的核苷酸的适体描述于标题为“HighAffinityNucleicAcidLigandsContainingModifiedNucleotides”的第5,660,985号美国专利中,该专利描述了含有在嘧啶的5'和2'位上化学修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸。第5,580,737号美国专利(参见上文)描述了含有一种或多种用2'-氨基(2'-NH2)、2'-氟(2'-F)和/或2'-O-甲基(2'-OMe)修饰的核苷酸的高度特异性适体。还参见标题为“SELEXandPHOTOSELEX”的第20090098549号美国专利申请公开,其描述了具有扩展的物理和化学性质的核酸文库以及它们在SELEX和photoSELEX中的用途。
SELEX也可用于识别具有期望的解离速率特性的适体。参见标题为“MethodforGeneratingAptamerswithImprovedOff-Rates”的第7,947,447号美国专利,其内容以全文引用的方式并入本文,描述了用于生成可与靶分子结合的适体的改进SELEX方法。描述了产生与其相应的靶分子解离速率较慢的适体和光适体的方法。所述方法涉及使候选混合物与靶分子接触,允许发生核酸-靶复合物的形成,并进行慢解离速率富集过程,其中具有快解离速率的核酸-靶复合物解离且不会重新形成,而具有慢解离速率的复合物保持不变。另外,所述方法包括修饰的核苷酸在生产候选核酸混合物以生成具有改进的解离速率性能的适体中的用途。(参见标题为“SELEXandPhotoSELEX”的第8,409,795号美国专利)。(还参见第7,855,054号美国专利和第20070166740号美国专利公开)。这些申请中的每一者以全文引用的方式并入本文。
“靶”或“靶分子”或“靶”在本文中是指核酸可以按期望的方式对其起作用的任何化合物。靶分子可以是蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、脂质、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、病原体、有毒物质、底物、代谢物、过渡态类似物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养物、生长因子、细胞、组织、任何前述物质的任何部分或片段等,没有限制。几乎任何化学或生物效应物都可以是合适的靶。任意大小的分子均可充当靶。也可以按某些方式对靶进行修饰以增大靶与核酸之间相互作用的可能性或强度。靶也可以包括特定化合物或分子的任何微小的变化,如在蛋白质的情况下,例如氨基酸序列的微小变化、二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化,或者任何其它的操纵或修饰,如与标记组分缀合,其基本上不改变分子的特性。“靶分子”或“靶”是一种类型或种类的能够与适体结合的分子或多分子结构的一组拷贝。“靶分子”或“靶”是指不止一个这样的分子组。其中靶是肽的SELEX法的实施方案描述于标题为“ModifiedSELEXProcessesWithoutPurifiedProtein”的第6,376,190号美国专利中。
如本文所用,“竞争分子”和“竞争子”可互换使用,指代可与非靶分子形成非特异性复合物的任何分子。在此上下文中,非靶分子包括游离适体,其中例如竞争子可用于抑制适体与别的非靶分子非特异性地结合(重新结合)。“竞争分子”或“竞争子”是一种类型或种类的分子的一组拷贝。“竞争分子”或“竞争子”是指不止一个这样的分子组。竞争分子包括但不限于寡核苷酸、聚阴离子(例如,肝素、鲱鱼精DNA、鲑鱼精DNA、tRNA、硫酸葡聚糖、葡聚糖、无碱基磷酸二酯聚合物、dNTP和焦磷酸酯)。在各种实施方案中,可以使用一种或多种竞争子的组合。
如本文所用,“非特异性复合物”是指不同于适体的两种或更多种分子与其靶分子之间的非共价缔合。非特异性复合物表示各类别分子之间的相互作用。非特异性复合物包括适体与非靶分子之间、竞争子与非靶分子之间、竞争子与靶分子之间和靶分子与非靶分子之间形成的复合物。
如本文所用,术语“慢解离速率富集过程”是指这样的过程,即改变候选混合物的某些组分的相对浓度,使得具有慢解离速率的适体亲和复合物的相对浓度相对于具有较快的不大期望的解离速率的适体亲和复合物的浓度而言增加。在一个实施方案中,慢解离速率富集过程是基于溶液的慢解离速率富集过程。在此实施方案中,基于溶液的慢解离速率富集过程发生于溶液中,使得在慢解离速率富集过程期间,在混合物中形成适体亲和复合物的靶或者核酸都不会固定在固体支持物上。在各种实施方案中,慢解离速率富集过程可包括一个或多个步骤,包括添加竞争分子和与其一起温育、稀释混合物或这些的组合(例如,在竞争分子的存在下稀释混合物)。因为慢解离速率富集过程的效果通常取决于不同适体亲和复合物(即,靶分子与候选混合物中不同的核酸之间形成的适体亲和复合物)的不同解离速率,所以选择慢解离速率富集过程的持续时间,以便保持具有慢解离速率的适体亲和复合物比例高,而大幅度地减少具有快解离速率的适体亲和复合物的数量。SELEX法期间可以在一个或多个周期中采用慢解离速率富集过程。当组合采用稀释和添加竞争子时,它们可以是同时或按任意顺序相继进行的。当混合物中总靶(蛋白质)浓度低时可采用慢解离速率富集过程。在一个实施方案中,当慢解离速率富集过程包括稀释时,可以尽可能可行地稀释混合物,记住要回收适体保留的核酸用于SELEX法中的后续轮次。在一个实施方案中,慢解离速率富集过程包括使用竞争子以及稀释,从而允许比不使用竞争子所需的情况更少地稀释混合物。
在一个实施方案中,慢解离速率富集过程包括添加竞争子,并且竞争子是聚阴离子(例如,肝素或硫酸葡聚糖(葡聚糖))。肝素和葡聚糖在先前的SELEX选择中已被用于识别特定的适体。然而在这类方法中,肝素或葡聚糖存在于其中靶和适体结合形成复合物的平衡步骤期间。在这类方法中,随着肝素或葡聚糖的浓度增加,高亲和力靶/适体复合物与低亲和力靶/适体复合物的比率增加。然而,由于核酸与竞争子之间对靶结合的竞争原因,肝素或葡聚糖的高浓度可减少平衡下的高亲和力靶/适体复合物的数量。相比之下,目前描述的方法在已允许形成靶/适体复合物之后添加竞争子,因此不影响形成的复合物的数量。已发生平衡结合之后在靶与适体之间添加竞争子建立了非平衡状态,其适时地发展成具有较少靶/适体复合物的新平衡。在已达到新平衡之前捕获靶/适体复合物富集了慢解离速率适体的样品,因为快解离速率复合物将首先解离。
在另一实施方案中,在慢解离速率富集过程中使用聚阴离子性竞争子(例如,硫酸葡聚糖或别的聚阴离子性物质)以便于识别耐受聚阴离子的存在的适体。在此上下文中,“聚阴离子耐受性适体”是这样的一种适体,其能够形成适体/靶复合物,所述适体/靶复合物相比包括非聚阴离子耐受性适体的适体/靶复合物来说不太可能在也含有聚阴离子耐受性物质的溶液中解离。按这种方式,聚阴离子耐受性适体可用在执行分析方法中检测样品中的靶的存在或量或浓度,其中检测方法包括使用适体耐受的聚阴离子性物质(例如硫酸葡聚糖)。
因此,在一个实施方案中,提供了一种产生聚阴离子耐受性适体的方法。在此实施方案中,在使核酸的候选混合物与靶接触后,使候选混合物中的靶和核酸达到平衡。引入聚阴离子性竞争子并允许在溶液中温育一个时间段,所述时间段足以确保候选混合物中大部分快解离速率适体自靶分子解离。还有,候选混合物中可在聚阴离子性竞争子的存在下解离的适体将自靶分子释放。分隔混合物以离析保持与靶分子缔合的高亲和力慢解离速率适体并自溶液中除去任何未复合的物质。然后可以自靶分子释放适体并离析。还可以对离析的适体进行扩增并进行更多轮选择以提高选定适体的整体性能。如果对于特定的应用不需要选择慢解离速率适体,则也可按最少的温育时间采用此过程。
因此,在一个实施方案中提供修改的SELEX法用于识别或生产具有慢(长)解离速率的适体,其中使靶分子和候选混合物接触并一起温育一个时间段,所述时间段足以发生靶分子与包含在候选混合物中的核酸之间的平衡结合。平衡结合之后,向混合物中加入过量的竞争分子,例如聚阴离子竞争子,并将混合物与过量的竞争分子一起温育预定的时间段。显著比例的解离速率小于此预定温育时段的适体将在预定温育时段期间自靶解离。这些“快”解离速率适体与靶的重新缔合被最小化,这是因为过量的竞争分子可与靶非特异性地结合并占据靶结合位点。显著比例的具有较长解离速率的适体在预定温育时段期间将保持与靶复合。在温育时段结束时,自混合物的其余部分分隔核酸-靶复合物允许慢解离速率适体的群体与具有快解离速率的群体分离。解离步骤可用于将慢解离速率适体自其靶解离并允许对靶分子具有高亲和力和特异性的慢解离速率适体(个别适体或慢解离速率适体组)的离析、识别、测序、合成及扩增。如与常规的SELEX,自一轮修改的SELEX法识别的适体序列可用于合成新的候选混合物,使得可以按需要多次地反复/重复接触、平衡结合、添加竞争分子、与竞争分子一起温育以及分隔慢解离速率适体的步骤。
允许候选混合物与靶在添加竞争子之前平衡结合、接下来添加过量的竞争子并与竞争子一起温育预定的时间段,上述组合允许选择具有比以前实现的要大得多的解离速率的适体的群体。
为了实现平衡结合,可以将候选混合物与靶一起温育至少约5分钟或至少约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时或约6小时。
可按需要选择竞争分子与候选混合物和靶分子的混合物的预定温育时段,考虑诸如靶的性质和靶的已知适体的已知解离速率(如果有的话)之类的因素。预定温育时段可选自:至少约5分钟、至少约10分钟、至少约20分钟、至少约30分钟、至少约45分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时。
在其它实施方案中采用稀释作为解离速率提高方法,并且可将稀释的候选混合物、靶分子/适体复合物的温育进行预定的时间段,所述预定的时间段可选自:至少约5分钟、至少约10分钟、至少约20分钟、至少约30分钟、至少约45分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时。
本公开的实施方案涉及慢解离速率适体的识别、生产、合成和用途。这些是这样的适体,其具有的自非共价适体-靶复合物解离的速率(t1/2)比通常通过常规SELEX得到的适体的解离速率高。对于含有适体和靶的非共价复合物的混合物,t1/2代表适体的一半自适体-靶复合物解离所花费的时间。根据本公开的慢解离速率适体的t1/2选自以下之一:大于或等于约30分钟;约30分钟与约240分钟之间;约30分钟至约60分钟之间;约60分钟至约90分钟之间、约90分钟至约120分钟之间;约120分钟至约150分钟之间;约150分钟至约180分钟之间;约180分钟至约210分钟之间;约210分钟至约240分钟之间。
通过SELEX程序识别的适体的表征特征是其对于其靶的高亲和力。适体对其靶将具有选自以下之一的解离常数(kd):小于约1μM、小于约100nM、小于约10nM、小于约1nM、小于约100pM、小于约10pM、小于约1pM。
化学合成
本文描述本公开中提供的化合物的化学合成方法。可以按已知的方式修改和/或改动这些和/或其它熟知的方法以便于合成本公开中提供的另外的化合物。
参考方案1,本公开还提供C-5修饰的氨基羰基嘧啶的3′-亚磷酰胺的合成方法。参考方案1,值得注意的是,一氧化碳和碱与5-取代的核苷的钯催化反应在小于或等于2个大气压的一氧化碳压力下进行;更具体地为0.1至2个大气压(或0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6.、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2个大气压),并且甚至更具体地在1个大气压下进行。在这些减压条件下进行的反应导致与在3个大气压与4个大气压[50psi]之间的压力下进行的以往方法相比收率更高且产物更纯。
参考方案2,本公开还提供C-5修饰的氨基羰基嘧啶的5′-三磷酸酯的合成方法,包括:
在某些实施方案中保护基团选自三苯基甲基、对甲氧苯基二苯基甲基、二对甲氧苯基二苯基甲基、对二甲氧基三苯甲基三苯甲基、甲酰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基、2-氯苄氧羰基、4-氯苯甲酰氧羰基、2,4-二氯苄氧羰基、糠基羰基、叔戊氧羰基、金刚烷氧羰基、2-苯基丙基-(2)-氧羰基、2-(4-联苯基)丙基-(2)-氧羰基、2-硝基苯基亚磺酰基和二苯基氧膦基。
提供以下实施例以例示某些具体特征和/或实施方案。这些实施例不应被解释为将本公开限制于所描述的具体特征或实施方案。
实施例
实施例1:5-(N-苄基甲酰胺)-2’-脱氧胞苷的合成
本实施例提供制备5-(N-苄基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(或BndC;参见下面的方案1(4a))的方法。简言之,将市售的5-碘-2'-脱氧胞苷(3)转化成相应的N-取代的甲酰胺(4a-c),方式是通过用必需的芳族伯胺RCH2NH2(5-10当量)、一氧化碳(</=1atm)和(Ph3P)4Pd(2摩尔%)于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中在室温下处理24-48小时(方案1)。过量的伯胺和有限的一氧化碳对限制2-酮基甲酰胺副产物的形成是必要的(参见,例如Uozumi,Y.等人(2001)和Takacs等人,2008)。修饰的核苷产物(4a-c)容易通过自醇中重结晶纯化。
起始物质:5-碘-2'-脱氧胞苷;5-碘-2'-O-甲基-胞苷;5-碘-2'-脱氧-2'-氟胞苷购自ChemGenesCorporation(Wilmington,MA01887,USA)或ThermoFisherScientificInc.(Waltham,MA02454,USA)。99.9%纯度的一氧化碳(安全性:有毒气体)购自SpecialtyGasesofAmerica(Toledo,OH43611,USA)。所有其它试剂均购自Sigma-Aldrich(Milwaukee,WI53201,USA)并且原样使用。
5-(N-苄基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(4a):向充氩的1L圆底烧瓶中装入:5-碘-2'-脱氧胞苷(30g,85mmol);苄胺(109.3g,1020mmol,12当量);和无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF,205mL)。将混合物快速地磁力搅拌,直到所有的固体已溶解。通过两轮抽真空至50mm并用氩再填充将所得到的溶液脱气。添加双(二亚苄基丙酮)钯(0)(978mg,1.7mmol,0.02当量)和三苯基膦(1.92g,7.3mmol,0.086当量)的混合物并快速地搅拌所得到的细黑色悬浮液,抽真空至50mm并用来自橡胶气囊的一氧化碳(1atm)填充。在室温(~20℃)下搅拌混合物并定期地用一氧化碳再填充。26小时后,通过tlc分析(硅胶,洗脱液:15%甲醇/85%二氯甲烷(v/v),Rf(SM)=0.3,Rf(4a)=0.4)确认反应完全。将反应混合物用乙酸乙酯(205mL)稀释、过滤并用65%乙酸乙酯/35%DMF(100mL)向前冲洗。在旋转蒸发器(50-80℃,1-2mm)上浓缩澄清的绿色滤液,直到所有的溶剂和大部分的苄胺已蒸馏。将暗橙色残余物(~75g)溶于热的无水乙醇(650mL)中并快速地热过滤以除去少量的不溶性薄片(~2g)。在缓慢搅拌下使澄清的滤液冷却并使产物针状结晶。过夜搅拌后,过滤浆料并用冰冷的乙醇(100mL)洗涤滤饼。真空干燥后,得到为白色结晶固体的产物(4a):22.0g,72%收率。1HNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=8.73(t,J=5.8Hz,1H),8.42(s,1H),8.06(bs,1H),7.75(bs,1H),7.32(m,4H),7.25(m,1H),6.14(t,J=6.5Hz,1H),5.24(d,J=4.4Hz,1H),5.03(t,J=5.5Hz,1H),4.42(dd,J=15.4,7.2Hz,1H),4.41(dd,J=15.4,7.3Hz,1H),4.26(m,J=4.3Hz,1H),3.83(dd,J=7.9,4.3Hz,1H),3.64(m,1H),3.58(m,1H),2.19(m,2H)。13CNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=165.88(1C),163.97(1C),153.99(1C),144.26(1C),139.64(1C),128.80(2C),127.60(2C),127.30(1C),99.20(1C),88.08(1C),86.29(1C),70.44(1C),61.50(1C),42.72(1C),40.62(1C)。MSm/z:C17H19N4O5的[M-]计算值,359.36;实测值,359.1(ESI-)。
4-N-乙酰基-5-(N-苄基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(5a):向1L圆底烧瓶中装入(4a)(20.0g,55.4mmol)和无水四氢呋喃(THF,500mL)。用乙酸酐(26.4mL,277mmol,5当量)处理充分搅拌的混合物并将混合物在50℃下加热20h。等分试样(通过在50%甲醇/50%二氯甲烷中溶解来均化)的Tlc分析显示反应完全(硅胶,洗脱液:15%甲醇/85%二氯甲烷(v/v),Rf(4a)=0.4,Rf(5a)=0.6)。使浆料冷却到5-10℃达1小时,过滤并用冷的THF(40mL)洗涤。真空干燥得到为白色结晶针状的产物(5a),20.4g,91%收率。1HNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=11.35(s,1H),8.98(t,J=5.7Hz,1H),8.73(s,1H),7.34(d,J=4.4Hz,4H),7.26(m,J=4.3Hz,1H),6.10(t,J=6.1Hz,1H),5.28(d,J=4.4Hz,1H),5.09(t,J=5.4Hz,1H),4.44(dd,J=15.3,8.1Hz,1H),4.43(dd,J=15.2,8.1Hz,1H),4.28(dt,J=9.8,4.0Hz,1H),3.91(dd,J=7.9,4.0Hz,1H),3.68(m,1H),3.60(m,1H),2.41(s,3H),2.34(m,1H),2.22(m,1H)。13CNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=171.27(1C),165.49(1C),159.77(1C),153.19(1C),146.24(1C),139.16(1C),128.82(2C),127.76(2C),127.41(1C),100.32(1C),88.67(1C),87.50(1C),70.11(1C),61.17(1C),43.00(1C),40.78(1C),26.70(1C)。MSm/z:C19H21N4O6的[M-]计算值,401.40;实测值,401.1(ESI-)。
5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-4-N-乙酰基-5-(N-苄基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(6a):向250mL圆底烧瓶中装入(5a)(4.82g,12mmol)和无水吡啶(40mL)。磁力搅拌所得到的无色溶液,同时经一个小时按五份添加4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(4.47g,13.2mmol,1.1当量)。将橙黄色溶液再搅拌30分钟,用乙醇(4.2mL,72mmol)淬灭并在旋转蒸发器(1-2mm,≤35℃)上浓缩。将所得到的粘性橙色残余物(~13g)用乙酸乙酯(100mL)和冷的碳酸氢钠饱和水溶液(50mL)进行分配。用硫酸钠干燥有机层,过滤并浓缩,留下黄色泡沫状物。通过快速色谱法纯化(硅胶,洗脱液:1%三乙胺/99%乙酸乙酯,Rf(6a)=0.4)得到为白色泡沫状物的(6a),6.1g,72%收率。1HNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=11.44(s,1H),9.12(t,J=5.5Hz,1H),8.46(s,1H),7.38(d,J=7.4Hz,2H),7.25(m,12H),6.84(m,4H),6.10(t,J=6.1Hz,1H),5.34(d,J=4.7Hz,1H),4.20(m,3H),4.05(m,1H),3.72(d,J=1.7Hz,6H),3.41(dd,J=10.5,6.0Hz,1H),3.20(dd,J=10.4,3.5Hz,1H),2.44(s,3H),2.39(m,1H),2.25(m,1H)。13CNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=171.28(1C),165.38(1C),159.88(1C),158.53(2C),153.07(1C),146.13(1C),145.26(1C),138.91(1C),136.00(1C),135.98(1C),130.16(2C),130.11(2C),128.78(2C),128.28(2C),128.13(2C),127.84(2C),127.46(1C),127.14(1C),113.60(4C),100.32(1C),88.04(1C),86.86(1C),86.19(1C),70.69(1C),60.22(1C),55.43(1C),55.42(1C),43.03(1C),40.70(1C),26.76(1C)。MSm/z:C40H39N4O8的[M-]计算值,703.77;实测值,703.2(ESI-)。
5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-4-N-乙酰基-5-(N-苄基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷-3'-O-(N,N-二异丙基-O-2-氰乙基亚磷酰胺)(7a)。向250mL圆底烧瓶中装入:(6a)(11.0g,15.6mmol);无水二氯甲烷(40mL);2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺(5.9mL,18.7mmol,1.2当量);和最后是三氟乙酸吡啶(3.61g,18.7mmol,1.2当量)。30分钟后,tlc分析显示反应完全(硅胶,75%乙酸乙酯/25%己烷(v/v),Rf(6a)=0.2,Rf(7a)=0.7/0.8[两种异构体])。将全部反应混合物施加于用1%三乙胺/64%乙酸乙酯/35%己烷预调节(直到洗脱液呈碱性)的硅胶快速柱,然后用65%乙酸乙酯/35%己烷洗脱(氩吹洗)。在氩气下将含产物的级分用密封广口瓶保护以隔离空气,并浓缩以得到为无色泡沫状物的(7a),10.8g,76%收率。1HNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=11.47(s,1H),9.11(bs,1H),8.57/8.54(s,1H),7.37(m,2H),7.24(m,12H),6.84(m,4H),6.10(m,1H),4.40(m,1H),4.21(m,3H),3.70(m,8H),3.55(m,2H),3.28(m,2H),2.75(t,J=5.9Hz,1H),2.64(t,J=5.9Hz,1H),2.55(m,1H),2.42(m,4H),1.11(m,9H),0.98(d,J=6.8Hz,3H)。31PNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=147.55/147.37(s,1P)。MSm/z:C45H56N6O9P的[M-]计算值,903.99;实测值,903.3(ESI-)。
方案1
为了制备2-氰乙基亚磷酰胺试剂(CEP试剂),通过与四氢呋喃(THF)中的乙酸酐(没有碱)一起搅拌而对5-N-苄基甲酰胺(4a-c)进行选择性N-保护,且然后通过与吡啶中的4,4'-二甲氧基三苯甲基氯反应进行5'-O-保护成为(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-衍生物(6a-c)(参见,例如Ross等人,2006)。通过3'-醇与2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰胺的吡啶鎓三氟乙酸盐催化缩合(参见,例如Sanghvi等人,2000)并通过用脱气溶剂的硅胶快速色谱法进行最终纯化(参见,例如Still等人,1978)而完成高纯度(>98.0%)CEP试剂(7a-c)的合成。
为了制备5'-三磷酸酯试剂(TPP试剂;方案2),用吡啶中的乙酸酐将5'-O-DMT保护的核苷(6a-c)全乙酰化,接下来用1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇裂解DMT和4-N-乙酰基保护基团(参见,例如Leonard和Neelima,1995)。通过Ludwig-Eckstein法将所得到的结晶3'-O-乙酸酯核苷(8a-c)转化成粗的5'-O-三磷酸酯。这些化学修饰的核苷酸通常要求两级纯化过程:阴离子交换色谱(AEX),接下来是反相制备型HPLC,以便获得高纯度(>%90)。
方案2
Ludwig,J.和Eckstein,F.(1989)RapidandEfficientSynthesisofNucleoside5'-O-(1-Thiotriphosphates),5'-Triphosphatesand2',3'-CyclophosphorothioatesUsing2-Chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphophorin-4-one.J.Org.Chem.,54,631-635,在此以引用的方式全文并入。
羧酰胺化反应也适用于制备核酸酶抗性的核糖类似物(参见,例如Ito等人,2003)(方案4),例如,5-(N-苄基甲酰胺)-2'-O-甲基-胞苷(12)和-5-(N-3-苯基丙基甲酰胺)-2'-脱氧-2'-氟-胞苷(13)。
5-(N-苄基甲酰胺)-2'-O-甲基-胞苷(12):如针对(4a)所述由5-碘-2'-O-甲基胞苷进行制备,不同的是产物从热的2-丙醇(12mL/g)中结晶,得到为毡状白色固体的(12),79%收率。1HNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=8.57(t,J=5.9Hz,1H),8.57(s,1H),8.05(bs,1H),7.85(bs,1H),7.33(m,4H),7.25(m,1H),5.85(d,J=3.1Hz,1H),5.27(t,J=5.4Hz,1H),5.11(d,J=6.8Hz,1H),4.43(dd,J=15.4,10.4Hz,1H),4.40(dd,J=15.3,10.4Hz,1H),4.17(dd,J=6.7,5.2Hz,1H),3.87(dt,J=6.8,3.2Hz,1H),3.80(dd,J=5.0,3.2Hz,1H),3.77(m,1H),3.61(ddd,J=12.2,5.3,3.4Hz,1H),3.44(s,3H)。13CNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=165.43(1C),163.57(1C),153.49(1C),143.99(1C),139.16(1C),128.40(2C),127.22(2C),126.90(1C),98.97(1C),87.95(1C),84.28(1C),83.05(1C),67.67(1C),59.92(1C),57.70(1C),42.40(1C)。MSm/z:C18H21N4O6的[M-]计算值,389.39;实测值,389.1(ESI-)。
5-(N-3-苯基丙基)-2'-脱氧-2'-氟-胞苷(13):如针对(4c)所述由5-碘-2'-脱氧-2'-氟-胞苷进行制备,为毡状白色固体(53%收率)。1HNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=8.52(s,1H),8.07(bs,1H),7.95(t,J=5.4Hz,1H),7.85(bs,1H),7.22(t,J=7.4,5H),5.91(d,J=17.6Hz,1H),5.58(d,J=6.6Hz,1H),5.32(t,J=5.3Hz,1H),4.99(dd,J=53.2,3.9Hz,1H),4.27(m,1H),3.92(d,J=8.3Hz,1H),3.86(m,1H),3.58(ddd,J=12.5,5.4,2.9Hz,1H),3.19(dd,J=12.7,5.3Hz,2H),2.61(t,J=7.5Hz,2H),1.78(m,J=7.3Hz,2H)。13CNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=165.22(s,1C),163.74(s,1C),153.34(s,1C),143.82(s,1C),141.73(s,1C),128.42(s,2C),128.35(s,2C),125.81(s,1C),99.26(1C),94.02(d,J=736.6Hz,1C),88.65(d,J=134.7Hz,1C),83.07(s,1C),67.00(d,J=65Hz,1C),59.24(s,1C),38.65(s,1C),32.64(s,1C),30.73(s,1C)。19FNMR(400MHz,d6-DMSO):δ=-200.82(ddd,J=19.0,6.2,56.6Hz,1F)。MSm/z:C19H22N4O5的[M-]计算值,405.41;实测值,405.1(ESI-)。
方案3
采用Ludwig-Eckstein法将3'-O-乙酰基保护的中间体(8a-c)转化成粗的5'-O-三磷酸酯(9a-c)。对于这些化学修饰的核苷酸采用替代性两级制备型HPLC纯化。
3'-O-乙酰基-5-(N-1-苄基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(8a)。向经氩吹扫的50mL圆底烧瓶中装入(6a)(900mg,1.35mmol)、无水吡啶(9mL)和乙酸酐(0.63mL,6.75mmol)。在室温下18h后,将溶剂真空蒸发(1mm,30℃),产生褐色泡沫状物,将其溶于1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(9mL)并在50℃和氩下加热。6h后,将反应混合物倒入甲醇(15mL)和甲苯(10mL)的快速搅拌混合物中。将所得到的橙色溶液浓缩(1mm,30℃),产生红色油状残余物,其经与乙酸乙酯(6mL)混合,得到结晶浆料。采用添加己烷(1mL)的方式进一步增强结晶。将混合物过夜搅拌并过滤,用50:50乙酸乙酯:己烷洗涤滤饼。分离产物(8a),干燥后为浅灰色固体(405mg),75%收率:1HNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=8.82(t,J=5.8Hz,1H),8.41(s,1H),8.09(bs,1H),7.81(bs,1H),7.33(m,4H),7.25(m,1H),6.17(dd,J=8.0,6.0Hz,1H),5.24(dt,J=6.2,1.8Hz,1H),5.13(t,J=5.6Hz,1H),4.43(dd,J=15.4,13.3Hz,1H),4.19(dd,J=15.3,13.2Hz,1H),4.06(dd,J=5.9,3.7Hz,1H),3.65(m,2H),2.45(m,1H),2.34(ddd,J=14.2,5.9,1.5Hz,1H),2.07(s,3H)。13CNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=170.05(1C),165.34(1C),163.54(1C),153.44(1C),143.94(1C),139.20(1C),128.34(2C),127.16(2C),126.85(1C),99.06(1C),85.96(1C),85.06(1C),74.63(1C),61.18(1C),42.28(1C),37.31(1C),20.85(1C).MSm/z:C19H21N4O6的[M-]计算值,401.40;实测值,401.1[M]-。
3'-O-乙酰基-5-(N-1-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(8b)。如针对(8a)所述由(6b)进行制备,为浅灰色固体,54%收率:1HNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=8.89(t,J=5.8Hz,1H),8.44(s,1H),8.14(d,J=8.4Hz,1H),8.11(bs,1H),7.96(dd,J=8.6,1.3Hz,1H),7.86(dd,J=6.6,2.8Hz,1H),7.84(bs,1H),7.57(m,2H),7.49(m,2H),6.15(dd,J=8.2,6.0Hz,1H),5.23(dt,J=6.2,1.9Hz,1H),5.13(t,J=5.8Hz,1H),4.94(dd,J=15.5,5.8Hz,1H),4.86(dd,J=15.7,5.4Hz,1H),4.05(dt,J=8.1,1.8Hz,1H),3.62(m,2H),2.45(m,1H),2.33(ddd,J=12.6,6.1,1.8Hz,1H),2.06(s,3H)。13CNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=170.51(1C),165.78(1C),164.02(1C),153.90(1C),144.52(1C),134.57(1C),133.74(1C),131.27(1C),129.02(1C),128.03(1C),126.80(1C),126.31(1C),125.94(1C),125.54(1C),123.78(1C),99.52(1C),86.60(1C),85.55(1C),70.12(1C),61.67(1C),40.80(1C),37.75(1C),21.32(1C)。MSm/z:C23H23N4O6的[M-]计算值,451.46;实测值,451.1(ESI-)。
3'-O-乙酰基-5-(N-3-苯基丙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(8c)。如针对(8a)所述由(6c)进行制备,为白色固体,74%收率:1HNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=8.37(s,1H),8.26(t,J=5.3Hz,1H),8.06(bs,1H),7.79(bs,1H),7.23(m,5H),6.16(dd,J=7.9,6.1Hz,1H),5.24(dt,J=4.2,2.1Hz,1H),5.18(t,J=5.6Hz,1H),4.06(dd,J=5.7,3.6Hz,1H),3.65(m,2H),3.19(dd,J=12.8,6.2Hz,2H),2.62(t,J=7.5Hz,2H),2.43(m,1H),2.34(m,1H),2.06(s,3H),1.78(m,J=7.4Hz,2H)。13CNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=170.52(1C),165.68(1C),164.00(1C),153.94(1C),144.09(1C),142.13(1C),128.80(2C),127.75(2C),126.21(1C),99.80(1C),86.42(1C),85.06(1C),75.07(1C),61.63(1C),39.12(1C),37.91(1C),33.04(1C),31.18(1C),21.31(1C).MSm/z:C21H25N4O6的[M-]计算值,429.45;实测值,429.1(ESI-)。
实施例2:5-(N-1-萘基甲基)-2'-脱氧胞苷-5-甲酰胺的合成
本实施例提供制备5-(N-1-萘基甲基)-2'-脱氧胞苷-5-甲酰胺(或NapdC;参见实施例1中的方案1(4b))的方法。
起始物质:5-碘-2'-脱氧胞苷;5-碘-2'-O-甲基-胞苷;5-碘-2'-脱氧-2'-氟胞苷购自ChemGenesCorporation(Wilmington,MA01887,USA)或ThermoFisherScientificInc.(Waltham,MA02454,USA)。99.9%纯度的一氧化碳(安全性:有毒气体)购自SpecialtyGasesofAmerica(Toledo,OH43611,USA)。所有其它试剂均购自Sigma-Aldrich(Milwaukee,WI53201,USA)并且原样使用。
5-(N-1-萘基甲基)-2'-脱氧胞苷-5-甲酰胺(4b):如针对(4a)所述进行制备,使用1-萘基甲胺(6当量)代替苄胺,在室温下反应时间为48小时。浓缩反应混合物后,将残余物用二异丙醚(~40mL/g)萃取以除去大部分过量的1-萘基甲胺。采用热过滤将残余物从热的甲醇(50mL/g)中结晶,得到为白色固体的产物(4b;方案1;实施例1),40%收率。1HNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=8.81(t,J=5.5Hz,1H),8.43(s,1H),8.14(d,J=4.4,1H),8.09(bs,1H),7.96(m,1H),7.79(m,1H),7.75(bs,1H),7.53(m,4H),6.14(t,J=6.6Hz,1H),5.24(d,J=4.3Hz,1H),5.01(t,J=5.6Hz,1H),4.90(dd,J=15.6,13.4Hz,1H),4.89(dd,J=15.5,13.2Hz,1H),4.26(m,J=4.1Hz,1H),3.84(dd,J=8.4,4.4Hz,1H),3.58(m,2H),2.20(m,2H).13CNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=165.45(1C),163.58(1C),153.57(1C),143.93(1C),136.07(1C),134.20(1C),133.32(1C),128.61(1C),127.59(1C),126.34(1C),125.89(1C),125.53(1C),125.07(1C),123.36(1C),98.82(1C),87.71(1C),85.99(1C),70.13(1C),61.16(1C),42.42(1C),40.14(1C)。MSm/z:C21H21N4O5的[M-]计算值,409.42;实测值,409.1(ESI-)。
4-N-乙酰基-5-(N-1-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(5b):向100mL圆底烧瓶中装入(4b)(1.17g,2.85mmol)和无水四氢呋喃(26mL)并搅拌以形成灰白色浆料。向混合物中滴加乙酸酐(1.4mL,14.3mmol,5当量),同时在室温下进行搅拌。搅拌反应混合物并加热到50℃达21h。取出等分试样用于TLC分析(硅胶,洗脱液:10%甲醇/90%二氯甲烷(v/v),Rf(4b)=0.61,Rf(5b)=0.12),其指示反应完全。将反应烧瓶转移至冰浴并搅拌>1h。然后过滤混合物并用冻冷的异丙醚冲洗滤饼。将所得到的固体收集起来并进一步真空蒸发,产生细的灰白色晶体(1.01g,78.2%收率)。1HNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=11.35(s,1H),9.07(t,J=4.6Hz,1H),8.74(s,1H),8.15(d,J=8.7Hz,1H),7.96(m,1H),7.87(m,1H),7.53(m,4H),6.11(t,J=6.2Hz,1H),5.29(d,J=4.2Hz,1H),5.08(t,J=5.4Hz,1H),4.92(dd,J=15.5,10.1Hz,1H),4.91(dd,J=15.7,9.7Hz,1H),4.28(dt,J=9.4,3.8Hz,1H),3.92(dd,J=7.6,3.9Hz,1H),3.64(m,1H),3.58(m,1H),2.42(s,3H),2.35(m,1H),2.22(m,1H).13CNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=171.27(1C),165.53(1C),159.77(1C),153.20(1C),146.30(1C),136.48(1C),134.17(1C),133.74(1C),131.26(1C),129.02(1C),128.12(1C),126.83(1C),126.33(1C),125.95(1C),123.80(1C),100.38(1C),88.74(1C),87.63(1C),70.25(1C),61.29(1C),41.13(1C),40.92(1C),26.71(1C)。MSm/z:C23H23N4O6的[M-]计算值,451.46;实测值,451.1(ESI-)。
5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-4-N-乙酰基-5-(N-1-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(6b):如针对6b)所述进行制备,为无色固体,59%收率。1HNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=11.40(s,1H),9.35(bt,1H),8.48(s,1H),8.02(m,1H),7.96(m,1H),7.86(d,J=8.4Hz,1H),7.54(m,2H),7.40(m,2H),7.35(m,1H),7.25(m,8H),6.85(d,J=8.9Hz,4H),6.09(t,J=6.1Hz,1H),5.32(d,J=3.7Hz,1H),4.72(dd,J=14.9,4.8Hz,1H),4.60(dd,J=15.1,3.4Hz,1H),4.16(dt,J=10.9,4.7Hz,1H),4.04(m,1H),3.70(s,6H),3.29(dd,J=10.5,6.4Hz,1H),3.18(dd,J=10.4,7.0Hz,1H),2.43(s,3H),2.38(m,1H),2.26(m,1H)。13CNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=171.25(1C),165.37(1C),159.88(1C),158.52(1C),158.54(1C),153.03(1C),146.32(1C),145.31(1C),136.05(1C),135.97(1C),133.92(1C),133.74(1C),131.22(1C),130.20(2C),130.11(2C),129.05(1C),128.30(2C),128.15(2C),127.16(1C),126.81(1C),126.33(1C),125.85(1C),125.80(1C),123.65(1C),113.61(4C),100.49(1C),88.12(1C),86.79(1C),86.17(1C),70.59(1C),64.40(1C),55.41(2C),41.01(1C),40.70(1C),40.82(1C),26.76(1C)。MSm/z:C44H41N4O8的[M-]计算值,753.83;实测值,753.21(ESI-)。
5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-4-N-乙酰基--5-(N-1-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷-3'-O-(N,N-二异丙基-O-2-氰乙基亚磷酰胺)(7b):如针对(7a)所述进行制备,为白色泡沫状物(88%收率)。1HNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=11.41(s,1H),9.13(bs,1H),8.56/8.54(s,1H),8.01(m,1H),7.95(m,1H),7.85(m,1H),7.53(m,2H),7.37(m,2H),7.24(m,9H),6.83(m,4H),6.06(m,1H),4.66(m,2H),4.39(m,1H),4.16(m,1H),3.68(m,8H),3.52(m,2H),3.28(m,1H),3.20(m,1H),2.74(t,J=5.8Hz,1H),2.63(t,J=5.9Hz,1H),2.45(m,5H),1.09(m,9H),0.96(d,J=6.8Hz,3H).31PNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=146.93/146.69(s,1P)。MSm/z:C53H58N6O9P的[M-]计算值,954.05;实测值,953.3(ESI-)。
实施例3:5-(N-3-苯基丙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷的合成
本实施例提供制备5-(N-3-苯基丙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(或PPdC;参见实施例1中的方案1(4c))的方法。
起始物质:5-碘-2'-脱氧胞苷;5-碘-2'-O-甲基-胞苷;5-碘-2'-脱氧-2'-氟胞苷购自ChemGenesCorporation(Wilmington,MA01887,USA)或ThermoFisherScientificInc.(Waltham,MA02454,USA)。99.9%纯度的一氧化碳(安全性:有毒气体)购自SpecialtyGasesofAmerica(Toledo,OH43611,USA)。所有其它试剂均购自Sigma-Aldrich(Milwaukee,WI53201,USA)并且原样使用。
5-(N-3-苯基丙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(4c):如针对(4a)所述进行制备(40nmol规模),使用3-苯基丙胺(6当量)代替苄胺且在室温下反应时间为48小时。在旋转蒸发器上除去溶剂后,将残余物用二***(~30mL/g)进行研磨以萃取过量的3-苯基丙胺,将胶状残余物溶于热的乙醇,在室温下搅拌18h,接下来在0℃下搅拌1h。将所得到的混合物过滤并将母液蒸发,得到棕色树脂。将此溶于二氯甲烷和水的温热混合物。在室温下搁置并搅拌后,在有机层中以及也在水层中形成白色羽状晶体。将三相混合物过滤并用二***洗涤滤饼,得到为蓬松白色固体的(4c)(10.78g,69.5%收率)。1HNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=8.39(s,1H),8.13(t,J=5.3Hz,1H),8.05(bs,1H),7.71(bs,1H),7.28(t,J=7.4,2H),7.22(d,J=7.0,2H),7.17(t,J=7.4,1H),6.13(t,J=6.4Hz,1H),5.22(d,J=4.3Hz,1H),5.07(t,J=5.5Hz,1H),4.26(dt,J=9.4,4.1Hz,1H),3.83(dd,J=7.8,3.9Hz,1H),3.66(m,1H),3.58(m,1H),3.19(dd,J=12.9,6.7Hz,2H),2.61(t,J=7.5Hz,2H),2.19(m,2H),1.78(m,J=7.4Hz,2H)。13CNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=165.34(1C),163.56(1C),153.60(1C),143.53(1C),141.70(1C),128.38(2C),128.33(2C),125.78(1C),98.99(1C),87.63(1C),85.86(1C),69.82(1C),60.96(1C),40.36(1C),38.58(1C),32.63(1C),32.63(1C)。MSm/z:C19H23N4O5的[M-]计算值,387.42;实测值,387.1(ESI-)。
4-N-乙酰基-5-(N-3-苯基丙基)甲酰胺-2'-脱氧胞苷(5c):对(4c)(10.8g,28mmol)在无水THF(100mL)中的溶液进行搅拌并用乙酸酐(3当量)逐滴进行处理。将溶液在室温下搅拌18小时,得到稀的悬浮液。通过滴加二异丙醚(35mL)缓慢地稀释混合物。借助过滤分离固体并真空干燥,得到为白色固体的(5c)(8.44g,70.5%收率)。1HNMR(400MHz,d6-DMSO):δ=11.34(s,1H),8.69(s,1H),8.41(t,J=5.2Hz,1H),7.23(m,5H),6.09(t,J=6.0Hz,1H),5.15(bs,2H),4.27(m,1H),3.90(dd,J=9.6,3.8Hz,1H),3.68(m,1H),3.59(m,1H),3.21(dd,J=12.3,7.0Hz2H),2.62(m,2H),2.40(s,3H),2.33(m,1H),2.21(m,1H),1.79(m,2H)。13CNMR(400MHz,d6-DMSO):δ=171.21(1C),165.34(1C),159.73(1C),153.21(1C),146.01(1C),142.08(1C),128.80(2C),128.75(2C),126.22(1C),99.14(1C),88.61(1C),87.41(1C),69.88(1C),61.05(1C),41.04(1C),39.22(1C),33.01(1C),30.97(1C),26.67(1C)。MSm/z:C21H25N4O6的[M-]计算值,429.45;实测值,429.1(ESI-)。
5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-4-N-乙酰基-5-(N-3-苯基丙基)甲酰胺-2'-脱氧胞苷(6c):如针对实施例1中的(6a)所述由(5c;方案1;实施例1)进行制备,为白色泡沫状物(64.6%收率)。1HNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=11.38(s,1H),8.56(t,J=5.2Hz,1H),8.37(s,1H),7.35(d,J=7.4Hz,2H),7.21(m,12H),6.80(m,4H),6.11(t,J=6.0Hz,1H),5.32(d,J=4.8Hz,1H),4.16(dt,J=10.8,4.7Hz,1H),4.04(m,1H),3.70(d,J=2.2Hz,6H),3.26(dd,J=10.6,6.1Hz,1H),3.21(dd,J=10.5,3.3Hz,1H),3.03(m,1H),2.95(m,1H),2.49(s,2H),2.43(s,3H),2.39(m,1H),2.23(m,1H),1.57(m,2H)。13CNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=170.77(1C),164.81(1C),159.41(1C),158.07(1C),158.06(1C),152.69(1C),145.18(1C),144.81(1C),141.53(1C),135.51(1C),135.50(1C),129.70(2C),129.61(2C),128.32(2C),128.29(2C),127.81(2C),127.66(2C),126.66(1C),125.79(1C),113.13(4C),100.37(1C),87.47(1C),86.40(1C),85.72(1C),70.03(1C),59.80(1C),54.99(1C),54.97(1C),40.48(1C),38.92(1C),32.64(1C)32.29(1C),26.27(1C)。MSm/z:C42H43N4O8的[M-]计算值,731.83;实测值,731.2(ESI-)。
5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-4-N-乙酰基-5-(N-3-苯基丙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷-3'-O-(N,N-二异丙基-O-2-氰乙基亚磷酰胺)(7c):如针对实施例1中的(7a)所述由(6c;方案1;实施例1)进行制备。向在氩气氛下含有6c(7.11g,9.70mmol)的500mL圆底烧瓶中装入无水二氯甲烷(97mL)。将无水N,N-二异丙基乙胺(3.4mL,19.4mmol)加入到烧瓶中,并且在搅拌的同时将混合物冻冷到0℃。经半小时的过程,将2-氰乙基二异丙基氯亚磷酰胺(2.6mL,11.6mmol)滴加到快速搅拌混合物中。使混合物缓慢地升至室温,同时对其进行搅拌。17小时后,对反应进行取样用于TLC,其显示反应完全(硅胶;洗脱液75%乙酸乙酯/25%己烷(v/v),Rf(6c)=0.10,Rf(7b)=0.46/0.56[两种异构体])。使用甲苯将反应混合物转移到250mL分液漏斗中,并通过用冷的经氩吹洗的2%碳酸氢钠溶液(2x,400mL/洗涤)进行洗涤来淬灭。收集有机层并蒸发,直到大部分二氯甲烷已被除去。用冻冷的经氩吹洗的甲苯使有机层返回到分液漏斗中,并用冻冷的经氩吹洗的去离子水(2x,400mL/洗涤)进行洗涤。然后用冻冷的经氩吹洗的乙酸乙酯稀释有机层,并用盐水(1x,400mL)进行洗涤。将有机层收集起来,经硫酸钠干燥,过滤并蒸发。将经后处理的反应混合物用二氯甲烷溶解并装载到经预调节的柱(如针对(6b)所述制备)上面,并且用冻冷的经氩吹洗的流动相(80%乙酸乙酯/20%己烷)进行洗脱,并且在密封的经氩吹扫的瓶中收集含产物的级分以限制产物与空气接触。在<40℃下蒸发含产物的级分,产生白色泡沫状物(6.16g,68.0%收率)。1HNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=11.40(s,1H),8.56(m,1H),8.47/8.43(s,1H),7.35(m,2H),7.20(m,12H),6.80(m,4H),6.08(m,1H),4.40(m,1H),4.18(m,1H),3.70(m,8H),3.53(m,2H),3.30(m,2H),3.00(m,2H),2.75(t,J=5.9Hz,1H),2.63(t,J=5.9Hz,1H),2.56(m,1H),2.50(m,2H),2.40(m,4H),1.59(m,2H),1.11(m,9H),0.97(d,J=6.8Hz,3H)。31PNMR(500MHz,d6-DMSO):δ=147.60/147.43(s,1P)MSm/z:C51H60N6O9P的[M-]计算值,932.05;实测值,931.4(ESI
实施例4:通过两级制备型HPLC进行的三磷酸核苷纯化
本实施例提供纯化三磷酸核苷的方法。
借助于两种正交制备型HPLC技术纯化粗的三磷酸酯(9a-c):阴离子交换色谱法,其用以使三磷酸核苷与其它核苷副产物(如二磷酸酯和单磷酸酯)分离;和反相色谱法,其用以除去反应试剂的残余副产物。
以两次注射进行阴离子交换色谱法,对于每个0.5mmol反应使用以Source15Q树脂填充的HPLC柱,用两种三乙基碳酸氢铵缓冲液的线性洗脱梯度液洗脱(表1)。所需的三磷酸酯通常是自柱洗脱的最终物质,在HPLC色谱图上为具有10-12分钟宽度的宽峰。对级分进行分析,并且合并含产物的级分并在GenevacVC3000D蒸发器中进行蒸发,产生无色至浅褐色树脂。将此在去离子水中进行重构并应用于单次注射,用于NovapakHRC18制备柱上的反相纯化,所述柱用乙腈在三乙基乙酸铵缓冲液中的线性梯度液(表2)洗脱。合并含纯三磷酸酯的级分并蒸发,产生无色至浅褐色树脂。
将最终的纯三磷酸酯(9a-c)在去离子水中进行重构,用于分析并使用HewlettPackard8452A二极管阵列分光光度计在240nm进行定量(表3)。
表1:AEX纯化条件
表2:RP-HPLC纯化条件
表3:三磷酸酯收率和纯度
5-(N-1-苄基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷-5'-O-三磷酸酯(9a)。1HNMR(300MHz,D2O):δ=8.45(s,1H),7.25(m,5H),6.14(t,J=6.9Hz,1H),4.57(m,J=2.9Hz,1H),4.43(dd,J=20.2,15.4Hz,2H),4.17(m,3H),2.39(m,1H),2.27(m,1H)。13CNMR31PNMR(300MHz,D2O):δ=-9.96(d,J=50.0Hz,1P),-11.43(d,J=50.8Hz,1P),-23.24(t,J=50.5Hz,1PMSm/z:C17H21N4O14P3的[M-]计算值,599.04;实测值,599.1[M]-。
5-(N-1-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷-5'-O-三磷酸酯(9b):1HNMR(500MHz,D2O):δ=8.12(s,1H),7.98(d,J=8.5Hz,1H),7.69(d,J=8.1Hz,1H),7.58(m,1H),7.40(m,1H),7.33(m,1H),7.24(m,1H),5.87(t,J=6.7Hz,1H),4.66(d,J=8.1Hz,2H),4.40(m,J=3.0Hz,1H),4.04(m,3H),2.21(ddd,J=14.1,6.0,3.4Hz,1H),2.06(m,1H).13CNMR(500MHz,D2O):δ=165.95(s,1C),163.15(s,1C),155.22(s,1C),143.33(s,1C),133.35(s,1C),133.17(s,2C),130.55(s,2C),128.66(s,1C),127.84(s,1C),126.65(s,1C),126.13(s,1C),125.64(s,1C),125.12(s,1C),123.11(s,1C),100.55(s,1C),86.88(s,1C),85.87(d,J=55.95Hz,1C),70.76(s,1C),65.38(d,J=36Hz,1C),41.19(s,1C),39.61(m,1C).31PNMR(500MHz,D2O):δ=-10.99(d,J=82.4Hz,1P),-11.61(d,J=84.9Hz,1P),-23.47(t,J=83.5Hz,1P)。MSm/z:C21H24N4O14P3的[M-]计算值,649.36;实测值,649.0(ESI-)。
5-(N-3-苯基丙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷-5'-O-三磷酸酯(9c)。1HNMR(500MHz,D2O):δ=8.07(s,1H),7.11(m,4H),6.98(m,1H),6.00(t,J=6.5Hz,1H),4.44(m,J=3.0Hz,1H),4.06(m,3H),3.21(m,1H),3.13(m,1H),2.50(t,J=7.5Hz,2H),3.13(ddd,J=14.1,10.9,3.1Hz,1H),2.13(m,1H),1.76(m,2H)。13CNMR(500MHz,D2O):δ=165.85(s,1C),163.50(s,1C),155.73(s,1C),142.94(s,1C),142.40(s,1C),128.55(s,2C),128.40(s,2C),125.72(s,1C),101.15(s,1C),86.93(s,1C),85.96(d,J=55.2Hz,1C),70.90(s,1C),65.38(d,J=37.6Hz,1C),39.88(s,1C),39.55(s,1C),32.74(s,1C),26.68(s,1C)。31PNMR(500MHz,D2O):δ=-11.00(d,J=82.7Hz,1P),-11.09(d,J=85.7Hz,1P),-23.53(t,J=84.3Hz,1P).MSm/z:C19H25N4O14P3的[M-]计算值,627.35;实测值,627.0(ESI-)。
实施例5:固相寡核苷酸合成
使用ABI3900自动化DNA合成仪(AppliedBiosystems,FosterCity,CA),采用常规的亚磷酰胺方法,对于修饰的亚磷酰胺(7a-c)偶合条件稍有改变(表4)。试剂(7a)使用的是二氯甲烷/乙腈(1/1)中的0.1M溶液,且试剂(7b)和(7c)使用的是乙腈中的0.1M溶液。固体支持物为ABI式烧结柱,填充有控孔玻璃(CPG,PrimeSynthesis,Aston,PA),所述控孔玻璃载有3'-DMT-dT琥珀酸酯,孔尺寸通过用乙腈中的20%二乙胺处理接下来是气态甲胺裂解并在35℃下脱保护2小时来完成脱保护。在具有Agilent6130B单四极杆质谱检测器的Agilent1290Infinity上,使用AcquityOSTC18柱1.7μm2.1x100mm(WatersCorp.,Milford,MA),在11分钟内使用0至25%B的梯度液(缓冲液A:100mM1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇,8.6mM三乙胺,pH8.25;缓冲液B:90%乙腈中的10%缓冲液A)确定产物的特性(Identity)和全长百分比(%FL)。
表4.ABI3900偶合循环参数(50nmol规模)
关键词:
ACN乙腈
Deblock甲苯中10%的二氯乙酸
活化剂ACN中的0.3M5-苄基巯基四唑和0.5%N-甲基咪唑
氧化剂44.9%ACN/45%吡啶/10.1%水中0.025M的碘
帽A吡啶和四氢呋喃中的乙酸酐
帽B四氢呋喃中的1-甲基咪唑
Ar干氩冲洗20秒
引物延伸测定:使用含所有可能的三重核苷酸组合的标准模板在引物延伸测定中评价作为KOD核酸外切酶-缺失DNA聚合酶的底物的修饰的三磷酸核苷。模板序列为:
5′-TTTTTTTTCTTCTTCTCCTTTCTCTTCCCAAAATCACACGGACCCAGGGCATTCTAGATATGGTTTACGCTCAAGCGAACTTGCCGTCCTGAGTGTAAAGAGGGAAAgagggcagggtgtggcatatatat-3′(RC70X27.37,TriLinkBiotechnologies)(SEQIDNO:1)。
引物序列为:
5′-atatatatgccacaccctgccctc-3′((AT)4-5P27,IDTTechnologies)(SEQIDNO:2)。
简言之,在37℃下用10pmol的32P-ATP与7mMTris-HCl(pH7.6,在25℃下)、10mMMgCl2、5mM二硫苏糖醇中的3'磷酸酶缺失T4多核苷酸激酶(NewEnglandBiolabs)标记10pmol引物30分钟,并通过经过两个SephadexG-50柱(GEHealthcare)纯化。30μL引物延伸反应含有120mMTris-HCl(pH7.8)、10mMKCl、7mMMgSO4、6mM(NH4)2SO4、0.001%BSA、0.1%TritonX-100、3pmol的模板、6pmol的引物和7.5个单位的KOD核酸外切酶-缺失DNA聚合酶(EMDNovagen)。在MJ热循环仪(Bio-Rad)中,在96孔板中在96℃下温育反应30秒,并在65℃下温育反应1小时。
将5μL样品在8%丙烯酰胺、7M脲、1xTBE凝胶(LifeTechnologies)上进行分析,并在成像板上暴露1小时,之后才在FujiFilmFLA3000磷光成像仪(GEHealthcare)中扫描。
实施例6:具有胞苷-5-甲酰胺修饰的核苷酸的核酸分子的合成
本实施例提供制备具有胞苷-5-甲酰胺修饰的核苷酸的核酸分子的方法。
测试CEP(亚磷酰胺)试剂(7a-c;方案1,实施例1)在自动化合成仪上使用固相寡核苷酸合成。对于每一新的亚酰胺试剂,基于下面所示的模型序列,采用在连续的内部位置中***0、1、2、3、4或5个胞苷-5-甲酰胺修饰的核苷酸来合成长度为34至39个核苷酸(或长度为34、35、36、37、38或39个核苷酸)的长度不等的六种不同的寡核苷酸。序列中的“X”指示序列内的胞苷-5-甲酰胺修饰的核苷酸的位置。
5′-GAGTGACCGTCTGCCTGX0-5CAGACGACGAGCGGGA-3′(SEQIDNO:3)
下表5汇总用0至5个胞苷-5-甲酰胺修饰的核苷酸合成寡核苷酸的百分比收率。
表5:结合修饰的2'-脱氧胞苷的合成DNA序列
结果指示修饰的胞苷亚磷酰胺(7a-c)的1至3个顺序偶合的全长合成收率同未修饰的DNA亚磷酰胺相当。对于修饰的胞苷的4或5个顺序偶合观察到收率的一些损失;然而得到了显著量的全长产物并且在所有的情况下得到了确认。
实施例7:通过KODDNA聚合酶结合胞苷-5-甲酰胺修饰的核苷酸的三磷酸酯试剂(TPP试剂)
本实施例显示胞苷-5-甲酰胺修饰的核苷酸(方案2的9a、9b和9c)通过KOD核酸外切酶-缺失DNA聚合酶可用作底物。
下图1显示引物延伸测定的结果。所有三种修饰的胞苷三磷酸酯在此测定中至少如天然未修饰的2'-脱氧胞苷一样有效地结合。
概括地说,以5'-O-三磷酸酯和3'-O-CEP亚磷酰胺两者的形式合成胞苷-5-甲酰胺修饰的核苷酸的实用方法提供了用于适体的体外选择和后SELEX优化的有价值的新试剂。
实施例8:采用SELEX选择胞苷-5-甲酰胺修饰的核苷酸适体
本实施例显示可采用SELEX选择用于与蛋白质靶结合的胞苷-5-甲酰胺修饰的核苷酸适体。进一步地,本实施例显示来源于针对特定蛋白质靶的SELEX的胞苷-5-甲酰胺修饰的核苷酸适体同来源于针对相同蛋白质靶的SELEX的尿苷-5-甲酰胺修饰的核苷酸适体的比较。
四种不同的蛋白质用作SELEX的靶:PCSK9、PSMA、ERBB2和ERBB3。
使用KODDNA聚合酶采用标准寡核苷酸合成方案酶促合成修饰的随机文库。随机文库包括标记为“dC/dT”且不含C-5修饰的核苷酸的对照文库;NapdC文库、NapdU(5-[N-(1-萘基甲基)甲酰胺]-2'-脱氧尿苷)文库、PPdC文库和PPdU(5-[N-(苯基-3-丙基)甲酰胺]-2'-脱氧尿苷)文库。采用靶向每个文库至少5nmol最终产物的这些相同的条件酶促合成所有随机文库(自起始反义模板50-60%收率)。使用10kDaNMW截止超滤离心装置浓缩粗文库。使用SPIN-X微量离心管使浓缩产物旋转减慢以除去任何链霉亲和素(SA)琼脂糖珠,并通过在260nm测量吸光度且使用估计的吸光系数进行定量。每个修饰的有义文库针对其不能转移游离SA而污染生物素化反义链以及还有标准PCR扩增条件而进行品质控制(数据未显示)。
具有C-末端polyHis标签且产生于人293(HEK293)细胞中的重组人PCSK9蛋白Gln31-Gln692(75.1kDa)得自ACROBiosystems(目录号PC9-H5223)。将此蛋白质糖基化并且自动蛋白水解裂解的DTT还原蛋白在SDS-PAGE凝胶上运行为20KDa(前结构域)和62kDa(成熟分泌蛋白)多肽。
重组人PSMA(~110kDa)得自R&DSystems(目录号4234-ZN-010),其为具有N-末端6XHis标签的CHO来源的Lys44-Ala750。
具有C-末端polyHis标签且产生于人293(HEK293)细胞的重组人ErbB2蛋白Thr23-Thr652(72.4kDa)得自ACROBiosystems(目录号HE2-H5225)。作为糖基化的结果,DTT还原蛋白针对此靶在SDS-PAGE上在90-110kDa范围迁移。
具有C-末端6XHis标签且产生于人293(HEK293)细胞中的重组人ErbB3蛋白Ser20-Thr643(71.5kDa)得自ACROBiosystems(目录号ER3-H5223)。作为糖基化的结果,DTT还原蛋白针对此靶在SDS-PAGE上在100-110kDa范围迁移。
使用磁性His-Tag捕获珠Lifetechnologies(目录号10104D)对于SELEX中使用的所有靶针对其纯度和分隔捕获效率进行检查。使用His标签捕获珠有效地捕获所有靶。
对于所有的选择步骤遵循SELEX方案(5mMDxSO4动力学激发起始第2轮)。对于第一轮,对于每个SELEX实验使用1000pmol(~1015个序列)随机文库。靶为50皮摩尔浓度(捕获在500μgHis捕获珠上)且复合物在37℃下平衡1小时,然后用1XSB18,0.05%TWEEN20洗涤若干次。选定的序列用20mMNaOH洗脱,中和,并使用5’OH引物和3'生物素化引物进行PCR扩增。扩增的双链未修饰的DNA被捕获在SA磁性珠上,洗涤并洗脱掉有义DNA,并使用修饰的核苷酸进行引物延伸,以再生富集的修饰汇集物待用于下一轮SELEX实验。
总共完成六轮选择。一般来说,在+/-蛋白质选择样品的Ct差没有改进时样品为1nM蛋白质浓度,指示可能没有序列的进一步富集,在第6轮停止SELEX,对于所有样品制得修饰的有义eDNA,并进行对相应靶汇集亲和力。应当注意的是,按同修饰文库类似的方式处理未修饰的对照DNA富集文库,即使经PCR扩增并洗脱的有义DNA链可直接用于之后的SELEX轮次。
对eDNA进行放射性标记并对所有富集的汇集物进行过滤结合测定,并与相应的起始随机文库进行比较。随机文库不同四种蛋白质结合。表6显示四种蛋白质靶PCSK9、PSMA、ERBB2和ERBB3的亲和力数据结果。
表6:6轮SELEX后的靶汇集物亲和力数据
如表6中所示,经由SELEX针对同PSMA靶蛋白结合而富集的具有至少一个C-5修饰的胞苷核苷酸的核酸适体的汇集物的平均结合亲和力(Kd)为0.86nM(NapdC),相比之下具有针对相同蛋白质的NapdU的核酸适体的汇集物为7.8nM;以及6.32nM(PPdC),相比之下具有针对相同蛋白质的PPdU的核酸适体的汇集物为6.79nM。经由SELEX针对同ERBB3靶蛋白结合而富集的具有至少一个C-5修饰的胞苷核苷酸的核酸适体的汇集物的平均结合亲和力(Kd)为0.25nM(NapdC),相比之下具有针对相同蛋白质的NapdU的核酸适体的汇集物为0.38nM。
针对同蛋白质PSCK9、PSMA、ERBB2和ERBB3结合而富集的核酸适体的SELEX汇集物的进一步分析显示,用具有至少一个C-5修饰的胞苷核苷酸的核酸适体进行的SELEX相比于用具有至少一个C-5修饰的尿苷核苷酸的核酸适体进行的SELEX提供更大数目的多拷贝(大于两(2)个拷贝)核酸序列。下表7汇总了用NapdC、NapdU、PPdC和PPdU进行的SELEX的差异。
表7:6轮SELEX后的多拷贝(>2)序列的数目
一般来说,表7显示C-5修饰的胞苷核苷酸提供了较大数目的在针对经由SELEX的靶蛋白结合而富集的核酸适体序列的汇集物中具有超过两个拷贝的序列。因此,一般来说,针对蛋白质靶的SELEX中的C-5修饰的胞苷核苷酸提供多拷贝核酸序列的较大多样性,这因此提供了较大数目的核酸适体来选择用于进一步表征和开发成为蛋白质结合试剂和/或治疗剂。鉴于与针对特定目的开发的核酸适体相关的挑战会更好地意识到C-5修饰的胞苷核苷酸的这种益处(例如,用于测定-拉下测定、蛋白质纯化、质谱法的蛋白质结合剂;试剂工具和/或治疗剂-蛋白质激动剂或拮抗剂)。较大数目的多拷贝核酸适体提供较大数目的可针对特定目的而进行筛选并进一步开发的序列,并且减少这种开发的失败率。
参考文献
Gold,L.etal.(2010)Aptamer-basedproteomictechnologyforbiomarkerdiscovery.PLoSONE,5(12),e15004.
Hollenstein,M.(2012)SynthesisofDeoxynucleosideTriphosphatesthatIncludeProline,Urea,orSulfonamideGroupsandTheirPolymeraseIncorporationintoDNA.Chemistry,AEuropeanJournal,18,13320-13330.
Imaizumi,Y.etal.(2013)EfficacyofBase-ModificationonTargetBindingofSmallMoleculeDNAAptamers.J.Am.Chem.Soc.,135(25),9412-9419.
Davies,D.R.etal.(2012)UniquemotifsandhydrophobicinteractionsshapethebindingofmodifiedDNAligandstoproteintargets.PNAS,190(49),19971-19976.
Lee,K.Y.etal.(2010)BioimagingofNucleolinAptamer-Containing5-(N-benzylcarboxamide)-2′-deoxyuridineMoreCapableofSpecificBindingtoTargetsinCancerCells.J.BiomedicineandBiotechnology,articleID168306,9pages.
Kerr,C.E.etal.SynthesisofN,N-Dialkylaniline-2′-deoxyuridineConjugatesforDNA-MediatedElectronTransferStudies.Nucleosides,Nucleotides&NucleicAcids,19(5&6),851-866.
Gaballah,S.T.etal.(2002)Synthesisof5-(2,2′-Bipyridyl-and2,2′-Bipyridinediiumyl)-2′-deoxyuridineNucleosides:PrecursorstoMetallo-DNAConjugates.Nucleosides,Nucleotides&NucleicAcids21(8&9),547-560.
Vaught,J.D.etal..(2004)T7RNAPolymeraseTranscriptionwith5-PositionModifiedUTPDerivatives.J.Am.Chem.Soc.,126,11231-11237.
Vaught,J.D.;etal.(2010)ExpandingthechemistryofDNAforinvitroselection.J.Am.Chem.Soc.,132(12),4141-4151.
Nomura,Y.etal.(1997)Site-specificintroductionoffunctionalgroupsintophosphodiesteroligodeoxynucleotidesandtheirthermalstabilityandnuclease-resistanceproperties.NucleicAcidsRes.,25(14),2784-2791.
Nomura,Y.etal.(1996)NucleosidesandNucleotides.161.Incorporationof5-(N-aminoalkyl)carbamoyl-2′-deoxycytidinesintooligodeoxynucleotidesbyaconvenientpost-syntheticmodificationmethod.Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,6(23),2811-2816.
Uozumi,Y.etal.(2001)DoubleCarbonylationofArylIodideswithPrimaryAminesunderAtmosphericPressureConditionsUsingthePd/Ph3P/DABCO/THFSystem.J..Org.Chem.66,5272-5274.
Takacs,A.etal.(2008)Palladium-catalyzedAminocarbonylationofIodoarenesandIodoalkeneswithAminophosphonateasN-Nucleophile.Tetrahedron.64,8726-8730.
Ross,B.S.etal.(2006)EfficientLarge-ScaleSynthesisof5′-O-Dimethoxytrityl-N4-Benzoyl-5-methyl-2′-deoxycytidine.Nucleosides,Nucleotides&NucleicAcids,25,765-770.
Sanghvi,Y.S.etal.(2000)ImprovedProcessforthePreparationofNucleosidicPhosphoramiditesUsingaSaferandCheaperActivator.OrganicProcessResearch&Development,4,175-181.
Still,W.C.etal.(1978)RapidChromatographicTechniqueforPreparativeSeparationswithModerateResolution.J.Org.Chem.,43,2923-2925.
Leonard,N.J.andNeelima(1995)1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanolfortheRemovalofthe4,4′-DimethoxytritylProtectingGroupfromthe5′-HydroxylofAcid-SensitiveNucleosidesandNucleotides.TetrahedronLetters,36(43),7833-7836.
Ludwig,J.andEckstein,F.(1989)RapidandEfficientSynthesisofNucleoside5′-O-(1-Thiotriphosphates),5′-Triphosphatesand2′,3′-CyclophosphorothioatesUsing2-Chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphophorin-4-one.J.Org.Chem.,54,631-635.
Ito,T.etal.(2003)Synthesis,thermalstabilityandresistancetoenzymatichydrolysisoftheoligonucleotidescontaining5-(N-aminohexyl)carbamoyl-2′-O-methyluridines.NucleicAcidsRes.,31(10),2514-2523.
Claims (57)
1.一种包含式I中所示的结构的化合物及其盐:
其中
R独立地为-(CH2)n-,其中n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10;
RX1独立地选自
其中,*表示RX1基团与-(CH2)n-基团的附接点;且
其中,
RX4独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C20);羟基基团;卤素(F、Cl、Br、I);腈(CN);硼酸(BO2H2);羧酸(COOH);羧酸酯(COORX2);伯酰胺(CONH2);仲酰胺(CONHRX2);叔酰胺(CONRX2RX3);磺酰胺(SO2NH2);N-烷基磺酰胺(SONHRX2);
RX2和RX3每次出现时独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C20);苯基(C6H5);RX4取代的苯环(RX4C6H4),其中RX4定义如上;羧酸(COOH);羧酸酯(COORX5),其中RX5是支链或直链低级烷基(C1-C20);和环烷基,其中RX2=RX3=(CH2)n;
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3和-叠氮基;
R'独立地选自-H、-OAc、-OBz、-P(NiPr2)(OCH2CH2CN)和-OSiMe2tBu;
R”独立地选自氢、4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)和三磷酸酯(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2)或其盐;
Z独立地选自-H、取代或未取代的C(1-4)烷基;
有以下例外:
当n=4时,则RX1不能是H;
当n=3时,则RX1不能是CH3;
当n=0时,则RX1不能是–CH(CH3)2;和
当n=2并且RX1是且RX4是羟基时,则RX1不能是
2.如权利要求1所述的化合物,其中n是1、2或3。
3.如权利要求1所述的化合物,其中RX1选自
其中,
*表示RX1基团与-(CH2)n-基团的附接点;且
Z独立地选自-H、取代或未取代的C(1-4)烷基。
4.如权利要求1所述的化合物,其中RX4独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C6);-OH;-F和羧酸(COOH)。
5.如权利要求1所述的化合物,其中X独立地选自-H、-OH、-OMe和-F。
6.如权利要求1所述的化合物,其中R'选自-H、-OAc和-P(NiPr2)(OCH2CH2CN)。
7.如权利要求1所述的化合物,R"是三磷酸酯(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2)。
8.一种化合物,包含选自式II(BndC)、III(PEdC)、IV(PPdC)、V(NapdC)、VI(2NapdC)、VII(NEdC)和VIII(2NEdC)的结构:
其中
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3和-叠氮基。
9.一种核酸分子,包含如权利要求1所述的化合物。
10.如权利要求9所述的核酸分子,其中所述核酸分子包含RNA、DNA或其组合。
11.如权利要求9所述的核酸分子,其中所述核酸分子长度为15至100个核苷酸。
12.如权利要求9所述的核酸分子,其中所述核酸分子为适体。
13.如权利要求9所述的核酸分子,其中所述核酸分子的至少一个另外的核苷酸包含选自2'-位糖修饰、2'-氨基(2'-NH2)、2'-氟(2'-F)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-乙基(2'-OEt)、2'-O-丙基(2'-OPr)和2'-O-CH2CH2OCH3的化学修饰。
14.一种核酸分子,包含具有式1A中所示的结构的化合物及其盐:
其中
R独立地为-(CH2)n-,其中n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10;
RX1独立地选自:
其中,*表示RX1基团与-(CH2)n-基团的附接点;且
其中,
RX4独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C20);羟基基团;卤素(F、Cl、Br、I);腈(CN);硼酸(BO2H2);羧酸(COOH);羧酸酯(COORX2);伯酰胺(CONH2);仲酰胺(CONHRX2);叔酰胺(CONRX2RX3);磺酰胺(SO2NH2);N-烷基磺酰胺(SONHRX2);
RX2和RX3每次出现时独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C20);苯基(C6H5);RX4取代的苯环(RX4C6H4),其中RX4定义如上;羧酸(COOH);羧酸酯(COORX5),其中RX5是支链或直链低级烷基(C1-C20);和环烷基,其中RX2=RX3=(CH2)n;
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3和-叠氮基;
Z独立地选自-H、取代或未取代的C(1-4)烷基;
有以下例外:
当n=4时,则RX1不能是H;
当n=3时,则RX1不能是CH3;
当n=0时,则RX1不能是–CH(CH3)2;和
当n=2并且RX1是且RX4是羟基时,则RX1不能是
15.如权利要求14所述的核酸分子,其中n是1、2或3。
16.如权利要求14所述的核酸分子,其中RX1选自:
其中,
*表示RX1基团与-(CH2)n-基团的附接点;且
Z独立地选自-H、取代或未取代的C(1-4)烷基。
17.如权利要求14所述的核酸分子,其中RX4独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C6);-OH;-F和羧酸(COOH)。
18.如权利要求14所述的核酸分子,其中X独立地选自-H、-OH、-OMe和-F。
19.如权利要求14所述的核酸分子,其中所述核酸分子包含DNA、RNA或其组合。
20.如权利要求14所述的核酸分子,其中所述核酸分子长度为15至100个核苷酸。
21.如权利要求14所述的核酸分子,其中所述核酸分子为适体。
22.如权利要求14所述的核酸分子,其中所述核酸分子的至少一个另外的核苷酸包含选自2'-位糖修饰、2'-氨基(2'-NH2)、2'-氟(2'-F)、2'-O-甲基(2'-OMe)、2'-O-乙基(2'-OEt)、2'-O-丙基(2'-OPr)和2'-O-CH2CH2OCH3的化学修饰。
23.如权利要求14所述的核酸分子,还包含选自主链修饰、3'帽、5'帽及其组合的修饰。
24.如权利要求14所述的核酸分子,其中化合物包含选自式IIA、IIIA、IVA、VA、VIA、VIIA和VIIIA的结构:
其中
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3和-叠氮基。
25.一种制备具有式I的化合物的方法:
其中
R独立地为-(CH2)n-,其中n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10;
RX1独立地选自
其中,*表示RX1基团与-(CH2)n-基团的附接点;且
其中,
RX4独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C20);羟基基团;卤素(F、Cl、Br、I);腈(CN);硼酸(BO2H2);羧酸(COOH);羧酸酯(COORX2);伯酰胺(CONH2);仲酰胺(CONHRX2);叔酰胺(CONRX2RX3);磺酰胺(SO2NH2);N-烷基磺酰胺(SONHRX2);
RX2和RX3每次出现时独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C20);苯基(C6H5);RX4取代的苯环(RX4C6H4),其中RX4定义如上;羧酸(COOH);羧酸酯(COORX5),其中RX5是支链或直链低级烷基(C1-C20);和环烷基,其中RX2=RX3=(CH2)n;
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3和-叠氮基;
R'独立地选自-H、-OAc;-OBz;-P(NiPr2)(OCH2CH2CN);和-OSiMe2tBu;
R”独立地选自氢、4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)和三磷酸酯(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2)或其盐;
Z独立地选自-H、取代或未取代的C(1-4)烷基;
所述方法包括提供具有式IX的化合物
其中,
RX6是碘或溴基团;
RX7和RX8每次出现时独立地为氢或保护基团;
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3和-叠氮基;以及
在RX1-R-NH2、一氧化碳和溶剂的存在下通过钯(0)催化的反应转化具有式IX的化合物;以及
离析具有式I的化合物。
26.如权利要求25所述的方法,其中RX6是碘基团。
27.如权利要求25所述的方法,其中RX7和RX8是氢。
28.如权利要求25所述的方法,其中X选自-H、-OMe和-F。
29.如权利要求25所述的方法,其中n是1、2或3。
30.如权利要求25所述的方法,其中RX1选自:
其中,
*表示RX1基团与-(CH2)n-基团的附接点;且
Z独立地选自-H、取代或未取代的C(1-4)烷基。
31.如权利要求25所述的方法,其中RX4独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C6);-OH;-F和羧酸(COOH)。
32.如权利要求25所述的方法,其中R'选自-H、-OAc和-P(NiPr2)(OCH2CH2CN)。
33.如权利要求25所述的方法,R"是氢或三磷酸酯(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2);或其盐。
34.如权利要求25所述的方法,其中所述保护基团选自三苯基甲基、对甲氧苯基二苯基甲基、二对甲氧苯基二苯基甲基、对二甲氧基三苯甲基三苯甲基、甲酰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基、2-氯苄氧羰基、4-氯苯甲酰氧羰基、2,4-二氯苄氧羰基、糠基羰基、叔戊氧羰基、金刚烷氧羰基、2-苯基丙基-(2)-氧羰基、2-(4-联苯基)丙基-(2)-氧羰基、2-硝基苯基亚磺酰基和二苯基氧膦基。
35.如权利要求25所述的方法,其中在0.1个大气压与2个大气压之间的一氧化碳压力下进行所述钯(0)催化的反应。
36.如权利要求25所述的方法,其中所述溶剂选自二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯、丙酮、乙腈(MeCN)、二甲基亚砜(DMSO)和碳酸丙烯酯。
37.一种制备具有选自式II、III、IV、V、VI、VII和VIII的式的化合物的方法:
其中
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3和-叠氮基;
所述方法包括提供具有式IX的化合物
其中,
RX6是碘或溴基团;
RX7和RX8每次出现时独立地为氢或保护基团;
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3和-叠氮基;以及
在RX1-R-NH2、一氧化碳和溶剂的存在下通过钯(0)催化的反应转化具有式IX的化合物;以及
离析具有选自式II、III、IV、V、VI、VII和VIII的式的化合物。
38.如权利要求37所述的方法,其中RX6是碘基团。
39.如权利要求37所述的方法,其中RX7和RX8是氢。
40.如权利要求37所述的方法,其中X选自-H、-OMe和-F。
41.如权利要求37所述的方法,其中所述保护基团选自三苯基甲基、对甲氧苯基二苯基甲基、二对甲氧苯基二苯基甲基、对二甲氧基三苯甲基三苯甲基、甲酰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基、2-氯苄氧羰基、4-氯苯甲酰氧羰基、2,4-二氯苄氧羰基、糠基羰基、叔戊氧羰基、金刚烷氧羰基、2-苯基丙基-(2)-氧羰基、2-(4-联苯基)丙基-(2)-氧羰基、2-硝基苯基亚磺酰基和二苯基氧膦基。
42.如权利要求37所述的方法,其中所述溶剂选自二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯、丙酮、乙腈(MeCN)、二甲基亚砜(DMSO)和碳酸丙烯酯。
43.如权利要求37所述的方法,其中在0.1个大气压与2个大气压之间的一氧化碳压力下进行所述钯(0)催化的反应。
44.一种制备核酸分子的方法,所述核酸分子包含具有式IA的化合物及其盐:
其中
R独立地为-(CH2)n-,其中n是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10;
RX1独立地选自:
其中,*表示RX1基团与-(CH2)n-基团的附接点;且
其中,
RX4独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C20);羟基基团;卤素(F、Cl、Br、I);腈(CN);硼酸(BO2H2);羧酸(COOH);羧酸酯(COORX2);伯酰胺(CONH2);仲酰胺(CONHRX2);叔酰胺(CONRX2RX3);磺酰胺(SO2NH2);N-烷基磺酰胺(SONHRX2);
RX2和RX3每次出现时独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C20);苯基(C6H5);RX4取代的苯环(RX4C6H4),其中RX4定义如上;羧酸(COOH);羧酸酯(COORX5),其中RX5是支链或直链低级烷基(C1-C20);和环烷基,其中RX2=RX3=(CH2)n;
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3和-叠氮基;
Z独立地选自-H、取代或未取代的C(1-4)烷基;
所述方法包括合成具有多个核苷酸和至少一种具有式IA的化合物的核酸分子。
45.一种制备核酸分子的方法,所述核酸分子包含具有选自式IIA、IIIA、IVA、VA、VIA、VIIA和VIIIA的式的化合物:
其中
X独立地选自-H、-OH、-OMe、-O-烯丙基、-F、-OEt、-OPr、-OCH2CH2OCH3和-叠氮基;
所述方法包括合成具有多个核苷酸和至少一种具有选自式IIA、IIIA、IVA、VA、VIA、VIIA和VIIIA的式的化合物的核酸分子。
46.一种选择对靶分子具有结合亲和力的核酸适体的方法,包括:
(a)使候选混合物与所述靶接触,其中所述候选混合物包含其中所述候选混合物的至少一种或每种核酸适体中的一种、若干或所有嘧啶包含如权利要求1至8中任一项所述的化合物的修饰的核酸适体,且其中对所述靶分子具有结合亲和力的核酸适体形成核酸适体-靶分子复合物;
(b)自所述候选混合物分隔所述核酸适体-靶分子复合物;
(c)解离所述核酸适体-靶分子复合物以生成游离的核酸适体;
(d)扩增所述游离的核酸适体以产生相对于所述候选混合物中的其它核酸而言自所述靶分子的解离半衰期增加的核酸适体;
(e)识别至少一种其中一种、若干或所有嘧啶包含如权利要求1至8中任一项所述的化合物的核酸适体,其中所述核酸适体对所述靶分子具有结合亲和力。
47.如权利要求46所述的方法,其中用富集了能够与所述靶分子结合并且当结合于所述靶分子时具有慢解离速率的核酸序列的核酸适体的混合物重复步骤a)到d),以进一步富集能够与所述靶分子结合并且当结合于所述靶分子时具有慢解离速率的核酸序列。
48.如权利要求46所述的方法,其中所述慢解离速率核酸适体的解离的速率为约2分钟至约360分钟(或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、45、60、75、90、105、120、150、180、210、240、270、300、330或360分钟)。
49.如权利要求46所述的方法,其中所述慢解离速率核酸适体的解离的速率大于或等于约2分钟(或大于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、45、60、75、90、105、120、150、180、210、240、270、300、330或360分钟)。
50.如权利要求46所述的方法,其中所述靶分子是蛋白质或肽。
51.如权利要求46所述的方法,其中所述靶分子选自PSCK9蛋白、PSMA蛋白、ERBB2蛋白和ERBB3蛋白。
52.如权利要求46所述的方法,其中所述至少一种核酸适体能够以小于100nM或约0.1nM至约100nM(或0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、8990、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100nM)的平衡结合常数(Kd)结合所述靶分子。
53.如权利要求46所述的方法,进一步包括使所述候选混合物暴露于慢解离速率富集过程。
54.如权利要求53所述的方法,其中在步骤(b)之前进行所述慢解离速率富集过程。
55.如权利要求53所述的方法,其中所述慢解离速率富集过程选自加入竞争分子、稀释步骤、加入竞争分子随后是稀释步骤的组合、稀释步骤随后是加入竞争分子的组合,以及同时加入竞争分子和稀释步骤的组合。
56.如权利要求55所述的方法,其中所述竞争分子是聚阴离子。
57.如权利要求55所述的方法,其中所述竞争分子选自寡核苷酸、dNTP、肝素和硫酸葡聚糖。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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US61/907,274 | 2013-11-21 | ||
PCT/US2014/066328 WO2015077292A1 (en) | 2013-11-21 | 2014-11-19 | Cytidine-5-carboxamide modified nucleotide compositions and methods related thereto |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105658658A true CN105658658A (zh) | 2016-06-08 |
CN105658658B CN105658658B (zh) | 2019-11-05 |
Family
ID=53180088
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201480058137.0A Active CN105658658B (zh) | 2013-11-21 | 2014-11-19 | 胞苷-5-甲酰胺修饰的核苷酸组合物及其相关方法 |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9938314B2 (zh) |
EP (2) | EP3071588A4 (zh) |
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TW (1) | TWI632155B (zh) |
WO (1) | WO2015077292A1 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107663220A (zh) * | 2016-07-27 | 2018-02-06 | 上海伯豪医学检验所有限公司 | 修饰碱基、包含修饰碱基的核酸、适配体及其应用 |
CN114524855A (zh) * | 2022-02-22 | 2022-05-24 | 武汉大学 | 一种5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体的合成方法 |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8975026B2 (en) | 2007-01-16 | 2015-03-10 | Somalogic, Inc. | Method for generating aptamers with improved off-rates |
US8598140B2 (en) * | 2010-04-12 | 2013-12-03 | Somalogic, Inc. | Aptamers to β-NGF and their use in treating β-NGF mediated diseases and disorders |
US20130116150A1 (en) | 2010-07-09 | 2013-05-09 | Somalogic, Inc. | Lung Cancer Biomarkers and Uses Thereof |
SG2014007454A (en) | 2010-08-13 | 2014-07-30 | Somalogic Inc | Pancreatic cancer biomarkers and uses thereof |
US9938314B2 (en) * | 2013-11-21 | 2018-04-10 | Somalogic, Inc. | Cytidine-5-carboxamide modified nucleotide compositions and methods related thereto |
CN116334088A (zh) | 2014-02-18 | 2023-06-27 | 私募蛋白质体运营有限公司 | 用于检测微生物的组合物和方法 |
EP3414229B1 (en) | 2016-02-09 | 2021-06-16 | Pharmakea, Inc. | Quinolinone lysyl oxidase-like 2 inhibitors and uses thereof |
CA3027626A1 (en) * | 2016-07-01 | 2018-01-04 | Somalogic, Inc. | Oligonucleotides comprising modified nucleosides |
EP4365597A2 (en) | 2016-12-01 | 2024-05-08 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Methods of assaying proteins |
LT6615B (lt) | 2017-09-12 | 2019-04-25 | Vilniaus Universitetas | N4-modifikuoti citidino nukleotidai ir jų panaudojimas |
JP2022550463A (ja) | 2019-10-01 | 2022-12-01 | エンピリアン ニューロサイエンス, インコーポレイテッド | トリプタミン発現を調整する真菌の遺伝子操作 |
AU2021288692A1 (en) | 2020-06-11 | 2023-02-02 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Methods and systems for computational decoding of biological, chemical, and physical entities |
EP4281774A2 (en) | 2021-01-20 | 2023-11-29 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Methods for biomolecule quantitation |
US20220227890A1 (en) | 2021-01-21 | 2022-07-21 | Nautilus Biotechnology, Inc. | Systems and methods for biomolecule preparation |
US11505796B2 (en) | 2021-03-11 | 2022-11-22 | Nautilus Biotechnology, Inc. | Systems and methods for biomolecule retention |
WO2023038859A1 (en) | 2021-09-09 | 2023-03-16 | Nautilus Biotechnology, Inc. | Characterization and localization of protein modifications |
WO2023049073A1 (en) | 2021-09-22 | 2023-03-30 | Nautilus Biotechnology, Inc. | Methods and systems for determining polypeptide interactions |
WO2023081728A1 (en) | 2021-11-03 | 2023-05-11 | Nautilus Biotechnology, Inc. | Systems and methods for surface structuring |
US20230314324A1 (en) | 2022-03-29 | 2023-10-05 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Integrated arrays for single-analyte processes |
WO2023212490A1 (en) | 2022-04-25 | 2023-11-02 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Systems and methods for assessing and improving the quality of multiplex molecular assays |
WO2023250364A1 (en) | 2022-06-21 | 2023-12-28 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Method for detecting analytes at sites of optically non-resolvable distances |
WO2024059655A1 (en) | 2022-09-15 | 2024-03-21 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Characterizing accessibility of macromolecule structures |
WO2024073599A1 (en) | 2022-09-29 | 2024-04-04 | Nautilus Subsidiary, Inc. | Preparation of array surfaces for single-analyte processes |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996038460A1 (en) * | 1995-06-02 | 1996-12-05 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | Palladium catalyzed nucleoside modification methods using nucleophiles and carbon monoxide |
WO2011129494A1 (en) * | 2010-04-14 | 2011-10-20 | Postech Academy-Industry Foundation | Nucleolin specific aptamer and use thereof |
WO2012174496A2 (en) * | 2011-06-17 | 2012-12-20 | Somalogic, Inc. | Method for purification and identification of sperm cells |
CN102858990A (zh) * | 2010-04-12 | 2013-01-02 | 私募蛋白质体公司 | 针对β-NGF的适体及其在治疗β-NGF介导的疾病和失调中的用途 |
Family Cites Families (74)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4267171A (en) | 1979-07-02 | 1981-05-12 | The Regents Of The University Of California | C-5 Substituted cytosine nucleosides |
US4415732A (en) | 1981-03-27 | 1983-11-15 | University Patents, Inc. | Phosphoramidite compounds and processes |
US4711955A (en) | 1981-04-17 | 1987-12-08 | Yale University | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
US5023243A (en) | 1981-10-23 | 1991-06-11 | Molecular Biosystems, Inc. | Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same |
US4594339A (en) | 1982-04-06 | 1986-06-10 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Anti-herpes virus compositions containing 5-substituted 1-2'(deoxy-2-'-substituted-β-d-arabinofuranosyl)pyrimedene nucleosides |
US4948882A (en) | 1983-02-22 | 1990-08-14 | Syngene, Inc. | Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis |
DE3329892A1 (de) | 1983-08-18 | 1985-03-07 | Köster, Hubert, Prof. Dr., 2000 Hamburg | Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden |
US4828979A (en) | 1984-11-08 | 1989-05-09 | Life Technologies, Inc. | Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection |
US5093232A (en) | 1985-12-11 | 1992-03-03 | Chiron Corporation | Nucleic acid probes |
US5047519A (en) | 1986-07-02 | 1991-09-10 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Alkynylamino-nucleotides |
US4997818A (en) | 1987-09-21 | 1991-03-05 | The University Hospital | Therapeutic method for selectively treating terminal deoxynucleotidyl transferase-positive neoplastic leukemias and lymphomas |
SE8802173D0 (sv) | 1988-06-10 | 1988-06-10 | Astra Ab | Pyrimidine derivatives |
CA2058632C (en) | 1989-06-05 | 2004-08-24 | Brian C. Froehler | Exonuclease-resistant oligonucleotides and methods for preparing the same |
US5118672A (en) | 1989-07-10 | 1992-06-02 | University Of Georgia Research Foundation | 5'-diphosphohexose nucleoside pharmaceutical compositions |
US5134066A (en) | 1989-08-29 | 1992-07-28 | Monsanto Company | Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs |
HUT61566A (en) | 1990-03-13 | 1993-01-28 | Acic Canada Inc | Process for producing 2,2'-o-cyclonucleosides, nucleosides and their analogous compounds |
US5705337A (en) | 1990-06-11 | 1998-01-06 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi-SELEX |
ES2259800T3 (es) | 1990-06-11 | 2006-10-16 | Gilead Sciences, Inc. | Procedimientos de uso de ligandos de acido nucleico. |
US5580737A (en) | 1990-06-11 | 1996-12-03 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine |
US5496938A (en) | 1990-06-11 | 1996-03-05 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid ligands to HIV-RT and HIV-1 rev |
US6030776A (en) | 1990-06-11 | 2000-02-29 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | Parallel SELEX |
US5270163A (en) | 1990-06-11 | 1993-12-14 | University Research Corporation | Methods for identifying nucleic acid ligands |
US5660985A (en) | 1990-06-11 | 1997-08-26 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides |
RU2088588C1 (ru) * | 1990-07-02 | 1997-08-27 | Хехст АГ | Олигонуклеотиды и способ их получения |
US5138045A (en) | 1990-07-27 | 1992-08-11 | Isis Pharmaceuticals | Polyamine conjugated oligonucleotides |
US5840867A (en) | 1991-02-21 | 1998-11-24 | Gilead Sciences, Inc. | Aptamer analogs specific for biomolecules |
US5582981A (en) | 1991-08-14 | 1996-12-10 | Gilead Sciences, Inc. | Method for identifying an oligonucleotide aptamer specific for a target |
DE637965T1 (de) | 1991-11-26 | 1995-12-14 | Gilead Sciences Inc | Gesteigerte bildung von triple- und doppelhelices aus oligomeren mit modifizierten pyrimidinen. |
US5719273A (en) | 1993-06-14 | 1998-02-17 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | Palladium catalyzed nucleoside modifications methods using nucleophiles and carbon monoxide |
US5428149A (en) | 1993-06-14 | 1995-06-27 | Washington State University Research Foundation | Method for palladium catalyzed carbon-carbon coulping and products |
US5580972A (en) | 1993-06-14 | 1996-12-03 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | Purine nucleoside modifications by palladium catalyzed methods |
US5801154A (en) | 1993-10-18 | 1998-09-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein |
US5596091A (en) | 1994-03-18 | 1997-01-21 | The Regents Of The University Of California | Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides |
US5658738A (en) | 1994-05-31 | 1997-08-19 | Becton Dickinson And Company | Bi-directional oligonucleotides that bind thrombin |
ATE276266T1 (de) | 1995-05-03 | 2004-10-15 | Gilead Sciences Inc | Nukleinsäureliganden für gewebeziele |
JP4899014B2 (ja) * | 1995-06-02 | 2012-03-21 | イーシー・テクノロジー・エルエルシー | 求核試薬および一酸化炭素を用いるパラジウム触媒ヌクレオシド修飾方法 |
US5945527A (en) * | 1996-05-30 | 1999-08-31 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | Palladium catalyzed nucleoside modification methods using nucleophiles and carbon monoxide |
US6794499B2 (en) | 1997-09-12 | 2004-09-21 | Exiqon A/S | Oligonucleotide analogues |
US20070166741A1 (en) | 1998-12-14 | 2007-07-19 | Somalogic, Incorporated | Multiplexed analyses of test samples |
US6020483A (en) | 1998-09-25 | 2000-02-01 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | Nucleoside modifications by palladium catalyzed methods |
US6175001B1 (en) | 1998-10-16 | 2001-01-16 | The Scripps Research Institute | Functionalized pyrimidine nucleosides and nucleotides and DNA's incorporating same |
JP3485023B2 (ja) | 1999-05-20 | 2004-01-13 | 東亞合成株式会社 | ヌクレオシド化合物 |
ES2319732T3 (es) | 2000-04-13 | 2009-05-12 | Pharmasset, Inc. | Derivados de nucleosido 3'- o 2'-hidroximetilo sustituido para el tratamiento de infecciones virales. |
US7601497B2 (en) | 2000-06-15 | 2009-10-13 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method |
US6376190B1 (en) | 2000-09-22 | 2002-04-23 | Somalogic, Inc. | Modified SELEX processes without purified protein |
US7105499B2 (en) * | 2001-01-22 | 2006-09-12 | Merck & Co., Inc. | Nucleoside derivatives as inhibitors of RNA-dependent RNA viral polymerase |
EP1481090A4 (en) | 2002-02-15 | 2006-08-09 | Somalogic Inc | METHOD AND REAGENTS FOR DETECTING BINDING OF TARGET MOLECULES BY NUCLEIC ACID ELECTRODES |
WO2003078623A1 (fr) | 2002-03-19 | 2003-09-25 | Fujitsu Limited | Molecule fonctionnelle et son procede de production |
US7767803B2 (en) | 2002-06-18 | 2010-08-03 | Archemix Corp. | Stabilized aptamers to PSMA and their use as prostate cancer therapeutics |
JP4119976B2 (ja) | 2003-02-07 | 2008-07-16 | 国立大学法人群馬大学 | 5位置換ピリミジンデオキシヌクレオチド誘導体、及びそれを用いた核酸の合成方法 |
EP1584923A3 (en) | 2004-04-07 | 2006-01-04 | Roche Diagnostics GmbH | Stabilization of biomolecules in samples |
EP3034510A1 (en) | 2004-04-30 | 2016-06-22 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | Oligonucleotides comprising a c5-modified pyrimidine |
US20060142311A1 (en) | 2004-11-18 | 2006-06-29 | Kyoto University | Prodan-containing nucleotide and use thereof |
JP4596902B2 (ja) | 2004-12-10 | 2010-12-15 | 株式会社日立製作所 | ストレージ管理装置、計算機システム、ストレージ管理方法及びストレージ管理プログラム |
EP1828217A2 (en) | 2004-12-16 | 2007-09-05 | Febit Biotech GmbH | Polymerase-independent analysis of the sequence of polynucleotides |
EP1994171B1 (en) | 2006-01-17 | 2015-03-11 | Somalogic, Inc. | Multiplexed analyses of test samples |
US8242258B2 (en) | 2006-12-03 | 2012-08-14 | Agilent Technologies, Inc. | Protecting groups for RNA synthesis |
CA2673029C (en) | 2006-12-22 | 2017-03-28 | Archemix Corp. | Materials and methods for the generation of transcripts comprising modified nucleotides |
US20110136099A1 (en) | 2007-01-16 | 2011-06-09 | Somalogic, Inc. | Multiplexed Analyses of Test Samples |
US7855054B2 (en) | 2007-01-16 | 2010-12-21 | Somalogic, Inc. | Multiplexed analyses of test samples |
US8975026B2 (en) | 2007-01-16 | 2015-03-10 | Somalogic, Inc. | Method for generating aptamers with improved off-rates |
US7947447B2 (en) | 2007-01-16 | 2011-05-24 | Somalogic, Inc. | Method for generating aptamers with improved off-rates |
EP2144921A2 (en) | 2007-02-27 | 2010-01-20 | K.U. Leuven Research and Development | Phosphate modified nucleosides useful as substrates for polymerases and as antiviral agents |
EP2152870A2 (en) | 2007-05-02 | 2010-02-17 | Sirna Therapeutics Inc. | Rna interference mediated inhibition of cyclic nucleotide type 4 phosphodiesterase (pde4b) gene expression using short interfering nucleic acid (sina) |
US8404830B2 (en) | 2007-07-17 | 2013-03-26 | Somalogic, Inc. | Method for generating aptamers with improved off-rates |
EP2336314A1 (en) | 2007-07-17 | 2011-06-22 | Somalogic, Inc. | Improved selex and photoselex |
US20090215050A1 (en) | 2008-02-22 | 2009-08-27 | Robert Delmar Jenison | Systems and methods for point-of-care amplification and detection of polynucleotides |
US8703416B2 (en) * | 2008-07-17 | 2014-04-22 | Somalogic, Inc. | Method for purification and identification of sperm cells |
EP2462341A2 (en) | 2009-09-14 | 2012-06-13 | Paul Dimaggio | Submersible hydroelectric power generator and methods thereof |
EP2542266A4 (en) | 2010-03-03 | 2013-10-23 | Somalogic Inc | 4-1BB-BINDING APTAMERS AND USE THEREOF IN THE TREATMENT OF DISEASES AND DISORDERS |
WO2011119852A1 (en) | 2010-03-24 | 2011-09-29 | Rxi Pharmaceuticals Corporation | Reduced size self-delivering rnai compounds |
WO2011130065A1 (en) | 2010-04-12 | 2011-10-20 | Merck Sharp & Dohme Corp. | RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF MET GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) |
EP2635681B8 (en) | 2010-11-05 | 2017-10-04 | Miragen Therapeutics, Inc. | Base modified oligonucleotides |
US9938314B2 (en) * | 2013-11-21 | 2018-04-10 | Somalogic, Inc. | Cytidine-5-carboxamide modified nucleotide compositions and methods related thereto |
-
2014
- 2014-11-19 US US14/917,056 patent/US9938314B2/en active Active
- 2014-11-19 MX MX2016005506A patent/MX371440B/es active IP Right Grant
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- 2014-11-19 WO PCT/US2014/066328 patent/WO2015077292A1/en active Application Filing
- 2014-11-19 KR KR1020167012432A patent/KR102290214B1/ko active IP Right Grant
- 2014-11-19 JP JP2016533204A patent/JP7008405B2/ja active Active
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-
2016
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- 2018-11-29 IL IL26338018A patent/IL263380B/en active IP Right Grant
-
2019
- 2019-09-19 IL IL269461A patent/IL269461B/en active IP Right Grant
-
2020
- 2020-02-12 JP JP2020021190A patent/JP2020090534A/ja active Pending
-
2021
- 2021-01-12 JP JP2021002566A patent/JP2021073211A/ja active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996038460A1 (en) * | 1995-06-02 | 1996-12-05 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | Palladium catalyzed nucleoside modification methods using nucleophiles and carbon monoxide |
CN102858990A (zh) * | 2010-04-12 | 2013-01-02 | 私募蛋白质体公司 | 针对β-NGF的适体及其在治疗β-NGF介导的疾病和失调中的用途 |
CN102985435A (zh) * | 2010-04-12 | 2013-03-20 | 私募蛋白质体公司 | 5-位修饰的嘧啶和它们的用途 |
WO2011129494A1 (en) * | 2010-04-14 | 2011-10-20 | Postech Academy-Industry Foundation | Nucleolin specific aptamer and use thereof |
WO2012174496A2 (en) * | 2011-06-17 | 2012-12-20 | Somalogic, Inc. | Method for purification and identification of sperm cells |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
XINGYU LU ET AL.: "Chemical Modification-Assisted Bisulfite Sequencing (CAB-Seq) for 5-Carboxylcytosine Detection in DNA", 《J. AM. CHEM. SOC.》 * |
YAZAN EL SAFADI ET AL.: "5-Modified-2'-dU and 2'-dC as Mutagenic Anti HIV-1 Proliferation Agents: Synthesis and Activity", 《J. MED. CHEM.》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107663220A (zh) * | 2016-07-27 | 2018-02-06 | 上海伯豪医学检验所有限公司 | 修饰碱基、包含修饰碱基的核酸、适配体及其应用 |
CN107663220B (zh) * | 2016-07-27 | 2020-10-02 | 上海伯豪医学检验所有限公司 | 修饰碱基、包含修饰碱基的核酸、适配体及其应用 |
CN114524855A (zh) * | 2022-02-22 | 2022-05-24 | 武汉大学 | 一种5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体的合成方法 |
Also Published As
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---|---|---|
CN105658658A (zh) | 胞苷-5-甲酰胺修饰的核苷酸组合物及其相关方法 | |
JP7025818B2 (ja) | 5位修飾ピリミジンとその使用 | |
TWI541249B (zh) | 5-位置經修飾之嘧啶類及彼等之用途 | |
AU2013202528A1 (en) | 5-position modified pyrimidines and their use |
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