TW201522341A - 化合物 - Google Patents

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Abstract

本發明特別係關於式(I)化合物 □及關於包括其等之組成物及關於該化合物及該化合物之組成物於治療，例如治療發炎疾病，特別是呼吸道發炎疾病的用途。本發明亦延伸至製備該化合物的方法。

Description

化合物 本發明範疇
本發明係關於抑制磷酸肌醇3-激酶，(PI3激酶，PI3K)之化合物。特別的，所揭示者為抑制PI3K δ亞型及，此外，其γ亞型之化合物，及關於其等於治療，包括於製藥組合中，尤其是於治療發炎疾病，包括肺的發炎疾病，如COPD及氣喘的用途。本發明亦延伸至製備該化合物及包含其等之製藥組成物。
本發明之背景
脂肪激酶係催化脂肪之磷酸化作用而產生涉及大範圍生理過程，包括細胞遷移及黏附，之調節的種類。該PI3激酶(PI3K)為與蛋白質有關之膜且屬於能催化脂質磷酸化作用之酵素屬，其等本身與細胞膜相關。該PI3K δ同工酶(PI3K δ)乃負責產生各種3'-磷酸化磷酸肌醇之四種型式I PI3K激酶之等形之一種，其傳介細胞信號傳導且牽連於發炎，生長因子信號傳導，惡性腫瘤轉型及免疫力[參見Review by Rameh，L.E.及Cantley，L.C.J.Biol.Chem.，1999，274：8347-8350]。
涉及在控制發炎之PI3K業於諸多型式中使用泛-活性PI3K抑制劑，如LY-294002及Wortmannin[Ito，K.等，J Pharmacol.Exp.Ther.，2007，321：1-8.]中確認。近年來之研究係使用如下所述選擇性PI3K抑制劑或於缺乏特定酶等形之擊倒小鼠來進行。此等研究證明了於發炎時，由PI3K酵素來控制呼吸道之角色。經發現於卵白蛋白-致敏，卵白蛋白-挑戰小鼠，PI3K δ選擇性抑制劑IC-87114抑制呼吸道高反應性，IgE釋放，促炎性細胞因子的表達，發炎細胞聚集至肺部及血管通透性[Lee，K.S.等，J.Allergy Clin.Immunol.，2006，118：403-409及Lee，K.S.等，FASEB J.，2006，20：455-65]。此外，IC-87114藉由TNFα刺激降低小鼠肺中之中性粒細胞聚集及中性粒細胞功能[Sadhu，C.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2003，308：764-9]。
該PI3K δ等形(isoform)係藉由胰島素及其他生長因子，以及藉由偶合蛋白質信號及炎性細胞因子之G-蛋白質來活化。再者，使用擊倒小鼠的研究顯示PI3K γ(PI3K γ)之活化於氣喘之發病機制可能是重要的。例如，鼠肥大細胞反應係於試管內及生體內藉由需要功能性PI3K γ之自分泌信號而加劇。缺乏PI3K γ之小鼠於挑戰以被動全身過敏時不會出現水腫[Wymann M.P.等，Biochem.Soc.Trans.，2003，31：275-80.]。因此，PI3K γ係經由各種G-蛋白質偶合受體(GPCRs)，尤其是藉由控制肥大細胞功能而接轉發炎信號。亦報導在卵白蛋白致敏和激發之小鼠中嗜酸性粒細胞之聚集亦於此等PI3K γ-缺乏小鼠中被抑制，如與野生型動物相較[Lim D.H.等，Am.J.Physiol.Lung Cell.Mol.Physiol.，2009，296(2)：L210-L219]。最後，用PI3K γ抑制劑之治療法衰減了IL-13-所增 強之肺葉呼吸道收縮[Jiang H.等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，2012，342(2)：305-11]。
最近，PI3K雙δ/γ抑制劑TG100-115被報導可在小鼠模式中抑制肺嗜酸細胞增多症並降低白介素-13濃度，黏蛋白堆積及呼吸道高反應性，當藉由氣溶膠給藥時。相同作者亦報導該化合物可抑制藉由LPS或香煙煙霧所引起之肺部中性粒細胞[Doukas，J.等，J Pharmacol.Exp.Ther.，2009，328：758-765.]。據報導，當與PI3K δ選擇性抑制劑相較時，其他PI3K δ及γ之小分子抑制劑可產生對於LPS引起之TNFα生成及T細胞活化的優異抑制作用[Williams O.等，Chem Biol.，2010，17(2)：123-34]。
由於其亦可藉由氧化性應激反應來活化，該PI3K δ等形可能是於該等疾病上以治療性干預之目標而相關，其中涉及高層次的氧化應激反應。PI3K信號傳導途徑之下游媒介子包括Akt(絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶)及哺乳動物雷帕黴素靶，酶mTOR。最近之作業提示PI3K δ之活化作用，導致Akt之磷酸化，另於皮質類固醇激素敏感的細胞能誘導皮質類固醇激素狀態[To，Y.等，Am.J.Respir.Crit.Care Med.，2010，182：897-904.]。這些觀察結果導致這一假設，此信號級聯可為一負責於罹患COPD之患者肺部觀察到之發炎的皮質類固醇不敏感性，以及於該等因抽煙之哮喘的機制，因而致使他們的肺部遭到提高的氧化應激反應。真的，茶鹼，用來治療COPD及氣喘兩者之化合物，業被建議經由涉及藉由PI3激酶δ來控制之途徑之交互作用的機制而扭轉類固醇不敏感性[To，Y.等，Am.J.Respir.Crit.Care Med.，2010，182：897-904.]。
現今，氣喘及COPD兩者之治療主體為吸入療法，使用皮質類固醇，毒蕈鹼拮抗劑及β2-激動劑之組合，作為臨床上適用的判斷。於COPD及氣喘上，解決未滿足之醫療需求的一個方式乃確定新的吸入藥物，當用於單一治療或於與一種或多種來自此三種藥理類別之醫藥品之組合中時，其有可能提供顯著的優點。因此，仍有需要確定及開發等形選擇性PI3K抑制劑，其對於氣喘，COPD及其他發炎疾病有可能提供增強的治療功效。
WO 2012/052753係揭示：6-(2-((4-胺基-3-(3-羥基苯基)-1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氯苄基)-4-酮基-3,4-二氫喹唑啉-5-基)-N,N-聯(2-甲氧基乙基)己-5-炔醯胺，於本文中係指稱為已知技藝化合物A。
WO 2011/048111係揭示特定之3-苄基-5-炔基-喹唑啉-4(3H)-酮。
本文中揭示之一化合物實例為2-((4-胺基-3-(3-羥基苯基)-1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-3-(2-氟苄基)-5-(3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙-1-炔基)喹唑啉-4(3H)-酮，於本文中指稱為實例50。
這些已知技藝之化合物無一具有與本文中揭示之式(I)化合物相同之有利表現。
本發明摘要
根據本發明，係提供式(I)化合物： 或其製藥上可接受之鹽，包括其所有的立體異構物，互變異構體及同位素衍生物。
於本發明另一方面，係提供呈固態結晶型式之式(I)化合物。
再於本發明另一方面，係提供呈其型式2多晶型結晶之型式的式(I)化合物(有時於本文中係指稱為“型式2多晶型結晶”)。
再於本發明另一方面，係提供呈其型式3多晶型結晶之型式的式(I)化合物(有時於本文中係指稱為“型式3多晶型結晶”)。
已知技藝化合物A及與本案揭示之實例50化合物之試管內表現的比較係呈現於下文中(參見實驗章節之表5)。本發明化合物為特別有效的雙PI3K δ/γ等形抑制劑，此藥理特性，其較先前揭示之化合物賦予其一個獨特且有利的治療表現。本發明之此方面特別係於式(I)化合物於動物模式之生體內表現得證，其等為 係於肺部發炎之治療功效及臨床功效的預測因子(參見實驗章節之表8-12)。
於一個具體例中，本案揭示之化合物較已知技藝化合物具有改進的抑制活性，當於生體內比較測試物質抑制聚IC引起之嗜中性粒細胞流入小鼠肺部之能力的分析。該得證之改良與先前於技藝中揭示之已知化合物相較為1，2，3，4，5，6，7，8，9或10倍(或更多)。
生體內聚IC分析之活性被認為是本發明化合物於罹患氣喘或COPD之患者中抑制病毒誘發之病情加重之潛力的指標。它被認為，病毒感染所引起之疾病的加重係藉由日益惡化於病患肺部之發炎及藉由產生激素耐藥型表型。聚IC刺激了其中之一個機制，經由其，病毒係促炎性。
本文中說明之化合物的類藥性質，包括其固有的物理及化學穩定性，溶解度表現，且尤其是其獨特的生物活性使得該化合物特別適用作為藥劑且特別為治療發炎所傳介之疾病。
本發明之詳細說明
本文中所使用之抑制劑一詞意指一化合物，於試管內酶分析時降低(例如由至少10%，20%，30%，40%，50%或更多)或消除目標蛋白質，例如PI3K δ同工酶，之生物活性。
本文中所使用之δ/γ抑制劑一詞意指化合物抑制，至某種程度，對於兩者酶等形之抑制活性事實，儘管不是必須，係到相同程度。
本案揭示之化合物於細胞基底之篩選系統為具有活性且因此證明其具有適當特性以穿透細胞且能發揮細胞內藥理功效 (參見實驗章節之表6及表7)。
本案揭示之化合物具有治療相關及想要的製藥特性的醫藥品，例如物-化特徵包括足夠的化學及光穩定性，適當的溶解度表現及強力活性。
於一個具體例中，其係提供本發明化合物之製藥上可接受的鹽。
於一個具體例中，其係提供本發明化合物之製藥上可接受的酸加成鹽。
前文中，該製藥上可接受的酸加成鹽意指包括治療活性，無毒性，該式(I)化合物可形成之酸加成鹽。這些製藥上可接受的酸加成鹽類可容易的藉由將該游離鹼型式之式(I)化合物用例如此等適當酸來處理而得到。適當酸之實例包括，例如，無機酸如氫氯酸，氫溴酸，及硫酸，及磷酸等；或有機酸如，例如，醋酸，丙酸，羥基醋酸，乳酸，丙二酸，琥珀酸，順式丁烯二酸，反式丁烯二酸，馬來酸，酒石酸，檸檬酸，甲烷磺酸，對甲苯磺酸，環己氨磺酸，水楊酸，對胺基水楊酸，雙羥萘酸等。另一個適當酸之實例為苯磺酸。
式(I)化合物之鹽的實例包括所有製藥上可接受的鹽，如，但不限於，無機酸之酸加成鹽如HCl及HBr鹽及有機酸之加成鹽如甲烷磺酸鹽。其他實例包括硫酸鹽及磷酸鹽。
於另一個具體例中，其係提供本發明化合物之製藥上可接受的鹽，其係藉由將式(I)化合物與適當鹼進行反應而形成。適當鹼之實例包括，例如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氫氧化鎂，氫氧化鈣，L-精胺酸，膽鹼及L-離胺酸。
於一個具體例中，其係提供2-((4-胺基-3-(3-氟-5-羥基苯基)-1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-(3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙-1-炔-1-基)-3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮作為游離鹼。
本發明亦延伸至本文中揭示之化合物的溶劑合物。溶劑合物之實例包括水合物。
本案化合物包括那些其中指定之原子為天然生成或非天然生成之同位素。於一個具體例中，該同位素為一穩定的同位素。因此，本案化合物包括，例如那些含有一種或多種氘原子以代替氫原子等者。
所揭示者係延伸至所有本文中所定義之化合物的多晶型型式。
該式(I)化合物可方便地藉由一製法而製備，其係將式(II)化合物： 或其經保護之衍生物，其中，LG1代表一釋離基，如鹵素，特別為溴，與式(III)化合物： 於適當催化劑及有機鹼存在之下及於極性對質子為惰性之溶劑中於惰性氛圍中進行反應。適當催化劑包括鈀催化劑，如聯(三苯基膦)鈀(II)二氯化物，於碘化銅存在之下。此轉化中適當的極性對質子為惰性之溶劑為DMF且適當的惰性氛圍為氮氣。
於其中式(II)化合物為經保護之衍生物之合成製法中，該式(I)化合物係藉由適當的去保護步驟而揭露，如於技藝中所詳知及實施。例如，當式(I)化合物中之苯酚係被矽烷基基團所保護，例如用第三丁基二甲基矽烷基基團，該去保護步驟可藉由用試劑如四丁基銨氟化物於極性對質子為惰性之溶劑如DMF存在之下處理而生效。該反應可於降低之溫度，如於0℃時進行。
式(II)化合物可藉由將式(IV)化合物： 或其經保護之衍生物，其中，LG1代表定義如上式(II)化合物之釋離基，且LG2亦為一釋離基如鹵素，例如一鹵素原子及適當的氯，與式(V)化合物： 或其經保護之衍生物，在一鹼存在之下及於極性對質子為惰性之溶劑中，進行反應而製備。
此轉化反應之適當鹼包括碳酸鉀且適當極性對質子為惰性之溶劑為DMF。
合成之製法包括那些被認為於偶合步驟中保護式(VII)化合物之苯酚羥基有利者且適當的經保護之衍生物包括第三丁基二甲基矽烷基醚及第三丁基醚。
替代的，式(II)化合物可藉由將式(VI)化合物： 或其經保護之衍生物，其中，LG1，係定義如上之式(II)化合物中且LG3代表一釋離基如鹵素，特別為碘，與式(VII)化合物： 或其經保護之衍生物，於適當貴金屬催化劑存在下，一無機鹼及於一極性對質子為惰性之溶劑中，於惰性氛圍中進行反應；接著， 如果適當，藉由去保護反應而製備。
適當的催化劑為四(三苯基膦)鈀(0)。
適當的無機鹼為碳酸鈉且適當的極性對質子為惰性之溶劑為乙醇。
該反應可在上昇之溫度時進行，例如於85℃達一延伸期間，例如，於冷卻至室溫之前3天。
保護基可有利的於上述說明之一種或多種反應順序期間遮蓋化學性敏感基團，以確保製法中之一種或多種生效。因此如果想要或需要，中間體化合物可藉由習用保護基來保護。移除所需之保護基及方法係於“Protective Groups in Organic Synthesis”，由Theodora W.Greene及Peter G.M.Wuts說明，由John Wiley & Sons Inc；4th Rev Ed.，2006，ISBN-10：0471697540公開。
新穎中間體係列入申請專利範圍中作為本發明之一方面。
有利的是，本發明化合物(I)不具有阻轉異構型。
根據本案之實例2所製備之化合物(I)係以型式1多晶型結晶製得。該型式1多晶型結晶的特徵在於實質上顯示於圖式3之XRPD圖示。
型式1多晶型結晶樣品之熱特性被認為是複雜的。如於實例2中討論及顯示於圖式4以DSC分析所說明(下方圖)，型式1多晶型結晶樣品於加熱時經歷多次活動，且最終轉化為不同的多晶型結晶-本文中指稱為型式2多晶型結晶。
經發現該型式2多晶型結晶為無水且於約190℃(波峰)熔融分解。於型式1多晶型結晶所進行之漿化實驗造成由大部分 溶劑中形成型式2多晶型結晶，即便是無水多晶型結晶-本文中指稱為型式3多晶型結晶，係藉由將型式1多晶型結晶於二氯甲烷中漿化而得到。經發現型式3多晶型結晶為無水且於約186℃(波峰；參見實例8)時熔融分解。數種化合物(I)之假多晶型(型式4，5，6及7假多晶型)亦藉由於THF，1,4-二烷，10%水/乙腈或10%水/丙酮中漿化無定形型式之型式1多晶型結晶或化合物(I)而得到(參見實例9至12)。
於七種不同多晶型及假多晶型型式之化合物(I)中，型式2及型式3多晶型結晶為最有前景的固體狀態屬性，而型式2多晶型結晶由於具有較高的熔點而屬最有利。
競爭性漿化實驗係於各種溶劑中在各種溫度時於型式2及型式3多晶型結晶之50：50混合物中進行(參見實例13)。所有生成型式2多晶型結晶之實驗，證實此乃熱力學上更穩定的型式。鑑於最好是將多晶型型式相互-轉化的風險最小化，於儲存化合物及製備含有化合物之製藥產物，或於製備後此等產物之壽命期間，該型式2多晶型結晶較型式3多晶型結晶及其他化合物(I)之多晶型型式為有利。
適當的，型式2多晶型結晶係藉由將化合物(I)由溶液中於1-丙醇中結晶出來而製備。使用1-丙醇之示範性程序係說明於實例3，有或無接種。
該型式2多晶型結晶亦可藉由將型式1多晶型結晶於甲醇，乙醇，2-丙醇，1-丙醇，丙酮，醋酸乙酯，乙腈，甲苯，異丙基醋酸酯，TBME，2-丁酮，DMSO，二***，MIBK，庚烷，硝基甲烷，10%水/乙醇，10%水/乙腈或10%水/2-丙醇中漿化而製備。
替代的，該型式2多晶型結晶可藉由將化合物(I)於甲醇，乙醇，2-丙醇，1-丙醇，丙酮，醋酸乙酯，乙腈，甲苯，異丙基醋酸酯，TBME，2-丁酮，DMSO，二***，MIBK，硝基甲烷，10%水/乙醇或10%水/2-丙醇中漿化成無定形型式而製備。
本案發明人的實驗顯示漿化呈無定形型式之化合物(I)，於二氯甲烷，導致形成型式3多晶型結晶。因此，應避免使用意在形成型式2多晶型結晶之於結晶條件下的二氯甲烷。
本案發明人的實驗顯示，漿化呈無定形型式之化合物(I)或型式1多晶型結晶，於THF，導致形成型式4假多晶型。因此，應避免使用意在形成型式2多晶型結晶之於結晶條件下的THF。
本案發明人的實驗顯示漿化呈無定形型式之化合物(I)或型式1多晶型結晶，於1,4-二烷，導致形成型式5假多晶型。因此，應避免使用意在形成型式2多晶型結晶之於結晶條件下的1,4-二烷。
本案發明人的實驗顯示，漿化呈無定形型式之化合物(I)，於10%水/乙腈，導致形成型式6假多晶型。因此，應避免使用意在形成型式2多晶型結晶之於結晶條件下的10%水/乙腈。
本案發明人的實驗顯示漿化呈無定形型式之化合物(I)，於10%水/丙酮中，導致形成型式7假多晶型。因此，應避免使用意在形成型式2多晶型結晶之於結晶條件下的10%水/丙酮。
該型式2多晶型結晶之特點在於實質上顯示於圖式5之XRPD圖示。此圖顯示於位置8.2，9.0，9.2，9.7，12.2，14.1，14.3，15.0，16.4，18.0，18.5，19.0，19.6，21.8，22.3，22.5，24.3，24.5，24.8，25.1及25.8具有主要峰值(±0.2°，2-θ值)。典型的，至少3 個(例如3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20或所有21個)這些峰值可在產生的XRPD圖示上觀察到。於9.7，12.2，14.1及14.3之峰值為型式2多晶型結晶之特別的特徵且因此，其典型的至少這些峰值之1個(例如1，2，3，或所有4個)可在XRPD圖示上觀察到。
該型式3多晶型結晶之特點在於實質上顯示於圖式12之XRPD圖示。
該型式4假多晶型之特點在於實質上顯示於圖式17之XRPD圖示。
該型式5假多晶型之特點在於實質上顯示於圖式17之XRPD圖示。
該型式6假多晶型之特點在於實質上顯示於圖式17之XRPD圖示。
該型式7假多晶型之特點在於實質上顯示於圖式17之XRPD圖示。
於一方面，該化合物有用於治療，例如COPD及/或氣喘。
該發展迄今之PI3K化合物典型的被用於口服給藥。典型的，此一策略涉及化合物之藥物動力學表現的最優化以便達到適當的作用期間。依此方式，建立足夠高的藥物濃度並於劑量間維持以提供連續的臨床利益。此方法之一必然且經常不想要的結果是未靶向人體組織，尤其是其肺部及腸道，很可能被暴露在藥物的藥理學活性濃度中。
一種替代的策略是設計治療方案，其中藥物係被直接給 藥至發炎的器官(例如局部治療)。雖然此方法並不適用於治療所有慢性發炎情況，其已被廣泛地應用在治療肺部疾病(氣喘，COPD，囊性纖維化)，皮膚損傷(異位性皮膚炎及牛皮癬)，鼻部疾病(過敏性鼻炎)，眼睛疾病(過敏性結膜炎)及胃腸功能障礙(潰瘍性結腸炎)。
於局部療法時，想要的功效有時可藉由確定該藥物具有作用的持續期間且主要保留在靶器官而達到，因而將全身毒性的風險最小化。替代的，可使用一適當製劑，其產生活性藥物之“儲存槽”，然後其可維持所希望的效果。舉例說明之第一個方法係抗膽鹼能藥物噻托溴銨(Spiriva HandiHaler®)之用途，其係局部給藥至肺部如處理COPD。此化合物對於其靶受體具有異常高的高親和力，造成非常慢的降率(解離速率)及隨之而來的作用持續期間。
根據本案揭示之一方面，其等係提供式(I)化合物或含其之製藥製劑，作為PI3激酶抑制劑，例如局部給藥至肺部的用途。
因此於一個具體例中，本案揭示之化合物係為了局部使用給藥至肺部以便將對於病患之治療效果最大化同時將不想要的全身作用可能性最小化。因此有利的是，式(I)化合物係快速的代謝一旦其達到一般循環，且該轉變成之產物較母分子為不具活性。
一個可能之式(I)化合物之首過代謝的主要產物為相關醇，化合物(Ia)，其將源自O-去甲基反應，一代謝過程，其為此種化學類型的共同特徵。此可能的代謝產物較於α及β亞型兩者中作為PI3K抑制劑之式(I)化合物顯著的活性較低(參見實驗章節之表6)。
因此，於一方面，係提供式(Ia)化合物或其製藥上可接受之鹽，包括所有立體異構物，互變異構體及其同位素衍生物。於揭示內容之一方面中，本發明化合物特別適用於局部給藥，如局部給藥至肺部，特別為治療COPD。
因此，於一方面，其係提供本發明化合物於治療COPD及/或氣喘，特別為COPD或嚴重氣喘，藉由吸入，即藉由局部給藥至肺部的方法。有利的是，給藥至肺部之有益作用為化合物可發揮作用同時將對於患者之副作用減到最小。
於一個具體例中，該化合物適用於以皮質類固醇治療之敏感性患者。
再者，本發明係提供一製藥組成物，其包括根據本案之化合物任意的與一種或多種製藥上可接受的稀釋劑或載體組合。
稀釋劑及載體可包括那些適用於非經腸胃，口服，局部，黏膜及直腸給藥，且可能根據給藥途徑而不同。
於一個具體例中，組成物可製備用於腸胃外，皮下，肌肉注射，靜脈注射，關節內或關節周圍給藥，特別是於液態溶液或熟浮液型式時；於口服給藥時，特別是以錠劑或膠囊型式；於 局部如肺部或鼻腔給藥時，特別是以粉末，鼻滴劑或氣溶膠及經皮給藥型式；於黏膜給藥時，如至頰，舌下或***黏膜，及於直腸給藥如以栓劑之型式。於另一個具體例中，組成物可製備成液體溶液或懸浮液型式以供口服給藥；製備成液體溶液，液體懸浮液，包括溶液或懸浮液之鼻滴劑或加壓或未加壓之氣溶膠以供局部給藥。
該組成物可方便的以單位劑量型式來給藥且可藉由任何製藥技藝熟知之方法來製備，例如說明於Remington's Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company，Easton，PA.，(1985)。該組成物亦可方便的以複數單位劑量型式給藥。
非經腸胃給藥之製劑可含有作為賦形劑之無菌水或食鹽水，亞烷基乙二醇，如亞丙基乙二醇，聚亞烷基乙二醇，如聚亞乙基乙二醇，植物來源的油，氫化萘等。
經鼻給藥製劑可為固體且可含有賦形劑，例如，乳糖或葡聚醣，或可為水性或油性溶液以用於經鼻滴劑或計量噴霧型式。經鼻給藥製劑亦可呈水性懸浮液型式。對於經頰給藥時，典型的賦形劑包括糖，硬脂酸鈣，硬脂酸鎂，預凝膠化澱粉等。
適於口服給藥之組成物可包含一種或多種生理上相容的載體及/或賦形劑且可為固體或液體型式。錠劑及膠囊可與黏結劑一起製備，例如，糖漿，***膠，凝膠，山梨糖醇，黃蓍膠，或聚乙烯吡咯烷酮；填充劑，如乳糖，蔗糖，玉米澱粉，磷酸鈣，山梨糖醇，或甘胺酸；潤滑劑，如硬脂酸鎂，滑石，聚亞乙基二醇，或矽膠；及表面活化劑，如月桂基硫酸鈉。液化組成物可含 有傳統添加劑例如懸浮劑，例如山梨糖醇糖漿，甲基纖維素，糖漿，凝膠，羧甲基纖維素，或食用油脂；乳化劑如卵磷脂，或***膠；植物油如杏仁油，椰子油，魚肝油，或花生油；防腐劑如丁基羥基茴香醚(BHA)及二丁基羥基甲苯(BHT)。液態組成物可封裝於，例如，凝膠以提供一單位劑量型式。
固態口服劑量型式包括錠劑，兩片式硬殼膠囊及軟彈凝膠(SEG)膠囊。此等兩片式硬殼膠囊可製自，例如，凝膠或羥基丙基甲基纖維素(HPMC)。
一乾外殼製劑典型的包括約40%-60%濃度之凝膠，約20%-30%濃度之增塑劑(如甘油，山梨糖醇或亞丙基乙二醇)及約30%-40%濃度之水。亦可存在有其他物質例如防腐劑，染料，乳濁劑及風味劑。該液體填充物質包括一固體藥物，其已溶解，溶化或分散(以懸浮劑，如蜂蠟，氫化蓖麻油或聚亞乙基乙二醇4000)或一液體藥物於載體或載體之組合如礦物油，植物油，三酸甘油酯，乙二醇，多元醇及表面活性劑。
適當的，該式(I)化合物係局部給藥至肺部。因此，於一個具體例中，其係提供製藥組成物，其包括本案之化合物其任意的與一種或多種局部可接受之稀釋劑或載體組合。
局部給藥至肺部可藉由使用氣溶膠製劑而達成。氣溶膠製劑典型的包括懸浮或溶解於一適當的氣溶膠推進劑，如一氯氟碳(CFC)或氫氟碳(HFC)之活性組成份。適當的CFC推進劑包括三氯單氟甲烷(推進劑11)，二氯四氟甲烷(推進劑114)，及二氯二氟甲烷(推進劑12)。適當的HFC推進劑包括四氟乙烷(HFC-134a)及七氟丙烷(HFC-227)。該推進劑典型的包括40%-99.5%如40%-90% 重量之總吸入性組成物。該製劑可包括賦形劑，其包含共溶劑(如乙醇)及表面活化劑(如卵磷脂，山梨醇三油酸酯等)。其他可能的賦形劑包括聚亞乙基乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，甘油等。氣溶膠製劑係包裝於一罐子中且藉由一計量閥而傳送出適當劑量(如由Bespak，Valois或3M或替代的藉由Aptar，Coster或Vari來提供)。
局部給藥至肺部亦可藉由使用未加壓製劑，如水性溶液或懸浮液而達成。這些可藉由如一種可手持及可攜帶或家庭用或醫院用(即不可攜帶)之噴霧器而給藥。該製劑可包括賦形劑如水，緩衝液，張力調節劑，pH調節劑，表面活化劑及共溶劑。懸浮液體及氣溶膠製劑(無論加壓或未加壓)將典型的含有呈細碎型式之本發明化合物，例如其D50為0.5-10μm如約1-5μm。粒徑分佈可用D10，D50及D90值來代表。該粒徑分佈之D50中間值係以微米來定義粒子大小，其將分佈分成兩半。由激光繞射所產生的測量係更準確地以體積分佈來描述，且因此，該使用此方法所得到的D50值係更有意義的指稱為Dv50值(體積分佈之中間值)。如本文中所使用，Dv值係指使用激光繞射所測得之粒徑分佈。同樣的，D10及D90值，於上下文中所使用之激光繞射法，係指Dv10及Dv90值且係指粒子大小，其中10%分佈在D10值下方，且90%分佈在D90值下方，分別的。
局部給藥至肺部亦可藉由使用乾性粉末製劑來達成。一乾性粉末製劑將含有呈細碎型式之本案化合物，典型的具有1-10μm之質均直徑(MMAD)或0.5-10μm，如約1-5μm之D50。呈細碎粉末型式之本發明化合物可藉由微粒化方法或類似之尺寸減低方法來製備。微粒化可藉由使用噴射研磨機來進行，如該等藉由 Hosokawa Alpine製備者。所產生之粒子大小分佈係使用激光繞射來測量(如用Malvern Mastersizer 2000S儀器)。該製劑典型的將含有一局部可接受之稀釋劑，如乳糖，葡萄糖或甘露糖醇(宜為乳糖)，通常為相對較大之粒子大小，如50μm或更大之質均直徑(MMAD)，如100μm或更大，或40-150μm之D50。如本文中所使用，“乳糖”之詞係指含有乳糖之組成份，包括α-乳糖單水合物，β-乳糖單水合物，無水α-乳糖，無水β-乳糖及無定形乳糖。乳糖組成份微粒化，過篩，碾磨，壓製，凝結或噴霧乾燥而製備。市售可得之各種乳糖型式亦涵蓋，例如Lactohale®(inhalation grade乳糖；DFE Pharma)，InhaLac®70(乾性粉末吸入劑用之過篩乳糖；Meggle)，Pharmatose®(DFE Pharma)及Respitose®(過篩吸入等級之乳糖；DFE Pharma)產物。於一個具體例中，該乳糖組成份係選自包含下列之基團：α-乳糖單水合物，無水α-乳糖及無定形乳糖。較佳者，該乳糖為α-乳糖單水合物。
乾性粉末製劑亦可含有其他賦形劑，如硬脂酸鈉，硬脂酸鈣或硬脂酸鎂。
乾性粉末製劑典型的係使用乾性粉末吸入器(DPI)裝置來傳送。乾性粉末傳輸系統之實例包括SP吸入器®，DISKHALER®，TURBOHALER®，DISKUS®，SKYEHALER®，ACCUHALER®及CLICKHALER®。乾性粉末傳送系統之其他實例包括ECLIPSE，NEXT，ROTAHALER，HANDIHALER，AEROLISER，CYCLOHALER，BREEZHALER/NEOHALER，MONODOSE，FLOWCAPS，TWINCAPS，X-CAPS，TURBOSPIN，ELPENHALER，MIATHALER，TWISTHALER，NOVOLIZER，PRESSAIR，ELLIPTA， ORIEL乾性粉末吸入器，MICRODOSE，PULVINAL，EASYHALER，ULTRAHALER，TAIFUN，PULMOJET，OMNIHALER，GYROHALER，TAPER，CONIX，XCELOVAIR及PROHALER。
於一個具體例中，本發明化合物係以微粒化乾粉末製劑提供，例如包括適當級別之乳糖，填充至一裝置，如DISKUS。適當的，此一裝置為複數劑量裝置，例如該製劑係填充至泡泡中以使用於複數單位劑量裝置，如DISKUS。
於一個具體例中，本發明化合物係以微粒化乾性粉末製劑來提供，包括適當級別之乳糖及硬脂酸鎂，填充至供複數劑量裝置使用之硬殼膠囊泡泡中以使用於複數劑量裝置，如DISKUS。適當的，此一裝置係一複數劑量裝置。
於另一個具體例中，本發明化合物係以微粒化乾性粉末製劑來提供，例如包括適當級別之乳糖，填充至供單一劑量裝置使用之硬殼膠囊，如AEROLISER。
於另一個具體例中，本發明化合物係以微粒化乾性粉末製劑來提供，包括適當級別之乳糖及硬脂酸鎂，填充至供單一劑量裝置使用之硬殼膠囊，如AEROLISER。
適用於乾性粉末吸入器之化合物(I)之組成物的實例係列於實例15。
根據本案之化合物意圖具有治療活性。於另一方面，本發明係提供本案化合物以用作為醫藥品。
根據本案之化合物亦可用來治療呼吸道障礙包括COPD(包括慢性支氣管炎及肺氣腫)，氣喘，小兒氣喘，囊性纖維化，結節病，特發性肺纖維化，過敏性鼻炎，鼻炎，鼻竇炎及其任一項 病毒誘發之急性發作，呼吸道病毒感染，尤其是氣喘，慢性支氣管炎及COPD。
呼吸道病毒包括流感，呼吸道合胞病毒，人副流感病毒，SARS冠狀病毒及腺病毒。呼吸道病毒之進一步實例為鼻病毒。
本案之化合物亦可，於當先前患者的病情已變得同樣難治時，敏化患者的病情以用皮質類固醇治療。
於本發明之一個具體例中，本案化合物所使用之一劑量係等同於適用作為單一療法但與皮質類固醇於組合中一起給藥。
於一個具體例中，所使用式(I)化合物之劑量係作為單一試劑之亞治療，於含有皮質類固醇之組合，因而回復病患對於後者之回應，舉例說，其中該病患已對同一者成為難治。
於一個具體例中，係使用一劑量之式(I)化合物，其係與如果於式(I)化合物不存在時給藥可為亞治療之一劑量的皮質類固醇合併在一組合中，因而回復病患對於皮質類固醇之回應，舉例說，其中該病患對同一者言已成為難治。
此外，本案化合物可具有抗病毒活性且，例如，證明有用於治療如氣喘及/或COPD之發炎狀況的病毒發作。
本案揭示之化合物亦有用於預防，治療或改善與流感病毒，鼻病毒及/或呼吸道合胞病毒有關之疾病或疾病之併發症。
於一個具體例中，其係提供式(I)化合物以治療或預防病毒感染或病毒感染引起之發炎性併發症。
根據本案之式(I)化合物亦預期可有用於治療某些狀況，其可藉由外用或局部治療處理，包括過敏性結膜炎，結膜炎，過敏性皮膚炎，接觸性皮膚炎，牛皮癬，潰瘍性結腸炎，類風濕性 關節炎或骨性關節炎之繼發性關節發炎。
於一個具體例中，該式(I)化合物被認為當藉由適當途徑給藥時有用於治療C型肝炎及/或HIV。適當給藥途徑可包括口服，靜脈注射或灌注。
於一個具體例中，該治療C型肝炎之式(I)化合物係於輸入到肝臟之前輸送到血液中。
本案之化合物預期亦有用於治療特定之其他狀況，包括類風濕性關節炎，胰腺炎，惡病質，抑制腫瘤生長及轉移，包括非小細胞肺癌，乳癌，胃癌，大腸癌及惡性黑色素瘤。
於一個具體例中，本案揭示之化合物及包括其等之製藥製劑有用於治療或預防癌症，特別為肺癌，尤其是藉由局部給藥至肺部。
因此，於另一方面，本發明係提供如本文所說明之化合物以用於治療一種或多種上述狀況。
於另一方面，本發明係提供如本文所說明之化合物以製備用於治療一種或多種上述狀況之醫藥品。
於另一方面，本發明係提供一治療上述狀況之方法，其包括將有效量之本案化合物或其製藥組成物給藥至一個體。
本文中說明之化合物亦可用來製備用於治療一種或多種如上指明之疾病的醫藥品。
“處理”之詞意在包括預防性以及治療性處理。
本案之化合物亦可以含一種或多種其他活性組成份，如適用於治療上述狀況之活性組成份的組合來給藥。例如治療呼吸道障礙之可能組合包括含有皮質類固醇(如布***，二丙酸倍氯 米松，丙酸氟替卡松，糠酸莫米松，糠酸氟替卡松)，β激動劑(如特布他林，沙丁胺醇，沙美特羅，福莫特羅，茚達特羅)，黃嘌呤(如茶鹼)，毒蕈鹼拮抗劑，(如異丙托溴銨)及/或p38 MAP激酶抑制劑之組合。適當皮質類固醇之其他實例為環索奈德或氟尼縮松。適當的，該β激動劑為β2激動劑。β2激動劑之其他實例為瑞普特羅，維拉特羅，歐塔特羅，瑞普特羅及非諾特羅。毒蕈鹼拮抗劑之其他實例包括噻托溴銨，米克丁尼，格隆，阿地尼亞及達拉托平，任意的這些可例如呈溴鹽。治療呼吸道障礙之其他可能的組合為本案之化合物及磷酸二酯酶抑制劑。
於一個具體例中，本案化合物可以含有抗病毒劑，例如阿昔洛韋，奧司他韋，扎那米韋(瑞樂沙®)或干擾素之組合給藥。
於一個具體例中，該活性組成份組合為共同配製。
於一個具體例中，本案揭示之化合物係與作為吸入性製劑之皮質類固醇共同配製，例如用來維持COPD或肺癌之治療，包括預防後者。
於一個具體例中，活性組成份之組合係簡單的共同配製。
於一個具體例中，其係提供一包括下列之組合產物：(A)一本案揭示之化合物；及(B)其他活性組成份，如選自皮質類固醇，β激動劑，黃嘌呤，毒蕈鹼拮抗劑，磷酸二酯酶抑制劑及p38 MAP激酶抑制劑(如選自皮質類固醇，β激動劑，黃嘌呤，毒蕈鹼拮抗劑及p38 MAP激酶抑制劑)。
其中，各組成份(A)及(B)係與製藥上可接受的稀釋劑或 載體配製成掺合物。該組合可任意包括其他相關之賦形劑。適當的β激動劑為β2激動劑。
於一個具體例中，其係提供根據申請專利範圍第1項之作為醫藥品之式(I)化合物以含有一種或多種其他活性組成份之組合一起給藥，如選自皮質類固醇，β激動劑，黃嘌呤，毒蕈鹼拮抗劑及p38 MAP激酶抑制劑。適當的β激動劑為β2激動劑。
於一個具體例中，本案化合物係藉由吸入給藥且皮質類固醇係口服給藥或藉由吸入給藥，以組合或分開。
於一個具體例中，本案化合物係藉由吸入給藥且β2激動劑係口服給藥或藉由吸入給藥，以組合或分開。
圖式1a：為一直方圖，其係代表用化合物(I)或化合物A於小鼠呼吸道對於聚-I：C-引起之中性粒細胞累積之治療功效。
圖式1b：顯示化合物(I)對於化合物A於小鼠呼吸道對於聚-I：C-引起之中性粒細胞累積之抑制效價的比較。
圖式2a：為一直方圖，其係代表用化合物(I)或化合物A於小鼠BALF對於香煙煙霧引起之巨噬細胞累積的功效。
圖式2b：為一直方圖，其係代表用化合物(I)或化合物A於小鼠BALF對於香煙煙霧引起之中性粒細胞累積的功效。
圖式3：為一X-射線粉末繞射(XRPD)圖，其得自型式1多晶型結晶樣品(參見實例2)。
圖式4：顯示一熱重分析(TGA)(上方圖)及差示掃描量熱分析(DSC)(下方圖)型式1多晶型結晶之樣品分析(參見實例 2)。
圖式5：為一XRPD圖示，其得自型式2多晶型結晶樣品(參見實例4)。
圖式6：顯示一型式2多晶型結晶樣品之TGA分析(參見實例4)。
圖式7 顯示一型式2多晶型結晶樣品之DSC分析(參見實例4)。
圖式8：為型式2多晶型結晶樣品之DVS等溫線(參見實例4)。
圖式9：為型式2多晶型結晶樣品於質量繪圖之DVS改變(參見實例4)。
圖式10：顯示型式2多晶型結晶樣品DVS分析之前(下方圖)及之後(上方圖)所得到之XRPD圖示(參見實例4)。
圖式11：顯示於之前(下方圖)及於25℃/96% RH(中間圖)及40℃/75% RH(上方圖)儲存1週後(參見實例4)得到之型式2多晶型結晶樣品之XRPD圖示。
圖式12：為XRPD圖示，其得自型式3多晶型結晶樣品(參見實例8)。
圖式13：顯示一型式3多晶型結晶樣品之TGA(上方圖)及DSC(下方圖)分析(參見實例8)。
圖式14：為對於型式3多晶型結晶樣品之GVS分析(參見實例8)。
圖式15：顯示XRPD圖示，其係得自對於型式3多晶型結晶樣品之GVS分析之前(下方圖)及之後(上方圖)(參見實例8)。
圖式16：顯示型式3多晶型結晶樣品之XRPD圖示，其得自於儲存之前(下方圖)及儲存於25℃/96% RH及40℃/75% RH(上方圖)一週之後(參見實例8)。
圖式17：顯示一XRPD圖示之重疊，其得自型式7(上方圖)，型式6，型式5，型式4，型式3，型式2及型式1(下方圖)之樣品(參見實例9至12)。
實驗章節
本文中所使用之縮寫係定義如下(表1)。任何未定義之縮寫意在傳達其等普遍接受之含義。
一般程序
所有起始物質及溶劑係得自市售來源或根據文獻引證來製備。除非另有說明所有反應係經攪拌。有機溶液係例行的於無水硫酸鎂上乾燥。
管柱色層分離法係於預填充矽膠(230-400篩孔，40-63μm)匣中使用指定量來進行。
分析方法 分析性LCMS
分析性LCMS係用Waters Xselect CSH C18 3.5μm管柱(4.6 x 50mm)，流速2.5-4.5毫升/分鐘，用含有0.1% v/v甲酸之H2O-MeCN梯度於4分鐘期間洗提而進行。梯度資料：0-3.00分鐘，斜度為由95% H2O-5% MeCN至5% H2O-95% MeCN；3.00-3.01分鐘，維持於5% H2O-95% MeCN，流速提昇至4.5毫升/分鐘；3.013.50分鐘，維持於5% H2O-95% MeCN；3.50-3.60分鐘，回到95% H2O-5% MeCN，流速降低至3.50毫升/分鐘；3.60-3.90分鐘，維持於95% H2O-5% MeCN；3.90-4.00分鐘，維持於95% H2O-5% MeCN，流速降低至2.5毫升/分鐘。含有餾份之樣品係藉由其等之UV吸光度於254nm檢測。洗提峰的質譜係使用Agilent 6120四極質譜儀，於混合的正離子和負離子電噴霧模式下操作。
1 H NMR光譜
1H NMR光譜係於Bruker Avance III光譜儀上以400MHz使用殘留之未氘化的溶劑作為參考而得到，且除非特別說明，係以DMSO-d6運行。
X-射線粉末繞射-方法1(使用Brucker AXS C2 GADDS繞射儀)
繞射圖之收集係使用：Cu Kα輻射(40kV，40mA)，自動化XYZ階段，自動-樣品定位之雷射視頻顯微鏡及HiStar 2-維面積檢測器。X-射線光學器件係含有一單一Göbel多層鏡配上0.3mm之針孔準直器。光束發散度，亦即於樣品上之X-射線束的有 效大小為約4mm。使用θ-θ連續掃描模式，樣品-檢測器距離為20cm，其有效2θ範圍為3.2°-29.7°。典型的，該樣品係暴露至X-射線束達120秒。該所使用來收集數據之軟體為GADDS供XP/2004 4.1.43且該數據係使用Diffrac Plus EVA v13.0.0.2或v15.0.0.0來分析及呈現。於周遭環境下運行的樣品係使用如收到時未經研磨之粉末製備成平板標本。將約1-2毫克樣品輕壓至一載玻片上而得到一個平坦的表面。將於非周遭環境下運行的樣品安裝在含有熱傳導化合物之矽膜片上。然後將樣品以20℃/分鐘加熱至適當溫度且隨即維持恆溫達1分鐘，之後開始收集數據。
X-射線粉末繞射-方法2(使用Brucker AXS D8 advance繞射儀)
收集繞射圖示，使用Cu Kα輻射(40kV，40mA)，θ-2θ測角儀，及發散V4及接收縫隙，Ge單色儀及Lynxeye檢測器。用來收集數據之軟體為Diffrac Plus XRD Commander v2.6.1且該數據係用Diffrac Plus EVA v13.0.0.2或v15.0.0.0來分析及呈現。樣品係於周遭環境下以平板標本使用粉末作為接收物來運行。將該樣品輕輕地裝入一切割成拋光，零-背景(510)矽膜片之室腔。於分析期間將該樣品旋轉至其自身平面。收集數據之細節為：角度範圍：2至42 °2θ；步長：0.05 °2θ；收集時間：0.5秒/步。
X-射線粉末繞射-方法3(使用PANalytical(Philips)X’PertPRO MPD繞射儀)
該儀器裝設有Cu LFF X-射線管。將化合物散佈在零背景樣品座上。所使用之儀器參數如下：發電機電壓：45kV；發電機安培數：40 mA；幾何學：Bragg-Brentano；階段：微調階段。測量條件如下：掃描模式：連續；掃描範圍：3至50° 2θ；步長：0.02°/步；計數時間：30秒/步；微調器旋轉時間：1秒；輻射類型：CuKα。入射光束路徑參數如下：方案。發散縫隙：15mm；Soller縫隙：0.04rad；光束罩：15mm；抗散射屏蔽：1°；光束刀：+。繞射光束路徑參數如下：長抗散射屏蔽：+；Soller縫隙：0.04rad；Ni過濾器：+；檢測器：X’Celerator。
差示掃描量熱分析-方法1(使用Mettler DSC 823e儀器)
Mettler DSC 823E係配備有34個位置之自動採樣器。該儀器係用認證之銦校正能量及溫度。典型的，將各樣品0.5-3毫克，於一針-孔鋁鍋，以10℃/分鐘由25℃加熱至300℃。於樣品上維持50毫升/分鐘之氮氣吹掃。該儀器控制及數據分析軟體為STARe v9.20。
差示掃描量熱分析-方法2(使用TA-Instruments Q1000 MTDSC，裝備有RCS冷卻部件)
將TA-Instrument樣品鍋用適當的蓋子蓋住並於裝備有RCS冷卻部件之TA-Instruments Q1000 MTDSC記錄DSC曲線。使用下列參數：初始溫度：25℃；加熱速率：10℃/分鐘；最終溫度：250℃。
熱重分析-方法1(使用Mettler TGA/SDTA 851e儀器)
於裝備有34個位置之自動採樣器之Mettler TGA/SDTA 851e上收集TGA數據。將該儀器用認證之銦校正溫度。典型的，將各樣品 5-30毫克負載至預秤重之鋁坩堝且以10℃/分鐘由週遭溫度加熱至350℃。在樣品上維持50毫升/分鐘之氮氣吹掃。儀器控制及數據分析軟體為STARe v9.20。
熱重分析(TGA)-方法2(使用TA-Instruments Q500 TGA熱天平)
於TA-Instruments Q500 TGA熱天平上收集TGA數據。於用下列參數分析之前，將該化合物轉移至鋁樣品鍋：起始溫度：室溫；加熱速率：20℃/分鐘；解析因子：4；最終狀況：350℃或<80[(w/w)%]。
重量水分吸附(GVS)
吸附等溫線係使用SMS DVS Intrinsic水分吸附分析儀而獲得，藉由DVS Intrinsic Control軟體v1.0.1.2(或v 1.0.1.3)來控制。將樣品溫度藉由儀器控制而維持於25℃。藉由掺合乾及濕氮氣而控制濕度，總流速為200毫升/分鐘。相對濕度係藉由經校正之Rotronic探針(動態範圍為1.0-100%RH)來測量，位於靠近樣品。作為%RH之函數的樣品之重量改變，(大規模放鬆)係由微量天平持續監控(準確度±0.005毫克)。典型的，將5-20毫克樣品於週遭狀況下置於一已秤空重有孔不銹鋼籃子中。將樣品於40%RH及25℃(典型的於房間狀況)負載及未負載。吸濕等溫線係如下所述而進行(4個掃描給予2個完整的循環)。該標準等溫線係於25℃在10%RH區間於0-90%RH範圍時進行。數據分析係於Microsoft Excel使用DVS Analysis Suite v6.2(或6.1或6.0)來進行。
該樣品係於完成等溫線後回收並藉由XRPD再分析。
動態蒸氣吸附(DVS)
將約20毫克化合物轉移至SMS動態蒸氣吸附並使用下列參數紀錄於25℃之大氣濕度重量改變：乾燥：60分鐘於乾氮氣；平衡：60分鐘；RH(%)測量點：循環1：5，10，20，30，40，50，60，70，80，90，95，90，80，70，60，50，40，30，20，10，5；循環2：10，20，30，40，50，60，70，80，90，95，90，80，70，60，50，40，30，20，10，5，0。
實例1-化合物(I)及化合物(Ia)之製備
中間體A：2-((4-胺基-3-碘-1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-溴-3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮。
於-1℃時，於一含有2-溴-6-(2-氯乙醯胺)苯甲酸[King-Underwood等，WO2011/048111]，(50.0克，171毫莫耳)，(2-(三氟甲基)苯基)甲胺(29.4毫升，205毫莫耳)及三乙胺(34毫升，430毫莫耳)於甲苯(1.2升)之經攪拌混合物中，將含有三氯化磷(37毫升，430毫莫耳)於甲苯(100毫升)之溶液於1小時期間逐滴加入，於此期間，溫度維持在低於5℃。將反應混合物加熱至回流達2.5小時且然後趁熱將產生的懸浮液過濾。保留濾液並將收集之固體懸浮於新鮮甲苯(100毫升)中，並於劇烈攪拌時加熱至90℃。將固體藉由過濾法移除並將該含有粗產物之有機萃出物合併。
第二批此物質係藉由在相同條件相同規模下重複該反應而製備。將來自該兩個反應之合併濾液於真空中蒸發並將殘質用IPA(2 x 400毫升)碾製。將如此得到之粗物質於真空中乾燥而得到呈灰白色固體之5-溴-2-(氯甲基)-3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮(100克，90%純度藉由HPLC，61%)；Rt 2.70分鐘；m/z 431/433(M+H)+(ES+)。
於室溫時，於一含有喹唑啉酮，得自如上，(100克，90%純度，210毫莫耳)及3-碘-1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶-4-胺(50.4克，193毫莫耳)於DMF(600毫升)之溶液中添加碳酸鉀(80.0克，580毫莫耳)且於18小時後，將反應混合物倒至水中(1.2升)。藉由過濾法收集所產生的沉澱物，且隨即用水(500毫升)，用EtOAc(600毫升)且最後用Et2O(400毫升)清洗。將產生的餅於真空中乾燥而得到呈灰白色固體之標的化合物，中間體A，(115克，89%)；Rt 2.28分鐘，m/z 656/658(M+H)+(ES+)。
中間體B：2-((4-胺基-3-(3-氟-5-羥基苯基)-1H-吡唑並 [3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-溴-3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮。
於室溫時，將一含有中間體A(54.4克，83.0毫莫耳)，(3-氟-5-羥基苯基)硼酸(15.5克，99.0毫莫耳)及K3PO4(19.1克，83.0毫莫耳)於1-丁醇(900毫升)之溶液用氮氣吹掃20分鐘。將混合物用PPh3(3.26克，12.4毫莫耳)及用Pd2(dba)3(1.90克，2.07毫莫耳)處理且用氮氣再吹掃10分鐘且於氮氣流中加熱至90℃。40小時後，將混合物冷卻至70℃並將水(250毫升)逐滴加入。將混合物冷卻至50℃達3小時且然後至室溫達3天，於此期間，形成灰棕色沉澱。藉由過濾法收集該固體，用1-丁醇(2 x 100毫升)及水(2 x 100毫升)清洗且然後於40℃真空中乾燥而得到呈灰白色固體之標的化合物，中間體B(35.2克，65%)；Rt 2.25分鐘，m/z 640/642(M+H)+(ES+)。
化合物(I)：2-((4-胺基-3-(3-氟-5-羥基苯基)-1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-(3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙-1-炔-1-基)-3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮。
將一含有中間體B(35.2克，55.0毫莫耳)，3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙-1-炔[King-Underwood等，WO2011/048111]，(17.4克，110毫莫耳)，PdCl2(PPh3)2(3.86克，5.50毫莫耳)及碘化銅(I)(1.05克，5.50毫莫耳)於含有Et2NH及DMF(4：1 v/v，820毫升)之混合物的懸浮液於室溫用氮氣吹泡10分鐘。將混合物加熱至65℃達1.5小時且然後冷卻至RT。將蒸發物於真空中蒸發並將殘質於EtOAc(600毫升)及飽和水性NH4OAc(650毫升)中分佈。將含水層分離並用EtOAc(300毫升)萃取且將合併之有機層於真空中蒸發而得到暗褐色黏稠油。將甲醇(200毫升)加入並將該混合物於室溫攪拌16小時。形成黃色沉澱，將其藉由過濾法收集並用MeOH(100毫升)清洗。將於兩個分離批次中所產生的固體藉由閃蒸管柱色層分離法予以純化(SiO2，330克，MeOH於DCM，0-6%，梯度洗提)。將經純化之物質一起於混合物DCM/MeOH(10：1 v/v)中提取而得到一均相溶液，然後將其蒸發並於真空中乾燥而得到呈灰白色固體之標的化合物，化合物(I)，(20.1克，51%)；Rt 2.15分鐘，m/z 718(M+H)+(ES+)；1H NMR δ：3.19(3H，s)，3.35-3.38(2H，重疊m)，3.44-3.49(4H，重疊m)，3.60-3.63(2H，重疊m)，4.37(2H，s)，5.49(2H，s)，5.76(2H，s)，6.42(1H，d)，6.65(1H， m)，6.73(1H，m)，6.79(1H，m)，7.15(1H，t)，7.28(1H，t)，7.52(1H，d)，7.65-7.69(2H，重疊m)，7.82(1H，m)，8.12(1H，s)，10.15(1H，s)。
化合物(Ia)：2-((4-胺基-3-(3-氟-5-羥基苯基)-1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-(3-(2-(2-羥基乙氧基)乙氧基)丙-1-炔-1-基)-3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮。
將一含有中間體B(190毫克，0.297毫莫耳)，2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙醇[King-Underwood等，WO2011/048111](257毫克，0.890毫莫耳)，PdCl2(PPh3)2(208毫克，0.297毫莫耳)及碘化銅(57毫克，0.30毫莫耳)於混合物Et2NH及DMF(4：1 v/v，7.5毫升)之懸浮液用N2脫氣且然後加熱至60℃達16小時。將反應混合物冷卻至室溫並於真空中蒸發至矽膠上並藉由閃蒸管柱色層分離法(SiO2，12克，MeOH於DCM，0-5%，梯度洗提)予以純化而得到呈淡褐色固體之標的化合物，化合物(Ia)，(30毫克，14%)；Rt 1.88分鐘，m/z 704(M+H)+(ES+)；1H NMR δ：3.36-3.50(6H，重疊m)，3.61-3.63(2H，重疊m)，4.37(2H，s)，4.58(1H，m)，5.48(2H，s)，5.76(2H，s)，6.41(1H，d)，6.64(1H，m)，6.72(1H，d)，6.78(1H，s)，7.14(1H，t)，7.27(1H，t)，7.52(1H，d)，7.65-7.71 (2H，重疊m)，7.82(1H，t)，8.13(1H，s)，10.19(1H，br s)。
根據結構上類似化合物之分析(參見WO2011/048111)，化合物(I)被認為不太可能會具有阻轉異構型。由阻轉異構型造成之藥物研發的額外複雜性及結果類似於那些由分子異構現象之其他來源所產生者，如立體中心的存在。此特性使得此等分子均為對掌性，且除非解析，消旋混合物；其中之組成份可具有不同的藥理和毒理表現。此特性可能會顯著的提高此等分子之下游開發成本，且因此沒有化合物(I)之阻轉異構型是非常期望且為有利的特性。
實例2-呈型式1多晶型結晶之化合物(I)的製備
呈型式1多晶型結晶之化合物(I)係由中間體B開始製備，其可依照下列程式所概述而製備：
該中間體的製備方法載列如下。
1-溴-3-(第三丁氧基)-5-氟苯
將第三醇鈉(284克，3.89莫耳)逐份加至一冰冷之DMA(2.0升)中，接著逐滴加入1-溴-3,5-二氟苯(298毫升，2.59莫耳)。於添加完成時，將混合物回暖至室溫並攪拌72小時。將水(200毫升)加入並將產生的膠狀沉澱物過濾出來。將上層清液於真空中濃縮並將殘質藉由真空蒸餾法予以純化。將產生的油溶解於二***(1.0升)，用水(6 x 250毫升)清洗，乾燥(MgSO4)並於真空中濃縮而得到呈無色油之標的化合物(220克，881毫莫耳，34.0%)：b.p.84-86℃(8毫巴)；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.35(9H，s)，6.64(1H，dt)，6.92-6.96(2H，重疊m)。
(3-(第三丁氧基)-5-氟苯基)硼酸；2
於-78℃，於一含有1-溴-3-(第三丁氧基)-5-氟苯(75.0克，304毫莫耳)於THF(1.0升)之溶液中逐滴加入正丁基鋰(2.5M於己烷，150毫升，337毫莫耳)。將產生的混合物於此溫度攪拌45分鐘且 將三異丙基硼酸酯(105毫升，455毫莫耳)逐滴加入。將混合物於該溫度攪拌1.5小時，且然後於1.5小時期間回暖至-5℃。將混合物用二***(1.0L)及1M HCl水溶液(450毫升)稀釋並將各層分離。將含水層用更多二***(2 x 250毫升)來萃取。將合併之有機萃出物乾燥(MgSO4)，過濾且然後於真空中蒸發得到淡黃色油。將固體再次溶解於異己烷(300毫升)並再次濃縮而得到灰白色黏稠固體。將固體用異己烷(150毫升)碾製並過濾而得到白色粉末。將物質於2M NaOH(600毫升)及二***(600毫升)中分佈。收集含水層並將有機物用更多NaOH(2 x 200毫升)萃取。有顯著數量之物質不溶並將其過濾，用二***清洗(藉由LCMS確認為乾淨產品)。將鹼性含水層於冰浴中冷卻並用濃HCl(~130毫升)酸化至pH 1。將含水層用DCM(3 x 300毫升)萃取並將合併之有機物乾燥(Na2SO4)，過濾並於真空中濃縮而得到一灰棕色粉末。將其用異己烷(100毫升)碾製而再次得到乾淨產品。合併兩批次而得到呈灰白色粉末之標的化合物2(17.2克，73.0毫莫耳，24.1%)：Rt：1.87分鐘。
2-(3-(第三丁氧基)-5-氟苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二硼烷；3
將一含有鈀(II)二氯化物-1,1'-聯(二苯基膦)二茂鐵(6.81克，9.31毫莫耳)，醋酸鉀(54.8克，558毫莫耳)及4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'- 雙(1,3,2-二硼烷)(52.0克，205毫莫耳)之混合物用氮氣沖洗並於其中加入含有1-溴-3-(第三丁氧基)-5-氟苯(46.0克，186毫莫耳)於DMSO(528毫升)之溶液。將產生的混合物以超音波處理3分鐘，脫氣5分鐘並於80℃加熱23小時。將反應混合物於二***(500毫升)及水(500毫升)中分佈。將含水層再用二***(3 x 400毫升)萃取。將合併之有機萃出物用鹽水(300毫升)清洗，乾燥(MgSO4)，過濾並於真空中蒸發而得到一暗褐色殘質。將此殘質溶解於異己烷/EtOAc之混合物中，經由矽膠短塞過濾並於真空中蒸發而得到淡褐色固體。將固體殘質再吸收至矽膠並藉由管柱色層分離法予以純化(SiO2，用0-4% EtOAc於異己烷洗提，梯度洗提)而得到呈白色固體之標的化合物3。(27.0克，87.0毫莫耳，46.8%)：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：1.31(12H，s)，1.34(9H，s)，6.78(1H，m)，7.17-7.20(2H，重疊m)。
2-((4-胺基-3-(3-(第三丁氧基)-5-氟苯基)-1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-溴-3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮；1(由硼酸，3)
將含有中間體A(2 x 10.0克，14.9毫莫耳)，(3-(第三丁氧基)-5-氟苯基)硼酸3(2 x 3.17克，14.9毫莫耳)，十水碳酸鈉(2 x 6.75克，23.6毫莫耳)及鈀四三苯基膦(2 x 0.52克，0.45毫莫耳)於EtOH/水(9：1，2 x 500毫升)混合物之混合物用氮氣脫氣，超音波處理達10分鐘且然後於65℃氮氣中攪拌18小時。將反應混合物合併並將溶劑於真空中移除，將殘質溶解於10% MeOH之DCM溶液(500毫升)中並用飽和醋酸銨溶液(400毫升)清洗。將含水層再次用10% MeOH之DCM溶液(2 x 400毫升)萃取。將合併之有機萃出物於真空中蒸發並將殘質再吸收至矽膠並藉由閃蒸管柱色層分離法予以純化(用0-40% EtOAc於DCM洗提，梯度洗提)而得到呈灰黃色固體之標的化合物1(8.4克，9.89毫莫耳，32.4%)：Rt 2.70分鐘，1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：1.37(9H，s)，5.50(2H，s)，5.78(2H，s)，6.49(1H，d)，6.91(1H，t)，6.95(1H，dt)，7.04(1H，m)，7.15(1H，t)，7.28(1H，t)，7.54(1H，d)，7.68-7.72(2H，重覆m)，7.83(1H，dd)，8.15(1H，s)。該物質約為80%純度。
2-((4-胺基-3-(3-(第三丁氧基)-5-氟苯基)-1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-溴-3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)酮；1(由硼酸酯，2)
將一含有中間體A(10.0克，14.9毫莫耳；製備如說明於實例1)，2-(3-(第三丁氧基)-5-氟苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二硼烷2(6.59克，22.40毫莫耳)(3.17克，14.9毫莫耳)，十水碳酸鈉(26.75克，23.6毫莫耳)及鈀四三苯基膦(0.52克，0.45毫莫耳)於EtOH/水(9：1，500毫升)混合物之混合物用氮氣脫氣，超音波處理10分鐘且然後於65℃氮氣中攪拌40小時。於真空中移除溶劑，將殘質溶解於10% MeOH之DCM溶液(250毫升)中且用飽和醋酸銨溶液(200毫升)清洗。將含水層再次用10% MeOH之DCM溶液(2 x 200毫升)萃取。將合併之有機萃出物於真空中蒸發並將殘質再吸收至矽膠並藉由閃蒸管柱色層分離法予以純化(用0-40% EtOAc之DCM洗提，梯度洗提)而得到呈灰黃色固體之標的化合物(4.5克，6.14毫莫耳，41.1%)：Rt 2.70分鐘。
2-((4-胺基-3-(3-氟-5-羥基苯基)-1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-溴-3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮
於一含有2-((4-胺基-3-(3-(第三丁氧基)-5-)-1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-溴-3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮1(13.0克，18.6毫莫耳)於DCM(150毫升)之溶液中加入三氟醋酸(21.6毫升，280毫莫耳)並將產生的溶液攪拌2小時。將溶劑於真空中移除。將殘質於DCM(200毫升)及NaHCO3飽和溶液(200毫升)中提取。將含水層再次用10% MeOH之DCM(2 x 100毫升)萃取並將合併之有機萃出物於真空中蒸發。將殘質再吸收至矽膠上並藉由閃蒸色層分離法用0-3% MeOH之DCM予以洗提而純化得到呈白色固體之標的化合物1b(7.60克，11.8毫莫耳，63.0%)：m/z 640(M+H)+(ES+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：5.47(2H，s)，5.78(2H，s)，6.43(1H，d)，6.65(1H,dt)，6.75(1H，m)，6.79(1H，t)，7.14(1H，t)，7.28(1H，t)，7.53(1H，d)，7.69-7.73(2H，重疊m)，7.85(1H，m)，8.13(1H，s)，10.18(1H，d)。
化合物(I)：2-((4-胺基-3-(3-氟-5-羥基苯基)-1H-吡唑並[3,4-d]嘧啶-1-基)甲基)-5-(3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙-1-炔-1-基)-3-(2-(三氟甲基)苄基)喹唑啉-4(3H)-酮，呈型式1多晶型結晶
將一含有3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙-1-炔(4.69克，29.7毫莫耳)，碘化銅(226毫克，1.19毫莫耳)，中間體B(7.6克，11.9毫莫耳)及聯(三苯基膦)鈀(II)二氯化物(833毫克，1.19毫莫耳)於二乙胺(330毫升)之混合物徹底的用氮脫氣並於60℃攪拌3小時。將更多3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙-1-炔(400毫克)，聯(三苯基膦)鈀(II)二氯化物(167毫克，0.24毫莫耳)及碘化銅(0.45克，0.24毫莫耳)添加至二乙胺(30.0毫升)並於60℃攪拌3小時。將另一份3-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)丙-1-炔7(400毫克)，聯(三苯基膦)鈀(II)二氯化物(167毫克，0.24毫莫耳)及碘化銅(0.45克，0.24毫莫耳)加入並將反應混合物於60℃再攪拌7小時。將溶劑於真空中移除，將殘質溶解於10% MeOH之DCM溶液(200毫升)中並用醋酸銨水溶液(10wt%，300毫升)清洗。將含水層再次用10% MeOH之DCM溶液(2 x 200毫升)萃取。將合併之有機層於真空中蒸發。將殘質於MeOH(30.0毫升)中漿化過夜並過濾。將固體殘質吸收至矽膠並藉由管柱色層分離法(SiO2，用0-5% MeOH之DCM 洗提，梯度洗提)予以純化而得到呈黃褐色固體之型式1多晶型結晶型式之化合物(I)(4.73克，6.52毫莫耳，55.0%)：m/z 718(M+H)+(ES+)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：3.20(3H，s)，3.35-3.39(2H，重疊m)，3.43-3.50(4H，重疊m)，3.60-3.64(2H，重疊m)，4.38(2H，s)，5.49(2H，s)，5.77(2H，s)，6.42(1H，d)，6.65(1H,dt)，6.74(1H，dq)，6.79(1H，t)，7.15(1H，t)，7.28(1H，t)，7.52(1H，d)，7.65-7.72(2H，重疊m)，7.83(1H，m)，8.13(1H，s)，10.19(1H，s)。
此物質樣品之XRPD分析係使用一般過程之XRPD方法2來進行。該物質為結晶如顯示於所得到之XRPD圖示(圖式3)，但亦含有一些無定形物質。
對於型式1多晶型結晶樣品之DSC分析(使用一般過程之DSC方法1)係顯示於圖式4(下方圖)，在那裡可以看出樣品經過多次加熱事件。於102℃之一個廣泛的吸熱峰後接著為於141℃之放熱峰，接著為於174℃更清晰的吸熱峰。於加熱期間觀察到形成新穎多晶型結晶-之後發現為型式2多晶型結晶。對於型式1多晶型結晶樣品之TGA分析(使用一般過程之TGA方法1)(圖式4；上方圖)顯示由周遭至75℃時重量損失0.34%，可能是因為游離溶劑及/或吸濕性水之蒸發。
實例3-呈型式2多晶型結晶之化合物(I)的製備 方法1
型式2多晶型結晶可如下藉著由1-丙醇溶液中結晶出來而製備。 於100毫升反應器中加入1.98克化合物(I)及49.5毫升1-丙醇(25 升/公斤)。將混合物攪拌並回暖至95℃(於92℃見到溶液)。將溶液維持於95℃達30分鐘後冷卻至23℃達10小時，於72℃自發性的結晶。將該非均相混合物攪拌4小時，然後將沉澱過濾出來並用1-丙醇(2毫升)清洗。將產物於45℃真空中乾燥18小時而得到1.71克型式2多晶型結晶，產率為86.4%。
方法2
該型式2多晶型結晶由1-丙醇溶液中結晶出來亦可如下藉由植晶以型式2多晶型結晶之結晶而促進。將1-丙醇(25.00升/公斤，275.0毫升)添加至化合物(I)(11.00克)中。將混合物以350rpm於25℃攪拌。然後將非均相混合物於40分鐘期間回暖至97℃(回流溫度)，維持於97℃達5分鐘，然後於5分鐘期間冷卻至96℃，然後維持於96℃達1小時。將該均相微橘色溶液於15分鐘期間冷卻至5℃。然後將攪拌速度降至250rpm並將溶液種晶以型式2多晶型結晶(0.01公斤種晶/公斤化合物(I)啟始物質，0.11克)。將混合物於85℃攪拌10分鐘，然後於8小時期間冷卻至22℃，採用非線形參數為2.3之立體冷卻。將該非均相混合物於22℃攪拌10小時之後將沉澱物過濾。將產物用1-丙醇(1.00升/公斤，8.84克，11.00毫升)清洗然後於45℃(週末；72小時)乾燥而得到型式2多晶型結晶(9.5克，86.4%)。
方法3
型式2多晶型結晶可藉由將型式1多晶型結晶於甲醇，乙醇，2-丙醇，1-丙醇，丙酮，醋酸乙酯，乙腈，甲苯，醋酸異丙酯，TBME， 2-丁酮，DMSO，二***，MIBK，庚烷，硝基甲烷，10%水/乙醇，10%水/乙腈或10%水/2-丙醇中漿化而製備。
方法4
型式2多晶型結晶可藉由將非晶型式之化合物(I)於甲醇，乙醇，2-丙醇，1-丙醇，丙酮，醋酸乙酯，乙腈，甲苯，醋酸異丙酯，TBME，2-丁酮，DMSO，二***，MIBK，硝基甲烷，10%水/乙醇或10%水/2-丙醇中漿化而製備。
方法5
型式2多晶型結晶之大規模準備法如下：將200毫克型式1多晶型結晶秤重添加至20毫升閃爍瓶中。將50體積之甲醇加入並將樣品於20℃及50℃之間漿化24小時(每個溫度各4小時)其間持續以500rpm攪拌。將產生的物質於真空中過濾並於40℃真空中乾燥過夜。
實例4-呈型式2多晶型結晶之化合物(I)的特性化
型式2多晶型結晶之樣品的XRPD分析係使用一般過程之XRPD方法3來進行。所得到之XRPD圖示係顯示於圖式5。
型式2多晶型結晶之樣品的TGA分析係使用一般過程之TGA方法2來進行。所得到之數據係顯示於圖式6，由此，顯而易見該型式2多晶型結晶顯示由155℃上升至200℃時重量損失±0.5%。
型式2多晶型結晶之樣品的DSC分析係使用一般過程 之DSC方法2來進行。所得到之數據係顯示於圖式7，由此，顯而易見型式2多晶型結晶顯示於190.1℃融溶分解(最大峰)。
型式2多晶型結晶樣品之DVS等溫線係顯示於圖式8且於質量圖之DVS變化係顯示於圖式9。該型式2多晶型結晶係被觀察到由0% RH上升至95% RH逐步吸收水±0.4%且水之攝入是可逆的，說明了型式2不吸濕。
型式2多晶型結晶樣品之靜態穩定性研究證明該樣品於固體型式係對濕氣穩定的，因為於DVS分析(參見圖式10)及1週之儲存於25℃/96% RH及40℃/75% RH(參見圖式11，使用XRPD方法1之一般過程)之後，藉由XRPD(使用一般過程之XRPD方法3)未注意到有改變。
實例5-呈型式2多晶型結晶之微粒化化合物(I)的穩定性
微粒化型式2多晶型結晶係使用5公分Jetmill微粒化裝置來製備以生產下列之粒子大小分佈：D10=1.14μm；D50=1.94μm且D90=3.39μm(粒子大小分佈係使用激光繞射法來確定(Malvern Mastersizer儀器)。
該微粒化物質係藉由TGA，XRPD，及DSC於時間零及於不同儲存條件後進行分析。將樣品儲存於下列條件：(i)7週於RT/<5% RH；(ii)7週於RT/56% RH；(iii)7週於RT/75% RH；(iv)7週於50℃；及(v)7週於40℃/75% RH。
該顯示於表3之數據指出該樣品於晶體學上及熱力學上係穩定的，因為於不同狀況下，未觀察到顯著的變化。
實例6-呈無定形型式之化合物(I)的製備
無定形型式之化合物(I)係藉由將該型式1多晶型結晶(使用實例2之過程而得到)加熱至120℃而製備。
實例7-呈型式3多晶型結晶之化合物(I)的製備 方法1
該型式3多晶型結晶可藉由於二氯甲烷中漿化呈無定形型式之化合物(I)而製備。
方法2
型式3多晶型結晶之大規模製備法如下：將200毫克型式1多晶型結晶添加至4毫升含有5體積二氯甲烷之瓶中。將樣品渦旋30秒。然後再添加5體積DCM並將樣品再渦旋30秒。將樣品過濾並於25℃真空乾燥箱中經過一週末。
實例8-呈型式3多晶型結晶之化合物(I)的特徵敘述
型式3多晶型結晶樣品之XRPD分析係使用一般過程之XRPD方法2來進行。該XRPD圖示係顯示於圖式12。
對於型式3多晶型結晶樣品所得到之TGA及DSC數據(使用一般過程之TGA方法1及DSC方法1)係顯示於圖式13。該型式3多晶型結晶於約186℃熔融並分解(波峰；DSC-下方圖)。
對於型式3多晶型結晶樣品所得到之GVS等溫線係顯示於圖式14，其中，0-90% RH觀察到0.99%之質量改變。
型式3多晶型結晶樣品之狀態穩定性研究證明該樣品於固體型式係對濕氣穩定的，因為於GVS分析(參見圖式15)及1週之儲存於25℃/96% RH及40℃/75% RH(參見圖式16；使用一般過程之XRPD方法1)之後藉由XRPD(使用一般過程之XRPD方法2)未注意到有改變。
實例9-呈型式4假多晶型之化合物(I)的製備
將呈型式1多晶型結晶之化合物(I)(20毫克)或呈無定形型式之化合物(I)(20毫克)秤重至HPLC瓶中。然後於室溫將THF增量添加並振盪達1分鐘。然後將樣品於50℃振盪(500rpm)達15分鐘，之後再添加THF。繼續此步驟直到添加了80體積之THF而得到一溶液。將溶液以0.1℃/分鐘由50℃冷卻至5℃並維持於5℃過夜。然後將溶液任其蒸發以便得到一固體。將固體於真空中過濾，風乾(於真空中)達2小時，之後藉由XRPD使用一般過程之XRPD 方法1予以分析。使用呈無定形型式之化合物(I)作為起始物質所得到之固體樣品的XRPD圖示係顯示於圖式17且相關於型式4假多晶型。
將使用型式1多晶型結晶作為起始物質所得到之固體樣品於25℃真空乾燥箱中乾燥達>48小時，之後再次藉由XRPD予以分析。於此延長之乾燥期間後，觀察到該型式4多晶型結晶轉化為無定形型式之化合物(I)。因此，該型式4假多晶型為一亞穩定溶劑合物。
實例10-呈型式5假多晶型之化合物(I)的製備
將呈型式1多晶型結晶(20毫克)之化合物(I)或呈無定形型式之化合物(I)(20毫克)秤重至HPLC瓶中。然後於室溫將1,4-二烷遞增振盪加入達1分鐘。然後於下次添加1,4-二烷之前將樣品於50℃振盪(500rpm)達15分鐘。繼續此步驟直到添加了80體積之1,4-二烷而得到溶液。將該溶液以0.1℃/分鐘由50℃冷卻至5℃並維持於5℃過夜。然後將溶液予以蒸發以便得到一固體。將該固體於真空中過濾，風乾(於真空中)2小時，之後藉由XRPD用一般過程之XRPD方法1進行分析。該使用不定型型式之化合物(I)作為起始物質所得到之固體樣品之XRPD圖示係顯示於圖式17且相關於型式5假多晶型。將使用型式1多晶型結晶作為起始物質而得到之固體樣品於25℃真空烘箱中乾燥>48小時，之後再次藉由XRPD進行分析。在延長乾燥時間之後，該型式5假多晶型並未改變型式。進行其他的特性鑑定而產生1H NMR，TGA及DSC數據(未顯示)，其等顯示該型式5假多晶型於溶劑耗損後還原 回無定形型式之化合物(I)。因此，該型式5假多晶型為亞穩定溶劑合物。
實例11-呈型式6假多晶型之化合物(I)的製備
將呈無定形型式之化合物(I)(20毫克)秤重至HPLC瓶中。且然後於室溫將10%水/乙腈加量振盪加入達1分鐘。然後將樣品於50℃振盪(500rpm)達15分鐘，之後添加10%水/乙腈。繼續此步驟直到添加了80體積之10%水/乙腈。將產生的漿液於25℃及50℃之間留待熟成(於各溫度各為4小時)，於500rpm振盪2天。然後將固體於真空中過濾，風乾達2小時且藉由XRPD用一般過程之XRPD方法1進行分析。此物質樣品之XRPD圖示係顯示於圖式17且相關於型式6假多晶型。於XRPD分析之後，將此物質於40℃真空乾燥箱中乾燥過夜。在延長乾燥時間之後，觀察到該型式6假多晶型耗損溶劑並轉化為型式2多晶型結晶。因此，該型式6假多晶型為亞穩定溶劑合物。
實例12-呈型式7假多晶型之化合物(I)的製備
將呈無定形型式之化合物(I)(20毫克)秤重至HPLC瓶中。然後將10%水/丙酮於室溫振盪增量加入達1分鐘。然後將樣品於50℃振盪(500rpm)達15分鐘，之後再添加10%水/丙酮。繼續此步驟直到添加了80體積10%水/丙酮。將產生的漿液於25℃及50℃之間留待熟成(於各溫度各為4小時)，於500rpm振盪2天。後將固體於真空中過濾，風乾達2小時且藉由XRPD使用一般過程之XRPD方法1予以分析。此物質樣品之XRPD圖示係顯示於圖式 17且相關於型式7假多晶型。接著XRPD分析之後，將物質於40℃真空乾燥箱中乾燥過夜。於此延長之乾燥期間之後，觀察到該型式7假多晶型已喪失溶劑並轉化為型式2多晶型結晶。因此，型式7假多晶型為亞穩定溶劑合物。
實例13-型式2及型式3多晶型結晶之熱力學穩定性及其等之相互轉化
競爭性漿化實驗係於型式2及型式3多晶型結晶之50：50混合物中進行。將50體積之溶劑加入並將樣品於設定之溫度攪拌(300rpm)3天。然後於XRPD分析之前，將所有樣品於真空中過濾並風乾達30分鐘。
漿化實驗之結果係概述於下表4： 所有於型式2中產生的競爭性漿化實驗說明了此為較穩定的熱力學型式。
實例14-試管內及生體內篩選方法和結果 試管內篩選 生物測試：實驗方法 酶抑制分析
該PI3K酵素係在ATP及Mg2+離子存在之下催化由磷脂醯肌醇4,5-二磷酸鹽(PIP2)成為磷脂醯肌醇3,4,5-三磷酸鹽(PIP3)之磷酸化反應。該PIP3產物可藉著將生物素-PIP3由包含銪標記之抗-GST單株抗體，一GST-標記Pleckstrin同源物(PH)結構區，生物素化PIP3及鏈親和素-別藻藍蛋白(APC)之能量轉移絡合物中藉由時間分辨螢光共振能量轉移(TR-FRET)(HTRF®PI3K酶分析，Millipore)被置換而檢測。絡合物中之銪於330nm之激發造成能量轉移至APC及於665nm之螢光發射，即便銪本身於其特徵波長620nm發射。該由PI3K活性所生成之PIP3產物係由絡合物中置換生物素-PIP3並造成能量轉移損失(降低訊號)。
將欲測試之化合物，於想要的最終濃度，添加至含有PIP2物質及重組體PI3K酶(抑或α，β或δ等形，ex Millipore，或γ等形[p110γ+p101構築]，ex United States Biological，Swampscott，MA)之混合物中並將該混合物於室溫培育2小時。於 此培育後，將ATP(10μM)添加至酶/化合物/PIP2物質混合物中並將所產生的混合物於室溫再培育30分鐘。然後將一含有生物素化PIP3之終止溶液及含有GST標記GRP1普列克底物蛋白同源物(PH)結構區之檢測混合物及螢光加入並將混合物於室溫培育達15-18小時，之後於螢光微板讀數器(Synergy 4，BioTek UK，Bedfordshire，UK)上檢測。
結果係根據公式來計算：APC訊號(於665nm輻射)/銪訊號(於620nm輻射)x 104。各反應之抑制百分比係相關於DMSO治療控制組來計算，且然後由濃度-回應曲線計算50%抑制濃度(IC50值)。
PI3K δ細胞基底之分析
測定蛋白質之磷酸化狀況，Akt，PI3Kδ下游產物，訊號，而作為評估PI3K δ活化以回應刺激之方法。
U937細胞，得自人類，白血病細胞，單核細胞淋巴瘤細胞系，係藉由用PMA(100ng/毫升)培育達48至72小時而分化為巨噬細胞-型式細胞。然後將細胞用測試化合物或載體預培育達2小時且然後藉由暴露至H2O2(10mM，5-7分鐘)而短暫刺激並將反應藉由將介質用4%甲醛溶液代替而停止。內源性過氧化物活性及甲醛係藉由用驟冷緩衝液(0.1%疊氮化鈉，1% H2O2於PBS含0.1% Triton X-100)培育20分鐘而失活。將細胞用緩衝液(PBS，含有0.1% Triton X-100)清洗並用阻斷溶液(1% BSA於PBS)培育1小時且然後再用緩衝液清洗並用抗-pAkt抗體或抗-pan-Akt抗體(兩者來自Cell Signaling Technology)培育過夜。用緩衝液(PBS，含有 0.1% Triton X-100)清洗後，將細胞用HRP-共軛之第二抗體(Dako)培育並將所產生的信號進行比色測定(OD：450nm，參考波長為655nm)使用TMB基質(由R&D Systems，Inc.提供之基質試劑包)。
此反應係藉由添加H2SO4溶液(100μL)而停止。然後將細胞用緩衝液(PBS，含有0.1% Triton X-100)清洗並施用5%結晶紫溶液(100μL)達30分鐘。用緩衝液(PBS，含有0.1% Triton X-100)清洗後，將1% SDS(100μL)添加至各孔中並將盤輕輕的震盪1小時後於595nm測量吸光度(Varioskan® Flash，Thermo-Fisher Scientific)。藉由將OD450-655除以OD595讀數而校正OD450-655讀數之細胞數目。pAkt訊號對於總Akt訊號之比率係用來定量PI3K δ之活化程度。計算每一孔洞之抑制百分比，相對於設定為100%抑制之10μg/毫升標準控制組(LY294002)相對於設定為0%抑制之僅有H2O2控制組。該IC50值係藉由測試化合物之系列稀釋而產生的濃度-回應曲線來計算。
PI3K γ細胞基底之分析
作為評估PI3K γ於回應刺激之活性的方法，蛋白質之磷酸化狀態，Akt，PI3K γ發信號之下游產物，係用接下來之MCP-1刺激來測定。
U937細胞係藉由用PMA(100ng/毫升)培育達48至72小時而分化為巨噬細胞-型式細胞。然後將細胞用測試化合物或載體預培育達2小時且然後用MCP-1短暫刺激(10nM，1分鐘)並將反應藉由將介質用4%甲醛溶液代替而終止。內源性過氧化物活性及甲醛係藉由用驟冷緩衝液(0.1%疊氮化鈉，1% H2O2於PBS含 0.1% Triton X-100)培育達20分鐘而滅活。將細胞用緩衝液(PBS含有0.1% Triton X-100)清洗且用阻斷溶液(1% BSA於PBS)培育1小時且然後用緩衝液再清洗並用抗-pAkt抗體或抗-pan-Akt抗體(兩者來自細胞Signaling Technology)培育過夜。用緩衝液清洗後(PBS含有0.1% Triton X-100)，將細胞用HRP-共軛第二抗體(Dako)培育並將產生的訊號進行比色測定(OD：450nm，參考波長為655nm)使用TMB基質(由R&D Systems，Inc.提供基質試劑包)。
此反應係藉由添加1N H2SO4溶液(100μL)而終止。然後將細胞用緩衝液(PBS含有0.1% Triton X-100)清洗並施用5%結晶紫溶液(100μL)達30分鐘。用緩衝液(PBS含有0.1% Triton X-100)清洗後，將1% SDS(100μL)添加至各孔洞中並將平盤微微振盪達1小時，之後，於595nm測量吸光度(Varioskan® Flash，Thermo-Fisher Scientific)。藉由將OD450-655除以OD595讀數而校正OD450-655讀數之細胞數目。pAkt訊號對於總Akt訊號之比率係用來定量PI3K γ之活化程度。計算每一孔洞之抑制百分比，相對於設定為100%抑制之10μg/毫升標準控制組(LY294002)相對於設定為0%抑制之僅有MCP-1控制組。該IC50值係藉由測試化合物之系列稀釋使用XL-Fit(idbs，Guildford，UK)而產生的濃度-回應曲線來計算。
超氧化物陰離子生產分析作為評估PI3Kδ依賴細胞功能之方法，係藉由化學發光法評估於IFNγ-填充之U937細胞的超氧化物陰離子生產。該U937細胞(購自ATCC，Manassas，VA)係用10% FCS於37℃維持於RPMI 1640(Invitrogen Ltd.，Paisley，UK)。將細胞以107細胞/毫升之密度懸 浮於40毫升10% FCS RPMI 1640中，並用20μL of 100μg/毫升IFNγ溶液(最終濃度：50ng/毫升)處理，並於37℃，5% CO2中培育達4天。
將IFNγ-填充之U937細胞以0.2 x 106細胞/孔洞接種於96-孔洞盤上，並用測試化合物於飢餓介質(0.5% FCS RPMI1640-不含酚紅)預培育2小時。將來自釀酒酵母之Zymosan A(10毫克)(ex Sigma-Aldlich)再懸浮於1毫升之150mM NaCl中並於100℃沸騰達15分鐘。沸騰後，將Zymosan顆粒用1毫升PBS清洗兩次，並用0.5毫升BioParticlesTM調理試劑(Life technologies)於37℃培育達60分鐘。將細胞用含有Zymosan顆粒溶液(10μL)，分析緩衝液(85μL)，發光氨(2.5μL)及強化劑溶液(2.5μL)之混合物處理，其等均來自(除了Zymosan)Superoxide Anion Assay Kit(# CS1000，Sigma-Aldrich Ltd，Poole，UK)。化學發光所指示之釋放的超氧陰離子係每15分鐘多至60分鐘藉由發光計量測量法(Varioskan® Flash，Thermo-Fisher Scientific)來測量。
使用培育60分鐘後之數據進行分析。計算各個孔洞之抑制百分比相對於10μg/毫升IC87114，標準PI3Kδ抑制劑，設定為100%抑制對比於0%抑制之控制組。相對之IC50值係藉由測試化合物之系列稀釋而產生的濃度-回應曲線使用XL-Fit(idbs，Guildford，UK)來計算。
於PBMCs，Cytostim-引起之細胞因子生成作為評估PI3Kδ-依賴細胞功能之方法，cytostim-引起之於PBMC之生產的IL-4，IL-5，IL-13及IFNγ係藉由Luminex多路復用分析來評估。由Quintiles Limited(London，UK)招募所有健康的志願 者，並將血液樣品送到Respivert Ltd。此研究係經由國內Ethics Committee核准，且所有受試者簽署知情同意書。
將PBMC懸浮液(200μL；2 x 106細胞/毫升)添加至96-孔洞盤。將細胞用含於乾淨DMSO之測試化合物或以DMSO作為載體(2μL)處理並於RT培育1小時。將Cytostim(Miltentyi Biotec，Surrey，UK)以1：50之比率加入並將細胞培育20小時(37℃；5% CO2)。將盤於500 x g旋轉5分鐘並收集上層清液。藉由Luminex使用高靈敏度細胞因子磁珠套組(#HSCYTMAG-60SK，Millipore，Watford，UK)來測量四個分析物(IL-4，IL-5，IL-13及IFNγ)如下：該磁性抗體珠係多路復用，並於96-孔洞盤用標準，僅有介質或樣品(50μL)培育過夜，於4℃振盪。以套組中提供之Millipore清洗緩衝液用磁性洗板清洗兩次後，將珠用檢測抗體(50μL)培育1小時，於RT振盪。將組具所提供之鏈親和素-藻紅蛋白溶液加入達30分鐘，於RT振盪。清洗後，將珠再懸浮於鞘液(150μL)中並立即分析。設定好Luminex系統以計算50個珠並計算上層清液中之各分析物的量以對照於標準曲線。由濃度-抑制曲線使用XL-Fit(IDBS，Guildford，UK)以測定IC50值。
趨化作用至MCP1
作為評估PI3K γ依賴細胞功能之方法，THP1細胞趨化至MCP-1係使用48孔洞-趨化作用室來評估。來自人類單核細胞白血病細胞淋巴瘤細胞系之THP1細胞，(購自ATCC Manassas，VA)用10% FCS於37℃維持於RPMI 1640(Invitrogen Ltd.，Paisley，UK)。將細胞再懸浮於0.5% BSA/RPMI1640(2 x 106細胞/毫升)並於37℃，5% CO2培育10分鐘。然後將細胞懸浮液整份(500μL)用於乾淨DMSO之化合物或用DMSO作為載體(2.5μL)處理1小時(37℃，5% CO2)。
MCP1(50nM)係於0.5% BSA/RPMI1640中製備。將MCP1溶液(50μL)添加至48-孔洞趨化室(AP48，NeuroProbe Inc.，Gaithersburg，MD)之底盤各孔洞中。將聚碳酸酯膜(8μm)安裝在底室，且然後將頂盤安裝在底室及過濾膜。將細胞懸浮液整份(50μL)用化合物或載體於添加至頂室之前小心的處理，並將0.5% BSARPMI1640(50μL)施用於上。然後將該室靜置2小時(37℃，5% CO2)。然後將該膜小心的移除並將來自底室之樣品(25μL)轉移至新96孔洞盤。
將含MTT(50μL)於10% FCS不含酚紅之RPMI1640之溶液添加至各孔洞中，並將該平盤培育2小時(37℃，5% CO2)。將乾淨DMSO(100μL)添加至各孔洞中以提取由MTT形成之甲臢並將該盤微微振盪達1小時，之後，於595nm測量吸光度(Varioskan® Flash，Thermo-Fisher Scientific)。將值與藉由AS604850(10μg/毫升)抑制者，一選擇性PI3Kγ抑制劑，相較以計算相對之抑制百分比。相對之EC50值係由濃度-抑制曲線使用XL-Fit(idbs，Guildford，UK)來測定。
由得自COPD病患之中性粒細胞釋放之CXCL8治療由得自COPD病患之中性粒細胞釋放的CXCL8的功效係藉由ELISA分析來評估。所有病患係由Quintiles Limited(London，UK)招募，並將血液樣品送到Respivert Ltd。此研究係經由國內Ethics Committee核准，且所有受試者簽署知情同意書。將全血(30毫升) 與ACD(5毫升；包括：7.36克檸檬酸，14.71克檸檬酸鈉，9.91克右旋糖於250毫升無菌，雙蒸水)及6%葡聚醣(15毫升；稀釋於0.9% NaCl)溫和的混合以移除紅血球。將管子於室溫培育45分鐘，且然後收集上層清液(白細胞富集餾份)，留下紅血球細胞。
將此餾份予以低制動離心(10分鐘，於1200rpm，4℃)。將上層清液抽吸並將小顆粒再懸浮於冰冷，無菌雙蒸H2O(10毫升)中，並將0.6M KCl(4毫升)於30秒後加入。將細胞懸浮液用無菌PBS(至50毫升之最終體積)稀釋且然後於1500rpm離心達5分鐘。將上層清液抽吸並將小顆粒再懸浮於PBS(2.5毫升)，並將來自相同提供者之兩個管子倒在一起。
小心的將此細胞懸浮液使用Pasteur移吸管而層疊在5毫升Ficoll-paqueTM premium(GE Healthcare Bio Science AB，Uppsala，Sweden)上，且然後離心(30分鐘於1500rpm，低制動)。將管子底部分離出來的中性粒細胞再懸浮於RPMI-1640介質中(Gibco，Paisley，UK)，含有5% FCS並以4x105細胞/孔洞之密度植晶於96孔洞盤中。於開始處理之前，將細胞培育30分鐘(37℃；5% CO2)。
將嗜中性粒細胞用測試化合物或用DMSO載體預培育1小時且然後用TNFα(10ng/毫升)予以刺激。於TNFα刺激後3小時收集不含細胞之上層清液，且用DuoSet ELISA development kit(R&D systems，Abingdon，UK)藉由ELISA來測量CXCL8。該所呈報之IC50值係由濃度-抑制曲線，用XL-Fit(IDBS，Guildford，UK)來測定。
MTT分析
PMA-分化之U937細胞用測試化合物(10μg/毫升)預培育4小時或於載體5% FCS或10% FCS預培育24小時。將上層清液用新介質(200μL)替代且將MTT儲備溶液(10μL，5毫克/毫升)添加至各孔洞中。培育1小時後，將介質移除，將200μL之DMSO添加至各孔洞並將盤微微振盪達1小時，之後於550nm讀取吸光度。計算各孔洞中細胞存活率之損失百分比，相對於載體(0.5% DMSO)-處理組。
生體內篩選：藥效學及抗炎活性
於小鼠，LPS-引起之呼吸道中性粒細胞累積將未禁食BALB/c小鼠(6-8週大)藉由氣管內給藥(給藥體積20μL)給予載體或給予測試化合物，於相對於開始LPS處理之時間點T=-2小時，-8小時，或-12小時。該LPS係於0.5毫克/毫升溶液中製備且使用De Vibliss超音波霧化器2000(7毫升，於30分鐘期間暴露)予以氣溶膠化。於LPS刺激後8小時，將氣管插管且支氣管肺泡灌洗液(BALF)藉由灌注提取且然後經由氣管導管收回PBS(1毫升)至肺部。重覆此過程而得到約2毫升肺泡灌洗液。於BALF樣品中之總細胞數係使用血細胞計數器來測量。BALF樣品之細胞離心塗片之製備係藉由於室溫時於1200rpm離心達2分鐘且使用DiffQuik染色系統(Dade Behring)染色以便細胞分類計數。細胞係使用油浸顯微鏡來計數。數據係以每毫升BALF中之中性粒細胞數目(平均±S.E.M)來表示。
於大鼠中，LPS-引起之呼吸道中性粒細胞累積 將未禁食大鼠給藥以載體或測試化合物藉由氣管內給藥(給藥體積100μL)，於相對於開始LPS處理之時間點T=-2h，-8h，或-12h。該LPS(0.3毫克/毫升)係使用De Vibliss超音波霧化器2000(7毫升，於30分鐘期間)予以氣溶膠化。於LPS刺激後8小時，將氣管插管且支氣管肺泡灌洗液(BALF)藉由灌注提取且然後經由氣管導管收回PBS(1毫升)至肺部。重覆此過程而得到約2毫升肺泡灌洗液。
於BALF樣品中之總細胞數係使用Countess自動細胞計數器(Invitrogen)來測量。BALF樣品之細胞離心塗片之製備係藉由於室溫時於1200rpm離心達2分鐘且使用DiffQuik染色系統(Dade Behring)染色以便細胞分類計數。細胞係使用油浸顯微鏡來計數。數據係以每毫升BALF中之中性粒細胞數目(平均±S.E.M)來表示。
於小鼠中，卵清蛋白-引起之呼吸道嗜酸性粒細胞及中性粒細胞累積於第0天及第7天，將BALB/c小鼠(6-8週大)用OVA進行免疫(10μg/老鼠，i.p.)。為了在肺部引發局部炎症反應，重複的將小鼠於第13-15天之間用卵清蛋白溶液刺激而予以霧化(10毫克/毫升，30分鐘暴露，De Vilibiss Ultraneb 2000)。於第17天，各隻動物經由氣管內給藥而於最終OVA刺激前2小時接受載體或測試化合物。將動物麻醉8小時之後進行氣管切開術。藉由灌輸PBS(1毫升)至肺部而得到BAL，然後將其撤回。重複此過程以提供約2毫升之肺泡灌洗液。於BALF樣品之總細胞數係用血細胞計數器來測量。BALF樣品之細胞離心塗片之製備係藉由於室溫時於200rpm 離心達5分鐘且使用DiffQuik染色系統(Dade Behring)染色以便細胞分類計數。細胞係使用油浸顯微鏡來計數。數據係以每毫升鼻肺泡灌洗液中之細胞數目差異(平均±S.E.M)來表示。
於小鼠中，聚-I：C-引起之細胞累積
將特定之無病原體A/J小鼠(雄性，5週大)經鼻內給藥以聚(I：C)-LMW(1毫克/毫升，40μL)(InvivoGen，San Diego，CA，USA)，在麻醉下(3%異氟醚)，每天兩次達3天。於各聚-I：C處理之前2小時，將測試物質經鼻內給藥(50μL於10% DMSO/等滲食鹽水載體)。於最終聚-I：C刺激之後24小時，將動物麻醉，氣管插管且藉由灌輸進入等滲食鹽水(100毫升/公斤)且然後由肺部撤回而做到支氣管肺泡灌洗(BAL)。於BALF樣品中之總細胞數係使用血細胞計數器於相位差顯微鏡中來測量。
肺泡巨噬細胞及中性粒細胞之比例係藉由FACS分析使用抗-老鼠MOMA2-FITC(巨噬細胞)或抗-老鼠7/4-FITC(中性粒細胞)來測定。將細胞懸浮於PBS並用抗-MOMA2-FITC(2μg/毫升，Catalogue no SM065F，Acris Antibodies GmbH，Herford，Germany)或抗-7/4-FITC(2μg/毫升，Catalogue no CL050F，Acris Antibodies GmbH，Herford，Germany)於30℃時培育達30分鐘，且然後用碘化丙啶對比染色以排除壞死細胞。將細胞用PBS清洗，並移轉至FACS管中。將樣品設置在一流式細胞儀中(ALTRA II；Beckman Coulter Japan，Tokyo，Japan)，且用單參數FL2[PMT2](FITC)含log x-軸之直方圖作圖說明相對之FITC強度。數據檔係儲存供隨即之分析，使用Kaluza分析軟體(1.2版)來計算各細胞型式之比 例。
香煙煙霧模式
將A/J小鼠(雄性，5週大)暴露於香煙煙霧(4%香煙煙霧，用壓縮空氣稀釋)達30分鐘/天達11天，小動物使用Tobacco Smoke Inhalation Experiment System(Model SIS-CS；Sibata Scientific Technology，Tokyo，Japan)。於香煙煙霧最終之暴露後，將測試物質每天給予一次達3天(鼻內劑量，包括35μL溶液於50% DMSO/等滲食鹽水)。
最終劑量給藥之後12小時，將動物麻醉，氣管插管且支氣管肺泡灌洗(BAL)係藉由將PBS(100毫升/公斤)灌輸進入且然後由肺部撤回而進行。於BALF樣品中之總細胞數係用血細胞計數器於相位差顯微鏡下測量。肺泡中巨噬細胞及中性粒細胞之比例係藉由FACS分析使用抗老鼠MOMA2-FITC(巨噬細胞)或抗老鼠7/4(中性粒細胞)來測定。
將細胞懸浮於PBS並用抗-MOMA2-FITC(2μg/毫升，Catalogue no SM065F，Acris Antibodies GmbH，Herford，Germany)或抗-7/4-FITC(2μg/毫升，Catalogue no CL050F，Acris Antibodies GmbH，Herford，Germany)於30℃時培育達30分鐘，且亦用碘化丙啶(2μg/毫升)來對比染色以允許排除壞死細胞。將細胞用PBS清洗，並移轉至FACS管子中。將樣品設置在一流式細胞儀中(ALTRA II；Beckman Coulter Japan，Tokyo，Japan)，及單參數FL2[PMT2](FITC)繪製含log x-軸之直方圖以描述相對之FITC強度。
數據檔係儲存以供隨即之分析，使用Kaluza分析軟體(1.2版)以計算各種細胞型式之比例。CXCL1(KC)，MCP1，TNFα，IL-17或骨橋蛋白於BALF之濃度係用Quentikine®老鼠KC，MCP1，TNFα，IL-17或骨橋蛋白ELISA套組(R&D systems，Inc.，Minneapolis，MN，USA)來測定。使用OxiSelect® TBARS Assay Kit(MDA Quantitation；Cell Biolabs Inc，San Diego，CA，USA)來測量丙二醛之存在。
試管內及生體內篩選結果之概述式(I)化合物之試管內表現，如使用上述方法測定者，係呈現如下(表5，6及7)。本發明化合物證明了PI3K δ及γ等形兩者之強大抑制性，且顯示對於PI3K α無抑制活性且於酶分析對於PI3K β僅有低抑制活性(表5)。
這些功效轉化為用過氧化氫或MCP-1刺激細胞所引起之Akt磷酸化的強效抑制作用。未檢測到對細胞存活率，用式(I)化合物培育而產生，有影響(表6)。再者，如本文所揭示，發現用式(I)化合物處理細胞可抑制由U937細胞生產ROS及由cytostim-刺激之PBMC生產細胞因子(表7)。
值得注意的是，式(I)化合物之可能的代謝產物，即相應的醇，化合物(Ia)，較式(I)化合物，為對於PI3K δ及γ等形兩者顯著較不活性之抑制劑(表6)。因此，式(Ia)化合物，較式(I)化合物，為對於由U937細胞生產ROS及由cytostim-刺激之PBMC生產細胞因子顯著較不活性之抑制劑(表7)。
1)WO 2012/052753中揭示之已知技藝化合物；2)WO 2011/048111中揭示之已知技藝化合物；NT未經測試； a)引起之Akt磷酸化的抑制；b)-ve係指一值<30%抑制，於10μg/毫升；ND：未處理
a)ROS：活性氧物種。
用化合物(I)於小鼠及大鼠中，對於LPS-引起之呼吸道中性粒細胞增多症的治療功效係分別報導於表8及9。經發現治療可於兩品種對於LPS-引起之中性粒細胞增多症產生劑量依賴抑制。再者，經發現該對於細胞累積之抑制功效可證明有長的作用期間。
N=8隻動物(每組)
N=8隻動物(每組)
化合物(I)於小鼠對於過敏原刺激-引起之呼吸道嗜酸粒細胞增多及中性粒細胞增多症之治療功效係報導於表10。經發現，於過敏原刺激之後，本文中所揭示用化合物治療小鼠，可對於嗜酸性粒細胞及中性粒細胞兩者累積於支氣管肺泡灌洗產生劑量依賴抑制。
N=8隻動物(每組)
於將小鼠暴露至聚-I：C之後，研究用化合物(I)及化合物A對於累積於BALF之巨噬細胞及中性粒細胞之治療功效。在這種直接比較中，發現用化合物(I)或化合物A治療產生對於聚-I：C-引起之累積至BALF之巨噬細胞及中性粒細胞之劑量依賴抑制性(表11)。值得注意的是，化合物(I)顯示較化合物A具有顯著較大的效價且此數據用圖形來表示中性粒細胞(圖式1a)。
a)細胞數目之數據係以平均值±SEM來顯示；N=5隻動物/每組
N=5隻動物(每組)；a)FP=丙酸氟替卡松，劑量為50μg/毫升；b)細胞數目之數據係以平均值±SEM來顯示
於暴露至香煙煙霧之後，測定以化合物(I)對於累積於BALF之巨噬細胞及中性粒細胞的治療功效(表12)。於此研究中使用之香煙煙霧模式係報導為皮質類固醇難治系統[To，Y.等，Am.J.Respir.Crit.Care Med.，2010，182：897-904；Medicherla，S.等，J.Pharmacol.Exp.Ther.2008，324：921-9]且該數據顯示***(0.3-10毫克/公斤，p.o.)，如預期，係無活性。用化合物(I)對於BALF 中性粒細胞及對於活化之肺泡巨噬細胞數目之治療功效證明了其具有抗發炎活性，當作為單一治療給藥時。再者，當化合物(I)係與丙酸氟替卡松共同給藥，以於單一治療劑量缺乏顯著效果之劑量，檢測到顯著增強之抗發炎活性。在同時發生之中，評估用化合物A對於暴露至香煙煙霧之小鼠的治療功效。此等數據與呈現如上之化合物(I)者相較時，證明了化合物(I)較化合物A為對於香煙煙霧引起之於小鼠BALF之細胞累積更強大的抑制劑(圖式2a及2b)。
香煙煙霧之暴露亦提高發炎性生物標記物CXCL1，MCP1，TNFα，IL17，骨橋蛋白及丙二醛於支氣管肺泡灌洗液之濃度。用化合物(I)治療說明於劑量依賴方式中各生物標記物之濃度降低。再者，用化合物(I)及丙酸氟替卡松兩者以組合來治療時顯示生物標記物濃度降低量較單獨使用化合物(I)治療所達成者為大(表13)。
N=每組5隻動物；1)對於香煙之抑制百分比，2)：丙酸氟替卡松(0.5毫克/毫升)；3)這些數據為μM值；係減去空氣控制值後之煙霧控制值
綜上所述，本發明化合物對於PI3K δ及γ等形兩者為有效抑制劑。該試管內表現係於生體內轉換成一個廣泛的抗發炎表型。在此設定中，於呼吸道中，本文中揭示之化合物的抑制功效對於Poly I：C-誘發之細胞累積是顯著的。亦特別引人注目的是，不同於PI3K δ選擇性抑制劑，單獨用本文中揭示之化合物(I)來治療對於香煙煙霧引起之呼吸道發炎造成顯著的抑制結果，且其等效果係於低劑量時發生，當其係與皮質類固醇，丙酸氟替卡松共同給藥，條件為單獨用皮質類固醇治療是無效的。
實例15-包含化合物(I)之製藥製劑
化合物(I)之組成物可如下配製以使用於乾性粉末吸入器：化合物(I)係藉由適當方法而微粒化，如空氣噴射研磨機而得到約2μm之D50值且然後以含或不含硬脂酸鎂來配製於混合物中。將混合物填入單位劑量容器中(例如，膠囊，泡泡)以經由乾性粉末吸入器來吸用。所給製劑之實例中係含有0及1%之間的硬脂酸鎂，舉個例子來說每劑量之填充重量為25毫克，且劑量強度範圍為由1至1000毫克(mcg)每劑量。亦可使用不同強度，不同含量之硬脂酸鎂及不同重量之每劑量。
在整個說明書及隨後的申請專利範圍中，除非內文另有 所指，‘包括’，及變化如‘包含’及‘含有’之字，應瞭解意指包含所述整數，步驟，整數組或步驟組，但非排除任何其他整數，步驟，整數組或步驟組。
本文中所指稱之所有專利案及專利申請案係整份合併於本文中作為參考。

Claims (17)

  1. 一種式(I)化合物， 或其製藥上可接受之鹽，包括其所有立體異構物，互變異構體及同位素衍生物。
  2. 如申請專利範圍第1項之式(I)化合物，其係呈其型式2多晶型結晶之型式。
  3. 如申請專利範圍第1項之式(I)化合物，其係呈其型式3多晶型結晶之型式。
  4. 一種製藥組成物，其係包含如申請專利範圍第1至3項中任一項之式(I)化合物合併一種或多種製藥上可接受之稀釋劑或載體。
  5. 如申請專利範圍第4項之製藥組成物，其進一步包含第二或其他活性組成份，如選自皮質類固醇，β激動劑，黃嘌呤，毒蕈鹼拮抗劑及p38 MAP激酶抑制劑。
  6. 一種組合產物，其包含(A)如申請專利範圍第1至3項中任一項之式(I)化合物；及(B)其他活性組成份，如選自皮質類固醇，β激動劑，黃嘌呤，毒蕈鹼拮抗劑，磷酸二酯酶抑制劑及p38 MAP激酶抑制 劑，其中，各個組成份(A)及(B)係與製藥上可接受的稀釋劑或載體配製成掺合物。
  7. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之式(I)化合物，其係用作為醫藥品。
  8. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之式(I)化合物，其係用於與一種或多種如選自皮質類固醇，β激動劑，黃嘌呤，毒蕈鹼拮抗劑及p38 MAP激酶抑制劑之其他活性組成份合併給藥之醫藥品中。
  9. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之式(I)化合物或如申請專利範圍第4項或申請專利範圍第5項之製藥組成物或如申請專利範圍第6項之組合產物，其用於治療或預防選自下列之狀況：COPD(包括慢性支氣管炎及肺氣腫)，氣喘，小兒氣喘，囊性纖維化，結節病，特發性肺纖維化，過敏性鼻炎，鼻炎，鼻竇炎，及同一狀況中任何一種由病毒引起的惡化，呼吸道病毒感染(包括其併發症)，過敏性結膜炎，結膜炎，過敏性皮膚炎，接觸性皮膚炎，牛皮癬，潰瘍性結腸炎，類風濕性關節炎或骨性關節炎之繼發性關節發炎，類風濕性關節炎，胰腺炎，惡病質，抑制腫瘤生長及轉移包括非小細胞肺癌，乳癌，胃癌，大腸癌及惡性黑色素瘤。
  10. 一種如申請專利範圍第1至3項中任一項之式(I)化合物或如申請專利範圍第4項或申請專利範圍第5項之製藥製劑或如申請專利範圍第6項之組合產物於製備醫藥品以治療或預防選自下列狀況之用途：COPD(包括慢性支氣管炎及肺氣腫)，氣喘，小 兒氣喘，囊性纖維化，結節病，特發性肺纖維化，過敏性鼻炎，鼻炎，鼻竇炎及同一狀況中任何一種由病毒引起的惡化，呼吸道病毒感染(包括其併發症)，過敏性結膜炎，結膜炎，過敏性皮膚炎，接觸性皮膚炎，牛皮癬，潰瘍性結腸炎，類風濕性關節炎或骨性關節炎之繼發性關節發炎，類風濕性關節炎，胰腺炎，惡病質，抑制腫瘤生長及轉移，包括非小細胞肺癌，乳癌，胃癌，大腸癌及惡性黑色素瘤。
  11. 一種治療選自包括下列之狀況的方法：COPD(包括慢性支氣管炎及肺氣腫)，氣喘，小兒氣喘，囊性纖維化，結節病，特發性肺纖維化，過敏性鼻炎，鼻炎，鼻竇炎，及同一狀況中任何一種由病毒引起的惡化，呼吸道病毒感染(包括其併發症)，過敏性結膜炎，結膜炎，過敏性皮膚炎，接觸性皮膚炎，牛皮癬，潰瘍性結腸炎，類風濕性關節炎或骨性關節炎之繼發性關節發炎，類風濕性關節炎，胰腺炎，惡病質，抑制腫瘤生長及轉移，包括非小細胞肺癌，乳癌，胃癌，大腸癌及惡性黑色素瘤，其包括將有效量之如申請專利範圍第1至3項中任一項之式(I)化合物，如申請專利範圍第4項或申請專利範圍第5項之製藥組成物或如申請專利範圍第6項之組合產物給藥至一個體。
  12. 一種式(II)中間體： 其中，LG1代表一釋離基或其經保護之衍生物。
  13. 一種製備如申請專利範圍第1至3項中任一項之式(I)化合物的方法，其包括將式(II)化合物 或其經保護之衍生物，其中，LG1代表一釋離基，與片段： 於適於提供式(I)化合物或其經保護之衍生物的條件下進行反應且，如需要時，將經保護之化合物去保護而得到式(I)化合物。
  14. 一種式(Ia)化合物 或其製藥上可接受之鹽，包括所有的立體異構物，互變異構體及其同位素衍生物。
  15. 一種式(I)化合物： 呈其型式2多晶型結晶之型式，其具有實質上顯示於圖5之XRPD圖示。
  16. 一種呈其型式2多晶型結晶之型式之式(I)化合物，具有XRPD圖示，其含有選自8.2，9.0，9.2，9.7，12.2，14.1，14.3，15.0，16.4，18.0，18.5，19.0，19.6，21.8，22.3，22.5，24.3，24.5，24.8，25.1及25.8(±0.2°，2-θ值)之三，四，五，六，七，八，九，十，十一，十二，十三，十四，十五，十六，十七，十八，十九，二十或全部二十一個峰。
  17. 如申請專利範圍第16項之式(I)化合物，具有XRPD圖示，其含有選自9.7，12.2，14.1及14.3(±0.2°，2-θ值)之一，二，三或四個峰。
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